CN103958538A - 控制线虫的小分子化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及参与线虫信号的化合物。

Description

控制线虫的小分子化合物
本申请要求享有2011年8月8日提交的美国临时申请序号61/521,295、2012年4月4日提交的美国临时申请序号61/620,348的权益，各自在此全文引入作为参考。
本发明是由国家卫生研究院（National Institutes of Health）给予的第GM088290、GM085285、和T32GM008500号资助的美国政府支持下作出的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明涉及参与线虫信号的小分子化合物。
发明背景
物种个体之间的交流依赖许多不同的感觉输入包括化学、机械、听觉或视觉线索（EDWARD O.WILSON,SOCIOBIOLOGY：THE NEWSYNTHESIS(25th anniv.ed.2000)）。化学信号或许是生物间最古老的交流形式（EDWARD O.WILSON,SOCIOBIOLOGY：THE NEW SYNTHESIS(25th anniv.ed.2000);Wyatt,Nature457:262–63(2009)），而且化学信号的分析和它们传递的行为对于理解内部和互相间特定相互作用的生态学和进化动力学具有重要意义。
以个体计数，线虫属于世界上最丰富的动物（SIEVERT LORENZEN：THE PHYLOGENETIC SYSTEMATICS OF FREELIVING NEMATODES(TheRay Society,London,1994)）。它们居住于硫磺沉积物、深海沟、哺乳动物、昆虫、植物、北极冰、和许多其它栖息地，使它们成为地球上最成功的动物类之一（Nussbaumer等，Aquat.Microb.Ecol.34:239–46(2004);ANDRASSY：EVOLUTION AS A BASIS FOR THESYSTEMATIZATION OF NEMATODES(Budapest,1976);Tietjen,Deep–Sea Res.36:1579–94(1989);Aben–Athar,Rev.Bras.Med.2:89–94(1951);Lutz,Weitere Mittheilungen3：425–28(1888);Blaxter,Science282:2041–46(1998)）。已经对许多线虫行为进行了研究，如在根、细菌、沙、琼脂和肠中寻找配偶（mate finding）（DONALD L.LEE：THE BIOLOGY OF NEMATODES(CRC Press,London,2002)）。关于线虫信息素系统了解得很少。尽管进行了许多尝试去鉴定线虫信息素（DONALD L.LEE：THE BIOLOGY OF NEMATODES(CRC Press,London,2002)），但只在极少数物种中成功鉴定（Jaffe等，J.Chem.Ecol.15:2031–43(1989);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Jeong,等，Nature433:541–45(2005);Butcher等，Nat.Chem.Biol.7:420–22(2007);Pungaliya等，PNAS19:7708–13(2009)）。
自由生活的线虫秀丽隐杆线虫（C.elegans）作为社会行为如觅食、种群密度感觉、交配和群聚的模型体系被广泛应用（de Bono&Maricq,Annu.Rev.Neurosci.28:451–501(2005))。昆虫致病性线虫（EPN），如异小杆线虫属种（Heterorhabditis spp.）和斯氏线虫属种（Steinernema spp.）是在共生细菌的帮助下杀死和消耗它们宿主的专性昆虫寄生虫（Kaya&Gaugler,Annu.Rev.Entomol.38:181–206(1993)）。秀丽隐杆线虫（C.elegans）典型地见于腐烂的植物材料中（Barriere&Felix,Curr.Biol.15:1176–84(2005)）。在标准实验室条件下它在3.5天内完成其生命周期。当条件对正常的生长发育不利时，如高温、高密度、或低食物可利用，它形成休眠期幼虫（可替代的第三幼虫）。这种特殊化的生命期，不需进食并能耐抗应激条件（Golden&Riddle,Dev.Biol.102:368–78(1984);Golden&Riddle,Science218:578–80(1982);Golden&Riddle,PNAS81:819–23(1984)），类似于昆虫致病性线虫的IJs和植物寄生的大豆根结线虫的第二期幼体（J2）（Paul De Ley：A Quick Tour of Nematode Diversity和The Backbone of Nematode Phylogeny(WormBook,ed.The C.elegans Research Community,2006)）（根结线虫属（Meloidogynespp）），它们同样适应于经历对正常的生长发育不利的生存条件。在食物资源耗尽时或当过度拥挤时，昆虫致病性线虫的感染幼体（IJs）和自由生活线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的休眠期幼虫表现出分散行为（Golden&Riddle,Dev.Biol.102:368–78(1984);Rolston等，J.Nematol.38:221–28(2006);Abebe等，J.Exp.Biol.213:3223–29(2010)）。
关于秀丽隐杆线虫（C.elegans），从早期的幼虫期（L1）进入休眠期（dauer stage）可通过信息素称为daumone调节（Jeong等，Nature433:541–45(2005)）。鉴定daumone之后，在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中发现了许多相关的化合物（Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Butcher等，PNAS105:14288–92(2008);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Butcher等，Org.Lett.11:3100–03(2009);Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134(3):1817–24(2012)）。所有这些化合物含不寻常的二脱氧糖（dideoxysugar）蛔糖并总称为蛔苷。
秀丽隐杆线虫（C.elegans）的研究表明此类小分子信息素调节性别特异性吸引、排斥、群聚、嗅觉可塑性、和进入休眠期（一种抗应激的生活期），共同证实蛔苷传递许多秀丽隐杆线虫（C.elegans）行为（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Macosko等，Nature458:1171–75(2009);Yamada等，Science329:1647–50(2010);Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)）。由于在任何其它动物门中还没有发现蛔苷（Bartley等，J.Nat.Prod.59(10):921–26(1996)），蛔苷可能包含可调节多种线虫物种的重要暗示（cues）的线虫特异性化学编码。尽管它们对于秀丽隐杆线虫（C.elegans）生物学的许多方面很重要，然而，对蛔苷结构、生物合成、和恒稳态、以及它们可生产和/或影响其它线虫将程度的认识，仍然不完全。
本发明旨在克服技术上的这些缺陷及其它缺陷。
发明概要
本发明的一方面涉及分离的式I化合物：
其中：
R1为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R1′为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R2为下式的部分
其中：
每个R1独立地为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
n1、n2、和n3各自独立地为0至30的整数；
n4为1至30的整数；且
n1的总和、每个n2、和每个n3为1至30；
R3和R4各自独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R5连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
每个R5独立地为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
条件是化合物不是ascr#1，ascr#2，ascr#3，ascr#4，ascr#5，ascr#6.1，ascr#6.2，ascr#7，ascr#8，ascr#12，ascr#19，ascr#21，ascr#23，ascr#25，bhas#24，bhas#26，bhas#28，bhas#30，或icas#9。这些分离的化合物包括式I′和式I″的化合物：
本发明的另一方面涉及包含至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖的分离的化合物。所述至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖通过共价键连接。所述化合物具有低于约2,000g/mol的分子量。
附图简述
附图1A–E显示吲哚蛔苷吸引秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体和雄性。附图1A为用于测量蠕虫中吸引行为的生物测定的图示。区域A为施用样品或对照液的区域。X表示试验蠕虫的初始位置。附图1B为象限趋化性检测的图示。X表示在检测开始时放置洗过的蠕虫的点。象限板的阴影区域表示含有化学品的琼脂，而白色区域表示对照琼脂。每个象限中的动物数在30分钟之后计数并计算趋化性指数（参见实施例9）。示意图的趋化性指数为0.84。附图1C显示icas#1、icas#3和icas#9对这两种秀丽隐杆线虫（C.elegans）性别有吸引性。所有三种化合物均采用N2两性体和him–5雄性在1pmol下试验。开放条：无化合物（溶剂载体）的对照。附图1D为在点吸引检测中N2两性体和him–5雄性对icas#3反应的剂量依赖性图（＊p<0.01，＊＊p<0.001，＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对t检验）。附图1E为在象限趋化性检测中icas#3对N2两性体吸引的剂量依赖性图（以Dunnett氏事后检验将单因素ANOVA，＊＊p<0.01）。
附图2A–E证实N2两性体中对icas#3的反应由ASK感觉神经元和下游AIA中间神经元介导。附图2A为ASK感觉神经元与其它神经元的连接性的图示。ASK的主要突触输出为AIA中间神经元。附图2B显示两性体对icas#3的吸引依赖于ASK感觉神经元和AIA中间神经元。RMG中间神经元的切除不影响icas#3对N2或ncs–1::gfp两性体的吸引（＊p<0.01，＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对Student氏t检验）。附图2C为在低蠕虫密度下（每个板20只蠕虫）N2和切除ASK的两性体的群聚图。切除ASK的蠕虫应对icas#3不群聚。icas#3诱导AIA中间神经元中的G–CaMP荧光信号（附图2D）。着色的痕迹代表在暴露于1μM icas#3时动物个体的AIA神经元中的荧光变化。黑色痕迹代表在暴露于缓冲液时动物个体的荧光变化。灰色阴影表示存在icas#3，n=10只动物。附图2E为暴露于缓冲液或icas#3的动物中的平均AIA荧光变化图（＊＊p<0.01，以Welch氏校正的非配对Student氏t检验）。误差条线表示平均标准误差（S.E.M）。
附图3A–D显示群居和独居的野生型两性体被icas#3吸引，但不被非吲哚蛔苷吸引。在点吸引检测中独居和群居的野生型两性体不被生理学的ascr#2、3、5混合物吸引，与npr–1（ad609）突变体蠕虫相反（附图3A）（＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对t检验）。在象限趋化性检测中，来自所有试验菌株的两性体均被1pM icas#3吸引和被非吲哚蛔苷的生理学混合物（10nM ascr#2、3、5）排斥，除npr–1（ad609）突变体蠕虫以外，其也被ascr#2、3、5混合物吸引（附图3B）（在30分钟之后的趋化性（对于在15分钟时的趋化指数，参见附图5C）。附图3C为在象限趋化性检测中icas#3对群居的两性体吸引的剂量依赖性图。附图3B–C:＊p<0.05，＊＊p<0.01,以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA。附图3D显示在点吸引检测中群居的野生型两性体和npr–1（ad609）突变体蠕虫被icas#3吸引（＊＊p<0.001，＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对t检验）。
附图4A–C涉及信号分子的模块化语言的显现模型。附图4A显示icas#3和ascr#3对于N2两性体是竞争性信号。120fmol ascr#3和10fmol icas#3的混合物（条件1）吸引蠕虫至区域A，而较大量的相同比例的混合物（条件2；12pmol ascr#3和1pmol icas#3）阻止蠕虫到区域A相反吸引至周边（区域B和C）。在以条件2进行的实验中，仅一只蠕虫进入处理的区域A，而31只蠕虫进入对照区域A（＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对t检验）。附图4B显示非吲哚蛔苷的增效混合物在纳摩尔至微摩尔级浓度下诱导和在皮摩尔至纳摩尔浓度下起雄性吸引剂作用，而吲哚蛔苷icas#3和icas#9在飞摩尔至皮摩尔浓度下起两性体吸引剂和群聚信号的作用。附图4C显示秀丽隐杆线虫（C.elegans）信号分子的模块化装配，基于由色氨酸（“头基团”）、脂肪酸（“脂质侧链”）、对氨基苯甲酸（PABA，“末端”）、和碳水化合物代谢（“蛔糖”）衍生来的结构单元。
附图5A–B显示吲哚蛔苷是两性体强吸引剂。在点吸引检测中，N2两性体被低浓度的icas#9强烈吸引，而雄性不被吸引（＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对Student氏t检验）（附图5A）。附图5B为在含或不含食物的含有1pM icas#3的板上N2和CB4856两性体的象限趋化指数图。在象限趋化性检测中，来自所有试验菌株的两性体均被1pM icas#3吸引和被非吲哚蛔苷的生理学混合物（ascr#2、3、5各10nM）排斥，除npr–1（ad609）突变体蠕虫以外，其也被ascr#2、3、5混合物吸引（附图5C）（在15分钟之后的趋化性（对于在30分钟时的趋化指数，参见附图3B），＊p<0.05，＊＊p<0.01,以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA）。
附图6A–E涉及响应icas#3的群聚和运动的变化。附图6A显示在低蠕虫密度下（每个5cm板20只蠕虫）在icas#9板上独居和群居的两性体的群聚行为（＊p<0.05，＊＊p<0.01，以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA）。附图6B显示在含有100fM或100pM的icas#3的板上him–5雄性的群聚（＊＊p<0.01，以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA）。附图6C显示在点吸引检测中daf–22两性体被icas#3吸引（＊p<0.01，＊＊p<0.01，＊＊＊p<0.0001，以Welch氏校正的非配对Student氏t检验）。附图6D显示在不同的icas#3浓度下N2两性体的前进速度（在蠕虫前进过程中蠕虫的速度）。附图6E显示在不同的icas#3浓度下N2两性体的每分钟反转数。附图6D–E：＊p<0.05，＊＊p<0.01，以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA。
附图7A–B显示ASK切除影响两性体的icas#3–依赖性运动行为。切除ASK的两性体在暴露于icas#3时没有表现前进速度降低（附图7A）。切除ASK的蠕虫响应icas#3的反转频率不增加（附图7B）。＊＊p<0.001，以Welch氏校正的非配对t检验）。
附图8A–D显示吲哚蛔苷在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中介导群聚行为。附图8A显示在不同浓度的icas#3时在低蠕虫密度下（每个板20只蠕虫）独居和群居的两性体的群聚行为。附图8B显示在不同浓度的icas#3时在高蠕虫密度下（每个板～120只蠕虫）独居和群居的两性体的群聚行为。附图8C显示在两种不同浓度的icas#3时在低蠕虫密度下daf–22两性体的群聚。附图8D显示在不同的icas#3浓度下N2两性体的平均停止持续时间（stopped duration）。附图8A–D：＊p<0.05，＊＊p<0.01，以Dunnett氏事后检验的单因素ANOVA。
附图9A–G涉及作为daf–22–依赖性代谢产物的吲哚蛔苷的鉴定。附图的9A显示重要的蛔苷的化学结构（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）。附图9B为2D–NMR光谱差示分析（DANS）的图示。野生型核磁共振光谱与daf–22突变体核磁共振光谱的比较使能够检测可能代表daf–22–依赖性信号分子的光谱信号。附图9C为用于DANS的实际的野生型和daf–22核磁共振光谱的小截面。吲哚羧酸的信号在这两个光谱中都存在（在每个板中的左框），而另一吲哚–衍生的信号（在每个板中的右框）只存在于野生型中，但在daf–22光谱中不存在。（附图9D为基于HPLC–MS的野生型和daf–22代谢产物组的比较。野生型所得到的离子色谱图显示了五个不同吲哚蛔苷的分子离子峰，其是daf–22色谱图所没有的。附图9E显示已鉴定的吲哚蛔苷的结构。附图9F显示在此研究中其它已鉴定的非吲哚蛔苷的结构。附图9G为生长在液体培养物中的秀丽隐杆线虫（C.elegans）N2分泌的吲哚蛔苷icas#3和icas#9和非吲哚蛔苷ascr#3和ascr#9的相对含量图，通过对培养基提取物进行HPLC–MS分析测定（标准化至ascr#3的浓度；n=5，±SEM）。对于吲哚和非吲哚蛔苷的质谱定量，使用真实参考化合物的标准混合物。
附图10含有daf–22依赖性吲哚衍生物的野生型（N2）代谢产物组级分的dqfCOSY核磁共振光谱（CDCl3，600MHz）的中心部分（框）。
附图11A–C为合成的icas#3的1H核磁共振光谱（CD3OD，600MHz）（附图11A），1H，13C–HSQC光谱（CD3OD，600MHz）（附图11B），和1H，13C–HMBC光谱（CD3OD，600MHz）（附图11C）。
