JP2014522882A - 線虫を防除するための低分子化合物 - Google Patents

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ボイス トンプソン インスティチュート フォー プラント リサーチ
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Abstract

本発明は、線虫のシグナル伝達に関与する化合物に関する。
【選択図】 なし

Description

本出願は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれている、2011年8月8日出願の米国仮特許出願第61/521,295号及び2012年4月4日出願の米国仮特許出願第61/620,348号の利益を主張する。
本発明は、米国国立衛生研究所により供与された助成金番号GM088290、GM085285及びT32GM008500のもと、米国政府の支援によりなされたものである。米国政府は、本発明においてある種の権利を保有する。
本発明は、線虫のシグナル伝達に関与する低分子化合物に関する。
種の個体間の情報交換は、化学的、機械的、聴覚的又は視覚的なキューを含む、いくつかの様々な感覚入力に依存している(EDWARD O. WILSON、SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS(25周年記念版、2000年))。化学的シグナル伝達は、恐らく生物間の情報交換の最古の形態であり(EDWARD O. WILSON、SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS(25周年記念版、2000年)、Wyatt、Nature 457巻、262〜63頁(2009年))、生物が媒介する化学的シグナル及び行動は、種内及び種間の相互作用の生態学的並びに進化的力学を理解するために非常に重要である。
線虫は、個体数により世界中で最も存在量の多い動物の1つである(SIEVERT LORENZEN: THE PHYLOGENETIC SYSTEMATICS OF FREELIVING NEMATODES(The Ray Society, London、1994年))。線虫は、亜硫酸性堆積物、深海海溝、哺乳動物、昆虫、植物、北極の氷、及び他の多くの生息場所に生息しており、これにより地球上の動物の中で最も成功を収めたグループの1つになっている(Nussbaumerら、Aquat. Microb. Ecol. 34巻、239〜46頁(2004年)、ISTVAN ANDRASSY: EVOLUTION AS A BASIS FOR THE SYSTEMATIZATION OF NEMATODES(Budapest、1976年)、Tietjen、Deep-Sea Res. 36巻、1579〜94頁(1989年)、Aben-Athar、Rev. Bras. Med. 2巻、89〜94頁(1951年)、Lutz、Weitere Mittheilungen 3巻、425〜28頁(1888年)、Blaxter、Science 282巻、2041〜46頁(1998年))。根、細菌、砂、寒天藻、及び腸において発見された仲間などの多くの線虫の行動が研究されてきた(DONALD L. LEE: THE BIOLOGY OF NEMATODES(CRC Press、London、2002年))。線虫フェロモン系に関しては、ほとんど知られていない。線虫フェロモンを同定しようとする試みが多数存在したが(DONALD L. LEE: THE BIOLOGY OF NEMATODES(CRC Press、London、2002年))、同定は、わずか数種において成功しているに過ぎない(Jaffeら、J. Chem. Ecol.、15巻、2031〜43頁(1989年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 7巻、420〜22頁(2007年)、Pungaliyaら、PNAS 19巻、7708〜13頁(2009年))。
自由生活性線虫C.エレガンス(C. elegans)が、食料調達、個体群密度の感知、交尾、及び集団形成などの社会行動に関するモデル系として広く使用されている(de Bono & Maricq、Annu. Rev. Neurosci.、28巻、451〜501頁(2005年))。ヘテロラブディティス属種(Heterorhabditis spp.)及びステイネルネマ属種(Steinernema spp.)などの昆虫病原性線虫(EPN)は、共生細菌の助けを得て、宿主を死滅させて食する偏性昆虫寄生生物である(Kaya & Gaugler、Annu. Rev. Entomol. 38巻、181〜206頁(1993年))。C.エレガンスは、植物性材料を分解する際に通常発見される(Barriere & Felix、Curr. Biol. 15巻、1176〜84頁(2005年))。C.エレガンスは、標準的実験室条件下では、3.5日以内にそのライフサイクルを完了する。条件が、高温、高密度、又は低食物利用度などの正常な成長及び発達にとって不都合な場合、この線虫は、耐久型幼虫(或いは、第3齢幼虫)を形成する。食物を摂取せず、且つストレスの多い条件に耐性を示すこの特殊な生活段階は、(Golden & Riddle、Dev. Biol. 102巻、368〜78頁(1984年)、Golden & Riddle、Science 218巻、578〜80頁(1982年)、Golden & Riddle、PNAS 81巻、819〜23頁(1984年))は、正常な成長及び発達に不都合な条件で生存するために同様に適合する昆虫病原性線虫のIJ、及び植物寄生性ネコブ線虫の第2幼体段階(J2)に類似している(PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY(WormBook版、The C. elegans Research Community、2006年))(メロイドギネ属種(Meloidogyne spp))。食物源が欠乏するか又は過密になると、昆虫病原性線虫の感染態幼体(IJ)及び自由生活性線虫のカエノラブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)の耐久型幼虫は、分散行動を示す(Golden & Riddle、Dev. Biol. 102巻、368〜78頁(1984年)、Rolstonら、J. Nematol.、38巻、221〜28頁(2006年)、Abebeら、J. Exp. Biol. 213巻、3223〜29頁(2010年))。
C.エレガンスに関すると、初期の幼虫段階(L1)から耐久型幼虫段階への移行は、ダウモンと呼ばれるフェロモンによって調節される(Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年))。ダウモンの同定に続いて、多くの関連化合物がC.エレガンスにおいて発見されている(Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年)、Butcherら、PNAS 105巻、14288〜92頁(2008年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、ButcherらOrg. Lett. 11巻、3100〜03頁(2009年)、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、von Reussら、J. Am. Chem. Soc. 134巻(3号)、1817〜24頁(2012年))。これらの化合物はすべて、珍しいジデオキシ糖アスカリロースを有しており、グループとしてアスカロシドと呼ばれる。
C.エレガンスにおける研究により、この低分子フェロモンのファミリーが、性特異的誘引、忌避、集団形成、嗅覚可塑性、及び耐久型幼虫(ストレス耐性生活段階)への移行を調節することが示され、アスカロシドがC.エレガンスの広範囲にわたる行動を媒介することがまとめて実証された(Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Yamadaら、Science 329巻、1647〜50頁(2010年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))。アスカロシドは、他のいかなる動物門にも依然として発見されていないので(Bartleyら、J. Nat. Prod. 59巻(10号)、921〜26頁(1996年))、アスカロシドは、複数の線虫種にとって重要なキューを調節することができる、線虫に特異的な化学的暗号を含み得る。しかし、C.エレガンスの生物学の多くの見地にとって重要であるにもかかわらず、アスカロシドの構造、生合成、及びホメオスタシス、並びにアスカロシドを産生することができる程度、及び/又はアスカロシドが他の線虫に影響を及ぼし得る程度に関する理解は依然として不完全であった。
本発明は、当技術分野において、これらのこと及び不足しているその他のことを克服することを対象としている。
本発明の1つの態様は、式Iの単離化合物に関する
Figure 2014522882
(式中、
R1は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R1'は、存在しないか、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R2は、式
Figure 2014522882
(式中、
各R1は、独立して、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
n1、n2、及びn3は、各々独立して、0〜30の整数であり、
n4は、1〜30の整数であり、
n1、各n2、及び各n3の合計は、1〜30である)
の部分であり、
R3及びR4は、各々独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR5に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
各R5は、独立して、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、このアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数である)
であって、
但し、この化合物は、ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#4、ascr#5、ascr#6.1、ascr#6.2、ascr#7、ascr#8、ascr#12、ascr#19、ascr#21、ascr#23、ascr#25、bhas#24、bhas#26、bhas#28、bhas#30、及びicas#9ではない)。これらの単離化合物には、式I'及び式I"
Figure 2014522882
のものが含まれる。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖を含む単離化合物に関する。これらの少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖が、共有結合により連結されている。本化合物は、約2,000g/mol未満の分子量を有する。
(A〜E)インドールアスカロシドが、C.エレガンスの雌雄同体及び雄を誘引することを示す図である。図1Aは、蠕虫において、誘引行動を測定するために使用したバイオアッセイの略図である。ゾーンAは、試料溶液又は対照溶液が施用される領域である。Xは、アッセイされる蠕虫の最初の位置を意味する。図1Bは、四分円化学走性アッセイの略図である。Xは、被洗浄蠕虫がアッセイの最初に置かれる場所を意味する。四分円板の陰影領域は、化学物質を含有している寒天を示している一方、白色領域は対照寒天を意味する。各四円分における動物数を30分後に数え、化学走性指数を計算した(実施例9を参照されたい)。略図についての化学走性指数は0.84である。図1Cは、そのicas#1、icas#3、及びicas#9が、C.エレガンスの雌雄の両方に対して誘引性であることを示している。N2雌雄同体及びhim-5雄を使用して、3つの化合物のすべてを1pmolでアッセイした。白色棒は化合物を含まない(溶媒ビヒクル)対照である。図1Dは、スポット誘引アッセイにおいて、N2雌雄同体及びhim-5雄に対するicas#3応答が用量依存性であることを示す図である(*p<0.01、**p<0.001、***p<0.0001、ウェルチ(welch's)補正による独立t検定)。図1Eは、四分円化学走性アッセイにおけるN2雌雄同体に関するicas#3誘引の用量依存性グラフである(ダンネット(Dunnett's)の事後検定による一元配置ANOVA、**p<0.01)。 (A〜E)N2雌雄同体におけるicas#3に対する応答は、ASK感覚ニューロン及び下流のAIA介在ニューロンにより媒介されることを実証するグラフである。図2Aは、ASK感覚ニューロンの他のニューロンへの接続の略図である。ASKの主要なシナプスの出力は、AIA介在ニューロンである。図2Bは、icas#3への雌雄同体の誘引が、ASK感覚ニューロン及びAIA介在ニューロンに依存することを示している。RMG介在ニューロンの除去は、icas#3に対するN2又はncs-1:: gfp雌雄同体の誘引に影響を及ぼさない(ウェルチの補正によるスチューデント(Student's)独立t検定、*p<0.01、***p<0.0001)。図2Cは、低蠕虫密度(1枚のプレートあたり蠕虫20匹)における、N2及びASK除去済み雌雄同体の集団形成を示すグラフである。ASK除去済み蠕虫は、icas#3に応答して集団形成をしない。icas#3は、AIA介在ニューロンにおいて、G-CaMP蛍光シグナルを誘発する(図2D)。色付き跡は、1μMのicas#3に暴露した際の、個々の動物のAIAニューロンの蛍光変化を表している。黒い跡は、緩衝液に暴露した際の個々の動物の蛍光変化を表している。灰色の陰は、icas#3、n=10の動物の存在を示している。図2Eは、緩衝液又はicas#3のいずれか一方に暴露した動物における平均AIA蛍光変化を示すグラフである(**p<0.01、ウェルチの補正によるスチューデント独立t検定)。エラーバーは、平均値の標準誤差(S. E. M)を示している。 (A〜D)社会型及び単独型の野生型雌雄同体は、icas#3に誘引されるが、非インドールアスカロシドには誘引されないことを示す図である。単独型及び社会型の野生型雌雄同体は、npr-1(ad609)突然変異蠕虫とは対照的に、スポット誘引アッセイにおいてascr#2、3、5の生理混合物に誘引されない(図3A)(***p<0.0001、ウェルチの補正による独立t検定)。四分円化学走性アッセイでは、npr-1(ad609)突然変異蠕虫(これらは、ascr#2、3、5のブレンドにも誘引される)を除いて、試験した株に由来するすべての雌雄同体は、1pMのicas#3に誘引され、非インドールアスカロシド(ascr#2、3、5は10nM)の生理混合物により忌避する(図3B)(30分後の化学走性(15分後における化学走性指数に関しては、図5Cを参照されたい)。図3Cは、四分円化学走性アッセイにおける、社会型の雌雄同体に対するicas#3誘引の用量依存性グラフである。図3B〜C: *p<0.05、**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA。図3Dは、スポット誘引アッセイにおいて、社会型の野生型雌雄同体及びnpr-1(ad609)突然変異蠕虫が、icas#3に誘引されていることを示している(**p<0.001、***p<0.0001、ウェルチの補正による独立t検定)。 (A〜C)シグナル伝達分子のモジュール言語のための新生モデルに関する図である。図4Aは、icas#3及びascr#3がN2雌雄同体に対する競合シグナルであることを示している。120fmolのascr#3と10fmolのicas#3の混合物(条件1)は、蠕虫をゾーンAに誘引する一方、同じ比の多量の混合物(条件2、12pmolのascr#3及び1pmolのicas#3)はゾーンAから蠕虫を阻み、代わりに周囲に誘引する(ゾーンB及びC)。条件2の実験では、たった1匹の蠕虫が処理済みゾーンAに進入した一方、31匹の蠕虫は、対照ゾーンAに進入した(***p<0.0001、ウェルチの補正によるスチューデント独立t検定)。図4Bは、非インドールアスカロシドの相乗的ブレンドが、ナノモル濃度からマイクロモル濃度で耐久型幼虫を誘発し、ピコモル濃度からナノモル濃度において雄の誘引物質として機能する一方、インドールアスカロシドicas#3及びicas#9は、フェントモル濃度からピコモル濃度において、雌雄同体の誘引物質及び集団形成シグナルとして作用することを示している。図4Cは、トリプトファン(「先端基」)、脂肪酸(「脂質側鎖」)、p-アミノ安息香酸(PABA、「末端」)、及び炭水化物代謝(「アスカリロース」)から誘導されたビルディングブロックに基づく、C.エレガンスのシグナル伝達分子のモジュール組立物を示している。 (A〜B)インドールアスカロシドが、雌雄同体の強力な誘引物質であることを示す図である。スポット誘引アッセイでは、N2雌雄同体は、低濃度のicas#9に強く誘引される一方、雄は誘引されない(***p<0.0001、ウェルチの補正によるスチューデント独立t検定)(図5A)。図5Bは、食物を含むか又は含まない1pMのicas#3を含有しているプレート上のN2及びCB4856雌雄同体の四分円化学走性指数のグラフである。四分円化学走性アッセイでは、npr-1(ad609)突然変異蠕虫(これは、ascr#2、3、5のブレンドにも誘引される)を除いて、1pMのicas#3に誘引されるが、非インドールアスカロシド(ascr#2、3、5は各々10nM)の生理混合物により忌避される(図5C)(15分後の化学走性(30分後における化学走性指数に関しては、図3Bを参照されたい)、*p<0.05、**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA)。 (A〜E)icas#3に応答する、集団形成及び移動性の変化に関する図である。図6Aは、低蠕虫密度(5cmプレートあたり20匹の蠕虫)におけるicas#9プレート上の単独型及び社会型の雌雄同体の集団形成行動を示す(*p<0.05、**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA)。図6Bは、100fM又は100pMのicas#3を含有しているプレート上のhim-5雄の集団形成を示す(**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA)。図6Cは、スポット誘引アッセイにおいて、daf-22雌雄同体がicas#3に誘引されることを示している(*p<0.01、**p<0.01、***p<0.0001、ウェルチの補正によるスチューデント独立t検定)。図6Dは、様々なicas#3濃度における、N2雌雄同体の前方向の速度(蠕虫が前進する間の蠕虫の速度)を示している。図6Eは、様々なicas#3濃度における、N2雌雄同体の1分あたりの反転数を示している。図6D〜E: *p<0.05、**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA。 (A〜B)ASK除去が、雌雄同体のicas#3依存性移動行動に影響を及ぼすことを示している図である。ASK除去済み雌雄同体は、icas#3への暴露に際し、前進速度が低下しないことを示している(図7A)。ASK除去済み蠕虫の反転頻度は、icas#3に応答して増加しない(図7B)。**p<0.001、ウェルチの補正による独立t検定。 (A〜D)インドールアスカロシドは、C.エレガンスにおける集団形成行動を媒介することを示す図である。図8Aは、低蠕虫密度(1枚のプレートあたり20匹の蠕虫)において、異なる濃度のicas#3に対する、単独型及び社会型の雌雄同体の集団形成行動を示している。図8Bは、高蠕虫密度(1枚のプレートあたり約120匹の蠕虫)において、異なる濃度のicas#3に対する、単独型及び社会型の雌雄同体の集団形成行動を示している。図8Cは、低蠕虫密度における、2つの異なるicas#3濃度に対するdaf-22雌雄同体の集団形成を示している。図8Dは、様々なicas#3濃度における、N2雌雄同体の平均停止期間を示している。図8A〜D: *p<0.05、**p<0.01、ダンネットの事後検定による一元配置ANOVA。 (A〜G)daf-22依存性代謝物としてのインドールアスカロシドの同定に関する図である。図9Aは、重要なアスカロシドの化学構造(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年))を示している。図9Bは、2D-NMR分光法による層別解析(DANS)の略図である。野生型のNMRスペクトルとdaf-22突然変異体のNMRスペクトルとの比較により、daf-22-依存性シグナル伝達分子を表し得る分光学的シグナルの検出が可能になった。図9Cは、DANSのために使用した、野生型及びdaf-22の実際のNMRスペクトルの小区域である。インドールカルボン酸のシグナルは、両方のスペクトル(各図の左枠)に存在する一方、別のインドール由来のシグナル(各図の右枠)は野生型のスペクトルにしか存在しておらず、daf-22のスペクトルには存在していない(図9Dは、野生型及びdaf-22のメタボロームのHPLC-MSに基づく比較である)。野生型について得られたイオンクロマトグラムは、daf-22のクロマトグラムには存在していない5本の異なるインドールアスカロシドの分子イオンに関するピークを示している。図9Eは、同定されているインドールアスカロシドの構造を示している。図9Fは、本研究で同定した追加の非インドールアスカロシドの構造を示している。図9Gは、培地抽出物のHPLC-MS分析により測定した、C.エレガンスN2によって分泌された、液体培養物中のインドールアスカロシドであるicas#3とicas#9と、非インドールアスカロシドであるascr#3とascr#9との相対量を示すグラフである(ascr#3の濃度に正規化した。n=5、±SEM)。インドール及び非インドールアスカロシドの質量分光法により定量するため、標準参照化合物の標準混合物を使用した。 daf-22依存性インドール誘導体(枠)を含有している野生型(N2)のメタボロームのフラクションのdqfCOSY NMRスペクトル(CDCl3、600MHz)の中央区域の図である。 (A〜C)1H NMRスペクトル(CD3OD、600MHz)(図11A)、1H、13C-HSQCスペクトル(CD3OD、600MHz)(図11B)、及び合成icas#3の1H、13C-HMBCスペクトル(CD3OD、600MHz)(図11C)を示す図である。 図１１Ａ−Ｂの続きである。 (A〜E)インドールアスカロシドのHPLC-MS同定に関する図である。それらは、icas#9、icas#7、icas#1、icas#3及びicas#10のエレクトロスプレーイオン化MSスペクトル(ネガティブイオンモード)をそれぞれ示している。 (A〜H)インドールアスカロシドの生合成起源のHPLC-MS分析に関する図である。それらは、L-[2,4,5,6,7-D5]-トリプトファンと、icas#9(図13A〜B)、icas#1(図13E〜F)、icas#3(図13C〜D)、及びicas#10(図13G〜H)の[D5]-並びに[H]-アイソトポマーをそれぞれ示すL-トリプトファンとの1:1混合物を含むCeMM培地で培養したC.エレガンスの全身抽出物のHPLC-MSイオンクロマトグラム(ネガティブイオンエレクトロスプレーイオン化及び単一イオン記録モードを使用することにより取得)を示している。 (A〜B)インドールアスカロシドはやはり、C.エレガンスにおける集団形成行動を媒介することを示す図である。図14Eは、対照プレート上の行動と比較した、10pMのicas#3を含有しているプレート上のN2雌雄同体(1枚のプレートあたり20匹の蠕虫)の集団形成(矢印)を示している。図14Fは、対照プレート上の行動と比較した、1pMのicas#3を含有しているプレート上のN2雌雄同体(1枚のプレートあたり約120匹の蠕虫)の集団形成を示している。 (A〜B)5-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ペンタン酸メチル(3)の1H NMRスペクトル(図15A)及び13C NMRスペクトル(図15B)の図である。1H NMR: 400MHz、アセトン-d6; 13C NMR: 100MHz、アセトン-d6。 図１５Ａの続きである。 (A〜B)5-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ペンタン酸(oscr#9)の1H NMRスペクトル(図16A)及び13C NMRスペクトル(図16B)の図である。1H NMR: 400MHz、メタノール-d4; 13C NMR: 100MHz、メタノール-d4。 (A〜B)9-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸メチル(5)の1H NMRスペクトル(図17A)及び13C NMRスペクトル(図17B)の図である。1H NMR: 400MHz、アセトン-d6; 13C NMR: 100MHz、アセトン-d6。 (A〜B)9-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸(oscr#10)の1H NMRスペクトル(図18A)及び13C NMRスペクトル(図18B)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; 13C NMR: 100MHz、メタノール-d4。 (8R)-ヒドロキシ-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシノナン酸エチル(9)の1H NMRスペクトル(500MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (8R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシノナン酸エチル(10)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (A〜D)(8R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシノナン酸(bhas#10)の1H NMRスペクトル(図21A)、13C NMRスペクトル(図21B)、HSQCスペクトル(図21C)、及びHMBCスペクトル(図21D)の図である。1H NMR: 500MHz、メタノール-d4; 13CNMR: 125MHz、メタノール-d4; HSQC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4; HMBC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4。 図２１Ａ−Ｂの続きである。 (A〜B)(8R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-1-エン(12)の1H NMRスペクトル(図22A)及び13C NMRスペクトル(図22B)の図である。1H NMR: 400MHz、アセトン-d6; 13C NMR: 100MHz、アセトン-d6。 (12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシトリデカ-5-エノン酸エチルエステル(13)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシトリデカン酸エチルエステル(14)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシトリデカン酸エチルエステル(15)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (A〜D)(12R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシトリデカン酸(bhas#22)の1H NMRスペクトル(図26A)、dqfCOSYスペクトル(図26B)、HSQCスペクトル(図26C)、及びHMBCスペクトル(図26D)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4; HSQC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4; HMBC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4。 図２６Ａの続きである。 図２６Ｂ−Ｃの続きである。 (A〜B)11-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ウンデカ-1-エン(17)の1H NMRスペクトル(図27A)及び13C NMRスペクトル(図27B)の図である。1H NMR: 400MHz、アセトン-d6; 13C NMR: 100MHz、アセトン-d6。 図２７Ａの続きである。 15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシペンタデカ-5-エノン酸エチルエステル(18)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシペンタデカン酸エチルエステル(19)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシペンタデカン酸エチルエステル(20)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d1)の図である。 (A〜D)15-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシペンタデカン酸(bhos#26)の1H NMRスペクトル(図31A)、dqfCOSYスペクトル(図31B)、HSQCスペクトル(図31C)、及びHMBCスペクトル(図31D)の図である。1H NMR: 400MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4; HSQC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4; HMBC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4。 図３１Ａ−Ｂの続きである。 (A〜D)9-(5'R-(1H-インドール-3-カルボニルオキシ)-3'R-ヒドロキシ-6'S-メチル-テトラヒドロ-(2H)-ピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸(icos#10)の1H NMRスペクトル(図32A)、dqfCOSYスペクトル(図32B)、HSQCスペクトル(図32C)、及びHMBCスペクトル(図32D)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4; HSQC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4; HMBC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4。 図３２Ａ−Ｂの続きである。 (A〜B)4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ安息香酸(22)の1H NMRスペクトル(図33A)及び13C NMRスペクトル(図33B)の図である。1H NMR: 400MHz、クロロホルム-d1; 13C NMR: 100MHz、クロロホルム-d1。 (A〜C)(8R)-(3'R-ヒドロキシ-5'R-(4-ヒドロキシベンゾイルオキシ)-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-(2E)-エノン酸(hbas#3)の1H NMRスペクトル(図34A)、dqfCOSYスペクトル(図34B)、及びHMBCスペクトル(図34C)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4; HMBC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4。 図３４Ａ−Ｂの続きである。 (A〜B)(8R)-(3'R-ヒドロキシ-5'R-(E)-(2-メチルブト-2-エノイルオキシ)-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-(2E)-エノン酸(mbas#3)の1H NMRスペクトル(図35A)、及びdqfCOSYスペクトル(図35B)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4。 図３５Ａの続きである。 (A〜D)2-(8R)-(3'R,5'R-ジ-ヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナノイル-3,4,5-トリヒドロキシ-6-ヒドロキシメチル-(2H)-テトラヒドロピラン(glas#10)の1H NMRスペクトル(図36A)、dqfCOSYスペクトル(図36B)、HMQCスペクトル(図36C)、及びHMBCスペクトル(図36D)の図である。1H NMR: 600MHz、メタノール-d4; dqfCOSY: 600MHz、メタノール-d4; HMQC: 1Hは600MHz、13Cは151MHz、メタノール-d4; HMBC: 600MHz、メタノール-d4。 図３６Ａの続きである。 図３６Ｂ−Ｃの続きである。 (A〜K)、以下のHPLC-ESI-MSデータを示す図である。(ω-1)-酸素化アスカロシド(ascr)(図37A)、(ω)-酸素化アスカロシド(oscr)(図37B)、(ω-1)-酸素化β-ヒドロキシアスカロシド(bhas)(図37C)、(ω)-酸素化β-ヒドロキシアスカロシド(bhos)(図37D)、(ω-1)-酸素化インドールアスカロシド(icas)(図37E)、(ω)-酸素化インドールアスカロシド(icos)(図37F)、(ω-1)-酸素化インドールβ-ヒドロキシアスカロシド(ibha)(図37G)、(ω)-酸素化インドールβ-ヒドロキシアスカロシド(ibho)(図37H)、グルコシルアスカロシドエステル(glas)(図37I)、ascr#8及び4-(4-ヒドロキシベンゾイル)-並びに4-(2-(E)-メチル-2-ブテノイル)-アスカロシド(hbas及びmbas)(図37J)、並びにascr#2及びascr#6.1(図37K)。*=合成基準品を使用して確認した; $SMID: C.エレガンス及び他の線虫から同定した低分子に関する低分子識別名(Small Molecule IDentifier)SMIDデータベース(www. smid-db. org)は、Wormbase(www. wormbase. org)と共同してBoyce Thompson InstituteのFrank C. Schroeder及びLukas Muellerにより維持されている電子資料である。このデータベースの目的は、C.エレガンス及び他の線虫から新規に同定されたすべての低分子に関して、検索可能な遺伝子形式の識別名「SMID」を導入することである。 図３７Ａの続きである。 図３７Ｂ−Ｃの続きである。 図３７Ｄ−Ｅの続きである。 図３７Ｆ−Ｇの続きである。 図３７Ｈ−Ｊの続きである。 C.エレガンスの野生型及び突然変異体のエクスクレトーム(excretome)抽出物中の、同定したアスカロシドのHPLC溶出プロファイル示す図である(Δは、(E)-配置のα,β-不飽和側鎖を有する成分を示している)。 (A〜B)アスカリロース環及び側鎖のメチル基(青色)、チグリン酸エステル単位のアリル位メチル基(赤色)に関する特有のシグナル、並びに側鎖二重結合のpH依存性シグナル(緑色)を示す、野生型C.エレガンス培地抽出物(図39A)由来のmbas#3が豊富なフラクション、及び合成mbas#3(図39B)のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の断面を示す図である。 (A〜B)アスカリロース環及び側鎖のメチル基(青色)、パラ置換4-ヒドロキシベンゾイル単位(赤色)、並びに側鎖二重結合(緑色)に関する特有のシグナルを示す、野生型のC.エレガンス培地抽出物(図40A)由来のhbas#3が豊富なフラクション、及び合成hbas#3(図40B)のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の区域を示す図である。 (A〜B)アスカリロース環のメチル基(青色)及びアスカリローススピン系(黒色)に関する特有のシグナルを示す、野生型のC.エレガンス培地抽出物(図41A)由来のhbas#3が豊富なフラクション、及び合成hbas#3(図41B)のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の拡大区域を示す図である。 acox-1(ok2257)の培地抽出物由来のoscr#9が豊富なフラクションのdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)を示す図である。 (A〜B)アスカリロース環及び側鎖のメチル基(青色)、グルコース単位のアノマー水素(赤色)、グルコーススピン系(緑色)、並びにアスカリローススピン系(黒色)に関する特有のシグナルを示す、acox-1(ok2257)蠕虫ペレット抽出物(図43A)由来のglas#10が豊富なフラクション、及び合成glas#10(図43B)のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の区域を示す図である。 (A〜P)アスカロシド標準品のMS/MS生成イオンスペクトルを示す図である。ascr#5は、アスカリロースについてm/z147[C6H11O4]、及びC3側鎖についてm/z73、並びに/又は同一分子組成のアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントを示している(図44A)。oscr#9(図44B)及びascr#9(図44C)は、C5側鎖についてm/z99[C5H7O2]、m/z147[C6H11O4]、及びアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73を示す。ascr#7は、C7側鎖についてのm/z125[C7H9O2]、m/z111[C6H7O2]、及びアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73を示す(図44D)。ascr#1は、C7側鎖についてm/z127[C7H11O2]、及びアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73を示す(図44E)。ascr#3は、m/z111[C6H7O2]、及びアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73を示す(図44F)。ascr#10(図44G)及びoscr#10(図44H)は、C9側鎖についてm/z173[C9H15O3]及び155[C9H13O2]、並びにアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73を示す。bhas#22(C13側鎖)(図44I])及びbhos#26(C15側鎖)(図44J])などのβ-ヒドロキシアスカロシドは、それぞれm/z185[C11H21O2]及びm/z213[C13H25O2]において側鎖に特有のフラグメントイオンを示しており、これらはアスカリロース及び酢酸が失われたことに起因している。さらに、bhas#22及びbhos#26は、酢酸についてm/z59[C2H3O2]において強度の強い生成物イオン、及びアスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73に特徴的なイオンを示す。icas#9(図44K])及びicas#1(図44L])などのインドールアスカロシドは、m/z247[C11H19O6]及びm/z275[C13H23O6]にそれぞれ対応するアスカロシドについて側鎖に特有のフラグメントイオンを示し、これらは、インドールカルボニル単位[C9H5NO]が失われたことに起因する。さらに、icas#9及びicas#1は、インドールカルボン酸イオンについてm/z160の[C9H6NO2]を示す。インドールアスカロシドのアスカロシド生成物イオンは、アスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73の特徴的なフラグメントイオンなどの非インドールアスカロシドのフラグメンテーションパターンに対応するさらなるフラグメントイオンを示す。icas#3(図44M])は、インドールカルボン酸イオンについてのm/z160[C9H6NO2]に加えて、インドールカルボニル単位[C9H5NO]が失われたことに由来するm/z301[C15H25O6]を示す。mbas#3(図44N])は、m/z301[C15H25O6]、及びm/z283[C15H23O5]を示し、これらは、チグロイル[C5H6O]及びチグレート[C5H8O2]単位がそれぞれ失われたことに起因している。さらに、mbas#3は、チグレートイオンについてm/z99[C5H7O2]を示す。アスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてのm/z73における特徴的なフラグメントイオンは、強度が小さい。hbas#3(図44O])は、ヒドロキシベンゾイル単位[C7H4O]が失われたことに起因する、m/z301[C15H25O6]を示す。さらに、hbas#3は、ヒドロキシベンゾエートイオン及びフェノレートイオンについて、m/z137[C7H5O3]及びm/z93[C6H5O]を示す。アスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてのm/z73におけるアスカロシドに特徴的なフラグメントイオンの強度は低い。PABAに連結しているascr#8(図44P])は、アスカリロース由来のC3O2H5フラグメントについてm/z73における特徴的なフラグメントイオンと一緒に、PABA及びアニリドイオンについて、それぞれm/z136[C7H6NO2]及びm/z92[C6H6N]において特徴的なフラグメントイオンを示す。 図４４Ａ−Ｄの続きである。 図４４Ｅ−Ｈの続きである。 図４４Ｉ−Ｌの続きである。 ClustalWを使用して行った、C.エレガンスのMAOC-1(NP_495494.1(赤色))及びDHS-28(NP_509146.1)を有するヒトMFE-2アイソフォーム2(NP_000405.1)、酸化還元酵素ドメイン(緑色)、SCP-2ステロールキャリアータンパク質ドメイン(黄色)の配列を示す図である。触媒部位を構成するアミノ酸は、緑色及び赤色の枠により、ペルオキシソーム標的シグナルは黒色で印を付けている。同一アミノ酸は灰色で印を付け、類似アミノ酸は薄灰色により印を付けている。 (A〜C)C.エレガンスにおける新規アスカロシドの同定に関する図である。図46Aは、野生型C.エレガンスのエクスクレトームのLC-MSの全イオン電流(TIC)クロマトグラムの図である(ESI-)。図46Bは、アスカロシドのMS/MSフラグメンテーションを例示している。図46Cは、野生型のエクスクレトームのLC-MS/MSスクリーニング(m/z73の前駆体)であり、公知のアスカロシド(黒)、新規ホモログ(C4、C6、C8、C11、及びC12)、新規(ω)-酸素化異性体(C5ω、C9ω、及びC11ω)、並びに新規4'-アシル化誘導体(hbas#3及びmbas#3)(*非アスカロシド)が明らかになっている。高度に極性のascr#5は、示した保持時間範囲外になる6.5分に溶出する。 (A〜C)野生型、acox-1、maoc-1、dhs-28、及びdaf-22の蠕虫において、LC-MS/MSにより同定されたアスカロシドを示す図である。図47Aは、(ω-1)-酸素化アスカロシドを示しており、図47Bは、(ω)-酸素化アスカロシドを示しており、図47Cは、4'-アシル化誘導体の例を示している。合成品が合成されていない化合物、及び146種の特徴付けの済んでいるアスカロシドの完成リストの立体化学は、類似性及びHPLC-MSの保持時間に基づいて示される通りに提示した(図38を参照されたい)。 (A〜B)hbas#3に対する誘引に関する図である。野生型(N2)雌雄同体は、スポット誘引アッセイにおいて、用量依存的にhbas#3に誘引される(図48A)。図48Bは、四分円化学走性アッセイにおいて、野生型雌雄同体について、hbas#3による誘引の用量依存性を示している。 (A〜B)アスカロシド生物発生に関する図である。図49Aは、アスカロシド生合成における、ペルオキシソームβ-酸化酵素ACOX-1、MAOC-1、DHS-28、及びDAF-22の提案されている役割を示している。図49Bは、acox-1、maoc-1、dhs-28、及びdaf-22の突然変異対立遺伝子を示しており、点突然変異(垂直の棒)及び欠失(水平棒)を示している。 (A〜E)飽和(青色)、α,β-不飽和(赤色)、及びβ-ヒドロキシ化(緑)側鎖を有する、野生型(図50E)、及びβ-酸化突然変異体(acox-1(図50A)、maoc-1(図50B)、dhs-28(図50C)、及びdaf-22(図50D)における(ω-1)-酸素化アスカロシドの量を示す図である。 ClustalWを使用して行った、他のペルオキシソームアシル-CoAオキシダーゼを有するC.エレガンスのACOX-1アイソフォームa.lの配列を示す図である。同一アミノ酸は灰色で印を付け、類似アミノ酸は薄灰色で印を付け、ペルオキシソーム標的シグナルは黒で印を付けている。 (A〜B)野生型(図52A)及びacox-1突然変異体(図52B)における、(ω)-酸素化アスカロシドの量を示す図である(図53A〜Eも参照されたい)。 (A〜E)飽和(青色)、α,β-不飽和(赤色)、及びβ-ヒドロキシ化(緑)アスカロシドを示す、野生型(N2)(図53A)、及びβ-酸化突然変異体(acox-1(図53B)、maoc-1(図53C)、dhs-28(図53D)、daf-22(図53E)における(ω)-酸素化アスカロシドのプロファイルを示す図である。((ω-1)-酸素化アスカロシドに関しては、図50A〜Eを参照されたい)。 (A〜B)インドールアスカロシド生合成に関する図である。acox-1における、(ω-1)及び(ω)-酸素化C5-アスカロシドascr#9及びoscr#9、並びにそれらの対応するインドールアスカロシドicas#9及びicos#9の相対存在量は、インドール-3-カルボニルの結合が高度に特異的であることを示している(図54A)。図54Bは、ascr#10とoscr#10との1:1混合物と共にインキュベートした後のdaf-22(m130)のエクスクレトームのLC-MSイオントレースを示しており、このことは、(ω-1)-酸素化ascr#10へインドール-3-カルボニルが結合していることが好ましいことを示している。 野生型のエクスクレトーム抽出物中の、アスカロシドascr#3及びascr#9、並びにそれらの対応するインドールアスカロシドicas#3及びicas#9の相対存在量を示す図であり、インドールの結合が側鎖長に高度の依存性であることを示している。 (A〜B)アスカロシドのプロファイルに関する図である。蠕虫の体のアスカロシドのプロファイルの分析(図56A)は、アスカロシドグルコシドを明らかにし(例えばglas#10)、不飽和アスカロシドが優先的に排泄されることを示している。dhs-28突然変異体エクスクレトーム(図56B)における、(ω-1)-連結飽和アスカロシドと(ω)-連結飽和アスカロシドの比は、栄養状態に強く依存すること(β-ヒドロキシアスカロシドについては図59A〜Cを参照されたい)を示しており、野生型C.エレガンスにおけるascr#3/ascr#5比の飢餓依存性を反映している(図60を参照されたい)(ウェルチのt検定、*: P<0.05、**p<0.001)。 (A〜C)acox-1(ok2257)蠕虫の体の抽出物のLC-MS/MSクロマトグラム(m/z=73の前駆体イオン)を示す図であり、グルコシルエステルglas#10、glas#18、及びglas#22、並びに対応する非グリコシル化アスカロシドascr#10、ascr#18、及びascr#22を示している。 野生型C.エレガンスによる(ω)-酸素化アスカロシドの排泄の違いを示す図である((ω-1)-酸素化アスカロシドに関しては、図56Aを参照されたい)。 (A〜C)dhs-28(hj8)突然変異蠕虫における、(ω-1)-連結アスカロシドと(ω)-連結アスカロシドの比を示す図であり、栄養状態に強く依存することを示している。図59Aは、dhs-28(hj8)のエクスクレトーム抽出物中のβ-ヒドロキシアスカロシドの比である。図59Bは、dhs-28(hj8)の蠕虫の体の抽出物中のβ-ヒドロキシアスカロシドの比である。図59Cは、dhs-28(hj8)の蠕虫の体の抽出物中の飽和アスカロシドの比である(dhs-28(hj8)のエクスクレトーム抽出物における飽和アスカロシドは、図56Bに示している)。 野生型エクスクレトームにおける、ascr#3/ascr#5比の飢餓依存性を示す図である。 (A〜B)アスカロシド生物発生に関する図である。図61Aは、アミノ酸(緑色)、脂肪酸(青色)、及び炭水化物(赤色)のビルディングブロックからのアスカロシドのモジュール組立物を示している。図61Bは、アスカロシド生物発生のためのモデルを示している。脂肪酸鎖を伸長(推定上のエロンガーゼホモログelo-1-925による)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Agbagaら、PNAS 105巻、12843〜48頁(2008年))後に、VLCFAの(ω)又は(ω-1)-酸素化及びアスカリロース結合が続く。得られたVLCAは、短鎖アスカロシドを産生するACOX-1、MAOC-1、DHS-28、及びDAF-22によってペルオキシソームβ-酸化に入り、該短鎖アスカロシドは、アミノ酸由来の部分及び他のビルディングブロックに連結する。 ClustalWを使用して行った、C.エレガンスのホモログC14F11.6(CCD64543.1)を有する仮性結核菌CDP-3,6-ジデオキシ-D-グリセロ-D-グリセロ-4-ヘキスロース-5-エピメラーゼ、すなわちascE(AAA88702.1)の配列を示す図である。同一アミノ酸は灰色で印を付け、類似アミノ酸は薄灰色により印を付けている。 (A〜D)C.エレガンス分散ブレンドに対するS.フェルティアエ(S. feltiae)の定量及び応答に関する図である。図63Aは、分散ブレンドのアスカロシドの構造を示している。図63Bは、Image Jを使用する分散しているC.エレガンスの定量を示す図である(2番目の列は反転図を示しており、3番目の列は計数した線虫を示している)。図63Cは、合成ブレンドascr#2(3.68pmol/ul)、ascr#3(0.165pmol/ul)、ascr#8(0.25pmol/ul)、及びicas#9(0.005pmol/ul)の活性に対する個々のアスカロシドの寄与を示している。各処理について、7回の実験を行った。+は存在、-は非存在である。スチューデント独立t検定(p<0.05)。図63Dは、プレート全体の中で視覚化されているC.エレガンスの分散ブレンドに対するS.フェルティアエの応答を示している。 (A〜D)分散アッセイに関する図である。図64Aは、昆虫死骸から自然に分散しているS.フェルティアエの感染態幼体(IJ)を示している。図64Bは、水中の寒天プレートに置かれた、およそ300匹のIJを示している。図64Cは、水(対照)又は昆虫死骸抽出物のどちらか一方により処理したIJを示している。画像は、各処理につき6回の実験の代表例である。図64Dは、同じプレート上における分散アッセイを示している。例示は、2つの実験を表している。行動は、温度及び季節依存的である。アッセイは、RT(22+0.5℃)又は温度管理条件下で実施した。 いくつかのアスカロシドの構造を示している図である。 (A〜E)アスカロシドが、C.エレガンスの分散行動を調節し、この分散ブレンドが、他の線虫により認識されていることを示している図である。図66Aは、分散ブレンドの同定を示している。画像(約250匹の線虫)は、それぞれ、対照(0.25%の大腸菌(E. coli)(HB101))、0.25%の大腸菌(HB101)を含む合成ブレンド、及び耐久型幼虫の上澄み液の9、10及び11回の実験の代表例である。図66Bは、Image J(http: //rsbweb. nih. gov/ij/download. html)を使用する定量を示している。対照対合成ブレンドのスチューデント独立t検定(p<0.02)。図66Cは、C.エレガンス分散ブレンドの成分について、昆虫病原性線虫、又はネコブ線虫によって感染した宿主死骸の分析を示す。図66Dは、分散ブレンドに対するS.フェルティアエのIJ(約250匹)の応答を示す。各処理につき4回の実験である。図66Eは、C.エレガンス分散ブレンドに対する、ネコブJ2(メロイドギネ属種、サツマイモネコブセンチュウ(M.incognita)、ジャワネコブセンチュウ(M. javanica)、及びM.フロリデンシス(M. floridensis)の混合物)の応答を示す。データは、対照の水、及びC.エレガンス分散ブレンドからの19回及び20回の実験をそれぞれ表している。2時間時のスチューデント独立t検定、p<0.007。 (A〜E)S.フェルティアエ分散フェロモンの、活性により導かれる分画を示す図である。図67Aは、昆虫死骸抽出物の逆相(C18)クロマトグラフィーのフラクションに対する応答を示している。画像は、2回の独立した実験を表している。推定される生理的に適切な濃度をアッセイに使用した。Frcとは、フラクションのことである。図67Bは、Frc A(ascr#9、40.3pmol/μl、及びascr#11、1.3pmol/μl)において見いだされたアスカロシドの生理的に適切な濃度の試験に関する。画像は、3回の実験を表している。図67Cは、ascr#2及びascr#9が構造類似体であることを示している。天然及び合成のascr#9をフラクションBとCとを組み合わせて試験した。画像は、4回の実験を表している。図67Dは、ascr#11の構造を示している。フラクションBとCとの組合せは、分散を引き起こすのにやはり十分である(1.3pmol/μl)。画像は、3回の実験を表している。 (A〜C)フラクションA(図68A〜B)及びフラクションB(図68C)のLC-MSイオンクロマトグラムを示す図である。最初のグラフは、m/z279におけるascr#11を示しており、2番目のグラフは、m/z293におけるascr#9を示している。 S.フェルティアエが発達している間の、ascr#9及びascr#11のプロファイルを示す図である。各時間点について、6つの昆虫死骸をLC-MSにより分析した。0時点について、4匹の非感染態幼虫を分析した。*は、検出したが、定量不可ということである。 C.エレガンス分散ブレンドにおいて、ascr#9は、ascr#2の機能に置きかえることができることを示す図である。代表的な画像を示している。0.25%大腸菌HB101を使用するネガティブ対照(3回の実験)、C.エレガンス分散ブレンド中のascr#9代替物(6回の実験)、及びポジティブ対照である合成ブレンドの分散ブレンド(7回の実験)と耐久型幼虫の液体培養物のポジティブ対照(3回の実験)である。 (A〜B)系統発生的に関連する線虫種の分散ブレンドに関する図である。図71Aは、昆虫病原性線虫、植物寄生性線虫、及びC.エレガンスに関する系統樹である。この図は、C.エレガンス及び線虫の生物学(全体が参照により本明細書に組み込まれている、PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY(WormBook版、The C. elegans Research Community、2006年))から改作したものである。赤色は、属の例を示している。図71Bは、ステイネルネマ属種及びヘテロラブディティス属種の宿主昆虫死骸中のascr#9及びascr#11の存在を示している。各種について、ステイネルネマ属種又はヘテロラブディティス属種のいずれか一方に感染した4匹の昆虫(ハチノスツヅリガ(G. mellonella))の死骸を、ascr#9及びascr#11のプロファイルに関してLC-MSにより分析した。 (A〜D)(ω-1)-酸素化飽和アスカロシド(図72A)、(ω-1)-酸素化不飽和アスカロシド(図72B)、(ω)-酸素化飽和アスカロシド(図72C)、及びインドールアスカロシドicas#9及びascr#2(図72D)の構造、並びにHPLC-ESI-MSのデータを示す図である。1SMID: C.エレガンス及び他の線虫から同定した低分子に関する低分子識別名。 図７２Ａ−Ｃの続きである。 アスカロシド(ascr)及びオメガ-アスカロシド(oscr)のHPLC保持時間を示す図である。側鎖は、C.エレガンスの野生型及びペルオキシソームβ酸化突然変異体、並びに合成標準品に由来して、炭素原子が3〜17個の範囲に及んでいる。 (A〜B)成体S.グラセリ(S. glaseri)の蠕虫の水抽出物中のアスカロシドの同定を示す図である。図74Aは、LC-MS/MSからの全イオン電流(TIC)クロマトグラムである。m/z73.0の前駆体イオンに関するスクリーニングにより、アスカロシドのシグナルが明らかになっている。図74Bは、LC-MS測定からの、ascr#9、ascr#12、ascr#1及びascr#14についての対応するイオントレースである。 (A〜K)以下にある通り、アスカロシド合成における成分のNMRスペクトルの表である。
Figure 2014522882
