JP2006506420A - 老化及びストレス調節用の薬学的に有用な新規ダウワーフェロモン化合物及びその分離精製方法 - Google Patents

Abstract

本発明はシーエレガンスの老化とストレスに関する一般式(1)を有する生理学的活性ダウワーフェロモン化合物の効果的な分離及び精製方法及びその構造決定を開示する。まず、シーエレガンスをエスベーサル液体倍地上で培養した後、液体培地をエタノールで完全に濃縮してエタノール抽出物を得、そして前記エタノール抽出物を酢酸エチルでまた抽出する。次に、シリカーゲル吸着クロマトグラフィーによって酢酸エチル抽出物から不純物を除し、多様な溶媒を溶出液として用いるアミンカラムクロマトグラフィー工程によってフェロモン抽出物を分離及び精製する。最後に、分子量の大きさを用いる高性能液体クロマトグラフィー段階を経て一般式(1)を有するフェロモン化合物を完全に分離及び精製する。

Description

本発明は新規ダウワーフェロモン及びその構造決定に関するもので、より詳しくはシーエレガンス（C.elegence）を長期休眠幼虫期（dauer larva stage）に誘導することができるダウワーフェロモンに関する。本発明は、また、生理学的活性のダウワーフェロモンを効果的に分離及び精製する新規方法及びその物質の構造決定に関する。

フェロモン（pheromones）は同種の他個体の間で作用する物質の総称である。フェロモンは一般的に有機溶媒抽出と液体カラムクロマトグラフィーを含む複雑な分離工程を通じて混合物の形態で得られる。

１９８０年代の初に、熱、餌の欠乏、群集密度のような生存環境の悪化によってシーエレガンスを長期休眠幼虫期（dauer larva stage）に誘導することができる、群集密度のインジケータとして作用する構成分泌物質である“ダウワーフェロモン”というフェロモンの一つの形態を分泌することができるシーエレガンスに対して報告された（Golden and Riddle 1982、Golden and Riddle 1984a、Golden and Riddle 1984ｃ）。しかし、このようなフェロモン物質の存在は既に知られているが、その構造、分子量及び物理的特性はまだ知られない（Riddle、D．L.,Science、218:558-580、1982）。

従来の研究を通じて報告されたことによると、シーエレガンス（C.elegans）から分泌されるフェロモンは非常に少量で存在する。シーエレガンスでの老化及びストレス調節の潜在的可能性のためにダウワーフェロモンは研究が多くなされた。しかし、現在までダウワーフェロモンを単一物質で得ることができないので、全ての研究者らはダウワーフェロモン及び他の化合物を含むものと信じられたシーエレガンスの粗抽出物を用いた。

従って、シーエレガンスの老化、ストレス及び他の細胞上機能の研究のためには、純粋なダウワーフェロモンを抽出物から分離し、その構造を決定することが必要である。ダウワーフェロモンはｄａｆ-１１を含むサイクリックＧＭＰ信号経路に結合する未知のフェロモン受容体として検出された（Birnyなど、2000）。シーエレガンスのダウワーフェロモンは非常に安定であって、疎水性であり、水酸化脂肪酸及び胆汁酸の特性と類似するクロマトグラフィー特性を有することが知られている。

本発明はシーエレガンスの特定ダウワーフェロモンの分離、精製及び同定に関して説明する。

本発明者らは老化、ストレス、信号伝達及びいろいろな生物学的な問題点に対する研究に用いられる新規ダウワーフェロモンを分離するために多年努力を重ねた。その結果、本発明者らはいろいろな疾病の好適動物モデルとして実験されたシーエレガンスから得られた抽出物が新規ダウワーフェロモンを含み、段階別分離工程に従う前記抽出物の分離により純粋ダウワーフェロモンが得られることを発見した。このような発見によって本発明は新規ダウワーフェロモンを提供する。

本発明の目的は、水、アルコル及び酢酸エチルからなる群より選ばれた一つまたはそれ以上の溶媒と、いろいろの溶媒を用いるクロマトグラフィー分離によるシーエレガンスの抽出物を含む新規ダウワーフェロモンを提供するものである。

本発明の他の目的は、一般式(1)で表される６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸またはその塩を提供するものである。

一般式(1)