附图12A–E涉及吲哚蛔苷的HPLC–MS鉴定。它们分别显示icas#9、icas#7、icas#1、icas#3、和icas#10的电喷雾离子化MS光谱（负离子模式）。
附图13A–H涉及吲哚蛔苷的生物合成来源的HPLC–MS分析。它们分别显示用1:1的L–[2,4,5,6,7–D5]–色氨酸和L–色氨酸的混合物在CeMM培养基中培养的秀丽隐杆线虫（C.elegans）的全身提取物的HPLC–MS离子色谱图（采用负离子电喷雾离子化和单离子记录模式），显示icas#9（附图13A–B）、icas#1（附图13E–F）、icas#3（附图13C–D）、和icas#10（附图13G–H）的[D5]–和[H]–同位素。
附图14A–B也显示在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中吲哚蛔苷介导群聚行为。附图14E显示与在对照板上的行为比较在含有10pM的icas#3板上N2两性体（每个板20只蠕虫）的群聚（箭头）。附图14F显示与在对照板上的行为比较在含有1pM的icas#3板上N2两性体（每个板～120只蠕虫）的群聚。
附图15A–B为5–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)戊酸甲酯的1H核磁共振光谱（附图15A）和13C核磁共振光谱（附图15B）(3)。1H NMR:400MHz，丙酮–d6;13C NMR:100MHz，丙酮–d6。
附图16A–B为5–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)戊酸（oscr#9）的1H核磁共振光谱（附图16A）和13C核磁共振光谱（附图16B）。1H NMR:400MHz，甲醇–d4);13C NMR:100MHz，甲醇–d4。
附图17A–B为9–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬酸甲酯（5）的1H核磁共振光谱（附图17A）和13C核磁共振光谱（附图17B）。1H NMR:400MHz，丙酮–d6;13C NMR:100MHz，丙酮–d6。
附图18A–B为9–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬酸（oscr#10）的1H核磁共振光谱（附图18A）和13C核磁共振光谱（附图18B）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;13C NMR:100MHz，甲醇–d4。
附图19为(8R)–羟基–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷基氧基壬酸乙酯（9）的1H核磁共振光谱(500MHz，氯仿–d1)。
附图20为(8R)–(3′R，5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基壬酸乙酯（10）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图21A–D为(8R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基壬酸（bhas#10）的1H核磁共振光谱（附图21A）、13C核磁共振光谱（附图21B）、HSQC光谱（附图21C）、和HMBC光谱（附图21D）。1H NMR:500MHz，甲醇–d4;13C NMR:125MHz，甲醇–d4;HSQC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4;HMBC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4。
附图22A–B为(8R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–1–烯（12）的1H核磁共振光谱（附图22A）和13C核磁共振光谱（附图22B）。1H NMR:400MHz，丙酮–d6;13C NMR:100MHz，丙酮–d6。
附图23为(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷基氧基十三–5–烯酸乙酯（13）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图24为(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十三烷酸乙酯（14）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图25为(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十三烷酸乙酯（15）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图26A–D为(12R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十三烷酸（bhas#22）的1H核磁共振光谱（附图26A）、dqfCOSY光谱（附图26B）、HSQC光谱（附图26C）、和HMBC光谱（附图26D）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4;HSQC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4;HMBC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4。
附图27A–B为11–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)十一–1–烯（17）的1H核磁共振光谱（附图27A）和13C核磁共振光谱（附图27B）。1H NMR:400MHz，丙酮–d6;13CNMR:100MHz，丙酮–d6。
附图28为15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十五–5–烯酸乙酯（18）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图29为15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十五烷酸乙酯（19）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图30为15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十五烷酸乙酯（20）的1H核磁共振光谱(400MHz，氯仿–d1)。
附图31A–D为15–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十五烷酸（bhos#26）的1H核磁共振光谱（附图31A）、dqfCOSY光谱（附图31B）、HSQC光谱（附图31C）、和HMBC光谱（附图31D）。1H NMR:400MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4;HSQC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4;HMBC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4。
附图32A–D为9–(5′R–(1H–吲哚–3–羰基氧基)–3′R–羟基–6′S–甲基–四氢–(2H)–吡喃–2′–基氧基)壬酸（icos#10）的1H核磁共振光谱(图32A）、dqfCOSY光谱（图32B）、HSQC光谱（图32C）、和HMBC光谱（图32D）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4;HSQC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4;HMBC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4。
附图33A–B为4–叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酸（22）的1H核磁共振光谱（附图33A）和13C核磁共振光谱（附图33B）。1H NMR:400MHz，氯仿–d1;13C NMR:100MHz，氯仿–d1。
附图34A–C为(8R)–(3′R–羟基–5′R–(4–羟基苯甲酰氧基)–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–(2E)–烯酸（hbas#3）的1H核磁共振光谱（附图34A）、dqfCOSY光谱（附图34B）、和HMBC光谱（附图34C）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4;HMBC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4。
附图35A–B为(8R)–(3′R–羟基–5′R–(E)–(2–甲基丁–2–烯酰氧基)–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–(2E)–烯酸（mbas#3）的1H核磁共振光谱（附图35A）和dqfCOSY光谱（附图35B）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4。
附图36A–D为2–(8R)–(3′R,5′R–二–羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬酰–3,4,5–三羟基–6–羟甲基–(2H)–四氢吡喃（glas#10）的1H核磁共振光谱（附图36A）、dqfCOSY光谱（附图36B）、HMQC光谱（附图36C）、和HMBC光谱（附图36D）。1H NMR:600MHz，甲醇–d4;dqfCOSY:600MHz，甲醇–d4;HMQC:600MHz对应1H,151MHz对应13C，甲醇–d4;HMBC:600MHz，甲醇–d4。
附图37A–K显示下列HPLC–ESI–MS数据：(ω–1)–氧化的蛔苷（ascr）（附图37A），(ω)–氧化的蛔苷(oscr)（附图37B），(ω–1)–氧化的β–羟基蛔苷（bhas）（附图37C），(ω)–氧化的β–羟基蛔苷(bhos)（附图37D），(ω–1)–氧化的吲哚蛔苷（icas）（附图37E），(ω)–氧化的吲哚蛔苷（icos）（附图37F），(ω–1)–氧化的吲哚β–羟基蛔苷（ibhA）（附图37G），(ω)–氧化的吲哚β–羟基蛔苷(ibho)（附图37H），葡糖基蛔苷酯（glas）（附图37I），ascr#8和4–(4–羟基苯甲酰基)–和4–(2–(E)–甲基–2–丁烯酰基)–蛔苷（hbas和mbas）（附图37J），和ascr#2和ascr#6.1（附图37K）。＊=采用合成的标准品证实；$SMID：对经鉴定源自秀丽隐杆线虫（C.elegans）及其它线虫的小分子的小分子鉴定符（Small Molecule IDentifier）。SMID数据库（www.smid–db.org）为由在Boyce Thompson Institute的Frank C.Schroeder和Lukas Mueller与Wormbase（www.wormbase.org）合作维护的电子资源。此数据库的目的是要引入所有从秀丽隐杆线虫（C.elegans）及其它线虫中新鉴定的小分子的可检索的、基因–型标识符、“SMIDs”。
附图38显示在秀丽隐杆线虫（C.elegans）的野生型和突变体排泌组提取物中已鉴定的蛔苷的洗脱图（Δ表示含(E)–构型α,β–不饱和侧链的组分）。
附图39A–B为由野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）培养基提取物的mbas#3–富集级分（附图39A）和合成的mbas#3（附图39B）的dqfCOSY光谱部分（600MHz，甲醇–d4），显示蛔糖环和侧链的甲基基团（蓝色）、惕各酸单元的烯丙基的甲基基团（红色）的特征信号、和侧链双键的pH依赖性信号（绿色）。
附图40A–B为由野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）培养基提取物的hbas#3–富集级分（附图40A）和合成的hbas#3（附图40B）的dqfCOSY光谱部分（600MHz，甲醇–d4），显示蛔糖环和侧链的甲基基团（蓝色）、对位取代的4–羟基苯甲酰基单元（红色）、和侧链双键的（绿色）的特征信号。
附图41A–B为由野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）培养基提取物的hbas#3–富集级分（附图41A）和合成的hbas#3（附图41B）的dqfCOSY光谱放大部分（600MHz，甲醇–d4），显示蛔糖环的甲基基团（蓝色）、和蛔糖自旋系统（黑色）的特征信号。
附图42为自acox–1(ok2257)培养基提取物的oscr#9–富集级分的dqfCOSY光谱（600MHz，甲醇–d4）。
附图43A–B为自acox–1(ok2257)蠕虫沉淀（pellet）提取物的glas#10富集级分（附图43A）和合成的glas#10（附图43B）的dqfCOSY光谱（600MHz，甲醇–d4）部分，显示蛔糖环和侧链的甲基基团（蓝色）、葡萄糖单元的异构氢（红色）、葡萄糖自旋系统（绿色）、和蛔糖自旋系统（黑色）的特征信号。
附图44A–P为蛔苷标准品的MS/MS产物离子光谱。ascr#5显示蛔糖的m/z147[C6H11O4]和C3–侧链和/或相同分子组成的蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73（附图44A）。oscr#9（附图44B）和ascr#9（附图44C）显示C5–侧链的m/z99[C5H7O2]、m/z147[C6H11O4]、和蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73。ascr#7显示C7–侧链的m/z125[C7H9O2]，m/z111[C6H7O2]和蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73（附图44D）。ascr#1显示C7–侧链的m/z127[C7H11O2]和蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73（附图44E）。ascr#3显示m/z111[C6H7O2]和蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73（附图44F）。ascr#10（附图44G）和oscr#10（附图44H）显示C9–侧链的m/z173[C9H15O3]和155[C9H13O2]和蛔糖衍生的C3O2H5碎片的m/z73。β–羟基蛔苷如bhas#22（C13–侧链）（附图44I]）和bhos#26（C15–侧链）（附图44J]）分别显示在m/z185[C11H21O2]和m/z213[C13H25O2]下的侧链特定的碎片离子，其源于蛔糖的丢失和乙酸。此外，bhas#22和bhos#26显示乙酸酯的在m/z59[C2H3O2]下的强产物离子、以及蛔糖衍生的C3O2H5碎片的在m/z73下的诊断性离子。吲哚蛔苷如icas#9（附图44K]）和icas#1（附图44L]）分别显示在m/z247[C11H19O6]和m/z275[C13H23O6]下的相应蛔苷的侧链特定的碎片离子，其源于吲哚羰基单元[C9H5NO]的丢失。此外，icas#9和icas#1显示吲哚羧酸酯离子的m/z160[C9H6NO2]。吲哚蛔苷的蛔苷产物离子显示相当于非吲哚蛔苷的碎裂模式的其它碎片离子，如蛔糖衍生的C3O2H5碎片的在m/z73下的诊断性碎片离子。icas#3（附图44M])显示来自吲哚羰基单元[C9H5NO]丢失的m/z301[C15H25O6]，与吲哚羧酸酯离子的m/z160[C9H6NO2]一起。mbas#3（附图44N])显示m/z301[C15H25O6]和m/z283[C15H23O5]，其分别源于惕各酰[C5H6O]和惕各酸根[C5H8O2]单元的丢失。此外，mbas#3显示惕各酸离子的m/z99[C5H7O2]。蛔糖衍生的C3O2H5碎片在m/z73下的诊断性碎片离子是低强度的。hbas#3（附图44O])显示m/z301[C15H25O6]，其源于羟基苯甲酰基单元[C7H4O]的丢失。此外，hbas#3显示羟基苯甲酸酯和苯酚离子的m/z137[C7H5O3]和m/z93[C6H5O]。蛔糖衍生的C3O2H5碎片在m/z73下的蛔苷诊断性碎片离子是低强度的。PABA连接的ascr#8（附图44P]）分别显示PABA和酰基苯胺离子的在m/z136[C7H6NO2]和m/z92[C6H6N]下的特征碎片离子，与蛔糖衍生的C3O2H5碎片的在m/z73下的诊断性碎片离子一起。
附图45显示采用ClustalW进行的人MFE–2亚型2（NP_000405.1）与秀丽隐杆线虫（C.elegans）MAOC–1（NP_495494.1（红色））和DHS–28（NP_509146.1；氧化还原酶结构域（绿色）、SCP–2固醇载体蛋白结构域（黄色））的排列。构成催化部位的氨基酸以绿色和红色框标记，过氧化物酶体靶向信号为黑色。相同氨基酸以灰色标记，相似的氨基酸以浅灰色标记。
附图46A–C涉及秀丽隐杆线虫（C.elegans）中新蛔苷的鉴定。附图46A为野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）排泌组的LC–MS总离子流（TIC）色谱图（ESI–）。附图46B显示蛔苷的MS/MS碎片。附图46C为野生型排泌组的LC–MS/MS筛选（m/z73的前体），揭示已知的蛔苷（黑色），新同系物（C4、C6、C8、C11和C12），新(ω)–氧化的异构体（C5ω、C9ω和C11ω）和新4′–酰化衍生物（hbas#3和mbas#3）（＊非蛔苷）。高极性ascr#5在6.5min时洗脱，在显示的保留时间范围之外。
附图47A–C显示在野生型、acox–1、maoc–1、dhs–28和daf–22蠕虫中通过LC–MS/MS鉴定的蛔苷。附图47A显示(ω–1)–氧化的蛔苷，附图47B显示(ω)–氧化的蛔苷，和附图47C显示4′–酰化的衍生物的实例。关于146种表征的蛔苷的合成和完整列表，未合成的化合物的立体化学的设想，基于类似物和HPLC–MS保留时间的显示（参见附图38）。
附图48A–B涉及吸引至hbas#3。在点吸引检测中野生型（N2）两性体以剂量依赖性方式被hbas#3吸引（附图48A）。附图48B显示在象限趋化性检测中hbas#3对野生型两性体吸引的剂量依赖性。