図７５Ａの続きである。 図７５Ｂ−Ｃの続きである。 図７５Ｄ−Ｅの続きである。 図７５Ｆ−Ｇの続きである。 図７５Ｈ−Ｉの続きである。 (A〜D)アスカロシドの構造(図76A)、検出(図76B〜C)、及び合成(図76D)に関する図である。アスカロシド(ascr)とインドールアスカロシド(icas)の両方が、以前に記載されているC.エレガンス中のアスカロシドである。(ω-1)-酸素化ascrの他に、それらの(ω)-酸素化異性体(oscr)が、このHPLC-MSスクリーニングにおいて同定された。図76Bは、自由生活性C.エレガンス(混合段階)、昆虫寄生性S.グラセリ(成体)、及びラット寄生性N.ブラシリエンシス(N. brasiliensis)(成体)から得られた条件の整えられている蠕虫の水中の短鎖及び中鎖アスカロシドのHPLC-MSによる同定を示している。C.エレガンス滲出物のHPLC-MS分析は、対応するホモログ(ascr#9、#10、#12、#14、及び#18)、及び(ω)-酸素化異性体(oscr#9、#10、#18)と共に、公知のアスカロシド(ascr#1、#3、#7、及びicas#9)を示している。高度に極性の高いascr#5は、示した保持時間範囲外になる6.5分に溶出する。分子イオンシグナル及びHPLC保持時間の種間比較により、C.エレガンスにより多量に産生されるアスカロシドも、S.グラセリ、N.ブラシリエンシスを含む他の多くの線虫種で発見されていることが示された(ピークは、C.エレガンス中にやはり多量に存在している化合物を示しており、青色で示されている)。図76Cは、P.ストロンギロイデス(P. strongyloides)(混合段階)、及びH.バクテリオフォラ(H. bacteriophora)(成体)における、中鎖及び長鎖アスカロシドのHPLC-MSによる同定を示している。ascr#18(青色)は、C.エレガンスによって多量に産生される一方、長鎖ホモログ(赤色ピーク)は、C.エレガンスではなく、P.ストロンギロイデス及びH.バクテリオフォラによって多量に産生されている。図76Dは、(ω)-酸素化アスカロシド、oscr#9及びoscr#10の合成を示している。 アスカロシドが広範囲の線虫種により産生されることを示すヒートマップである。このマップは、S Basal、ddH2O又はDMEM中で数時間インキュベートした蠕虫から得られた、蠕虫培地試料のHPLC-MS分析からの結果に基づいている。感染態幼体(IJ)及び成体(A)として示されている寄生性の種を個別に収集した。他の試料はすべて、混合段階の培養物から得た。このヒートマップ中の色は、右側の棒グラフに示されている通り、HPLC-MSによって検出されたアスカロシドの相対存在量を表している。例えば、S.グラセリの感染態幼体において検出されるアスカロシドの合計は、ascr#11が5.7%、ascr#9が92.2%、ascr#12が2.1%、及びascr#10が0.1%から構成されている。 線虫は、アスカロシドにより条件が整えられた領域に対して特有の応答をすることを示す図である。3種の濃度の合成アスカロシド(点数化領域あたり、0.6fmol、0.6pmol、及び0.6nmolにそれぞれ相当する1nM、1μM、及び1mMを0.6μL)により条件を整えた領域に対する応答について、いくつかの線虫種の点数化を行った。条件の整えられた領域における線虫種の占有を、20分間、対照領域における占有と比較した。1回の試験あたり10匹の個体を使用した。アスカロシドにより条件を整えた領域でかなり長い間過ごした線虫の実験を、緑色で強調している。対照領域でかなり長い間過ごした線虫の実験は赤色で強調しており、アスカロシドを忌避していることを示している。エラーバーはS. D.である。各値に対する統計的有意性は、各値一式において最初に示した、水に対する応答と比較して算出した。p値は、スチューデント独立t検定を使用して決定した。**p<0.01、*p<0.05。 両方の領域における蠕虫の存在を検知するソフトウェアを使用した保持アッセイを示す図であり、蠕虫により占有された各点数化領域の百分率の出力値を示しており、この値は、試験全体の間、1秒あたり1回計算される。その出力値は、両方の点数化領域について、蠕虫の占有率対時間のプロットである。全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁により記載されている点数化指数を採用した。 (A〜C)誘引アッセイに関する図である。C.エレガンスの雄は、様々な線虫種及びアスカロシドに対する、特異な長期間にわたる誘引を実証している。同種の雌雄同体に対するC.エレガンスの雄の長期間にわたる誘引を、10cmの寒天プレート上の雌雄同体又はアスカロシドで条件を整えた点源への化学走性を点数化することにより確定した(図80A)。雌雄同体をM9緩衝液中に懸濁し、寒天プレート上の銅製シリンダー内に6時間入れた後、雌雄同体を取り出して、麻痺剤であるアジ化ナトリウムを加えた。銅製シリンダー中、M9緩衝液の対照を用いて、同じことを反対側で行った。C.エレガンスの雄を上記プレートの中心に置き、どちらか一方の点で麻痺するまで動きまわらせた。次に、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁(1993年)から適合させた誘引指数を計算し、対照対キュー領域で麻痺した蠕虫を比較した。図80Bは、50匹の同種の雌雄同体により条件の整えられた点源にC.エレガンスの雄が誘引されていることを示している。それらは、同量のP.レディビブス(P. redivivus)の雌に部分的に誘引されるが、S.カルポカプサエ(S. carpocapsae)、P.パキフィクス(P. pacificus)、又はP.ストロンギロイデスの雌/雌雄同体には誘引されないことを実証している。図80Cにより、C.エレガンスの雄が6時間にわたり、25匹の雌雄同体によって条件を整えられた点源を検知して、それに向かって化学走することができることが示されている。それらは、ascr#2及びascr#3の点源に向かっては化学走するが、ascr#8にはしない。エラーバーはS. D.である。各値に関する統計的有意性は、図80Cにおいて示した、対照との比較で算出した。p値は、スチューデント独立t検定を使用して決定した。**p<0.01、*p<0.05。 アスカロシドが同種の雌雄同体との交尾を増加もせず、異なる線虫種とも交尾を誘発しないことを示す図である。交尾応答アッセイ(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pedenら、Curr. Biol. 15巻、394〜404頁(2005年))を適用し、雌雄同体について、3分の試験期間内の連続した10秒間に、その腹側尾に首尾よく位置した雄の百分率を定量した。エラーバーはS. D.である。 線虫及び細菌における、シグナル伝達分子の類似の組立物を示す図である。N-アシルホモセリンラクトン(AHL)は、細菌のクオラムセンシングを媒介する低分子ファミリーである。AHLは、ホモセリンラクトンをベースとするものであり、N-アシル鎖中の種特異的な変化を特徴としている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dickschat、Nat. Prod. Rep. 27巻、343〜69頁(2010年))。アスカロシドは、可変脂質鎖が結合しているジデオキシ糖アスカリロース骨格に基づき、非常によく似た様式で組み立てられている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Edison、Curr. Opin. Neurobiol. 4巻、378〜88頁、(2009年))。それらはどちらも、重要な生き残り戦略を媒介する際に重要な役割を果たす。 ジャワネコブセンチュウ及び/又はキタネコブセンチュウ(M. hapla)において検出されたアスカロシド化合物のリストである。 ネコブセンチュウから同定されたアスカロシドシグナル伝達分子の高分解能質量分析データを示す図である。 (A〜E)ネコブセンチュウ(ジャワネコブセンチュウ、M.フロリデンシス、サツマイモネコブセンチュウからの抽出物のHPLC-MSクロマトグラムを示す図であり、アスカロシドascr#10(図85A)、ascr#16(図85B)、ascr#18(図85C)、ascr#20(図85D)、及びascr#22(図85E)の存在を実証している。 (A〜E)ジャワネコブセンチュウ(J2幼虫)からの抽出物のHPLC-MSクロマトグラムを示す図であり、アスカロシドascr#10(図86A)、ascr#16(図86B)、ascr#18(図86C)、ascr#20(図86D)、及びascr#22(図86E)の存在を実証している。 (A〜E)キタネコブセンチュウ、M.hapla(J2幼虫)からの抽出物のHPLC-MSクロマトグラムを示す図であり、アスカロシドascr#10(図87A)、ascr#16(図87B)、ascr#18(図87C)、ascr#20(図87D)、及びascr#22(図87E)の存在を実証している。 (A〜E)合成アスカロシド標準品(ascr#10(図88A)、ascr#16(図88B)、ascr#18(図88C)、ascr#20(図88D)、ascr#22(図88E))のHPLC-MSクロマトグラムを示す図である。 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(11)の1H NMRスペクトル(600MHz、クロロホルム-d)を示す図である。 (A〜B)(R)-メチル4-((2-ヒドロキシ-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタノエート((R)-12)の1H NMR(400MHz、アセトン-d6)(図90A)及び13C NMR(100MHz、アセトン-d6)(図90B)のスペクトルを示す図である。 図９０Ａの続きである。 (A〜B)(R)-(R)-2-(4-メトキシ-4-オキソブタンアミド)-1-フェニルエチル4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(18)の1H NMR(500MHz、メタノール-d4)(図91A)及び13C NMR(125MHz、メタノール-d4)(図91B)のスペクトルを示す図である。 図９１Ａの続きである。 (A〜D)4-(((R)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタン酸(pasc#9)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図92A)、dqfCOSY(600MHz、メタノール-d4)(図92B)、HMQC(1Hは600MHz、151MHz)(図92C)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図92D)のスペクトルを示す図である。 図９２Ａの続きである。 図９２Ｂ−Ｃの続きである。 (A〜C)4-(((S)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタン酸(19)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図93A)、HMQC(1Hは600MHz、151MHz)(図93B)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図93C)のスペクトルを示す図である。 図９３Ａの続きである。 (A〜B)(2S,3R,5S,6R)-6-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-5-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イルベンゾエート(22)の1H NMR(600MHz、アセトン-d6)(図94A)及び13C NMR(151MHz、アセトン-d6)(図94B)のスペクトルを示す図である。 (A〜B)(2R,3S,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン(24)の1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)(図95A)及び13C NMR(100MHz、クロロホルム-d)(図95B)のスペクトルを示す図である。 (A〜D)(R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(part#9)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図96A)、dqfCOSY(600MHz、メタノール-d4)(図96B)、HMQC(1Hは600MHz、151MHz)(図96C)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図96D)のスペクトルを示す図である。 図９６Ａ−Ｂの続きである。 (A〜B)(2S,3R,5S,6R)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-メトキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン(26)の1H NMR(400MHz、クロロホルム-d)(図97A)及び13C NMR(100MHz、クロロホルム-d)(図97B)のスペクトルを示す図である。 (A〜B)(3R,5S,6R)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン((R)-29、α-アノマー)の1H NMR(500MHz、クロロホルム-d)(図98A)及び13C NMR(125MHz、クロロホルム-d)(図98B)のスペクトルを示す図である。 (A〜B)(R)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸((R)-30)の1H NMR(500MHz、メタノール-d4)(図99A)及び13C NMR(125MHz、メタノール-d4)(図99B)のスペクトルを示す図である。 (A〜B)(2S,3R)-ベンジル3-ヒドロキシ-2-(3-(9-((3R,4S,5R)-3,4,5-トリス(ベンジルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタノエート(6)の1H NMR(500MHz、メタノール-d4)(図100A)及び13C NMR(125MHz、メタノール-d4)(図100B)のスペクトルを示す図である。 (A〜E)(2S,3R)-3-(((R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-トリヒドロキシテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタン酸(npar#1)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図101A)、13C NMR(600MHz、メタノール-d4)(図101B)、dqfCOSY(600MHz、メタノール-d4)(図101C)、HSQCAD(1Hは600MHz、151MHz)(図101D)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図101E)のスペクトルを示す図である。 図１０１Ａ−Ｂの続きである。 図１０１Ｃ−Ｄの続きである。 (A〜C)(2S,3R)-3-(((S)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-トリヒドロキシテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタン酸(36)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図102A)、HSQCAD(1Hは600MHz、151MHz)(図102B)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図102C)のスペクトルを示す図である。 図１０２Ａの続きである。 (A〜D)(R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘプタノイル)オキシ)-3-ヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘプタン酸(dasc#1)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図103A)、dqfCOSY(600MHz、メタノール-d4)(図103B)、HMQC(1Hは600MHz、151MHz)(図103C)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図103D)のスペクトルを示す図である。 図１０３Ａ−Ｂの続きである。 (A〜B)(R)-ベンジル4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(38)の1H NMR(500MHz、クロロホルム-d)(図104A)及び13C NMR(125MHz、クロロホルム-d)(図104B)のスペクトルを示す図である。 (R)-ベンジル4-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-アジド-2-メチルプロパノイル)オキシ)-3-ヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(8)の1H NMRスペクトル(400MHz、クロロホルム-d)を示す図である。 (A〜B)5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(10)の1H NMR(500MHz、アセトン-d6)(図106A)及び13C NMR(125MHz、アセトン-d6)(図106B)のスペクトルを示す図である。 図１０６Ａの続きである。 (A〜B)(2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-アジド-2-メチルプロパノイル)オキシ)-2-(((R)-5-(ベンジルオキシ)-5-オキソペンタン-2-イル)オキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(40)の1H NMR(500MHz、アセトン-d6)(図107A)及び13C NMR(125MHz、アセトン-d6)(図107B)のスペクトルを示す図である。 図１０７Ａの続きである。 (A〜D)(R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-((5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-6-メチル-5-(((R)-2-メチル-3-ウレイドプロパノイル)オキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(ubas#1)の1H NMR(600MHz、メタノール-d4)(図108A)、dqfCOSY(600MHz、メタノール-d4)(図108B)、HMQC(1Hは600MHz、151MHz)(図108C)、及びHMBC(1Hは600MHz、151MHz)(図108D)のスペクトルを示す図である。 図１０８Ａの続きである。 図１０８Ｂ−Ｃの続きである。 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-(((R)-5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘキサノイル)オキシ)-6-メチル-5-(((R)-2-メチル-3-ウレイドプロパノイル)オキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(ubas#2)を含有する天然試料のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)を示す図である。 (A〜C)P.パキフィクス(P.pacificus)のエキソメタボローム(exo-metabolome)及びC.エレガンス(C.elegans)からの以前に同定されたシグナル伝達分子の分析に関する図である。図110Aは、C.エレガンスの発達及び行動を調節する、アスカロシドをベースとする低分子シグナルの構造を示す。図110Bは、P.パキフィクスにより排泄された代謝物が、耐久型幼虫の阻止を誘発して口腔形態の二形性に影響を及ぼし、幅広型口腔(eurystomatous mouth)の発達を促進することを示している。図110Cは、P.パキフィクスのエキソメタボロームフラクションの2D NMR(dqfCOSY)スペクトルの一部の例であり、公知の一次代謝物及び未知の成分を含む、複雑な代謝混合物であることを明らかにしている。交差ピークによる精密構造の詳細な解析及び追加のHMBCスペクトルにより、アスカリロース、パラトース、トレオニン、キシロース、及び他のビルディングブロックの組合せに基づく一連の珍しい化学構造の検出に至った。 (A〜C)P.パキフィクス代謝物のHPLC-MS/MS分析、モジュールアーキテクチャー、及び化学合成に関する図である。図111Aにおいて示される通り、高分解能HPLC-MS分析により、その分子式がP.パキフィクスのエキソメタボロームのNMR分光分析に基づいて提唱される構造に関して、さらなる制約をもたらす種が明らかになる。炭水化物(黒色)、アミノ酸(緑色)、及びヌクレオシド(赤色)の代謝、及び恐らくTCA回路に由来するスクシネート(赤紫色)からのビルディングブロックの組立物からのP.パキフィクスのエキソメタボロームの主成分が、図111Bに示されている。図111Cは、同定されたP.パキフィクス代謝物及びいくつかの非天然立体異性体に関する、簡略した合成スキームを示す。 図１１１Ａ−Ｂの続きである。 P.パキフィクスの主要低分子である、pasc#9、npar#1、dasc#1、及びubas#1を示す図である。これらの構造は、NMR分光法を使用して明らかにされた。太線は、dqfCOSYスペクトルにおけるスピン系を示している。曲線の矢印は、構造を帰属するために使用した重要なHMBC相関を示している。npar#1中の印の付いているプロトン(---H)は、N6-カルバモイルアデノシンに特徴的なものであり、1H、HSQCAD及びHMBCスペクトルにおいて観察される。 アスカロシドであるascr#1、ascr#9、ascr#12、pasc#1、pasc#9、pasc#12、ubas#1、ubas#2、dasc#1、part#9、npar#1、及びnpar#2の分子式、LC保持時間、分光分析データ、及びそれらの培養上澄み液中の推定濃度を明らかにしている表である。 天然pasc#9(黒色)、及び(R)-N-スクシニル-1-フェニルエタノールアミド部分(赤色)を含む合成pasc#9、並びに(S)-N-スクシニル-1-フェニルエタノールアミド部分(青色)を含む合成pasc#9の1H-NMRスペクトルの一部を示す図である。天然試料の1H NMRは、(R)-N-スクシニル-1-フェニルエタノールアミドのジアステレオマーと一致しており、天然pasc#9が(R)-N-スクシニル-1-フェニルエタノールアミドを含むことを示している。 (A〜B)dasc#1(図115A)及びdasc#1の合成試料(図115B)を含有する、HPLCにより濃度を高めたP.パキフィクスのエキソメタボローム抽出物フラクションのdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の一部を示す図である。dasc#1に関する特有の交差ピークを青色枠で囲んでいる一方、天然試料中に存在している他の代謝物由来の無関係な交差ピークは赤色枠で囲んでいる。天然試料と合成試料の間の交差ピークの精度の高い一致はdasc#1の構造及び立体化学の帰属を立証しており、P.パキフィクスのエキソメタボローム中にdasc#1が存在していることを裏付けている。 図１１５Ａの続きである。 (A〜B)ubas#1の立体化学の決定に関わるHPLC-MSトレース(図116A)及び1H-NMRスペクトル(図116B)を示す図である。天然ubas#1(赤色)、3-ウレイド-2R-イソブチレート及び3-ウレイド-2S-イソブチレートを約95:5の比で含有しているubas#1のジアステレオマー合成混合物(青色)、及び天然試料と合成試料の混合物(黒色点線)のHPLC-MS保持時間(ESI-、m/z=605のイオンクロマトグラム)の比較を図116Aに示している。合成(3-ウレイド-2R-イソブチレート)-誘導化ubas#1のHPLC保持時間は、天然ubas#1の保持時間と一致しており、(3-ウレイド-2S-イソブチレート)-誘導化ubas#1ジアステレオマー(*で印を付けている)とは明確に異なっており、天然ubas#1は3-ウレイド-2R-イソブチレート部分を含んでいることを示している。図116Bにおいて示されている通り、合成の(3-ウレイド-2R-イソブチレート)-誘導化ubas#1(一番下)、ubas#1含有天然試料(一番上)、及びこれらの2種の試料の1:1混合物(中央)の1H-NMRスペクトルの部分の比較により、4種の特徴的なメチルのダブレット(添付の構造において赤色及び青色の枠で示している)の相対強度が、合成ubas#1を天然試料に添加すると増大していることを示している(天然試料中の無関係のピークには、*で印を付けている)。これにより、天然ubas#1が3-ウレイド-2R-イソブチレートを含んでおり、3-ウレイド-2S-イソブチレートは含有していないことが確認される。天然及び合成試料の間のpH及び濃度の差異は、メチルのダブレットの化学シフトにわずかに影響を及ぼし、天然及び合成試料を混合すると、化学シフト値がわずかに変化する。 図１１６Ａの続きである。 (A〜B)part#9の立体化学の決定に関するHPLC-MSトレースを示す図である。両図は、ascr#9及びpart#9の天然混合物(赤色)、part#9の合成試料(青色)、及び天然試料と合成試料の1:1混合物(黒色点線)のHPLC-MS保持時間(ESI-、m/z=247のイオンクロマトグラム)の比較を示している。合成D-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸を図117Aで使用した。そのHPLC保持時間は、天然part#9には一致せず、D-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸もその鏡像異性体のどちらも天然part#9であり得ないことを示している。合成D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸を図117Bで使用した。D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸のHPLC保持時間は、天然part#9の保持時間と一致する。これは、天然part#9が、D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸又はその鏡像異性体であるL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸のどちらか一方であることを示している。天然npar#1と、D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸又はL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸(図118A〜Cを参照されたい)の一方に由来する2種の合成npar#1ジアステレオマーのNMRスペクトル及びHPLC保持時間とを比較するにより、天然part#9及びnpar#1が、L-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸に基づいていることが明らかにされている。 図１１７Ａの続きである。 (A〜C)npar#1の立体化学の決定に関わるHPLC-UVトレース(図118A〜B)及び1H-NMRスペクトル(図118C)を示す図である。図118A〜Bは、npar#1含有天然試料(赤色)、npar#1の合成試料(青色)、及び天然試料と合成試料の混合物(黒色点線)のHPLC-UV保持時間(260nm)の比較を示している。L-トレオニン及びD-キシロアデノシンにカップリングしているD-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸由来の合成npar#1ジアステレオマーを図118Aで使用した。HPLC保持時間は、天然npar#1のそれとは一致しない。L-トレオニン及びD-キシロアデノシンにカップリングしているL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸由来の合成npar#1ジアステレオマーを図118Bで使用した。HPLC保持時間は、天然npar#1の保持時間と一致する。図118Cで示される通り、L-トレオニン及びD-キシロアデノシンにカップリングしているL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸由来の合成npar#1(一番下)、天然npar#1(一番上)、及びこれら2つの1:1混合物(中央)の1H-NMRスペクトルの部分の比較により、pH及び濃度の変化が、3種の特徴的なメチルのダブレット(添付の構造において赤色及び青色の枠で示している)のシフトに影響を及ぼすことが示されている。しかし、混合試料では、新しいピークは出現せず、メチルのダブレットの相対強度は、天然試料中の無関係のピーク(*で印を付けている)に比べて増大している。図118A〜Bに示されているHPLC-UV結果と組み合わせると、これらの知見は、天然npar#1がL-トレオニン及びD-キシロアデノシンにカップリングしているL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸から構成されることを示している。 図１１８Ａの続きである。 HPLCにより濃度を高めたP.パキフィクスのエキソメタボローム抽出物のフラクション中の、pasc#12に関する特有の1H NMRシグナルを示す1組のスペクトルを示す図である。 (A〜B)P.パキフィクスのエキソメタボローム抽出物(図120A)及び大腸菌(E.coli)OP50のメタボローム抽出物(図120B)のdqfCOSYスペクトル(600MHz、メタノール-d4)の一部を示す図である。アスカロシドに関する特有の交差ピークは青色の枠で囲い、パラトシドに特有の交差ピークは赤色枠で囲んでいる。この2つのスペクトルの比較により、P.パキフィクスのエキソメタボロームから同定された複雑な低分子は、細菌を起源とするものではないことが示される。それに対応して、細菌抽出物のHPLC-MS分析では、P.パキフィクスのエキソメタボローム試料中で検出されたピークのいずれも示されなかった。 図１２０Ａの続きである。 エタノール、ascr#1、又はnpar#1を投与したP.パキフィクスにおける耐久型幼虫形成を示すグラフであり、ascr#1は、非常に高濃度(20μM)でさえもP.パキフィクスにおける耐久型幼虫形成を誘発しないことが実証される。P.パキフィクス耐久型幼虫形成に対するポジティブ対照として、npar#1(1μM)が使用された。 (A〜E)同定された代謝物による機能アッセイ、及び進化的に保存された経路に対するP.パキフィクス中における低分子シグナル伝達の関係に関するグラフである。図122A〜Dは、成体の表現型可塑性(口腔形態)の調節を示すグラフである。活性なP.パキフィクスのエキソメタボロームフラクションの主成分の合成試料による図122A及び図122C、並びに耐久型幼虫の誘導(図122B及び図122D)。実験はすべて、各処置について三連で行った。化合物は、まず、1μM濃度(*P<0.01及び**P<0.001)(図122A〜B)でアッセイし、続いて1μM濃度(P<0.01)において非常に活性な化合物は、広い範囲の濃度で試験した(図122C〜D)。図122E中で例示されている通り、線虫中の低分子シグナル伝達は、進化的に保存されている転写因子(DAF-16/FOXO及び核内ホルモン受容体(NHR)DAF-12、ビタミンD、及び肝臓X受容体ホモログを含む)に一次代謝を結びつける中心的な立場を占めている。npar#1は、DAF-12及びDAF-16を介するシグナル伝達の両方を必要とする耐久型幼虫の阻止を誘発する一方、dasc#1は、DAF-12をやはり必要とするがDAF-16には無関係である成体形態を調節する。 (A〜E)mvaDANS、次いでHPLC-MS分析により同定された、daf-22突然変異体に特異的なVLCA7〜11の同定に関する図である。図123Aは、daf-22突然変異体及び野生型メタボロームに関するHPLC-MSスペクトルを示している。HPLC-MS分析により、daf-22メタボローム中には、野生型には存在しない長鎖のアスカロシド及びエタノールアミドが確認される。代謝物の構造は、図123Bに示されている。図123Cは、daf-22の上方調節されたアスカロシルメチルケトンの量的分布を示すグラフである。図123Dは、野生型及び様々な突然変異体のメタボローム中のEPEA産生を示すグラフである。maoc-1、dhs-28、及びdaf-22では、突然変異によりEPEA産生がかなり低下し、アスカロシド(2.5μMのascr#3及びascr#9)をdaf-22(m130)培養物に添加してもEPEA産生は回復しない。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図123Eは、ペルオキシソームβ-酸化と内在性カンナビノイド生合成の相互作用を例示する概略図である。daf-22の突然変異により、長鎖アスカロシドCoAエステルのプロセッシングが止まり、そのエタノールアミドへの変換は、恐らくホスファチジルエタノールアミンのプールの枯渇によるEPEA産生(13)の低下に関係している。 図１２３Ａ−Ｂの続きである。 図１２３Ｃ−Ｄの続きである。 野生型及び様々な突然変異体中のAEA産生を示すグラフである。maoc-1、dhs-28及びdaf-22が突然変異することにより、AEA産生は著しく低下するが、acox-1が突然変異してもAEA産生はわずかに減少するだけである。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。 (A〜B)daf-22突然変異体における上方調節及び下方調節された代謝物の同定に関する図である。mvaDANSの概略図を図125Aに示している。主成分分析(PCA)において、PC1により4種の野生型のデータセット(青色点)とdaf-22突然変異体データセットの両方(赤色及び茶色の点)を分離する一方、PC2により2種のdaf-22対立遺伝子を分離する。逆投影(左下)では、交差ピークの色づけは、PC1の負荷係数に相当する。2種のdaf-22突然変異体株中において、青いピークは下方調節されたシグナルを表し、赤いピークは上方調節されたシグナルを表している。実際のスペクトルに関しては、図130を参照されたい。図125Bは、部分構造が、α-メチル分岐脂肪酸、メチルケトン、及びβ-ケト脂肪酸誘導体を示唆する、daf-22に特異的な交差ピークの人の手による分析から推定されることを示している。 4種の野生型C.エレガンスのエキソメタボローム抽出物うちの1つのdqfCOSYスペクトルの一部(0.85〜4.80ppm)を示す図である。 4種のdaf-22(m130)のエキソメタボローム抽出物のうちの1つのdqfCOSYスペクトルの一部(0.85〜4.80ppm)を示す図である。 (A〜D)mvaDANSがどのように自動的にスペクトルの交差ピークを同定し、統計的に導かれる偽スペクトルを生成するかを示している一連のスペクトル図である。図128Aは、野生型C.エレガンスのメタボロームの位相敏感dqfCOSYスペクトルの1〜3ppm領域である。図128Bは、図128Aで示したものと同じNMRスペクトルであるが、自動的にビン(bin)区切りする前に、大きさモードで処理したものである。図128Cは、mvaDANSにより同定したビン区間の境界にプロットした図128A〜BからのNMRスペクトルの等高線プロットである。図128Dは、野生型C.エレガンス/daf-22の比較NMRデータセットの、主成分1に由来する逆投影偽スペクトルである。交差ピークの色は、ビン区間のPC1負荷係数を正規化したものを示している。 PLS成分の点数を示すグラフである。PLS成分の点数により、4種の野生型培養物(赤色点)と8種のdaf-22培養物(青色点)を分ける。 (A〜G)PCAが、野生型と2種のdaf-22突然変異体の対立遺伝子を区別する交差ピークをどのように同定するかを示している図である。図130Aに示される通り、大きさモードによるdqfCOSYスペクトル上にPC1負荷量を逆投影することにより、突然変異体のスペクトルに比較して、野生型のスペクトルにおける増大(赤色)又は低下(青色)した交差ピークが同定される。図130B〜Cは、mvaDANSの作業フロー、及び公知化合物の同定による方法バリデーションに関する一例を提示している。図130B中における野生型に特異的な赤い交差ピークに相当する図130Cで示されている位相敏感dqfCOSYスペクトル中の交差ピークを解析することにより、公知アスカロシドであるascr#5の存在が明らかになり、その生合成はdaf-22依存性であることが以前に示されている。同様に、図130A中の野生型に特異的な(赤色の)シグナルのほとんどは、公知のアスカロシドフェロモンの1つに帰属することができる。同様に、図129を参照されたい。図130D〜Fは、α-メチル分岐脂肪酸、メチルケトン、及びβ-ケト脂肪酸誘導体を示唆するdaf-22に特異的な交差ピーク解析から推定された部分構造であることを示している。図130Gは、代謝物(推定上のメチオニン誘導体)に関する一例を提示しており、厳密には特異的なdaf-22の例を提示するものではない。この化合物は、daf-22突然変異体中で上方調節されるだけでなく、野生型中にも存在している。 NMRスペクトルを示す図である。4x交差バリデーションによる1成分モデルからのPLS-DA予測値の逆投影は、PCAからの結果によく一致する(図123)。より重要なPLS-DAの結果は、野生型について多数の複製物を使用して得られることになる。 エキソメタボローム抽出物について、大腸菌OP50のdqfCOSYの一部(0.85〜4.80ppm)を示す図である。 C.エレガンス中のアスカロシド-をベースとするシグナル伝達分子の構造例を示し、生物的機能を列挙している図である。 ペルオキシソームβ-酸化酵素であるACOX-1、MAOC-1、DHS-28及び推定上の3-ケトアシル-CoAチオラーゼであるDAF-22の役割を示しているアスカロシド側鎖のペルオキシソームの生合成に関するモデルの概略を示す図である。 (A〜B)mvaDANSにより同定された差分交差ピークに関する例を示すスペクトルの図である。図135Aは、野生型スペクトルにおいて検出されたascr#2-交差ピークを示している。図135Bは、図128からのdaf-22(m130)スペクトルにおいて検出されたβ-ケトエタノールアミド及びメチルケトンの交差ピークを示している。
本明細書では、線虫におけるシグナル伝達分子として作用し、生殖、発達、耐久型幼虫形成、集団形成、誘引、忌避、分散、制止、摂食、宿主発見、及び/又は宿主侵入を含む、線虫行動を調節する化合物のクラスが開示される。
定義
本明細書で使用する場合、特に示されない限り、以下の用語は、次の意味を有するものと理解されたい。本明細書において他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、この発明が帰属する分野の当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書における用語に関して複数の定義が存在する場合、他に明記しない限り、この項のものが優先する。
用語「アルキル」は、直鎖、分岐、若しくは環式炭化水素構造、又はそれらの組合せとすることができる、脂肪族炭化水素基を指す。代表的なアルキル基は、24個以下の炭素原子を有するもの、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、i-ペンチル、n-ヘキシルなどがある。低級アルキルは、鎖中に約1個〜約6個の炭素原子を有するアルキル基を指す。分岐アルキルとは、メチル、エチル、又はプロピルなどの1つ以上の低級アルキル基が直鎖のアルキル鎖に結合していることを意味する。
アルキルが直鎖、分岐、又は環式炭化水素構造、及びそれらの組合せを含むと意図されているという記述とは、「アルキル」基がさらに、以下の直鎖及び環式構造要素
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(及び、同様の組合せ)も含んでいることを意味する。
「アルケニル」とは、上で定義した通り、隣接炭素原子間に少なくとも1つの二重結合を含んでいるアルキルを意味する。アルケニルは、シス及びトランス異性体の両方を含んでいる。分岐アルケニルとは、メチル、エチル、又はプロピルなどの1つ以上の低級アルキル基が直鎖のアルケニル鎖に結合していることを意味する。代表的な直鎖及び分岐アルケニルは、鎖中に約2個〜約6個の炭素原子を有するものであり、例えば、エチレニル、プロピレニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブチレニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-メチル-1-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、2,3-ジメチル-2-ブテニルなどがある。
用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを指す。
用語「ハロアルキル」は、1つ以上のハロゲンにより置換されている、上で記載した分岐又は直鎖アルキルを指す。
用語「ハロアルケニル」は、1つ以上のハロゲンにより置換されている、上で記載した分岐又は直鎖アルケニルを指す。
用語「アリール」とは、6個〜約19個の炭素原子(例えば、約6個〜約10個の炭素原子)の芳香族性の単環式又は多環式(ポリ環式)環系を意味し、アリールアルキル基を含んでいる。代表的なアリール基には、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル、アズレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、ピレニル、トリフェニレニル、クリセニル、及びナフトアセニルなどの基が含まれる。
用語「アリールアルキル」とは、アリール環に結合しているアルキル残基を意味する。例は、ベンジル、フェネチルなどである。
用語「ヘテロアリール」とは、約5個〜約19個の環原子(例えば、約5個〜約10個の環原子)の芳香族性の単環式又は多環式環系を意味しており、環系における1つ以上の原子は、炭素以外の元素(複数可)、例えば、窒素、酸素及び/又は硫黄である。当業者に周知のように、ヘテロアリール環は、それらの全炭素相当物よりも芳香族性質は低い。したがって、本発明のためには、「ヘテロアリール」基は、ある程度の芳香族性質しか必要としない。例えば、多環式環系の場合には、環のたった1つだけが、「ヘテロアリール」として定義されるべき環系に関して芳香族性であることしか必要としない。例示的なヘテロアリールは、約5〜6個の環原子を含んでいる。ヘテロアリールの前に付く接頭語のアザ、オキサ、チア、又はチオは、少なくとも窒素原子、酸素原子又は硫黄原子がそれぞれ、環原子として存在していることを意味する。ヘテロアリール環中の窒素原子、炭素原子、又は硫黄原子は、場合により酸化されていてもよい。窒素は場合により四級化されていてもよい。代表的なヘテロアリールには、以下に限定されないが、プリニル、ピリジル、2-オキソ-ピリジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、フラニル、ピロリル、チオフェニル、ピラゾリル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、インドリル、イソインドリル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリニル、2-オキソインドリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、インダゾリル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、フタラジニル、キノキサリニルなどが含まれる。
用語「シクロアルキル」及び「シクロアルケニル」は、約3〜約8個の炭素原子(例えば約5〜約7個の炭素原子)の、非芳香性の飽和(シクロアルキル)又は不飽和(シクロアルケニル)の、単環式又は多環式環系を指す。例示的なシクロアルキル基及びシクロアルケニル基には、非限定的に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、ノルボルニル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロフェニル、anti-ビシクロプロパン、syn-トリシクロプロパンなどが含まれる。
本明細書で使用する場合、「複素環」又は「ヘテロシクリル」は、飽和、不飽和又は芳香族性であり、且つ炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄からなる群から選択される1〜5個のヘテロ原子から構成される、安定な3員〜18員環(ラジカル)を指す。この発明の目的のためには、複素環は、単環式、二環式、又はポリ環式環系とすることができ、これらの環系は、上記の複素環の任意のものがベンゼン環に縮合している二環式環を含めた、縮合、架橋又はスピロ環系を含むことができる。複素環中の窒素原子、炭素原子、又は硫黄原子は、場合により酸化されていてもよい。窒素原子は、場合により四級化されていてもよく、またその環は、部分的又は完全に飽和していてもよい。複素環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合されていてもよい。複素環には、以下に定義されるヘテロアリールが含まれる。こうした複素環の例は、非限定的に、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル(piperizynyl)、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。さらなる複素環及びヘテロアリールは、全体が参照により本明細書に組み込まれているKatritzkyら(編)の、Comprehensive Heterocyclic Chemistry: The Structure、Reactions、Synthesis and Use of Heterocyclic Compunds、第1〜8巻、Pergamon Press、N. Y. (1984年)に記載されている。
用語「アシル」は、カルボニル官能基を介して親構造に結合している、直鎖、分岐、又は環式構成の飽和、不飽和、又は芳香族性の1〜8個の炭素原子の基、及びそれらの組合せを指す。アシル残基中の1つ以上の炭素は、親への結合点が依然としてカルボニルにある限り、窒素、酸素、又は硫黄によって置きかえられてもよい。例には、アセチル(Ac)、ベンゾイル、プロピオニル、イソブチリル、t-ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニルなどが含まれる。
用語「アミノ酸」は、アミノ酸のカルボキシル基と別の分子のアミノ基との反応により、以下のアミド結合形成を維持している、アミノ酸の断片のことを指す。アミノ酸はD又はLの立体配置とすることができる。適切なアミノ酸には、α-アミノ酸、β-アミノ酸、γ-アミノ酸、δ-アミノ酸、及びε-アミノ酸が含まれ、天然アミノ酸(すなわち、天然タンパク質中で見いだされている20種のアミノ酸を含めた生物系で見いだされたもの)だけではなく、こうしたアミノ酸の天然由来の変種、並びに当業者に公知の合成アミノ酸及びそれらの類似体も含まれる。例示的なアミノ酸には、20種の天然アミノ酸、4-ヒドロキシプロリン、ヒドロキシイシン(hydroxyysine)、デモシン、イソデモシン、3-メチルヒスチジン、ノルバリン、ベータ-アラニン、ガンマ-アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、オルニチン、及びメチオニンスルホンが含まれる。
用語「ピリミジン」は、2個の窒素原子によって2個の炭素原子が置きかえられているベンゼン環を含む複素芳香族化合物を指す(ジアジン)。例えば、1位及び3位で炭素原子が窒素原子により置きかえられている以下の部分
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はピリミジンと見なされる。この用語は、本明細書で定義した通り、1位及び2位に窒素原子を有するピリダジン、1位及び4位に窒素原子を有するピラジンなどの、ジアジンの異性体も含まれる。用語「ピリミジン」にはまた、一般にその類似体及び誘導体も含まれる。例えば、天然のヌクレオ塩基である、シトシン(C)、チミン(T)、及びウラシル(U)は、ピリミジン誘導体である。用語「プリン」は、イミダゾール環に縮合しているピリミジン環を含有している複素芳香族化合物を指す。用語「プリン」にはまた、一般にその類似体及び誘導体も含まれる。例えば、天然ヌクレオ塩基である、アデニン(A)及びグアニン(G)がある。天然のプリン誘導体の他の例には、ヒポキサンチン、キサンチン、テオブロミン、カフェイン、尿酸、及びイソグアニンがある。例示的なプリン及びピリミジンには、米国特許第3,687,808号、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz、J. I. (編)John Wiley & Sons、1990年、及びEnglischら、Angewandte Chemie、International Edition、1991年、30巻、613頁に開示されているものが含まれ、それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
用語「ヌクレオ塩基」には、すべての天然及び合成ヌクレオ塩基、並びに普遍的なヌクレオ塩基が含まれる。典型的な天然ヌクレオ塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミンが含まれる。合成ヌクレオ塩基には、通常、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、又はツベルシジンが含まれる。本明細書で使用する場合、普遍的なヌクレオ塩基とは、2種以上の天然ヌクレオ塩基の代わりとなり得る、任意の改変済み、未改変、天然又は非天然のヌクレオ塩基である。普遍的な塩基は、窒素原子を含有することができるか、又は含有することができず、且つオリゴヌクレオチド二重鎖を安定化する芳香族環のスタッキングを一般に利用する芳香族環部分を通常含有している。いくつかの普遍的な塩基は、ペントース糖のC-1'炭素に共有結合して、普遍的なヌクレオチドを作ることができる。いくつかの普遍的な塩基は、別のヌクレオ塩基と特異的に水素結合をしない。いくつかの普遍的な塩基は、天然ヌクレオ塩基のすべてと塩基対を形成する。いくつかの普遍的な塩基は、疎水性スタッキングによって、同じ核酸鎖に基づく隣接ヌクレオチド塩基と相互作用することがある。例示的な普遍的なヌクレオ塩基は、以下に限定されないが、2,4-ジフルオロトルエン、ニトロピロリル、ニトロインドリル、8-アザ-7-デアザアデニン、4-フルオロ-6-メチルベンゾイミダズレ(methylbenzimidazle)、4-メチルベンゾイミダズレ、3-メチルイソカルボスチリリル、5-メチルイソカルボスチリリル、3-メチル-7-プロピニルイソカルボスチリリル、7-アザインドリル、6-メチル-7-アザインドリル、イミジゾピリジニル、9-メチル-イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、7-プロピニルイソカルボスチリリル、プロピニル-7-アザインドリル、2,4,5-トリメチルフェニル、4-メチリノリル、4,6-ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニル、及びそれらの構造誘導体が含まれる。
適切なヌクレオ塩基には、以下に限定されないが、2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル並びに他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル並びに他のアルキル誘導体、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン及びチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシ及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル並びにシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン並びにN-2、N-6及びO-6置換プリン(2-アミノプロピルアデニンを含む)、5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6,N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノ-アリル-ウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N-6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、及びO-アルキル化塩基が含まれる。さらなるプリン及びピリミジンには、米国特許第3,687,808号、Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz、J. I. (編)、John Wiley & Sons、1990年、及びEnglischら、Angewandte Chemie、International Edition、1991年、30巻、613頁に開示されているものが含まれ、それらの各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれている。
用語「ヌクレオシド」は、1'-位でペントースに連結している、本明細書で定義したヌクレオ塩基を含む化合物を指す。ヌクレオ塩基がプリン誘導体、又は類似体である場合、ペントースは、通常、プリン誘導体又は類似体の9位でヌクレオ塩基に結合している。ヌクレオ塩基が、ピリミジン誘導体又は類似体である場合、ペントースは、通常、ピリミジンの1位でヌクレオ塩基に結合している(例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kornberg及びBaker、DNA Replication、第2版、Freeman、San Francisco、1992年)。ヌクレオシドが、本明細書において、R3、R4、又はR5中に存在する場合、ヌクレオシドは、ヌクレオ塩基又はペントース上の任意の原子を介して隣接原子(複数可)に連結していてもよい。
用語「脂肪酸」は、一般に、脂肪族後尾部(鎖)を有するカルボン酸を指す。脂肪族鎖は、長さが、約2〜約36個の間の炭素原子とすることができる。脂肪酸は、飽和、不飽和、又はポリ不飽和とすることができる。脂肪族鎖は、直鎖又は分岐鎖とすることができる。用語「脂肪酸」は、本明細書では、1つ以上の異なる脂肪酸誘導体又は脂肪酸誘導体の混合物を含むことができる「脂肪酸誘導体」を指すために使用されることがある。例示的な脂肪酸には、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、及び二酸、カルボン酸官能基を有するアスカロシドのモノ、ジ、トリグリセリド、ヒドロキシ酸、ωヒドロキシ酸、ω-1ヒドロキシ酸、ジヒドロキシ脂肪酸(例えば、オメガ又はオメガ-1でヒドロキシ化されているジヒドロキシ脂肪酸、及びアルファ又はベータ-ヒドロキシ化脂肪酸)が含まれる。
用語「糖」は、各炭素原子に結合している酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子を含む少なくとも5個の炭素原子を有する1つ以上の単糖単位からそれ自体構成されている炭水化物(直鎖、分岐又は環式であってもよい)であるか、又は1つ以上の単糖単位から構成されている炭水化物部分(直鎖、分岐又は環式であってもよい)をその一部として含み、各単糖単位が少なくとも5個の炭素原子を有している(酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子が、各炭素原子に結合している)化合物のどちらか一方の化合物を指す。代表的な糖には、モノ、ジ、トリ、及び約4〜9個の単糖単位を含んでいるオリゴ糖、並びにデンプン、グリコーゲン、セルロース、及び多糖ガムなどの多糖類が含まれる。例示的な単糖には、C5及びそれ以上(例えば、C5〜C8又はC5〜C6)の糖が含まれる。二糖及び三糖には、2つ又は3つの単糖単位(例えば、C5〜C8又はC5〜C8)を有する糖が含まれる。
用語「単糖」とは、アルデヒド(アルドース)又はケトン(ケトース)の形態の3〜10個の炭素原子鎖を有する糖分子を意味する。適切な単糖には、天然及び合成単糖の両方が含まれる。適切な単糖には、グリセロース及びジヒドロキシアセトンなどのトリオース、エリトロース及びエリトルロースなどのテキストロース、キシロース、アラビノース、リボース、キシルロース リブロースなどのペントース、ラムノース及びフコースなどのメチルペントース(6-デオキシヘキソース)、アスカリロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース及びソルボースなどのヘキソース、グルコヘプトース、ガラマンノヘプトース(galamannoheptose)、セドヘプツロース及びマンノヘプツロースなどのヘプトースが含まれる。例示的な単糖は、アロース、アルトロース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリトルロース、フルクトース、D-フシトール、L-フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、D-ガラクトサミニトール、N-アセチル-ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、N-アセチルグルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース-6-リン酸、グロースグリセルアルデヒド、L-グリセロ-D-マンノス-ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース-6-リン酸、プシコース、キノボース、キノバサミン(quinovasamine)、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、及びキシルロースのラジカルを包含する。単糖は、D又はLの立体配置とすることができる。本明細書で使用される典型的な単糖は、ヘキソースである。
単糖はさらに、デオキシ糖(アルコール性水酸基が水素により置きかえられている)、アミノ糖(アルコール性水酸基がアミノ基により置きかえられている)、チオ糖(アルコール性水酸基がチオールにより置きかえられているか、若しくはC=OがC=Sにより置きかえられているか、又は環形態の環酸素が硫黄により置きかえられている)、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖(環炭素が窒素により置きかえられている)、イミノ糖(環酸素が窒素により置きかえられている)、ホスファノ糖(環酸素がリンにより置きかえられている)、ホスファ糖(環酸素がリンにより置きかえられている)、C置換単糖(非末端炭素原子上の水素が炭素により置きかえられている)、不飽和単糖、アルジトール(カルボニル基がCHOH基により置きかえられている)、アルドン酸(アルデヒド基がカルボキシ基により置きかえられている)、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸などとすることができる。アミノ糖には、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノバサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトセジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、ホロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン、ロドサミンなどのアミノ単糖が含まれる。単糖などはさらに置換され得ることが理解される。
用語「二糖」、「三糖」及び「多糖」は、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、2-デオキシリボース、2-デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース、フルクトオリゴサッカリド(fructoologosachharide)、ガルト-オリゴ糖、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グルコーゲン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトセジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β-マルトース、マルトリオース、マンナン-オリゴ糖、マンニノトリオース、メレジトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、ニゲロース、ノジリマイシン、モビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロディノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、ソラトリオース、ソフォロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α、α-トレハロース、トレハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロンなどのラジカルを包含する。さらに、「二糖」、「三糖」及び「多糖」などは、さらに置換され得ることが理解される。二糖類はまた、アミノ糖及びそれらの誘導体、特にC-4'位で誘導体化されているミカミノース、C-6'位で誘導体化されている4 デオキシ-3-アミノ-グルコースも含まれる。
本明細書で使用される用語「ポリ環式」又は「多環式」は、以下に限定されないが、縮合、架橋又はスピロ環を含む、2個以上の環を有する分子構造を示す。
上記の「アルキル」、「アルケニル」「シクロアルキル」及び「シクロアルケニル」ラジカル、並びに上のアリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール基の環系は、場合により置換されていてもよい。
