CN110467644B

CN110467644B - 一种普洱消脂素的制备方法

Info

Publication number: CN110467644B
Application number: CN201910838712.3A
Authority: CN
Inventors: 乔小燕; 刘振; 马成英; 陈维; 苗爱清
Original assignee: Hunan tea research institute; Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Hunan tea research institute; Tea Research Institute Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-09-05
Filing date: 2019-09-05
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-09-05
Also published as: CN110467644A

Abstract

本发明公开了一种利用高速逆流色谱分离制备汝城白茶中Strictinin(普洱消脂素)的方法，该方法包括如下步骤：制备汝城白茶粗提取液、初步纯化、高速逆流色谱分离纯化Strictinin。本发明所述制备方法制备的普洱消脂素纯度高，且同时还具有得率高简便，重现性好的优点，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。

Description

一种普洱消脂素的制备方法

技术领域

本发明涉及天然产物活性成分的分离纯化技术领域，具体涉及到一种白毛茶中Strictinin的制备方法。

背景技术

Strictinin（普洱消脂素，C₂₇H₂₂O₁₈ ）是一种酚酸类化合物，存在于多种药材和普洱茶中。Strictinin不仅具有抗流感、抗菌功效，还能有效抑制胰脂肪酶，减少体重增加，降低血脂与血糖增加，将其称为消脂素。

茶是我国传统的经济作物，其保健功效为世人所知。“白毛茶”因新梢肥壮，且银毫满批而知名，如仁化白毛茶、凌云白毛茶和汝城白毛茶。这些品种加工的白茶和绿茶具有银毫满批、茶汤清澈的特点。汝城白毛茶是湖南特有的地方茶树品种，茶多酚含量高，加工茶类适口性差，使得白毛茶只作为地方品种种植，开发利用却较为落后。本申请发明人发现，汝城白毛茶鲜叶中含有很高含量的Strictinin，且稳定存在。鉴于文献对于Strictinin抗流感和降脂减肥的相关研究，建立该茶的Strictinin分离纯化方法并鉴定其结构对汝城白毛茶的进一步开发利用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种Strictinin的制备方法，该制备方法可用于高纯度的Strictinin化合物的大量制备。

实现上述目的的技术方案如下。

一种Strictinin的制备方法，该方法包括以下步骤：

A．高速逆流上样原料的制备：

取白毛茶，粉碎过筛，加入蒸馏水超声提取和过滤1-3次，收集滤液，调节pH值3.0±0.1，以3-4 BV/h流速通过层析柱进行吸附，吸附后静置30min-60min（目标组分被紧密吸附在色谱柱上，避免被水洗去），先用1-1.5 BV 的超纯水以4-6 BV/h的流速淋洗，然后用3-4 BV 质量浓度为20±5%的乙醇水溶液以2-4 BV/h的流速洗脱至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得白毛茶提取物；

B.高速逆流色谱法分离：

按体积比（8±0.1）：（3.5±0.1）：（1±0.1）：（1±0.1）：（0.5±0.01）用量取0.02%三氟乙酸水溶液、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、乙酸乙酯作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜；

两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相，在流速1.6~2.0 mL/min、检测波长254nm条件下，将上述制得的白毛茶提取物进行高速逆流色谱分离，根据峰形收集175~215min流出液，将收集的流出液浓缩后干燥，得Strictinin。

在其中一个实施例中，所述提取温度为40℃~60℃。

在其中一个实施例中，所述蒸馏水的用量为毛叶茶的8~11倍，更优选为10倍。

在其中一个实施例中，提取3次，每次30min~60min。

在其中一个实施例中，加入10倍的蒸馏水50~60℃超声提取30±2min，过滤，滤渣再用8倍的蒸馏水超声提取2次，每次30±2 min，合并滤液。

在其中一个实施例中，用盐酸调节pH值为3。

在其中一个实施例中，通过装有的大孔吸附树脂的层析柱以3-4BV/h流速进行吸附，优选AB-8大孔吸附树脂。

在其中一个实施例中，高速逆流色谱（HSCCC）分离时的主机转速850±50rpm，分离温度20±1℃。

在其中一个实施例中，乙醇的浓度优选为20±1%，更优选为20%。

在其中一个实施例中，粉碎过10目~30目。

在其中一个实施例中，所述白毛茶为湖南汝城白毛茶。

在其中一些实施例中，发明人发现，上样量过少，色谱峰低，不利于接收，同时分离效率低；上样量过多，会造固定相流失，分离效果差，纯度低，本申请针对白毛茶提取物的特点，优化选择高速逆流色谱法分离的上样量为150~300 mg，更优选为180~300 mg，进一步优选为250±5 mg。