附图49A–B涉及蛔苷生物发生。附图49A显示在蛔苷的生物合成中过氧化物酶体β–氧化酶ACOX–1、MAOC–1、DHS–28、和DAF–22的所设想的作用。附图49B显示acox–1、maoc–1、dhs–28、和daf–22突变体等位基因的基因结构，显示点突变（垂直条）和缺失（水平条）。
附图50A–E显示在含饱和（蓝色）、α,β–不饱和（红色）、和β–羟基化（绿色）侧链的野生型（附图50E）和β–氧化突变体（acox–1（附图50A）、maoc–1（附图50B）、dhs–28（附图50C）、和daf–22（附图50D）中(ω–1)–氧化蛔苷的量。
附图51显示采用ClustalW进行的含其它过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶的秀丽隐杆线虫（C.elegans）ACOX–1亚型a.1的排列。相同氨基酸以灰色标记，相似的氨基酸以浅灰色标记，过氧化物酶体靶向信号以黑色标记。
附图52A–B显示在野生型（N2）（附图52A）和acox–1突变体（附图52B）(也参见附图53A–E）中(ω)–氧化的蛔苷的量。
附图53A–E为在野生型（附图53A）和β–氧化突变体(acox–1（附图53B）、maoc–1（附图53C）、dhs–28（附图53D）、daf–22（附图53E）中(ω)–氧化蛔苷的特性，显示饱和(蓝色)、α,β–不饱和(红色)、和β–羟基化(绿色)的蛔苷。(关于(ω–1)–氧化蛔苷，参见附图50A–E）。
附图54A–B涉及吲哚蛔苷的生物合成。在acox–1中(ω–1)和(ω)–氧化的C5–蛔苷ascr#9和oscr#9及其相应的吲哚蛔苷icas#9和icos#9以acox–1的相对丰度表明吲哚–3–羰基连接具有高度特异性（附图54A）。附图54B包括在用ascr#10和oscr#10的1:1的混合物温育之后daf–22（m130）排泌组的LC–MS离子痕迹，显示优先进行吲哚–3–羰基与(ω–1)–氧化的ascr#10的连接。
附图55显示在野生型排泌组提取物中蛔苷ascr#3和ascr#9及其相应的吲哚蛔苷icas#3和icas#9的相对丰度，表明吲哚连接高度依赖于侧链长度。
附图56A–B涉及蛔苷特性。蠕虫体蛔苷特性的分析（附图56A）揭示蛔苷葡糖苷（例如glas#10）且表明优先排泌不饱和蛔苷。在dhs–28突变体排泌组中(ω–1)与(ω)–连接的饱和蛔苷之比（附图56B）显示对营养条件的强烈依赖（关于β–羟基蛔苷参见附图59A–C），反映在野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）中ascr#3/ascr#5比例的饥饿依赖性（参见附图60）（Welch氏t检验，＊:p<0.05;＊＊P<0.001）。
附图57A–C为acox–1(ok2257)蠕虫体提取物的LC–MS/MS（m/z=73的前体离子），显示葡萄糖基酯glas#10、glas#18、和glas#22和相应的非葡糖基化的蛔苷ascr#10、ascr#18、和ascr#22。
附图58显示野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）的(ω)–氧化蛔苷的有差异的排泌（关于(ω–1)–氧化蛔苷参见附图56A）。
附图59A–C显示dhs–28（hj8）突变体蠕虫中(ω–1)与(ω)–连接的蛔苷的比例并显示对营养条件的强烈依赖。附图59A为dhs–28（hj8）排泌组提取物中β–羟基蛔苷的比例。附图59B为dhs–28（hj8）蠕虫体提取物中β–羟基蛔苷的比例。附图59C为dhs–28（hj8）蠕虫体提取物中饱和蛔苷的比例（dhs–28（hj8）排泌组提取物中的饱和蛔苷如图56B所示）。
附图60显示在野生型排泌组中ascr#3/ascr#5比的饥饿依赖性。
附图61A–B涉及蛔苷的生物发生。附图61A显示由氨基酸（绿色）、脂肪酸（蓝色）、和碳水化合物（红色）结构单元模块化装配蛔苷。附图61B显示蛔苷生物发生的模型。脂肪酸的链延长（通过推定的延长酶同系物elo–1–925）（Agbaga等，PNAS105:12843–48(2008)，在此全文引入作为参考）之后进行VLCFAs的(ω–1)–或(ω)–氧化和蛔糖连接。产生的VLCAs进入经ACOX–1、MAOC–1、DHS–28和DAF–22的过氧化物酶体β–氧化产生短链蛔苷，其与氨基酸–衍生的部分及其它结构单元连接。
附图62为采用ClustalW进行的假结核耶尔森氏菌（Yersiniapseudotuberculosis）CDP–3、6–双脱氧–D–甘油基–D–甘油基–4–己酮糖–5–表异构酶或ascE(AAA88702.1)与秀丽隐杆线虫（C.elegans）同系物C14F11.6（CCD64543.1）的排列。相同氨基酸以灰色标记，相似的氨基酸以浅灰色标记。
附图63A–D涉及夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）的定量和对秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物的反应。附图63A显示关于分散混合物的蛔苷的结构。附图63B显示运用Image J.对分散秀丽隐杆线虫（C.elegans）的定量（第二根柱显示反转的图片而第三根柱显示计数的线虫）。附图63C显示单独的蛔苷对合成的混合物活性的贡献。ascr#2(3.68pmol/ul),ascr#3(0.165pmol/ul),ascr#8(0.25pmol/ul),和icas#9(0.005pmol/ul)。对每种处理进行七次实验。+，存在，–，不存在。Student氏t检验，未配对（p<0.05）。附图63D显示夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）对秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物的反应，显现在整个板内。
附图64A–D涉及分散检测。附图64A显示来自昆虫尸体的夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）的天然分散性侵染期幼虫（IJ）。附图64B显示放置在水中的琼脂板上的300个IJ。附图64C显示用水（对照）或昆虫尸体提取物处理的IJ。图像代表每种处理的六次实验。附图64D显示在相同板上的分散检测。图解代表两次实验。行为是温度和季节依赖性的。检测在室温（22±0.5℃）下或在温度控制的条件下进行。
附图65显示几种蛔苷的结构。
附图66A–E显示蛔苷混合物调节秀丽隐杆线虫（C.elegans）的分散行为，且分散混合物被其它线虫识别。附图66A显示分散混合物的鉴定。图像(～250只线虫)分别代表对照品（0.25％大肠杆菌（HB101））、含0.25％大肠杆菌（HB101）的合成混合物、和休眠期上清液的9、10、和11实验。附图66B显示采用Image J进行定量（http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html）。对照品对合成混合物的未配对Student氏t检验（p<0.02）。附图66C显示对昆虫致病性线虫或根结线虫感染的宿主尸体进行关于秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物组分的分析。附图66D显示夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）IJ（～250）对分散混合物的反应；每种处理进行四次实验。附图66E显示根结线虫J2s（南方根结线虫（M.incognita）、爪哇根结线虫（M.javanica）和M.floridensis的根结线虫属种混合物）对秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物的反应。数据分别代表对照水和秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物的19和20实验。在2h时，采用Student氏t检验，未配对，p<0.007。
附图67A–E显示夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）分散信息素的活性引导的分级。附图67A显示对昆虫尸体提取物的反相（C18）色谱级分的反应。图像代表两次独立实验。在检测中采用估算的生理学相关浓度；Frc，级分。附图67B涉及生理学相关浓度的在Frc A中发现的蛔苷(ascr#9，40.3pmol/μl和ascr#11，1.3pmol/μl)的试验。图像代表三次实验。附图67C显示ascr#2和ascr#9为结构类似物。将天然和合成的ascr#9与级分B和C组合进行试验。图像代表四次实验。附图67D显示ascr#11的结构。它（1.3pmol/μl）与级分B和C组合也足以产生分散。图像代表三次实验。
附图68A–C为级分A（附图68A–B）和级分B（附图68C）的LC–MS离子色谱图。第一板显示在m/z279下的ascr#11，第二板显示在m/z293下的ascr#9。
附图69显示在夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）发育过程中ascr#9和ascr#11的特性。对于每个时间点，通过LC–MS对六只昆虫尸体进行分析。对于0时间点，对4只未感染的幼虫进行分析。＊检测到但不可定量。
附图70显示ascr#9可替换秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物中的ascr#2的功能。给出了代表性的图片。采用0.25％大肠杆菌HB101的阴性对照（3次实验），秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物中的ascr#9替换（6次实验），和阳性对照：合成的混合物分散混合物（7次实验）和阳性对照休眠期液体培养物（3次实验）。
附图71A–B涉及种系发生相关的线虫物种的分散混合物。附图71A为昆虫致病性线虫、植物寄生的线虫类、和秀丽隐杆线虫（C.elegans）的系统演化树。该图根据秀丽隐杆线虫（C.elegans）和线虫的生物学绘制（PAUL DE LEY:A QUICK TOUR OF NEMATODEDIVERSITY和THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY(WormBook,ed.The C.elegans Research Community,2006)，在此全文引入作为参考）。红颜色表示属的实例。附图71B显示在斯氏线虫属种（Steinernema spp.）和异小杆线虫属种（Heterorhabditis spp.）的寄主昆虫尸体中存在ascr#9和ascr#11。对于每个物种，通过LC–MS对四只感染了斯氏线虫属种（Steinernema spp.）和异小杆线虫属种（Heterorhabditis spp.）两者的昆虫（蜡螟（G.mellonella））尸体分析ascr#9和ascr#11的特性。
附图72A–D显示(ω–1)–氧化的饱和蛔苷（附图72A）、(ω–1)–氧化的不饱和蛔苷（附图72B）、(ω)–氧化的饱和蛔苷（附图72C）、和吲哚蛔苷icas#9和ascr#2（附图72D）的结构和HPLC–ESI–MS数据。1SMID：经鉴定来自秀丽隐杆线虫（C.elegans）及其它线虫中的小分子的小分子鉴定符。
附图73显示蛔苷（ascr’s）和Ω–蛔苷（oscr’s）的HPLC保留时间。侧链在3–17碳的范围内，由对秀丽隐杆线虫（C.elegans）的野生型和过氧化物酶体β氧化突变体和合成的标准样品进行分析获得。
附图74A–B显示成虫格氏斯氏线虫（S.glaseri）的蠕虫水提取物中的蛔苷的鉴定。附图74A来自LC–MS/MS的总离子流（TIC）色谱图；对m/z73.0的前体离子的筛选揭示蛔苷信号。附图74B为来自LC–MS测量的ascr#9、ascr#12、ascr#1、和ascr#14的相应的离子痕迹。
附图75A–K为在蛔苷合成中的成分的核磁共振光谱，如下。
附图76A–D涉及蛔苷的结构（附图76A）、检测（附图76B–C）、和合成（附图76D）。蛔苷（ascr）和吲哚蛔苷（icas）为先前已经描述的在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中蛔苷。除(ω–1)–氧化的ascr之外，它们的(ω)–氧化异构体（oscr）在该HPLC–MS筛选中进行了鉴定。附图76B显示由自由生活的秀丽隐杆线虫（C.elegans）（混合期）、昆虫寄生的格氏斯氏线虫（S.glaseri）（成虫）、和大鼠寄生的巴西日圆线虫（N.brasiliensis）（成虫）获得的在调节的蠕虫水中的短链和中链蛔苷的HPLC–MS鉴定。秀丽隐杆线虫（C.elegans）渗出液的HPLC–MS分析显示已知的蛔苷(ascr#1，＃3，＃7，和icas#9)，与相应的同系物(ascr#9，＃10，＃12，＃14，和＃18)、和(ω)–氧化的异构体(oscr#9，＃10，＃18)一起。高极性ascr#5在6.5分钟时洗脱，在显示的保留时间范围之外。分子离子信号及其HPLC–保留时间的交叉物种对比表明秀丽隐杆线虫（C.elegans）大量产生的蛔苷也存在于许多其它线虫物种，包括格氏斯氏线虫（S.glaseri）和巴西日圆线虫（N.brasiliensis）（代表在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中也丰富的化合物的峰以蓝色显示）。附图76C显示P.strongyloides（混合期）和嗜菌异小杆线虫（H.bacteriophora）（成虫）中的中链和长链蛔苷的HPLC–MS鉴定。ascr#18（蓝色）由秀丽隐杆线虫（C.elegans）大量产生，而较长链的同系物（红峰）由P.strongyloides和嗜菌异小杆线虫（H.bacteriophora）大量产生，但秀丽隐杆线虫（C.elegans）不产生。附图76D显示(ω)–氧化的蛔苷，oscr#9和oscr#10的合成。
附图77为显示蛔苷由宽范围线虫物种产生的热地图。其基于来自蠕虫培养基样品的HPLC–MS分析结果，其中蠕虫培养基样品获自蠕虫在S Basal、ddH2O、或DMEM中数小时的温育。分别收集标明为侵染期幼虫（IJ）和成虫（A）的寄生物种；所有其它样品由混合期培养物获得。热地图中的颜色代表通过HPLC–MS检测到的蛔苷的相对丰度，如右边条形图所示。例如，在格氏斯氏线虫（S.glaseri）侵染期幼虫中检测到的蛔苷中，全部由5.7％ascr#11、92.2％ascr#9、2.1％ascr#12、和0.1％ascr#10构成。
附图78显示线虫仅对蛔苷调节的区域作出反应。给几种线虫物种就它们对三个浓度的合成蛔苷调节的区域的反应评分(每个评分区域，0.6μL的1nM、1μm、和1mM，分别相当于0.6fmol、0.6pmol、和0.6nmol)。将它们在调节的区域中的占位性与它们在对照区域中的占位性比较20分钟；每个试验10个个体。其中在以蛔苷调节的区域中明显花费较多时间的线虫的实验以绿色突出显示。其中在对照区域中明显花费较多时间的线虫的实验以红色突出显示，表明逃避蛔苷。与对水的反应比较计算每个值的误差条线、S.D.统计显著性，在每个组中显示第一个。采用非配对Student氏t检验测定P–值。＊＊P<0.01，＊P<0.05。
附图79涉及采用软件进行的逗留检测，所述软件检测两个区域中蠕虫存在并提供被蠕虫占据的每个评分区域的百分比的输出，其在整个试验过程中每秒计算一次。输出为两个评分区域的蠕虫占位比率相对时间的图（右边的板）。采用Bargmann等，Cell74:515–27(1993)描述的评分指数，在此全文引入作为参考。
附图80A–C涉及吸引检测。秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性证实了对不同的线虫物种和蛔苷有差别的远程吸引。秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性对同种的两性体的远程吸引通过给对两性体或在10cm琼脂板上蛔苷调节的点源的趋化性评分来证实（附图80A）。将两性体悬浮于M9缓冲液中并放置在琼脂板上的铜缸内6小时，之后将它们移除并加入麻痹试剂叠氮化钠。在对侧，在铜缸内用M9缓冲液对照进行相同的操作。将秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性放置在板的中心并让它们漫步直至它们在任何一点变得麻痹。然后计算采用Bargmann等，Cell.74:515–27(1993)中的（在此全文引入作为参考）吸引指数，比较在对照与指示（cue）区域内变麻痹的蠕虫。附图80B显示秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性被吸引至由50只同种两性体调节的点源。它们证实对相等数量的腐生线虫（P.redivivus）雌性有部分吸引，但对小卷蛾斯氏线虫（S.carpocapsae）、P.pacificus、或P.strongyloides雌性/两性体没有吸引。附图80C显示秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性可在6小时内探测到由25只两性体调节的点源并对其具有化学趋向。它们对ascr#2和ascr#3的点源有化学趋向，但对ascr#8没有化学趋向。与对照对比计算每个值的误差条线、S.D.统计显著性，
在附图80C中显示。采用非配对Student氏t检验测定P–值。＊＊P<0.01，＊P<0.05。
附图81显示蛔苷不增加与同种的两性体交配，它们也不诱导与不同线虫物种的交配。采用交配反应检测（Peden等，Curr.Biol.15:394–404(2005)，在此全文引入作为参考），在3–分钟试验跨度内，对成功将它们的腹面尾部放置在两性体上连续10秒的雄性百分比定量。误差条线，S.D。
附图82显示在线虫和细菌中相似的信号分子的装配。N–酰基高丝氨酸内酯（AHLs）为一族调节细菌群体感应的小分子。AHLs以高丝氨酸内酯为基础且特征是在N–酰基链上具有物种特异性(Dickschat,Nat.Prod.Rep.27:343–69(2010)，在此全文引入作为参考)。蛔苷以很相似的方式装配，以可变脂链附着于其上的二脱氧糖蛔糖支架为基础（Edison,Curr.Opin.Neurobiol.4:378–88(2009)，在此全文引入作为参考）。它们均在调节重要的生存策略中发挥显著的作用。
附图83为在爪哇根结线虫（M.javanica）和/或北方根结线虫（M.hapla）中检测到的一列蛔苷化合物。
附图84显示从根结线虫中已鉴定的蛔苷信号的高分辨率质谱数据。
附图85A–E为根结线虫（爪哇根结线虫（M.javanica）,M.floridensis,南方根结线虫（M.incognita））提取物的HPLC–MS色谱图，证实存在蛔苷ascr#10（附图85A）、ascr#16（附图85B）、ascr#18（附图85C）、ascr#20（附图85D）、和ascr#22（附图85E）。
附图86A–E为爪哇根结线虫（M.javanica）（J2幼虫）提取物的HPLC–MS色谱图，证实存在蛔苷ascr#10附图86A）、ascr#16（附图86B）、ascr#18（附图86C）、ascr#20（附图86D）、和ascr#22（附图86E）。