用語、「置換されている」又は「場合により置換されている」とは、基が、その各置換可能な原子において置換基を有する(単一原子上の2つ以上の置換基を含む)ことがあることを意味するが、但し、指定した原子の正常な原子価数を超えることはなく、また各置換基の種類(identity)は、他のものとは独立している。本発明によれば、各残基中の最大3個のH原子を、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルキエニル(alkyenyl)、ハロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、カルボキシ、カルボアルコキシ(アルコキシカルボニルとも呼ばれる)、カルボキサミド(アルキルアミノカルボニルとも呼ばれる)、シアノ、カルボニル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メルカプト、アルキルチオ、スルホキシド、スルホン、アシルアミノ、アミジノ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、プリン若しくはピリジミン、又はそれらの類似体、或いは誘導体(「ヌクレオ塩基」において定義した通り)、或いは5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖(「単糖」において定義した通りの)などの糖により置きかえることができる。「無置換」原子は、それらの原子価によって示される水素原子をすべて有しているものである。置換基がケトの場合(すなわち=O)、その原子上の2個の水素が置きかえられる。こうした組合せが安定な化合物になる場合に限り、置換基及び/又は可変基の組合せは許容可能となる。「安定な化合物」又は「安定な構造」とは、反応混合物から有用となる程度の純度での単離、及び有効な作用剤への配合に分解しない(survive)程、十分頑強であることを意味する。
置換基の一部の特徴付けでは、ある種の置換基は一緒になって環を形成してもよい。特に明記しない限り、こうした環は、様々な不飽和度(完全飽和から完全不飽和)を示すことができ、ヘテロ原子を含むことができ、また上で記載した通り、他の置換基により置換されていてもよい。
本明細書に記載した化合物は、1つ以上の不斉中心を含んでいることがあり、それ故に、鏡像異性体、ジアステレオマー、及び他の立体異性体形態が生じることがある。各キラル中心は、(R)-又は(S)-として、絶対立体化学について定義することができる。本発明は、ラセミ形態及び光学的に純粋な形態を含め、こうした考えられるすべての異性体、並びにそれらの混合物を含むものと意図される。光学活性な(R)-及び(S)-、(-)-及び(+)-、又は(D)-及び(L)-異性体は、キラルシントン又はキラル試薬の使用により調製することができ、又は従来の技法によって分割することもできる。本明細書に記載されている化合物がオレフィン性二重結合又は他の幾何学的不斉中心を含んでいる場合、特に指定しない限り、該化合物は、E及びZ幾何異性体の両方を含むことが意図されている。同様に、すべての互変異性体形態も含まれることが意図されている。本明細書で見られる任意の炭素-炭素二重結合の立体配置は、便宜的に選択されているに過ぎず、特定の立体配置を指定する意図はない。すなわち、本明細書でトランスとして任意に図示されている炭素-炭素二重結合は、E、Z、又はこれら2つの任意の比の混合物とすることができる。
用語「本発明の化合物」及び等価物という表現は、プロドラッグ、薬学的に許容される塩、酸化物、溶媒和物例えば水和物、並びにその化合物の包接錯体、並びに、文脈がそのように許容する場合、任意の立体異性体形態、又は特に指定しない限り、該化合物のこうした任意の形態の任意の比の混合物を包含するものと意図される。包接錯体は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Remington、The Science and Practice of Pharmacy、19版、1巻、176〜177頁(1995年)に記載されている。最も一般に使用される包接錯体は、シクロデキストリンとのものであり、すべてのシクロデキストリン錯体、天然及び合成のものが、具体的に特許請求の範囲内に包含される。したがって、本発明の一部の実施形態によれば、本明細書に記載した化合物は、医薬組成物に照らすと、処置方法及び化合物自体を含めて、塩形態として提供される。同様に、中間体自体が特許請求されているか否かに関わらず、中間体に対する参照は、文脈がそのように許容する場合、それらの塩及び溶媒和物を包含するものと意図されている。明確性のために、特定の例が、文脈がそのように許容する場合、時として本文中に示されているが、これらの例は、単に例示しているに過ぎず、文脈がそのように許容する場合、他の例を排除することを意図するものではない。
本明細書に開示されている化合物の任意の塩基性窒素含有基の「四級化」もやはり、考えられる。塩基性窒素は例えば、塩化メチル、塩化エチル、塩化プロピル、及び塩化ブチル、それらの臭化物及びヨウ化物などの低級ハロゲン化アルキル、ジメチル硫酸、ジエチル硫酸、ジブチル硫酸及びジアミル硫酸を含むジアルキル硫酸、塩化デシル、塩化ラウリル、塩化ミリスチル及び塩化ステアリル、それらの臭化物及びヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物、並びに臭化ベンジル及び臭化フェネチルを含むハロゲン化アラルキルを含む、当業者に公知の任意の作用剤により四級化することができる。水溶性若しくは油溶性、又は分散性生成物を、こうした四級化により得ることができる。
本発明の1つの態様は、式Iの単離化合物に関する
Figure 2014522882
(式中、
R1は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R1'は、存在しないか、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R2は、式
Figure 2014522882
(式中、
各R1は、独立して、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
n1、n2、及びn3は、各々独立して、0〜30の整数であり、
n4は、1〜30の整数であり、
n1、各n2、及び各n3の合計は、1〜30である)、
R3及びR4は、各々独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR5に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
各R5は、独立して、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
ここで、
R6及びR7は、各々独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個又は6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数であり、
R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
ここで、
各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
n4は、1〜30の整数である)
であって、
但し、この化合物は、ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#4、ascr#5、ascr#6.1、ascr#6.2、ascr#7、ascr#8、ascr#12、ascr#19、ascr#21、ascr#23、ascr#25、bhas#24、bhas#26、bhas#28、bhas#30、及びicas#9ではない)。
本発明のこの態様の一実施形態は、R1が、H、アルキル(例えば、-CH3)、又はアルケニルであり、R'は、存在しないか又はHである、式Iの化合物である。このアルキル又はアルケニルは、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R3及びR4が、それぞれ独立して、H、-C(O)R8、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖などの炭水化物(例えば、グリコシルなどのヘキソース)である、式Iの化合物である。この実施形態による適切な化合物には、例えば、R3が、H又は、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖である化合物、及びR4が、H又は-C(O)R8である化合物を含む、式I'の化合物
Figure 2014522882
が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R5が、-OH、-NHR6、-OCHR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、アルキル、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖などの炭水化物である式Iの化合物である。このアルキル又は炭水化物は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。この実施形態による例示的な化合物には、R5が、-OH、-NHR6、アルキル、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖(例えば、グリコシルなどのヘキソース)である化合物が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R6及びR7の少なくとも1つが存在する、式Iの化合物である。この実施形態では、R6及びR7は、通常、それぞれ独立して、アルキル又はアリールである。このアルキル基又はアリール基は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。例えば、これらの基は、-C(O)R8及び-NHC(O)R8からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換され得る。この実施形態による例示的な化合物は、R6が存在しており、-C(O)R8からなる1つ以上の置換基により場合により置換されているアリールである化合物が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R8が存在する、式Iの化合物である。この実施形態では、R8は通常、-OH、-NH2、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、プリン、又はピリミジンである。このアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、プリン、又はピリミジンは、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。例えば、これらの基は、-OR9、-NHC(O)R9、アルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖などの炭水化物からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換され得る。この実施形態による例示的な化合物には、R8が、-OH、-NH2、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する1つ以上の単糖(例えば、グリコシルなどのヘキソース)により場合により置換されているプリン又はピリミジンである化合物が含まれる。この実施形態による例示的なR8の部分には、インドリル、ヒドロキシフェニル、カルボキシフェニル、及びブテニルが含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R9が存在している、式Iの化合物である。この実施形態では、R9は、通常、H、-NH2、又はアルキルであり、好ましくはH又はアルキルである。
式I'の化合物には、式I'a
Figure 2014522882
の立体異性体が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、アスカロシド(例えば、本明細書では「ascr」と呼ばれる化合物)、(ω-1)-酸素化インドールアスカロシド(例えば、本明細書では「icas」と呼ばれる化合物)、(ω-1)-酸素化βヒドロキシアスカロシド(例えば、本明細書では「bhas」と呼ばれる化合物)、(ω-1)-酸素化インドールβヒドロキシアスカロシド(例えば、本明細書では「ibha」と呼ばれる化合物)、4-(2-(E)-メチル-2-ブテノイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「mhas」と呼ばれる化合物)、グリコシルアスカロシドエステル(例えば、本明細書では「glas」と呼ばれる化合物)、及び4-(4-ヒドロキシベンゾイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「hbas」と呼ばれる化合物)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、(ω)-酸素化アスカロシド(例えば、本明細書では「oscr」と呼ばれる化合物)、(ω)-酸素化インドールアスカロシド(例えば、本明細書では「icos」と呼ばれる化合物)、(ω)-酸素化βヒドロキシアスカロシド(例えば、本明細書では「bhos」と呼ばれる化合物)、及び(ω)-酸素化インドールβヒドロキシアスカロシド(例えば、本明細書では「ibho」と呼ばれる化合物)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R4が-C(O)R8であり、R8はインドリル(例えば、3-インドリル)である、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである化合物が含まれる。こうした化合物には、(ω-1)-酸素化インドールアスカロシドが含まれる。この実施形態による例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。こうした化合物には、(ω-1)-酸素化アスカロシドが含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R4が4-ヒドロキシベンゾイルである、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである化合物が含まれる。こうした化合物には、(ω)-酸素化4-(4-ヒドロキシベンゾイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「hbos」と呼ばれる化合物)が含まれる。この実施形態による例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。こうした化合物には、(ω-1)-酸素化4-(4-ヒドロキシベンゾイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「hbas」と呼ばれる化合物)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R4が2-メチル-2-ブテノイルである、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである化合物が含まれる。こうした化合物には、(ω)-酸素化4-(2-(E)-メチル-2-ブテノイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「mbos」と呼ばれる化合物)が含まれる。この実施形態による例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。こうした化合物には、(ω-1)-酸素化4-(2-(E)-メチル-2-ブテノイル)-アスカロシド(例えば、本明細書では「mbas」と呼ばれる化合物)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R5がα-D-グルコシルである、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである化合物が含まれる。こうした化合物には、(ω)-酸素化グリコシルアスカロシドエステル(例えば、本明細書では「glos」と呼ばれる化合物)が含まれる。この実施形態による例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。こうした化合物には、(ω-1)-酸素化グリコシルアスカロシドエステル(例えば、本明細書では「glas」と呼ばれる化合物)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R5が-OCHR6R7である、式I又は式I'aの化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'は存在しないか又はHである化合物が含まれる。この実施形態による例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、R5が-CR6R7C(O)NHR8である、式I又は式I'aの化合物である。
本発明のこの態様の別の実施形態は、式IAの化合物
Figure 2014522882
(式中、nは、1〜30の整数である)である。この実施形態による例示的な化合物には、式IA'の化合物
Figure 2014522882
が含まれる。式IA及びIA'の例示的な化合物には、「ascr」、「oscr」、「icas」、「icos」、「glas」、「hbas」、及び「mbas」というSMIDにより呼ばれる化合物(例えば、ascr#1、2、4〜5、9〜12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36及び38、oscr#1、3、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36及び38、icas#1、9、10、12、14、16、18、20及び22、icos#1、9、10、16及び18、glas#1、10、16、18、20、22、24及び26、hbas#10、並びにmbas#10を含む)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、式IBの化合物
Figure 2014522882
(式中、mは、1〜28の整数である)である。この実施形態による例示的な化合物には、式IB'の化合物
Figure 2014522882
が含まれる。式IB及びIB'の例示的な化合物には、「ascr」、「oscr」、「icas」、「icos」、「glas」、「hbas」、及び「mbas」というSMIDにより呼ばれる化合物(例えば、ascr#3、7〜8、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35及び37、oscr#7、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35及び37、icas#3、7、15、17、19及び21、icos#3、15及び17、glas#3、hbas#3、並びにmbas#3を含む)が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、式ICの化合物
Figure 2014522882
(式中、q1及びq2は、それぞれ独立して、1〜28の整数であり、q1とq2の合計は、29以下である)である。この実施形態による例示的な化合物には、式IC'の化合物
Figure 2014522882
が含まれる。式IC及び式IC'の例示的な化合物には、R1が-CH3であり、R1'が存在しないか又はHである化合物が含まれる。こうした化合物には、「bhas」及び「ibha」というSMIDにより呼ばれる化合物(例えば、bhas#10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40及び42、並びにibha#10、16、18、20、22、24、26、28及び30)が含まれる。式IC及び式IC'の例示的な化合物には、R1がHであり、R1'は存在しないか又はHである化合物も含まれる。こうした化合物には、「bhos」及び「ibho」というSMIDにより呼ばれる化合物(例えば、bhos#10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40及び42、並びにibho#10、16、18、20、22、24及び26)が含まれる。式IC及び式IC'の例示的な化合物には、R1がH又は-CH3であり、R1'が存在していないか又はHであり、R4が-C(O)R8であり、R8が3-インドリルである化合物も含まれる。こうした化合物には、「ibha」(R1は-CH3である)及び「ibho」(R1はHである)というSMIDにより呼ばれる化合物が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、式IDの化合物
Figure 2014522882
(式中、
Figure 2014522882
は、それぞれ独立して単結合又は二重結合であり、q1、q2及びq3は、それぞれ独立して1〜26の整数であり、q4及びq5は、それぞれ独立して0〜26の整数であり、q1、q2、q3、q4及びq5の合計は28以下であり、q4とq5の合計は1以上である)である。この実施形態による例示的な化合物には、式ID'の化合物
Figure 2014522882
が含まれる。
本発明のこの態様の化合物はまた、2つ以上の式Iのユニットを含有することもできる。これらのユニットは、6員環のユニットから広がる置換基のいずれかによっても互いに連結され得る。例えば、一般式Iのユニットの1つは、同一又は異なる位置を介して、以下に示す、式Iの別のユニットの1'、2'、3'、4'又は5'位において任意の置換基に連結していてもよい。
Figure 2014522882
本発明のこの態様の別の実施形態は、式Iのユニットの1つにおけるR5が、式Iの別のユニットのR3又はR4に連結している結合であり、式Iの少なくとも2つのユニット(2つのみのユニットも含む)を含有する化合物を形成する化合物である。この実施形態による例示的な化合物には、例えば式IE及び式IFの化合物
Figure 2014522882
Figure 2014522882
(式中、R2a及びR2bは、それぞれ独立して式の部分
Figure 2014522882
であり、R3及びR4は、それぞれ独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖である)が含まれる。適切な化合物には、例えば式IE'及び式IF'の化合物
Figure 2014522882
Figure 2014522882
が含まれる。
IE、IE'、IF及びIFの化合物には、アスカロシド二量体(例えば、本明細書では「dasc」と呼ばれる化合物)、例えば、dasc#1、dascs#2及びdasc#3が含まれる。
Figure 2014522882
本発明のこの態様の別の実施形態は、式I"の化合物
Figure 2014522882
である。式I"は、式I'の立体異性体である。式I'の化合物について上で記載されているR1、R1'、R2、R3、R5、R6、R7、R8及びR9のすべての好ましい例示的な定義は、式I"の化合物に関する適切な例でもある。この実施形態による適切な化合物には、R5が-OCHR6R7であり、R6及びR7の少なくとも1つが-NHC(O)R8により置換されているアルキルである、化合物が含まれる。
本発明のこの態様の別の実施形態は、以下の条件の少なくとも1つを満足する、式Iの化合物である。
(i)R1は、独立して、-C(R')3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、各R'は、独立して、ハロゲン又はアルケニルであり、
R1'は、独立して、存在しないか、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、
(ii)R2は、
Figure 2014522882
(式中、
各
Figure 2014522882
は、独立して、単結合又は二重結合であり、
q1、q2及びq3は、各々独立して、1〜26の整数であり、
q4及びq5は、各々独立して、0〜26の整数であり、
q1、q2、q3、q4及びq5の合計は、28以下であり、
q4及びq5の合計は、2以上であり、
(iii)R5は、H、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、又はヌクレオシドであり、
(iv)R5は、式Iの別のユニットのR3又はR4に連結している結合であり、式Iの少なくとも2つのユニットを含む化合物を形成し、
(v)R3及びR4は、各々独立して、-CR6R7R8、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は-(CO)R8であり、R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、上記アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
(vi)本化合物は式I"の化合物
であるが、
但し、該化合物は
Figure 2014522882
ではないとすること、
を満足する。
この実施形態の一例は、条件(i)を満足する化合物である。このアルキル基又はアルケニル基は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。この例には、R1がアルケニルであり、R1'が存在しないか又はHである、化合物が含まれる。
この実施形態の別の例は、条件(ii)を満足する化合物である。こうした化合物には、例えば式ID及びID'の化合物、例えば
Figure 2014522882
が含まれる。
この実施形態の別の例は、条件(iii)を満足する化合物である。このアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、又はヌクレオシドの基は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換されている。好ましくは、この例におけるR5は、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NR6R7、又は-CR6R7C(O)NHR8である。-OCHR6R7が特に好ましい。これらの好ましい例では、R6及びR7は、通常、それぞれ独立して、アルキル又はアリールである。このアルキル基又はアリール基は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。例えば、これらの基は、-OR8、-C(O)R8、及び-NHC(O)R8からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換され得る。好ましくは、R8は、H、-OH、-NH2、アルキル、プリン、又はピリミジンである。このアルキル、プリン又はピリミジンの基は、-COOH、及び5個又は6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換され得る。
この例による適切な化合物には、R5が、
Figure 2014522882
である化合物が含まれる。こうした化合物には、フェニルエタノールアミンアスカロシド(例えば、本明細書では「pasc」と呼ばれる化合物)、及びアスカロシドエタノールアミドが含まれる。この例による例示的な化合物には、
Figure 2014522882
(式中、m1は1(すなわち、pasc#9)、2(すなわち、pasc#12)、又は3(すなわち、pasc#1)である)が含まれる。この実施例によるさらなる例示的な化合物には、以下に示す化合物
Figure 2014522882
(式中、RIは-NH3でありm2は20であるか、又はRIはHでありm2が22である)も含まれる。
この実施形態の別の例は、条件(iv)を満足する化合物である。式Iの少なくとも2つのユニットは、上で記載されている通り連結され得る。この例による適切な化合物には、例えば式IE、式IF、式IE'、式IF'の化合物、及び一般式Iのユニットを2つしか含有していない化合物が含まれる。一部の例では、R1は、独立してH又はアルキル(例えば、-CH3)である。例示的な化合物には、R2aが-(CH2)nC(O)-でありR2bが-(CH2)nC(O)-であり、またR2aとR2bの両方が-(CH2)nC(O)-である式IE及びIE'の化合物、R2aが-(CH2)nC(O)-でありR2bが-(CH2)nC(O)-であり、またR2bとR2bの両方が-(CH2)nC(O)-である式IF及びIF'の化合物、R3がHである化合物、各R1が独立してH又はアルキル(例えば、-CH3)である式IE、IE'、IF及びIF'の化合物、R3がHである式IE、IE'、IF及びIF'の化合物、R4が独立してH又は-C(O)R8であり、R8は、-NHC(O)R9により場合により置換されているアルキルであり、R9は、H又は-NH2である、IE、IE'、IF及びIF'の化合物が含まれる。IE、IE'、IF及びIFの化合物には、アスカロシド二量体(例えば、本明細書では、「dasc」又は「ubas」(「3-ウレイドイソブチレートアスカロシド」(3-ureido isobutyrate ascaroside)を表す)、例えば、dasc#1、dasc#2(ubas#1とも呼ばれる)、及びdasc#3(ubas#2とも呼ばれる)が含まれる。
Figure 2014522882
この実施形態の別の例は、条件(v)を満足する化合物である。このアルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、又はヌクレオシドは、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換され得る。この例による適切な化合物には、R3及びR4がそれぞれ、-C(O)R8であり、R8は、好ましくは-NHC(O)NH2か5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖(例えば、グリコシルなどのヘキソース)のどちらか一方により置換されているアルキルである化合物が含まれる。この例による適切な化合物には、R8が、-[CH2]n4NHC(O)R9又は-[CH2]n4C(O)(NH)R9であり、R9は、好ましくは-OH、フェニル、フェノール、及びカルボキシフェニルからなる群から選択される1つ以上の置換基により置換されているアルキル又はアリールである化合物も含まれる。この例による化合物例には、R3及び/又はR4が、
Figure 2014522882
Figure 2014522882
である、化合物も含まれる。
この実施形態の別の例は、条件(vi)を満足する化合物である。この例による例示的な化合物には、例えば式I"aの化合物
Figure 2014522882
が含まれる。条件(i)〜(iv)について上で記載されているR1、R1'、R2、R3、R5、R6、R7、R8及びR9のすべての好ましい例示的な定義は、この例においても適切である。この例による適切な化合物には、例えば、R1はH又はアルキル(例えば、-CH3)であり、R'は存在しないかHであり、このアルキル基又はアルケニル基は、本明細書で定義されている1つ以上の置換基により場合により置換されており、R2は-(CH2)nC(O)R5であり、R3はHであり、R4はHであり、R5は-OH又は-OCHR6R7(R6、R7、R8及びR9は、例えば、条件(iii)を満足する上で記載した通り、場合により定義される)である式I"及びI"aの化合物である。この例による化合物には、パラトシド(例えば、本明細書では「part」と呼ばれる化合物)、及びヌクレオシド含有パラトシド(例えば、本明細書では「npar」と呼ばれる化合物)、例えば、part#9、npar#1、npar#2、及びnpar#3
Figure 2014522882
も含まれる。
本発明の別の態様は、少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖を含む単離化合物に関する。これらの少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖が、共有結合により連結されている。本化合物は、好ましくは約2,000g/mol未満の分子量を有する。
上で記載される通り、本発明のこの態様による適切なヌクレオ塩基には、天然又は合成ヌクレオ塩基、及び普遍的な塩基が含まれる。少なくとも1つの実施形態では、少なくとも1つのヌクレオ塩基は、プリン、ピリミジン、アデニン、グアニン、チミン、ウラシル、シトシン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、並びにそれらの誘導体及び類似体からなる群から選択される。少なくとも1つの実施形態では、ヌクレオ塩基は、場合により置換されているプリン、例えば、9位に連結している置換基(例えば、少なくとも1つの糖(例えば、ピラノース、3、6-ジデオキシ糖))を有するプリンである。少なくとも1つのヌクレオ塩基は、該ヌクレオ塩基上の任意の原子を介して、又はヌクレオシドの場合、リボース糖を介して、少なくとも1つの糖、少なくとも1つのアミノ酸、及び/又は少なくとも1つの脂肪酸に連結していてもよい。例えば、このヌクレオ塩基は、例えば該ヌクレオ塩基上の環外アミノ基への連結を介して、少なくとも1つのアミノ酸に連結されていてもよい。
本発明のこの態様による適切な脂肪酸には、上で記載されている通り、飽和、不飽和、及びポリ不飽和脂肪酸が含まれる。少なくとも1つの実施形態では、この少なくとも1つの脂肪酸は、ヒドロキシ酸(例えば、C4〜32ヒドロキシ酸)を含む。脂肪酸の脂肪族鎖上に、複数のヒドロキシル置換基が存在していてよい。少なくとも1つのヒドロキシ基は、以下のスキーム1に示されている通り、β位に存在している。
Figure 2014522882
少なくとも1つの実施形態では、この少なくとも1つの脂肪酸は、β-酸素化産生物である。こうした実施形態では、少なくとも1つの二重結合は、該脂肪酸のα位とβ位の間に生じる。少なくとも1つの実施形態では、少なくとも1つの脂肪酸は、例えばヒドロキシ酸のヒドロキシル基へのエーテル連結を介して、少なくとも1つの糖に連結しているC4〜32ヒドロキシ酸である。これには、例えば、アノマー性ヒドロキシル基へのエーテル連結を介して連結しているもの、すなわちベータピラノシド連結を介して連結しているものなどが含まれる。
本発明のこの態様による適切なアミノ酸には、上で記載されている通り、天然又は合成アミノ酸が含まれる。少なくとも1つの実施形態では、この少なくとも1つのアミノ酸は、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸、ガンマアミノ酸、L-アミノ酸、及びD-アミノ酸からなる群から選択される。この少なくとも1つのアミノ酸の側鎖は、例えば*-OR、*NRR'、*-SR、*-C(O)NRR'、及び*-Im-Rからなる群から選択される置換基を含んでもよく、*-は、アミノ酸の炭素原子への置換基の結合部位を表し、Rは、少なくとも1つの脂肪酸のカルボキシ基への連結から生じるアシル基であり、Imは、イミダゾール環であり、R'は、-H、場合により置換されているC1〜12脂肪族、又は場合により置換されているアリールである。
本発明のこの態様による適切な糖には、例えば単糖を含む、当業者に公知のいかなる炭水化物も含まれる。少なくとも1つの実施形態では、この少なくとも1つの糖は、例えばアスカリロース、マンノース、ペントース、ヘキソース、リボース及びデオキシリボースを含む、デオキシ糖、ジデオキシ糖、及び3',6'-ジデオキシ糖からなる群から選択される。
この少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖は、このような連結が有効で且つ生じる化合物が安定である限り、こうした様々な連結により、任意の順序で互いに連結することができる。
本発明のこの態様による適切な実施形態には、例えば上のスキーム1に示される通り、ω-連結又はω-1連結により、少なくとも1つの脂肪酸が少なくとも1つの糖(例えば、アスカリロース)に連結しているものが含まれる。
本発明のこの態様の少なくとも1つの実施形態では、本化合物は少なくとも1つの第2の糖をさらに含んでいる。適切な糖には、上で同定されたものが含まれる。好ましい実施形態では、この少なくとも1つの第2の糖は、リボース糖又は改変済みリボース糖などのペントースである。好ましくは、この少なくとも1つの第2の糖は、ベータグリコシド連結によって少なくとも1つのヌクレオ塩基と少なくとも1つのヌクレオシドを形成することができる。
本発明のこの態様の実施形態には、式[NB]-[AA]-[FA]-[S]を有する化合物、式[S1]-[NB]-[AA]-[FA]-[S2]を有する化合物、及び式[S1]-[S2]-[NB]-[AA]-[FA]-[S3]を有する化合物が含まれ、NBはヌクレオ塩基であり、AAはアミノ酸であり、FAは脂肪酸であり、S、S1、S2及びS3は、それぞれ独立した糖である。2番目の式中のS1及びNB、並びに3番目の式中のS2及びNBは、場合によりヌクレオシドを形成することができる。このヌクレオシドは、例えばアミノ酸のαアミノ基への尿素連結により連結されていてもよい。このアミノ酸は、1つ以上のヘテロ原子を有する側鎖を含んでもよい。脂肪酸は、例えば、アミノ酸の側鎖上に存在しているヘテロ原子と該脂肪酸のカルボキシ部分との間の共有結合を介して、アミノ酸に連結していてもよい。例えば、このアミノ酸は、エステル連結、アミド連結、チオエステル連結、イミド連結、アシルアミジン連結、アシルグアニジン連結などにより、脂肪酸のカルボキシ基に連結していてもよい。或いは、このアミノ酸は、例えば、脂肪酸のカルボキシ基と該アミノ酸側鎖上に存在しているヒドロキシ基との間のエステル連結を介して、脂肪酸に連結していてもよい。
本発明のすべての態様による単離化合物は、公知の方法の応用又は適用により調製することができる。適切な方法には、天然で産生する化合物の単離、及びこれまでに使用された方法、又は文献に記載されている方法、例えば全体が参照により本明細書に組み込まれている、LAROCKのCOMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS(Wiley-VCH publishers、New York(1989年)により記載されている方法を使用する合成が含まれる。化合物を合成するのに適した方法には、実施例15〜21、35〜43、及び80〜81において記載されているものが含まれる。
本発明は、以下の実施例を参照することによって、さらに例示することができる。
[実施例]
以下の実施例は、例示することが意図されているが、添付の特許請求の範囲において説明されている本発明の範囲を決して限定するものではない。
[実施例1]-分析機器及び手順
核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Varian INOVA 600 NMR(1Hは、600MHz、13Cは151MHz)で測定した。NMRスペクトルは、Varian VNMR及びMestreLabs MestReCソフトウェアパッケージを使用して処理した。NMRスペクトルに由来するビットマップの追加処理は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)において記載されているAdobe Photoshop CS3を使用して行った。高速液体クロマトグラフィー-質量分析(HPLC-MS)は、ダイオードアレイ検出器を装備し、Quattro II分光計(Micromass/Waters社)に接続した、Agilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。データ取得及び処理は、MassLynxソフトウェアにより管理した。フラッシュクロマトグラフィーは、Teledyne ISCO CombiFlashシステムを使用して行った。
[実施例2]C.エレガンス株及び一般的培養法
特に言及しない限り、すべての株は、Bacto寒天(BD Biosciences社)により作製し、一晩成長させたOP50細菌を播種した、NGM寒天プレート上で20℃に維持した。C.エレガンス品種のN2 Bristol及びhim-5(e1490)株CB1490由来の雄を、誘引バイオアッセイ及び自動追跡実験に使用した。このhim-5(e1490)突然変異体は、減数分裂の間に、X染色体不分離によりXO型雄後代が分離する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hodgkinら、Genetics 9巻、67〜94頁(1979年))。sra-9プロモーター(Tokumitsu Wakabayashiの寄贈、岩手大学)の影響下で、ASKニューロン中において哺乳動物のカスパーゼを発現する、遺伝子導入株PS6025 qrIs2[sra-9:: mCasp1]を、ASKニューロンの遺伝的除去に使用した。使用した他の株は、以下の通りである。CB4856、C.エレガンスHawaii単離物(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hodgkin & Doniach、Genetics 146巻、149〜64頁(1997年))、RC301、C.エレガンスFreiburg単離物(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Hodgkin & Doniach、Genetics 146巻、149〜64頁(1997年))、DA609 npr-1(ad609)、CX4148 npr-1(ky13)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年))、CX9740 C.エレガンス(N2)、kyEx2144 [ncs 1:: GFP](全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))、N2、Ex(gcy-28:: dp:: mec-4D)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Shinkaiら、J. Neurosci. 31巻、3007〜15頁(2011年))、CX10981 kyEx2866 [“ASK:: GCaMP2.2b"sra-9:: GCaMP2.2b SL2 GFP、ofm 1:: GFP](ASK画像線)、CX11073 kyEx2916 [“AIA:: GCaMP2.2b" T01A4.1:: GCaMP2.2b SL2 GFP、ofm-1:: GFP](AIA画像線)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))、DR476 daf-22(m130)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Golden & Riddle、Mol. Gen. Genet. 198巻、534〜36頁(1985年))、及びdaf-22(ok693)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年))。
[実施例3]-C.エレガンスの代謝物命名
新規に同定したアスカロシドはすべて、4つの文字「SMID」(SMID(Small Molecule IDentifier):低分子識別名)により名前を付け、例えば、「icas#3」又は「ascr#10」である。全体が参照により本明細書に組み込まれているSMIDデータベースは、Paul SternbergとWormBaseとが共同し、Frank Schroeder及びLukas Mueller(Boyce Thompson Institute)により維持されている電子資料である。このデータベースは、C.エレガンス及び他の線虫から新規に同定されたC.エレガンス低分子をカタログに掲載し、同定された低分子に対して固有の4つの文字SMIDを割り当て(検索可能な遺伝子型式の低分子識別名)、さらに各化合物に関して文献で使用された他の名称及び略語のリストを含むものである。
[実施例4]-代謝抽出物の調製
代謝抽出物は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)において以前に記載されている方法に従い、以下の通り修正を加えて調製した。
3つの10cmNGMプレートからの蠕虫(N2又はdaf-22)を、M9培地を使用して100mLのS培地の前培養物に洗い入れ、ここで、回転式振とう器で、22℃で5日間成長させた。1Lの細菌培養物由来の濃縮大腸菌OP50(LB培地中で16時間成長させたもの)を、1日目及び3日目に餌食として加えた。次に、合わせてS培地425mLの体積となるよう、400mLのS培地を含む1Lエルレンマイヤーフラスコに、この前培養物を均等に4分割して入れ、次に、回転式振とう器で、22℃でさらに10日間成長させた。1Lの細菌培養物由来の濃縮OP50を、1〜9日目まで毎日、餌食として加えた。次に、この培養物を遠心分離にかけ、上澄み媒体及び蠕虫ペレットを個別に凍結乾燥した。凍結乾燥した物質は、室温で12時間、95%エタノール(250mL、2回)により抽出した。得られた黄色の懸濁液をろ過した。次に、ろ液を室温において真空で蒸発させ、培地及び蠕虫ペレットの代謝抽出物を生成した。
[実施例5]-クロマトグラフィー分画
2つの培養物からの培地代謝抽出物をオクタデシル官能基化シリカゲル6g上に吸着させ、空の25gのRediSep Rfサンプル装填用カートリッジに乾式充填した。次に、水-メタノール溶媒系を使用して、上記の吸着させた物質を逆相RediSep Rf GOLD30g HPLC 18カラムにより分画した。溶媒は、水100%を4分間から始め、次に、メタノール含量を42分で最大100%メタノールになるまで直線的に増加させて、これを55分まで継続した。この分画から生じた8つのフラクションを真空で蒸発させた。残留物を、HPLC-MS及び二次元核磁気共鳴(2D-NMR)分光法によって分析した。
[実施例6]-質量分析
クロマトグラフィー分画に由来する蠕虫の培地抽出物フラクション又は代謝物フラクションをメタノール1.5ml中で再懸濁させ、5分間2,000gで遠心分離した。上澄み液をHPLC-MS分析に供した。HPLCは、Agilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)で行った。0.1%酢酸-アセトニトリル溶媒のグラジエントを使用し、5%アセトニトリル含量を5分間から始めて、40分間かけて100%に増加した。質量分析法は、ネガティブイオン又はポジティブイオンモードのいずれか一方で、エレクトロスプレーイオン化を使用して行った。
[実施例7]-C.エレガンス無菌培養及び生合成検討
C.エレガンス(N2、Bristol)のインビトロ無菌培養は、シトステロール及びヌクレオシド-5-リン酸の代わりにコレステロール(5mg/l)を含むC.エレガンス維持培地(CeMM、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lu & Goetsch、Nematologica 39巻、303〜11頁(1993年))を使用する、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Nass & HamzaのCurr. Protoc. Toxicol. 31巻、1.9.1〜1.9.18(2007年)により記載されている通り確立された。21日後に、培養物を遠心分離した。得られた上澄み媒体及び蠕虫ペレットを個別に凍結乾燥した。凍結乾燥した蠕虫ペレット(1.2〜2.0mg)をメタノール2mlで抽出し、ろ過し、次いで真空で濃縮した。凍結乾燥した蠕虫の培地を、酢酸エチル-メタノール(95:5、100mL、2回)で抽出してろ過し、次に真空で濃縮した。残留物をメタノール150μlに溶解し、高速液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析(HPLC-ESI-MS)により検討した。施用実験に関しては、CeMM培地50mlに、Cambridge Isotope LaboratoriesからのL-[2,4,5,6,7-D5]-トリプトファン9.2mgを補給した。
[実施例8]-スポット誘引アッセイ
スポット誘引アッセイは、以前に報告された方法(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))によって行った。C.エレガンスの雌雄同体と雄の両方について、次の日に幼成体として使用するために、第4齢期(L4)の蠕虫を毎日50〜60匹採り、性別によって分けて、20℃で一晩、保管した。競争実験については、2つの条件、すなわちエタノールを10%含む水中の、120nMのascr#3及び10nMのicas#3(条件1)、又は12μMのascr#3及び1μMのicas#3(条件2)を使用した。一定分量を20μLチューブ中、-20°Cで保管した。水中の10%エタノールを対照として使用した。
[実施例9]-四分円化学走性アッセイ
非インドールアスカロシドとインドールアスカロシドの両方への化学走性を、10cmの四分円ペトリ板(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wicksら、Dev. Biol. 221巻、295〜307頁(2000年))上で評価した。各四分円は、プラスチック製のスペーサー(図1B)によって隣接した四分円と隔離した(図1B)。反対側の四分円の対に、異なる濃度でインドールアスカロシド又は非インドールアスカロシドのどちらか一方を含んでいる線虫成長培地(NGM)寒天を満たした。動物を基本緩衝液中で優しく洗い、四分円に交互にアスカロシドを含む四分円プレートの中心に置き、15分後及び30分後に点数化した。化学走性指数は、次のように計算した。(アスカロシドのある四分円上の動物数-緩衝液のある四分円上の動物数)/(動物の総数)。
[実施例10]-移動性パラメーターの測定
反転頻度及び速度は、自動蠕虫追跡システム(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))を用いて測定した。
[実施例11]-集団形成アッセイ
蠕虫の集団形成行動は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)において報告されているアッセイを使用して測定した。集団形成アッセイは、標準NGMプレート上で実施した。インドールアスカロシドを含有しているプレートは、NGM培地にインドールアスカロシドのストック溶液を添加した後に、プレートに注ぐことにより作製した。これらのプレートを、室温で2〜3日間、乾燥した。対照プレートは、icas溶液の代わりにエタノール溶液(icas溶液により導入されるエタノールの量に相当する)をプレートに添加したことを除いて、同様に処理した。このプレートの最終エタノール濃度は、すべての条件について0.1%未満であった。乾燥後、対照プレートと、インドールアスカロシドを含むプレートの両方に、マイクロピペットを使用して、大腸菌OP50の一晩培養物150μlを播種し、室温で2日間乾燥させた。
「低蠕虫密度」実験については、20匹の蠕虫を細菌叢上に置き、3時間20℃にした。「高蠕虫密度」実験については、約120匹の蠕虫を細菌叢上に置き、3時間20℃にした。集団形成行動は、動物の体長の50%を超えて、2匹以上の動物と接触した動物数として定量した。
[実施例12]-カルシウムイメージング及び解析
ASK(kyEx2866)及びAIA(kyEx2916)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))中で遺伝的にコードされるCa2+センサーを発現する遺伝子導入系をカルシウムのイメージングに使用した。幼成体又は成体の蠕虫を、「嗅覚チップ(Olfactory chip)」というマイクロ流体デバイスに装着した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Chronisら、Nat. Methods 4巻、727〜31頁(2007年))。icas#3の希釈は、S基本緩衝液(コレステロールなし)を用いて行った。少量のエタノールを含むicas#3のストック溶液として、等量のエタノールをS基本対照液流に加えた。
イメージングは、Andorカメラを装備した反転Zeiss顕微鏡を使用して行った。イメージ獲得のための露光時間は300ミリ秒とした。ASKは、青色光そのものに反応するので、ASKニューロンをイメージングする前に、蠕虫を3分間、青色光に暴露させた。このステップは、ニューロンがCa2+測定に使用する青色光に順応するために必要である。映像を、注文仕様のMatlabスクリプトを使用して解析した。緩衝液又はicas#3のどちらか一方に暴露した際の平均蛍光変化量を算出するために、緩衝液又はicas#3への暴露直後の最初の蛍光ピークを選んだ。次に、5秒間の蛍光の平均値からこの最大値を差し引いた後、icas#3/緩衝液を導入した(図2Dにおいて、5〜10秒間の領域に相当する)。
[実施例13]-統計的解析
(i)インドールアスカロシドに関する雌雄同体及び雄の誘引を比較するため(*: p<0.01、**: p<0.001、***: p<0.0001)(図1C〜1D、3A、3D、4A、5A、及び6C)、(ii)未除去系及びASK除去系の間の反転を比較するため(*: p<0.01、**: p<0.001)(図7A〜B)、(iii)ASKとAIAに関して、及びASIニューロン除去及びRMGニューロン除去について、遺伝的除去系に対する野生型蠕虫の誘引を比較するため(***: p<0.0001)(図2B)、(iv)緩衝液及びicas#3に対するG-CaMP蛍光を比較するため(**: p<0.001)(図2E)、ウェルチ補正を伴うスチューデント独立t検定を使用した。(i)様々な株の四分円化学走性指数の比較のため(*: p<0.05、**: p<0.01)(図1E及び3B〜C)、(ii)インドールアスカロシドを含むプレート上の単独型、社会型の蠕虫、及びCel-daf-22の集団形成の比較のため(*: p<0.05、**: p<0.01)(図5C、6A〜B、及び8A〜C)、(iii)インドールアスカロシドを含むプレート上の蠕虫の停止期間を比較するため(*: p<0.05、**: p<0.01)(図8D)、及び(iv)インドールアスカロシドを含むプレート上の速度及び反転頻度を比較するため(*: p<0.05、**: p<0.01)(図6D〜E)、一元配置ANOVA、その後にダンネットの事後検定を使用した。エラーバーはすべて、平均値の標準誤差(S. E. M)を示している。
[実施例14]-100fMにおけるL4蠕虫の体積中のicas#3の分子数計算
100fM(フェントモル濃度)における、1匹のL4蠕虫の体積中のicas#3の分子数(n)は、式(1)を使用して計算した:
n=VYA*c*NA(1)
(式中、
VYA=C.エレガンスの幼成体の体積(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Knightら、Evol. Dev. 4巻、16〜27頁(2002年))
c=濃度(100fM)
NA=アボガドロ数
この場合、VYA=3*106μm3=3*10-9L、及びc=10fM=10-14Mである。nの解は、n=VYA*c*NA=3*10-9L*10-14mol*L-1*6.022*1023mol-1=18分子数である。したがって、icas#3濃度10fMにおいて、寒天の1匹の蠕虫の体積中に、18個のicas#3分子が含まれて存在している。
[実施例15]-化学合成
バイオアッセイにおいて及びHPLC-MS用標準品として使用するためのインドールアスカロシドicas#1、icas#7、icas#3及びicas#9の試料を化学合成によって調製した。詳細な合成手順、及びNMR分光分析データを、実施例16〜21で説明する。
[実施例16]-アスカロシドascr#9の合成
Figure 2014522882
ascr#9を調製するために、ascr#6の合成について記載されている条件を使用して、(R)-ヘキサ-5-エン-2-オール2(32mg、0.32mmol)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)中で記載されている通り調製した)をトリクロロアセトイミド1(150mg、0.3mmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))にカップリングした。得られたグリコシド3(92mg、0.21mmol)をアセトン(2ml)に溶解し、過マンガン酸カリウムの1M溶液2mlで処理した。30分後、反応混合物を、氷冷した飽和塩化ナトリウム水溶液(5ml)、酢酸(0.1ml)、及びジクロロメタン(DCM)(5ml)の混合物に注いだ。有機相を分離し、水相をDCM5ml部で2回抽出した。合わせた有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発させて乾燥し、0.5Mの水酸化リチウム水溶液(2ml)及びジオキサン(6ml)の混合物に再度溶解した。この混合物を70℃で3時間撹拌し、次に23℃に冷却して、0.2M塩酸水溶液で酸性にした。この混合物を蒸発させて乾燥し、メタノール-DCM溶媒のグラジエントを使用するCombiflashカラムクロマトグラフィーによって精製すると、粘性オイルとして、純粋なascr#9が15.6mg(0.063mmol)得られた。
ascr#9に関する1H(600MHz)及び13C(126MHz)NMR分光分析データは、メタノール-d4中で得た。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。カップリング定数は、ヘルツ[Hz]で与えられる。1H NMR(600MHz, CD3OD): δ 4.65(s, 1H), 3.84(m, 1H), 3.72(m, 1H), 3.61(dq, 1H, J=9.4Hz, J=6.1Hz), 3.51(ddd, 1H, J=11.2Hz, J=9.5Hz, J=4.5Hz), 2.43(m, 2H), 1.95(dt, 1H, J=13.1Hz, J=3.5Hz), 1.71-1.87(m, 3H), 1.22(d, 3H, J=6.1Hz), 1.15(d, 3H, J=6.1Hz) ppm; 13C NMR(126MHz, CD3OD): δ 174.5, 97.3; 71.5, 71.4, 69.9, 68.4, 36.0, 33.5, 31,3, 19.1, 18.1 ppm; ESI-MS(m/z): [M-H] 247.2.
[実施例17]-アスカロシドascr#10の合成
Figure 2014522882
ascr#10を調製するため、ascr#3(3.2mg、10.6μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))のエタノール10mlの撹拌溶液を、パラジウム担持活性炭を使用して23℃で18時間、水素化した(10%Pd、H2圧は1気圧)。完結後、反応物を蒸発させて乾燥した。残留物は、メタノール及びDCMの1:8(v/v)混合物を使用してシリカのショートパッドでろ過し、純粋なascr#10を3.0mg(9.9μmol)得た。
ascr#10に関する1H(600MHz)及び13C(126MHz)NMR分光分析データは、メタノール-d4中で得た。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照した。カップリング定数は、ヘルツ[Hz]で与えられた。1H NMR(600MHz, CD3OD): δ 4.64(s, 1H), 3.78(m, 1H), 3.71(m, 1H), 3.63(dq, 1H, J=9.3Hz, J=6.2Hz), 3.51(ddd, 1H, J=11.2Hz, J=9.3Hz, J=4.6Hz), 2.27(t, 2H, J=7.4Hz), 1.94(dt, 1H, J=13.0Hz, J=3.7Hz), 1.77(ddd, 1H, J=13.3Hz, J=11.5Hz, J=3.0Hz), 1.61(m, 2H), 1.56(m, 1H), 1.46(m, 1H), 1.32-1.38(m, 6H), 1.21(d, 3H, J=6.2Hz), 1.12(d, 3H, J=6.1Hz) ppm; 13C NMR(126MHz, CD3OD): δ 177.7, 97.3, 72.3, 71.0, 69.8, 68.1, 38.1, 38.2, 35.7, 34.9, 30.0, 26.5, 26.0, 19.0, 18.0 ppm; ESI-MS(m/z): [M-H] 303.2.