本発明の他の目的は、６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸またはその塩及び薬学的に許容される担体を含有するダウワー誘導活性を有する組成物を提供するものである。

本発明の他の目的は、シーエレガンスの長期休眠状態を誘導し、または動物の老化過程を調節する医薬組成物を提供するものである。

本発明の他の目的は、いろいろなクロマトグラフィー工程を用いてダウワーフェロモンを分離及び精製する方法を提供するものである。

本発明の方法は次の段階を含む。
１）エスベーサル（S. basal）液体倍地上で大腸菌を餌で育てたシーエレガンスのエタノール抽出；
２）前記段階１で得られた抽出物の酢酸エチル抽出；
３）シリカゲル吸着クロマトグラフィーによって酢酸エチル分画から不純物除去；
４）アミン残基が結合されている高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってダウワーフェロモン分画抽出物を分離及び精製。

本発明の他の目的及び利点は次の説明によって充分に説明される。前記目的は本発明の適切な目的の中でいくつかを例示したもので、これらの目的は本発明を説明するためのものである。本発明に開示された範囲の中で本発明を他の形態に適用して、または変形することにより多い長所を得ることができる。従って、本発明は請求範囲に定義された範囲に加えて詳細な説明の実施例を考慮して理解されるべきである。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明によって分離されたフェロモンは次の 一般式(1)で表される６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸及びその塩である。前記 一般式(1)化合物はシーエレガンスを長期休眠幼虫期に著しく誘導する。

一般式(1)

前記一般式(1)化合物は薬学的に受容できる受容体または担体と共に薬学的組成物に形成されることができる。特に、前記組成物は動物の長期休眠状態の調節及び老化、ストレス、信号伝達、神経系疾病及び代謝系疾病のメカニズム研究のための多様な実験試薬として好ましく用いられることができる。

前記新規フェロモン化合物及びその塩は媒体に添加された時、シーエレガンスを長期休眠幼虫期に誘導できる生理学的な活性物質である。また、本発明の新規フェロモン化合物は前記一般式(1)を有し、その化学式が６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸である新規フェロモン化合物であることが明らかにされた。

本発明の第１目標は、シーエレガンスのダウワーフェロモンの高純粋単一分子を大量に得るもので、これは老化、信号伝達、代謝調節及びストレス研究に用いられることができる。本発明の第二目標は、その化学構造を決定し、分離された純粋ダウワーフェロモンが新規なのか、および多様な分析技術と生物学的分析を用いて生物学的機能性の長期休眠誘導化合物を含むのかを検証するものである。

本発明を通じて分離されて構造決定された前記フェロモン化合物及びその塩はダウワーフェロモン活性を現すシーエレガンスから分泌される化合物である。

多くの研究者によって老化、信号伝達及びストレスの研究において、現在に用いられるフェロモンの活性分画は培養されたシーエレガンスのエタノール抽出によって得られた組抽出物である。従って、本発明の純粋ダウワーフェロモンの活用性によってダウワーフェロモンが関与された老化、信号伝達及びストレスの研究ができる。

以下、本発明を望ましい実施例、図面及び表を通じてより具体的に説明する。ここに記載された実施例は本発明を説明するためのもので、本発明はこれに限定されなく、請求範囲及び基本的な発明の概念の内で多様に変更ができる。

実施例
エスベーサル（S basal）液体培地上で大腸菌（OP50）を餌としてシーエレガンスを２０℃で5日間培養した後、大腸菌を追加的に供給して10日以上培養した。

シーエレガンス（C.elegance）の長期休眠幼虫期の形成が７０％以上誘発された後に、培養液を得るために遠心分離を実施した。０．４５μmの膜フィルターを通じてシーエレガンスと大腸菌を完全に除去して液体状の培養液を得た。

前記培養液を減圧蒸発器を用いて水分を完全に除去して粉末状の培養液を得た。前記粉末状態の培養液にエタノールを添加してエタノールによる溶液の抽出をした。この過程を3回以上反復する。前記エタノール抽出物（Ａ）が長期休眠幼虫期を誘導するかを検査するために、エスベーサル培地上で培養されたシーエレガンスに長期休眠テストをした。

表１は前記エターノル抽出物（Ａ）の長期休眠誘導活性を現す。エタノール抽出物（Ａ）が長期休眠誘導活性を示すと、酢酸エチルで更に抽出する。即ち、乾燥エタノール抽出物を蒸留水に溶かして同量の酢酸エチルで抽出する。この抽出工程は5回反復する。