在其中一个实施例中，发明人发现，流速过慢，色谱峰扩散，矮小，不利于接收，化合物纯度低；流速过快，出峰时间短，也不利于接收，与杂质分离效果差，化合物纯度低，本申请针对白毛茶提取物的特点，进一步地，优化高速逆流色谱法分离的流动相的流速为1.75~1.85 mL/min。

在其中一个实施例中，高速逆流色谱法分离为：按体积比8:3.5:1:1:0.5量取0.02%三氟乙酸水溶液、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、乙酸乙酯作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜，两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相；在流速1.8mL/min、主机转速850 rpm，分离温度20℃，检测波长254nm，在上样量为250 mg的条件下，将上述制得的毛叶茶提取物进行HSCCC分离，根据峰形收集200~215 min流出液，将收集的流出液旋转蒸发浓缩后冷冻干燥。

本发明以白毛茶为原料，特别是汝城白毛茶，所述白毛茶提取物经优化后大孔吸附树脂纯化后，再进一步结合采用优化后的高速逆流色谱法分离得到普洱消脂素。本发明所述制备方法制备的普洱消脂素纯度高，且同时还具有得率高简便，重现性好的优点，可用于化合物大量制备，为进一步活性研究奠定了物质基础。

附图说明

图1 汝城白茶水提取液HPLC色谱图。

图2 汝城白茶大孔吸附树脂20%乙醇洗脱液的HPLC图。

图 3 HSCCC分离色谱图。

图4分离化合物的HPLC纯度检测图。

具体实施方式

除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

实施例1 汝城白茶中Strictinin的制备

1、高速逆流（HSCCC）上样原料的制备

取汝城白茶200g，粉碎过10目-30目筛，加入10倍的蒸馏水50~60℃超声提取30min，过滤，滤渣再用8倍的蒸馏水超声提取2次，每次30min，合并滤液，用盐酸调节pH值3，以3-4BV/h流速通过装有1400ml的AB-8大孔吸附树脂的层析柱进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用1~1.5BV的水以4-6BV/h的流速淋洗，然后用3-4BV质量浓度为20%的乙醇水溶液以2-4BV/h的流速洗脱，收集20%质量浓度的乙醇洗脱液，其HPLC图请见图2，浓缩后冷冻干燥，得汝城白茶提取物22.3g，作为后续高速逆流分离原料。

2、HPLC检测方法

高效液相色谱条件：色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm,4.6×250mm），流动相A为0.2%的磷酸水溶液，B为乙腈。洗脱梯度为：0→25min: B 5%→72%; 25→30min:B 28%→32%。流速为1.0mL/min，DAD检测器，进样量为20μL，柱温：28℃。

取少量的上述制备的汝城白茶水提取液，过膜后进样，HPLC谱图见图1，由图可见，提取物中含有多个化学成分，保留时间为16.08 min的化合物为目标组分。

3、高速逆流色谱（HSCCC）分离

3.1溶剂系统的选择

本申请通过溶剂体系K值测定法筛选高速逆流分离的溶剂体系，多个溶剂体系中目标组分（RT16.08）与2个主要干扰组分（RT7.1和RT17.0）的分配系数K值测与分离度a见表1。

由于目标组分极性较大，首先采用常见的亲水体系正丁醇/甲醇/水体系（体系1、2）进行K值测定，结果显示，水中不加酸时目标组分K2与干扰组分K1、K3均太小，加酸后目标组分K2适宜，且与干扰组分K1、K3分离度也较为适宜(大于1.3)，但上机操作时发现，该体系保留率低于30%，不能实现化合物分离。