[実施例18]-インドールカルボキシアスカロシドicas#1の合成
Figure 2014522882
icas#1を調製するために、ascr#1をまず、対応するメチルエステルに変換した。全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)において報告されている通りに調製した、ascr#1(10mg、0.036mmol)を、トルエン(1mL)及びメタノール(1mL)の混合物に溶解した。この混合物に、トリメチルシリルジアゾメタン(TMS-ジアゾメタン(ヘキサン2M溶液、50μL、0.1mmol)溶液を加えた。23℃で20分間撹拌した後、過剰のTMS-ジアゾメタンを、酢酸(40μL)の添加により分解(destroyed)し、溶媒を真空で除去すると、粘性オイルとして、ascr#1のメチルエステル(10.3mg、0.035mmol)が得られた。
次に、インドール-3-カルボニルクロリドの溶液を調製した。少量のジメチルホルムアミド(DMF)(20μL)を含む乾燥DCM(2ml)中のインドール-3-カルボン酸(67.7mg、0.42mmol)のよく撹拌した懸濁液を、0℃で塩化オキサリル(0.84mmol、107mg、72μL)で処理した。塩化オキサリルへの添加に続いて、この混合物を23℃で2時間撹拌すると、透明でわずかに黄色の溶液が生成した。過剰の塩化オキサリルの除去を確実とするために、この溶液を、0.1Torrの減圧下で蒸発させて乾燥し、続いて2mlの乾燥DCMに再度溶解した。
ascr#1のメチルエステルの試料(10.3mg、0.035mmol)を乾燥DCM1mlに溶解し、この液に、ジイソプロピルエチルアミン(129mg、1mmol)を加えた。得られた溶液に効果的な撹拌子を装備し、-20℃に冷却した。続いて、インドール-3-カルボン酸クロリドの溶液を、激しく撹拌しながら、10分間かけて滴下して加えた。よく撹拌した反応物を-7℃まで徐々に温め、この温度で、氷冷した飽和重炭酸ナトリウム水溶液(2ml)を加えた。二相の混合物を20℃まで温め、酢酸エチルにより3回抽出した。合わせた酢酸エチル抽出物を減圧下で蒸発させて、DCM中の0〜10%メタノールを使用して、シリカゲル上のカラムクロマトグラフィーに付した。
ascr#1メチルエステルのビス-2,4-O-(-インドール-3-カルボニル)-誘導体を含むフラクションを一緒にして、蒸発して乾燥し、67℃で3時間、0.5M水酸化リチウム水溶液3ml及びジオキサン7mlの混合物により処理した。続いて、この反応混合物を23℃に冷却し、0.2M塩酸水溶液の添加により中和し、真空で蒸発させた。残留物を、Agilent Eclipse XDB C-18カラム(25cm×9.4mm、粒子径5μm)によるHPLCによって精製した。溶媒としてアセトニトリル及び0.1%水性酢酸を使用し、アセトニトリルの百分率を、0分時の15%から30分時に85%まで増加した。icas#1含有フラクションを蒸発させると、ワックス様の白色固形物として標的化合物5.8mg(0.014mmol)が得られた。
icas#1の1H(600MHz)、13C(126MHz)、及びHMBC NMR分光分析データをメタノール-d4を使用して取得し、以下の表1中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。カップリング定数は、ヘルツ[Hz]で与えられる。*: 相互変換可能である。
Figure 2014522882
[実施例19]-インドールカルボキシアスカロシドicas#3の合成
Figure 2014522882
icas#3を調製するために、ascr#3をまず、対応するメチルエステルに変換した。全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)において報告されている通りに調製した、ascr#3(5.2mg、0.017mmol)を、トルエン(1mL)及びメタノール(1mL)の混合物に溶解した。この混合物に、TMS-ジアゾメタン(ヘキサン2M溶液、25μL、0.05mmol)溶液を加えた。23℃で20分間撹拌した後、過剰のTMS-ジアゾメタンを酢酸(30μL)の添加により分解し、溶媒を真空で除去すると、粘性オイルとして、ascr#3のメチルエステル(5.3mg、0.017mmol)が得られた。
ascr#3のメチルエステル(10.3mg、0.035mmol)の試料を、すべての試薬を比例して少なくした量を使用して、icas#1の調製に関して実施例18に記載した通り、インドールカルボニルクロリドと反応させた。実施例18に記載した条件を使用するHPLCによって粗製反応生成物を精製すると、無色オイルとしてicas#3(2.3mg、5.2μmol)が得られた。
icas#3の1H(600MHz)、13C(126MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表2中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。カップリング定数は、ヘルツ[Hz]で与えられる。
Figure 2014522882
[実施例20]-インドールカルボキシアスカロシドicas#7の合成
Figure 2014522882
icas#7(120μg)の標準試料は、ascr#1からのicas#1の調製に関して実施例18に記載されている通り、ascr#7(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))から得られた。
icas#7の1H(600MHz)NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表3中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppmを参照する。カップリング定数は、ヘルツ[Hz]で与えられる。
Figure 2014522882
[実施例21]-インドールカルボキシアスカロシドicas#9の合成
Figure 2014522882
Icas#9は、ascr#1からのicas#1の調製について実施例18に記した通り、ascr#9から取得した。NMR分光分析データは、公表データ(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Org. Lett. 11巻、3100〜03頁(2009年))に一致している。
[実施例22]-比較メタボロミクスによるインドールアスカロシドicas#3の同定
現在のところ公知となっている、C.エレガンス中の低分子フェロモンはすべて、ヒトステロールキャリアータンパク質SCPxと強い相同性を有するタンパク質であるDAF-22を介した長鎖脂肪酸のペルオキシソームβ-酸化に由来している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年))。推定上の集合形成フェロモンが同じ経路に由来し得ることが疑われ、daf-22突然変異体は、それらを産生しないことを示唆した。その場合、野生型のメタボロームと、daf-22突然変異蠕虫から得られたものとの分光学的比較により、誘引シグナル又は集団形成シグナルの候補化合物を明らかにすべきである。
以前の研究では、NMRスペクトルの層別解析(「DANS」)と呼ばれるNMRの分光学法に基づく技法が、野生型のメタボロームとdaf-22突然変異蠕虫のメタボロームとを比較するために使用された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))。この比較は、ascr#6〜8の同定に結びついており、これらのうち、ascr#8が雄誘引シグナルの主要成分である(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))。シグナル対ノイズ比の改善したNMRスペクトルに基づいて、野生型のメタボロームとdaf-22突然変異体のメタボロームのより詳細な比較が行われ、野生型のメタボロームにおけるインドール含有化合物のいくつかは、daf-22蠕虫によって産生されないことが明らかになった(図9B〜C)。フェロモンの生合成におけるDAF-22の役割が確立されたことにより(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年)、Golden & Riddle、Mol. Gen. Genet. 198巻、534〜36頁(1985年))、これらのインドール誘導体は、以前には認識されていないシグナル伝達分子のファミリーとなり得ることが示唆されている。
daf-22-依存性インドール誘導体の構造及び生物学的役割を明確にするために、野生型のメタボロームのNMR分光法により導かれる分画により、これらのインドール誘導体の完全な同定を推し進めた。逆相クロマトグラフィーは、8つの代謝物フラクションを生じ、これらを二次元NMR分光法により分析した。NMRスペクトルにより、2つのフラクション中にdaf-22-依存性インドール誘導体の存在が明らかにされ、さらなるNMR分光学研究及び質量分析検討を行うためにこれらのフラクションを選択した。これらの分析により、最も多量に存在しているdaf-22-依存性インドール誘導体は、公知のascr#3において発見されたものと同一の、炭素が9個の不飽和側鎖を有するアスカリロースに連結しているインドールカルボキシ単位から構成されることが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))(実施例18〜19、図10〜13中のNMR及びMSデータを参照されたい)。公知のascr#3との構造上の関係に基づいて、この新規に同定された代謝物は、インドールカルボキシアスカロシド(indole carboxy ascaroside)「icas#3」(図9E)と命名された。
[実施例23]-icas#3はトリプトファンから誘導される低分子のより大きなファミリーの一部である。
DANSにより検出された他のdaf-22依存性インドール化合物の一部が、やはりインドールアスカロシドであるかどうかを判断するために、これらを検討した。icas#3の質量スペクトル分析により、関連化合物に関してスクリーニングを可能にする特徴的なMSフラグメンテーションパターン(インドール-3-カルボキシ部分が失われる、図12)が明らかになるので、質量分光(MS)手法をこの検討のために使用した。
類似のフラグメンテーションプロファイルによる化合物に関するMSスクリーニングにより、icas#3が、5〜9個の炭素を有する側鎖を特徴とする、一連のインドールアスカロシドのより大きなメンバーであることが示されている(図9D〜E)。インドールアスカロシドのこのファミリーの最も多量の成分はicas#3、icas#9及びicas#10であり、これらは、少量のicas#1及びicas#7を伴う(図9E)。icas#9を除き、これらの化合物はすべて新規の代謝物であり、icas#9は中程度の耐久型幼虫の誘発活性を有することが報告されており、また鐘形応答曲線を生じる点で、公知の耐久型幼虫フェロモンの中で特有のものである(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Org. Lett. 11巻、3100〜03頁(2009年))。
2種の新規非インドールアスカロシドも検出された。すなわち、炭素5個の飽和側鎖を特徴とするascr#9、及び炭素9個の飽和側鎖を特徴とするascr#10であり、これらは公知のascr#3の飽和類似体である(図9F)。
MS分析により、インドールアスカロシドの定量的分布は、対応する非インドールアスカロシドのそれとははっきり異なることがさらに明らかになり、インドール単位の取り込みが強く調節されていることを示唆している。最も多量のインドールアスカロシドであるicas#3は、対応する非インドールアスカロシドであるascr#3の10〜40倍多量に伴う一方、icas#9は対応するascr#9よりも多い(図9G)。
インドールアスカロシド生合成起源の決定、及びインドールアスカロシドが大腸菌食物源により産生される可能性を除外するため、C.エレガンス(N2)のインビトロ無菌(細菌が非存在)培養を、化学的に規定したCeMM培地を使用して確立した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lu & Goetsch、Nematologica 39巻、303〜11頁(1993年)、Nass & Hamza、Curr. Protoc. Toxicol. 31巻、1.9.1-1.9.18(2007年))。無菌培養のHPLC-MS分析により、icas#1、icas#3、icas#9及びicas#10の存在が明らかになり、こうして、インドールアスカロシドが、餌食用細菌の関与なしにC.エレガンスによって産生されることが示された。無菌培地中のL-[2,4,5,6,7-D5]-トリプトファンとL-トリプトファンの1:1混合物の使用により、[D5]-icas#1、[D5]-icas#3、[D5]-icas#9、及び[D5]-icas#10が、等量の非標識化合物と共に産生された(図13)。結論として、これらの生化学検討により、インドールアスカロシド中のインドール-3-カルボキシ部分のトリプトファン起源が確立され、これらの化合物は、強力に調節された生合成経路の産生物であることが示される。
[実施例24]-インドールアスカロシドが雌雄同体を強く誘引する
アスカロシドにインドール-3-カルボキシ部分を付加すると、重要な構造変化を示す。この化学的差異は、これらの化合物に関するシグナル機能が、それらの非インドール同族体のものとは異なることを示し得る。
側鎖長が変わる3種の合成インドールアスカロシド、icas#1、icas#3、及びicas#9をスポット誘引アッセイで試験し、低分子の社会的機能を実証した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))(図1A)。3種の被試験インドールアスカロシド、icas#1、icas#3、及びicas#9はすべて、高濃度において雄と雌雄同体の両方を誘引した(図1C)。最も多量に存在するインドールアスカロシドicas#3を広範囲の濃度にわたり試験することにより、低濃度では、icas#3は雌雄同体を強く誘引する一方、雄はもはや誘引されないことが明らかになった(図1D)。同様に、雄ではなく雌雄同体が、低濃度のicas#9に強く誘引された(図5A)。
icas#3への雌雄同体の誘引を、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Wicksら、Dev. Biol. 221巻、295〜307頁(2000年)において報告されている四分円化学走性バイオアッセイを使用してさらに検討した(図1B)。化合物の点源への誘引を測定するスポット誘引アッセイとは対照的に、四分円化学走性アッセイは、十分に規定された化合物濃度により、プレート区域上の雌雄同体の集団形成を測定するものである(全体が参照により本明細書に組み込まれているMacoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Wicksら、Dev. Biol. 221巻、295〜307頁(2000年))。1pMもの低濃度のicas#3により、餌食の存在下及び非存在下の両方において、雌雄同体(図1E)が強く誘引されることが分かった(図5B)。
こうして、icas#3の生物学的役割は、対応する非インドールアスカロシドascr#3のそれとははっきりと異なっており、ascr#3は雄を強く誘引するが、雌雄同体を忌避する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))。ここでは、この結果は、アスカリロースの4位に単にインドール-3-カルボキシ基を結合することにより、強力に雄を誘引するascr#3は、主に雌雄同体を誘引するシグナルに変換されることを示している。ascr#3及びicas#3が蠕虫により産生される量の差異は、それらの相対的な効力に対応している。すなわち、icas#3よりもはるかに効力が低く雄を誘引するascr#3は、非常に強力な雌雄同体誘引物質icas#3よりもはるかに高い濃度で産生される(図9G)。
[実施例25]-単独型及び社会型の野生型雌雄同体は、icas#3に誘引されるが、非インドールアスカロシドには誘引されない
スポット誘引アッセイ及び四分円化学走性アッセイからの結果は、雌雄同体がインドールアスカロシドに強く誘引されることを示しており、これらの化合物が、C.エレガンスの集団形成行動を調節することを示唆している。C.エレガンスは、その食料調達行動に天然の変化を示し、一部の株(例えば、一般的な実験室株N2)は細菌叢上では個々に分散する一方、ほとんどの野生型株(例えば、RC301及びCB4856(Hawaii))は、細菌が最も多量な所に集合して集団形成をする(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Hodgkin & Doniach、Genetics 146巻、149〜64頁(1997年))。これらの変種は、それぞれ「単独型」及び「社会型」と呼ばれる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Rogersら、Nat. Neurosci. 6巻、1178〜85頁(2003年))。食料調達行動及び集団形成行動におけるこれらの差異は、一つのアミノ酸の位置に違いのある、ニューロペプチドY様受容体NPR-1の2つの異なる対立遺伝子に関係している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Rogersら、Nat. Neurosci. 6巻、1178〜85頁(2003年))。すなわち、N2などの単独型の株は、NPR-1の高活性変種(215-バリン)を発現する一方、CB4856などの集団形成型の株は、NPR-1の低活性変種(215-フェニルアラニン)を発現する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Rogersら、Nat. Neurosci. 6巻、1178〜85頁(2003年))。N2のバックグラウンドで生じた、高度機能喪失変異体npr-1(ad609)及びnpr-1(ky13)もまた、集団形成する傾向が高いことを示している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Hodgkin & Doniach、Genetics 146巻、149〜64頁(1997年))。
以前の研究により、npr-1の機能喪失は、非インドールアスカロシドに対する雌雄同体の応答に影響を及ぼすことが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれているMacoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。NPR-1の高活性変種を発現する野生型(N2)蠕虫は、非インドールアスカロシドにより忌避されるが、npr-1(ad609)突然変異体は、最も多量に存在する非インドールアスカロシドであるascr#2、ascr#3及びascr#5の生理的に近い混合物に誘引されることが示された(全体が参照により本明細書に組み込まれているMacoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。
四分円化学走性アッセイとスポット誘引アッセイの両方により、ascr#2/3/5混合物へのnpr-1(ad609)雌雄同体の誘引が確認された。しかし、2種の社会型の被試験野生型株(RC301及びCB4856)の雌雄同体は、一方のアッセイには誘引性を示さなかった(図3A〜B)。対照的に、社会型の野生型株(RC301及びCB4856)とnpr-1(ad609)雌雄同体の両方とも、四分円化学走性アッセイ及びスポット誘引アッセイの両方で、icas#3に強く誘引された(図3B〜D及び5B〜C)。これらの結果は、icas#3は、単独型と社会型のC.エレガンス株の両方において、雌雄同体誘引物質として作用することを示している。
[実施例26]-フェントモル濃度のインドールアスカロシドはC.エレガンスの集団形成を促進する
インドールアスカロシドの一定のバックグラウンド濃度がどのように雌雄同体の行動に影響するかを試験した。単独型のN2蠕虫及びいくつかの社会型株(社会型の野生型株CB4856及び2種のnpr-1機能喪失型突然変異体を含む)の集団形成を、2種の異なる条件、すなわち5cmプレートあたり120匹の蠕虫を有する「高蠕虫密度」、及び5cmプレートあたり20匹の蠕虫を有する「低蠕虫密度」を使用して、icas#3に対する応答を測定した。
低蠕虫密度では、単独型と社会型の雌雄同体の両方について、集団形成の非常に強力な向上が、icas#3が10fM(フェントモル濃度)もの低い濃度で観察された(図8A及び14E)。N2雌雄同体の集団形成は、icas#3が1pMにおいて4倍向上しており、より高いicas#3濃度により、より小さな集団形成が生じた。同様に、天然の社会型株CB4856は、icas#3が1pMにおいて最大の集団形成となる鐘形応答曲線を示し、より小さな集団形成は、icas#3が1nMである対照と有意な差がなかった(図8A)。対照的に、icas#3は、試験を行った濃度範囲全体にわたり、より高い濃度において低下することなく、npr-1(ad609)雌雄同体の集団形成を向上させた(図8A)。高蠕虫密度では、最大3倍のN2雌雄同体の集団形成向上が、icas#3プレート上で観察された(図8B及び14F)一方、試験を行った3種の社会型株に由来する雌雄同体はすべて、icas#3の非存在下でさえもほぼ完全な集団形成を示しており、これにより、icas#3のいかなる追加的な集団形成促進効果の検出も排除された(図8B)。これらの結果は、icas#3がこの化合物の濃度勾配がない場合でさえ、雌雄同体の集団形成を向上させること、並びに単独型及び社会型株は、同様に影響を受けることを示している。同様に、2番目に多量に存在しいているインドールアスカロシドであるicas#9は、単独型と社会型の雌雄同体の両方の集団形成を向上させた(図6A)。
雌雄同体の非存在下において一般に集団形成する傾向がある、雄の集団形成に対するicas#3の効果(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Gems & Riddle、Genetics 154巻、1597〜610頁(2000年))も検討した。icas#3のプレート上において、him-5雄の集団形成が、顕著に向上することが観察された(図6B)。
これらの結果は、濃度勾配がない場合でさえも、インドールアスカロシドが集団形成行動を促進することを示しており、これにより、icas#3及びicas#9の感知は、他の集団形成を促進する(化学的又は他の)シグナル又は条件に対する応答に影響を及ぼすことが示唆される。例えば、外因性icas#3を含有しているプレート上の蠕虫によるさらなるインドールアスカロシドの分泌は、集団形成の向上が観察される一因となり得る。この可能性を検討するために、集団形成アッセイにおけるdaf-22雌雄同体を試験した。daf-22雌雄同体はインドールアスカロシドを産生しなかったが、スポット誘引アッセイと四分円化学走性アッセイの両方においてN2蠕虫と同じぐらい強力にicas#3に応答した(図3B及び5C)。daf-22雌雄同体は、10pMのicas#3ではなく、1pMのicas#3において、N2蠕虫よりも小さい集団形成を示すことが分かった(図8C)。これらの結果は、蠕虫によるさらなるインドールアスカロシド又は他のdaf-22依存性化合物の分泌は、icas#3プレート上に集団形成する一因となり得ることを示している。しかし、低酸素レベル又は他の蠕虫との接触などの他の要因(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Rogersら、Curr. Biol. 16巻、649〜59頁(2006年)、Changら、Publ. Lib. Sci. Biol. 4巻(9号)、e274(2006年)、Chang & Bargmann、PNAS 105巻、7321〜26頁(2008年))がより重要となり得る。さらに、icas#3のプレート上の移動性行動の変化は、集団形成のレベルに影響を及ぼすことができる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Rogersら、Curr. Biol. 16巻、649〜59頁(2006年))。蠕虫移動(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Croninら、BMC Genet. 6巻、5頁(2005年))を追跡するための自動機器監視システムを使用すると、icas#3の集団形成誘発濃度は平均停止期間中に大きく増加し、他の移動性パラメーターに影響を及ぼすことが見いだされた(図6D〜E及び8D)。蠕虫の移動性のこうした変化は、他の集団形成媒介性要因と共に、icasプレート上の集団形成の向上を観察する一因となり得る。
[実施例27]-icas#3に対する応答は、感覚ニューロンASK及び介在ニューロンAIAを必要とする
双器の単一細毛感覚ニューロンであるタイプK(ASK)は、C.エレガンスの行動を媒介する際に重要な役割を果たす。以前の研究により、雄及び雌雄同体の、非インドールアスカロシドに対する行動応答に、ASKニューロンが必要なことが示された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。ASK感覚ニューロンは、RMG介在ニューロンへの解剖学的なギャップ結合を介して連結しており、集団形成、並びにASK及び他の感覚ニューロンから、入力に基づく関連行動を調節する中心として作用することが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Whiteら、Philos. Trans. R. Soc. London[Biol]314巻、1〜340頁(1986年))(図2A)。
icas#3媒介性の雌雄同体の誘引及び集団形成に必要な神経回路を検討するため、ASKニューロンがこれらの行動に必要かどうか判断するための試験を行った。ニューロンの発達における哺乳動物のカスパーゼの細胞特異的発現のため、ASKニューロンが欠損している蠕虫(Tokumitsu Wakabayashi、岩手大学、日本)を、これらの試験に使用した。ASK感覚ニューロンの除去により、icas#3への誘引がほぼ完全に失われる(図2B)。対照的に、ASKニューロンのように耐久型幼虫のフェロモン感知に関与するASIニューロンの除去は、雌雄同体において、icas#3媒介性の誘引に対して何ら有意な効果を持たなかった(図2B)。さらに、ASIニューロンとASKニューロンの両方を除去すると、ASK除去単独の場合と比較して、さらに有意に誘引性が喪失することはなく、ASK感覚ニューロンはicas#3の感知に必要であることを示唆している(図2B)。
ASKニューロンが、icas#3媒介性の集団形成に必要かどうかを判断するための試験も行った。結果は、いずれの被試験濃度(図2C)においても、ASKニューロンが欠損している雌雄同体は、icas#3に応答して集団形成をしなかったことを示している。icas#3プレート上のASK除去雌雄同体の移動性解析により、野生型蠕虫について観察される通り、反転頻度が増加することもなく、速度が低下することもないことが示された(図7A〜B)。
次に、RMG介在ニューロンが、icas#3媒介性行動に必要かどうかを判断するための試験を行った。微分干渉(DIC)顕微鏡を使用して、野生型の蠕虫及びncs-1:: gfpを発現する遺伝子導入株(Bargmannの研究室からの寄贈)における、RMG介在ニューロンの細胞の位置を突き止めた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Sulstonら、Dev. Biol. 100巻、64〜119頁(1983年))。この導入遺伝子は、RMG介在ニューロン及び他の少数の感覚ニューロンにおいて、GFPを発現する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。野生型蠕虫とncs-1:: gfp蠕虫の両方におけるRMG介在ニューロンの除去は、スポット誘引アッセイにおいて、icas#3応答に影響を及ぼさないことが分かった(図2B)。これらの結果は、非インドールアスカロシドの行動影響とは対照的に、ASK感覚ニューロンからのicas#3由来の誘引シグナルの変換にRMG介在ニューロンが必要なのではなく、ASK感覚ニューロンとRMG介在ニューロンの両方を必要としていることを示している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。
この観察を考慮すると、下流におけるどのASK介在ニューロンがicas#3に対する応答に必要であるかを決めるための試験も行った。C.エレガンスの系統図によれば、ASKニューロンの主要なシナプス出力が、AIA介在ニューロンである(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Whiteら、Philos. Trans. R. Soc. London[Biol]314巻、1〜340頁(1986年))。AIA介在ニューロンにおいて機能亢進型MEC-4を発現する遺伝子導入系(Ishihara研究室からの寄贈、日本)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Shinkaiら、J. Neurosci. 31巻、3007〜15頁(2011年))を使用して、icas#3の感知にAIA介在ニューロンが必要かどうか試験した。MEC-4、すなわちDEG/ENaCナトリウムチャネルの発現は、C.エレガンスにおいてニューロン毒性を引き起こし、これにより、AIAニューロンが喪失する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Harbinderら、PNAS 94巻、13128〜33頁(1997年))。AIA欠損蠕虫は、icas#3に対して何ら誘引を示さず、AIA介在ニューロンがicas#3応答に必要であることが示唆された。したがって、icas#3への誘引に必要な神経回路は、非インドールアスカロシドのそれとは異なる。
行動アッセイにより、ASKニューロン及びAIAニューロンがicas#3の感知に関与していることが示されたので、icas#3がこれらのニューロンにおいて、カルシウム流入を誘発するかどうか判断するための試験を行った。Ca2+流入を測定するために、これらのニューロンにおいて遺伝的にコードされたカルシウムセンサー(GCaMP)を発現する遺伝子導入系を使用した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。「嗅覚チップ」を使用して、これらのニューロンからイメージングをしながら、蠕虫を抑制し、icas#3のON及びOFFステップを適用した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Chronisら、Nat. Methods 4巻、727〜31頁(2007年))。1pMから1μMに及ぶ広範囲の濃度を適用した場合でさえも、ASKニューロンにおけるCa2+の移行は検出されなかった。次に、ASKニューロンの主要なシナプス標的であるAIA介在ニューロンにおけるカルシウムの応答をモニターした(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Whiteら、Philos. Trans. R. Soc. London[Biol]314巻、1〜340頁(1986年))。この結果は、3種の非インドールアスカロシドの混合物によりAIA介在ニューロンが刺激されると報告されている結果と同様に、icas#3は、AIAニューロンにおいてG-CaMP蛍光の著しい向上を誘発したことを示した(図2D〜E)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。これらの結果は、icasに対する応答にASK感覚ニューロンが必要であること、及びこの応答がAIA介在ニューロンを介して変換されることを示している。
[実施例28]-icas#3及びascr#3は競合シグナルである
以前の研究により、耐久型幼虫を誘発する高い濃度のascr#3は、社会型及び単独型の雌雄同体の両方を強力に抑止することが示された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。ascr#3の添加が、雌雄同体のicas#3媒介性誘引に影響するかどうかを検討するために、12:1(ascr#3: icas#3)という生理的に近い比でこれら2種の化合物を含有している混合物を、修正を加えたスポット誘引アッセイにおいて試験し、N2雌雄同体の誘引を3種の同心ゾーンA〜Cで点数化した(図1A)。この結果は、より低い2種の試験濃度(120fmolのascr#3及び10fmolのicas#3)において、ascr#3が存在してもicas#3媒介性の誘引は妨害されないが、ascr#3の濃度がより高いと、比例的に増加したicas#3濃度の存在下でさえ強く忌避したことを示している(12pmolのascr#3及び1pmolのicas#3、図4A)。多くの蠕虫は、ゾーンAの外部の縁から後退した後、ゾーンA内側の高濃度icas#3/ascr#3ブレンドによって忌避された中心ゾーンAを取り囲む円形
ゾーンBに「捕捉」されて居残るが、ゾーンBに散布したより低濃度のicas#3/ascr#3ブレンドによって誘引された。これらの結果は、高濃度の生理的混合物であるicas#3/ascr#3において、ascr#3の忌避効果が支配的である一方、icas#3による誘引は、より低い濃度で支配的となることを示している。
実施例1〜28の考察
インドールアスカロシドは、野生型雌雄同体を強力に誘引して集団形成を促進することが示された最初のC.エレガンスのフェロモンである。インドールアスカロシドは、それらが、性には関わりなく、放出領域に同種を引きつける及び/又は阻止するという点で、集合形成フェロモンの広い定義に適合する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、EDWARD O. WILSON、SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS(The Belknap Press of Harvard University、Cambridge、Mass.、第25記念版、2000年)、Shorey、Annu. Rev. Entomol. 18巻、349〜80頁(1973年)、Wertheimら、Annu. Rev. Entomol. 50巻、321〜46頁(2005年))。これらの行動を促進する際は、インドールアスカロシドは、蠕虫の行動応答がわずか数個の分子の感知によって生じなければならない程の低(フェントモル濃度)濃度において活発となる。例えば、10fMの濃度のicas#3では、成体の雌雄同体の長さ及び径に相当する円筒には、約20個のicas#3分子だけしか含有されていない。それらが高い比活性であることを考慮すると、インドールアスカロシドは、非インドールアスカロシドよりもはるかに少ない存在量であると考えるのが妥当である。
インドールアスカロシドの強力な誘引物性により、これらの化合物は、食物源などの望ましい環境に同種を誘引する働きをすることが示唆される。しかし、競合実験からの結果は、icas#3による雌雄同体の誘引は、高濃度のascr#3により打ち消すことができ、ascr#3は、雌雄同体に対して忌避的である(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))。競合実験はさらに、icas#3とascr#3との生理的ブレンドが低濃度である場合、icas#3の誘引特性が支配的となる一方、その同じブレンドが高濃度である場合、ascr#3による忌避が支配的となることを示している(図4A)。これらの知見は、高い個体群密度を有する耐久型幼虫誘発性条件下では、ascr#3を高濃度で一緒にすると分散が促進される一方(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))、低い個体群密度、及びそれに対応して低濃度のascr#3は、icas#3により媒介される誘引をもたらすことが示唆される。したがって、icas及びascrは、個体群密度及び集団形成のレベルの逆の刺激調節を示し得る。ひいては、個体群密度、食物利用度、他の環境因子が、調整回路の一部として、ascr及びicasの相対的な生合成速度に影響を及ぼし得る。
インドールアスカロシドは、濃度勾配の非存在下でさえも集団形成行動に影響を及ぼす。すなわち、icas#3及びicas#9の非常に低いバックグラウンド濃度(fM-pM)により、雌雄同体(及び雄)が集団形成する傾向を強力に高めた。この知見は、icas#3及びicas#9の感知がプレート上の蠕虫によって分泌されるさらなる量のicasなどの、集団形成を促進する(化学的、又は他の)シグナル又は条件に対する感受性を高めることを示唆している。
C.エレガンスにおける集団形成は、一連の遺伝的因子、並びに食物利用度及び酸素濃度を含む環境条件に依存することが知られており、このことは、異なる源からの入力を統合する神経回路が存在することを示唆している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Cheungら、Curr. Biol. 15巻、905〜17頁(2005年)、Coates & de Bono、Nature 419巻、925〜29頁(2002年)、de Bonoら、Nature 419巻、899〜903頁(2002年)、Grayら、Nature 430巻、317〜22頁(2004年))。酸素感知URXニューロン及びascr感知ASKニューロンを含む、いくつかの異なる感覚ニューロンに由来する集団形成シグナル及び誘引シグナルが、RMG介在ニューロンに収束することが最近示されており、このRMG介在ニューロンが、これらの行動を調整する中心として作用することが提唱されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。RMG介在ニューロンは、ニューロペプチドY受容体のホモログNPR-1の中心的な作用部位であり、このNPR-1は、単独型株(高いNPR-1活性)と社会型株(低いNPR-1活性)とを区別している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Bono & Bargmann、Cell 94巻、679〜89頁(1998年)、Rogersら、Nat. Neurosci. 6巻、1178〜85頁(2003年))。社会型のnpr-1(lf)突然変異体雌雄同体では、酸素感知URXニューロンは、細菌叢の縁で集団形成を促進する一方、単独型N2雌雄同体は、酸素勾配に応答しない。同様に、単独型雌雄同体がascrによって忌避されるように、ascrによる忌避はNPR-1に依存する一方、社会型のnpr-1(lf)雌雄同体は、著しく低い忌避か弱い誘引のどちらか一方を示す(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。
対照的に、icas#3は、社会型株及び単独型株の両方において、雌雄同体の誘引及び集団形成を促進することが示された。icas#3は、単独型のN2及び社会型のnpr-1(lf)雌雄同体を誘引し、単独型株N2、NPR-1の低活性変種を有する社会型の野生型株RC301及びCB4856(Hawaii)、並びに2種の被試験npr-1ヌル対立遺伝子においては、雌雄同体の集団形成を向上させた。icas#3媒介性の誘引及び集団形成が、NPR-1の高い活性によって縮小しなかったという知見は、これらのicas#3媒介性の行動が、低酸素レベルなどの他のタイプの刺激に対する集団形成応答を制御するものとは異なるシグナル伝達経路に依存していることを示唆している。このことは、NPR-1を介して他の集団形成応答を調整するRMG介在ニューロンを欠損している雌雄同体が、icas#3に依然として誘引されるという観察により支持される。さらに、icas#3媒介性の集団形成は、icas#3プレート上の蠕虫の集団形成が、より速度論的なものであり、酸素が限られる細菌叢の縁には制限されないという点で、NPR-1依存性の集団形成行動とは異なるものであった。蠕虫の速度は、最大の集団形成(1〜10pM、図6D)を引き起こすicas#3濃度においては著しく縮小せず、またicas#3媒介性の集団形成は、集団形成をしているNPR-1突然変異蠕虫(平均集塊サイズ6〜16匹の蠕虫)について観察されるものよりも小さな集塊(平均集塊サイズ3〜5匹の蠕虫)を伴う(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Rogersら、Curr. Biol. 16巻、649〜59頁(2006年))。これらの観察は、icas#3媒介性の集団形成が、NPR-1及びRMG介在ニューロンによって制御される集団形成行動とは表現型が異なることを示している。
icas#3媒介性の誘引及び集団形成は、ascrによる雌雄同体の忌避及び雄の誘引に類似し、ASKニューロンに依存することが示され(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))、C.エレガンスにおいて、異なるタイプのフェロモンの知覚に対する一対の感覚ニューロンの中心的な役割であることを裏付けた(図2A〜E)。さらに、icas#3応答は、AIA介在ニューロンに依存することが示され、RMG介在ニューロンを必要としなかった。したがって、感覚ニューロンASKが、2つの異なるタイプのフェロモンであるascr及びicasの知覚に関与すること、並びに、これらのシグナルは、構造上多様な一連のフェロモンのシグナルを統合する複雑なニューロン回路及び遺伝子回路の一部として、2つの異なる神経生理的経路を介して変換されるように思われる。
カルシウムの移行は、非インドールアスカロシドに応答する双器感覚ニューロンから記録される。しかし、報告されたG-CaMP蛍光の変化は、比較的小さいものである(約20%程度)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Kimら、Science 326巻、994〜98頁(2009年))。非インドールアスカロシドascr#5は、ASI感覚ニューロンにおけるカルシウム移行を誘発しないが、ASIニューロンは、ascr#5のセンサーとして機能し、ascr#5-受容体srg-36及びsrg-37を発現することが最近報告された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、McGrathら、Nature 477巻、321〜25頁(2011年))。同様に、広範囲の濃度のicas#3に応答するASKニューロンにおける顕著なCa2+移行は検出されなかった。恐らく、icas#3は極めて低濃度(フェントモル濃度から低ピコモル濃度)でも活性であるので、このニューロンにおけるicas#3誘発性のCa2+シグナルのいずれもが、非インドールアスカロシドのものよりも一層弱い。さらに、ASKニューロンがいくつかの他の感覚ニューロンに対するシナプス後であることを考慮すると、icas#3シグナル伝達におけるさらなるニューロンの関与が存在し得る(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Whiteら、Philos. Trans. R. Soc. London [Biol] 314巻、1〜340頁(1986年))。特に、本明細書で示される通り、icas#3は、ASK感覚ニューロンの主要な後シナプス標的である、AIA介在ニューロンにおけるG-CaMP蛍光に著しい変化を誘発した(図2D〜E)。
集団形成シグナルとしてのインドールアスカロシドの同定により、C.エレガンスにおける社会性シグナル伝達は予期しない程複雑であることが明らかになった。本明細書におけるこの結果は、アスカリロース由来の低分子(icas及びascr)は、C.エレガンスにおいて、少なくとも3つの個別の機能を果たすことを示している。すなわち、耐久型幼虫の誘発、雄の誘引、及び雌雄同体の社会性シグナル伝達である(図4B)。以前の研究により、ascrは2つ以上の機能を有することが多いことが示されている。例えば、ascr#3は、耐久型幼虫のシグナル伝達と雄の誘引の両方にとって重要な役割を果たす(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))。本明細書における結果は、アスカリロース由来の低分子の構造上の特定の変種が、特定の機能と関係していることを実証する(図4C)。インドールカルボキシ基のascrへの付加はシグナル伝達特性を変化させ、その結果、インドール修飾化合物が、未修飾化合物のものとは非常に異なるシグナル伝達効果を有することができる。すなわち、icas#3は雌雄同体を強力に誘引し、集団形成を促進する一方、ascr#3は、雌雄同体を忌避し、雄を誘引する。構造上の変化の他に、個別のシグナル伝達機能は、異なる濃度幅に関係していることも本明細書において示されている。すなわち、耐久型幼虫形成に高いナノモル濃度のascrが必要であるが、低いナノモル濃度から高いピコモル濃度のascrは雄の誘引を促進し、またピコモル濃度からフェントモル濃度のicasは、雌雄同体の誘引及び集団形成を促進する(図4B)。
こうして、C.エレガンスにおける社会性シグナル伝達は、構造上個別のビルディングブロックのいくつかを組み合わせた組立物に由来する、低分子のモジュール言語に基づいているように思われる(図4C)。これらのビルディングブロックの様々な組合せは、異なる、時として重複するシグナル伝達機能を果たしている。同一側鎖を有する相対的に多量のascr及びicasに関する結果(図9G)により、様々なビルディングブロックの統合が、慎重に制御されていることが示されている。生化学的に、ビルディングブロックは、3つの基本的な代謝経路に由来している。すなわち、炭化水素代謝、ペルオキシソーム脂肪酸β-酸化、及びアミノ酸代謝である。これらの構造上の観察は、低分子による社会性シグナル伝達が、有機体の総合的な同化状態からの入力を変換しているものである可能性を提起している。他の環境因子と共同した食物利用度及び栄養の内容物がascr及びicasの生合成経路を制御して、集団形成、交尾誘引、及び発達のタイミングを分化的に調節する、特定のフェロモンブレンドを生成し得る。化学的なモジュール言語の語彙を拡張することにより、様々な線虫が、同種間及び異種間でシグナル伝達することが可能になるが、C.エレガンス以外の線虫種が、化学情報交換するためにアスカリロースをベースとする低分子に依存しているのかどうか未知であった。アスカリロースの脂質由来のグリコシドが、他のいくつかの線虫種から同定されており(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bartleyら、J. Nat. Prod. 59巻、921〜26頁(1996年))、このことは、線虫がascr又はicas様化合物を産生する能力を有することができることを示し得る。
誘引シグナル及び集団形成シグナルとしてのインドールアスカロシドの同定により、C.エレガンスの集団形成行動が、同種によって産生される専用の化学シグナルに依存し、特定の環境条件に対して共有する好みには依存しないことが実証された。このように、C.エレガンスの社会性シグナル伝達は、以前に疑問が持たれたよりも、かなり一層高度に進化をとげているように思われる。
[実施例29]-分析機器
NMRスペクトルは、Varian INOVA 600(1Hは600MHz、13Cは151MHz)、INOVA 500(1Hは500MHz、13Cは125MHz)、又はINOVA 400(1Hは400MHz、13Cは100MHz)分光計で記録した。NMRスペクトルは、Varian VNMR、MestreLabs MestReC、及びMnovaソフトウェアパッケージを使用して処理した。
低分解能HPLC-MS及びHPLC-MS/MSは、ダイオードアレイ検出器を装備し、Quattro II質量分光計(Micromass/Waters社)に接続した、Agilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。高分解能MS/MSは、LTQ Orbitrap Velos Hybridフーリエ変換(FT)質量分析計を使用して行った(Thermo Scientific、Cornell University Life Sciences Core Laboratories Center)。高分解能HPLC-MSは、Waters Acquity UPLC HSS C-18カラム(2.1×100mm、粒子径1.8μm)を装備し、Xevo G2 QTof質量分析計に接続した、Waters社、nanoACQUITY UPLCシステムを使用して行った。MSデータ取得及び処理に、MassLynxソフトウェアを使用した。
フラッシュカラムクロマトグラフィーは、Teledyne ISCO CombiFlashシステムを使用して行った。HPLC分画は、Agilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を装備し、Teledyne ISCO Foxy 200フラクションコレクターに接続した、Agilent 1100 Series HPLCを使用して行った。
[実施例30]C.エレガンス株及び一般的培養方法
C.エレガンス品種Bristol、株N2(野生型)、acox-1(ok2257)、dhs-28(hj8)、maoc-1(hj13)、maoc-1(ok2645)、daf-22(m130)、daf-22(ok693)、F58F9.7(tm4033)、C48B4.1(ok2619)、F59F4.1(ok2119)、及びF08A8.3(tm5192)は、Bacto寒天(BD Biosciences社)により作製し、且つ一晩成長させた大腸菌OP50を播種した、NGM寒天プレート上で20℃に維持した。
[実施例31]-代謝抽出物の調製
10cmNGMプレートからの、野生型(N2、Bristol)又はacox-1(ok2257)、maoc-1(hj13)、dhs-28(hj8)、及びdaf-22(ok693)突然変異蠕虫を、M9培地を使用して100mLのS培地の前培養物に洗い入れ、ここで、1分あたり(rpm)220回数の回転式振とう器で、22℃で4日間成長させた。1Lの細菌培養物由来の濃縮大腸菌OP50を、1日目及び3日目に餌食として加えた。続いて、4日目に100mLのS培地を含む500mLエルレンマイヤーフラスコに、各前培養物を均等に4分割した。これらの培養物の2つ(非飢餓(NS)と名付けた)は、回転式振とう器で、22℃で5日間成長させて、500mLの細菌培養物由来の濃縮OP50を、1〜4日目まで毎日、与えた。各セットの残り2つ(飢餓(S)と名付けた)の培養物には、500mLの細菌培養物由来の濃縮OP50を1日目に1回与え、さらに9日間は餌食なしに、回転式振とう器で、22℃で9日間成長させた。続いて、この培養物を、NSについては5日目に、Sについては10日目に採取し、遠心分離にかけた。得られた上澄み媒体及び蠕虫ペレットをドライアイス-アセトンスラッシュで凍結させ、個別に凍結乾燥した。上澄み液由来の凍結乾燥物質は、95%エタノール150mLにより、室温で16時間抽出した。蠕虫ペレットは、乳鉢及び乳棒を使用して、顆粒NaCl約2gと一緒に粉砕し、100%エタノール100mLにより、室温で16時間抽出した。得られた懸濁液をろ過した。ろ液を室温で真空で蒸発させると、培地の代謝(蠕虫「エクスクレトーム」)抽出物、蠕虫のペレットの代謝抽出物が生成する。
[実施例32]-daf-22(m130)によるアスカロシド食餌実験
アスカロシドの食餌実験は、添加されたアスカロシドにより、daf-22(ok693)突然変異体よりも成長障害にそれほど敏感ではないdaf 22(m130)突然変異体により行った。daf-22(m130)のHPLC-MSの解析により、daf22(ok693)と類似のアスカロシドプロファイルにより、12個未満の炭素鎖長を有する短鎖アスカロシドがとりわけ完全に無いことが示された。daf 22(m130)の非飢餓培養物は、実施例31に記載した通りだが、前培養物の分割後1日目に、ascr#3、又はascr#10とoscr#10の1:1混合物のどちらか一方の培養物につき5μMを添加して成長させた。
[実施例33]-試料調製
培地又は蠕虫ペレット代謝抽出物は、メタノール約15mL中で再懸濁して、遠心分離にかけた。次に、上澄み液を集めて、室温で真空で濃縮し、メタノール1mLに再懸濁して、遠心分離にかけた。得られた抽出物30μLを、LC-MS/MS分析用に直接注入した。
[実施例34]-質量分析
低分解能HPLC-MS/MSプロファイリングは、Agilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を装備し、スプリット10:1を使用するQuattro II質量分析計に接続したAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。0.1%酢酸-アセトニトリル溶媒のグラジエントを使用し、3.6ml/分の流速で、5%アセトニトリル含量を5分間から始めて、40分間かけて100%に増加した。代謝抽出物は、3.5kVのキャピラリー電圧、並びに-40V及び+20Vのコーン電圧をそれぞれ使用し、ネガティブイオンモード及びポジティブイオンモードでHPLC-ESI-MSにより分析した。m/z=73.0(ネガティブモード)の前駆体イオン及び130.0(ポジティブモード)の中性体の喪失についてのHPLC-MS/MSのスクリーニングは、2.1mtorr及び30eVの衝突ガスとしてアルゴンを使用して行った。アスカロシドのフラグメンテーションは、LTQ Orbitrapを使用する高分解能MS/MSによりさらに分析した。新規化合物の元素組成を確認するために、Xevo G2 QTofを使用する高分解能HPLC-MSにより突然変異体のメタボローム試料及びフラクションをさらに分析した。
[実施例35]-アスカロシドoscr#9の合成
アスカロシドoscr#9は、以下のスキーム2で示される通り調製した。
Figure 2014522882
3を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(1、132mg、263μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))及び5-ヒドロキシペンタン酸メチル(2、125mg、950μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Huckstepら、Synthesis 10巻、881〜82頁(1982年))の乾燥DCM(3ml)溶液を0℃で、トリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)で処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の20〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、5-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ペンタン酸メチル(3)(66.8mg、142μmol、47%)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 1.28(d, J=6.2Hz, 3H), 1.67-1.80(m, 4H), 2.23(m, 1H), 2.40(t, J=6.9Hz, 2H), 2.48(m, 1H), 3.58(m, 1H), 3.64(s, 3H), 3.83(m, 1H), 4.13(dq, J=9.8Hz, J=6.0Hz, 1H), 4.87(s.br, 1H), 5.15(ddd, J=11.0Hz, J=10.4Hz, J=4.5Hz, 1H), 5.18(s.br, 1H), 7.50-7.60(m, 4H), 7.62-7.72(m, 2H), 8.05(d, J=7.5Hz, 2H), 8.11(d, J=7.5Hz, 2H); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 18.3, 22.5, 29.6, 30.4, 34.0, 51.5, 67.5, 67.9, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.3, 130.4, 131.0, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9, 166.0, 174.0.図15A〜Bを参照されたい。
oscr#9を調製するために、LiOH(28mg、1.4mmol)及び水(0.6ml)の1,4-ジオキサン(4ml)混合物に、3(66.8mg、142μmol)の乾燥THF(0.5ml)溶液を加えた。66°Cで2時間撹拌した後、この溶液を氷酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。1%酢酸を含むDCM中の5〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして5-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ペンタン酸(oscr#9)(26mg、105μmol、74%)が得られた。1H NMR(400MHz, メタノール-d4): δ(ppm) 1.22(d, J=6.0Hz, 3H), 1.58-1.72(m, 4H), 1.77(ddd, J=13.1Hz, J=11.1Hz, J=3.2Hz, 1H), 1.95(ddt, J=13.1Hz, J=3.7Hz, J=0.9Hz, 1H), 2.33(t, J=7.2Hz, 2H), 3.43(dt, J=9.6Hz, J=6.0Hz, 1H) 3.47-3.59(m, 2H), 3.71(dt, J=9.8Hz, J=6.2Hz, 1H), 3.77(m, 1H), 4.50(s, 1H); 13C NMR(100MHz, メタノール-d4): δ(ppm) 18.1, 23.0, 30.1, 34.7, 36.0, 67.9, 68.3, 69.4, 70.9, 100.4, 177.5.図16A〜Bを参照されたい。
[実施例36]-アスカロシドoscr#10の合成
アスカロシドoscr#10は、以下のスキーム3で示される通り調製した。
Figure 2014522882
5を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(1、132mg、263μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))及び9-ヒドロキシノナン酸メチル(4、112.8mg、600μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaiら、Tetrahedron 64巻、6760〜69頁(2008年))の乾燥DCM(3ml)溶液を0℃で、トリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)で処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の20〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、9-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸メチル(5)(99.3mg、190μmol、72%)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 1.28(d, J=6.2Hz, 3H), 1.30-1.40(m, 6H), 1.40-1.49(m, 2H), 1.56-1.72(m, 2H), 2.22(ddd, J=13.6Hz, J=11.5Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.30(t, J=7.5Hz, 2H), 2.46(m, 1H), 3.55(dt, J=9.8Hz, J=6.5Hz, 1H), 3.60(s, 3H), 3.81(dt, J=9.6Hz, J=6.6Hz, 1H), 4.13(dq, J=9.7Hz, J=6.2Hz, 1H), 4.86(s.br, 1H), 5.15(ddd, J=11.4Hz, J=9.8Hz, J=4.6Hz, 1H), 5.18(m, 1H), 7.50-7.60(m, 4H), 7.63-7.71(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 18.3, 25.6, 26.8, 29.7, 29.9, 30.0, 30.2, 30.4, 34.4, 51.4, 67.4, 68.2, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.2, 130.3, 130.9, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9, 165.9, 174.3.図17A〜Bを参照されたい。
ascr#10を調製するために、LiOH(38mg、1.9mmol)及び水(800μl)の1,4-ジオキサン(5ml)混合物に、5(99.3mg、190μmol)のTHF(500μl)溶液を加えた。66°Cで3時間撹拌した後、この溶液を酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。1%氷酢酸を含むDCM中の5〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして9-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸(oscr#10)(49mg、161μmol、85%)が得られた。1H NMR(400MHz, メタノール-d4): δ(ppm) 1.22(d, J=6.1Hz, 3H), 1.32-1.43(m, 8H), 1.56-1.63(m, 4H), 1.77(ddd, J=13.1Hz, J=11.1Hz, J=3.2Hz, 1H), 1.96(ddt, J=13.1Hz, J=3.7Hz, J=0.9Hz, 1H), 2.28(t, J=7.4Hz, 2H), 3.41(dt, J=9.6Hz, J=6.2Hz, 1H) 3.49-3.59(m, 2H), 3.68(dt, J=9.8Hz, J=5.5Hz, 1H), 3.76(m, 1H), 4.49(s, 1H); 13C NMR(100MHz, メタノール-d4): δ(ppm) 17.3, 25.2, 26.4, 28.0, 29.3, 29.5, 29.6, 30.5, 34.1, 61.1, 67.4, 68.5, 69.9, 99.4, 176.8.図18A〜Bを参照されたい。
[実施例37]-アスカロシドbhas#10の合成
アスカロシドbhas#10は、以下のスキーム4で示される通り調製した。
Figure 2014522882
9を調製するために、6(366mg、1.91mmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Guan & Greenberg,、J. Am. Chem. Soc. 131巻、15225〜31頁(2009年))及び7(104mg、380μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Evans & Andrews、Angew. Chem. Int. Ed. 47巻、5426〜29頁(2008年))の乾燥DCM(10ml)溶液を、DCM(0.5ml)中の1,4-ベンゾキノン(4mg、38μmol))で処理し、10分間撹拌した。グラブス(Grubbs)の第2世代触媒(16mg、19μmol)のDCM(0.5ml)溶液を加えた。得られた混合物を40℃で撹拌した。20時間後、混合物を小さい層のシリカでろ過し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜20%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、所望の生成物8及びホモダイマー6の混合物が得られた。この混合物をさらに精製しなかった。代わりに、この粗製混合物(160mg)をエタノール(2ml)に溶解し、Pd/C(15mg、10%、w/w)により40時間、水素化するために処理した。得られた混合物をろ過して真空で濃縮し、ヘキサン中の10〜30%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製すると、無色オイルとして(8R)-ヒドロキシ-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシノナン酸エチル(9)(48mg、144μmol、2ステップで38%)が得られた。1H NMR(500MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.03(s, 3H), 0.06(s, 3H), 0.86(s, 9H), 1.19(d, J=6.2Hz, 3H), 1.26(t, J=7.2Hz, 3H), 1.29-1.47(m, 6H), 1.47-1.53(m, 2H), 2.40(dd, J=14.6Hz, J=5.7Hz, 1H), 2.44(dd, J=14.6Hz, J=7.0Hz, 1H), 3.75-3.83(m, 1H), 4.09-4.15(m, 3H).図19を参照されたい。
10を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(1、62mg、120μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))の乾燥DCM(2ml)溶液を、-10℃で9(47mg、141μmol)及びトリメチルシリルオキシトリフレート(10μl)により処理した。3.5時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(8R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシノナン酸エチル(10)(4.0mg、7.2μmol、6%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 1.19(d, J=6.1Hz, 3H), 1.27(t, J=7.2Hz, 3H), 1.28(d, J=6.4Hz, 3H), 1.33-1.72(m, 8H), 2.20(ddd, J=14.3Hz, J=11.6Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.42(dd, J=16.5Hz, J=9.0Hz, 1H), 2.38-2.45(m, 1H), 2.52(dd, J=16.5Hz, J=3.0Hz, 1H), 3.00(d, J=3.9Hz, 1H), 3.80-3.89(m, 1H), 3.98-4.07(m, 1H), 4.11(dq, J=9.7Hz, J=6.1Hz, 1H), 4.17(q, J=7.2Hz, 2H), 4.95(s.br, 1H), 5.12-5.22(m, 2H), 7.43-7.50(m, 4H), 7.55-7.62(m, 2H), 8.05(d, J=7.5Hz, 2H), 8.11(d, J=7.5Hz, 2H).図20を参照されたい。
bhas#10を調製するために、10(4mg、7.2μmol)のTHF(150μl)溶液を、水(100μl)及び1,4-ジオキサン(250ml)中のLiOH(7mg、290μl)により、67℃で5時間処理した。反応混合物を酢酸(100μl)により酸性にし、真空で濃縮して、メタノール(2ml)により処理し、真空で濃縮した。0.5%氷酢酸を含むDCM中の5〜25%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(8R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシノナン酸(bhas#10)(1.5mg、4.7μmol、65%)が得られた。
bhas#10に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表4中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図21A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例38]-アスカロシドbhas#22の合成
アスカロシドbhas#22は、以下のスキーム5で示される通り調製した。
Figure 2014522882
Figure 2014522882