附图87A–E为北方根结线虫（Northern Root–Knot Nematode）北方根结线虫（M.hapla）（J2幼虫）提取物的HPLC–MS色谱图，证实存在蛔苷ascr#10（附图87A）、ascr#16（附图87B）、ascr#18（附图87C）、ascr#20（附图87D）、和ascr#22（附图87E）。
附图88A–E为合成的蛔苷标准品(ascr#10（附图88A）、ascr#16（附图88B）、ascr#18（附图88C）、ascr#20（附图88D）、和ascr#22（附图88E）)的HPLC–MS色谱图。
附图89为(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双((叔丁基二甲基硅烷基)氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(11)的1H NMR光谱(600MHz，氯仿–d)。
附图90A–B为(R)–甲基4–((2–羟基–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸酯((R)–12)的1H NMR(400MHz，丙酮–d6)(附图90A)和13CNMR(100MHz，丙酮–d6)(附图90B)光谱。
附图91A–B为(R)–(R)–2–(4–甲氧基–4–氧代丁酰胺)–1–苯基乙基4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(18)的1H NMR(500MHz，甲醇–d4)(附图91A)和13C NMR(125MHz，甲醇–d4)(附图91B)光谱。
附图92A–D为4–(((R)–2–(((R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸(pasc#9)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图92A)、dqfCOSY(600MHz，甲醇–d4)(附图92B)、HMQC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图92C)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图92D)光谱。
附图93A–C为4–(((S)–2–(((R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸(19)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图93A)、HMQC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图93B)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图93C)光谱。
附图94A–B为(2S,3R,5S,6R)–6–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–5–羟基–2–甲基四氢–2H–吡喃–3–基苯甲酸酯(22)的1H NMR(600MHz，丙酮–d6)(附图94A)和13C NMR(151MHz，丙酮–d6)(附图94B)光谱。
附图95A–B为(2R,3S,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–2–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃(24)的1H NMR(400MHz，氯仿–d)(附图95A)和13C NMR(100MHz，氯仿–d)(附图95B)光谱。
附图96A–D为(R)–4–(((2R,3S,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(part＃9)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图96A)、dqfCOSY(600MHz，甲醇–d4)(附图96B)、HMQC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图96C)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图96D)光谱。
附图97A–B为(2S,3R,5S,6R)–3,5–双(苄氧基)–2–甲氧基–6–甲基四氢–2H–吡喃(26)的1H NMR(400MHz，氯仿–d)(附图97A)和13CNMR(100MHz，氯仿–d)(附图97B)光谱。
附图98A–B为(3R,5S,6R)–3,5–双(苄氧基)–2–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃((R)–29，α–异头物)的1H NMR(500MHz，氯仿–d)(附图98A)和13C NMR(125MHz，氯仿–d)(附图98B)光谱。
附图99A–B为(R)–4–(((2S,3R,5S,6R)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸((R)–30)的1H NMR(500MHz，甲醇–d4)(附图99A)和13C NMR(125MHz，甲醇–d4)(附图99B)光谱。
附图100A–B为(2S,3R)–苄基3–羟基–2–(3–(9–((3R,4S,5R)–3,4,5–三(苄氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸酯(6)的1HNMR(500MHz，甲醇–d4)(附图100A)和13C NMR(125MHz，甲醇–d4)(附图100B)光谱。
附图101A–E为(2S,3R)–3–(((R)–4–(((2R,3S,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–(3–(9–((2R,3R,4S,5R)–3,4,5–三羟基四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸(npar#1)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图101A)、13C NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图101B)、dqfCOSY(600MHz，甲醇–d4)(附图101C)、HSQCAD(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图101D)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图101E)光谱。
附图102A–C为(2S,3R)–3–(((S)–4–(((2S,3R,5S,6R)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–(3–(9–((2R,3R,4S,5R)–3,4,5–三羟基四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸(36)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图102A)、HSQCAD(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图102B)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图102C)光谱。
附图103A–D为(R)–6–(((2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–6–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)庚酰基)氧基)–3–羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)庚酸(dasc#1)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图103A)、dqfCOSY(600MHz，甲醇–d4)(附图103B)、HMQC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图103C)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图103D)光谱。
附图104A–B为(R)–苄基4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(38)的1H NMR(500MHz，氯仿–d)(附图104A)和13C NMR(125MHz，氯仿–d)(附图104B)光谱。
附图105为(R)–苄基4–(((2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–3–叠氮基–2–甲基丙酰基)氧基)–3–羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(8)的1H NMR光谱(400MHz，氯仿–d)。
附图106A–B为5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(10)的1H NMR(500MHz，丙酮–d6)(附图106A)和13C NMR(125MHz，丙酮–d6)(附图106B)光谱。
附图107A–B为(2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–3–叠氮基–2–甲基丙酰基)氧基)–2–(((R)–5–(苄氧基)–5–氧代戊–2–基)氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–3–基5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(40)的1H NMR(500MHz，丙酮–d6)(附图107A)和13CNMR(125MHz，丙酮–d6)(附图107B)光谱。
附图108A–D为(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3–((5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–6–甲基–5–(((R)–2–甲基–3–脲基丙酰基)氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(ubas#1)的1H NMR(600MHz，甲醇–d4)(附图108A)、dqfCOSY(600MHz，甲醇–d4)(附图108B)、HMQC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图108C)、和HMBC(对于1H使用600MHz，151MHz)(附图108D)光谱。
附图109为含有(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3–(((R)–5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)己酰基)氧基)–6–甲基–5–(((R)–2–甲基–3–脲基丙酰基)氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(ubas#2)的天然样品的dqfCOSY光谱(600MHz，甲醇–d4)。
附图110A–C涉及P.pacificus外代谢组和先前从秀丽隐杆线虫（C.elegans）中鉴定的信号分子的分析。附图110A显示调节秀丽隐杆线虫（C.elegans）发育和行为的蛔苷–型小分子信号的结构。附图110B显示P.pacificus排泌的代谢物诱导休眠期停止和影响嘴形二态性，促进阔口的嘴发育。附图110C为P.pacificus外代谢组级分的2DNMR（dqfCOSY）光谱的实例部分，揭示了复杂的代谢物混合物，包括已知的初级代谢产物以及未知的组分。交叉峰微细结构和其它HMBC光谱的详细的分析导致一系列不寻常的基于蛔糖、泊雷糖、苏氨酸、木糖、及其它结构单元的组合的化学结构的检测。
附图111A–C涉及P.pacificus代谢物的HPLC–MS/MS、模块化结构、和化学合成。如附图111A所示，高分辨率的HPLC–MS分析揭示了这样的种类：它们的分子式为基于P.pacificus外代谢组的NMR–光谱分析提出的结构提供附加约束。由碳水化合物(黑色)、氨基酸(绿色)、和核苷(红色)代谢、以及很可能的TCA循环–产生的琥珀酸盐(洋红色)的结构单元的装配产生的P.pacificus外代谢组的主要成分，如图111B所示。附图111C显示已鉴定的P.pacificus代谢物和几种非天然的立体异构体的简略合成流程图。
附图112显示主要的P.pacificus小分子pasc#9、npar#1、dasc#1、和ubas#1。采用核磁共振光谱阐明了结构。粗线表示dqfCOSY光谱中的自旋系统。弯箭头表示用于指定结构的关键的HMBC相关性。npar#1中有标记的质子(---H)是N6–氨甲酰基腺苷的特征并在1H、HSQCAD、和HMBC光谱中观察到。
附图113为鉴定蛔苷ascr#1、ascr#9、ascr#12、pasc#1、pasc#9、pasc#12、ubas#1、ubas#2、dasc#1、part＃9、npar#1、和npar#2的分子式、LC保留时间、光谱数据、和培养物上清液中的估算浓度的表。
附图114显示天然pasc#9(黑色)、合成的包含(R)–N–琥珀酰–1–苯基乙醇酰胺部分的pasc#9(红色)、和合成的包含(S)–N–琥珀酰–1–苯基乙醇酰胺部分的pasc#9(蓝色)的1H–NMR光谱的部分。天然样品的1H NMR与(R)–N–琥珀酰–1–苯基乙醇酰胺非对映异构体匹配，表明天然的pasc#9含有(R)–N–琥珀酰–1–苯基乙醇酰胺。
附图115A–B为HPLC–富集的P.pacificus外代谢组提取物级分dasc#1（附图115A）和dasc#1的合成样品（附图115B）的dqfCOSY光谱的部分（600MHz，甲醇–d4）。dasc#1的特征交叉峰画上蓝色框，而来自存在于天然样品之中的其它代谢产物的无关交叉峰画上红色框。天然和合成样品之间交叉峰的精确匹配证明了dasc#1的结构和立体化学的指定并证实了dasc#1在P.pacificus外代谢组中存在。
附图116A–B为涉及ubas#1立体化学测定的HPLC–MS痕迹(附图116A)和1H–核磁共振光谱(附图116B)。天然ubas#1(红色)、含有～95:5比例的3–脲基–2R–异丁酸酯和3–脲基–2S–异丁酸酯的合成的ubas#1非对映异构体的混合物(蓝色)、和天然和合成样品的混合物(画点的黑色)的HPLC–MS保留时间(ESI–，m/z=605的离子色谱图)的比较，显示于附图116A中。合成的(3–脲基–2R–异丁酸酯)–衍生的ubas#1的HPLC–保留时间与天然的ubas#1匹配，而明显不同于(3–脲基–2S–异丁酸酯)–衍生的ubas#1非对映异构体(显著的＊)，表明天然的ubas#1包含3–脲基–2R–异丁酸酯部分。如附图116B所示，合成的(3–脲基–2R–异丁酸酯)–衍生的ubas#1(底部)、含有ubas#1的天然样品(顶端)、和这两种样品1:1的混合物(中间)的1H–核磁共振光谱的部分的比较，显示四个特征性的甲基双重峰的相对强度（通过伴随结构中红色和蓝色框标记）在向天然样品（天然样品中无关的峰标记＊）加入合成的ubas#1时增强。这证实了天然ubas#1含有3–脲基–2R–异丁酸酯，而不是3–脲基–2S–异丁酸酯。天然和合成样品之间的pH和浓度的差别略微地影响甲基双重峰的化学位移，导致在混合天然和合成样品时化学位移值小的变化。
附图117A–B为涉及part#9立体化学测定的HPLC–MS痕迹。两者均显示ascr#9和part＃9的天然混合物(红色)、part＃9的合成样品(蓝色)、和天然和合成样品1:1的混合物(画点的黑色)的HPLC–MS保留时间(ESI–，m/z=247的离子色谱图)的比较。合成的D–泊雷糖基–4R–羟基戊酸用于附图117A。其HPLC–保留时间与天然part＃9不匹配，表明D–泊雷糖基–4R–羟基戊酸及其对映体都不可能是天然part#9。合成的D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸用于附图117B。D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸的HPLC–保留时间与天然part#9匹配。这表明天然part＃9为D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸或其对映体L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸二者之一。天然npar#1与由D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸或L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸衍生来的两个合成的npar#1非对映异构体的核磁共振光谱和HPLC–保留时间的比较（参见附图118A–C）揭示天然part＃9和npar#1建立在L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸的基础之上。
附图118A–C为涉及npar#1立体化学测定的HPLC–UV痕迹(附图118A–B)和1H–核磁共振光谱(附图118C)。附图均118A–B显示含有npar#1的天然样品物(红色)、npar＃1合成样品(蓝色)、和天然和合成样品的混合物(画点的黑色)的HPLC–UV保留时间(260nm)的比较。由D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸与L–苏氨酸和D–木糖腺苷（xyloadenosine）偶联产生的合成的npar#1非对映异构体用于附图118A。HPLC–保留时间与天然的npar#1不匹配。由L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸与L–苏氨酸和D–木糖腺苷偶联产生的合成的npar#1非对映异构体用于附图118B。HPLC–保留时间与天然的npar#1匹配。如附图118C所示，由L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸与L–苏氨酸和D–木糖腺苷偶联产生的合成的npar#1(底部)、天然npar#1(顶端)、和两种样品1:1的混合物(中间)的1H–核磁共振光谱的部分的比较，显示pH和浓度的变化影响三个特征性的甲基双重峰的位移（通过伴随结构中红色和蓝色框标记）。不过，在混合的样品中，没有新的峰出现且与天然样品中无关的峰（以＊标记）相比甲基双重峰的相对强度增强。与显示于附图118A–B中的HPLC–UV结果结合，这些发现表明天然npar#1由与L–苏氨酸和D–木糖腺苷偶联的L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸构成。