然后对另一亲水体系氟乙酸水/正丁醇/甲基叔丁基醚/乙腈(体系3)进行测定，发现目标组分的K值适宜，但与干扰组分K1不能分离；在该体系中加入乙酸乙酯后对目标组分K2适宜，与干扰组分K1、K3的分离度虽达不到1.5，但仍有一定的分离，通过上机操作，体系4和体系5 的目标组分纯度为93%左右，体系6的分离目标组分纯度可达96%以上，效果最好。

表1 溶剂体系K值与分离度a

3.2 HSCCC操作条件

高速逆流色谱柱：TBE-300B高速逆流色谱仪（上海同田生物技术有限公司）：配置有聚四氟乙烯柱，内径1.6 mm，柱容积280 mL，转速0-1000 r/min，TBP-50A泵，TBD-2000 UV检测器，LX-300 恒温器。

按上述体系6配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。下相流速1.8 mL/min、主机转速850 rpm，柱温箱20℃，波长254nm，在该条件下固定相的保留率46%，上样量250mg，HSCCC分离图谱见图3，收集200~215 min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得23mg化合物。

根据HPLC（分析条件同上）在254nm下的色谱图，见图4，采用峰面积归一法计算化合物纯度，化合物纯度为96.2%。

采用质谱和核磁共振鉴定分离化合物的结构。

ESI-MS m/z: 633.0624 [M－H]^–，分量式为C₂₇H₂₂O_18； ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)δ_H: 7.21 (2H, s, galloyl ArH), 6. 72and 6.61(each 1H, s, ArH), 5.76( 1H, d, J=7Hz, 1-H), 5.22( 1H, dd, J=6Hz, 14Hz,6-H) , 4.91(1H, t, J = 9Hz, 4-H) ,4.11(1H, dd, J=6Hz, 9Hz,5-H), 3.84( 1H ,t, J = 9 Hz, H-3) , 3.79( 1H , d , J=14Hz,H-6 ) , 3.66( 1H, dd , J=7Hz, 9Hz, H-2)；

^{1 3} C-NMR (125 MHz , DMSO-d6):δ 94.8 (Glu, C-1 ) ,72.6 (Glu, C-2 ) ,72.4 ( Glu,C-3 ) , 71.9 (Glu, C-4 ),73.4 ( Glu,C-5 ),63.7( Glu,C-6 ); 166.3（galloyl, C=O）,119.1（galloyl, C-1）,110.5（galloyl, C-2）,144.8（galloyl, C-3）,139.2（galloyl, C-4）, 144.8（galloyl, C-5）, 110.5（galloyl, C-6）;169.6(HHDP, C=O), 169.4(HHDP, C=O),124.8(HHDP, C-1), 125.2(HHDP, C-1’),114.9(HHDP, C-2),114.8(HHDP, C-2’), 144.8(HHDP, C-3), 144.7(HHDP, C-3’),136.0(HHDP, C-4),135.7(HHDP, C-4’),144.7(HHDP, C-5), 144.7(HHDP, C-5’),107.9(HHDP, C-6), 107.8(HHDP, C-6’).

根据1H 和 13C NMR数据与已经公开的文献（例如：Okuda, T., Yoshida, T.,Ashida, M., & Yazaki, K. Cheminform abstract: tannins of casuarina andstachyurus species. part 1. structures of pendunculagin, casuarictin, strictinin, casuarinin, casuariin, and stachyurin [J]. Cheminform, 1983, 14(48) :1765-1772；Michihata N, Kaneko Y, Kasai Y, et al. High-yield totalsynthesis of (-)-strictinin through intramolecular coupling of gallates [J].Journal of Organic Chemistry, 2013, 78(9):4319-28.）基本一致，确定化合物为Strictinin，其结构式如下。

实施例 2 体系5的HSCCC分离及分离效果

按上述体系5配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。下相流速2.0mL/min、主机转速850 rpm，柱温箱20℃，波长254nm，在该条件下固定相的保留率为45%，上样量280mg，收集175~185 min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得18.6mg化合物，HPLC检测结果目标组分纯度为92.3%。