12を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(1、132mg、263μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))の乾燥DCM(3ml)溶液を、0℃で、(8R)-ヒドロキシノナ-1-エン(11、85.2mg、600μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれているFerrieら、Synlett 18巻、2891〜93頁(2007年))及びトリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)で処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜30%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(8R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-1-エン(12)(71.0mg、148μmol、56%)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 1.20(d, J=6.1Hz, 3H), 1.27(d, J=6.3Hz, 3H), 1.33-1.72(m, 8H), 2.09(m, 2H), 2.23(ddd, J=13.5Hz, J=11.4Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.47(m, 1H), 3.91(m, 1H), 4.20(dq, J=9.6Hz, J=6.1Hz, 1H), 4.93(ddt, J=10.2Hz, J=2.2Hz, J=1.3Hz, 1H), 5.01(s.br, 1H), 5.02(ddt, J=17.1,Hz, J=2.2Hz, J=1.6Hz, 1H), 5.13(m, 1H), 5.16(ddd, J=11.3Hz, J=9.8Hz, J=4.6Hz, 1H), 5.84(ddt, J=17.1Hz, J=10.3Hz, J=6.8Hz, 1H), 7.50-7.60(m, 4H), 7.63-7.71(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.12(m, 2H); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 18.3, 19.5, 26.3, 29.7, 29.7, 30.4, 34.4, 37.8, 67.7, 71.5, 72.1, 72.9, 94.4, 114.8, 129.4, 129.5, 130.2, 130.4, 131.0, 131.0, 134.1, 134.2, 139.8, 165.9, 166.0.図22A〜Bを参照されたい。
13を調製するために、12(38mg、80μmol)及び7(65mg、240μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Evans & Andrews、Angew. Chem. Int. Ed. 47巻、5426〜29頁(2008年))の乾燥DCM(2ml)溶液を、DCM(0.5ml)中の1,4-ベンゾキノン(1mg、8μmol)で処理し、10分間撹拌した。グラブスの第2世代触媒(3mg、4μmol)のDCM(0.5ml)溶液を加えた。得られた混合物を40℃で撹拌した。20時間後、この混合物を小さい層のシリカでろ過し、真空で濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの5:1混合物を使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシトリデカ-5-エノン酸エチル(13)(17.0mg、23μmol、29%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.03(s, 3H), 0.06(s, 3H), 0.86(s, 9H), 1.19(d, J=6.2Hz, 3H), 1.25(t, J=7.1Hz, 3H), 1.28(d, J=6.3Hz, 3H), 1.32-1.44(m, 4H), 1.44-1.52(m, 2H), 1.61-1.68(m, 2H), 1.99-2.06(m, 2H), 2.17-2.22(m, 3H), 2.38-2.43(m, 3H), 3.84(m, 1H), 4.06-4.18(m, 4H), 4.95(s, 1H), 5.14(s.br, 1H), 5.18(dt, J=4.2Hz, J=10.6Hz, 1H), 5.39(dt, J=15.2Hz, J=6.8Hz, 1H), 5.47(dt, J=15.2Hz, J=6.3Hz, 1H), 7.43-7.49(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(d, J=7.4Hz, 2H), 8.11(d, J=7.2Hz, 2H).図23を参照されたい。
14を調製するために、13(14.2mg、18.9μmol)のメタノール(1.5ml)溶液をPd/Cにより処理し、24時間、水素化した。この混合物をろ過して真空で濃縮すると、(12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシトリデカン酸エチル(14)(12.8mg、17.0μmol、90%)が、無色オイルとして得られた。1H NMR(600MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.03(s, 3H), 0.05(s, 3H), 0.86(s, 9H), 1.19(d, J=6.1Hz, 3H), 1.25(t, J=7.1Hz, 3H), 1.28(d, J=6.3Hz, 3H), 1.29-1.40(m, 10H), 1.42-1.53(m, 4H), 1.58-1.68(m, 2H), 2.21(ddd, J=14.0Hz, J=11.7Hz, J=2.8Hz, 1H), 2.37-2.45(m, 3H), 3.84(m, 1H), 4.08-4.15(m, 4H), 4.95(s, 1H), 5.14(s.br, 1H), 5.18(dt, J=4.2Hz, J=10.6Hz, 1H), 7.43-7.49(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(d, J=7.4Hz, 2H), 8.11(d, J=7.2Hz, 2H).図24を参照されたい。
15を調製するために、14(19.5mg、26.8μmol)のアセトニトリル(1ml)溶液を、アセトニトリル(100μl)中の40%水性フッ化水素酸(10μl)により処理した。1時間撹拌後、この溶液をNaHCO3(100mg)で15分間処理し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の5〜80%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(12R)-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシトリデカン酸エチル(15)(12.0mg、19.6μmol、73%)が得られた。1H NMR(501MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 1.19(d, J=6.1Hz, 3H), 1.27(t, J=7.2Hz, 3H), 1.28(d, J=6.4Hz, 3H), 1.30-1.55(m, 14H), 1.60-1.68(m, 2H), 2.21(ddd, J=13.5Hz, J=11.6Hz, J=3.1Hz, 1H), 2.38(dd, J=16.4Hz, J=9.2Hz, 1H), 2.41(m, 1H), 2.49(dd, J=16.3Hz, J=3.1Hz, 1H), 3.84(m, 1H), 3.99(m, 1H), 4.12(dq, J=9.8Hz, J=6.2Hz, 1H), 4.17(q, J=7.1Hz, 2H), 4.95(s, 1H), 5.15(s.br, 1H), 5.18(ddd, J=11.2Hz, J=9.9Hz, J=4.5Hz, 1H), 7.43-7.49(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H).図25を参照されたい。
bhas#22を調製するために、15(12mg、19.6μmol)のTHF(1ml)溶液を、水(200μl)及び1,4-ジオキサン(2ml)中のLiOH(15mg)により、67℃で3時間処理した。この反応混合物を酢酸(100μl)により酸性にして真空で濃縮して、メタノール(2ml)により処理して真空で濃縮した。0.2%酢酸を含むDCM中の5〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(12R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシトリデカン酸(bhas#22)(7.3mg、19.4μmol、99%)が得られた。
bhas#22に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表5中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照した。図26A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例39]-アスカロシドbhos#26の合成
アスカロシドbhos#26は、以下のスキーム6で示される通り調製した。
Figure 2014522882
17を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(1、132mg、263μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年))の乾燥DCM(3ml)溶液を、0℃で11-ヒドロキシウンデカ-1-エン(16、102mg、600μmol)及びトリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)により処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜30%(v/v)酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、11-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ウンデカ-1-エン(17)(92.3mg、182μmol、69%)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 1.28(d, J=6.2Hz, 3H), 1.30-1.49(m, 11H), 1.63-1.72(m, 2H), 2.03(m, 2H), 2.22(ddd, J=13.5Hz, J=11.3Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.46(m, 1H), 3.55(dt, J=9.7Hz, J=6.5Hz, 1H), 3.80(dt, J=9.8Hz, J=6.7Hz, 1H), 4.13(dq, J=9.8Hz, J=6.3Hz, 1H), 4.86(s.br, 1H), 4.90(ddt, J=10.2Hz, J=2.2Hz, J=1.3Hz, 1H), 5.98(ddt, J=17.1,Hz, J=2.2Hz, J=1.6Hz, 1H), 5.15(ddd, J=11.3Hz, J=9.8Hz, J=4.6Hz, 1H), 5.18(m, 1H), 5.80(ddt, J=17.1Hz, J=10.3Hz, J=6.8Hz, 1H), 7.49-7.59(m, 4H), 7.62-7.71(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ(ppm) 18.28, 26.88, 29.67, 29.83, 30.10, 30.16, 30.28, 34.46, 67.43, 68.25, 71.43, 71.53, 97.00, 114.66, 129.42, 129.48, 130.23, 130.35, 130.95, 130.96, 134.08, 134.19, 139.78, 165.89, 165.91.図27A〜Bを参照されたい。
18を調製するために、17(30.8mg、60μmol)及び7(50mg、180μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Evans & Andrews、Angew. Chem. Int. Ed. 47巻、5426〜29頁(2008年))の乾燥DCM(2ml)溶液を、DCM(0.5ml)中の1,4-ベンゾキノン(1mg、8μmol)で処理し、10分間撹拌した。グラブスの第2世代触媒(3mg、4μmol)のDCM(0.5ml)溶液を加えた。得られた混合物を40℃で撹拌した。20時間後、この混合物を小さい層のシリカでろ過し、真空で濃縮した。ヘキサンと酢酸エチルの5:1混合物を使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシペンタデカ-5-エノン酸エチル(18)(14.2mg、18.9μmol、31%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.03(s, 3H), 0.06(s, 3H), 0.86(s, 9H), 1.25(t, J=7.2Hz, 3H), 1.30(d, J=6.2Hz, 3H), 1.27-1.43(m, 12H), 1.61-1.68(m, 2H), 1.95-2.02(m, 2H), 2.16-2.25(m, 2H), 2.35-2.46(m, 3H), 3.50(dt, J=9.6Hz, J=6.5Hz, 1H), 3.76(dt, J=9.6Hz, J=6.8Hz, 1H), 4.04-4.18(m, 4H), 4.82(s, 1H), 5.18(ddd, J=11.2Hz, J=9.9Hz, J=4.7Hz, 1H), 5.21(s.br, 1H.), 5.37(dt, J=15.2Hz, J=7.0Hz, 1H), 5.45(dt, J=15.3Hz, J=6.9Hz, 1H), 7.43-7.50(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H).図28を参照されたい。
19を調製するために、18(14.2mg、18.9μmol)のメタノール(1.5ml)溶液をPd/C(10mg、10%、w/w)により処理し、24時間、水素化した。この混合物をろ過し、真空で濃縮した。ヘキサン中の5〜80%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-tert-ブチルジメチルシリルオキシペンタデカン酸エチル(19)(12.8mg,、17.0μmol、90%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.03(s, 3H), 0.06(s, 3H), 0.86(s, 9H), 1.25(t, J=7.2Hz, 3H), 1.30(d, J=6.2Hz, 3H), 1.25-1.36(m, 14H), 1.36-1.42(m, 2H), 1.45-1.51(m, 2H), 1.61-1.68(m, 2H), 2.21(ddd, J=14.3Hz, J=11.4Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.35-2.46(m, 3H), 3.50(dt, J=9.6Hz, J=6.5Hz, 1H), 3.76(dt, J=9.6Hz, J=6.8Hz, 1H), 4.04-4.18(m, 4H), 4.82(s, 1H), 5.18(ddd, J=11.2Hz, J=9.9Hz, J=4.7Hz, 1H), 5.20(s.br, 1H.), 7.43-7.50(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H).図29を参照されたい。
20を調製するために、19(9.2mg、12.2μmol)のアセトニトリル(2ml)溶液を、40%フッ化水素酸(20μl)により処理した。1時間撹拌後、この溶液をNaHCO3(100mg)で15分間処理し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の5〜80%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、15-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシペンタデカン酸エチル(20)(4.4mg、6.9μmol、57%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 1.27(t, J=7.2Hz, 3H), 1.30(d, J=6.2Hz, 3H), 1.25-1.36(m, 16H), 1.36-1.42(m, 2H), 1.45-1.51(m, 2H), 1.61-1.68(m, 2H), 2.21(ddd, J=14.3Hz, J=11.4Hz, J=3.2Hz, 1H), 2.39(dd, J=16.4Hz, J=9.0Hz, 1H), 2.41(m, 1H), 2.50(dd, J=16.4Hz, J=3.0Hz, 1H), 3.50(dt, J=9.6Hz, J=6.5Hz, 1H), 3.76(dt, J=9.6Hz, J=6.8Hz, 1H), 3.99(m, 1H), 4.07(dq, J=10.0Hz, J=6.2Hz, 1H), 4.17(q, J=7.1Hz, 2H), 4.82(s, 1H), 5.18(ddd, J=11.2Hz, J=9.9Hz, J=4.7Hz, 1H), 5.20(s.br, 1H), 7.43-7.50(m, 4H), 7.56-7.61(m, 2H), 8.04(m, 2H), 8.11(m, 2H).図30を参照されたい。
bhos#26を調製するために、20(4.4mg、6.9μmol)のTHF(1ml)溶液を、水(200μl)及び1,4-ジオキサン(2ml)中のLiOH(5mg)の溶液で処理し、67℃で撹拌した。3時間後、この溶液を氷酢酸(50μl)により酸性にし、真空で濃縮した。0.2%酢酸を含むDCM中の5〜50%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、15-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-(3R)-ヒドロキシペンタデカン酸(bhos#26)(2.3mg、5.7μmol、83%)が得られた。
bhos#26に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表6中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図31A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例40]-アスカロシドicos#10の合成
アスカロシドicos#10は、以下のスキーム7で示される通り調製した。
Figure 2014522882
icos#10を調製するために、oscr#10(12mg、39.5μmol)のメタノール(1ml)及びトルエン(1ml)の混合物中の溶液を、ジエチルエーテル中の2.0MのTMS-ジアゾメタン(23μl、46μmol)で処理した。30分間撹拌後、酢酸(20μl)を添加することにより過剰の試薬をクエンチし、この溶液を真空で濃縮した。DCM中の5〜10%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色固体としてメチルエステル(11.3mg、35.5μmol、90%)が得られた。
-20℃のメチルエステルのDCM(1ml)溶液を、DIPEA(175μl、1mmol)及びインドールカルボン酸クロリドにより処理した。インドールカルボン酸クロリドは、DCM(2ml)中、インドール-3-カルボン酸(68mg、420μmol)をDMF(10μl)及びSOCl2(72μl、840μmol)と0℃で処理することにより、新しく調製した。室温で20分間、反応混合物を撹拌した後、溶液を真空で濃縮し、DCM(2ml)を滴下して加えた。この溶液を-7℃にして、次に飽和NaHCO3水溶液(2ml)によりクエンチした。水相はDCM(2ml、3回)により抽出した。合わせた有機相をNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。DCM中の5〜10%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、インドールカルボン酸エステルの異性体混合物が得られた(8.4mg、18.2μmol、51%)。得られたインドールカルボン酸エステルの異性体混合物をTHF(1ml)に溶解し、67℃で水(0.5ml)及び1,4-ジオキサン(2ml)中のLiOH(2.8mg、116μmol)溶液により処理した。2時間撹拌後、この溶液を酢酸(30μl)により酸性にし、真空で濃縮した。0.2%酢酸を含有するDCM中の5〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、icos#10異性体の異性体混合物が得られた。HPLCにより、9-(5'R-((1H)-インドール-3-カルボニルオキシ)-3'R-ヒドロキシ-6'S-メチル-テトラヒドロ-(2H)-ピラン-2'-イルオキシ)ノナン酸(icos#10)(0.6mg、1.3μmol、7%)の純粋な試料、及びその異性体(0.3mg、0.67μmol、3.7%)が得られた。
icos#10に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表7中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図32A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例41]-アスカロシドhbas#3の合成
アスカロシドhbas#3は、以下のスキーム8で示される通り調製した。
Figure 2014522882
22を調製するために、4-ヒドロキシ安息香酸(21、1.52g、10mmol)のDMF(7ml)溶液を、DIPEA(5.2ml、30mmol)及び塩化tert-ブチルジメチルシリル(3.7g、24.5mmol)で処理した。12時間後、この混合物を1MのH3PO4を添加することにより、pH4にした。この混合物をヘキサン(15ml)で2回抽出した。有機相を水(15ml)で2回洗浄し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。残留物(3.7g)をTHF(10ml)に溶解し、水(7ml)及び氷酢酸(21ml)で処理した。90分間撹拌した後、この混合物を氷水に加え、ジエチルエーテル及びヘキサン(30ml)の1:1混合物(v/v)により2回抽出した。有機相を水(30ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。0.2%酢酸を含むDCM中の5〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、白色固体として4-tert-ブチルジメチルシリルオキシ安息香酸(22、1.42g、5.3mol、53%)が得られた。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) 0.24(s, 6H), 0.99(s, 9H), 6.89(d, J=8.8Hz, 2H), 8.02(d, J=8.8Hz, 2H); 13C NMR(100MHz, クロロホルム-d1): δ(ppm) -4.22, 18.40, 25.73, 120.08, 122.39, 132.46, 132.46, 161.01, 172.23.図33A〜Bを参照されたい。
hbas#3を調製するために、アスカロシド#3のメチルエステル(23、5.7mg、18μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Pub. Lib. Sci. Biol. 10巻、e1001237頁(2012年))の乾燥DCM(500μl)溶液を、22(11.0mg、41μmol)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC、9.0mg、47μmol)、及び4-ジメチルアミノピリジン(DMAP、6.2mg、51μmol)で処理した。48時間撹拌した後、この溶液を真空で濃縮し、H2O(500μL)で処理した。得られた生成物をDCM(1ml、3回)で抽出し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。DCM中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、4-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾイル-アスカロシド#3のメチルエステル(7.3mg、12.9μmol、72%)が得られた。
芳香族性tert-ブチルジメチルシリルオキシ基(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jiang & Wang, Tetrahedron Lett. 44巻、3859〜61頁(2003年))の脱保護については、DMF(360μl)中の(4-tert-ブチルジメチルシリルオキシベンゾイル)-アスカロシド#3のメチルエステル(6.0mg、10.7μmol)の混合物を、H2O(36μl)中、Cs2CO3(1.9mg、5.4μmol)により処理し、3.5時間撹拌した。得られた生成物をDCM(1ml、2回)で抽出し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。DCM中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、4-ヒドロキシベンゾイル-アスカロシド#3のメチルエステル(4.5mg、10.0μmol、93%)の異性体混合物が得られた。メチルエステル基の開裂については、THF(100μl)中の4-ヒドロキシベンゾイル-アスカロシド#3のメチルエステル(4.5mg、10.0μmol)の混合物を、H2O(30μl)及び1,4-ジオキサン(500μl)中のLiOH(2.3mg)により67℃で処理した。2時間後、氷酢酸(50μl)を加えることによりこの反応をクエンチした。この溶液を真空で濃縮した。0.2%酢酸を含むDCM中の5〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、hbas#3異性体の異性体混合物が得られた(1.2mg、2.8μmol、28%)。HPLCにより、(8R)-(3'R-ヒドロキシ-5'R-(4-ヒドロキシベンゾイルオキシ)-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-(2E)-エノン酸(hbas#3)(0.6mg、1.4μmol、14%)の純粋な試料、及びその異性体(0.6mg、1.4μmol、14%)が得られた。
hbas#3に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表8中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図34A〜Cを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例42]-アスカロシドmbas#3の合成
アスカロシドmbas#3は、以下のスキーム9で示される通り調製した。
Figure 2014522882
mbas#3を調製するために、アスカロシド#3のメチルエステル(23、10mg、31.4μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Pub. Lib. Sci. Biol. 10巻、e1001237(2012年))の乾燥DCM(1ml)溶液を0℃で、DIPEA(110μl、630μmol)で処理した。DCM(0.5ml)中の(E)-2-メチルブト-2-エノン酸クロリド(35μl、316μmol)を滴下して加えた。1時間0℃で撹拌した後、この溶液を室温に戻し、飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で処理した。生成物を酢酸エチルにより抽出し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。ヘキサン中の5〜25%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュクロマトグラフィーにより、黄色固体としてジチグレートエステル(5.2mg、10.8μmol、34%)が得られた。
生成物(4.5mg、9.4μmol)をTHF(1ml)に溶解し、水(100μl)及び1,4-ジオキサン(2ml)中のLiOH(0.5mg、22μmol)で処理した。3時間67℃で撹拌後、氷酢酸(100μl)を加えることにより反応をクエンチした。この溶液を真空で濃縮した。残留物をメタノールに溶解し、真空で濃縮した。0.2%酢酸を含有しているDCM中の0〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、mbas#3異性体の混合物が得られた(2.1mg、5.45μmol)。HPLCにより、C.エレガンス由来の天然産物と同一の、(8R)-(3'R-ヒドロキシ-5'R-(E)-(2-メチルブト-2-エノイルオキシ)-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)ノナ-(2E)-エノン酸(mbas#3)(1.2mg、3.1μmol、33%収率)の純粋な試料が得られた。
mbas#3に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表9中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図35A〜Bを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例43]-アスカロシドglas#10の合成
アスカロシドglas#10は、以下のスキーム10で示される通り調製した。
Figure 2014522882
glas#10を調製するために、ascr#10(3mg、9.9μmol)の乾燥DMF(2ml)溶液を、2,3,4,6-テトラ-O-ベンジル-D-グルコース(11mg、20μmol)、DMAP(12.2mg、100μmol)及びEDC(19.2mg、100μmol)で処理した。18時間室温で撹拌した後、この溶液を真空で濃縮した。残留物を水性酢酸(200μl)で処理し、DCM中の5〜50%メタノールのグラジエントを使用して、シリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。
生成物をエタノール(1ml)に溶解し、Pd/C(10mg、10%Pd(w/w))で処理して、24時間、水素化した。混合物をろ過し、真空で濃縮した。HPLCにより、β-D-グルコシル-アスカロシド#10(1.5mg、3.22μmol、33%)の純粋な試料、及びα-D-グルコシル-アスカロシド#10(1.2mg、2.58μmol、26%)が得られた。
glas#10に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表10中に示す。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD2HOD)=49.05ppmを参照する。図36A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例44]-アスカロシドの同定及び定量
野生型及び突然変異体において検出したアスカロシド(ascr、oscr、bhas、bhos、icas、icos、ibha、ibho及びglas)の同定に関しては、HPLCの保持時間をm/z(又は鎖長)に対してプロットした(HPLC-EMI-MSに関しては、図37A((ω-1)-酸素化アスカロシド(ascr))、図37B((ω)-酸素化アスカロシド(oscr))、図37C((ω-1)-酸素化β-ヒドロキシアスカロシド(bhas)、図37D((ω)-酸素化β-ヒドロキシアスカロシド(bhos))、図37E((ω-1)-酸素化インドールアスカロシド(icas))、図37F((ω)-酸素化インドールアスカロシド(icos))、図37G((ω-1)-酸素化インドールβ-ヒドロキシアスカロシド(ibha))、図37H((ω)-酸素化インドールβ-ヒドロキシアスカロシド(ibho))、図37I(グルコシルアスカロシドエステル(glas))、図37J(ascr#8及び4-(4-ヒドロキシベンゾイル)-及び4-(2-(E)-メチル-2-ブテノイル)-アスカロシド(hbas及びmbas))、及び図37K(ascr#2及びascr#6.1)を参照されたい)。一連のホモログに属する成分は、ほとんど直線の溶出プロファイルを示しており(図38)、一連内の成分は、同じ相対的な立体化学を共有していることが示された。次に、一連の様々なものの構造及び立体化学は、(1)代表的な実施例の単離、及びNMR分析(例えば、図39A〜B、図40A〜B、図41A〜B、図42及び図43A〜Bを参照されたい)、(2)代表的な実施例と合成標準品との比較、(3)高分解能MSから確定した分子式、(4)特有のMS/MSフラグメンテーション(図44A〜Pを参照されたい)、及び(5)合成試料のものから推定したHPLCの保持時間の値と一致する保持時間、に基づいて同定した。α,β-不飽和アスカロシドの(E)-配置は、ascr#3、(Z)-配置のascr#3及びascr#7と比較することにより確定し、アシル-CoA-オキシダーゼ(ACOX)活性の立体選択性によっても示唆された。β-ヒドロキシアスカロシド(bhas及びbhos系)の(3R)-立体化学は、代表的な実施例としてのbhas#10、bhas#22及びbhos#26の合成標準品との比較から推定し、(R)-選択的MFE-2を有するMAOC-1及びDHS-28の配列相同性からも示唆された(図45)。
アスカロシドの定量は、対応するイオントレースからのLC-MS信号を積分することによって行った。アスカロシド濃度は、ascr#1、ascr#3、ascr#5、ascr#7、ascr#9、ascr#10、oscr#9、oscr#10、bhas#22、bhos#26、icas#3、icas#9、icos#10、及びglas#10の合成標準品用に決定した応答ファクターを使用して計算した。ほとんどの化合物について、質量分析計の応答は、1回の注入あたり1pmolから2nmolの量に関すると、ほぼ直線(10%未満の誤差)であった。合成しなかったアスカロシド用応答ファクターは、利用可能な標準品について観察されたデータに基づいて推定した。一般に、一連のものの各々の短鎖数(C7未満の側鎖)の応答ファクター間には大きな差異が観察されたが、より長鎖のホモログの応答ファクター間の差異は小さかった。一連のものすべての短鎖数のすべては合成していないで、一部の短鎖アスカロシドに関して報告した絶対量の系統誤差は、より長鎖の化合物に対するものよりも大きくなり得る。
培養期間及び蠕虫バイオマスについて大まかに説明するため、エクスクレトーム及び蠕虫ペレットの試料のアスカロシド含量を、蠕虫ペレットの乾燥重量1mgあたりの培養時間の1時間あたり産生されたアスカロシドをfmolで記録した。図37〜62中で報告した定量データはすべて、少なくとも2回の独立した生物的繰返しを由来としていた。
[実施例45]-スポット誘引アッセイ
以前に報告された通り、hbas#3による誘引アッセイを行った(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Pungaliyaら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106巻、7708〜13頁(2009年))。誘引アッセイ用に、50〜60匹の雌雄同体の蠕虫を、次の日に幼成体として使用するために、第4早幼齢期(L4)で毎日採り、20℃で一晩保管した。hbas#3は10%エタノール含有水に溶解した。一定分量を20μLチューブ中、-20°Cで保管した。水中の10%エタノールを対照として使用した。
[実施例46]-化学走性を測定するための四分円アッセイ
hbas#3への化学走性を、4つの10cmの四分円ペトリ板上で評価した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wicksら、Dev. Biol. 221巻、295〜307頁(2000年))。各四分円は、プラスチック製のスペーサーによって隣接した四分円と隔離した。反対側の四分円の対に、異なる濃度のhbas#3を含有している線虫成長培地(NGM)寒天を満たした。S-基本緩衝液中で動物を優しく洗い、四分円に交互にアスカロシドを含む4つの四分円プレートの中心に置き、15分後及び30分後に点数化した。化学走性指数は、次のように計算した。(アスカロシドのある四分円上の動物数-緩衝液上の四分円の動物数)/(動物の総数)
[実施例47]-統計的解析
野生型及び突然変異体のメタボロームの間のアスカロシドプロファイルを比較するため、及びhbas#3上の雌雄同体の誘引を比較するため、ウェルチ補正による独立スチューデントt検定を使用した(*: P<0.05、**: P<0.001、***: P<0.0001)。異なる濃度のhbas#3の化学走性指数の比較のために、一元配置ANOVA、その後にダンネットの事後検定を使用した(*: P<0.05、**: P<0.01)。
[実施例48]-LC-MS/MSにより、野生型C.エレガンスにおける新規アスカロシドが明らかになる
(1)様々なC.エレガンス株及び突然変異体のメタボローム中の公知のアスカロシドの感度のよい検出及び定量を促進する、及び(2)新規アスカロシド誘導体を発見する手助けとなる分析法の開発が望まれた。
C.エレガンスのメタボロームの複雑さが大きいために、代謝抽出物のHPLC MS分析は、解釈するのが困難な、かなり極度に込み入ったクロマトグラムになる(図46A)。しかし、構造的に関連しているアスカロシドは、特有のMS/MSフラグメンテーションパターンを示すことになり、このパターンは、それらを検出するのに優れた選択的且つ感度の高い手段を提供する可能性が高いと思われた。したがって、一連の合成アスカロシドのESI-MS/MSのフラグメンテーションを検討した。
ネガティブイオンエレクトロスプレーイオン化(ESI-)により、アスカロシドはm/z73.02939[C3H5O2]において、アスカリロース単位に由来する、強度が強く非常に特徴的な生成物イオンを生じることが分かった(図44A〜P及び46B)。この検出方法は、ESI-条件下で首尾よくイオン化しないascr#2及びascr#4を除いて、すべての公知のアスカロシドに適していることが分かった。ESI+条件下でのみイオン化するアスカロシドの検出については、アスカリロース単位の開裂による130.0663amu[C6H10O3]の中性体の喪失がモニターされた。しかし、アスカロシドのESI+ MS/MS検出は、アスカロシドのフラグメントがESI+条件下では予想通りとならないので、ESI- MS/MS検出ほど一般に感度のよいものではなかった。次に、m/z73の前駆体イオンのスクリーニングが、C.エレガンスの野生型メタボローム中の公知のアスカロシド及び依然として未同定のアスカロシドを検出するのに使用することができるかどうかを見極めるために試験を行った。多量の蠕虫(蠕虫「エクスクレトーム」)から排泄された代謝蓄積物を含有している液体の培養代謝抽出物を使用した。得られたHPLC-MS/MSクロマトグラムにより、以前には検出されなかったいくつかの化合物ファミリーを含め、それらの大部分がアスカロシドであると分かる、多数の良好な分解能のピークが示された。
公知のアスカロシドの同定は、合成標準品を使用して確認した。さらに、公知の飽和アスカロシドascr#1、ascr#9及びascr#10は、6〜15個の炭素側鎖を有する多量のホモログを伴っている(図46C及び47A)。この一連のホモログの同定は、高分解能MS/MS、LC保持時間、及び代表的なメンバーの合成に基づいた(実施例44及び図38]を参照されたい)。LC-MS/MSスクリーニングにより、5〜11個の炭素の側鎖を有するアスカロシドは、わずかに極性の低い異性体をより少ない量、伴っていることがさらに明らかになった。これらのアスカロシド異性体は、acox-1突然変異体の蠕虫によって、さらに多量に産生された。
野生型のMS/MSクロマトグラム中のいくつかの追加のピークは、公知のアスカロシドのクラスのいずれにも帰属することができなかった。これらの化合物のうちの2つについては、m/z301.1651[C15H25O6]におけるMS/MS生成物イオンにより、それらがascr#3誘導体であることが示唆される。推定上のascr#3誘導体を分取HPLCにより単離し、2D NMR分光法(dqfCOSY、図39A〜B、図40A〜B、及び図41A〜B)を使用して分析し、これらの化合物がascr#3をベースとするものであることが確認され、またアスカリロースの4位に結合している4-ヒドロキシベンゾイル又は(E)-2-メチル-2-ブテノイル(チグロイル)部分の存在がさらに示された(図47C)。これらの構造的な帰属は、基準試料の全合成によって確証した(図41〜42を参照されたい)。ascr#3(「icas#3」)の最近報告されたインドール-3-カルボキシ(indole-3-carboxy)誘導体と同様に、(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))、ascr#3の4-ヒドロキシベンゾイル(4-hydroxybenzoyl)及び(E)-2-メチル-2-ブテノイル(2-methyl-2-butenoyl)誘導体を、SMIDで「hbas#3」及び「mbas#3」とそれぞれ名付けた。hbas#3及びmbas#3は、icas#3におけるインドール-3-カルボキシ部分と同様に(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))、アミノ酸前駆体に由来し得る4-ヒドロキシベンゾイル及び(E)-2-メチル-2-ブテノイル部分を取り込んでいる最初のアスカロシドである。集団形成誘発性のインドールアスカロシド(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))への構造上の類似性のために、hbas#3を蠕虫行動に対するその効果に関して試験した。hbas#3は、10フェントモル濃度という低い濃度において、C.エレガンスを強力に誘引し(図48A〜Bを参照されたい)、これは、以前から公知のいずれのC.エレガンスの低分子シグナルの効力をも超えるものであることが分かった(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。低いフェントモル濃度での活性は、動物では低分子シグナルには異常であるが、一部のペプチドホルモンの部類の活性には適合する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Rittschof & Cohen、Peptides 25巻、1503〜16頁(2004年)、Gozesら、CNS Drug Rev. 11巻、353〜68頁(2005年)。
[実施例49]-アスカロシド生合成におけるペルオキシソームβ-酸化
比較LC-MS/MSを使用し、アスカロシド生物発生の検討を行った。研究により、アスカロシドの側鎖が長鎖前駆体のペルオキシソームβ-酸化に由来すること、及びアシル-CoA-オキシダーゼACOX-1が、アスカロシド側鎖のβ-酸化の最初のステップに関与し、α,β-不飽和を導入することが示された(図49A〜B)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jooら、J. Biol. Chem. 285巻、29319〜25頁(2010年))。脊椎動物及びキイロショウジョウバエ属において、二重結合のペルオキシソームβ酸化-水和における次の2つのステップ、及びその後のβ-ケトアシル-CoAエステルへの脱水素は、1種のタンパク質、例えば、多機能性酵素タイプ2(MFE-2)によって触媒される。これらの酵素の2つの機能は、C.エレガンスではデヒドラターゼ及びデヒドロゲナーゼが個別のタンパク質であるように、分かれているように思われる(図45)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Haatajaら、Biochem. J. 435巻、771〜81頁(2011年))。研究により、ヒトMFE-2の(R)-選択的β-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼドメインと相同のタンパク質である、C.エレガンスのDHS-28は、β-ヒドロキシアシル-CoA-誘導体の対応するβ-ケトアシル-CoA中間体への変換に関与している可能性があり、この中間体は、その後、β-ケトアシル-CoAチオラーゼDAF-22により開裂されることが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年)、Jooら、Biochem. J. 422巻、61〜71頁(2009年))。しかし、どの酵素がβ-酸化カスケードの第2の必須ステップを触媒するエノイル-CoAヒドラターゼとして働いているのかは、依然として不明であった。
本明細書に記載の、MS/MSに基づくアスカロシドスクリーニング法を使用し、acox-1(ok2257)、dhs-28(hj8)、及びdaf-22(ok693)突然変異蠕虫のアスカロシドのプロファイルを再検討した。さらに、別の研究により、maoc-1は、ペルオキシソームの2-エノイル-CoAヒドラターゼをコードし(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Zhangら、PNAS 10巻、4640〜45頁(2010年))、このヒドラターゼは、アスカロシドβ酸化の水和ステップに関与しているという仮説を立てた。そこで、maoc-1(hj13)蠕虫を含む、他のいくつかのペルオキシソーム突然変異体のエクスクレトームを分析した。
[実施例50]-側鎖機能は、β-酸化の前に起こる
acox-1(ok2257)突然変異蠕虫のエクスクレトームのLC-MS/MSの分析により、野生型媒体の主要成分であるα,β-不飽和ascr#3の存在量が大幅に減少していることが明らかになった(図50A〜E)。この、ascr#3及び他のα,β-不飽和アスカロシドの減少は、アスカロシド産生における総合的な下方調節の結果のようには思われないが、その代わりに、一連の飽和アスカロシドの蓄積を伴っていた。例えば、acox-1(ok2257)では、ascr#10、ascr#3のジヒドロ誘導体及び直接前駆体は、野生型のエクスクレトーム中よりも13.6倍多量に存在していた。acox-1中では、11個及び13個の炭素側鎖を有する対応するホモログであるascr#18及びascr#22は、野生型のエクスクレトーム中よりも、それぞれ29倍及び66倍、多量に存在していた。acox-1(ok2257)エクスクレトームにおける長鎖の飽和アスカロシドの増加は、アスカロシド側鎖のα,β-脱水素におけるACOX-1の重要性を裏付けた(図49A)。アスカロシド生合成は、acox-1(ok2257)蠕虫においてなくならないので、他の、依然として未同定のACOX酵素が、長鎖アスカロシド前駆体のペルオキシソームβ-酸化の一因である可能性が高い。しかし、他のいくつかのペルオキシソームacox突然変異体のエクスクレトームのLC-MS/MS分析(実施例29〜34、及び44〜47、並びに図51]を参照されたい)により、野生型にかなり似たアスカロシドプロファイルが明らかになった。
acox-1(ok2257)エクスクレトームのさらなる分析により、野生型蠕虫において多量に産生される、主な耐久型幼虫誘発性のアスカロシドの1つである、ascr#5が全く存在していないことが明らかになった(図52])。Ascr#5は、その側鎖が、末端から2番目の炭素(「ω-1連結」)ではなく、末端炭素(「ω連結」)を介してアスカリロース糖に結合している点で、以前に同定された他のすべてのアスカロシドと異なっている(図47B)。acox-1(ok2257)において、ascr#5の代わりに、飽和アスカロシドの一連の新規ホモログが多量に検出され、この飽和アスカロシドの少量は、野生型のエクスクレトーム中でも存在した(図52])。この一連の異性体の最も多量の成分が分取HPLCにより単離され、NMR分光法によって、C5側鎖を有するω-連結アスカロシドであると同定された(図42及び47B)。このことは、acox-1中で観測されたさらなる一連の化合物が、一連のω-連結飽和アスカロシド(図37B)であり、これらは、C5及びC9ω-連結しているアスカロシドの合成により確認された(実施例35〜36を参照されたい)。(ω)-連結アスカロシドと、以前に記載されたそれらの(ω-1)-連結異性体とを区別するために、新規に発見された(ω)-連結化合物に、SMID「oscr」と名付け、例えば、ascr#9及びascr#10の合成(ω)-連結異性体は、oscr#9及びoscr#10と名付けた(図47])。
こうして、(ω)-連結ascr#5の産生はacox-1(ok2257)蠕虫中でなくなる一方、5〜13個の炭素側鎖を有するより長鎖のホモログ、例えばoscr#9の産生は明確に上方調節された(図52)。これらの結果により、acox-1(ok2257)蠕虫におけるβ酸化は、側鎖が(ω-1)-又は(ω)-官能基化されているかどうかに強く依存することが示される。(ω-1)-酸素化基質の短鎖化は、ascr#10の場合と同様に、鎖長が9個の炭素で停止するように思われるが、(ω)-酸素化基質は、さらに2つのβ-酸化段階の処理を受けて、5個の炭素側鎖を特徴とする(ω)-酸素化oscr#9を多量に与える。これは、側鎖の酸化が、ペルオキシソームβ-酸化よりも先に起こることを示唆している。対照的に、アスカリロースが結合する時間点は、もっと明確ではないようであった。C.エレガンス突然変異体メタボローム試料の検討において、(ω-1)-又は(ω)-ヒドロキシ化脂肪酸が何ら存在しないことは、非常に長鎖のアスカロシドが、ペルオキシソームβ-酸化のための基質として働く、生合成モデルであることを示唆している。しかし、アスカリロースの結合よりも前に、β-酸化が起こる可能性があり得る。
[実施例51]-MAOC-1及びDHS-28は、ヒトMFE-2の機能的ホモログである
野生型及びacox-1(ok2257)蠕虫とは対照的に、短鎖(<C9)アスカロシドは、maoc-1(hj13)及びdhs-28(hj8)蠕虫では検出されず、その代わりに、一連の(ω-1)-及び(ω)-酸素化媒体及び長鎖アスカロシド(≧C9)のいくつかが蓄積した。maoc-1(hj13)エクスクレトームのアスカロシドのプロファイルは、ascr#21(C13)及びascr#25(C15)などのα,β-不飽和アスカロシドにより主に占められており(図50A〜E)、このことは、MAOC-1が、アスカロシド生合成経路において、エノイル-CoAヒドラターゼとして機能するという仮説を支持している(図49A)。さらに、maoc-1(hj13)エクスクレトームは、第3の一連のホモログ化合物と共に、少量の対応する飽和アスカロシドを含有しており、その高分解能質量分光法(HRMS)及びMS/MSフラグメンテーションにより、それらが一連の長鎖β-ヒドロキシ化アスカロシドを示すことが示唆された(図37C〜D、図44A〜P、及び図50A〜E)。これらの構造の帰属は、この一連の代表的なメンバー(実施例37〜39を参照されたい)、すなわち、C9及びC13βヒドロキシ化(ω-1)-アスカロシドbhas#10及びbhas#22、並びにC15βヒドロキシ化(ω)-アスカロシドbhos#26((ω-1)-及び(ω)-酸素化β-ヒドロキシ化アスカロシドに関するSMIDである「bhas」及び「bhos」)の合成によって確認した。β-ヒドロキシ化アスカロシドは、MAOC-1などのエノイル-CoAヒドラターゼの推定上の産生物であるので、検討がなされたmaoc-1突然変異体株であるmaoc-1(hj13)(活性部位(D186N)において点突然変異体を有する)と2110塩基対欠失突然変異体maoc-1(ok2645)(図49B)の両方のエクスクレトーム中の、アスカロシドの存在は、さらなるエノイル-CoAヒドラターゼがアスカロシド生合成に関与していることを示唆している。
maoc-1(hj13)に関する結果と類似して、dhs-28(hj8)アスカロシドのプロファイルは、C9〜C21の範囲に及ぶ側鎖を有する化合物によって主に占められることが分かった(図50A〜E)。しかし、maoc-1(hj13)とは対照的に、飽和及びα,β-不飽和アスカロシドは、dhs-28(hj8)中で総アスカロシドの比較的少ない部分を構成した。さらに、C13〜C21の奇数の側鎖を有する(ω-1)-及び(ω)-酸素化β-ヒドロキシアスカロシド(bhas及びbhos)が主要成分となることが見いだされ(図50A〜E及び図53A〜E)、これは、提唱されているβ-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼとしてのDHS-28の生合成的な役割と一致している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年)、Jooら、Biochem. J. 422巻、61〜71頁(2009年))。daf-22(ok693)のエクスクレトームの分析により、以前に報告された通り、12個の炭素よりも短い側鎖を有するアスカロシドがすべて存在していないことが明らかになった(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年)、Jooら、Biochem. J. 422巻、61〜71頁(2009年))(図50A〜E及び図53A〜E)。daf 22(ok693)のエクスクレトームは、飽和(ascr及びoscr)及びβ-ヒドロキシ化側鎖(bhas及びbhos)を特徴とする、一連のホモログの(ω-1)及び(ω)-酸素化長鎖アスカロシドを少量含有していた。さらに、daf-22(ok693)のエクスクレトームは、以前報告された通り(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Zagoriyら、Chem. Biodivers. 7巻、2016〜22頁(2010年))、最大33個の炭素の側鎖長を有する非常に長鎖のアスカロシド(VLCA、>C22)を含有していた。
[実施例52]-新規インドールアスカロシドの同定
インドール-3-カルボニル化アスカロシドは、対応する非官能基化アスカロシドよりも存在量がかなり少なく、高度に有効な集団形成シグナルとして機能することが知られている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。LC-MS/MSのスクリーニングにより、いくつかの新しいタイプのインドールアスカロシドが明らかになった(図37E〜H、及び図47C)。icas#3、icas#9及びicas#1の合成試料の結果は(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))、インドールアスカロシドが、インドール-3-カルボニル単位の開裂による143amuの[C9H5NO]の中性体の喪失、及びm/z73におけるアスカロシドに特徴的な生成物イオンを含む、特徴的なフラグメンテーションパターンを示すことを示している(図44A〜P)。このフラグメンテーションパターンを有する成分に関するLC-MS/MSのスクリーニングにより、acox-1(ok2257)において、公知の(ω-1)-酸素化異性体であるicas#1、icas#9及びicas#10が、代表的な実施例(実施例40を参照されたい)としてicos#10の化学合成によって確認された、一連の(ω)-酸素化インドールアスカロシド(SMID: icos#1、icos#9及びicos#10)を伴うことが明らかになった。短鎖アスカロシド(<9個の炭素側鎖)を産生しないペルオキシソームβ-酸化突然変異体、例えばmaoc-1及びdhs-28蠕虫も、対応するインドールアスカロシドのいずれも産生しなかった。代わりに、maoc-1及びdhs-28のエクスクレトームは、9〜17個の炭素側鎖を有する(ω-1)-及び(ω)-酸素化長鎖インドールアスカロシド(SMIDはicas及びicosである)、及びインドールβ-ヒドロキシアスカロシド(SMIDはibha及びibhoである)をかなりの量含有していた(図37E〜Hを参照されたい)。
[実施例53]-インドールアスカロシドの生物発生
重水素標識トリプトファン及び無菌のインビトロ培養物による実験は、インドールアスカロシドのインドール-3-カルボニル部分がL-トリプトファンを由来とすることを示した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。同様のL-チロシン又はL-フェニルアラニンの起源は、hbas#3の4-ヒドロキシベンゾイル部分である可能性が高いが、mbas#3のチグロイル基は、L-イソロイシンに由来し得る(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Attygalleら、J. Chem. Ecol. 33巻、963〜70頁(2007年))。しかし、アスカロシド生合成においてどの段階でインドール-3-カルボニル部分が結合するのか、依然として不明であった。
アスカロシド及びインドールアスカロシドのプロファイルを比較することにより、インドールアスカロシド生合成が厳密に制御されていることが明らかになった。例えば、acox-1突然変異体では、(ω)-アスカロシドoscr#9は、(ω-1)-アスカロシドascr#9より100倍以上も多量に存在する一方、(ω-1)-インドールアスカロシドicas#9は、(ω)-インドールアスカロシドicos#9よりもはるかに突出していることが分かった(図54A)。同様に、icas#3及びicas#9は、野生型エクスクレトームにおける主なインドールアスカロシドであるが、これらは、ほぼ等量で産生される一方、ascr#3はascr#9よりも約20倍多量に存在していた(図55)。インドールアスカロシド生合成の、側鎖長及び(ω-1)-対(ω)-酸素化へのこの強い依存性は、これらの化合物が、インドール-3-カルボニル単位の対応する非インドールアスカロシドへの特異的な結合に由来していることを示唆している。
非インドールアスカロシドがインドールアスカロシドの前駆体として働くのかどうかを試験するために、daf-22(m130)蠕虫(それらはすべての短鎖インドール及び非インドールアスカロシドが欠損している)を、ascr#10及びoscr#10の1:1混合物と共に5日間インキュベートした。その後のLC-MSによる分析により、icas#10及びicos#10(図54B)へ一部変換されていることが示され、このことは、非インドールアスカロシドがそれらの対応するインドール誘導体に対する特定の前駆体として働くことを示している。さらに、(ω-1)-アスカロシドascr#10の変換は(ω)-アスカロシドoscr#10の変換よりも優先し、野生型及びacox-1突然変異体中のこれらの化合物の比を反映した。同様に、daf-22(m130)蠕虫は、添加したascr#3をicas#3に変換することが分かった。インドール又は非インドールアスカロシドの、より短鎖誘導体(例えば、ascr#1又はicas#1)へのさらなる変換は観察されなかった。これらの結果は、L-トリプトファン由来のインドール-3-カルボニル単位の結合が、インドールアスカロシド生合成の最終ステップにあたることを示す。
[実施例54]-アスカロシド排泄は選択的である
アスカロシド機能の詳述な研究があるにもかかわらず、アスカロシドが生合成のアスカロシドの部位からどのように放出されて輸送されるのかについては、ほとんど分かっていない。野生型のエクスクレトーム(液体培養物の上澄み抽出物)及び蠕虫の体のメタボローム(蠕虫ペレット抽出物)のアスカロシドプロファイルを比較して、考えられる非排泄アスカロシド誘導体の同定、及び量の差異を決定した。蠕虫ペレット抽出物のアスカロシドのプロファイルは、培地に排泄されたものとはかなり異なっており、異なるアスカロシドがC.エレガンスにより放出されることを示していた(図56A)。蠕虫ペレットでは、野生型蠕虫中のascr#3及びacox-1蠕虫中のascr#10などの最も多量に存在するアスカロシドは、培地抽出物には存在していなかった、著しく極性の高い誘導体を伴った(図57)。MS/MS分析により、これらの成分が、アスカロシドO-グリコシドエステルを表すことが示唆された。acox-1(ok2257)蠕虫ペレット抽出物からの推定上のascr#10グリコシドの単離、及びその後のNMR分光分析(図43A〜B)は、βグルコースのアノマー性ヒドロキシ基を有するascr#10がエステル化されていることを示しており、このことは、合成(1-β-D-グルコシルascr#10のSMIDはglas#10である、図56A)によって後に確認された。非常に極性の高いglas#10及び他のアスカロシドグルコシド(図37Iを参照)が、蠕虫の体内に多量に維持されているが、排泄されていないということは、それらが、最終的に排泄されるシグナル伝達分子の輸送型又は保存型にあたることを示唆している。
さらに、飽和アスカロシドは、蠕虫の体内に、それらのα,β-不飽和誘導体よりもはるかに大きい程度に保持されていた(図56A)。(ω)-酸素化成分について、異なる放出も観察された(図58)。したがって、C.エレガンスは、アスカロシドシグナルの放出全体にわたり驚くほどの制御を示すように思われる。
[実施例55]-栄養状態がアスカロシド生合成に影響する
アスカロシド生合成は、食物利用度(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、PNAS 106巻、1875〜79頁(2009年))、発達段階(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE6巻、e17804(2011年))及び温度(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jooら、J. Biol. Chem. 285巻、29319〜25頁(2010年))を含む、様々な環境因子に依存することが報告されている。
LC-MSを使用し、野生型及び突然変異体蠕虫の、十分に餌食された培養物及び飢餓培養物のエクスクレトームを比較することにより、アスカロシド生合成に対する栄養状態の影響を検討した。この結果は、(ω-1)-連結アスカロシドと(ω)-連結アスカロシドの比が、栄養状態に強く依存することを示している。dhs-28の飢餓培養物中の長鎖(ω-1)-酸素化アスカロシドの産生量は、十分に餌食された培養物のものよりも約5倍多かった(図56B及び図59A〜C)。同様に、飢餓した野生型蠕虫は、(ω)-連結ascr#5の量に比べて、十分に餌食された蠕虫よりもかなり多量の(ω-1)-連結ascr#3を排泄した(図60)。ascr#5とascr#3の両方が、耐久型幼虫のフェロモンの主成分である。しかし、それらは、蠕虫行動に異なる影響を及ぼす(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Butcherら、PNAS 105巻、14288〜92頁(2008年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年))。
したがって、アスカロシドのシグナル伝達は、ペルオキシソームβ-酸化の上流にある非常に長鎖の脂肪酸の(ω-1)-及び(ω)-官能基化の調節によって、栄養素利用度の変化に応答して、活発に調節されるように見える。(ω)-及び(ω-1)-官能基化アスカロシドがGタンパク質共役型受容体の様々なファミリーによって感知されるという最近の知見と共に(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kimら、Science 326巻、994〜98頁(2009年)、McGrathら、Nature 477巻、321〜25頁(2011年))、これらの結果は、(ω)-及び(ω-1)-官能基化アスカロシドは、下流にある個別のシグナル伝達経路を標的としていることを示唆している。
実施例29〜55の考察
アスカロシドは、C.エレガンス生物学のいくつかの様々な見地にとって重要な役割を果たしている。この機能的な多様性は、対応する構造上の多様性及び複雑な生合成経路と類似している。実施例34〜43及び図37A〜37Kにおいて記載したMS/MSに基づく検討により、脂肪酸由来の側鎖の(ω)-酸素化、すなわちアスカリロース単位の4-ヒドロキシベンゾイル化又は(E)-2-メチル-2-ブテノイル化、及びグルコシルエステルを含めて、いくつかの予期されない特徴を示す、以前には未報告の124種の類似体を含む146種のアスカロシドが明らかになった。大部分のアスカロシドは、(ω-1)若しくは(ω)-連結飽和、α,β-不飽和、又は3〜21個(場合によりそれ以上)の炭素に及ぶβ-ヒドロキシ化側鎖を有する、一連のホモログ化合物メンバーとして生じる。重要なことに、一連のものの各々の中のわずか数種のメンバーが、野生型線虫において多量に産生され、また、アスカリロース(例えば、インドールアスカロシド中と同様に)の4位における修飾などの特定の構造的特徴の取り込み、又はα,β-不飽和物の取り込みは、厳密に制御されているように見える。
炭水化物、脂質、及びアミノ酸由来のビルディングブロックからのそれらの組立物を考慮すると、アスカロシドは、3つの基礎的な代謝経路からの入力を統合する、低分子シグナルのモジュールライブラリーとして現れる(図61A)。次に、これらのアスカロシドは、耐久型幼虫形成、交尾誘引、雌雄同体の忌避、及び集団形成を含めた、C.エレガンスの行動及び発達における、多様なシグナル伝達機能を介する、これらの経路からの入力を変換している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年)、Edison、A. S.、Curr. Opin. Neurobiol. 19巻、378〜88頁(2009年))。それらの特異的な生合成により、新規に同定されたアスカロシドの多くはまた、C.エレガンス中の、公知の、又は依然として未確認の機能にも寄与していることが示唆される。一例として、hbas#3は、その効力が、このモデル有機体において、以前から公知のすべての低分子のそれに勝る、誘引シグナルとして作用することが示された。
アスカロシド生物発生用の実用モデルを図61Bに提案している。アスカロシドが、最大21個(及び、それ以上の)の炭素側鎖を有する一連の同族体メンバーであるという知見により、非常に長鎖の前駆体のペルオキシソームβ-酸化がそれらの起源であることが示唆される。以前の研究では、野生型及びdaf-22突然変異体中のC29〜C31側鎖を有する非常に長鎖のアスカロシド(VLCA)の存在が報告されており、このアスカロシドは、アスカロシド生合成における、前駆体又は中間体となり得る(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Zagoriyら、Chem. Biodivers. 7巻、2016〜22頁(2010年))。或いは、非常に長鎖の脂肪酸(VLCFA)は、(ω-1)-又は(ω)-官能基化及びその後のアスカリロースの結合に先立って、ペルオキシソームβ-酸化を受けることができる。acox-1突然変異体は(ω-1)-及び(ω)-酸素化アスカロシドに異なる影響を及ぼすという観察により、VLCFA前駆体の(ω-1)及び(ω)-官能基化は、ペルオキシソームβ-酸化によるそれらの分解の上流で起こることが示唆される。側鎖長が広い範囲にあることを考慮すると、生じた(ω-1)-及び(ω)-ヒドロキシVLCFAは、β-酸化経路に入る前にアスカリロースに連結するが、無差別なアスカロシルトランスフェラーゼが存在していることも可能となり得る(図61B)。
次に、VLCAの短鎖化は、ペルオキシソームβ-酸化の繰返しサイクルにより進み得る。LC-MS/MSのスクリーニングからの結果により、4つのステップのβ酸化サイクル、すなわち、アシルCoAオキシダーゼACOX-1、エノイル-CoAヒドラターゼMAOC-1、β-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼDHS-28、及びβ-ケトアシル-CoAチオラーゼDAF-22の各々に関与する酵素に関する正確な役割の提唱が可能になる。acox-1、maoc-1、及びdhs-28中の突然変異は、それらの提唱されている機能と一致して、対応するアスカロシドのプロファイルの特異的な変化をもたらすことが示された。
アシル-CoAオキシダーゼACOX-1は、acox-1における突然変異が、ascr#1ではなくascr#2及びascr#3の生合成に主として影響を及ぼすことを示す、以前の研究の主題であった(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jooら、J. Biol. Chem. 285巻、29319〜25頁(2010年))。しかし、実施例50に記載した結果は、acox-1(ok2257)突然変異体はC9(ω-1)-官能基化アスカロシドを処理する能力が低下し、その結果、短鎖アスカロシドのすべての産生量の低下、及びC9以上の長鎖飽和アスカロシドの増加をもたらすことを示している。maoc-1(dhs-28及びdaf-22も同様)の突然変異は、腸の脂質滴の広がりをもたらし、耐飢餓性及び耐脂肪分解性トリグリセリドの増加を引き起こすことが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Zhangら、PNAS 10巻、4640〜45頁(2010年))。実施例51に記載された結果は、MAOC-1がアスカロシド生合成に関与し、以前に未同定のエノイル-CoAヒドラターゼとして作用することを示している。これらの知見はさらに、C.エレガンスにおける、エノイル-CoAの水和、及びβ-ヒドロキシアシル-CoAの脱水素が、ヒトMFE-2の個別の機能ドメインに対するそれらの同族性により示された通り、2種の個別の酵素であるMAOC-1及びDHS-28により触媒されることを実証している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Zhangら、PNAS 10巻、4640〜45頁(2010年))
実施例52〜53において記載されている結果は、インドールアスカロシドにおけるトリプトファン由来のインドール-3-カルボニル単位の結合は、それらの生合成における最終ステップにあたること、及びこのステップが、高度に特異的であることを示している。インドール-3-カルボニル基のアスカロシドへの結合は、それらの生物機能を劇的に変えることができるので、こうした厳密な調節は理にかなっている。例えば、耐久型幼虫誘発性且つ強い忌避性のシグナルascr#3にインドール-3-カルボニルを付加すると、有効な雌雄同体誘引物質icas#3になる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。