附图119为显示HPLC–富集的P.pacificus外代谢组提取物级分中的pasc#12的特征性的1H NMR信号的一对光谱。
附图120A–B为P.pacificus外代谢组提取物(附图120A)和大肠杆菌OP50代谢组提取物(附图120B)的dqfCOSY光谱的部分(600MHz，甲醇–d4)。蛔苷的特征交叉峰画上蓝色框泊雷糖苷（paratosides）的特征交叉峰画上红色框。两个光谱的比较表明从P.pacificus外代谢组中鉴定的复杂小分子不来源于细菌。相应地，细菌提取物的HPLC–MS分析没有显示在P.pacificus外代谢组样品中检测到的任何峰。
附图121为在施用了乙醇、ascr#1、或npar#1的P.pacificus中的休眠期形成图，证明了ascr#1不诱导P.pacificus的休眠期形成，即使在非常高的浓度下（20μM）。npar#1(1μm)用作P.pacificus休眠期形成的阳性对照。
附图122A–E涉及用已鉴定的代谢产物进行的功能检测和在P.pacificus中小分子信号与进化保守途径的关系。附图122A–D为显示成虫表型可塑性（嘴形）的调节的图。附图122A和122C为活性P.pacificus外代谢组级分的主要成分的合成样品产生的休眠期诱导（附图122B和122D）。所有实验对于每种处理以一式三份进行。首先在1μM浓度下检测化合物（＊p<0.01和＊＊p<0.001）（附图122A–B）。随后对在1μM浓度下具有显著活性的化合物（p<0.01）在一定的浓度的范围内进行试验（附图122C–D）。如附图122E所示，线虫中的小分子信号占据连接初级代谢与进化保守的转录因子的中心位置，其中进化保守的转录因子包括DAF–16/FOXO和核激素受体（NHR）DAF–12、维生素D和肝脏X受体同系物。尽管npar#1诱导休眠期停止，其需要通过DAF–12和DAF–16两种信号，而dasc#1调节成虫形态学，其亦需要DAF–12但与DAF–16无关。
附图123A–E涉及daf–22突变体–特异性的VLCAs7–11的鉴定，其通过mvaDANS和随后的HPLC–MS分析鉴定。附图123A显示daf–22突变体和野型代谢组的HPLC–MS光谱。HPLC–MS分析证实了daf–22代谢组中的长链蛔苷和乙醇酰胺，其在野型中不存在。代谢产物的结构如附图123B所示。附图123C为显示daf–22–上调的蛔糖基methylketones的定量分布图。附图123D为野型和各种突变体的代谢组中EPEA的产生图。maoc–1、dhs–28、和daf–22的变异大大减少了EPEA的产生且向daf–22（m130）培养物中加入蛔苷(2.5μM ascr＃3和ascr#9)不恢复EPEA的产生。＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。附图123E为显示过氧化物酶体β–氧化和内源性大麻素生物合成的相互作用的示意图。daf–22的变异消除了长链蛔苷辅酶A酯的处理，它们转化为乙醇酰胺与EPEA产生（13）的减少有关，很可能是由于磷脂酰乙醇胺池的耗尽。
附图124为野型和各种突变体中AEA的产生图maoc–1、dhs–28、和daf–22的变异大大减少了AEA产生，而acox–1的变异只略微降低AEA产生。＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。
附图125A–B涉及daf–22突变体中上调的和下调的代谢产物的鉴定。mvaDANS的示意图总览如附图125A所示。在主成分分析（PCA）中，PC1将四个野型数据组（蓝点）从两个daf–22突变体数据组（红色和棕色点）中分离，而PC2分离两个daf–22等位基因。在反投影（左下）中，交叉峰的着色与PC1加载系数相对应；蓝峰代表两个daf–22突变株中下调的信号而红峰代表两个daf–22突变株中上调的信号。参见实际光谱的附图130。附图125B显示由对daf–22–特异性交叉峰的人工分析推测的局部结构，其中daf–22–特异性交叉峰提示α–甲基分支脂肪酸、甲基酮、和β–脂肪酮酸衍生物。
附图126为四种秀丽隐杆线虫（C.elegans）野型外代谢组提取物之一的dqfCOSY光谱的一部分（0.85–4.80ppm）。
附图127为四种daf–22（m130）外代谢组提取物之一的dqfCOSY光谱的一部分（0.85–4.80ppm）。
附图128A–D为显示mvaDANS如何自动地鉴定光谱的交叉峰和创建统计学上衍生的伪光谱的一系列光谱。附图128A为秀丽隐杆线虫（C.elegans）代谢组的相敏dqfCOSY光谱的1–3ppm区域。附图128B为与附图128A中显示的相同的NMR光谱，但在自动面元（binning）之前以幅度模式处理。附图128C为由附图128A–B得到的核磁共振光谱轮廓块，其中附图128A–B用通过mvaDANS鉴定的面元（bin）区域的边界绘制。附图128D为由秀丽隐杆线虫（C.elegans）野型/daf–22的主分量1的比较NMR数据集产生的反投影的伪光谱。交叉峰的颜色表示标准化的区域面元的PC1加载系数。
附图129为PLS组分得分图。PLS组分得分将4种野型培养物（红点）与8种daf–22培养物（蓝点）分开。
附图130A–G显示PCA如何鉴定区分野型和两种daf–22突变体等位基因的交叉峰。如附图130A所示在幅度模式dqfCOSY光谱上PC1载量的反投影鉴定相对于突变体光谱野型光谱中增强的（红色）或减弱的（蓝色）交叉峰。附图130B–C提供了通过鉴定已知化合物的mvaDANS工作流程和方法验证的实例。对与附图130B中野型特定的红色交叉峰相对应的显示于附图130C中的相敏dqfCOSY–光谱中交叉峰的分析揭示了已知的蛔苷ascr#5，其生物合成先前被证明是daf–22依赖性的。类似地，附图130A中其它野型特定的（红色）信号中的大部分可归属于已知的蛔苷信息素之一。也参见附图129。附图130D–F显示由对daf–22–特异性交叉峰的分析推测的局部结构，其中daf–22–特异性交叉峰提示α–甲基分支脂肪酸、甲基酮、和β–脂肪酮酸衍生物。附图130G提供了不严格是特异性daf–22的代谢物（推定的甲硫氨酸衍生物）实例该化合物在daf–22突变体中被上调而且存在于野型中。
附图131为NMR光谱。由以4x交叉效度分析的1组分模型得到的PLS–DA预测因子的反投影，很大程度上与由PCA得到的结果匹配（附图123）。采用对野型较大数量的重复将得到更显著的PLS–DA结果。
附图132为用于外代谢组提取物的大肠杆菌OP50（E.coli OP50）的dqfCOSY的一部分（0.85–4.80ppm）。
附图133显示实施例结构并列出秀丽隐杆线虫（C.elegans）中蛔苷–型信号分子的生物功能。
附图134为蛔苷的过氧化物酶体生物合成模型的示意图，显示过氧化物酶体β–氧化–还原酶ACOX–1、MAOC–1、DHS–28、和推定的3–酮脂酰CoA硫解酶DAF–22的作用。
附图135A–B为显示通过mvaDANS鉴定的有差别的交叉峰光谱实例。附图135A显示在野型光谱中检测到的ascr#2–交叉峰。附图135B显示在来自附图128的daf–22（m130）光谱中检测到的β–酮乙醇酰胺和甲基酮交叉峰。
发明详述
本文中公开了多类充当线虫中信号分子调节线虫行为的化合物，其中线虫行为包括繁殖、发育、休眠期形成、群聚（aggregation）、吸引（attraction）、排斥（repulsion）、分散（dispersal）、威慑（deterrence）、喂食（feeding）、寻找宿主（host finding）、和/或侵入宿主（host invasion）。
定义
如本文中所用的，下述术语，除非另外说明，要理解为具有下述的含义。如果本申请中没有另外定义，本申请中所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。如果本申请中的术语存在多个定义，除非另有说明，在此部分的那些定义占优。
术语“烷基”指可以是直链、分支的、或环烃结构或其组合的脂族烃基团。代表性的烷基基团为具有24或更少碳原子的那些，例如，甲基，乙基，正丙基，异丙基，正丁基，仲丁基，叔丁基，正戊基，异戊基，正己基等。低级烷基指在链中具有约1至约6个碳原子的烷基基团。分支的烷基指一个或多个低级烷基基团如甲基、乙基、或丙基附于直链烷基链上。
烷基是指包括直链、分支的、或环烃结构及其组合的说法意味着“烷基”基团还包括下述直链和环状结构成分的组合（和类似的组合）。
“链烯基”指如上定义的在相邻碳原子之间含有至少一个双键的烷基。链烯基既包括顺式又包括反式异构体。分支的链烯基指一个或多个低级烷基基团如甲基、乙基、或丙基附着于直链链烯基链上。代表性的直链和分支的链烯基为在链中具有约2至约6个碳原子的那些，例如，乙烯基，丙烯基，1–丁烯基，2–丁烯基，异丁烯基，1–戊烯基，2–戊烯基，3–甲基–1–丁烯基，2–甲基–2–丁烯基，2,3–二甲基–2–丁烯基等。
术语“卤素”指氟、氯、溴、和碘。
术语“卤代烷基”指如上所述的分支的或直链–烷基，被一种或多种卤素取代。
术语“卤代烯基”指如上所述的分支的或直链–烯基，被一种或多种卤素取代。
术语“芳基”指6至约19个碳原子，例如，约6至约10个碳原子的芳香单环或多环环系，包括芳基烷基基团。代表性的芳基基团包括但不限于，诸如苯基，萘基，奥基，菲基，蒽基，芴基，芘基，triphenylenyl，屈基，和naphthacenyl的基团。
该术语“芳基烷基”指与芳环连接的烷基残基。实例为苄基、苯乙基等。
术语“杂芳基”指约5至约19个环原子，例如，约5至约10个环原子的芳香单环或多环环系，其中环系中一个或多个原子为除碳之外的元素，例如，氮、氧、和/或硫。如本领域的技术人员熟知的，杂芳环比其全碳配对物具有较小的芳香性。因此，对本发明而言，“杂芳基”基团只需要具有一定程度的芳香性。例如，在多环环系的情况下，对于被定义为“杂芳基”的环系只需要其中一个环是芳香的。示例性的杂芳基含有约5至6个环原子。在杂芳基之前的前缀氮杂、氧杂、硫杂、或硫基指至少一个氮、氧、或硫原子分别以环原子的形式存在。杂芳环中的氮、碳、或硫原子可任选地被氧化；氮可任选地被季铵化。代表性的杂芳基包括但不限于，嘌呤基，吡啶基，2–氧代–吡啶基，嘧啶基，哒嗪基，吡嗪基，三嗪基，呋喃基，吡咯基，噻吩基，吡唑基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，三唑基，噁二唑基，噻二唑基，四唑基，吲哚基，异吲哚基，苯并呋喃基，苯并苯硫基，二氢吲哚基，2–氧代二氢吲哚基，二氢苯并呋喃基，二氢苯并噻吩基，吲唑基，苯并咪唑基，苯并噁唑基，苯并噻唑基，苯并异噁唑基，苯并异噻唑基，苯并三唑基，喹啉基，异喹啉基，喹唑啉基，噌啉基，酞嗪基（pthalazinyl），喹喔啉基等。
术语“环烷基”和“环烯基”指非芳香、饱和(环烷基)或不饱和(环烯基)、约3至约8个碳原子，例如，约5至约7个碳原子的单环或多环环系。示例性的环烷基和环烯基非限制性地包括，环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，降莰基（norbornyl），环丙烯基，环丁烯基，环戊烯基，环己烯基，cyclophenyl，反式–双环丙烷（bicyclopropane），顺式–三环丙烷（tricyclopropane）等。
如本文中所用的，“杂环”或“杂环基”指稳定的3–至18–元环(基团)，其为饱和、不饱和、或芳香的，且其由碳原子和一个至五个选自氮、氧和硫的杂原子构成。就本发明而言，杂环可以是单环、二环、或多环环系，其可包括稠合、桥接、或螺环系，包括其中上述任何杂环与苯环稠合的双环。杂环中的氮、碳、或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化；且环可以是部分饱和或全饱和。杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如下定义的杂芳基。此种杂环的实例非限制性地包括，吗啉基，吡咯烷酮基，吡咯烷基，哌啶基，piperizynyl，海因基（hydantoinyl），戊内酰胺基（valerolactamyl），氧杂环丙基，氧杂环丁基，四氢呋喃基，四氢吡喃基，四氢吡啶基，四氢嘧啶基（tetrahydroprimidinyl），四氢噻吩基，四氢噻喃基，四氢嘧啶基，四氢噻吩基，四氢噻喃基等。其它杂环和杂芳基描述于Katritzky等，eds.,Comprehensive Heterocyclic Chemistry：TheStructure,Reactions,Synthesis和Use of Heterocyclic Compounds,Vol.1–8,Pergamon Press,N.Y.(1984)中，在此全文引入作为参考。
术语“酰基”指1至8个碳原子的直链、分支的、或环状构型、饱和、不饱和、或芳香、及其组合的基团，穿过羰基官能团与母结构连接。酰基残基中的一个或多个碳可被氮、氧、或硫置换，只要与母体的连接点仍然在羰基上。实例包括乙酰基(Ac)，苯甲酰基，丙酰基，异丁酰基，叔丁氧羰基，苄氧羰基等。
术语“氨基酸”指通过氨基酸羧基基团与另一分子的氨基基团反应形成酰胺键之后保留的氨基酸片段。氨基酸可为D–或L–构型。适合的氨基酸包括α–氨基酸，β–氨基酸，γ–氨基酸，δ–氨基酸，和ε–氨基酸，不仅包括天然氨基酸(即，在生物系统中发现的那些，包括在天然蛋白质中发现的二十种氨基酸)，而且包括此种氨基酸的天然存在的变体，以及合成的氨基酸及本领域技术人员已知的它们的类似物。示例性的氨基酸包括该二十种天然氨基酸，4–羟脯氨酸，hydroxyysine，锁链赖氨酸（demosine），异锁链赖氨酸（isodemosine），3–甲基组氨酸，正缬氨酸，β–丙氨酸，γ–氨基丁酸，瓜氨酸，高半胱氨酸，高丝氨酸，鸟氨酸，和甲硫氨酸砜。
术语“嘧啶”指含有两个碳原子被两个氮原子置换的苯环(二嗪)的芳香杂环化合物。例如，认为在1和3位上的碳原子被氮原子置换的下述部分为嘧啶：该术语，如本文中定义的，还包括二嗪的异构形式，如哒嗪，氮原子在1和2位；和吡嗪，氮原子在1和4位。术语“嘧啶”通常还包括其类似物和衍生物。例如，天然的核碱基，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)、和尿嘧啶(U)，为嘧啶衍生物。术语“嘌呤”指含有与咪唑环稠合的嘧啶环的芳香杂环化合物。术语“嘌呤”通常还包括其类似物和衍生物。例如，天然核碱基，腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)。其它天然存在的嘌呤衍生物的实例为次黄嘌呤、黄嘌呤、可可碱、咖啡因、尿酸、和异鸟嘌呤。示例性的嘌呤和嘧啶包括在美国专利号3,687,808；Concise Encyclopedia Of Polymer Science和Engineering,第858–859页；Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990；和Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些，各自在此全文引入作为参考。
术语“核碱基”包括所有天然和合成的核碱基以及一般核碱基。典型的天然核碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、和胸腺嘧啶。合成的核碱基典型地包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、isoguanisine、或tubercidine。如本文中所用的，一般核碱基为任何改性、未改性的、天然存在的或可代替一个以上天然核碱基的非天然存在的核碱基。一般碱典型地含有可含或可不含氮原子的芳香环部分，且通常使用堆叠的（stacking）芳香环以稳定寡核苷酸双链体。一些一般碱可通过共价键附着于戊糖糖的C1′碳上以制备一般核苷酸。一些一般碱不特异性地与另一核碱基形成氢键。一些一般碱与所有的天然存在的核碱基成碱对。一些一般碱可通过疏水性堆叠（stacking）在相同的核酸链上与相邻的核苷酸碱相互作用。示例性的一般核碱基包括但不限于，2,4–二氟甲苯，硝基吡咯基，硝基吲哚基，8–氮杂–7–脱氮腺嘌呤，4–氟–6–甲基苯并咪唑，4–甲基苯并咪唑，3–甲基isocarbostyrilyl，5–甲基isocarbostyrilyl，3–甲基–7–丙炔基isocarbostyrilyl，7–氮杂吲哚基，6–甲基–7–氮杂吲哚基，咪唑并吡啶基（imidizopyridinyl），9–甲基–咪唑并吡啶基（imidizopyridinyl），吡咯并吡嗪基（pyrrolopyrizinyl），isocarbostyrilyl，7–丙炔基isocarbostyrilyl，丙炔基–7–氮杂吲哚基，2,4,5–三甲基苯基，4–methylinolyl，4,6–二甲基吲哚基，苯基，萘基，蒽基，phenanthracenyl，芘基，stilbenzyl，丁省基（tetracenyl），戊省基（pentacenyl），及其结构衍生物。
适合的核碱基包括但不限于，2–氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6–甲基及其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2–丙基及其它烷基衍生物，5–卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5–丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6–偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5–尿嘧啶(假尿嘧啶)，4–硫尿嘧啶，5–卤代尿嘧啶，5–(2–氨丙基)尿嘧啶，5–氨基烯丙基尿嘧啶，8–卤代、氨基、硫醇、烷硫基、羟基及其它8–取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5–三氟甲基及其它5–取代脲嘧啶类和胞嘧啶，7–甲基鸟嘌呤，5–取代的嘧啶，6–氮杂嘧啶和N–2、N–6和O–6取代的嘌呤，包括2–氨丙基腺嘌呤，5–丙炔基尿嘧啶和5–丙炔基胞嘧啶，二氢尿嘧啶，3–脱氮–5–氮杂胞嘧啶，2–氨基嘌呤，5–烷基尿嘧啶，7–烷基鸟嘌呤，5–烷基胞嘧啶，7–脱氮腺嘌呤，N6,N6–二甲基腺嘌呤，2,6–二氨基嘌呤，5–氨基–烯丙基–尿嘧啶，N3–甲基尿嘧啶，取代的1,2,4–三唑，2–吡啶酮，5–硝基吲哚，3–硝基吡咯，5–甲氧基尿嘧啶，尿嘧啶–5–乙醇酸，5–甲氧羰基甲基尿嘧啶，5–甲基–2–硫尿嘧啶，5–甲氧羰基甲基–2–硫尿嘧啶，5–甲基氨甲基–2–硫尿嘧啶，3–(3–氨基–3–羧丙基)尿嘧啶，3–甲胞嘧啶，5–甲基胞嘧啶，N4–乙酰基胞嘧啶，2–巯基胞嘧啶，N6–甲基腺嘌呤，N6–异戊基腺嘌呤，2–甲硫基–N–6–异戊烯基腺嘌呤，N–甲基鸟嘌呤，和O–烷基化碱。其它嘌呤和嘧啶包括在美国专利3,687,808；ConciseEncyclopedia Of Polymer Science和Engineering，第858–859页；Kroschwitz,J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990；和Englisch等，Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613中公开的那些，各自在此全文引入作为参考。