实施例 3 体系6 HSCCC分离时上样量优化

按上述体系6配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。下相流速1.8mL/min、主机转速850 rpm，柱温箱20℃，波长254nm，在该条件下固定相的保留率为45%，上样量150mg，收集185~195 min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得15.6mg目标化合物，HPLC检测结果目标组分纯度为96.9%。

实施例 4 体系6 HSCCC分离时流动相流速优化

按上述体系6配置溶剂体系，充分混合，静置过夜，两相分离后超声脱气30min。下相流速1.6mL/min、主机转速850 rpm，柱温箱20℃，波长254nm，在该条件下固定相的保留率为48%，上样量180mg，收集202~215 min的流出液，55℃旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得17.1mg化合物，HPLC检测结果目标组分纯度为96.3%。

本申请中所举例说明的发明可适当地在不存在本文中未具体公开的任何要素、限制的情况下实施。因此，例如术语“包含/包括”等应理解为开放式的且没有限制。另外，本文中采用的术语和表达用作描述而非限制的术语，并且并非旨在使用排除所示出且描述的特征或其部分的任何等同特征的此类术语和表达，但是应认识到，在本发明所要求保护的范围可进行多种修改。因此，应理解，尽管已通过优选实施方案和任选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可采用本文中公开的其中体现发明的修改方案和变化方案，并且这样的修改方案和变化方案被认为在本发明的范围之内。

Claims

1.一种普洱消脂素的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

A．高速逆流上样原料的制备：

取白毛茶，粉碎过筛，加入蒸馏水超声提取和过滤1-3次，收集滤液，调节pH值3.0±0.1，以3-4 BV/h流速通过装有大孔吸附树脂的层析柱进行吸附，吸附后静置30min-60min，先用1-1.5 BV的水以4-6 BV/h的流速淋洗，然后用3-4 BV 质量浓度为20±5%的乙醇水溶液以2-4 BV/h的流速洗脱至洗脱液无色，收集乙醇洗脱液，浓缩后冷冻干燥，得白毛茶提取物；所述蒸馏水的用量为白毛茶的8~11倍；所述提取温度为40℃~60℃；

B.高速逆流色谱法分离：

按体积比（8±0.1）：（3.5±0.1）：（1±0.1）：（1±0.1）：（0.5±0.01）用量取0.02%三氟乙酸水溶液、正丁醇、甲基叔丁基醚、乙腈、乙酸乙酯作为两相溶剂体系，充分混合后静置过夜；高速逆流色谱法分离的上样量为150~300 mg；高速逆流色谱法分离的流动相的流速为1.75~1.85 mL/min；

两相分离后超声脱气，上相作固定相，下相作流动相，在流速1.6~2.0 mL/min、检测波长254nm条件下，将上述制得的白毛茶提取物进行高速逆流色谱分离，根据峰形收集175~215min流出液，将收集的流出液浓缩后干燥，得普洱消脂素；

所述白毛茶为湖南汝城白毛茶；所述普洱消脂素的结构式如下：

。

2.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

所述蒸馏水的用量为白毛茶的10倍。

3.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，加入蒸馏水超声提取3次，每次30min~60min。

4.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

加入10倍的蒸馏水50~60℃超声提取30±2min，过滤，滤渣再用8倍的蒸馏水超声提取2次，每次30±2min，合并滤液。

5.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

用盐酸调节pH值为3。

6.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

通过装有AB-8大孔吸附树脂的层析柱以3-4BV/h流速进行吸附。

7.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

高速逆流色谱分离时的主机转速850±50rpm，分离温度20±1℃。

8.根据权利要求1所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，

乙醇的浓度为20±1%。

9.根据权利要求1-8任一项所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，高速逆流色谱法分离的上样量为180~300 mg。

10.根据权利要求1-8任一项所述的普洱消脂素的制备方法，高速逆流色谱法分离的上样量为250±5 mg。

11.根据权利要求1-8任一项所述的普洱消脂素的制备方法，其特征在于，高速逆流色谱法分离的流动相的流速为1.8 mL/min。