C.エレガンス中のアスカリロースの生合成は検討されていない。しかし、無菌のC.エレガンス培養物中のアスカロシドの検出は、C.エレガンスがアスカリロースを内生的に産生していることを実証している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。細菌中のアスカリロース生合成は、十分に理解されており、C.エレガンスのゲノムは、この経路における細菌の遺伝子のいくつかのホモログ、例えば仮性結核菌由来のascEを含んでおり(図62)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Thorsonら、J. Bacteriol. 176巻、5483〜93頁(1994年))、アスカリロース生合成及び線虫におけるアスカリロース調節の研究に対する潜在的なエントリーポイントを提供する。さらに、VLCFA前駆体の(ω-1)-又は(ω)-官能基化を触媒するオキシダーゼの同定は依然として残されている。野生型及びペルオキシームβ-酸化突然変異体における、(ω-1)/(ω)-酸素化アスカロシドの比が、飢餓によって強く影響を受けるという知見は、このステップが栄養状態に関する情報をコードし得ることを示している。さらに、アスカロシドの排泄は、驚くほど特異的であることが示された。LC-MS/MSが高感度であること及び選択性が高いことを考慮すると、実施例29〜55において記載した方法を使用するアスカロシドのプロファイリングは、アスカロシド生合成及びホメオスタシスに関与する、さらなる遺伝子及び環境因子を特定する手助けとなり得る。
[実施例56]-耐久型幼虫の生成
20,000匹の蠕虫/ml及び0.5%(湿重量)大腸菌(HB101)を含むS-完全培地(S-complete)中、耐久型幼虫誘発性液体培養条件下で、C.エレガンスを培養した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE6巻、e17804(2011年))。線虫のL1幼虫に餌食した112時間後、線虫を振とう器中、22℃でインキュベートした(250rpm)。その後、線虫を1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で15分間処理した。残存している線虫を集める前に、寒天プレート上の死亡した線虫から分離した。死亡線虫を真空により除去した後、耐久型幼虫の動物を、M9緩衝液を使用して集め、4℃に置いた。
[実施例57]-S.フェルティアエの飼育
S.フェルティアエは、ARBICO Organics社(Tucson、AZ)から注文した。ハチノスツヅリガ幼虫(スイムシ、Grubco社、Hamilton、OH)を幼虫1匹あたり50匹のS.フェルティア耐久型幼体に感染させた。2日後、感染した幼虫を新しい直径6cmのペトリ皿に入れ、ホワイトトラップ法を使用して、感染態幼体(IJ)を集めた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY(1997年))。
S.フェルティアエIJは、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Campos-Herreraら、Ann. Appl. Biol. 158巻、55〜68頁(2011年)に記載されている通り、ITS rDNA領域からの種特異的プライマーを使用する、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって確認した。PCR増幅は、MJ Research PTC 200 Peltier Thermal Cyclerで行った。増幅は、無菌脱イオン水、及びネガティブ対照としてステイネルネマ・リオブラベから調製したDNAを使用し、1μLのDNAテンプレートを含有している25μLの最終体積中において、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Campos-Herreraら、Ann. Appl. Biol. 158巻、55〜68頁(2011年)に記載されている通り実施した。周期パラメーターは、94℃で15分、続いて、94℃で30秒の熱変性を35サイクル、59℃で20秒間のアニーリング、及び72℃で20秒間の伸長、72℃で10分間の最終の伸長とした。アンプリコンサイズは、三酢酸EDTA(TAE)2%アガロースゲル上の電気泳動法により確認し、UVP BioDoc-itTM Systemで可視化した。
S.フェルティアエのプライマーは、従来的なPCRにおいて、研究室の集団からのIJを含有するすべての試料について、特定の増幅物を産生した。このプライマーは、S.リオブラベ及び脱イオン水対照には増幅を示さなかった。
[実施例58]-ネコブセンチュウの飼育
感染したトマト植物は、フロリダの圃場地から集めた。根は、根瘤病感染の有無を検査し、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hussey及びBarkerのPlant Dis. Rep. 57巻、1025〜28頁(1973年)により記載されているものに修正を加えて、ネコブセンチュウの卵を集めた。被感染根は、2分間1%漂白剤により処理した。卵の塊のマトリックスから放出された卵は、植物のくずを採集するための階層化フィルターシステム(nested filter system)(85μm)により、及び卵を採集するために25μmナイロンフィルター(Nytex)により採集した。卵をMILLI-Q水により徹底的により洗浄し、孵化するための少量の水を有する直径8cmのペトリ皿上の20μmフィルターの上に3日間室温で置いた。
被感染トマトの根から抽出したネコブセンチュウを、形態学、及びエステラーゼ(EST)及びリンゴ酸脱デヒドロゲナーゼ(MDH)に関するアイソザイムの表現型タイピングに基づいて同定した。形態学的な同定は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、JOSEPH NEAL SASSER & CATHY CAMERON CARTER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE(1985年)に記載されている、成熟雌の会陰パターンを使用して行った。手短に言えば、アイソザイムの表現型タイピングは、25匹の産卵雌を使用して行った。根系から直接切り裂いた雌の抽出物を、2つのポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Britoら、Nematology 10巻、757〜66頁(2008年)上で行った。1つめのゲルは、MDH活性とEST活性の両方のために染色(全体が参照により本明細書に組み込まれている、KENNETH REECE BARKER、CATHY CAMERON CARTER & JOSEPH NEAL SASSER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE(1985年))し、一方、2つめのゲルはESTだけのために染色した。
[実施例59]C.エレガンス分散ブレンドの同定
L1に餌食した67時間後に、60%耐久型幼虫(2回の実験)、及び40%の耐久型幼虫を誘発した液体培養物をLC-MSを使用して分析した。4種のアスカロシドは、3つの液体培地すべてに共通であった。60%耐久型幼虫を生じた液体培養物から、各々の濃度を測定した。
[実施例60]-分散アッセイ
S.フェルティアエIJは、MILLI-Q水で3回洗浄し、少量のMILLI-Q水(4〜5ml)により36時間、6cmペトリ皿中でインキュベートした。次の日、1010g/cm2のゲル強度を有する10.7g/Lの寒天上に線虫を置いた(PhytoTechnology Lab. Shawnee Mission、KS)。線虫行動がプレート組成物により影響を受ける可能性を排除するために、内部プレート複製物を有する複数のプレート上で行動アッセイを行った。10μlの水中、およそ300匹のIJを寒天培地上に置き、試験化合物又は抽出物(1〜2μl)を線虫の懸濁液に入れた。液体の吸収(約15分)に際して、自由運動線虫を5〜10分間ビデオ録画した。分散行動は、温度及び季節依存的である。冬の間は、アッセイは室温(22±1℃)で行う。夏の間は、23℃より高いと線虫の行動に影響するので、このアッセイは温度管理環境が必要である。
C.エレガンスの耐久型幼体をMILLI-Q水で3回洗浄し、少量の水を有する6cmペトリ皿に入れ、一晩休ませた。水10μl中の約200〜300匹の線虫を、寒天プレートに置き、ここに2μlの処理剤を加えた。60%の耐久型幼虫動物を生じた液体培養物を遠心分離にかけ、0.45μmフィルターによりろ過し、分散用のポジティブ対照として使用した。その後、媒体を凍結乾燥し、MILLI-Q水中で5回再懸濁した。線虫の懸濁液2μl〜10μlをアッセイに使用した。ネガティブ対照として、0.5%大腸菌(HB101)をS-完全培地中で調製し凍結乾燥し、アッセイにおいて0.25%大腸菌の最終体積となるよう調節した。分散行動は、12〜15分間、観察した。
ネコブセンチュウの分散をアッセイするために、1〜3日以内に孵化したネコブセンチュウを採集し、10μmナイロンフィルター(Nytex)を使用して、MILLI-Q水で3回洗浄した。その後、それらを1.5mlエッペンドルフチューブに入れた。10μl水中の線虫を寒天プレートに置いた。線虫が元々置かれた場所から離れた場所で発見される線虫を、1時間時及び2時間時に計数した。展開した線虫の総数を使用して、各処理を正規化した。各処理については、20回の実験を違う3日に行った。線虫密度は、14回の実験では1プレートあたり約30匹、6回の実験では1プレートあたり100匹であった。実験は朝に行った。
[実施例61]C.エレガンス分散の定量
線虫は、Image Jソフトウェアを使用して定量した(Image Processing and Analysis in Java、National Institutes of Health)。Image Jを使用した視覚化して計数した線虫の数を図63Bに例示している。円内部の線虫は線虫の配置場所であるので、計数した蠕虫の総数から手計算で差し引いた。各処理をそれぞれ9〜11回繰り返した。グラフは、ポジティブ対照、すなわち耐久型幼虫の状態に整えた培地に正規化した。
[実施例62]-S.フェルティアエ分散ブレンドの精製
活性指向分画は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)において報告されているものに修正を加えて行った。合計33個の昆虫宿主死骸(ハチノスツヅリガの幼虫)を70%EtOHに入れ、抽出まで-20℃で保存した。昆虫死骸は、Precellys24ホモジナイザーを使用して、2mlチューブ中、1gのセラミック製ジルコニウムビーズ(1.25mm)(ZIRMIL)を使用して、37秒間ホモジナイズした。試料は18400相対遠心力(rcf)で15分間、遠心分離にかけ、上澄み液を凍結乾燥し、MILLI-Q水中で再懸濁した。線虫の分散活性は、実施例60において記載した、分散アッセイ及び昆虫宿主死骸抽出物の生理的に適切な濃度又は分画抽出物を使用して試験した。アスカロシドの生理的に適切な濃度の計算を容易にするために、スイムシの体積を約200μlで見積もった。スイムシの平均重量は232+57mg(n=19)であった。
1番目の逆相固相抽出は、Sep-Pak Plus C18カートリッジ(Waters corporation社、Milford、MA)を使用して行った。最初に採集した素通り画分をフラクションAと名付けた。その後、カラムを水で洗浄し、集めて保存した。続いて、カラムを、50%(フラクションB)及び90%(フラクションC)のMeOHにより溶出した。個別と組合せの両方で、フラクションの分散活性を試験した。さらに、個々のフラクションは、LC-MSにより分析した。フラクションAは、LC-MSにより採集し、且つフラクションB+Cと共に活性の試験を行うascr#9を含有した。
[実施例63]-S.フェルティアエのアスカロシド産生の経時検討
一対一のアッセイ方法(全体が参照により本明細書に組み込まれている、LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY(1997年))を使用した。1匹のスイムシを、24ウェルプレートの1つのウェル上に置いた。感染については、50匹のS.フェルティアエIJを、各ウェル中の水25μl中に置いた。24時間後、このプレートを被感染昆虫幼虫についての試験を行った。感染したものをホワイトトラップ中に置き(全体が参照により本明細書に組み込まれている、LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY(1997年))、48時間後に感染したものを、個別のホワイトトラップに置いた。最初のサンプリングは、48時間後に行った。その後、試料は9日間毎日、及び14日目に1回採取した。各実験については、試料は6個の昆虫宿主死骸を含んだ。この昆虫死骸は、1mlの水を含む2mlエッペンドルフチューブに入れた。この死骸を針で刺して、内部の含有物を出し、次にボルテックスした。試料は3380rcfで10分間、遠心分離にかけ、0.5〜1mlの上澄み液を回収した。上澄み液を-20℃で凍結し、次に、凍結乾燥した。その後、該液を50%MeOH200μl中で再懸濁し、0.1%ギ酸により1:1に希釈した。試料pHは、4.3であった。この時点で、各試料の20μlをascr#9の分析用にLC-MSに付した。
[実施例64]-ステイネルネマ属種及びヘテロラブディティス属種の昆虫宿主死骸中のasrc#9
昆虫宿主(ハチノスツヅリガ)は、H.バクテリオフォラ、H.ゼアランディカ、H.フロリデンシス、S.カルポカプサエ、S.リオブラベ、又はS.ディアプレペシに感染させた。線虫が昆虫死骸から出現し始めると、70%EtOH1.5mlに入れ、それらを使用するまで-20℃で保管した。その後、昆虫死骸は、Precellys24ホモジナイザーを使用して、2mlチューブ中、1gのセラミック製ジルコニウムビーズ(1.25mm)(ZIRMIL)を使用して、39秒間使用ホモジナイズした。ホモジナイズした死骸は、10分間、3380rcfで遠心分離にかけた。上澄み液は、HPLC用水1mlにより希釈し、-20℃に置き、次いで、SpeedVac(登録商標)(Speed Vac Plus SC210A、Savant)に一晩入れた。死骸抽出物はそれぞれ、50%MeOH1ml中に再懸濁し、18400rcfで15〜20分間、遠心分離にかけた。その後、試料を0.1%ギ酸により1:1の比に希釈すると、pH4.2の試料が得られた。arc#9の存在又は非存在をLC-MSにより決定した。
[実施例65]-LC-MS分析
アスカロシド分析は、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE 6: e17804(2011年)において報告されている方法を使用して行った。
[実施例66]-分散アッセイ
昆虫病原性線虫(EPN)については、昆虫死骸は、IJ段階の分散行動を促進することが知られている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Shapiro-Ilanら、J. Invertebr. Pathol. 83巻、270〜72頁(2003年))。したがって、アッセイは、分散を促進する被消費昆虫死骸中の化合物を同定するために開発されたものである。水10μl中の約300匹のS.フェルティアエのIJを寒天プレートに置いた(図64B)。次に、2μl水(図64C)、又はS.フェルティアエに感染したハチノスツヅリガの幼虫の死骸の水性抽出物(図64D)の一方を、線虫の懸濁液に入れた。水が培地に吸収された後、線虫は自由運動することができた。水処理された線虫は、分散行動をすることなく、配置場所近くに留まった。対照的に、死骸抽出物により処理した線虫は、非常に活発で、開放点から動いて遠ざかった。これは、死骸から去った線虫に対して観察された、同一の明確な分散行動であった。死骸抽出物のLC-MS分析により、アスカロシド(ascr#9)の存在が明らかになり(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))、S.フェルティアエがアスカロシドを分散シグナルとして利用し得るという仮説を支持している。
[実施例67]-C.エレガンス分散は、アスカロシドのブレンドによって調節される
次に、実施例66の分散バイオアッセイをC.エレガンス耐久型幼虫の分散を試験するために使用することもできるかどうかを見極めるため、このアッセイを検討した。このアッセイについては、60%耐久型幼虫を生じたC.エレガンス液体培養物由来の成長培地を使用した。すべての線虫の除去に続いて、この耐久型幼虫に条件を整えた培地が、C.エレガンスの耐久型幼虫における分散行動を強力に引き起こした。LC-MSを使用して、耐久型幼虫を形成する培地は、4種の公知のアスカロシド(ascr#2、ascr#3、ascr#8及びicas#9)を含有することが見いだされており(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁、(2007年)、Pungaliyaら、PNAS 106巻: 7708〜13頁(2009年)、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))(図63A及び図65)、これらのアスカロシドは、C.エレガンスにおける耐久型幼虫への移行をそれぞれ促進することが以前に示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年)、Butcherら、Org. Lett. 11巻、3100〜03頁(2009年)、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年))。耐久型幼虫形成培養培地中のアスカロシドの濃度は、ascr#2(3.68pmol/μl)、ascr#3(0.165pmol/μl)、ascr#8(0.25pmol/μl)、及びicas#9(0.005pmol/μl)であると見積もられた。
次に、これらのアスカロシドの合成ブレンドをポジティブ対照として耐久型幼虫に条件を整えた培地を使用して、分散活性を試験した。培地は、元々0.5%大腸菌(HB101)食料源のおよそ半分を含有すると見積もられた。したがって、食物が無いことによって引き起こされる食物探索行動を防止するため、0.25%大腸菌を合成した試験試料及び水対照に加えた。分散線虫数は、ポジティブ対照の応答率に正規化した。食品だけが存在する場合(ネガティブ対照)、耐久型幼虫のおよそ35%が、開放場所を去った。しかし、合成アスカロシドブレンドの添加により、ほぼ2倍の線虫(62%)が、開放場所から去った(図63B及び図66A〜B)。生理的濃度において個別に試験すると、ascr#8(50%)及びascr#2(40%)が最も強力な応答を与えたが、しかし、4つのすべてが、ブレンドほど活性ではなかった(図63C)。このことは、C.エレガンス耐久型幼虫は分散ブレンドの単一成分を知覚して応答することができるが、活性を取り戻すのに、4種の成分ブレンドのすべてが必要であることを示唆している。
[実施例68]-EPN及び植物寄生性線虫は、C.エレガンス分散ブレンドを感知する
多くの線虫種は、他の線虫種によって放出されるシグナルを感知して応答することができると仮説が立てられた。したがって、C.エレガンスにより放出されたアスカロシドは、有効な忌避シグナルとして機能することができた。分散アッセイでは、S.フェルティアエのIJは、水にさらされても顕著な運動を示さないが、C.エレガンス分散ブレンドにさらされると、非常に活発になり、開放場所から遠ざかった(図63D及び66C)。トマトの根から単離された野生のネコブセンチュウ(メロイドギネ属種であるジャワネコブセンチュウ、M.フロリデンシス及びサツマイモネコブセンチュウの混じりもの)のJ2の運動形態も、C.エレガンス分散ブレンドに対する応答について試験を行った(図66D)。対照と比較して、やはりより多くの線虫(10〜12%)が、C.エレガンスブレンドが導入された場所を去った。これは、少なくともある線虫種が、遠くの関連線虫種の分散ブレンドに応答することができることを示唆している。
[実施例69]-S.フェルティアエ及びC.エレガンスのブレンドの主成分は、構造類似体である
S.フェルティアエ分散フェロモンの特徴付けに関すると、昆虫宿主死骸を70%EtOHにより抽出し、逆相(C18)クロマトグラフィーによって分画してアッセイした(図67A〜D)。バイオアッセイにより、3つのフラクションすべて(A、B、及びC)の組合せが活性に必要であることが明らかになった(図67A)。LC-MSによるフラクションの分析(図68A〜C)により、フラクションA中の2種のアスカロシドが明らかになり、これらは合成標準品(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年)、von Reussら、J. Am. Chem. Soc. 134巻(3号)、1817〜24頁(2012年))の助けを受けてascr#9及びascr#11と同定した。バイオアッセイは、ascr#9及びascr#11が、生理的に適切な濃度において、独力で活性を有していないことを示した(図67B)。これは、単独で試験した場合、天然のフラクションAが不活性であったからである(図67A)。しかし、生物上適切な濃度(40pmol/μl)で合成ascr#9を天然フラクションB及びCと一緒にすると、元々あった分散活性が戻り(図67C)、これにより、S.フェルティアエの分散ブレンドの活性成分としてascr#9が確認された。フラクションAで発見された第2のアスカロシドであるascr#11もまた、フラクションB及びCと一緒にすると、完全活性が戻り(図67D)、ascr#9又はascr#11いずれか一方は、それ自体、フラクションB及びCと組み合わされて完全な分散活性を再構成するのに十分であった。
発達プロファイルは、C.エレガンスの分散フェロモンの主要成分であるascr#2について、以前に確立(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE 6: e17804(2011年))されている。S.フェルティアエ分散ブレンド中のフラクションAの主要なアスカロシドであるascr#9は、ascr#2の構造類似体である(図67C)。それ故、S.フェルティアエに感染した昆虫死骸中のascr#9の蓄積を経時実験において分析した(図69)。結果は、ascr#9が、C.エレガンスにおけるascr#2に関して以前に確立されたものと非常に類似した蓄積プロファイルを有したことを示している。さらに、ascr#9の蓄積は、IJが分散する直前に最も高く、IFに食い尽くされた死骸でも少なくとも6日間一定のままであった。これは、ascr#2及びC.エレガンスに関する耐久型幼虫形成で観察したものと非常に似ている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE 6: e17804(2011年))。対照的に、ascr#11のプロファイル(図69)はascr#9のそれとは異なった。ascr#11は、最初は検出可能であったが、8日目(分散日)には定量することができなくなり、また分散後6日目にあたる14日目まで昆虫宿主死骸において定量することができなかった。
ascr#9も試験を行い、C.エレガンス分散ブレンド中の構造類似体ascr#2の代替となることができることが分かった(図70)。こうして、S.フェルティアエにおいて見いだされた通り、種間の知覚はC.エレガンスにも該当した。
[実施例70]-ascr#9は、系統発生的に関連するEPNの分散ブレンド中の共通成分である
甲虫類及びハエ類では、系統発生的な関連種は、それらの集合形成フェロモンブレンド中の成分を共有している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Symonds & Elgar、Proc. Biol. Sci. 271巻、839〜46頁(2004年)、Symonds & Wertheim、J. Evol. Biol. 18巻、1253〜63頁(2005年))。分散ブレンド成分が系統発生的に関連する線虫種によって、どの程度共有されるのかをさらに試験するために、ステイネルネマ属種及びヘテロラブディティス属種に感染している昆虫宿主死骸を、ascr#9、ascr#2及びascr#11の存在について分析した(図71A〜B)。
両方の種にとっての昆虫宿主死骸は、ascr#9を含有していることが見いだされ(図71A〜B)、このことは、ascr#9が、それらの分散ブレンドの一部として、広範囲のEPN種によって使用され得ることを示唆している。ascr#11は、試験したステイネルネマ属種のすべてで発見されたが、ヘテロラブディティス属種では発見されず、ascr#11はステイネルネマ属種に特異的となり得ることが示唆される。
実施例56〜70の考察
C.エレガンスについては、アスカロシドの共有された特有の組成物が、様々な行動を調節する。例えば、交尾及び分散ブレンドは、ascr#2、ascr#3及びascr#8を共有する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年)、Pungaliyaら、PNAS 106巻、7708〜13頁(2009年)、Kaplanら、Publ. Lib. Sci. ONE 6: e17804(2011年))。C.エレガンスの交配ブレンドは、特有成分ascr#4を特徴とし(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年))、また分散ブレンドは、特有成分icas#9を有する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。したがって、これは、多くの線虫種にとって一般的なものとなり得ると考えられる。
メロイドギネ属種もまた分散ブレンドを利用するかどうか依然として不明であったが、本明細書では、これらの線虫種は、植物性材料に分解性及び腐敗性を示す、他の線虫種によって放出されるシグナルを検出して応答することができることが示された。C.エレガンス分散ブレンドは、系統発生的な関連種の類似の発達段階において類似活性を示し、このことは、このブレンドが、植物、ヒト及び家畜に対する寄生性の種を防除するために、遺伝的標的を特定すること、及び分散ブレンドを配合するために使用し得ることを示唆している。実施例56〜70は、いくつかの線虫種が、分散行動を調節する種特異的な低分子シグナルを利用するだけでなく、線虫の分散行動が、種間の情報交換により広く誘発され得ることも実証している。
[実施例71]-維持アッセイ
OP50大腸菌を、5cmの標準寒天プレート(標準線虫成長培地で作製した)上で成長させた。細菌叢は直径16mmであり、20℃で一晩成長させた後、試験に使用した。2つの4mmのスポット(0.6μL)を、細菌叢の反対側に置き(スポット配置を案内するための透明テンプレートを使用する)、液体を沈着させるために数分間経過した後、線虫をアッセイに置いた。記録は、蠕虫を配置した直後に開始した。対照0.6μLを細菌叢の一方に置き、実験的キューとなるもの0.6μLを細菌叢のもう一方に置き、偏りを回避するために、左/右及び上部/底部の間で、試験全体にわたりキューの位置を変えた。
線虫は、L4段階で性別により分けた後、成長成体として試験に使用した。蠕虫を均等に分け、点数化領域の焦点から等距離の2つの点に置いた。試験は、20分間記録し、1秒あたり1フレームで、フレームを分析用に集めた。結果は、少なくとも3回の別の試験から平均をとった。本研究における各線虫種について、総数の異なる蠕虫(両方の点数化領域に水を使用して)を試験し、20分間の試験にわたり一貫した公正な結果に必要な蠕虫の最少数を決定した。複数種のアッセイにおいて使用される蠕虫の総数は、その種の最適パラメーターに依存した。P.レディビブスの雄及び雌には、10匹の蠕虫を使用し、C.エレガンスの雄及びO.ドリクリダエ(O. dolichuridae)の雄については20匹の蠕虫を使用し、S.グラセリの雄については14匹の蠕虫を使用した。自動ソフトウェアを使用して、経時的に各点数化領域内の蠕虫の占有を比較し、化学走性指数(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁(1993年))を適合して、各アスカロシドに対し好む又は忌避するのを数値化した。
[実施例72]-誘引アッセイ
10cmの標準化学走性用プレートを調製し(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁(1993年))、使用前日まで4℃で保管した。標準の1cm径銅管を1cm区間に区分分けし、チャンバを保持するのに使用した。雌/雌雄同体を一晩分離しておき、M9緩衝液中で3回洗浄し、次に、1000×ストレプトマイシン50μLにより事前に条件を整えたプレート上を2時間這わせ、偽陽性誘引物質を産生し得るいかなる細菌をも死滅させた。次に、線虫を3回洗浄し、最後の洗浄からの上澄み液を対照として、10cmのプレートの境界から1cmのところの銅製チャンバ内に置いた。線虫は、対照チャンバと反対の境界から1cmの銅製チャンバ内のM9中で懸濁した。6時間後、続いて、線虫を取り出し、1Mアジ化ナトリウム3μLにより置きかえた。100匹のC.エレガンスの雄の成体を一晩分けておき、ddH2O中で数回洗浄し、寒天プレートの中心に置いた。数時間後、各領域の2cm以内で麻痺していた雄を点数化した。次に、化学走性指数(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁(1993年))を使用し、いずれかの点源への雄の化学走を点数化した。
[実施例73]-交尾アッセイ
全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pedenら、Curr. Biol.、15巻、394〜404頁(2005年)において記載されている交尾アッセイを適用した。手短に言えば、40匹の幼成体の雌雄同体/雌を8mmの細菌叢に置いた。C.エレガンスL4の雄を一晩隔離した。雌雄同体/雌の豊富なプレート上に5匹の雄を置いた。3分の期間内に雌雄同体に応答した雄の数を数えた(1匹の雄は、1回しか数えない)。雄が雌雄同体で止まり、且つ連続する10秒を超えて、腹尾部を潜在的な交尾相手にくっつけた場合に、応答していると定義した。それらを、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pedenら、Curr. Biol. 15巻、394〜404頁(2005年)からも適用される応答率について点数化し、それには以下の式を使用して計算した。応答率=[#応答する雄/5匹の雄]×100%。
[実施例74]-自動ソフトウェア(保持アッセイ用)
顕微鏡に取り付けたビデオカメラがデジタルビデオストリームを作製し、これを次に解析した。平均的な蠕虫が対象の各領域で過ごした時間の比を各試験について計算した。実施を容易にするため、1回の試験中の蠕虫はすべて、ほぼ同じサイズであると見なした。したがって、全体の蠕虫の代わりに蠕虫のピクセル数を数え、これにより、対象領域の蠕虫の比率を考慮することができる。形に基づいた蠕虫識別アルゴリズムの必要性もやはり排除して、各フレームを独立して解析することが可能になった。バンドパスフィルターを各フレームに適用して不均一な光の影響をなくし、さらにバックグラウンドに対する蠕虫を目立たせることもした。次に、フィルターをかけた画像に閾値を設けた後、蠕虫を識別した。各実験の全体にわたり、対象領域の場所及びサイズは既知であった。上で記載したフィルタリングを通じて、どのピクセルが蠕虫により占有され、どのピクセルが占有されていないかが分かる。こうして、蠕虫ピクセル数と対象領域内部のすべてのピクセル数との比を計算して、蠕虫占有率を出すことができる。この計算を各フレームについて行い、各領域について、蠕虫占有率対時間の出力プロットを行った。
[実施例75]-HPLC分析
50〜1000AMU範囲において、ポジティブイオンモードで、エレクトロスプレーイオン化によりThermo Finnigan LCQ Deca XP Maxを使用した。Thermo SeparationスペクトルHPLCシステムは、P4000クォータナリーポンプ、AS 3000自動サンプラー、及びUV 6000ダイオードアレイ検出器から構成した。溶媒は、(a)0.1%ギ酸を含む水、及び(b)90%アセトニトリル-10%水(10mMギ酸アンモニウム含有)とした。カラム温度は60℃に維持し、1.0ml/分の溶媒流量とした。逆相カラム(PLRP-Sポリマー逆相カラム、250x4.6mmid、Varian Inc.社)は、90:10(a、b)を2分間から始めて、その後、20分で5:95にグラジエントし、追加の5分を5:95とする溶媒組成により溶出させた。紫外線吸収は、190nm及び400nmでモニターした。紫外線検出器と質量分光エレクトロスプレーの間の溶媒流量は、低容量用マイクロニードルP450スプリッターバルブ(Upchurch Scientific社、Oak Harbor、WA)により9:1のスプリットにインターフェース連結し、これにより、溶出化合物のスペクトルの取得及びバイオアッセイ用の注入物質の90%を同時に採集することが可能となる。9.7分の保持時間を有する精製ピークは、バイオアッセイにおいて、雄に活性であった。化学イオン化(ポジティブモード)によるLC-MSは、m/z294(M+NH4)の主要ピークを示す。これにより、NMR分析を使用して、ascr#1であると確認した。
[実施例76]-系統樹の構造
この解析のためのリボソーム小サブユニットDNA(SSU rDNA)配列を、GenBankから得た。この配列は、MUSCLEを使用してまず整列させて、続いて、トリミングして、配列と変動する長さを比較し易くした。トリミングした整列は、すべての分類群について表される690文字になった。隣接結合(N-J)解析は、多数決合意樹を作製するための「Consense」を使用して、PHYLIP 3.68パッケージからの「Dnadist」及び「Neighbor」プログラムを使用して行った。
[実施例77]-線虫の培養、並びに蠕虫の排泄物及び分泌物の採集
C.エレガンス、ラブディティス属種(Rhabditis sp.)、O.ティプラエ(O. tipulae)、C.属種7、P.パキフィクス、P.レディビブス、コエルニア属種(Koernia sp.)、及びP.ストロンギロイデスは、大腸菌OP50を含む6cm標準寒天プレート上に維持した。大量に育成するために、それらを液体培養物中、すなわち大腸菌HB101を含むS-完全培地中で、インキュベーターシェーカー中、250rpm、20℃で育成した。蠕虫を、S基本培地を使用して数回の洗浄及びろ過のステップにさらし、細菌を除去した。蠕虫を、3000rpmで5分間、遠心分離により洗浄の間に採集した。この蠕虫を6時間、S基本培地中、蠕虫1匹/μLでインキュベートした。その後、蠕虫をろ別し、残りの上澄み液を0.22μmフィルターに通した後、-20℃で保存した。
S.カルポカプサエ、S.グラセリ、S.リオブラベ、及びH.バクテリオフォラを、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hallemら、Curr. Biol. 21巻(5号)、377〜83頁(2011年)において報告されている通り維持した。手短に言えば、いくつかの終齢ハチノスツヅリガの幼虫を55mmのWhatman1のろ紙を備えた6cmペトリ皿に置いた。約500〜1000匹のIJをこのろ紙上に置いた。7日後、Whatman1のろ紙を有する逆さまにした6cmペトリ板に昆虫死骸を置き、10cmペトリ皿中の少容量のddH2Oに浸した。発生したIJを採集し、上で記載した通り数回洗浄した後、蠕虫1匹/μLで、6時間、ddH2O中でインキュベートした。感染3日後に、成体を昆虫死骸から切り出し、上で記載した通り洗浄/インキュベートした。
N.ブラシリエンシス、ブタ回虫(A. suum)、キタネグサレセンチュウ(P. penetrans)、及びロマノメルミス属種(Romanomermis spp.)は共同研究者によって提供を受け、以下の表11に同定している。この実施例中で使用した株のすべてを列挙する。株の同定のない種は、「名称なし」と呼ぶ。
Figure 2014522882
N.ブラシリエンシスは、蠕虫1匹/5μL(サイズは大きいとする)で0.85%の生理食塩水中、30℃でインキュベートした。ブタ回虫を無菌生理食塩水中で洗浄した後、DMEM中、37℃で3、6及び13時間インキュベートした。上澄み液を個々に試験し、次いで、複合分析のためにプールした。キタネグサレセンチュウ及びロマノメルミス属種を、250rpm、20℃でddH2O中において一晩インキュベートした。
[実施例78]-蠕虫試料の調製
蠕虫の水試料を凍結乾燥し、メタノール1〜10mlで2回抽出し、綿花でろ過した。抽出物は、真空で濃縮した。得られた残留物をメタノール150μL中で再懸濁し、次いでろ過した。
[実施例79]-MS分析
HPLC-MSは、Agilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を装備し、10:1のスプリットを使用するQuattro II分析計(マイクロ質量計/Waters社)に接続したAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。0.1%酢酸-アセトニトリル溶媒のグラジエントを使用し、3.6ml/分の流速で、5%アセトニトリル含量を5分間から始めて、次に、40分間かけて、100%に増加した。代謝抽出物は、3.5kVのキャピラリー電圧、及び-40V及び+20Vのコーン電圧をそれぞれ使用し、ネガティブイオン及びポジティブイオンモードでHPLC-ESI-MSにより分析した。アスカロシドは、準分子イオンシグナル(図72A〜D)及びHPLC保持時間(図73)と、C.エレガンスの野生型及びペルオキシソームベータ-酸化変異体から同定した150種の成分ライブラリーのものとを比較することにより同定した。以前の研究により、アスカロシドはすべてMS/MS(2.1mtorr及び30eVの衝突ガスとしてアルゴン)時に、強度の強いC3H5O2生成物イオンを与えることを示しているので、アスカロシドの構造帰属を確認するため、m/z=73.0(図74A〜B)の前駆体イオンにMS/MSスクリーニングを使用した。アスカロシドの定量は、対応するイオン-トレースからのLC-MSシグナルを積分することによって行った。相対アスカロシド濃度は、ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#5、ascr#7、ascr#9、ascr#10、oscr#9、oscr#10及びicas#9の合成標準品用に決定した応答ファクターを使用して最終的に算出した。依然として合成されていないアスカロシド用応答ファクターは、利用可能な標準品について観察されたデータに基づいて推定した。
[実施例80]-アスカロシドoscr#9の合成
アスカロシドoscr#9は、以下のスキーム11で示される通り調製した。
Figure 2014522882
2を調製するため、メタノール(17ml)中の新しく蒸留したδ-バレロラクトン(1)(856mg)を濃H2SO4(100μl)で処理し、12時間還流した。溶液を-20℃に冷却し、NaHCO3(80mg)により処理して10分間撹拌した。反応混合物をろ過し、溶媒を真空で除去した。残留物をDCM(10ml)に溶解し、Na2SO4で脱水してろ過し、真空で濃縮すると、5-ヒドロキシペンタン酸メチル(2)が無色オイルとして得られ(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Huckstepら、Synthesis 10巻、881〜82頁(1982年))(1071mg、94%)、これをさらに精製することなく直接使用した。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ 1.55(2H, m), 1.68(2H, m), 2.35(2H, t, J=7.4Hz), 3.57(2H, m), 3.64(3H, s); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ 22.2, 32.9, 34.1, 51.5, 61.9, 174.2.図75A〜Bを参照されたい。
4を調製するため、ノナン二酸モノメチルエステル(3)(923mg、4.6mmol)の乾燥THF(3ml)溶液を、THF中の1MのBH3(4.6ml、4.6mmol)により、-20℃で10分間かけて処理した。室温で4時間撹拌した後、反応を0.77MのK2CO3水溶液(10ml)により0℃でクエンチした。生成物をジエチルエーテル(3×20ml)により抽出して飽和NaCl水溶液で洗浄し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮すると、9-ヒドロキシノナン酸メチル(4)が無色オイルとして得られ(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kai K.ら、Tetrahedron 64巻、6760〜69頁(2008年))(850mg、99%収率)、これをさらに何ら精製することなく直接使用した。1H NMR(400MHz, クロロホルム-d1): δ 1.27-1.37(8H, m), 1.50-1.66(4H, m), 2.29(2H, t, J=7.5Hz), 3.62(2H, t, J=6.5Hz), 3.66(3H, s).図75Cを参照されたい。
6を調製するため、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(5)(11116)(132mg、263μmol)及び2(125mg、950μmol)の乾燥DCM(3ml)溶液を、0℃でトリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)により処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水し、真空で濃縮した。n-ヘキサン中の20〜40%(v/v)酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、5-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ)-ペンタン酸メチルエステル(6)(66.8mg、142μmol、47%)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ 1.28(3H, d, J=6.2Hz), 1.67-1.80(4H, m), 2.23(1H, m), 2.40(2H, t, J=6.9Hz), 2.48(1H, m), 3.58(1H, m), 3.64(3H, s), 3.83(1H, m), 4.13(1H, dq, J=9.8Hz, J=6.0Hz), 4.87(1H, s.br), 5.15(1H, ddd, J=11.0Hz, J=10.4Hz, J=4.5Hz), 5.18(1H, s.br), 7.50-7.60(4H, m), 7.62-7.72(2H, m), 8.05(2H, d, J=7.5Hz), 8.11(2H, d, J=7.5Hz); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6):δ 18.3, 22.5, 29.6, 34.0, 51.5, 67.5, 67.9, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.03, 130.04, 131.0(2X), 134.1, 134.2, 165.9, 166.0, 174.0.図75D〜Eを参照されたい。
oscr#9(7)を調製するために、LiOH(28mg、1.4mmol)及び水(0.6ml)の1,4-ジオキサン(4ml)混合物に、6(66.8mg、142μmol)の乾燥THF(0.5ml)溶液を加えた。66°Cで2時間撹拌した後、この溶液を氷酢酸により酸性にして真空で濃縮した。1%氷酢酸を含むDCM中の5〜30%(v/v)メタノールのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして5-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ)-ペンタン酸(oscr#9)(7)(26mg、105μmol、74%)が得られた。1H NMR(400MHz, メタノール-d4): δ 1.22(3H, d, J=6.0Hz), 1.58-1.72(4H, m), 1.77(1H, ddd, J=13.1Hz, J=11.1Hz, J=3.2Hz), 1.95(1H, ddt, J=13.1Hz, J=3.7Hz, J=0.9Hz), 2.33(2H, t, J=7.2Hz), 3.43(1H, dt, J=9.6Hz, J=6.0Hz) 3.47-3.59(2H, m), 3.71(1H, dt, J=9.8Hz, J=6.2Hz), 3.77(1H, m), 4.50(1H, s); 13C NMR(100MHz, メタノール-d4): δ 18.1, 23.0, 30.1, 34.7, 36.0, 67.9, 68.3, 69.4, 70.9, 100.4, 177.5; ESI-MS(ネガティブモード) m/z=247.1 [M-H].図75F〜Gを参照されたい。
[実施例81]-アスカロシドoscr#10の合成
アスカロシドoscr#10は、以下のスキーム12で示される通り調製した。
Figure 2014522882
8を調製するために、2,4-ジ-O-ベンゾイル-アスカリロース-1-(2,2,2-トリクロロアセトイミド)(5)(132mg、263μmol、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hallemら、Curr. Biol. 21巻(5号)、377〜83頁(2011年))及び4(112.8mg、600μmol)の乾燥DCM(3ml)溶液を、0℃でトリメチルシリルオキシトリフレート(5μl)により処理した。3時間後、この溶液を飽和NaHCO3水溶液(0.5ml)で洗浄し、Na2SO4で脱水して真空で濃縮した。n-ヘキサン中の20〜40%(v/v)酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、99.3mgの9-(3'R,5'R-ジベンゾイルオキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ)ノナン酸メチルエステル(8)(190μmol、72%収率)が得られた。1H NMR(400MHz, アセトン-d6): δ 1.28(3H, d, 6.2Hz), 1.30-1.40(6H, m), 1.40-1.49(2H, m), 1.56-1.72(2H, m), 2.22(1H, ddd, J=13.6Hz, J=11.5Hz, J=3.2Hz), 2.30(2H, t, J=7.5Hz), 2.46(1H, m), 3.55(1H, dt, J=9.8Hz, J=6.5Hz), 3.60(3H, s), 3.81(1H, dt, J=9.6Hz, J=6.6Hz), 4.13(1H, dq, J=9.7Hz, J=6.2Hz), 4.86(1H, s.br), 5.15(1H, ddd, J=11.4Hz, J=9.8Hz, J=4.6Hz), 5.18(1H, m), 7.50-7.60(4H, m), 7.63-7.71(2H, m), 8.04(2H, m), 8.11(2H, m); 13C NMR(100MHz, アセトン-d6): δ 18.3, 25.6, 26.8, 29.7, 29.9, 30.0, 30.2, 30.4, 34.4, 51.4, 67.4, 68.2, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.2, 130.3, 130.9, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9(2C), 174.3.図75H〜Iを参照されたい。
oscr#10を調製するため、LiOH(38mg、1.9mmol)及び水(800μl)の1,4-ジオキサン(5ml)混合物に、8(99.3mg、190μmol)のTHF(500μl)溶液を加えた。66°Cで3時間撹拌した後、この溶液を酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。1%の氷酢酸を含むDCM中の5〜30%(v/v)メタノールのグラジエントを使用するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして9-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2-イルオキシ)-ノナン酸(oscr#10)(9)(49mg、161μmol、85%)が得られた。1H NMR(400MHz, メタノール-d4): δ 1.22(3H, d, J=6.1Hz), 1.32-1.43(8H, m), 1.56-1.63(4H, m), 1.77(1H, ddd, J=13.1Hz, J=11.1Hz, J=3.2Hz), 1.96(1H, ddt, J=13.1Hz, J=3.7Hz, J=0.9Hz), 2.28(2H, t, J=7.4Hz), 3.41(1H, dt, J=9.6Hz, J=6.2Hz) 3.49-3.59(2H, m), 3.68(1H, dt, J=9.8Hz, J=5.5Hz), 3.76(1H, m), 4.49(1H, s); 13C NMR(100MHz, メタノール-d4): δ 17.3, 25.2, 26.4, 28.0, 29.3, 29.5, 29.6, 30.5, 34.1, 61.1, 67.4, 68.5, 69.9, 99.4, 176.8; ESI-MS(ネガティブイオンモード) m/z=303.2 [M-H].図75J〜Kを参照されたい。
[実施例82]-多くの線虫種がアスカロシドを産生する
自由生活性及び寄生性(植物、昆虫及び哺乳動物)線虫の両方を含む、様々な線虫種の選択において、アスカロシド(図76A〜D)に関する質量分析法に基づいたスクリーニングを開始した。以前の研究により、C.エレガンスのアスカロシドの産生は、発達段階に特有であることが示されている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Pub. Lib. Sci. ONE 6巻(3号): e17804(2011年))。広範囲にわたる試料を得るため、発達上の培養混合物からの滲出液を試験し、こうして、すべての幼虫段階及び成体段階によって放出されるアスカロシドの蓄積を含めた。宿主探し又は交尾相手探しにそれぞれ特有して関連するアスカロシドを同定するため、実現可能な場合、寄生性の感染態幼体及び成体を個別に試験した。線虫の分泌物は、複雑なメタボローム試料(実施例79)中のアスカロシドを検出するために最適化したプロトコルを使用し、HPLC-MSにより分析した。これらの分析により、ほとんどの線虫試料中にアスカロシドが存在することが明らかになった。試料は、野生型とC.エレガンスの突然変異株の両方から既に同定されている150種のアスカロシドのライブラリーからの質量分光データと比較した。これらの分析により、分析したほとんどの線虫試料中にアスカロシドが存在することが明らかになった。
アスカロシドは、飽和及び不飽和側鎖を有する化合物を含む混合物として一般に発生した。側鎖長はかなり変動しており、C.エレガンスでも発見されている短鎖からペロデラ・ストロンギロイデス(Pelodera strongyloides)及びヘテロラブディティス・バクテリオフォラ中の相当長い側鎖を有する化合物までの範囲に及んでいた。C.エレガンスと同様に、ほとんどの同定済みアスカロシドは、カエノラブディティス属種7及びラブディティス属(これらは、側鎖(「ω官能基化」、例えば、図76D中のoscr#9及びoscr#10)の末端炭素にアスカリロースが結合しているアスカロシドを産生する)を除いて、側鎖の最後から二番目の炭素(「ω-1官能基化」)においてアスカリロース糖を有している。C.エレガンスにおいて集団形成シグナルとして作用することが最近示された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))インドールアスカロシド、例えばicas#9(図76A)は、カエノラブディティス属種中にしか発見されていない。しかし、C.エレガンス中では、インドールアスカロシド濃度は、単純なアスカロシド(図76A中の「ascr」及び「oscr」)の濃度よりもはるかに低いものであった。本明細書において検討したほとんどの種について、利用可能な代謝物試料のサイズが、カエノラブディティス属種について利用可能なものよりもはるかに小さいので、インドールアスカロシドは、その量がHPLC-MSによる検出には少なすぎるため、一部の線虫において検出することができなかった。
アスカロシドのプロファイルは一般に、種間で変動がある(図77)。しかし、一部の場合、非常に異なる生態学からの種が、同じアスカロシドを産生した。例えば、ascr#9は、コンポスト生息性のパナグレルルス・レディビブス(Panagrellus redivivus)、ラブディティス属種及びカエノラブディティス属種、土壌生息性のオスキエウス・ティプラエ(Oschieus tipulae)、昆虫関連性のプリスティオンクス・パキフィクス(Pristionchus pacificus)、及び昆虫感染性のヘテロラブディティス・バクテリオフォラ、ステイネルネマ・カルポカプサエ、ステイネルネマ・リオブラベ、及びステイネルネマ・グラセリによって産生される。
17種の分析済み線虫種の3種、すなわちキタネグサレセンチュウ、ブタ回虫(Ascaris suum)、及びロマノメルミス種では、公知のアスカロシドは検出されなかった。野生型及びC.エレガンスの突然変異株から同定されたものと類似のアスカロシドがスクリーニングの対象であったことを考慮すると、これらの種はアスカロシドを非常に少量しか産生しないか、又は使用した方法では検出することができない構造上の予期されない特徴を有するアスカロシドを産生している可能性がある。以前の研究により、ブタ回虫中において脂質様の長鎖アスカロシドの存在が報告されている。しかし、それらは、卵胞細胞及び卵に限定されていた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bartleyら、J. Nat. Prod. 59巻(10号)、921〜26頁(1996年)、Tarr、Comp. Biochem. Physiol. 46B、167〜76頁(1973年))。脂質性質が高いことを考慮すると、これらの化合物は水性媒体には溶解性に乏しく、これにより、本明細書の上記の分析において存在しなかったことが説明され、それ故に、フェロモンとして働かない可能性がある。ロマノメルミス属種などのシヘンチュウ(Mermithid)種は、脂質を構成する栄養を一生分蓄えるという特有の能力を有する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Platzer、J. Am. Mosquito Contr. Association Bulletin 7巻、58〜64頁(2007年)、Ittycheriahら、Nematologica 23巻、165〜71頁(1977年))。ロマノメルミス属種が試験された最も古い祖先の種であることを考慮すると、異なる脂肪酸代謝機構を有しているか、又は恐らく、アスカロシド合成が依然として進化をとげていない可能性がある。
[実施例83]-アスカロシドは個々の線虫行動を媒介する
一連の合成アスカロシドに対する線虫の行動応答を、いくつかの異なる行動アッセイを使用して試験した。個々のアスカロシド(図79)により条件を整えた領域を好むか又は忌避するかを検知するため、自動ソフトウェアを使用する保持アッセイ(図78)を使用した。HPLC/MS検討では、細菌叢を横切って適切な移動を必要とするこのバイオアッセイとの適合性を見るために、線虫種をスクリーニングした。寄生性線虫は、それらの宿主環境に類似の基質を必要とするので、ほとんど除外した。ほとんどの種では、雄は、雌又は雌雄同体よりもかなりよく動くので、P.レディビブスの雌(これは、よく動くので含めた)を除き、本検討はさらに雄に限定した。オスケイウス・ティプラエ(Oscheius tipulae)は、雄が、この雌雄同体種中でわずかの機会しか存在しないことから除外した。代わりに、非常に関連した雄-雌種である、オスケイウス・ドリクロイデス(Oscheius dolichuroides)を含めた。以前の研究において、ascr#2及びascr#3の(1μM濃度から)約1pmolの試料が、C.エレガンスの誘引にとって最も活性な濃度であることが分かっていた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年))。したがって、利用可能な合成アスカロシドは、1nM、1μM、及び1mMの濃度で試験した。
試験した線虫種のいくつかは、多くの同じアスカロシド、特にascr#1、ascr#3、ascr#7、ascr#8、ascr#9及びascr#10により条件の整えられた領域を好んだ(図78)。しかし、活性の閾値は、種間で様々であった。例えば、C.エレガンスの雄は、1μMのascr#10で条件を整えた領域を好んだ一方、S.グラセリ、及びP.レディビブスの雄だけが、1mMのascr#10で条件を整えた領域を好んだ。さらに、いくつかの線虫種は、自分の種によって産生されないアスカロシドに応答しており、異種間の情報伝達の可能性が示唆される。試験した種の1種である、O.ドリクロイデスは、アッセイしたアスカロシドのいずれにも応答しなかった。この種は他のアスカロシドに応答するか、又はアスカロシドへの応答を誘発するには、特定の環境条件が必要である可能性がある。
さらに、P.レディビブスの雄及び雌は、C.エレガンスにおいて以前に記載されている現象、異なる一連のアスカロシドに応答することが観察された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年))。これらの性特異的な応答は、アスカロシドが種間と種内の両方で、異なる役割を果たし得ることを実証している。例えば、icas#9は、C.エレガンスでは、集団形成性刺激物質として作用した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Publ. Lib. Sci. Biol. 10巻(1号)、e1001237(2012年))。しかし、icas#9は、P.レディビブスの雌を忌避し、且つP.レディビブスの雄からの応答を引き起こさなかった。icas#9は、P.レディビブスにより産生されなかったので、それは異種間のキューとして作用し得る。
C.エレガンス雌雄同体がC.エレガンスの雄をある距離から誘引する能力も試験した。以前の研究は、C.エレガンスの雌雄同体は、単一の雌雄同体により条件を整えられた点源を含む5cmプレート上、又は雌雄同体をインキュベートした上澄み液を保持した寒天搭載スライド上の雄を誘引しなかったことを報告している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bargmannら、Cell、74巻、515〜27頁(1993年))。本明細書に記載の実験において、アッセイ領域の直径と雌雄同体数の両方を拡張し、10cmプレートを使用し、1〜300匹の雌雄同体を試験した(図80A)。結果は、C.エレガンスの雌雄同体が、ある距離(図80B)からの雄を確かに誘引したことを実証している。C.エレガンスの雄の、50匹のC.エレガンスの雌雄同体に対して化学走させる能力を、他の種からの等量の雌又は雌雄同体のそれと比較した。C.エレガンスの雄は、7種の異なるアスカロシド(図78)に誘引されることが分かったので、これらのアスカロシドを産生する種はC.エレガンスの雄を誘引する一方、これらのアスカロシドのわずか又は全く産生しないものは、C.エレガンスの雄を誘引しないと予想した。本明細書における結果は、C.エレガンス雄は、P.レディビブスの雌を部分的に誘引することを実証し(図80A〜C)、この種は、7種の公知のC.エレガンスの雄の誘引物質のうちの3種を産生することを示している(図77)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年)、Pungaliyaら、PNAS 19巻、7708〜13頁(2009年))。C.エレガンスの雄は、S.カルポカプサエ、P.パキフィクス、P.ストロンギロイデス(これらは、公知のC.エレガンス雄誘引物質を、それぞれ2種、1種産生する、及び全く産生しない)から、雌又は雌雄同体に対する広範囲の誘引は示さないことも見いだした。これらの知見は、異なる線虫種間のアスカロシド媒介性相互作用の可能性のさらなる証拠を提示する。以前に記載されたC.エレガンスの交尾相手を見つける3種のフェロモン(ascr#2、ascr#3、及びascr#8)の個々の役割(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature
454巻、1115〜18頁、(2008年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 7巻、420〜22頁(2007年))について、ある距離から雄の誘引を誘発する試験も行った。結果は、ascr#2及びascr#3が、それぞれ500アトモル及び5フェントモルという少量で、C.エレガンスの雄の誘引を誘発した一方、ascr#8はこのアッセイにおいて活性を示さないことを示している。これらの結果により、ascr#2及びascr#3は、ある距離のC.エレガンスの雄を誘引するよう働く一方、ascr#8は、点源に到着時に、近辺内の雄を留まらせる働きをすることが示唆される。
C.エレガンスの雄と同種の雌雄同体の間、及び異なる線虫種の雌/雌雄同体の間の交尾も検討した。雌雄同体/雌で交尾しようとする雄の百分率を数値化する、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Peden & Barr、Curr. Biol. 15巻、394〜404頁(2005年)において記載されている交尾アッセイを適用した(図81)。C.エレガンスが離れた関連線虫種と交尾するかどうかを試験する検討を行った。これらの結果により、C.エレガンスが、P.レディビブス、S.カルポカプサエ、P.パキフィクス又はP.ストロングリオイデス(P. stronglyoides)と、10秒間交尾しようとしなかったことが示される(図81)。さらに、アスカロシドのブレンドの添加により、これらの線虫種のいずれもが交尾を誘発しなかった。以前の研究により、C.エレガンスの雄の交尾行動は、機械感覚性又は局所化学的キューによる雌雄同体認識によって主に導かれることが示された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Liuら、Neuron 14巻、79〜89頁(1995年))。本明細書におけるこの結果は、アスカロシドの性フェロモンは、C.エレガンスの仲間場所を助力するよう働くが、身体的な交尾には影響しないことを示唆している。
実施例71〜83の考察
異なる線虫種により広範囲のアスカロシドが産生されること及び認識されるということを考慮すると、実施例71〜83の知見は、アスカロシドは、幅広い線虫語彙を含むことを示している。これらの知見は、細菌のクオラムセンシングを示唆するものであり、グラム陰性菌の多くの種により、アシルホモセリンラクトン(AHL)の産生と感知の両方がなされている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Millerら、Annu. Rev. Microbiol. 55巻、165〜99頁(2001年))(図82)。様々なAHLは、構造上非常に類似しているが、N-アシル鎖では、種特異的な変化形を有する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Millerら、Annu. Rev. Microbiol. 55巻、165〜99頁(2001年))。アスカロシドは、非常に似た方法で組織化される。すなわち、それらは同一のアスカリロース糖環から構成されるが、結合している脂肪酸側鎖には変化形を有する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dickschat、Nat. Prod. Rep. 27巻、343〜69頁(2010年))(図82)。本明細書における結果は、線虫がアスカロシドの同じレパートリーからの組合せを分泌し、それらの周辺環境に特定の化学的シグネチャーをもたらすことを示している。
アスカロシドとAHLの両方の構造的組織化の共有、及びそれらが広範囲に到達する性質は、生化学情報伝達ネットワークの統語論に対する新しい洞察をもたらす。多くの細菌の行動が、生物発光、バイオフィルム形成、病原性因子発現、抗生物質産生、及び運動性(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Boyer & Wisnieski-Dye、FEMS Microbiol. Ecol. 1巻、1〜19頁(2009年))などのクオラムセンシングによって媒介される。同様に、交尾相手探し、忌避、集団形成、嗅覚可塑性、及び休眠生活段階への移行などの多くのC.エレガンスの行動が、アスカロシドによって媒介される(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁、(2008年)、Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 7巻、420〜22頁(2007年)、Pungaliyaら、PNAS 19巻、7708〜13頁(2009年)、Niblackら、Annu. Rev. Phytopathol. 44巻、283〜303頁(2006年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171〜75頁(2009年)、Yamadaら、Science 329巻、1647〜50頁(2010年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 3巻、420〜22頁(2007年)、Golden & Riddle、Science 218巻、578〜80頁(1982年))。
さらに、C.エレガンスのアスカロシドのプロファイルは、成長上及び環境的な摂動に応答して変化する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Kaplanら、Pub. Lib. Sci. ONE 6巻(3号): e17804(2011年))。線虫及び線虫行動の広い多様性を考慮すると、アスカロシドのモジュール性質は、個体又は集団の必要性の変化を伝達する単一の機構を使用するための適切な戦略のようである。細菌の情報伝達を妨害する新しいクラスの抗菌薬を開発するために、細菌のAHLに構造上類似している分子を合成することができる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Schauderら、Genes Dev. 15巻、1468〜80頁(2001年))。線虫における類似の研究により、寄生性宿主モデルにおける、線虫の生殖及び生存を妨害する合成アスカロシドブレンドの設計が可能になる。
線虫は、現在、全世界の農業に年間約1000億ドルの損失の原因になっており(全体が参照により本明細書に組み込まれている、JOSEPH A. VEECH: VISTAS ON NEMATOLOGY(Society of Nematologists、Inc. 社、Hyatsville、MD、1987年))、また全世界で30億のヒトに感染しているので(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Blumenthal & Davis、Nat. Genet. 36巻、1246〜47頁(2004年))、寄生を防除する必要性が依然として大いに存在している。昆虫有害生物の管理用の種特異的フェロモンを使用するという概念により、有害生物管理に>100種のフェロモンを利用する、50年間以上にわたる昆虫フェロモンの研究が推進されてきた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Witzgallら、J. Chem. Ecol. 36巻、80〜100頁(2010年))。しかし、フェロモン媒介性妨害は、ダイズ寄生性線虫であるダイズシストセンチュウ(Heterodera glycines)の防除に対して、たった1種の線虫フェロモンであるバニリン酸が実際に応用されたに過ぎなかった(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Meyerら、J. Nematol. 29巻、282〜88頁(1997年))。これは、ダイズシストセンチュウ及びC.エレガンスにおいて発見されたものは別にすると、線虫フェロモンの同定の欠如が最も可能性の高い一因である(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jaffeら、J. Chem. Ecol. 15巻、2031〜43頁(1989年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年)、Butcherら、Nat. Chem. Biol. 7巻、420〜22頁(2007年)、Pungaliyaら、PNAS 19巻、7708〜13頁(2009年))。この幅広く到達する、線虫フェロモンのモジュールライブラリーの発見は、この必要な努力に対する有用性を疑いなく証明するが、統語論の解釈により、生化学的シグネチャーの進化に新しい洞察をもたらし得る。
[実施例84]-ネコブセンチュウにおけるアスカロシド産生