术语“核苷”指包含在1′–位置与戊糖连接的如本文中定义的核碱基的化合物。当核碱基为嘌呤衍生物或类似物（anologue）时，戊糖典型地与嘌呤衍生物或类似物（anologue）9–位上的核碱基连接。当核碱基为嘧啶衍生物或类似物（anologue）时，戊糖典型地与嘧啶1–位上的核碱基连接(例如，Kornberg和Baker,DNA Replication,2ndEd.,Freeman,San Francisco,1992，在此全文引入作为参考)。当核苷存在于本文中的R3、R4、或R5中时，核苷可通过核碱基或戊糖上的任何原子与邻近的原子连接。
术语“脂肪酸”通常指具有脂肪族尾（链）的羧酸。脂肪链长度可在约2至约36个碳原子之间。脂肪酸可以是饱和、不饱和、或多不饱和的。脂肪链可以是直链或分支链。术语“脂肪酸”可用于本文中指“脂肪酸衍生物”，其可包括一种或多种不同的脂肪酸衍生物，或脂肪酸衍生物的混合物。示例性的脂肪酸包括不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸，和二酸；具有羧酸官能团的蛔苷的甘油单酯、甘油二酯、和甘油三酯；羟酸，ω羟酸，ω–1羟酸，二–羟基脂肪酸（例如，Ω–或Ω–1羟基化的二羟基脂肪酸，以及α–或β–羟基化脂肪酸）。
术语“糖”指其为本身由一个或多个单糖单元构成的碳水化合物的化合物，其中单糖单元具有至少5个碳原子（其可以是直链、分支的、或环状），含与各碳原子键合的氧、氮、或硫原子；或含作为其一部分的由一个或多个单糖单元构成的碳水化物部分的化合物，各单糖单元具有至少5个碳原子（其可以是直链、分支的、或环状），含与各碳原子键合的氧、氮、或硫原子。代表性的糖包括单糖、二糖、三糖、和含有约4–9个单糖单元的寡糖，和多糖如淀粉、糖原、纤维素、和多糖胶。示例性的单糖包括C5和C5以上(例如，C5–C8或C5–C6)的糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元的糖(例如，C5–C8或C5–C8)。
术语“单糖”指醛（醛糖）或酮（酮糖）形式的具有3–10个碳原子链的糖分子。适合的单糖既包括天然存在的单糖又包括合成的单糖。适合的单糖包括丙糖，如甘油糖和二羟基丙酮；textroses如赤藓糖和赤藓酮糖；戊糖，如木糖，阿拉伯糖，核糖，木酮糖核酮糖；甲基戊糖(6–脱氧己糖)，如鼠李糖和岩藻糖；己糖，如蛔糖，葡萄糖，甘露糖，半乳糖，果糖，和山梨糖；和庚糖，如葡庚糖，半乳甘露庚糖，景天庚酮糖，和甘露庚酮糖。示例性的单糖包括阿洛糖，阿卓糖，阿拉伯糖，克拉定糖，赤藓糖，赤藓酮糖，果糖，D–岩藻糖醇，L–岩藻糖醇，岩藻糖胺，岩藻糖，fuculose，半乳糖胺，D–galactosaminitol，N–乙酰–半乳糖胺，半乳糖，葡糖胺，N–乙酰–葡糖胺，glucosaminitol，葡萄糖，葡糖–6–磷酸，古洛糖甘油醛，L–甘油基–D–甘露糖–庚糖，甘油，甘油酮（glycerone），古洛糖，艾杜糖，来苏糖，甘露糖胺，甘露糖，甘露糖–6–磷酸酯，阿洛酮糖，奎诺糖，奎诺糖胺，鼠李糖醇，鼠李糖胺，鼠李糖，核糖，核酮糖，景天庚酮糖，山梨糖，塔格糖，塔罗糖，酒石酸，苏糖，木糖，和木酮糖基团。单糖可以是D–或L–构型。本发明中所用的典型的单糖为己糖。
单糖另外可以是脱氧糖（被氢置换的醇羟基），氨基糖（被氨基基团置换的醇羟基），硫糖（被硫醇置换的醇羟基或被C=S置换的C=O，或被硫置换的环状形式的环氧基)，硒基糖，碲基糖，氮杂糖（被氮置换的环碳），亚氨基糖（被氮置换的环氧基)，phosphano糖（用磷置换的环氧基)，磷杂糖（用磷置换的环碳），C–取代的单糖（用碳置换的非末端碳原子上的氢），不饱和单糖，醛醇（用CHOH基团置换的羰基），糖醛酸（被羧基置换的醛基团），ketoaldonic酸，糖醛酸，醛糖二酸等。氨基糖包括氨基单糖，如半乳糖胺，葡糖胺，甘露糖胺，岩藻糖胺，奎诺糖胺，神经氨酸，胞壁酸，乳糖二胺（lactosediamine），acosamine，bacillosamine，柔红糖胺（daunosamine），去氧糖胺，forosamine，加拉糖胺（garosamine），卡那霉素水解物（kanosamine），kansosamine，碳霉糖，海藻糖胺，perosamine，pneumosamine，purpurosamine，紫红霉胺。可以理解单糖等还可被经取代。
术语“二糖”、“三糖”、和“多糖”包括阿比可糖，acrabose，amicetose，支链淀粉，直链淀粉，芹菜糖，arcanose，蛔糖，抗坏血酸，波伊文糖，纤维二糖，纤维三糖，纤维素，马铃薯三糖，查耳糖，壳多糖，可立糖，环糊精，磁麻糖，糊精，2–脱氧核糖，2–脱氧葡萄糖，迪吉糖（diginose），毛地黄糖，毛地黄毒素糖，evalose，evemitrose，fructoologosachharide，galto–低聚糖，龙胆三糖，龙胆二糖，葡聚糖，糖原（glucogen），糖原（glycogen），金缕梅糖，肝素，菊粉，异左旋葡萄糖酮（isolevoglucosenone），异麦芽糖，异麦芽三糖，异葡糖基麦芽糖，曲二糖，乳糖，乳糖胺（lactosamine），乳糖二胺（lactosediamine），laminarabiose，左旋葡聚糖，左旋葡萄糖酮（levoglucosenone），β–麦芽糖，麦芽三糖（maltriose），甘露聚糖–低聚糖，甘露三糖，松三糖，蜜二糖，胞壁酸，碳霉糖，阿洛糖（mycinose），神经氨酸，黑糖，野尻霉素，moviose，齐墩果糖，潘糖，泊雷糖，车前糖，樱草糖，棉子糖，玫红糖（rhodinose），芸香糖，蔓茎毒毛旋花子糖，景天庚酮糖，茄三糖，槐糖，水苏糖，链霉糖，蔗糖，α,α–海藻糖，海藻糖胺，松二糖，泰威糖，木二糖，伞形糖等基团。另外，可以理解“二糖”、“三糖”、和“多糖”等类似物还可被取代。二糖还包括氨基糖及其衍生物，特别是，在C–4′位上衍生化的碳霉糖或在C–6′位上衍生化的4去氧基–3–氨基–葡萄糖。
本文中所用的术语“多环”表示具有两个或更多环的分子结构，包括但不限于，稠合环、桥接环、或螺环。
上述“烷基”、“链烯基”、“环烷基”、和“环烯基”基团、以及上述芳基、杂环基、或杂芳基基团的环系，可任选地被取代。
术语“取代的”或“任选地被取代的”用于表示基团可具有在基团的每一个可取代的原子上的取代基（包括在单一原子上的一个以上的取代基），条件是指定的原子的正常价不是超过限度且各取代基的身份（identity）与其它取代基无关。按照本发明，每个残基中最高三个H原子可用下列基团置换：烷基，卤素，卤代烷基，alkyenyl，卤代烯基，环烷基，环烯基，羟基，烷氧基，酰基，羧基，carboalkoxy(亦称为烷氧羰基)，羧酰胺基(亦称为烷基氨基羰基)，氰基，羰基，硝基，氨基，烷基氨基，二烷基氨基，巯基，烷硫基，亚砜，砜，酰基胺基，脒基，芳基，杂芳基，杂环基，芳氧基，杂芳氧基，嘌呤或pyridimine或其类似物或衍生物（derative）（如“核碱基”中定义的），或糖如具有5或6个碳原子的单糖(如“单糖”中定义的)。“未取代的”的原子带有它们的化学价支配的所有氢原子。当取代基为酮（即，=O）时，那么原子上的两个氢被置换。取代基和/或变量的组合只有当这种组合产生稳定的化合物时才可允许；“稳定的化合物”或“稳定的结构”意指足够稳固以在经历自反应混合物分离至有用的纯、和从制剂变成有效的试剂度之后仍然存在的化合物。
在一些取代基的表征中，某些取代基可以组合形成环。除非另有说明，意图是这种环可表现为各种不饱和度（从全饱和到全不饱和），可包括杂原子，和可被如上所述的其它取代基取代。
本文中描述的化合物可含有一个或多个不对称中心，因而导致对映异构体、非对映异构体、及其它立体异构形式。每个手性中心可根据绝对立体化学进行定义，如(R)–或(S)–。本发明意在包括所有这种可能的异构体、以及它们的混合物，包括外消旋和光学纯的形式。可采用手性合成子或手性试剂制备、或采用常规的技术拆分光学活性的(R)–和(S)–、(–)–和(+)–、或(D)–和(L)–异构体。当本文中描述的化合物含有烯族双键或其它几何不对称性中心时、和除非另有说明时，意图是化合物包括E和Z两种几何异构体。同样，所有互变异构形式也意在包括在内。出现在本文中的任何碳–碳双键的构型只是为了方便起见进行的选择，而不是旨在指特定的构型；因而本文中任意描述为反式的碳–碳双键可以是Z、E、或两者以任何比例的混合物。
术语“本发明的化合物，”和同等表达式，意在包括化合物的前药、药学上可接受的盐、氧化物、溶剂合物（例如水合物）、和包合配合物（在上下文允许这样的情况下）、以及任何立体异构形式、或化合物的任何这种形式以任何比例的混合物，除非另有说明。包合配合物描述于Remington,The Science和Practice of Pharmacy,19th Ed.1:176–177(1995)中，在此全文引入作为参考。最常用的包合配合物为含环糊精的那些，所有环糊精复合物，天然和合成的，明确包括在权利要求的范围内。因此，按照本发明的一些实施方案，包含在药物组合物、处理方法、和化合物本身的范围内的本文中描述的化合物，以盐形式提供。类似地，提到中间物，无论它们本身是否被要求保护，在上下文允许这样的情况下，意在包括它们的盐、和溶剂合物。为了清楚起见，当上下文允许这样时的特定的实例有时候在本文中注明，但这些实例纯粹为示例性的，它不意在排除其它实例（当上下文允许这样时）。
也考虑本文中所公开的化合物的任何碱性含氮基团的“季铵化”。碱性氮可用本领域普通技术人员已知的任何试剂进行季铵化，包括，例如，低级烷基卤化物，如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，包括二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；和芳烷基卤化物，包括苄基和苯乙基溴化物。水溶性或油溶性或可分散的产物可通过这种季铵化获得。
本发明的一方面涉及分离的式I化合物：
其中：
R1为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R1′为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R2为下式的部分
其中：
每个R1独立地为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
n1、n2、和n3各自独立地为0至30的整数；
n4为1至30的整数；且
n1的总和、每个n2、和每个n3为1至30；
R3和R4各自独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R5连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8,–C(O)R8,–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
每个R5独立地为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
条件是化合物不是ascr#1，ascr#2，ascr#3，ascr#4，ascr#5，ascr#6.1，ascr#6.2，ascr#7，ascr#8，ascr#12，ascr#19，ascr#21，ascr#23，ascr#25，bhas#24，bhas#26，bhas#28，bhas#30，或icas#9。
本发明这方面的一个实施方案为式I化合物，其中R1为H、烷基(例如，–CH3)、或链烯基；且R′不存在或H。烷基或链烯基可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中R3和R4各自独立地为H、–C(O)R8、或碳水化合物如含5或6个碳原子的单糖(例如，己糖，如葡基)。根据该实施方案的适合的化合物包括，例如，式I′化合物：
包括，例如，其中R3为H或含5或6个碳原子的单糖的那些；和其中R4为H或–C(O)R8的那些。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中R5为–OH，–NHR6，–OCHR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，烷基、或碳水化合物，如含5或6个碳原子的单糖。烷基或碳水化合物可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R5为–OH、–NHR6、烷基、或含5或6个碳原子的单糖(例如，己糖，如葡基)的那些。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中R6和R7中至少一个存在。在该实施方案中，R6和R7典型地各自独立地为烷基或芳基。烷基或芳基基团可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。例如，这些基团可任选地被独立地选自–C(O)R8和–NHC(O)R8的一个或多个取代基取代。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R6存在且为任选地被一个或多个–C(O)R8取代基取代的芳基的那些。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中R8存在。在该实施方案中，R8典型地为–OH、–NH2、烷基、链烯基、芳基、杂芳基、嘌呤、或嘧啶。烷基、链烯基、芳基、杂芳基、嘌呤、或嘧啶可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。例如，这些基团可任选地被独立地选自–OR9、–NHC(O)R9、烷基、和碳水化合物如含5或6个碳原子的单糖的一个或多个取代基取代。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R8为–OH、–NH2、或任选地被一个或多个含5或6个碳原子的单糖(例如，己糖，如葡基)取代的嘌呤或嘧啶的那些。根据该实施方案的示例性的R8包括吲哚基、羟苯基、羧基苯基、和丁烯基。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中R9存在。在该实施方案中，R9为典型地H、–NH2、或烷基，优选为H或烷基。
式I′化合物包括式I′a的立体异构体：
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R1为–CH3且R1′不存在或为H。根据该实施方案的示例性的化合物包括蛔苷(例如，本文中标记“ascr”的化合物)、(ω–1)–氧化的吲哚蛔苷(例如，本文中标记“icas”的化合物)、(ω–1)–氧化的β–羟基蛔苷(例如，本文中标记“bhas”的化合物)、(ω–1)–氧化的吲哚β–羟基蛔苷(例如，本文中标记“ibha”的化合物)、4–(2–(E)–甲基–2–丁烯酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“mhas”的化合物)、葡基蛔苷酯(例如，本文中标记“glas”的化合物)、和4–(4–羟基苯甲酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“hbas”的化合物)。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R1为H且R1′不存在或为H。根据该实施方案的示例性的化合物包括(ω)–氧化的蛔苷(例如，本文中标记“oscr”的化合物)、(ω)–氧化的吲哚蛔苷(例如，本文中标记“icos”的化合物)、(ω)–氧化的β–羟基蛔苷(例如，本文中标记“bhos”的化合物)、(ω)–氧化的吲哚β–羟基蛔苷(例如，本文中标记“ibho”的化合物)。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R4为–C(O)R8且R8为吲哚基(例如，3–吲哚基)。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω–1)–氧化的吲哚蛔苷。根据该实施方案的示例性的化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω)–氧化的蛔苷。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R4为4–羟基苯甲酰基。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω)–氧化的4–(4–羟基苯甲酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“hbos”的化合物)。根据该实施方案的示例性的化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω–1)–氧化的4–(4–羟基苯甲酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“hbas”的化合物)。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R4为2–甲基–2–丁烯酰基。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω)–氧化的4–(2–(E)–甲基–2–丁烯酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“mbos”的化合物)。根据该实施方案的示例性的化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω–1)–氧化的4–(2–(E)–甲基–2–丁烯酰基)–蛔苷(例如，本文中标记“mbas”的化合物)。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R5为α–D–葡糖基。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω)–氧化的葡基蛔苷酯(例如，本文中标记“glos”的化合物)。根据该实施方案的示例性的化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括(ω–1)–氧化的葡基蛔苷酯(例如，本文中标记“glas”的化合物)。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R5为–OCHR6R7。根据该实施方案的示例性的化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。根据该实施方案的示例性的化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。
本发明这方面的另一个实施方案为式I或式I′a化合物，其中R5为–CR6R7C(O)NHR8.