表２は酢酸エチル抽出物（Ｂ）のシーエレガンスに対する長期休眠誘導活性の分析結果を現す。前記酢酸エチル抽出物（Ｂ）の長期休眠誘導活性を確認した後、前記工程によって得られた抽出物を完全蒸発させた後、へキサン：酢酸エチル：メタノールを７：７：１比率に混合したシリカーゲル吸着クロマトグラフィーの上で分画を実施する。カラムに吸着されたダウワーフェロモン活性分画はメタノールを用いて溶出させる。

表３はシリカーゲル吸着クロマトグラフィーから得られた分画（Ｃ）の長期休眠誘導分析に対する結果を現す。分画（Ｃ）を更に精製するためにアミンカラムを用いる高性能液体分配クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を実施する。即ち、前記分画（Ｃ）はメタノールと蒸留水（ＭｅＯＨ：ｄｄＨ₂Ｏ＝１：１）に溶解される。前記分画（Ｃ）を含む溶液はイソプロパノールで満たされた（イソプロパノール：蒸留水＝１：１）アミンカラムを用いて分画を実施する。カラムに結合されたダウワーフェロモン分画（分画Ｄ）は同一な溶媒の傾斜溶離法によって溶出される。

表４はアミンカラムクロマトグラフィーの時間に従う溶媒組成である。

表５はアミンカラムクロマトグラフィーからの活性分画（Ｄ）を用いた長期休眠誘導分析結果を現す。

最後に、前記で得られた分画を溶出液としてメタノールを用いて分子大きさに従うアイソクラチック溶出法によってダウワーフェロモン分画（Ｅ）を完全に分離及び精製する。表６は純粋ダウワーフェロモンの長期休眠幼虫期の誘導活性に対する分析結果である。

前記のような工程によって分離された純粋ダウワーフェロモンは前記一般式(1)と同一な構造に決定され、その化学式は６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸またはそのナトリウム塩である。

前記６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸はさらに塩基と反応してその付加塩を形成することができる。前記塩基は薬製学的に許容されることができるアルカリ及びアルカリ土類金属塩である。例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、またはカルシウムが塩基として用いられる。

前記純粋ダウワーフェロモン、６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸の分子量は２７６ダルトンで、分子式はＣ₁₃Ｈ₂₄Ｏ₆である。しかし、精製された物資の分子量は生理活性を現すために非共有結合によって連結されている1分子のナトリウムを合わせて２９９ダルトンである。

このような純粋形態と分離形態の分子量の差異は四極子タンデム（quadrople tandem）質量分析器を用いて測定し、この時、ナトリウムの1分子が酸に非公有結合されている。また、純粋フェロモン化合物、６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸はアンモニウム塩になることもできるし、その分子量も２７６ダルトンに再確認された。

前記一般式(1)の新規フェロモンの化学構造を決定するために、水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）はデュートロメタノール（ＣＤ₃ＯＤ）を溶媒として測定した。そして、炭素核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ）もまたデュートロメタノール（ＣＤ₃ＯＤ）を溶媒として測定した。

ケミカルシフト(chemical shift)はピーピーエム（ＰＰＭ）単位にセットされた。明白な１Ｈ―と１３Ｃ−ＮＭＲケミカルシフトは１Ｈ−１Ｈ ＤＱＦ―ＣＯＳＹスペクトル、１３Ｃ−１Ｈ ＨＭＢＣのような二次元ＮＭＲ技術を用いて得られた。その結果は表７に示す。即ち、ダウワーフェロモンの１Ｈ ＮＭＲ（ＭＨｚ）、１３Ｃ ＮＭＲ（ＭＨｚ）スペクトル分析結果は、その分子式が６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸であることを確認した。

以上で説明した通り、本発明はシーエレガンス（C.elegans）から分泌される新規ダウワーフェロモン化合物を得て、その化学式が多様な塩の形態に存在する６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸であることを決定した。フェロモンによって誘発される生体内老化、信号伝達、ストレス、代謝経路、肥満、神経器官の障害と関連された薬物の開発研究に多い効果を得ることができる。