アスカロシドascr#10、ascr#16、ascr#18、ascr#20及びascr#22が、高分解能質量分析法を使用して、ある種のメロイドギネ属の植物寄生性線虫(図83)中で検出され、同定された(図84〜88)。これらのアスカロシド及び/又はその構造上の誘導体(単独、共同、及び/又はascr#9若しくは他のアスカロシドとの共同)は、メロイドギネ属種において分散剤及び忌避剤として作用することが予期される(ascr#18及びascr#22、並びに/又はそれらの構造上の誘導体(単独、共同、及び/又はascr#9若しくは他のアスカロシドとの共同)は、ヘテロラブディティス属種において、分散剤及び忌避剤として作用することがやはり予期される)。
[実施例85]- P.パキフィクス代謝物の命名
実施例3に記載されている通り、新規に同定された化合物はすべて、4つの文字SMIDにより名前が付けられる。新しい4文字のSMID(pasc(フェニルエタノールアミドアスカロシド(phenylethanolamide ascaroside))、ubas(3-ウレイドイソブチレートアスカロシド(3-ureido isobutyrate ascaroside))、dasc(アスカロシド二量体(dimeric ascaroside))、part(パラトシド(paratoside))、及びnpar(ヌクレオシドをベースとするパラトシド(nucleoside-based paratoside))がここでは導入される。
[実施例86]-分析機器
NMRスペクトルは、Varian INOVA-600(1Hは600 MHz、13Cは151 MHz)、INOVA-500(1Hは500 MHz、13Cは125MHz)、及びINOVA-400(1Hは400MHz、13Cは100MHz)機器で記録した。HPLC-MS及びフラッシュクロマトグラフィーは、実施例1に記載した通りに実施した。HPLC分画は、Teledyne ISCO Foxy 200フラクションコレクターに接続したAgilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を装備したAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。高分解能質量スペクトルは、Xevo G2 QTOF質量分析計を使用して取得した。
[実施例87]-P.パキフィクス株及び培養条件
プリスティオンクス・パキフィクス(Pristionchus pacificus)株のRS2333(エキソメタボローム調製物)、RS5134(耐久型幼虫形成アッセイ)、及びRSB020(口腔形態の二形性アッセイ)を使用した。蠕虫のプレート培養物及び液体培養物を、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ogawaら、Curr.Biol.19巻、67〜71頁(2009年)に記載されている通り調製した。
[実施例88]-エキソメタボローム抽出物の調製及び予備分画
P.パキフィクス株RS2333の培養上澄み液3Lをろ過して、10,000rpmで10分間遠心分離にかけた。培養上澄み液は、C18カラム(Chromabond、Macherey Nagel)に適用し、その後にH2O中の50%MeOHにより溶出させた。この工程により、脂溶性の高い成分(例えば、トリグリセリド、長鎖脂肪酸)は除去されるが、生物活性は低下しなかった。溶出液を蒸発させて、クロロホルムとメタノール(2:1)の混合物に再懸濁した。クロロホルム/メタノール(2:1)により平衡にしたSiOHカラム(Chromabond、Macherey Nagel)に、この試料を適用した。クロロホルム/メタノール(2:1、フラクションI)、クロロホルム/メタノール(1:5、フラクションII)、及びクロロホルム/メタノール/水(6:10:1、フラクションIII)により、このカラムを洗浄した。フラクションIIは、後の耐久型幼虫形成アッセイにおいて最も高い活性を示し、予備的な2D-NMR分光法に基づく分析に使用した。最初の2D NMR分光分析において検出された化合物を多量に得るために、追加の培養上澄み液1Lのバッチをいくつか同様に処理した。
未分画物質をさらに高分解能HPLC-MS分析するために、培養上澄み液100ml試料を凍結乾燥して微粉末にし、続いて、これをエタノールと水の95:5混合物50mlにより、16時間抽出した。この抽出物を真空で濃縮してろ過して、さらにプロセッシングすることなくHPLC-MSに使用した。細菌の対照実験用に、一晩成長させた大腸菌OP50細菌培養物1Lを上に記載した通り凍結乾燥して処置した。
[実施例89]-メタボロームの2D NMRの分光分析
非勾配位相巡回dqfCOSYスペクトルは、以下のパラメーターを使用して得た。捕捉時間0.8s、コンプレックスインクリメント(complex increment)400〜600、インクリメントあたり8〜32スキャンである。dqfCOSYスペクトルは、8k×4kにゼロで埋め、フーリエ変換前の両次元に余弦釣鐘型窓関数を適用した。勾配及び非勾配HSQCAD及びHMBCスペクトルは、捕捉時間0.25s、及びコンプレックスインクリメント256〜500を使用して取得した。NMRスペクトルは、Varian VNMR、MestreLabs' MestReC、及びMnovaソフトウェアパッケージを使用して処理した。
[実施例90-HPLCプロトコル及びLC-MS/MS分析
HPLC-MSは、10:1のスプリットを使用するQuattro II分析計(マイクロ質量計/Waters社)に接続したAgilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を装備したAgilent 1100 Series HPLCを使用して行った。0.1%酢酸-アセトニトリル溶媒のグラジエントを使用し、3.6mL/分の流速で、5%アセトニトリル含量を5分間から始めて、40分間かけて100%に増加した。エキソメタボロームフラクションは、4.0kVのキャピラリー電圧、並びに-40V及び+20Vのコーン電圧をそれぞれ使用し、ネガティブイオン及びポジティブイオンモードでHPLC-ESI-MSにより分析した。m/z=73.0(ネガティブモード)の前駆体イオンに関するLC-MS/MSのスクリーニングは、2.1mtorr及び40eVの衝突ガスとしてアルゴンを使用して行った。このHPLCプロトコルは、合成試料の精製及びP.パキフィクスのエキソメタボロームの少量成分の濃度向上にも使用した。
[実施例91]-化学合成の一般法
薄層クロマトグラフィー(TLC)は、特に明記しない限り、J.T.Baker Silica Gel IB2-Fを使用し、反応の進行をモニターするために使用した。特に明記しない限り、試薬はSigma-Aldrich社から購入し、さらなる精製をすることなく使用した。N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)及びジクロロメタン(DCM)は、使用前にモレキュラーシーブ4Åで乾燥した。テトラヒドロフラン(THF)及び1,4-ジオキサンは、使用前に蒸留した。旋光度は、Perkin Elmer 241旋光計で測定した。旋光度を測定するために使用した溶媒(メタノール)は、使用前にさらに精製することはしなかった。
[実施例92]-耐久型幼虫形成アッセイ
耐久型幼虫形成アッセイは、加熱又はカナマイシンにより死滅させた大腸菌OP50を使用し、全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ogawaら、Curr.Biol.19巻、67〜71頁(2009年)に記載されている通り実施した。合成化合物は、エタノール(0.5mM、ストック溶液)に溶解し、水と合わせて100μl溶液を作製し、続いて、ペプトン不含の3mL NGM寒天に加えた(3、1、0.3、0.1μMの最終濃度)。
[実施例93]-口腔形態の二形性アッセイ
口腔形態の二形性アッセイは、P.パキフィクス株RSB020を使用して行った。エタノール(0.5mM)中に溶解した合成化合物を水により希釈し100μl溶液を作製し、続いて、3mL NGM寒天に加えた(最終濃度1μM)。アッセイプレートに、LB培地中の50μl OP50培養物により播種し、20℃で一晩インキュベートして、細菌を成長させた。各複製物には、2種の母親の子孫が含まれ、これらは一定幼齢の成体雌雄同体(4〜6個の卵を有している)として採取し、またこれらはすべて同一のP.パキフィクス培養プレート由来のものとした。アッセイプレート上に母親を配置した後、幼齢体全部がスクリーニング時に成体になるよう、20℃で6日間、維持した。プレート1枚あたり50匹の雌雄同体の子孫の無作為サンプルをスクリーニングした。動物はすべて、微分干渉(DIC)顕微鏡法によりZeiss Axiskopでスクリーニングした。幅広型個体と狭小型(stenostomatous)個体をそれぞれ区別するため、以下の個別の特徴を使用した。(1)鉤爪形状対フリント形状(すなわち、背部から腹部方向に対称である)背方突起、(2)亜腹側口の有り対無し(3)強力対貧弱な節片化気孔壁である。中間の口腔形態は観察されなかった。実験は各処置について三連で行った。
いくつかの濃度(1、0.3、0.1、0.03、0.01μMの最終濃度)の化合物に対する応答アッセイでは、次の修正を加え、上に記載される通り実験を行った。より低濃度に対する応答の感度限界を大きくするため、化合物あたりの濃度あたり5つの複製物の各々において、60匹の無作為スクリーニングを行った個体をアッセイした。濃度曲線実験はすべて、同一の2種の集団源から無作為に採取した母親を使用し、並行して行った。これらの実験用の個々の母親を多量に調製するため、集団源を処女雌雄同体から定着させて雄の存在を抑制し、少なくとも1つの世代について十分な餌食及び周囲条件に条件を整えた後、母親をこのアッセイ用に採取した。
[実施例94]-統計的解析
図122A〜Dにおいて、エラーバーは95%の信頼区間を表す。実験はすべて、各処置について三連(又は、口腔形態の濃度曲線アッセイには五連)で行った。図122A〜Bにおける各化学処置と対照(EtOH)処置の間の有意差(*P<0.05及び**P<0.001)は、プログラムRにおけるフィッシャー(Fisher's)の正確確率検定を使用して決定した。
[実施例95]-アスカロシドpasc#9の合成
アスカロシドpasc#9は、以下のスキーム13で示される通り調製した。
Figure 2014522882
11を調製するため、ascr#9(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、PLoS Biol.10巻、e1001237(2012年))(30mg、121μmol)のメタノールとトルエンの3:2(v/v)混合物(2mL)中の溶液を、ジエチルエーテル中、2.0M(トリメチルシリル)ジアゾメタン溶液(120μl)により処理した。30分間撹拌後に、過剰の試薬を酢酸の添加により分解(destroyed)し、この溶液を真空で濃縮した。この粗製残留物をさらに精製することなく、次の工程に使用した。この残留物13を乾燥DMF(1.5mL)に溶解し、0℃に冷却し、イミダゾール(91mg、1.34mmol)で処理して5分間撹拌した。この混合物をtert-ブチルクロロジメチルシラン(182mg、1.21mmol)で処理し、一晩撹拌した。反応をブライン(5mL)によりクエンチしてジエチルエーテルにより抽出し、Na2SO4で脱水して減圧下で濃縮した。ヘキサン中の0〜25%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、14(55mg、112μmol、93%、2工程)が得られた。LiOH(11mg、457μmol)及び水(0.4mL)の1,4-ジオキサン(2mL)混合物に、14(55mg、112μmol)の乾燥テトラヒドロフラン(1mL)溶液を加えた。67℃で3時間撹拌した後、この溶液を氷酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。ヘキサン中、0.1%酢酸を含む0〜30%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス((tert-ブチルジメチルシリル)オキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(11)(50mg、105μmol、94%)が得られた。1H NMR (600 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 4.55 (s, 1H), 3.87-3.80 (m, 1H), 3.78-3.75 (m, 1H), 3.68-3.61 (m, 1H), 3.58-3.52 (m, 1H), 2.56-2.42 (m, 2H), 1.89-1.71 (m, 4H), 1.18 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.13 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.91-0.87 (m, 18H), 0.07-0.03 (m, 12H).図89を参照されたい。
(R)-12を調製するため、(R)(-)-2-アミノ-1-フェニルエタノール((R)-15)(281mg、2.05mmol)及び無水コハク酸(220mg、2.2mmol)の乾燥ジクロロメタン(7mL)溶液を一晩撹拌した。次に、反応物を減圧下で濃縮した。0.25%酢酸を含むジクロロメタン中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、白色粉末として(R)-16(470mg、1.98μmol、97%)が得られた。(R)-16(288mg、1.22mmol)のメタノールとトルエンの3:2(v/v)混合物(10mL)中の溶液を、ジエチルエーテル中、2.0M(トリメチルシリル)ジアゾメタン溶液(900μl)により処理した。30分間撹拌後、過剰の試薬を酢酸の添加により分解し、この溶液を真空で濃縮した。粗製(R)-メチル4-((2-ヒドロキシ-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタノエート((R)-12)が得られ、さらに精製することなく次の工程に使用した。(300mg、1.20mmol、98%)。1H NMR (400 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 7.41-7.20 (m, 5H), 4.76 (dd, J = 7.7 Hz, J = 3.8 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.50 (ddd, J = 13.6 Hz, J = 6.4 Hz, J = 4.0 Hz, 1H), 3.26 (ddd, J = 13.6 Hz, J = 8.0 Hz, J = 5.2 Hz, 1H), 2.60-2.54 (m, 2H), 2.52-2.46 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 173.7, 172.7, 144.3, 128.9, 127.9, 126.8, 73.6, 51.7, 48.5, 31.0, 29.7.図90A〜Bを参照されたい。
18を調製するため、11(17mg、36μmol)の乾燥ジクロロメタン3mL溶液を4-ジメチルアミノピリジン(1mg、8.2μmol)及びEDC塩酸塩(11mg、57μmol)により処理した。30分間撹拌した後、乾燥ジクロロメタン1mL中の(R)-12(18mg、71μmol)をこの混合物に加えた。2時間撹拌した後、この溶液を真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜70%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして17(17mg、24μmol、67%)が得られた。17(17mg、24μmol)のアセトニトリル(750μL)溶液を0℃に冷却し、撹拌しながら、40%HFを1滴で処理した。反応物を室温まで温め、1.5時間撹拌した。反応物を0℃に再冷却し、飽和NaHCO3水溶液(4滴)によりクエンチし、直ちに氷酢酸により酸性にした。反応物を真空で濃縮し、ジクロロメタン中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(R)-(R)-2-(4-メトキシ-4-オキソブタンアミド)-1-フェニルエチル4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(18)(6.6mg、13.7μmol、57%)が得られた。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 7.41-7.27 (m, 5H), 5.84 (dd, J = 8.4 Hz, J = 4.4 Hz, 1H), 4.64 (s, 1H), 3.84-3.76 (m, 1H), 3.73-3.68 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.61-3.45 (m, 4H), 2.6-2.44 (m, 6H), 1.98-1.91 (m, 1H), 1.88-1.71 (m, 3H), 1.20 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.1 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 174.7, 174.6, 174.3, 139.7, 129.6, 129.3, 127.5, 97.4, 75.7, 71.6, 71.4, 69.9, 68.3, 52.2, 45.4, 36.0, 33.3, 31.6, 31.3, 30.1, 19.1, 18.1.図91A〜Bを参照されたい。
pasc#9を調製するため、18(6.6mg、14μmol)の乾燥テトラヒドロフラン(200μl)溶液を、LiOH(0.3mg、12μmol)及び水(80μl)の1,4-ジオキサン(400μl)混合物により処理した。60℃で5分間撹拌した後、この溶液を氷酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。粗製反応混合物のHPLC精製(方法を参照されたい)により、無色オイルとして4-(((R)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタン酸(pasc#9)(1.8mg、4μmol、29%)が得られた。
Figure 2014522882
=-110.0(c. 0.18、メタノール)。
pasc#9に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBCのNMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表12に示している。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD3OD)=49.00ppmを参照した。図92A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例96]-4-(((S)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタン酸の合成
実施例95に記載したものと類似の反応工程に従ったが、以下のスキーム14に示した通り(S)(+)-2-アミノ-1-フェニルエタノール(S)-15から始めて、pasc#9の非天然異性体である4-(((S)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-フェニルエチル)アミノ)-4-オキソブタン酸(19)を調製した。1H NMR (600 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 7.40-7.34 (m, 4H), 7.32-7.28 (m, 1H), 5.86 (dd, J = 8.5 Hz, J = 4.3 Hz, 1H), 4.63 (s, 1H), 3.84-3.78 (m, 1H), 3.67-3.64 (m, 1H), 3.60-3.53 (m, 2H), 3.52-3.47 (m, 2H), 2.62-2.43 (m, 6H), 1.95-1.89 (m, 1H), 1.88-1.77 (m, 2H), 1.77-1.71 (m, 1H), 1.16 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.1 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 176.1, 174.6, 174.1, 139.4, 129.4, 129.0, 127.3, 97.0, 75.4, 71.3, 71.1, 69.6, 68.0, 45.3, 35.6, 33.0, 31.29, 31.25, 30.2, 18.8, 17.9.図93A〜Cを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例97]-アスカロシドpart#9の合成
アスカロシドpart#9は、以下のスキーム15で示される通り調製した。
Figure 2014522882
22を調製するため、LiOH(8.9mg、371μmol)及び水(0.2mL)の1,4-ジオキサン(1ml)混合物に、3(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、PLoS Biol.10巻、e1001237(2012年))(181.5、413μmol)の乾燥テトラヒドロフラン(0.5mL)溶液を加えた。67℃で40分間撹拌した後、この溶液を数滴の氷酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、20(48.5mg、145μmol、35%)が得られた。20(48.5mg、145μmol)の乾燥ジクロロメタン(2mL)溶液を、デス-マーチン(Dess-Martin)ペルヨージナン(88mg、208μmol)により処理した。5時間後、この溶液をジクロロメタン10mLにより希釈し、H2O中の5%Na2S2O3溶液により3回洗浄した。有機層をNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜30%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、21(26.8mg、81μmol、56%)が得られた。21(24.5mg、74μmol)のジクロロメタン:メタノール(0.7mL)1:1溶液を、NaBH4(12mg、317μmol)により処理した。10分後、この溶液を氷酢酸により酸性にし、ジクロロメタンで希釈して真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(2S,3R,5S,6R)-6-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-5-ヒドロキシ-2-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イルベンゾエート(22)(18.2mg、54μmol、74%)が得られた。1H NMR (600 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 8.04-8.01 (m, 2H), 7.67-7.63 (m, 1H), 7.55-7.50 (m, 2H), 5.89 (ddt, J = 17.1 Hz, J = 10.3 Hz, J = 6.6 Hz, 1H), 5.09-5.04 (m, 1H), 4.99-4.95 (m, 1H), 4.84 (d, J = 3.7, 1H), 4.69 (ddd, J = 11.4 Hz, J = 9.8 Hz, J = 4.6 Hz, 1H), 4.04-3.98 (m, 1H), 3.89-3.82 (m, 1H), 3.78-3.71 (m, 1H), 2.29-2.16 (m, 3H), 1.93-1.86 (m, 1H), 1.79-1.72 (m, 1H), 1.65-1.58 (m, 1H), 1.19 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.3 Hz, 3H).13C NMR (151 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 165.9, 139.6, 134.1, 131.1, 130.2, 129.5, 114.9, 96.4, 73.7, 72.9, 67.8, 66.8, 37.3, 34.3, 30.7, 19.5, 17.9.図94A〜Bを参照されたい。
24を調製するため、LiOH(13.5mg、563μmol)及び水(0.2mL)の1,4-ジオキサン(1mL)混合物に、22(18.2mg、54μmol)の乾燥テトラヒドロフラン(0.5mL)溶液を加えた。67℃で3時間撹拌した後、この溶液を氷酢酸により酸性にし、真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、23(8.5mg、37μmol、67%)が得られた。0℃に冷却した23(8.5mg、37μmol)のDMF(700μl)溶液を水素化ナトリウム(10mg、鉱物油中60%懸濁物、250μmol)により処理した。20分間撹拌後、臭化ベンジル(15μl)を加え、混合物を一晩撹拌した。過剰試薬は、メタノール(300μl)の添加により分解し、残留物を酢酸エチル(2mL)により希釈し、有機相を水(3×0.5mL)により洗浄してNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜25%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(2R,3S,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン(24)(13mg、32μmol、80%)が得られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 7.38-7.25 (m, 10H), 5.82 (ddt, J = 17.1 Hz, J = 10.4 Hz, J = 6.5 Hz, 1H), 5.06-4.99 (m, 1H), 4.98-4.93 (m, 1H), 4.89 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.46 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 3.86-3.74 (m, 2H), 3.51-3.43 (m, 1H), 3.07 (ddd, J = 11.1 Hz, J = 9.4 Hz, J = 4.3 Hz, 1H), 2.33-2.06 (m, 3H), 1.93-1.82 (m, 1H), 1.83-1.73 (m, 1H), 1.63-1.52 (m, 1H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 6.1 Hz, 3H). 計34 H. 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 138.6, 138.41, 138.38, 128.55 (2C), 127.92, 127.89, 127.85 (2C), 114.7, 93.2, 78.2, 74.1, 71.6, 70.90, 70.86, 67.6, 52.4, 36.5, 30.3, 19.7, 17.9.図95A〜Bを参照されたい。
part#9を調製するため、24(5.4mg、13μmol)のジクロロメタン:アセトニトリル:H2Oの1:1:1(v/v/v)混合物(300μL)中の溶液をまず、NaIO4(13mg、61μmol)、次に、RuCl3・H2O(145μg、0.7μmol)のH2O(50μL)溶液により処理した。1.75時間後、この混合物をH2O(1mL)で希釈し、ジクロロメタン(3×1mL)により抽出してNa2SO4で脱水し、減圧下で濃縮した。0.25%氷酢酸を含むジクロロメタン中の0〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして4(4.6mg、11μmol、81%)が得られた。Pd/C(11mg、10%、w/w)の、10%ギ酸を含むメタノール500μL溶液に、まず5分間アルゴン、続いて適度な流速のH2ガスを流した。この撹拌溶液に、4(4.1mg、9.3μmol)のメタノール500μL溶液を加えた。4.5時間後、反応物をシリカパッドでろ過し、真空で濃縮した。HPLC精製(実施例90を参照されたい)により、無色オイルとして(R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(part#9)(1.5mg、6.0μmol、65%)が得られた。
Figure 2014522882
=-128.6(c. 0.15、メタノール).
part#9に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表13に示している。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD3OD)=49.00ppmを参照した。図96A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例98]-D-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸((R)-30)の合成
part#9の非天然ジアステレオマー(R)-30を、以下のスキーム16に示した通り調製した。
Figure 2014522882
26を調製するため、25(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Zhao & Liu、J.Org.Chem.66巻、6810〜15頁(2001年))(137mg、845μmol)のDMF(2mL)溶液を0℃に冷却し、水素化ナトリウム(203mg、鉱物油中60%懸濁物、5.1mmol)により処理した。30分後、臭化ベンジル(630μl)を加え、混合物を一晩撹拌した。反応混合物を0℃に冷却後、過剰試薬をメタノール(3mL)の添加により分解し、残留物をジエチルエーテル(5mL)により希釈し、有機相を水(3×2mL)により洗浄してNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜25%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(2S,3R,5S,6R)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-メトキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン(26)(217mg、634μmol、75%)が得られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 7.41-7.27 (m, 10H), 4.68-4.56 (m, 4H), 4.46 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 3.75-3.66 (m, 1H), 3.53-3.45 (m, 1H), 3.43 (s, 3H), 3.12-3.03 (m, 1H), 2.36-2.29 (m, 1H), 1.92-1.81 (m, 1H), 1.26 (d, J = 6.4 Hz, 3H). 13C NMR (100 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 138.3, 138.2, 128.49, 128.46, 127.90, 127.86, 127.78, 127.75, 97.1, 77.9, 74.1, 71.1, 70.7, 67.0, 54.8, 30.0, 17.8.図97A〜Bを参照されたい。
(R)-29を調製するため、26(217mg、634μmol)の、3MのH2SO4(0.5mL)及び酢酸(2mL)の混合物中の溶液を100℃で2時間加熱した。冷却後、反応混合物を真空で乾燥し、ここに水性飽和NaHCO3(5mL)を加えて10分間撹拌し、ジクロロメタン(3×2mL)により抽出した。ヘキサン中の0〜30%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、27(177mg、539μmol、85%)が得られた。27(177mg、539μmol)の乾燥ジクロロメタン(4mL)溶液をトリクロロアセトニトリル(115μL、1.15mmol)及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(9μL、60.3μmol)により処理した。30分後、この溶液を真空で濃縮した。ヘキサン中の10〜20%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして28(110mg、233μmol、43%)が得られた。28(110mg、233μmol)の乾燥ジクロロメタン(2mL)溶液を0℃に冷却し、(R)-2-ヘキセノール(60μL、500μmol)及びトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル(5μL、28μmol)により処理した。0℃で3時間撹拌後、この反応物を飽和水性NaHCO3によりクエンチしてNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜20%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(3R,5S,6R)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-2-((R)-ヘキサ-5-エン-2-イルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン((R)-29)のα-アノマー(40.5mg、99μmol、43%)及びβ-アノマー(35mg、85μmol、37%)が得られた。(R)-29α-アノマーについて1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 7.38-7.26 (m, 10H), 5.82 (ddt, J = 17.0 Hz, 10.3 Hz, 6.6 Hz, 1H), 5.04-4.98 (m, 1H), 4.97-4.93 (m, 1H), 4.87 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 4.59 (s, 2H), 4.46 (d, J = 11.5 Hz, 1H), 3.86-3.78 (m, 1H), 3.78-3.72 (m, 1H), 3.49-3.43 (m, 1H), 3.80 (ddd, J = 11.1 Hz, 9.4 Hz, 4.4 Hz, 1H), 2.34-2.28 (m, 1H), 2.25-2.11 (m, 2H), 1.94-1.85 (m, 1H), 1.75-1.66 (m, 1H), 1.58-1.49 (m, 1H), 1.25 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.22 (d, J = 6.3 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 138.7, 138.39, 138.37, 128.54, 128.52, 127.91, 127.86, 127.84, 127.80, 114.6, 95.7, 78.2, 74.5, 74.4, 71.0, 70.9, 67.4, 35.9, 30.2, 29.7, 21.5, 17.9.図98A〜Bを参照されたい。
(R)-30を調製するため、(R)-29α-アノマー(20.3mg、49μmol)のジクロロメタン:アセトニトリル:H2O1:1:1(v/v/v)混合物(360μL)溶液をまず、NaIO4(43mg、203μmol)により、次に、RuCl3・H2O(547μg、2.6μmol)のH2O(80μL)溶液により処理した。2.75時間後、この混合物をH2O(1.2mL)により希釈し、ジクロロメタン(3×1mL)により抽出してNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。0.25%氷酢酸を含むジクロロメタン中の0〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(R)-2(16mg、37μmol、76%)が得られた。Pd/C(20mg、10%、w/w)の、10%ギ酸を含むメタノール500μL溶液に、まず5分間アルゴン、続いて適度な流速のH2ガスを流した。この撹拌溶液に、(R)-2(7.0mg、16.3μmol)のメタノール500μL溶液を加えた。1時間後、反応物をシリカパッドでろ過して真空で濃縮すると、無色オイルとして(R)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸((R)-30)(4.0mg、16.1μmol、98%)が得られた。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 4.70 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 3.81-3.72 (m, 1H), 3.63-3.54 (m, 2H), 3.16 (ddd, J = 11.4 Hz, 9.4 Hz, 4.6 Hz, 1H), 2.45 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.04-1.97 (m, 1H), 1.85-1.77 (m, 2H), 1.77-1.69 (m, 1H), 1.26 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 6.3 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 178.0, 99.6, 76.1, 71.9, 69.9, 69.0, 37.0, 33.1, 31.0, 21.8, 17.7.図99A〜Bを参照されたい。
[実施例99]-(S)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸((S)-30)の合成
実施例98に記載したものと類似の反応工程に従ったが、以下のスキーム17に示した通り(S)-2-ヘキセノールを使用し、part#9の鏡像異性体である(S)-30を調製した。(S)-30のNMR分光学的特徴付けは、part#9のそれと同一であった。
Figure 2014522882
[実施例100]-アスカロシドnpar#1の合成
アスカロシドnpar#1は、以下のスキーム18で示される通り調製した。
Figure 2014522882
32を調製するため、-40℃に冷却した5(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lucero & Woerpel、J.Org.Chem.71巻、2641〜47頁(2006年))(550mg、1.19mmol)の乾燥ジクロロメタン(1.5mL)溶液に、一定の速度で撹拌しながら臭化トリメチルシリル(3.2mL、24.2mmol)を滴下して加えた。次に、反応混合物を室温まで温め、45分間撹拌した。過剰試薬及び溶媒を真空で除去した。生成物((3R,4S,5R)-3,4,5-トリス(ベンジルオキシ)-2-ブロモテトラヒドロ-2H-ピラン(32))は水分に接触すると分解するので、さらに特徴付けることはせず、次の工程に直接使用した。
6を調製するため、31(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Chheda & Hong, J. Med. Chem. 14巻、748〜53頁(1971年))(500mg、1.12mmol)を真空で徹底的に乾燥し、32の乾燥トルエン12mL溶液に加えた。反応混合物を2.5時間還流した。トルエンを蒸発させて約3mLの体積まで減量し、石油エーテル3mLをそこに加えた。得られた茶色の懸濁液をろ過し、沈殿物を温クロロホルム(3×10mL)により洗浄した。ろ液及び洗浄液を合わせ、30%KI水溶液10mL、水10mLで洗浄し、Na2SO4で脱水して真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、淡黄色オイルとして33(160mg、262μmol、22%、2工程、α及びβアノマーの約2:3比の混合物)が得られた。33をL-トレオニンと反応させて、対応する2,3,5-トリ-O-アセチルリボフラノシド誘導体(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Chheda & Hong、J.Med.Chem.14巻、748〜53頁(1971年))に関して報告されている条件に従い後処理した。0.25%酢酸を含むジクロロメタン中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、黄色固体として34(117mg、172μmol、66%、α及びβ-アノマーの約2:3比の混合物)が得られた。トリフルオロメチルベンゼン300μl中の、34(72mg、106μmol)と15μlのトリエチルアミン(210μmol)との混合物を、2-ベンジルオキシ-1-メチルピリジニウムトリフレート(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Tummatornら、J.Org.Chem.72巻、8962〜64頁(2007年))(71mg、210μmol)で処理し、83℃で15時間撹拌した。生成物は、酢酸エチル2mL及び水2mLの間に分配し、有機相を水1mL、ブライン1mLで洗浄し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜20%イソプロパノールのグラジエントを使用する、シリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、黄色固体として(2S,3R)-ベンジル3-ヒドロキシ-2-(3-(9-((3R,4S,5R)-3,4,5-トリス(ベンジルオキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタノエート(6)(8.1mg、10μmol、10%、β-アノマー)が得られた。1H NMR (500 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 8.39 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.43-7.25 (m, 15H), 6.99-6.95 (m, 1H), 6.91-6.86 (m, 2H), 6.67-6.62 (m, 2H), 5.53 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 5.23 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 5.01 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.88 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 4.74 (s, 2H), 4.62-4.56 (m, 2H), 4.48 (dq, J = 6.4 Hz, 2.5 Hz, 1H), 4.26-4.15 (m, 3H), 3.94-3.88 (m, 1H), 3.84-3.79 (m, 1H), 3.53-3.46 (m, 1H), 1.31 (d, J = 6.5 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 172.2, 156.6, 152.1, 151.5, 151.4, 143.7, 139.9, 139.7, 138.4, 137.2, 129.65, 129.53, 129.46, 129.37, 129.24, 129.13, 129.08, 129.06, 128.90, 128.88, 128.74, 128.71, 121.5, 86.5, 85.6, 79.6, 78.8, 76.5, 75.7, 74.1, 68.5, 68.1, 67.7, 60.6, 20.7.図100A〜Bを参照されたい。
npar#1を調製するため、4(4mg、9μmol)の乾燥ジクロロメタン450μL溶液を4-ジメチルアミノピリジン(2.5mg、20μmol)及びEDC塩酸塩(4mg、21μmol)により処理した。15分間撹拌した後、6(7.3mg、9μmol)の乾燥ジクロロメタン300μLをこの混合物に加えた。12時間撹拌した後、この溶液を真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜15%イソプロパノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、35(5.5mg、4.6μmol、51%)が得られた。Pd/C(7mg、10%、w/w)の、10%ギ酸を含むメタノール500μL溶液に、まず5分間アルゴン、続いて適度な流速のH2ガスを流した。この撹拌溶液に、35(5.5mg、4.6μmol)のメタノール500μL溶液を加えた。4時間後、反応をシリカパッドでろ過し、真空で濃縮した。HPLC精製(実施例90を参照されたい)により、無色オイルとして(2S,3R)-3-(((R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-トリヒドロキシテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタン酸(npar#1)(1.1mg、1.7μmol、37%)が得られた。
Figure 2014522882
=-14.5(c. 0.11、メタノール)。
npar#1に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表14に示している。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD3OD)=49.00ppmを参照した。図101A〜Eを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例101]-(2S,3R)-3-(((S)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-トリヒドロキシテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)-9H-プリン-6-イル)ウレイド)ブタン酸(36)の合成
実施例100でnpar#1に関して記載したものと類似の反応工程に従ったが、以下のスキーム19に示した通り(S)-2を使用して36を調製した。1H NMR (600 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 8.65 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 5.59-5.54 (m, 1H), 5.55 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.71 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.67-4.63 (m, 1H), 4.14 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 4.04 (dd, J = 11.3 Hz, 5.5 Hz, 1H), 3.84-3.73 (m, 2H), 3.62-3.56 (m, 1H), 3.55-3.47 (m, 3H), 3.13 (ddd, J = 11.3 Hz, 9.3 Hz, 4.4 Hz, 1H), 2.60-2.47 (m, 2H), 2.04-1.98 (m, 1H), 1.94-1.84 (m, 2H), 1.75-1.68 (m, 1H), 1.37 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.15 (d, J = 6.3 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 173.7, 173.5, 153.5, 152.3, 151.8, 151.5, 143.3, 121.1, 96.0, 85.7, 78.6, 72.8, 72.4, 71.9, 71.6, 70.5, 70.1, 69.7, 68.4, 58.5, 36.8, 33.2, 31.5, 19.1, 17.61, 17.57.図102A〜Cを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例102]-アスカロシドdasc#1の合成
アスカロシドdasc#1は、以下のスキーム20で示される通り調製した。
Figure 2014522882
dasc#1を調製するため、ascr#1(15mg、54μmol)の乾燥DMF15mL溶液を、4-ジメチルアミノピリジン(13.5mg、110.7μmol)及びEDC塩酸塩(11mg、57.3μmol)の乾燥DMF7mL溶液に加えた。ESI-MSにより反応をモニターし、ポリマーピーク(m/z=791など)がかなりの量で観察された場合、氷酢酸数滴によりクエンチし、真空で濃縮した。0.25%を含有するジクロロメタン中の0〜30%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィー、及び粗製混合生成物のさらなるHPLC精製(実施例90を参照されたい)により、無色オイルとして(R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘプタノイル)オキシ)-3-ヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘプタン酸(dasc#1)(1.1mg、2.1μmol、7.8%)が得られた。
Figure 2014522882
=-115.0(c. 0.11、メタノール)。
dasc#1に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBC NMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表15に示している。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD3OD)=49.00ppmを参照した。図103A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例103]-アスカロシドubas#1の合成
アスカロシドubas#1は、以下のスキーム21で示される通り調製した。
Figure 2014522882
38を調製するため、トリフルオロメチルベンゼン300μl中の、ascr#9(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、PLoS Biol. 10巻、e1001237 (2012年))(24.0mg、97μmol)及びトリエチルアミン28μl (200μmol)の混合物を、2-ベンジルオキシ-1-メチルピリジニウムトリフレート(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Tummatornら、J.Org.Chem.72巻、8962〜64頁(2007年))70mg(200μmol)で処理し、83℃で18時間撹拌した。生成物は、酢酸エチル2mL及び水2mLの間に分配し、有機相を水1mL、飽和NaCl水溶液1mLで洗浄し、Na2SO4で脱水して、真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜10%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(R)-ベンジル4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(38)(22.6mg、66.8μmol、69%)が得られた。1H NMR (500 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 7.39-7.30 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 4.68 (s, 1H), 3.88-3.80 (m, 1H), 3.80-3.74 (m, 1H), 3.63-3.52 (m, 2H), 2.54-2.41 (m, 2H), 2.06-2.01 (m, 1H), 1.90-1.84 (m, 2H), 1.82-1.75 (m, 1H), 1.24 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.14 (d, J = 6.2 Hz, 3H).13C NMR (125 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 173.6, 136.0, 128.7, 128.39, 128.37, 95.8, 70.3, 70.1, 69.3, 68.1, 66.5, 35.3, 32.2, 30.8, 18.8, 17.8.図104A〜Bを参照されたい。
8を調製するため、38(22.6mg、66.8μmol)及び3-アジド-(2R)-メチルプロパン酸(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Rejら、J.Org.Chem.61巻、6289〜95頁(1996年))(37、8.6mg、66.8μmol)のジクロロメタン2mL溶液を、4-ジメチルアミノピリジン(16.3mg、133.6μmol)及びEDC塩酸塩(25.7mg、133.6μmol)により処理した。室温で12時間撹拌後、この反応物を5%水性酢酸(100μl)の添加によりクエンチし、Na2SO4で脱水して真空で濃縮した。ジクロロメタン中の0〜10%イソプロパノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、(R)-ベンジル4-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-アジド-2-メチルプロパノイル)オキシ)-3-ヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(8)(5.2mg、11.6μmol、17%)が得られた。1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d): δ (ppm) 7.40-7.31 (m, 5H), 5.15 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 5.11 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 4.86 (ddd, J = 10.9 Hz, 9.4 Hz, 4.6 Hz, 1H), 4.73-4.70 (m, 1H), 3.90-3.76 (m, 3H), 3.52 (dd, J = 12.2 Hz, 7.5 Hz, 1H), 3.38 (dd, J = 12.2 Hz, 5.6 Hz, 1H), 2.71-2.60 (m, 1H), 2.57-2.42 (m, 2H), 2.13-2.05 (m, 2H), 1.93-1.83 (m, 3H), 1.20 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 1.17 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.2 Hz, 3H).図105を参照されたい。
10を調製するため、oscr#9(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817〜24頁(2012年))(17.6mg、71μmol)のメタノールとトルエンの1:1混合物(v/v)(2mL)中の溶液を、ジエチルエーテル中の2.0M(トリメチルシリル)ジアゾメタン溶液(200μl)により処理した。30分間撹拌後、過剰の試薬を酢酸の添加により分解し、この溶液を真空で濃縮した。残留物をDMF(500μl)に溶解して0℃に冷却し、水素化ナトリウム(17mg、鉱物油中60%懸濁物、425μmol)により処理した。10分後、臭化ベンジル(51μl)を加え、混合物を一晩撹拌した。過剰試薬をメタノール(300μl)の添加により分解し、残留物を酢酸エチル(2mL)により希釈し、有機相を水(3×1mL)により洗浄してNa2SO4で脱水し、真空で濃縮した。ヘキサン中の0〜40%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして、39(14.4mg、33μmol、46%、2工程)が得られた。39(14.4mg、33μmol)のTHF(1mL)溶液を、ジオキサン(2mL)中の3.3Mの水性水酸化リチウム溶液(100μl、330μmol)により67℃で処理した。3時間後、酢酸を添加することにより反応をクエンチし、真空で濃縮した。ジクロロメタン中、0〜20%メタノールのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(10)(11.8mg、28μmol、85%)が得られた。1H NMR (500 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 7.32-7.38 (m, 8H), 7.30-7.25 (m, 2H), 4.69 (s, 1H), 4.62 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 4.58 (s, 2H), 4.48 (d, J = 11.8 Hz, 1H), 3.73-3.64 (m, 2H), 3.64-3.60 (m, 1H), 3.46-3.38 (m, 2H), 2.37-2.30 (m, 3H), 1.73-1.57 (m, 5H), 1.21 (d, J = 6.2 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 174.6, 140.0, 139.9, 129.1, 129.0, 128.6, 128.4, 128.19, 128.21, 97.7, 76.4, 76.0, 71.4, 71.2, 68.9, 67.3, 33.9, 30.2, 29.8, 22.6, 18.6.図106A〜Bを参照されたい。
40を調製するため、8(5.2mg、11.6μmol)及び10(6.4mg、14.9μmol)のジクロロメタン1mL溶液を4-ジメチルアミノピリジン(3.7mg、30μmol)及びEDC塩酸塩(5.8mg、30μmol)により処理した。室温で12時間撹拌後、この反応を5%水性酢酸(50μl)の添加によりクエンチし、Na2SO4で脱水して真空で濃縮した。ヘキサン中、0〜50%酢酸エチルのグラジエントを使用するシリカ上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、無色オイルとして(2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-アジド-2-メチルプロパノイル)オキシ)-2-(((R)-5-(ベンジルオキシ)-5-オキソペンタン-2-イル)オキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-3-イル5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ビス(ベンジルオキシ)-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノエート(40)(9.6mg、11.2μmol、97%)が得られた。1H NMR (500 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 7.40-7.25 (m, 15H), 5.15 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.84-4.78 (m, 2H), 4.66 (s, 1H), 4.74 (s, 1H), 4.58 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.57 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 3.87-3.80 (m, 2H), 3.75-3.67 (m, 2H), 3.60-3.56 (m, 1H), 3.51 (dd, J = 12.2 Hz, 7.6 Hz, 1H), 3.47-3.34 (m, 3H), 2.68-2.60 (m, 1H), 2.55-2.41 (m, 2H), 2.38 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.24-2.18 (m, 1H), 2.12-2.06 (m, 1H), 1.96-1.85 (m, 3H), 1.77-1.65 (m, 3H), 1.64-1.55 (m, 2H), 1.29 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 1.16 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.15 (d, J = 6.1 Hz, 3H). 13C NMR (125 MHz, アセトン-d6): δ (ppm) 173.4, 173.2, 172.9, 138.6, 138.5, 136.0, 128.7, 128.52, 128.51, 128.45, 128.38, 128.0, 127.79, 127.77, 97.2, 93.5, 75.6, 75.4, 71.4, 71.24, 71.22, 70.5, 70.4, 68.3, 67.0, 66.8, 66.5, 55.8, 40.1, 34.1, 32.1, 30.6, 29.9, 29.7, 29.5, 29.1, 21.8, 18.9, 18.3, 17.7, 14.9. ESI+ MS: m/z = 882.5 [M+Na+]又は898.5 [M+K+].図107A〜Bを参照されたい。
ubas#1を調製するため、Pd/C(5.4mg、10%、w/w)の、5%1M水性HClを含むメタノール0.7mL溶液に、5分間アルゴンガス、続いて適度な流速のH2ガスを5分間流した。この撹拌溶液に、40(4.3mg、5.0μmol)のメタノール1.3mL溶液をシリンジで加え、H2ガスをこの反応に連続して流した。この反応をESI-MSに直接注入することによりモニターした。20分後、反応をメタノールを加えながらシリカパッド上でろ過した。生成物を真空で濃縮し、40及び41(3.7mg)の粗製混合物を、さらに精製することなく、次の工程に使用した。水性HCl(200μL、50μmol)、水性KCNO(200μL、50μmol)及びH2O(100μL)の溶液を調製した。この水性HCl/KCNO溶液を40及び41(3.7mg)の粗製混合物に加え、75℃の油浴中に5分間置いた。さらに水性HCl溶液(50μL、12.5μmol)を反応に加え、これをさらに2.5分間撹拌した。pHが塩基性にならないのを確実とするために、反応混合物のpHを定期的に確認した。この反応をESI-MSに直接注入することによりモニターした。この混合物を真空で濃縮し、HPLC精製(実施例90を参照されたい)により、無色オイルとして、(R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-((5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタノイル)オキシ)-6-メチル-5-(((R)-2-メチル-3-ウレイドプロパノイル)オキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(ubas#1)(200μg、0.3μmol、7%、2工程)が得られた。
ubas#1に関する1H(600MHz)、13C(151MHz)、及びHMBCのNMR分光分析データは、メタノール-d4を使用して取得し、以下の表16に示している。化学シフトは、(CD2HOD)=3.31ppm及び(CD3OD)=49.00ppmを参照した。図108A〜Dを参照されたい。
Figure 2014522882
[実施例104]-ubas#2の濃度向上
粗製P.パキフィクスのエキソメタボローム抽出物のHPLCによる濃度向上により、(R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-(((R)-5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-ジヒドロキシ-6-メチルテトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ヘキサノイル)オキシ)-6-メチル-5-(((R)-2-メチル-3-ウレイドプロパノイル)オキシ)テトラヒドロ-2H-ピラン-2-イル)オキシ)ペンタン酸(ubas#2)の濃度を高めた試料を得た。1H NMR (600 MHz, メタノール-d4): δ (ppm) 4.80 (m, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.74 (m, 1H), 4.65 (s, 1H), 3.99 (m, 1H), 3.84 (m, 1H), 3.82 (m, 1H), 3.72 (m, 1H), 3.62 (m, 1H), 3.51 (m, 1H), 3.26 (m, 2H), 2.68 (m, 1H), 2.42 (m, 2H), 2.34 (m, 2H), 2.10 (m, 1H), 2.01 (m, 1H), 1.95 (m, 1H), 1.83 (m, 2H), 1.78 (m, 1H), 1.64-1.57 (m, 4H), 1.23 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.157 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.156 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.147 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.142 (d, J = 7.0 Hz, 3H).図109を参照されたい。
Figure 2014522882
実施例85〜104の考察
低分子は、広範囲にわたる必須の生物的機能として働く(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Meinwald、J.Nat.Prod.74巻、305〜09頁(2011年))。それらは、種間及び種内特異的な化学情報交換を促進し、化学的防御及び捕食に使用され、動物及び植物におけるホルモン及び二次的メッセンジャーとして機能し、生体高分子用のビルディングブロックとして働く。それらのゲノムにより、非常に様々な「二次的な」低分子生合成経路、例えば、ポリケチド及び非リボソームペプチドが明らかになっている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Walsh、Acc.Chem.Res.41巻、4〜10頁(2008年))ほとんどのグループの微生物及び植物とは対照的に、ほとんどの後生動物は生合成機構に専念して構造的に複雑な低分子を生じることは知られていない。それに対応して、動物源から単離された最も珍しい代謝物は、餌食誘導性のものであることが知られている。例外には、基底動物(basal animal)(例えば、海綿動物)及び節足動物から単離された化合物が含まれるが、これらの一部は、微生物起源でもあり得る(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Piel、Nat.Prod.Rep.26巻、338〜62頁(2009年)、Dossey、Nat.Prod.Rep.27巻、1737〜57頁(2010年)、Gronquist & Schroeder, in 2 COMPREHENSIVE NATURAL PRODUCTS II-CHEMISTRY AND BIOLOGY 67〜108頁(Bradley S.Moore & Phillip Crews(編)、2010年))。モデル有機体のエレガンスにおける研究により、この線虫は、低分子シグナルであるアスカロシド(例えば、ascr#1〜ascr#3、及びhbas#3)(図110A)のファミリーを産生し、このアスカロシドは、幼虫の発達、交尾、及び社会行動を含む、C.エレガンスの生活歴の複数の特徴を制御している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Srinivasanら、Nature 454巻、1115〜18頁(2008年)、Butcherら、Nat.Chem.Biol.3巻、420〜22頁(2007年)、Srinivasanら、PLoS Biol.10巻、e1001237(2012年)、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817〜24頁(2012年))。これらのC.エレガンスのシグナル伝達分子の構造は、様々な脂質代謝及びアミノ酸代謝由来の部分を含む、ジデオキシ糖アスカリロースの組合せに由来しており、線虫及び恐らくは他の動物は、依然として認識されていない生合成能力を保持していることが示唆される。