本发明这方面的另一个实施方案为式IA化合物：
其中n为1至30的整数。根据该实施方案的示例性的化合物包括式IA′的那些：
示例性的式IA和IA′化合物包括以SMIDs“ascr”、“oscr”、“icas”、“icos”、“glas”、“hbas”、和“mbas”标记的化合物，包括，例如，ascr#1,2,4–5,9–12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36，和38；oscr#1,3,9,10,12,14,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36，和38；icas#1,9,10,12,14,16,18,20，和22；icos#1,9,10,16，和18；glas#1,10,16,18,20,22,24，和26；hbas#10；和mbas#10。
本发明这方面的另一个实施方案为式IB化合物：
其中m为1至28的整数。根据该实施方案的示例性的化合物包括式IB′的那些：
示例性的式IB和IB′化合物包括以SMIDs“ascr”、“oscr”、“icas”、“icos”、“glas”、“hbas”、和“mbas”标记的化合物，包括，例如，ascr#3,7–8,13,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35，和37；oscr#7,15,17,19,21,23,25,27,29,31,33,35，和37；icas#3,7,15,17,19，和21；icos#3,15，和17；glas#3；hbas#3;和mbas#3。
本发明这方面的另一个实施方案为式IC化合物：
其中q1和q2各自独立地为1至28的整数且q1和q2的总和小于或等于29。根据该实施方案的示例性的化合物包括式IC′的那些：
示例性的式IC和式IC′化合物包括其中R1为–CH3且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括以SMIDs“bhas”和“ibha”标记的化合物，例如，bhas#10,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40，和42；和ibha#10,16,18,20,22,24,26,28，和30。示例性的式IC和式IC′化合物还包括其中R1为H且R1′不存在或为H的那些。此类化合物包括以SMIDs“bhos”和“ibho”标记的化合物，例如，bhos#10,16,18,20,22,24,26,28,30,32,34,36,38,40，和42；和ibho#10,16,18,20,22,24，和26。示例性的式IC和式IC′化合物还包括其中R1为H或–CH3,R1′不存在或为H，且R4为–C(O)R8且R8为3–吲哚基的那些。此类化合物包括以SMIDs“ibha”(R1为–CH3)和“ibho”标记的化合物(R1为H)。
本发明这方面的另一个实施方案为式ID化合物：
其中每个独立地为单键或双键；q1、q2、和q3各自独立地为1至26的整数；q4和q5各自独立地为0至26的整数；q1、q2、q3、q4、和q5的总和小于或等于28；且q4和q5的总和大于或等于1。根据该实施方案的示例性的化合物包括式ID′的那些：
本发明这方面的化合物还可含有两个或更多的式I单元。这些单元可通过该单元的6–元环伸出的任何取代基相互连接。例如，通式I的一个单元可与式I的另一个单元在下面显示的1′、2′、3′、4′、或5′位置上的任何取代基通过相同或不同的位置连接。
本发明这方面的另一个实施方案为这样的化合物：其中式I的一个单元中的R5为与式I的另一个单元的R3或R4连接的直连键，形成含有式I的至少两个单元（仅包括两个单元）的化合物。根据该实施方案的示例性的化合物包括，例如，式IE和式IF化合物：
其中R2a和R2b各自独立地为下式的部分每个R3和R4独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或含5或6个碳原子的单糖；且R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或含5或6个碳原子的单糖。适合的化合物包括，例如，式IE′和式IF′化合物：
IE、IE′、IF和IF化合物包括二聚体的蛔苷(例如，本文中标记“dasc”的化合物)，例如dasc#1、dascs#2、和dasc#3：
本发明这方面的另一个实施方案为式I″化合物：
式I″为式I′的立体异构体。对于式I′化合物的上述R1、R1′、R2、R3、R5、R6、R7、R8、和R9的所有优选和示例性的定义对于I″也是适合的实例。根据该实施方案的适合的化合物包括其中R5为–OCHR6R7且R6和R7中至少一个为被–NHC(O)R8取代的烷基的那些。
本发明这方面的另一个实施方案为式I化合物，其中满足下列中的至少一个条件：
（i）R1独立地为–C(R′)3，–OR，–N(R)2，卤素，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基，且每个R′独立地为卤素或链烯基；且
R1′独立地为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；
（ii）R2为
其中：
每个独立地为单键或双键；
q1、q2、和q3各自独立地为1至26的整数；
q4和q5各自独立地为0至26的整数；
q1、q2、q3、q4和q5的总和小于或等于28；且
q4和q5的总和大于等于2；
（iii）R5为H，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，或核苷；
（iv）R5为与式I的另一单元的R3或R4连接的直连键，形成含有至少两个式I的单元的化合物；
（v）R3和R4各自独立地为–CR6R7R8，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或–(CO)R8其中R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
（vi）化合物为式I″化合物；
条件是该化合物不是
该实施方案的一个实例是其中条件(i)被满足的化合物。烷基或链烯基基团可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。此实例包括其中R1为链烯基和R1′不存在或为H的化合物。
该实施方案的另一个实例是其中条件(ii)被满足的化合物。此类化合物包括，例如，式ID和ID′化合物，例如
该实施方案的另一个实例是其中条件(iii)被满足的化合物。链烯基、芳基、杂芳基、芳基烷基、杂环基、环烷基、环烯基、酰基、氨基酸、或核苷基团任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。优选地，在此实例中R5为–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NR6R7，或–CR6R7C(O)NHR8。特别优选–OCHR6R7。在这些优选的实例中，R6和R7典型地各自独立地为烷基或芳基。烷基或芳基基团可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。例如，这些基团可任选地被独立地选自–OR8、–C(O)R8、和–NHC(O)R8的一个或多个取代基取代。优选地，R8为H、–OH、–NH2、烷基、嘌呤、或嘧啶。烷基、嘌呤、或嘧啶基团可任选地被独立地选自–COOH和含5或6个碳原子的单糖的一个或多个取代基取代。
根据此实例的适合的化合物包括其中R5为下列的那些：
或此类化合物包括苯基乙醇胺蛔苷（例如，本文中标记“pasc”的化合物）、和蛔苷乙醇酰胺。根据此实例的示例性的化合物包括：
其中m1为1(即，pasc#9)、2(即，pasc#12)、或3(即，pasc#1)。其它根据此实例的示例性的化合物还包括如下所示的化合物：
其中RI为–NH3且m2为20；或者RI为H且m2为22。
该实施方案的另一个实例是其中条件(iv)被满足的化合物。式I的至少两个单元可按照上面的描述连接。根据此实例的适合的化合物包括，例如，式IE、式IF、式IE′、式IF′的化合物、和只含有通式I的两个单元的化合物。在某些实例中，R1独立地为H或烷基(例如，–CH3)。示例性的化合物包括：其中R2a为–(CH2)nC(O)–、R2b为–(CH2)nC(O)–、和R2a和R2b两者均为–(CH2)nC(O)–的式IE和IE′化合物；其中R2a为–(CH2)nC(O)–、R2b为–(CH2)nC(O)–、和R2b和R2b两者均为–(CH2)nC(O)–的式IF和IF′化合物；其中R3为H的化合物；其中每个R1独立地为H或烷基(例如，–CH3)的式IE、IE′、IF、和IF′化合物；其中R3为H的式IE、IE′、IF、和IF′化合物；其中R4独立地为H或–C(O)R8、R8为任选地被–NHC(O)R9取代的烷基、且R9为H或–NH2的IE、IE′、IF、和IF′化合物。IE、IE′、IF、和IF化合物包括二聚体的蛔苷(例如，本文中标注“dasc”或“ubas”(“3–脲基异丁酸酯蛔苷”)的化合物)，例如dasc#1、dasc#2(亦称ubas#1)、和dasc#3(亦称ubas#2)：
该实施方案的另一个实例是其中条件(v)被满足的化合物。烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、酰基、氨基酸、或核苷可任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代。根据此实例的适合的化合物包括其中R3和R4各自为–C(O)R8；R8优选为被–NHC(O)NH2或含5或6个碳原子的单糖(例如，己糖，如葡基)二者之一取代的烷基的那些。根据此实例的适合的化合物亦包括其中R8为–[CH2]n4NHC(O)R9或–[CH2]n4C(O)(NH)R9；R9优选为被一个或多个选自–OH、苯基、酚、和羧基苯基的取代基取代的烷基或芳基。根据此实例的实例化合物亦包括其中R3和/或R4为下列的那些：
该实施方案的另一个实例是其中条件(vi)被满足的化合物。根据此实例的示例性的化合物包括，例如，式I″a化合物：
对于条件(i)–(iv)的上述R1、R1′、R2、R3、R5R6、R7、R8、和R9的所有优选和示例性的定义在此实例中也是适合的。根据此实例的适合的化合物包括，例如，式I″和I″a化合物，其中：R1为H或烷基(例如，–CH3)且R′不存在或为H，烷基或链烯基基团任选地被一个或多个本文中定义的取代基取代；R2为–(CH2)nC(O)R5；R3为H；R4为H；R5为–OH或–OCHR6R7，其中R6、R7、R8、和R9任选地按照上面注释的定义例如其中条件(iii)被满足。根据此实例的化合物亦包括泊雷糖苷（例如，本文中标记的“part”的化合物）和含核苷的泊雷糖苷（例如，本文中标记“npar”的化合物），例如part＃9、npar#1、npar#2、和npar#3：
本发明的另一方面涉及包含至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖的分离的化合物。至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖通过共价键连接。化合物优选具有低于约2,000g/mol的分子量。
根据本发明这方面的适合的核碱基包括天然或合成的核碱基、和一般的碱，如上所述。在至少一个实施方案中，至少一个核碱基选自嘌呤，嘧啶，腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶，尿嘧啶，胞嘧啶，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，nubularine，isoguanisine，tubercidine，及其衍生物和类似物。在至少一个实施方案中，核碱基任选地被嘌呤，例如，具有与9位连接的取代基(例如，至少一个糖(例如，吡喃糖，3,6–双脱氧糖))的嘌呤取代。至少一个核碱基可通过核碱基上或在核苷的情况下核糖糖上的任何原子与至少一个糖、至少一个氨基酸、和/或至少一个脂肪酸连接。例如，核碱基可通过，例如，与核碱基上的环外氨基连接与至少一个氨基酸连接。
根据本发明这方面的适合的脂肪酸包括饱和、不饱和、和多不饱和脂肪酸，如上所述。在至少一个实施方案中，至少一个脂肪酸包括羟酸(例如，C4–32羟酸)。可以在脂肪酸的脂肪链上有多羟基取代基。至少一个羟基位于β位，如下面的流程图1所示。
流程图1
在至少一个实施方案中，至少一个脂肪酸为β–氧化的产物。在这样的实施方案中，至少一个双键存于脂肪酸的α和β位置之间。在至少一个实施方案中，至少一个脂肪酸为通过，例如，与羟酸的羟基基团连接的醚键，与至少一个糖连接的C4–32羟酸。这包括，例如，通过醚键与其异构羟基基团连接，通过β吡喃糖苷（pyranosidic）键连接等。
根据本发明这方面的适合的氨基酸包括天然或合成的氨基酸，如上所述。在至少一个实施方案中，至少一个氨基酸选自α氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸、L–氨基酸、和D–氨基酸。至少一个氨基酸的侧链可包括，例如，选自下列的取代基：＊–OR,＊–NRR′,＊–SR,＊–C(O)NRR′，和＊–Im–R，其中＊–代表取代基与氨基酸的碳原子连接的位置，R为与至少一个脂肪酸的羧基基团连接产生的酰基基团，Im为咪唑环，且R′为–H、任选地被取代的C1–12脂肪族、或任选地被取代的芳基。
根据本发明这方面的适合的糖包括任何本领域的技术人员已知的碳水化合物，包括，例如，单糖。在至少一个实施方案中，至少一个糖选自脱氧糖、双脱氧糖、和3′,6′–双脱氧糖，包括，例如，蛔糖、甘露糖、戊糖、己糖、核糖、和脱氧核糖。
至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖可通过各种连接原子以任何顺序相互连接，只要这种连接是有效的和所得化合物是稳定的。
根据本发明这方面的适合的实施方案包括，例如，其中至少一个脂肪酸通过ω–连接或通过ω–1连接与至少一个糖（例如，蛔糖）连接，如上面的流程图1所示。
在本发明这方面的至少一个实施方案中，化合物进一步包含至少一个第二糖。适合的糖包括上述已鉴定的那些。在优选的实施方案中，至少一个第二糖为戊糖如核糖糖或改性核糖糖。优选地，至少一个第二糖可通过β–糖苷键与至少一个核碱基形成至少一个核苷。
本发明这方面的实施方案包括具有[NB]–[AA]–[FA]–[S]式的化合物，具有[S1]–[NB]–[AA]–[FA]–[S2]式的化合物，和具有式[S1]–[S2]–[NB]–[AA]–[FA]–[S3]的化合物，其中NB为核碱基，AA为氨基酸，FA为脂肪酸，且S、S1、S2、和S3各自独立地为糖。第二个式中的S1和NB、第三个式中的S2和NB，可任选地形成核苷。核苷可通过脲连接与氨基酸的氨基基团连接。氨基酸可包含具有一个或多个杂原子的侧链。脂肪酸可通过，例如，存在于氨基酸侧链上的杂原子和脂肪酸的羧基部分之间的共价键与氨基酸连接。例如，氨基酸可通过酯键、酰胺键、硫酯键、酰亚胺键、酰基脒键、酰基胍键等与脂肪酸基团的羧基连接。作为替代，氨基酸可通过，例如，脂肪酸羧基和存在于氨基酸侧链上的羟基之间的酯键与脂肪酸连接。
本发明所有方面的分离的化合物可通过应用已知的方法来制备。适合的方法包括分离天然产生的化合物、以及运用以前所用的或在文献中描述的方法合成，例如，Larock：Comprehensive OrganicTransformations(Wiley–VCH publishers,New York(1989))描述的那些，在此全文引入作为参考。合成化合物的适合的方法包括实施例15–21、35–43、和80–81中描述的那些。
本发明还可参考下列实施例来说明。
实施例
以下实施例旨在举例说明，但决不旨在限定所附权利要求陈述的本发明的范围。
实施例1—分析仪器和步骤
核磁共振（NMR）记录在Varian INOVA600NMR上（1H使用600MHz，13C使用151MHz）。NMR–光谱采用Varian VNMR和MestreLabs MestReC软件包进行处理。其它由核磁共振光谱获得的位图的处理使在用Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)中描述的Adobe Photoshop CS3进行，其在此全文引入作为参考。采用装有二极管阵列检测器和与Quattro II分光计（Micromass/Waters）连接的Agilent1100系列HPLC系统进行高效液体色谱–质谱（HPLC–MS）。数据采集和处理由MassLynx软件控制。采用Teledyne ISCOCombiFlash系统进行急骤层析。
实施例2—秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株和一般培养法