本発明のフェロモン化合物をシーエレガンスから分離精製する方法を段階的に示した図面である。 イソプロパノールと蒸留水を溶媒として傾斜溶離法を実施したアミン高性能液体分配クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。 メターノルを溶媒としてアイソクラチック溶出法を実施した分子量の大きさ別（Ｗ２５１）高性能液体分配クロマトグラフィーの結果を示すグラフである。 デュートロメタノール（ＣＤ₃ＯＤ）を溶媒として測定した水素核磁気共鳴スペクトル（１Ｈ−ＮＭＲ）のグラフである。 デュートロメタノール（ＣＤ₃ＯＤ）を溶媒として測定した炭素核磁気共鳴スペクトル（１３Ｃ−ＮＭＲ）のグラフである。 四極子方式の質量分析器を用いてポジティブモードで質量を測定した結果を示すグラフである。 四極子方式の質量分析器を用いてポジティブモードで質量を測定する時、フェロモンに酢酸ナトリウムを添加した後に質量を測定した結果を示すグラフである。 四極子方式の質量分析器を用いてネガティブモードで質量を測定した結果を示すグラフである。

Claims (12)

1. 一般式(1)で表されるダウワーフェロモン化合物またはその塩。
   

   

   一般式(1)
2. 前記フェロモン化合物が,６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ)−ヘプタン酸である請求項１記載のダウワーフェロモン化合物またはその塩。
3. 前記塩が,６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸ナトリウム塩である請求項１記載のダウワーフェロモン化合物またはその塩。
4. ６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸とアルカリ又はアルカリ土類金属塩基とを反応させてその付加塩を形成する請求項１記載のダウワーフェロモン化合物またはその塩。
5. 前記ダウワーフェロモンが、水、アルコル及び酢酸エチルからなる群より選ばれた一つまたはそれ以上の溶媒、及び希釈剤として種々の溶媒を用いるクロマトグラフィー分離によるシーエレガンスの抽出物を含む請求項１記載のダウワーフェロモン化合物またはその塩。
6. ６−（３、５−ジヒドロキシ−６−メチル−テトラヒドロ−ピラン−２−イルオキシ）−ヘプタン酸またはその塩及び薬学的に許容される担体を含有する、長期休眠幼虫期誘導活性を有する医薬組成物。
7. 前記組成物が、シーエレガンスの長期休眠状態を誘導し、または動物の老化状態を調節する請求項６記載の医薬組成物。
8. エタノールでシ―エレガンスの総培養液を抽出する段階（分画Ａ）；
   エタノール抽出物（分画Ａ）を水に溶解した後、酢酸エチルで抽出して分画Ｂを抽出する段階；
   シリカゲル吸着クロマトグラフィーによって分画Ｂから不純物を除去する段階（分画Ｃ）；
   アミンカラムを用いる高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって分画Ｃを分離及び精製して分画Ｄを得る段階；
   前記分画Ｄを分子サイズ排除カラムを備えた高性能液体クロマトグラフィー（ＨＬＰＣ）によって精製して純粋ダウワーフェロモ化合物を得る段階を含む、一般式(1)で表されるダウワーフェロモ化合物またはその塩の分離及び精製方法。
   

   

   一般式(1)
9. 前記不純物除去段階が、シリカゲル吸着カラムクロマトグラフィーを用いるヘキサン：酢酸エチル：メタノール溶媒＝７：７：１の成分で不純物を除去し、メタノールを用いてシリカゲル吸着カラムクロマトグラフィーから部分精製されたフェロモン分画を溶出させる請求項８記載の分離及び精製方法。
10. メタノールで溶出された部分精製状態のフェロモン誘導体をアミンカラムを有する高性能液体クロマトグラフィーによってイソプロパノールと蒸留水の溶媒組成を用いた傾斜溶離法で分離及び精製してフェロモン分画を得る請求項９記載の分離及び精製方法。
11. 生理学的活性フェロモン化合物が、メタノール溶媒を用いたアイソクラチック溶出法で分子量の大きさ別にフェロモン分画を分離するカラム（Ｗ２５１）を有する高性能液体クロマトグラフィーによって分離される請求項８記載の分離及び精製方法。
12. 老化、信号伝達及びストレス関連疾患調節剤として用いるための一般式(1)で表されるダウワーフェロモン化合物またはその塩の使用。
    

    

    一般式(1)
    

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