線虫のメタボロームの広域2D NMR分光的スクリーニングの一部として、ネクロメニック(necromenic)線形動物であるプリスティオンクス・パキフィクス(Pristionchus pacificus)のエキソメタボローム(分泌及び排泄代謝物の全部)を分析した。C.エレガンスのように、P.パキフィクスは、発生生物学及び進化生物学の研究にとって、モデル有機体として確定している自由生活性線虫である(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hong & Sommer、Bioessays 28巻、651〜59頁(2006年))。P.パキフィクスは、甲虫類とネクロメニックな関係を形成し、真の寄生の進化に対する前適応を示し得る(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Raeら、J.Exp.Biol.211巻、1927〜36頁(2008年))。P.パキフィクスは、野生において、生存に対して重要な2種の表現型可塑性を示す。他の多くの線虫種における場合と同様に、過酷な環境条件、例えば食物不足は、高度の耐ストレス代替幼虫段階である、耐久型幼虫蠕虫として発達阻止の引き金となる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wellerら、J.Parasitol.96巻、525〜31頁(2010年))。P.パキフィクスは、口腔の発達において特有の二形性を示し、この性質は、後生動物の成体における形態学の表現型可塑性に関する例を示す(図110B)。蠕虫の成虫は、狭い(「狭小型」)又は広くてより複雑(「幅広型」)な開口のどちらか一方を有することができ、後者は、食物利用度が低い条件に応答して発達する。2種の異なる口腔形態は、異なる食性に関係している。狭小型蠕虫は細菌を主に常食としていると考えられている一方、幅広型は他の線虫に対する捕食行動に適している。以前の研究により、耐久型幼虫形成と口腔二形性は個体群密度によって調節され、表現型可塑性のこれらの2つの例が、相互有機体の低分子シグナル伝達により推進される(図110B)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Bentoら、Nature 466巻、494〜97頁(2010年))。
耐久型幼虫誘発活性を有するP.パキフィクスのエキソメタボロームのフラクションの2D NMRに基づくメタボロミクスにより、シグナルの顕著な多様性が、一次代代謝物、例えばキシロース、トレオニン、アデノシン、短鎖脂肪酸、スクシネート、フェニルエタノールアミン及びいくつかのジデオキシ糖誘導体であることを示唆することが明らかになった(図110C)。しかし、それらのNMRデータにより、これらの部分のほとんどは、より大きな組立物の一部であることが示された。ジデオキシ糖誘導体は、2種の化学上異なるサブグループに分類された。グループの1つは、線虫により幅広く産生される糖であるアスカリロースに基づくものである(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Choeら、Curr.Biol.22巻、772〜80頁(2012年))一方、第2の化合物グループは、以前には細菌にしか報告されていなかった、関連糖であるパラトースが含まれるように思われる(図110C)。C.エレガンスから最近同定された約150種のアスカロシドのいずれが存在するかどうかについてHPLC-MS/MSによりP.パキフィクスのエキソメタボロームを分析すると(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817〜24頁(2012年))、以前に報告されたascr#1、ascr#9、及びascr#12が検出された(図111A)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Choeら、Curr.Biol.22巻、772〜80頁(2012年))。しかし、これらの3種の化合物は、2D NMR分光法によって検出された構造のわずか一部しか占めなかった。
少量成分の含有量を高めるためにさらに分画した後の一部について、NMRからの結果と高分解能HPLC-MS/MS分析を合わせて(図111A、図112及び図113)、P.パキフィクスのエキソメタボロームの主要な未知成分の構造が提唱された(図111B)。最も多量に存在するアスカロシド誘導体、すなわちpasc#9は、4-ヒドロキシペンタン酸鎖(図111B)を介してアスカリロースに連結しているN-スクシニル1-フェニルエタノールアミドと提唱されている。この化合物は、2種のアスカロシド二量体の誘導体すなわち、1つのascr#1-ユニットが別のascr#1ユニットの4位炭素に結合している公知のascr#1の二量体(dasc#1)、及び(ω)-酸素化アスカロシドoscr#9が2位に結合しているascr#9からなる及び第2の二量体(ubas#1)(図111B)を伴っていた。この第2の二量体ubas#1は、炭素4に結合している3-ウレイドイソブチレート部分をさらに有している。アスカロシド二量体とウレイドイソブチレート置換代謝物のどちらも天然からはこれまで報告されていないと思われる。
これらのアスカロシドは、アスカリロース、npar#1及びpart#9の代わりにパラトースを含む2種の多量に存在する代謝物を伴った(図111B)。npar#1では、パラトース部分は短い脂質側鎖に連結しており、この側鎖は次にトレオニンに連結していた。このアミノ酸は、カルバモイル基によってヌクレオシドアデノシン誘導体にさらに連結していた(図111B)。際立つことに、このアデノシンは、DNA、RNA、及び公知のヌクレオシドをベースとするシグナル伝達分子と同様に、キシロピラノースは含んでいるが、リボフラノース又はデオキシリボフラノースは含んでいないことが見いだされた。付随するpart#9は、パラトース及びnpar#1の側鎖部分に相当する(図111B)。
立体化学を決定するための、これらの構造の帰属の確認、及び生物的機能を探索するために、提唱されている構造物に関する合成を、それらのモジュール性質を利用して開発した(図111C、実施例95〜104を参照されたい)。合成試料と天然試料のNMRスペクトルの比較により、天然pasc#9中のN-スクシニル1-フェニルエタノールアミド部分の立体配置がRと確定した(図114)。同様に、NMR分光分析データとHPLC保持時間の比較により、アスカロシド二量体dasc#1及びubas#1の立体化学の帰属が可能になった(図115及び116)。ubas#1中の3-ウレイドイソブチレート部分のR立体配置は、可能性の高いチミン異化作用を起源とするものと一致している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、van Kuilenburgら、Biochem.J.379巻、119〜24頁(2004年))。最後に、パラトシドpart#9及び珍しいキシロアデノシン誘導体npar1#の試料を合成した。天然part#9のHPLC保持時間といくつかの合成part#9のジアステレオマーとを比較すると、天然part#9は、D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸又はL-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸のいずれか一方に違いないことが分かった(図117)。最初、part#9及びnpar#1は、D-パラトースを含んでいると想定され、これは以前には細菌からのものと記載されていたが、L-パラトースは自然界では発見されていなかった。さらに、D-パラトースは、L-アスカリロースの生合成における推定上の中間体であり(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Thorsonら、J.Bacteriol.176巻、5483〜93頁(1994年))、線虫におけるアスカロシドはすべてL-アスカリロースをベースとしている。しかし、D-パラトシル-4S-ヒドロキシペンタン酸を含む合成npar#1のジアステレオマーのHPLC保持時間及びNMRスペクトルは、天然npar#1について得られたデータと一致しなかった(図118A)。したがって、npar#1は、L-パラトシル-4R-ヒドロキシペンタン酸に基づいているに違いなく、この酸は、このジアステレオマーの合成、及びその分光分析デーと天然npar#1のものとの比較により確認した(図118B〜C)。糖のL-パラトースは、これまで自然界では発見されていない。しかし、線虫におけるその発生は、2位のL-アスカリロースのエピメリ化に起因するのが妥当と思われる。
糖、アミノ酸、脂質、及びヌクレオシドに由来するビルディングブロックの同定されている組合せが特異的かどうかを次に求めた。これに対処するため、高分解能HPLC-MS/MSにより、P.パキフィクスのエキソメタボローム全部を注意深く再分析し、既に同定されている構造中の一次代謝由来ビルディングブロックのホモログ又は代替組合せについてスクリーニングした。pasc#9は、6個及び7個の炭素側鎖を含む、わずかな量の2種のホモログを伴うことが見いだされており、これらの側鎖はNMR分光法によっても検出された(図119)。さらに、少量のubas#1のホモログ(図113中のubas#2)、及びnpar#1の誘導体(そのMSデータによりキシロースが失われていることが示された(図113中のubas#2))が検出された。重要なことに、同定されている化合物の非酵素的発生を示唆しているビルディングブロックの非特異的な、又は一見するとランダムな組合せは観察されなかった。これらの結果より、同定された化合物のモジュール組立物は、高度に特異的であることが示される。同定された化合物が細菌の代謝物である可能性を除外するために、P.パキフィクスのための餌食として使用した大腸菌OP50細菌のメタボロームも分析した。同定された化合物のいずれも、細菌のメタボローム中には存在していないことが分かった(図120)。さらに、同定された化合物はすべて、大腸菌の代わりにプセウドモナス属種(Pseudomonas sp.)を与えたP.パキフィクス培養物中で検出された。
次に、同定された化合物の合成試料について、P.パキフィクス耐久型幼虫及び口腔形態の二形性アッセイにおける活性を試験した。C.エレガンスのエキソメタボローム試料が、P.パキフィクスの口腔形態の二形性及び耐久型幼虫のアッセイにおいて活性ではないことを示した以前の研究から予期される通り(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ogawaら、Curr.Biol.19巻、67〜71頁(2009年))、C.エレガンスにより多量に排泄された化合物であるascr#1(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Jeongら、Nature 433巻、541〜45頁(2005年))は、非常に高い濃度でさえも、P.パキフィクスにおいて耐久型幼虫誘発活性がないことが分かった(図121)。対照的に、ヌクレオシド誘導体であるnpar#1は耐久型幼虫形成を強力に誘発し、報告されている未分画エキソメタボロームの耐久型幼虫誘発活性のほとんどを占めるように思われる(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Mayer & Sommer、Proc.Biol.Sci.278巻、2784〜90頁(2011年))(図122A及び図122C)。さらに、part#9による耐久型幼虫誘発はより弱く観察される一方、試験した他の化合物すべてが、このアッセイにおいて不活発であった。口腔の二形性アッセイ中における合成化合物を試験すると、耐久型幼虫形成アッセイにおいて不活発を示した二量体化合物dasc#1は、幅広型口腔形態を強力に誘発することが分かった(図122B及び図122D)。さらに、幅広型の口腔形態の誘発は、pasc#9、ascr#1、及びnpar#1が高濃度の場合には弱く観察される一方、二量体ubas#1、及びモノマーascr#9並びにpart#9は不活発であった。
これらの結果により、P.パキフィクスにおける、成体の表現型可塑性及び幼虫の発達は、依然として部分的に重複する個別の一連のシグナル伝達分子により制御されることが示される。口腔形態の二形性は主に、非常に特異的なアスカロシド二量化生成物であるdasc#1によって調節されるが、耐久型幼虫形成は、パラトシドと珍しいヌクレオシドとを組み合わせた分子によって制御される。以前の研究により、P.パキフィクス中の表現型可塑性を制御するシグナル伝達分子が、進化的に保存された転写因子(DAF-16/FOXO及び核内ホルモン受容体DAF-12(図122E)を含む)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ogawaら、Development 138巻、1281〜84頁(2011年)、Sommer & Ogawa、Curr.Biol.21巻、R758〜R66頁(2011年))の上流で作用することが示され、こうして、daf-12は耐久型幼虫誘発及び口腔形態の二形性の両方に必要である一方、daf-16は耐久型幼虫誘導には必要であるが、口腔形態の二形性の調節には必ずしも必要ではない(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ogawaら、Development 138巻、1281〜84頁(2011年))。したがって、耐久型幼虫形成及び口腔形態の二形性を調節する低分子の異なるサブセットは、異なる下流エフェクターを標的とするように思われる。ascr#1がC.エレガンスにおける耐久型幼虫に寄与する一方、その二量体のdasc#1は、P.パキフィクスにおける成体の形態性を調節するので、本実施例はさらに、異なるタイプの表現型可塑性を調節するために低分子生合成経路が種特異的に流用(co-option)されることを実証している。GPCRが、最近C.エレガンス耐久型幼虫フェロモンの受容体であると同定されたことに基づくと(全体が参照により本明細書に組み込まれている、McGrathら、Nature 477巻、321〜25頁(2011年))、P.パキフィクスにおける特異的なGPCRは、npar#1、dasc#1とそれぞれの下流経路とを結んでいる可能性が高い。
同定された低分子シグナルの構造は、主要な一次代謝経路(脂肪酸、炭水化物、アミノ酸、及びヌクレオシド代謝(図122E))からの特異的な入力を統合するように思われる。これらの経路からのビルディングブロックのモジュール組立物は、多様な分子アーキテクチャーを生成しており、このアーキテクチャーは、珍しいヌクレオシド改変によって、以前から公知のいかなる動物代謝物からもさらに区別されており、キシロピラノースをベースとするアデノシンとなる。この先例のないヌクレオシドは、古典的(リボ)-トレオニルカルバモイルアデノシン(t6A)(tRNAの部分集合のアンチコドントリプレットに直接隣接して見いだされた高度に保存されているヌクレオシドである)の代謝に由来している可能性が高い(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Deutschら、J.Biol.Chem.287巻、13666〜73頁(2012年))。t6Aは、翻訳の忠実度を維持するために重要な役割を果たしている。しかし、その役割は、通常、tRNAの非常に小さな部分だけしか占めておらず、P.パキフィクスにおける多量のキシロピラノース誘導体の産生は驚くべきことである。
本実施例は、内分泌腺の保存されたシグナル伝達経路に依存する後生動物における成体の表現型可塑性の低分子制御に関する直接的な証拠を提示している。同定されたシグナル伝達分子の生合成は、保存された経路も含んでいるか、又はP.パキフィクス(及び、恐らく他の線虫)に特異的な専用酵素に依存しているかどうかは知られていない。しかし、P.パキフィクス化合物が改変された一次代謝物の組立物に由来しているという知見により、それらの生合成が保存された生化学経路に大部分基づいていることが示唆される(図122E)。とりわけ、P.パキフィクスのゲノムは、一次代謝性酵素をコードする遺伝子の中で、多くの特異的遺伝子の重複事象を有する25,000を超える遺伝子予測を含有している(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dieterichら、Nat.Genet.40巻、1193〜98頁(2008年)、Borchertら、Genome Res.20巻、837〜46頁(2010年))。線虫のシグナル伝達分子の生合成における一次代謝の関与を支持して、C.エレガンス中のアスカロシド生物発生の最近の検討により、脂質様のアスカロシド側鎖が、保存されたペルオキシソームβ-酸化に由来していることが示された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817〜24頁(2012年)、Butcherら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、1875〜79頁(2009年))。高等動物における公知のシグナル伝達分子及び補因子、例えばS-アデノシルメチオニン又はホスファチジルイノシトールは、1つ又は2つの異なる一次代謝経路に由来するビルディングブロックの組合せに依存することが多い。本実施例は、後生動物が構造的により一層複雑なシグナル伝達分子を産生するような戦略を展開することができることを実証しており、このことは、哺乳動物を含む高等動物由来のメタボロームの分光学的な再分析を詳細に行うことにより、やはり新規なタイプのモジュール低分子シグナルが明らかになり得ることを示唆している。
[実施例105]C.エレガンス株及び一般的培養方法
野生型のC.エレガンス(N2、Bristol)、daf-22(m130)、daf-22(ok693)、acox-1(ok2257)、maoc-1(hj13)、及びdhs-28(hj8)突然変異株はCaenorhabditis Genetics Center(CGC)から得た。株は、餌食として細菌(大腸菌OP50)を含むNGMプレート上、20℃で維持した。
[実施例106]-C.エレガンス代謝抽出物の調製
液体培養物は、(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、7708頁(2009年))に報告されている通りに成長させた。手短に言えば、野生型蠕虫又はdaf-22突然変異体蠕虫を、OP50を播種したNGMプレート上で2世代成長させた。3枚の密集6cmNGMプレートを500mLエルレンマイヤーフラスコ中のS-培地100mL溶液に洗い入れて、22℃及び220pmで成長させた。一晩成長させた1Lの細菌培養物からの濃縮OP50を、1日目及び3日目に与えた。5日目に、この液体培養物を2個の500mLエルレンマイヤーフラスコに分割して入れ、この成長培地の体積を100mLに維持した。さらに1LのOP50ペレットを分割時に餌食として与えた。7日目に、この培養物を4750rpmで遠心分離することにより採取した。上澄み液を凍結乾燥し、残渣を室温で12時間、95%エタノール(300mL)により抽出した。得られた懸濁液をろ過して室温において真空で蒸発させると、粗製抽出物が生じた。この方法で、野生型(N2)、daf-22(m130)、及びdaf-22(ok693)の培養物の各々の4種の抽出物を調製した。NAEの定量については、突然変異株を上にある通り複製して成長させた。0日目において、アスカロシド混合物実験用の液体培養物を、2.5μMのascr#3及び2.5μMのascr#9を添加することにより、上に記載する通り調製した。
NMR分光分析に備えて、粗製抽出物は、1グラムの粗製抽出物あたりこの溶媒混合物7.5mLを使用し、1:8メタノール(MeOH):ジクロロメタン(DCM)中で懸濁した。遠心分離に続いて、溶出用に1:8のMeOH:DCM10mLを使用し、各試料の上澄み液の2mlの一定分量を1gのシリカ(EMD Chemicals Inc.社)でろ過した。分析前に、このろ液を蒸発させて真空で乾燥した。NMR分光分析については、得られた代謝抽出物10〜20mgを使用した。
[実施例107]-細菌の代謝抽出物の調製
大腸菌OP50を37℃及び220rpmで一晩成長させて、溶原培地(LB)2L中の1.2のODとした。細菌のブロスは、4750rpmで20分間回転した。次に、上澄み液を凍結乾燥し、乳鉢及び乳棒を用いて粉砕し、95%エタノール150mLにより抽出した(2回)。この抽出物を焼きるつぼによりろ過をして、分析前に真空で濃縮した。
[実施例108]-質量分析
上で記載した通りに調製した代謝抽出物をメタノール1.5mLに再懸濁し、遠心分離にかけて、この試料30μLを分析するためにHPLC-MSに注入した。HPLC-MS分析は、10:1のスプリットを使用するQuattro II質量分析計に接続したAgilent Eclipse XDB-C18カラム(9.4×250mm、粒子径5μm)を備えたAgilent 1100 Series HPLCシステムを使用して行った。短鎖アスカロシドに関しては、0.1%水性酢酸-アセトニトリルのグラジエントを使用した。グラジエントは、5分間の5%アセトニトリルで始め、次に、32分間かけて100%アセトニトリルまで増加した。長鎖アスカロシドに関しては、アセトニトリル-イソプロパノールのグラジエントを使用し、5分間、アセトニトリル中の5%イソプロパノールから始め、その後、32分間かけてイソプロパノールを75%まで増加した。試料は、3.5kVのキャピラリー電圧、並びに-40V及び+20Vのコーン電圧をそれぞれ使用し、ネガティブイオン及びポジティブイオンモードでHPLC-ESI-MSにより分析した。長鎖アスカロシドの元素組成は、Xevo G2 QTofを使用する高分解能MS及びHPLC-MSによって行った。
EPEA及びAEA(14)は、短鎖アスカロシドに関して上で記載した通り、水(0.1%酢酸)-アセトニトリルのグラジエントを使用して、HPLC-MS(Quattro IIを使用)により定量した。EPEA及びAEAの保持時間は、標準品(それぞれ、Enzo Life Sciences社及びCayman Chemicals社)を注入することにより確定した。野生型及び突然変異株中の相対的な内在性カンナビノイド含有量は、(M-H)-又は(M+Cl)-に関する対応するイオントレースからのLC-MSシグナルの積分により定量した。積分値はすべて、液体培養物ペレットの質量により正規化した。図123中で報告した定量データはすべて、少なくとも2回の独立した生物学的繰返しからのものであった。
[実施例109]-NMR分光分析
NMR試料は、CD3OD0.6ml中に代謝抽出物(実施例107を参照されたい)の一部である10〜20mgを溶解することにより調製した。試料は、Varian INOVA 600 MHz NMR分光計を使用して分析した。非勾配位相巡回dqfCOSYスペクトルは、以下のパラメーターを使用して得た。捕捉時間0.8s、コンプレックスインクリメント600、インクリメントあたり16スキャンである。mvaDANSによる処理に関しては、スペクトルは、2048×1024のデータポイントにゼロで埋め、フーリエ変換前に両次元に正弦二乗型窓関数を適用し、MATLABへ移動する前に、スペクトルを大きさモードに変換した。
位相敏感モードでの詳細な分析に関しては、dqfCOSYスペクトルは、8192×4096のデータポイントにゼロで埋め、フーリエ変換前に両次元に余弦釣鐘型窓関数を適用した。daf-22の上方調節の代謝物の精製フラクションの勾配及び非勾配HSQCAD及びHMBCスペクトルは、8〜32スキャン、捕捉時間0.25s、及びコンプレックスインクリメント256〜500を使用して取得した。NMRスペクトルは、Bruker TopSpin、Varian VNMR、MestreLabs' MestReC、及びMNovaソフトウェアパッケージを使用して処理した。
[実施例110]-daf-22の上方調節された主要代謝物の単離
セライト8g(酢酸エチルにより予備洗浄済み)に、16個の100ml液体培養物からのdaf-22代謝抽出物溶液を加えた。溶媒の蒸発後、この物質を空の25g RediSep(登録商標) Rf装填用カートリッジに乾式充填した。分画は、順相のジクロロメタン-メタノール溶媒系を使用するRediSep(登録商標)Rf GOLD 40g HPシリカカラム上のTeledyne ISCO CombiFlash(登録商標)システムを使用して行い、100%ジクロロメタンを6分から始めて、その後、メタノール含量を24分に10%まで直線的に増加し、次いで、メタノール含量を40分に40%まで別に直線的に増加し、次いで、メタノール含量を45分に95%まで別に直線的に増加し、次に、これを48分まで継続した。これにより70個のフラクション(各約20mL)が得られ、真空で個別に蒸発し、NMR分光法(1H NMR、dqfCOSY)及びHPLC-MSにより分析した。daf-22の上方調節された代謝物を表すものとしてmvaDANSにより同定される1H NMR分光シグナルは、フラクション35〜45で検出された。daf-22の上方調節された主要代謝物の単離は、長鎖アスカロシドのHPLC-MS分析に関して実施例90に記載したものと同一のHPLC法を使用した分取HPLCにより実現した。分離フラクションはdqfCOSY、HSQC及びHMBC、並びにXevo G2 QTofを使用する高分解能HPLC-MSにより、さらに特徴付けた。
[実施例111]-統計的解析
野生型及び突然変異株中のEPEAとAEAの相対的な存在量を比較するため、ウェルチの補正によるスチューデント(student's)の独立t検定を使用した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。図123D及び図124を参照されたい。
[実施例112]-mvaDANS分析
mvaDANSによるdaf-22の上方調節された代謝物の同定については、2種の異なるdaf-22対立遺伝子(m130、ok693)及び野生型C.エレガンスから得られたメタボローム抽出物に関するdqfCOSYスペクトルを得た(図125、図126、及び図127)。4つの独立した生物的複製物からのdqfCOSYスペクトルを、Matlabにおいて、動的ビニング及び多変量パターン認識解析を組み込んだmvaDANSアルゴリズムを使用する大きさモードで処理した(図128)。交差ピーク自動同定及びビニングにより、dqfCOSYスペクトルのそれぞれは、確率的指数正規化を使用して希釈に対して補正が行われ、平均中心を求めて単位分散に調整した一連の交差ピークの積分値に変換される(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dieterleら、Anal.Chem.78巻、4281頁(2006年))。次に、このビン積分値のマトリックスに、二元階層的クラスタリング、主成分分析(PCA)(図125A)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Woldら、Chemometr.Intell.Lab.Syst.2巻、37頁(1987年))、及び部分的最小二乗法-判別分析(PLS-DA)(図129)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、de Jong、Chemometr.Intell.Lab.Syst.18巻、251頁(1993年))を含む統計的解析を施した。PCA負荷量及びPLS-DA予測値からの係数をdqfCOSYスペクトル上に逆投影して、3種のC.エレガンス株中で分化的に発現した化合物を示すNMR分光シグナルの検出を可能にした(図130及び131)。
mvaDANSに関する交差ピーク自動同定及び積分
代表的な偽スペクトル(この場合、スペクトル階層の第三次元に沿う平均値から算出した平均スペクトルのことである)からスペクトル区分を検出する。交差ピーク領域に対応する偽スペクトル区分を同定するために、局所表面ノイズをAUTOPSY(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Koradi、J.Magnetic Res.135巻、288頁(1998年))法(式1〜4)を使用して計算する。AUTOPSYとは、以下の通りノイズの下にあるポイントワイズ推定値を計算するものである。
Figure 2014522882
Figure 2014522882
式中、dx及びdyは、それぞれ2D NMRスペクトルの直接的及び間接的次元における、各x切片及びy切片に対するノイズ値である。所与の切片δx又はδyに関するノイズ値は、切片を、直接次元についてはサイズn=F1/16の16領域、及び間接次元についてはサイズn=F2/16の16領域に分割することにより計算される。すると、そのトレースに対するノイズは、式1及び式2に示される通り、最小標準偏差を含む領域の標準偏差となる。スペクトル中の各点pは、そのノイズ値がdx及びdyとなる、2つの切片x及びyにより交差する。ポイントpxyにおけるノイズは、式3及び式4にある通り、ベースラインノイズ値bを含む、切片xにおけるノイズと切片yにおけるノイズとを組み合わせる。ノイズを算出するこの方法は、2D NMRデータのノイズ構造に非常によく適合し、この構造は、T1及び水のノイズなどの垂直方向のノイズを特徴とする。
一旦、ノイズ表面pxyが算出されると、ピークはある種の複数のノイズ表面の上にある局所極大値を識別することによって検出することができる。正確な閾値は変動し得るが、値5〜10は交差ピークの大部分を検出する。ここで、使用される高濃度C.エレガンス試料の場合、閾値10を使用した。次に、区分を検出ピークの隣接領域として定義する。
最初のスペクトル区分は、同核スペクトルの1H次元における、ピークの0.04ppm以内の領域として識別される。多重の場合、局所極大値は最初の単一の区分に一緒にグループ化される。次に、各区分は固有の整数値により標識され、極小値及び極大値のフィルタリングの繰返しにより、これらの最初の区分を拡張する。極小値/極大値フィルタリングは、この区分が別のスペクトル区分に遭遇するか、又はそれらが1Hの場合、およそ0.2ppmの最大周波数範囲に到達するまで、この区分を展開する効果を有する。この手順は、依然として近傍にある共鳴によって取り囲まれている非長方形型領域を有するスペクトル区分を作り上げ、交差ピーク線の形状に近い切り取りを回避する。次に、台形の数値積分法を使用してこれらの区分を積分する。
スペクトルビンを使用するパターン認識
検出されたスペクトル区分の積分により、フル解像度2Dスペクトル(ω1、ω2、N)の三次元階層からの2D NMRデータセットを形状の二次元マトリックス(N,P)に変換する(この場合、Pは検出区域数である)。次に、得られたビン強度のマトリックスを確率的指数正規化、及び一変量スケーリングを使用して安定化させた分散を使用して正規化する(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Dieterleら、Anal.Chem.78巻、4281頁(2006年))。時として列方向正規化及び行方向正規化とも呼ばれるこれらの手法は、メタボロームのデータ処理において、試料間の希釈、又はスペクトルと、高強度シグナル及び低強度シグナルの分散のバランスとのレシーバーゲイン差の説明に適用されることが多い。次に、パターン認識方法のPCA及びPLS-DAを変換したビンマトリックスに直接適用した。パターン認識の結果は、モデルにおける各成分に関して、試料の相互類似性を示す一連のN点数、及び各ビンの、試料間の分離への寄与を示すP係数(負荷量及び予測値とも呼ばれる)のベクターである。
ピーク積分値のマトリックスはまた、log2-倍率変化対メジアンヒートマップとしても表された。ヒートマップは、UPGMA階層的クラスタリングアルゴリズムを使用してクラスター化した(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Gordon、J.Royal Stat.Soc.Ser.A Stat.Soc.150巻、119頁(1987年))。ビンマトリックスをクラスター化したヒートマップとして表すことにより、その差異のレベルが実験群を区別する交差ピーク群を迅速に識別するのを可能にする。さらに、PLS-DA予測値及びPCA負荷量が、交差ピーク領域のクラスター化指数を使用することにより求められた。この表示は、パターン認識によって識別されるデータ形状を表示する。
モデルを理解して重要な代謝物を同定するために、スペクトル区分を使用することにより、フル解像度スペクトル上に係数が逆投影される。フル解像度マトリックス中のすべての区間について、区間内のデータポイントを、その区間から抽出したビンのパターン認識からの係数値により置きかえ、フル解像度負荷量マトリックスを生成する。安定データに関すると、負荷係数はシグナル強度に無関係で、こうして、ピーク形状は目視可能ではない。次に、2D NMRスペクトルのように見えるフル解像度の逆投影の負荷量を生成するため、このマトリックと2D NMR階層の第三次元に沿った標準偏差とをポイントワイズに掛け合わせる。負荷量を視覚化するために、等高線を逆投影負荷量により画定し、これらの線の色を係数そのものにより画定する。mvaDANSアルゴリズムを大きさモードで処理したdqfCOSYデータに適用して、局所極大値/極小値の数を低下させながら、mvaDANSによって識別された対象とする領域をより重要な詳細構造に関する元々の位相敏感データと相互参照した。mvaDANSは、元々、TOCSY、COSY及びNOESYを含む1H-1H NMR実験と互換性があり、1H-13C HSQCを含む異核実験に対するパラメーターのほんのわずかの変化にしか互換性がない。
バリデーション及びスペクトルの解釈
daf-22特異的交差ピークの解析に関すると、逆投影スペクトルを、位相敏感モードにおいて処理された元々のdaf-22 dqfCOSYスペクトルと重ねた。化学シフト値及びカップリング定数値を含めたスピン系は、元々の位相敏感スペクトルを人の手により解釈することにより得られたものであった。利用可能なデータベース(Reaxys、Beilstein、Scifinder、HMDB、NMRshiftDB、BMRB)の使用により、同定されたスピン系を表す部分構造に関する仮説が展開される。daf-22エキソメタボロームの部分分画を使用すると、HMQC及びHMBCによるさらなるNMR分光分析用に、濃度を高めた同定代謝物の試料を作製することができる(実施例110を参照されたい)。
PCA解析からの逆投影を使用し、daf-22特異的交差ピークを同定した。PLS-DA解析を使用し、野生型及びdaf-22メタボロームの統計をベースとする分離をバリデートした(図129)。PLS-DA予測値からの逆投影(図131)は、PC 1負荷値からの逆投影とほとんど一致した(図130)。大腸菌OP-50代謝抽出物のdqfCOSYスペクトル(図132)中に存在している目立つピークは、さらなる解析から除外した。
[実施例113]-daf-22の突然変異体に特異的な非常に長鎖のアスカロシド
daf-22の突然変異体に特異的なVLCAである、24R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-2-メチル-3-オキソペンタコサン酸エタノールアミド(7)、(26R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-3-オキソ-ヘプタタコサン酸エタノールアミド(8)、24R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-2-メチル-2E-ペンタコセン酸エタノールアミド(9)、24R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-2-メチル-2E-ペンタコセン酸(10)、及び(24R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-2-メチル-ペンタコサン酸(11)(図123Bを参照されたい)は、実施例105〜112に記載した方法を使用して同定した。それらの構造及び分光分析データを以下の表17に示している。
Figure 2014522882
Figure 2014522882
[実施例114]-daf-22の突然変異体に特異的な非常に長鎖のアスカロシド(ω-1)-O-アスカロシル2-ケトン(12)
(23R)-(3'R,5'R-ジヒドロキシ-6'S-メチル-(2H)-テトラヒドロピラン-2'-イルオキシ)-テトラコサン-2-オン(12a)を含む、daf-22の突然変異体に特異的な一連のVLCA(ω-1)-O-アスカロシル2-ケトン(12)(図123Cを参照されたい)は、実施例105〜112に記載されている方法を使用して同定した。12aの構造及び分光分析データを以下の表18に示している。
Figure 2014522882
一連のVLCA(ω-1)-O-アスカロシル2-ケトン(12)の構造及びHPLC/HR-MS(ESI+)データを以下の表19に示している。
Figure 2014522882
実施例105〜114の考察
C.エレガンスメタボロームの分析により、保存されたペルオキシソームβ-酸化の産生物として、構造上多様な低分子であるアスカロシドファミリーが明らかになった(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134:1817頁(2012年)、Butcherら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、1875頁(2009年)、Pungaliyaら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、7708頁(2009年))(図133及び図134を参照されたい)。アスカロシドは、モジュール化合物ライブラリーを形成し、脂質、炭水化物、及びアミノ酸代謝からのビルディングブロックをC.エレガンス生物学の重要な特徴を調節する低分子シグナルに統合している(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Nat.Chem.Biol.3巻、420頁(2007年)、Srinivasanら、Nature 454巻、1115頁(2008年)、Srinivasanら、PLoS Biol.10巻、e1001237(2012年)、Macoskoら、Nature 458巻、1171頁(2009年))。以前の研究では、アスカロシド生合成における3種の酵素(アシル-CoAオキシダーゼであるACOX-1、エノイル-CoAヒドラターゼであるMAOC-1、及び3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼであるDHS-28)の機能を特徴付けるために、質量分析法に基づいた比較メタボロミクスが使用された(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817頁(2012年))(図134を参照されたい)。しかし、哺乳動物の3-ケト-アシルCoA-チオラーゼに近いホモログである遺伝子daf-22によりコードされる、ペルオキシソームβ-酸化カスケードにおける第4の酵素の予想される役割は、特徴的なシャント代謝物が見いだされていないので、確認することができなかった。提唱されたペルオキシソームβ-酸化経路におけるdaf-22の中心的な役割を考慮すると、依然として未同定の他の代謝物がdaf-22突然変異体に蓄積するという仮説が立てられ、これは、この酵素の生化学的機能を確認する一助となり得る。
したがって、先入観のないNMR分光法に基づいたメタボロミクスを使用し、daf-22メタボロームを再検討した。以前、野生型及びdaf-22のメタボロームの2D NMRスペクトルの人の手による比較を使用して、シグナル伝達分子のアスカロシドファミリーのさらなるメンバーが同定された(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Pungaliyaら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、7708頁(2009年)、Srinivasanら、PLoS Biol.10巻、e1001237(2012年)、Robinetteら、Acc.Chem.Res.45巻、288頁(2012年))。これらの研究により、メタボロミクスの比較に2D NMRスペクトルの利便性が強調されるだけではなく、様々な突然変異体由来の一連のスペクトルの統計的解析を可能にすることになる、計算ツールの必要性が実証される。この目的に、2D NMRスペクトル一式の自動処理及び比較計算解析を可能にする、2D NMR分光法による多変数差分解析法(mvaDANS)(multivariate Differential Analysis by 2D NMR Spectroscopy)を開発した。
mvaDANSは、動的シグナル検出及びパターン認識を組み込むことにより代謝物解析用に2D NMRを使用しようとする以前の成果に立脚している(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Hedenstromら、Mol.Plant 2巻、933頁(2009年)、Hedenstromら、Chemometr.Intell.Lab.92巻、110頁(2008年)、Robinetteら、Anal.Chem.83巻、1649頁(2011年)、Robinetteら、Anal.Chem.80巻、3606頁(2008年)、Zhangら、Anal.Chem.79巻、7748頁(2007年)、Zhang & Bruschweiler、Angew.Chem.Int.Ed.46巻、2639頁(2007年)、Zhangら、Anal.Chem.80巻、7549頁(2008年))(実施例112を参照されたい)。図125は、daf-22突然変異体において上方調節される化合物を同定するためのこの手法の使用をまとめたものであり、こうしてシャント代謝物又は生合成中間体を表すことができる。4種の独立した生物的複製物を含む、2種の異なるdaf-22対立遺伝子(m130、ok693)、及び野生型C.エレガンスから得られたメタボローム抽出物について、dqfCOSYスペクトルを取得した(図125、図126、及び図127)。交差ピーク自動識別及びビニング(図128)により、遺伝子型によりデータをクラスター化する、主成分分析(「PCA」)による統計解析のためのdqfCOSYスペクトルが用意される(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Woldら、Chemometr.Intell.Lab.2巻、37頁(1987年))(実施例112を参照されたい)(図125A)。PCA負荷量からの係数は、dqfCOSYスペクトル上に逆投影され、これにより、daf-22突然変異体において野生型に比べて上方又は下方調節されている非常に多くの交差ピークが明らかになった(図125A、図130及び図135)。
この研究に関すると、解析は、daf-22の対立遺伝子の両方からのスペクトル中において強く特徴付けられるが、野生型では非常に弱いか又は検出できない交差ピークに限定した。さらに、大腸菌食物源中に存在している交差ピークも除外した。上記の残りのdaf-22の強力に上方調節された交差ピーク及び対応するHMBCスペクトルからの入力の人の手による解析により、メチルケトン、α-メチル分岐脂肪酸、及び対応するエタノールアミド、並びにβ-ケト脂肪酸誘導体を含む、一連の部分構造が示唆された(図125B)。アスカロシド生合成(図134)におけるdaf-22の提唱された役割を考慮すると、これらの構造的特徴は、蓄積されるシャント代謝物に属するという仮説が立てられる。daf-22-特異的NMRシグナルにより導かれるdaf-22メタボロームのその後の分画により、予期される構造的特徴のすべてを説明する、異なる6種の非常に長鎖のアスカロシド(VLCA)(very long-chain ascarosides)の単離に結びついた(図123、全分光分析データに関しては実施例113〜114を参照されたい)。最も顕著なものは、一連の(ω-1)-O-アスカロシル2-ケトン(12)、及び(ω-1)-O-アスカロシル3-ケト脂肪酸エタノールアミドの一連のものであり、これらには、2-メチルペンタコサン酸誘導体7及び直鎖ヘプタコサン酸誘導体8が含まれる。化合物7及び8は、少量の対応するビス-ノルホモログ(norhomologue)を伴う。同様に、2-メチルペンタコサ-2-エン酸エタノールアミド9、並びに2種の脂肪酸10及び11はビス-ノルホモログを伴う。対照的に、(ω-1)-O-アスカロシル2-ケトン(12)の鎖長は広く変動し、優先的には奇数をとらない(図123C)。HPLC-MS分析により、野生型の試料中には、これらの成分が存在しないことが確認された(図123A)。
daf-22の特異的なVLCA中のエタノールアミンの取り込みは予期しないものであり、ペルオキシソームβ-酸化とエタノールアミドをベースとするシグナル伝達経路の間に相互作用がある可能性が示唆された。最近、N-アシル-エタノールアミン(NAE)は、C.エレガンス中の内在性カンナビノイド様シグナル伝達分子と同定され、食物制限依存性のライフスパン調節にリンクしている(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Lucanicら、Nature473巻、226頁(2010年))。daf-22突然変異体におけるVLCAの上方調節がNAEレベルに影響を及ぼすかどうか評価した。最も活発な内在性カンナビノイドである、エイコサペンタエノイルエタノールアミド(13、EPEA)、及びアラキドノイルエタノールアミド(AEA)を含むNAEの産生は、daf-22の対立遺伝子の両方において著しく下方調節され(図123D及び図124)、エタノールアミンの利用がNAEからVLCAにシフトしていることが示唆された。同様に、大幅に低下するEPEA及びAEA産生が、daf-22の上流で直接作用するmaoc-1及びdhs-28(図123D及び図124)の突然変異体中で見いだされた(図134)。acox-1突然変異体蠕虫中のEPEAレベルは、有意に影響を受けず、AEAレベルだけがわずかに低下するだけであり、ペルオキシソームβ-酸化に対するacox-1突然変異の影響が随分小さいことに対応していた(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817頁(2012年))。EPEA及びAEAの産生は、合成アスカロシドを添加して成長させたdaf-22蠕虫により回復することはなく(図123D及び図124)、ペルオキシソームβ-酸化突然変異体中で観察されたNAEレベルの低下は、アスカロシドのフェロモンの欠如による間接的な影響ではない。これらの知見は、C.エレガンスでは、ペルオキシソームβ-酸化の特異的欠損は、内在性カンナビノイドのプールの枯渇をもたらす(図123E)ことを示す。健常な動物において、ペルオキシソームβ-酸化遺伝子の発現を低下する条件が、脂肪代謝を結びつける調節機構及び食物制限の経路に対するアスカロシドシグナル伝達として働き得る、内在性カンナビノイドの下
方調節の引き金となるかどうかは未知である。短鎖アスカロシドのエタノールアミドは、寄生性線虫種ではフェロモンとして働き(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Noguezら、ACS Chem.Biol.7巻、961頁(2012年))、ペルオキシソームβ-酸化とエタノールアミド代謝の相互作用は、他の線虫属にも存在していることが示唆される。
daf-22の哺乳動物のホモログは、フィタン酸などの分岐脂肪酸鎖の短鎖化に特に必要であると考えられている(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wanders & Waterham、Annu.Rev.Biochem.75巻、295頁(2006年)、Wanders、Mol.Genet.Metab.83巻、16頁(2004年))。しかし、daf-22突然変異体に特異的なVLCAの中で、直鎖及びメチル分岐誘導体の共発生は、daf-22が分岐及び直鎖脂肪酸の両方のプロセッシングに関与していることを示唆している。daf-22突然変異体に特異的なVLCAの鎖長により、23〜27個の炭素脂肪酸は、最後の鎖延伸ステップが、マロネート又はメチルマロネートのいずれか一方が取り込まれる、C.エレガンス脂肪酸生物発生のエンドポイントに相当し得ることが示される。とりわけ、本代謝物解析により、これらの脂肪酸誘導体の生合成において、初期段階でメチルマロネートを取り込んでいる証拠は提供されない。C.エレガンス中のdaf-22の突然変異体の上方調節されたVLCAの鎖長は、ゼルウィガー症候群などのペルオキシソームβ-酸化の欠如を含むヒトの障害で蓄積する非常に長鎖の脂肪酸のものに似ている(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wanders & Waterham、Annu.Rev.Biochem.75巻、295頁(2006年)、Wanders、Mol.Genet.Metab.83巻、16頁(2004年))。しかし、ヒト脂肪酸生合成は、最後の鎖延伸ステップにおいてプロピオネート又はメチルマロネートを選択的に取り込んで、α-メチル-分岐変異体を形成することは知られていない。
生合成モデル(図134及び図123E)では、同定されたdaf-22の突然変異体に特異的な化合物は、脂肪酸及びβ-ケト酸CoAエステルに由来するシャント代謝物に相当すると考えるのが妥当であり、この場合、α,β-不飽和及びβ-ケト官能基化はACOX-1、MAOC-1及びDHS-28の上流での作用に起因している。daf-22の上方調節された長鎖メチルケトンは、対応するβ-ケト脂肪酸に由来することができ、この脂肪酸は脱炭酸する傾向が高い。初期の研究において記載されているが(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Butcherら、Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.106巻、1875頁(2009年))、本代謝抽出物中のβ-ケト脂肪酸に関する証拠は、NMR分光法又はHPLC-MSのどちらによっても見いだされなかった。daf-22の上方調節されたアスカロシル-脂肪酸の奇数側鎖長は、ペルオキシソームβ-酸化の既知のエンド産生物である、短鎖アスカロシドフェロモンの構造に一致しており、それらの大部分は、3個、5個、7個又は9個の炭素を含む側鎖である(図133)(全体が参照により本明細書に組み込まれている、von Reussら、J.Am.Chem.Soc.134巻、1817頁(2012年))。これらの奇数側鎖は、さらに、アスカロシド側鎖の生合成が3個の炭素(メチルマロネート)テンプレートから始まること、又はC.エレガンスが食物から得る奇数鎖脂肪酸を伸長することを示唆している。
結論として、mvaDANSに基づくdaf-22と野生型のメタボロームの比較により、daf-22突然変異体蠕虫において、予期されないシャント代謝物クラスとして長鎖のアスカロシルエタノールアミドの存在が明らかにされた。哺乳動物のペルオキシソームのチオラーゼとの相同性に基づいて疑念が持たれる通り、同定された長鎖アスカロシドの中にβ-ケト誘導体及びメチルケトンが多量に存在することにより、アスカロシドフェロモンの生合成において、daf-22がチオラーゼとして作用することを支持している。
対象にしなかった比較メタボロミクスは、後生動物の生化学を再検討するための重要なツールを形成することになる。mvaDANSにより、交差ピーク自動識別及び積分を導入することにより、2D NMRに基づく代謝物解析の範囲が拡張される(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Wishart、Brief.Bioinform.8巻、(5号)、279〜93頁(2007年)、Nicholsonら、Nature Rev.Drug Discov.1巻、153頁(2002年)、Gartlandら、Mol.Pharmacol.39巻、629頁(1991年))。パターン認識技法は、これまでに、2D NMRスペクトルに適用されているが、これらの手法は、人の手によるピーク選択(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Vanら、J.Proteome Res.7巻、630頁(2008年))、パラメトリック手法(全体が参照により本明細書に組み込まれている、Chyllaら、Anal.Chem.83巻、4871頁(2011年))、又は利用済みのスペクトル展開/再構築技法(各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Robinetteら、Anal.Chem.83巻、1649頁(2011年)、Hedenstromら、Chemometr.Intell.Lab.92巻、110頁(2008年))に依存してきた。統計的分光法の進歩が続けられ、生物起源の低分子の構造及び機能的特徴付けが促進されることになることが期待される。
好ましい実施形態は、本明細書に詳細に示され、且つ説明されているが、様々な改変、追加、代替などを本発明の主旨から逸脱することなく行うことができ、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲内にあると見なされることが、当業者には明らかとなろう。

Claims (50)

  1. 式Iの単離化合物
    Figure 2014522882
     (式中、
    R1は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R1'は、存在しない、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R2は、式の部分
    Figure 2014522882
     (式中、
    各R1は、独立して、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    n1、n2、及びn3は、それぞれ独立して、0〜30の整数であり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    n1、各n2、及び各n3の合計は、1〜30である)
    であり、
    R3及びR4は、それぞれ独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR5に連結している結合であり、
    ここで、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    各R5は、独立して、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
    ここで、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数である)
    であって、
    以下の条件
    (i)R1は、独立して、-C(R')3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、各R'は、独立して、ハロゲン又はアルケニルであり、
    R1'は、独立して、存在しない、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルである、
    (ii)R2は、
    Figure 2014522882
     である
    (式中、
    各
    Figure 2014522882
     は、独立して、単結合又は二重結合であり、
    q1、q2及びq3は、それぞれ独立して、1〜26の整数であり、
    q4及びq5は、それぞれ独立して、0〜26の整数であり、
    q1、q2、q3、q4及びq5の合計は、28以下であり、
    q4及びq5の合計は、2以上である)、
    (iii)R5は、H、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、又はヌクレオシドである、
    (iv)R5は、式Iの別のユニットのR3又はR4に連結している結合であり、式Iの少なくとも2つのユニットを含む化合物を形成する、
    (v)R3及びR4は、それぞれ独立して、-CR6R7R8、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は-(CO)R8であり、R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている、
    (vi)前記化合物が、式I"の化合物
    Figure 2014522882
     であること、
    からの少なくとも1つを満足するが、
    但し、前記化合物が
    Figure 2014522882
     ではないとする、
    上記化合物。
  2. R1が、独立して、-C(R')3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、各R'は、独立して、ハロゲン又はアルケニルであり、R1'は、独立して、存在しない、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルである、請求項1に記載の化合物。
  3. R1がアルケニルであり、R1'が存在しないか又はHである、請求項2に記載の化合物。
  4. R2が、
    Figure 2014522882
     であり、各
    Figure 2014522882
     が、それぞれ独立して、単結合又は二重結合であり、q1、q2及びq3は、それぞれ独立して1〜26の整数であり、q4及びq5は、それぞれ独立して0〜26の整数であり、q1、q2、q3、q4及びq5の合計は28以下であり、q4及びq5の合計が2以上である、請求項1に記載の化合物。
  5. 式IDの化合物
    Figure 2014522882
     である、請求項4に記載の化合物。
  6. 式ID'の化合物
    Figure 2014522882
     である、請求項4に記載の化合物。
  7. Figure 2014522882
     である、請求項6に記載の化合物。
  8. R5が、H、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、又はヌクレオシドである、請求項1に記載の化合物。
  9. R5が、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NR6R7又は-CR6R7C(O)NHR8である、請求項8に記載の化合物。
  10. R5が、-OCHR6R7である、請求項9に記載の化合物。
  11. R6及びR7が、それぞれ独立して、アルキル又はアリールであり、前記アルキル又はアリールは、-OR8、-C(O)R8及び-NHC(O)R8からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換される、請求項9に記載の化合物。
  12. R8が、H、-OH、-NH2、アルキル、プリン、又はピリミジンであり、前記アルキル、プリン,又はピリミジンは、-COOH、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている、請求項8に記載の化合物。
  13. R5が、
    Figure 2014522882
     からなる群から選択される、請求項8に記載の化合物。
  14. 式の化合物
    Figure 2014522882
     (式中、m1は、1〜3の整数である)
    である、請求項8に記載の化合物。
  15. 式の化合物
    Figure 2014522882
     (RIは、-NH3又はHであり、m2は20〜22の整数である)
    である、請求項8に記載の化合物。
  16. R5が、式Iの別のユニットのR3又はR4に連結している結合であり、式Iの少なくとも2つのユニットを含む化合物を形成する、請求項1に記載の化合物。
  17. 各R1が、独立して、H又はアルキルである、請求項16に記載の化合物。
  18. 式IE、IE'、IF又はIF'の化合物
    Figure 2014522882
    Figure 2014522882
    (式中、
    R2a及びR2bは、それぞれ独立して、式の部分
    Figure 2014522882
     であり、
    各R3及びR4は、独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、
    R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖である)
    である、請求項16に記載の化合物。
  19. 式IE又はIE'の化合物である、請求項18に記載の化合物。
  20. 式IF又はIF'の化合物である、請求項18に記載の化合物。
  21. 各R1が、独立して、H又はアルキルである、請求項18に記載の化合物。
  22. R1が-CH3である、請求項21に記載の化合物。
  23. R2a及びR2bの一方が、-(CH2)nC(O)-である、請求項18に記載の化合物。
  24. R2a及びR2bの両方が、-(CH2)nC(O)-である、請求項18に記載の化合物。
  25. R3がHである、請求項18に記載の化合物。
  26. 各R4が、独立して、H又は-C(O)R8である、請求項18に記載の化合物。
  27. R8が-NHC(O)R9により場合により置換されているアルキルである、請求項26に記載の化合物。
  28. R9が、H又は-NH2である、請求項27に記載の化合物。
  29. Figure 2014522882
    Figure 2014522882
    からなる群から選択される、請求項18に記載の化合物。
  30. R3及びR4が、それぞれ独立して、-CR6R7R8、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、又は-(CO)R8であり、R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている、請求項1に記載の化合物。
  31. R3及びR4が、それぞれ-C(O)R8である、請求項30に記載の化合物。
  32. R8が、-NHC(O)NH2、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖のどちらか一方により置換されているアルキルである、請求項31に記載の化合物。
  33. R8がヘキソースにより置換されているアルキルである、請求項32に記載の化合物。
  34. ヘキソースがグリコシルである、請求項33に記載の化合物。
  35. R8が、-[CH2]n4NHC(O)R9又は-[CH2]n4C(O)(NH)R9である、請求項30に記載の化合物。
  36. R9が、-OH、フェニル、フェノール、及びカルボキシフェニルからなる群から選択される1つ以上の置換基により置換されているアルキル又はアリールである、請求項35に記載の化合物。
  37. R3及びR4の少なくとも1つが、
    Figure 2014522882
     からなる群から選択される、請求項30に記載の化合物。
  38. 式I"の化合物である、請求項1に記載の化合物。
  39. 式I"aの化合物
    Figure 2014522882
     である、請求項38に記載の化合物。
  40. R1が、H又はアルキルであり、R1'が存在しないか又はHである、請求項38に記載の化合物。
  41. R1が-CH3である、請求項40に記載の化合物。
  42. R2が-(CH2)nC(O)R5である、請求項38に記載の化合物。
  43. R3がHである、請求項38に記載の化合物。
  44. R4がHである、請求項38に記載の化合物。
  45. R5が-OH又は-OCHR6R7である、請求項38に記載の化合物。
  46. R6及びR7が、それぞれ独立して、アルキル又はアリールであり、前記アルキル又はアリールは、-OR8、-C(O)R8及び-NHC(O)R8からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている、請求項45に記載の化合物。
  47. R8が存在し、H、-OH、-NH2、アルキル、プリン、又はピリミジンであり、前記アルキル、プリン、又はピリミジンは、-COOH、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されている、請求項45に記載の化合物。
  48. Figure 2014522882
     からなる群から選択される、請求項38に記載の化合物。
  49. 式Iの単離化合物
    Figure 2014522882
     (式中、
    R1は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R1'は、存在しない、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R2は、式の部分
    Figure 2014522882
     (式中、
    各R1は、独立して、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、又はハロアルケニルであり、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R5は、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
    ここで、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    n1、n2、及びn3は、それぞれ独立して、0〜30の整数であり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    n1、各n2、及び各n3の合計は、1〜30である)
    であり、
    R3及びR4は、それぞれ独立して、H、-CR6R7R8、-C(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR5に連結している結合であり、
    ここで、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    各R5は、独立して、H、-OH、-OR6、-OCR6R7R8、-CR6R7R8、-NH2、-NHR6、-NR6R7、-CR6R7C(O)NHR8、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アシル、アミノ酸、ヌクレオシド、5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖、又は式Iの別のユニットのR3若しくはR4に連結している結合であり、
    ここで、
    R6及びR7は、それぞれ独立して、H、-CR3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルであり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、又はシクロアルケニルは、-OR8、-C(O)R8、-NHC(O)R8、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数であり、
    R8は、H、-C(R)3、-[C(R)2]n4NHC(O)R9、-[C(R)2]n4C(O)(NH)R9、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR9、-C(O)R9、-NHC(O)R9、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、及び5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖からなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、
    ここで、
    各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    R9は、H、-C(R)3、-OR、-N(R)2、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、ハロアルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は5個若しくは6個の炭素原子を有する単糖であり、前記アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、プリン、ピリミジン、又は単糖は、-C(R)3、-OR、-C(O)R、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、及びシクロアルキルからなる群から独立して選択される1つ以上の置換基により場合により置換されており、各Rは、独立して、H、ハロゲン、アルキル、又はアルケニルであり、
    n4は、1〜30の整数である)
    であって、
    但し、ascr#1、ascr#2、ascr#3、ascr#4、ascr#5、ascr#6.1、ascr#6.2、ascr#7、ascr#8、ascr#12、ascr#19、ascr#21、ascr#23、ascr#25、bhas#24、bhas#26、bhas#28、bhas#30、及びicas#9ではない、
    上記化合物。
  50. 少なくとも1つのヌクレオ塩基、
    少なくとも1つの脂肪酸、
    少なくとも1つのアミノ酸、及び
    少なくとも1つの糖、
    を含み、
    前記少なくとも1つのヌクレオ塩基、少なくとも1つの脂肪酸、少なくとも1つのアミノ酸、及び少なくとも1つの糖が、共有結合により連結されている、
    単離化合物であって、
    約2,000g/mol未満の分子量を有している、
    上記化合物。
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