除非另有说明，所有菌株保持在NGM琼脂板上在20℃，其中NGM琼脂板用Bacto琼脂（BD Biosciences）制成并接种过夜培养的OP50细菌。秀丽隐杆线虫（C.elegans）变种N2Bristol和来自him–5(e1490)的雄性菌株CB1490用于吸引生物测定和自动化的跟踪仪实验。在减数分裂期间him–5(e1490)突变体通过不分离X染色体分离（segregates）XO型雄体后代(Hodgkin等,Genetics91:67–94(1979),在此全文引入作为参考)。转基因菌株PS6025qrIs2[sra–9::mCasp1]，在ASK神经元中受sra–9启动子的影响表达哺乳动物的半胱天冬酶(Tokumitsu Wakabayashi,Iwate University赠予)，用于ASK神经元的基因切除（genetic ablation）。使用的其它菌株如下：CB4856,C.elegans Hawaii isolate(Hodgkin&Doniach,Genetics146:149–64(1997)，在此全文引入作为参考)；RC301,C.elegans Freiburg isolate(de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Hodgkin&Doniach,Genetics146:149–64(1997)，在此全文引入作为参考)；DA609npr–1（ad609）;CX4148npr–1(ky13)(de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998)，在此全文引入作为参考)；CX9740C.elegans(N2);kyEx2144[ncs–1::gfp](Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考)；N2;Ex(gcy–28::dp::mec–4D)(Shinkai等，J.Neurosci.31:3007–15(2011)，在此全文引入作为参考)；CX10981kyEx2866[“ASK::GCaMP2.2b”sra–9::GCaMP2.2b SL2GFP,ofm–1::GFP](ASK imaging line);CX11073kyEx2916[“AIA::GCaMP2.2b”T01A4.1::GCaMP2.2b SL2GFP,ofm–1::GFP](AIAimaging line)(Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考)；DR476daf–22(m130)(Golden&Riddle,Mol.Gen.Genet.198:534–36(1985)，在此全文引入作为参考)；和daf–22(ok693)(Butcher等，PNAS106:1875–79(2009)，在此全文引入作为参考)。
实施例3—秀丽隐杆线虫（C.elegans）代谢物命名
所有新鉴定的蛔苷以四个字母“SMID”（SMID：Small MoleculeIDentifiers）命名，例如，“icas#3”或“ascr#10”。SMID数据库，在此全文引入作为参考，是一种由与Paul Sternberg和WormBase合作的在Boyce Thompson Institute的Frank Schroeder和Lukas Mueller维护的电子资源。该数据库目录新鉴定的源自秀丽隐杆线虫（C.elegans）及其它线虫的秀丽隐杆线虫（C.elegans）小分子，为鉴定了的小分子分配独一无二的四字母SMID（可查询的、基因型SmallMolecule IDentifiers），包括一列在文献中使用的各化合物的其它名字和缩写。
实施例4—代谢物提取物的制备
按照先前描述于Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)（在此全文引入作为参考）中的方法制备代谢物提取物，其改进如下。
来自三个10cm NGM板的蠕虫（N2或daf–22）用M9培养基洗涤，变成100mLS–培养基预培养物，让它们在其中在旋转摇瓶机上于22℃生长5天。在第1和3天加入作为食物的由1L细菌培养物获得的浓缩的大肠杆菌OP50（在LB培养基中生长了16小时）。随后，将预培养物平均分配到四个装有400mL S–培养基的1L锥形烧瓶中，S–培养基的合并体积为425mL，然后让其在旋转摇瓶机上于22℃再生长10天。从第1至9天每天加入作为食物的由1L细菌培养物获得的浓缩OP50。随后，将培养物离心并将上清液培养基和蠕虫沉淀（pellet）分别冻干。冻干物用95%乙醇（250mL，2次）于室温提取12小时。将所得到的黄色悬浮液过滤。然后将滤液于室温在真空中蒸干，产生培养基和蠕虫沉淀（pellet）代谢物提取物。
实施例5—色谱分级
将由两种培养物得到的培养基代谢物提取物吸附到6g十八烷基官能化的硅胶上并干装入空白的25g RediSep Rf样品装载筒内。然后将吸附物通过反相RediSep Rf GOLD30g HPLC18柱采用水–甲醇溶剂系统分级。溶剂从100%水开始持续4分钟，之后线性增加甲醇含量，在42分钟时最高至100%甲醇，持续直至55分钟。将由该分级产生的八个级分在真空中蒸干。残余物通过HPLC–MS和二维核磁共振（2D–NMR）光谱进行分析。
实施例6—质谱分析
将由色谱分级获得的蠕虫培养基提取物或代谢物级分再悬浮于1.5ml甲醇中并在2,000g下离心5分钟。将上清液进行HPLC–MS分析。用Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4×250mm,5μm粒径）进行HPLC。采用0.1%乙酸–乙腈溶剂梯度，从5%的乙腈含量开始持续5分钟，在40分钟的时间内将其增加到100%。采用电喷射电离以阴离子或阳离子模式进行质谱。
实施例7—秀丽隐杆线虫（C.elegans）纯培养（Axenic Cultures）和生物合成研究
以胆固醇(5mg/l)代替谷甾醇和核苷–5–磷酸酯，采用秀丽隐杆线虫（C.elegans）维持培养基(CeMM,Lu&Goetsch,Nematologica39:303–11(1993)（在此全文引入作为参考），按照Nass&Hamza,Curr.Protoc.Toxicol.31:1.9.1–1.9.18(2007)（在此全文引入作为参考）的描述建立秀丽隐杆线虫（C.elegans）（N2,Bristol）的体外纯培养。在21天之后，将培养物离心。将所得到的上清液培养基和蠕虫沉淀（pellet）分别冻干。将冻干的蠕虫沉淀(1.2–2.0mg)用2ml甲醇提取，过滤，然后在真空中浓缩。冻干的蠕虫培养基用乙酸乙酯–甲醇（95:5，100mL，两次）提取，过滤，然后在真空中浓缩。残余物以150μl甲醇收纳并通过高效液相色谱–电喷射电离串联–质谱（HPLC–ESI–MS）研究。为了应用实验，用得自剑桥同位素实验室（Cambridge IsotopeLaboratories）的9.2mg L–[2,4,5,6,7–D5]–色氨酸补充50ml CeMM培养基。
实施例8—点吸引检测
按照先前报道的方法(Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Srinivasan等,Nature454:1115–18(2008),在此全文引入作为参考)进行点吸引检测（spot attraction assays）。对于两种秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体和雄性，每天在第四幼虫期(L4)收获50–60只蠕虫并按性别于20℃分开储存过夜，以在随后的几天作为年轻的成虫使用。对于竞争实验，采用两种条件：在含10%乙醇的水中的120nM ascr#3和10nM icas#3（条件1），或12μM ascr#3和1μM icas#3（条件2）。将等分试样于-20℃储存在20μL管内。在水中的10%乙醇用作对照。
实施例9—象限趋化性检测
在10cm四象限陪替氏平皿（petri plates）上评价对非吲哚和吲哚两种蛔苷的趋化性(Wicks等，Dev.Biol.221:295–307(2000)，在此全文引入作为参考)。各象限通过塑料隔片与相邻的象限分开（附图1B）。相反的象限对填充含不同浓度的吲哚蛔苷或非吲哚蛔苷的线虫生长培养基（NGM）琼脂。将动物在S–基础缓冲液中轻轻地洗涤，以交替象限置于含蛔苷的四象限板的中心，并在15分钟和30分钟之后记分（scored）。趋化性指数计算如下：(蛔苷象限上的动物数减缓冲液象限上的动物数)/(总动物数)。
实施例10—运动参数的测量
采用自动化蠕虫–跟踪系统测量反转频率和速度（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)；Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）。
实施例11—群聚检测
蠕虫的群聚行为采用de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998)中报道的检测方法进行测量，在此全文引入作为参考。群聚检测在标准NGM板上进行。通过在将它们倾倒到板上之前将吲哚蛔苷原液加入到NGM培养基中制备含吲哚蛔苷的板。将这些板于室温干燥2至3天。对照板进行类似地处理，除了将乙醇溶液代替icas溶液加入到板中外，相应的引入的量通过icas溶液计算。对于所有的条件板中的最终乙醇浓度低于0.1%。在干燥之后，将对照板和含吲哚蛔苷的板均用微量吸移管以150μl大肠杆菌OP50的过夜培养物接种，并让其于室温干燥2天。
对于“低蠕虫密度”实验，将20只蠕虫放在菌苔（lawn）上并于20℃放置3小时。对于“高蠕虫密度”实验，将大约120只蠕虫放在细菌菌苔（lawn）上并于20℃放置3小时。以与两个或更多高于它们体长50%的动物接触的动物数对群聚行为进行定量。
实施例12—钙成像和分析
在ASK(kyEx2866)和AIA(kyEx2916)（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）中表达基因编码的Ca2+感受器的转基因线用于钙成像。将年轻的成虫或蠕虫成虫插入“嗅觉芯片”微流控设备中（Chronis等，Nat.Methods4:727–31(2007)，在此全文引入作为参考）。以S–基础缓冲液（不含胆固醇）进行icas#3的稀释。由于icas#3的原液含有少量的乙醇，将等量的乙醇加入到该S–基础对照流中。
采用装有Andor照相机的Zeiss显微镜进行成像。图象获取的曝光时间为300毫秒。在ASK神经元成像之前，由于ASK对蓝光本身有响应将蠕虫暴露于蓝光3分钟。此步骤为神经元适应用于Ca2+测量的蓝光所必需。采用定做的Matlab手稿（scripts）对影片进行分析。选择在暴露于缓冲液或icas#3之后立即出现的荧光的第一峰作为计算暴露于缓冲液或icas#3的荧光的平均变化。然后从在输送icas#3/缓冲液前5秒期间（相当于附图2D中5至10秒区域）的平均荧光中减去此值的最大量。
实施例13—统计分析
采用Welch氏校正的非配对t检验：(i)用于比较吲哚蛔苷上的两性体和雄性的吸引（＊：p<0.01,＊＊：p<0.001,＊＊＊：p<0.0001）（附图1C–1D，3A，3D，4A，5A，和6C）；(ii)比较未切除和ASK切除的系之间的反转（＊：p<0.01,＊＊：p<0.001）（附图7A–B）；(iii)比较野型蠕虫对ASK和AIA的基因切除的系以及ASI和RMG神经元切除的吸引（＊＊＊：p<0.0001）（附图2B）；和(iv)比较对缓冲液和icas#3的G–CaMP荧光变化（＊＊：p<0.001）（附图2E）。采用单因素ANOVA之后采用Dunnett氏事后检验：(i)用于比较各菌株的象限趋化性指数（＊：p<0.05,＊＊：p<0.01）（附图1E和3B–C）；(ii)用于比较含吲哚蛔苷的板上独居、群居蠕虫和Cel–daf–22的群聚（＊：p<0.05,＊＊：p<0.01）（附图5C,6A–B，和8A–C）；(iii)比较含吲哚蛔苷的板上蠕虫被停止的持续时间（＊：p<0.05,＊＊：p<0.01）（附图8D）；和(iv)比较含吲哚蛔苷的板上的速度和反转频率（＊：p<0.05,＊＊：p<0.01）（附图6D–E）。所有误差条指示均值标准误差（S.E.M）。
实施例14—在100fM下在一个L4蠕虫体积中icas#3分子数的计算
采用方程式(1)计算在100fM（飞摩尔）下在一个L4蠕虫体积中icas#3的分子数（n）：
n=VYA＊c＊NA(1)
其中：
VYA=秀丽隐杆线虫（C.elegans）年轻的成虫的体积（Knight等，Evol.Dev.4:16–27(2002)，在此全文引入作为参考）
c=浓度(100fM)
NA=阿伏加德罗数
在这种情况下，VYA=3＊106μm3=3＊10–9L和c=10fM=10–14M.求出n,n=VYA＊c＊NA=3＊10–9L＊10–14mol＊L–1＊6.022＊1023mol–1=18分子。因此，在10fM的icas#3浓度下有18个含在一个琼脂的蠕虫体积中将icas#3分子。
实施例15—化学合成
用于生物学检测和作为HPLC–MS标准品的吲哚蛔苷icas#1，icas#7，icas#3，和icas#9样品通过化学合成制备。详细的合成的步骤和NMR–光谱数据在实施例16–21中描述。
实施例16—蛔苷ascr#9的合成
为了制备ascr#9，将(R)–己–5–烯–2–醇2(32mg，0.32mmol)(按照Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)中的描述制备，在此全文引入作为参考，采用关于ascr#6的合成描述的条件)与三氯乙酰亚胺1（trichloroacetimide1）(150mg，0.3mmol，Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)偶联。将所得糖苷3(92mg，0.21mmol)溶解于丙酮(2ml)并用2ml的1M的高锰酸钾溶液处理。在30分钟之后，将反应混合物倒入冰冷过的饱和氯化钠水溶液(5ml)、乙酸(0.1ml)、和二氯甲烷(DCM)(5ml)的混合物中。分离有机相并将水相用两份5ml–的DCM萃取。合并的有机萃取液经硫酸钠干燥，蒸干，并再溶解于0.5M含水的氢氧化锂(2ml)和二噁烷(6ml)的混合物中。将混合物于70℃搅拌3小时，然后冷却至23℃并用0.2M盐酸水溶液酸化。将混合物蒸干并通过Combiflash柱色谱采用甲醇–DCM溶剂梯度洗脱纯化，产生15.6mg(0.063mmol)的稠油状的纯ascr#9。
在甲醇–d4中获得ascr#9的1H(600MHz)和13C(126MHz)NMR光谱数据。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm.偶合常数以赫兹[Hz]给出。1H NMR(600MHz,CD3OD)：δ4.65(s,1H),3.84(m,1H),3.72(m,1H),3.61(dq,1H,J=9.4Hz,J=6.1Hz),3.51(ddd,1H,J=11.2Hz,J=9.5Hz,J=4.5Hz),2.43(m,2H),1.95(dt,1H,J=13.1Hz,J=3.5Hz),1.71–1.87(m,3H),1.22(d,3H,J=6.1Hz),1.15(d,3H,J=6.1Hz)ppm;13C NMR(126MHz,CD3OD)：δ174.5,97.3;71.5,71.4,69.9,68.4,36.0,33.5,31,3,19.1,18.1ppm;ESI–MS(m/z)：[M–H]247.2。
实施例17—蛔苷ascr#10的合成
为了制备ascr#10，将搅拌过ascr#3(3.2mg，10.6μmol，Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)在10ml乙醇中的溶液用活性碳载钯(10%Pd，1个大气压的H2压力)于23℃氢化18小时。完成之后，将反应物蒸干。残余物在二氧化硅短垫上采用1:8（v/v）甲醇和DCM的混合物过滤，产生3.0mg(9.9μmol)的纯ascr#10。
在甲醇–d4中获得ascr#10的1H(600MHz)和13C(126MHz)NMR光谱数据。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm.偶合常数以赫兹[Hz]给出。1H NMR(600MHz,CD3OD)：δ4.64(s,1H),3.78(m,1H),3.71(m,1H),3.63(dq,1H,J=9.3Hz,J=6.2Hz),3.51(ddd,1H,J=11.2Hz,J=9.3Hz,J=4.6Hz),2.27(t,2H,J=7.4Hz),1.94(dt,1H,J=13.0Hz,J=3.7Hz),1.77(ddd,1H,J=13.3Hz,J=11.5Hz,J=3.0Hz),1.61(m,2H),1.56(m,1H),1.46(m,1H),1.32–1.38(m,6H),1.21(d,3H,J=6.2Hz),1.12(d,3H,J=6.1Hz)ppm;13C NMR(126MHz,CD3OD)：δ177.7,97.3,72.3,71.0,69.8,68.1,38.1,38.2,35.7,34.9,30.0,26.5,26.0,19.0,18.0ppm;ESI–MS(m/z)：[M–H]303.2。
实施例18—吲哚羧基蛔苷icas#1的合成
为了制备icas#1，首先将ascr#1转变为相应的甲基酯。ascr#1(10mg，0.036mmol)，按照Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)的报道制备，在此全文引入作为参考，将其溶解于甲苯(1mL)和甲醇(1mL)的混合物中。向该混合物中，加入四甲基硅烷重氮甲烷(TMS–重氮甲烷)(2M在己烷中的溶液，50μL，0.1mmol)。于23℃搅拌20分钟之后，通过添加乙酸(40μL)破坏过量的TMS–重氮甲烷并在真空中除去溶剂，产生稠油状的ascr#1的甲基酯(10.3mg，0.035mmol)。
下一步，制备吲哚–3–羰基氯化物的溶液。将充分搅拌的吲哚–3–羧酸(67.7mg，0.42mmol)在含有少量二甲基甲酰胺(DMF)(20μL)的无水DCM(2ml)中的悬浮液用乙二酰氯(0.84mmol，107mg，72μL)于0℃处理。在添加到乙二酰氯之后，将混合物于23℃搅拌20分钟，产生透明的、略微黄色的溶液。将该溶液在0.1托下在真空中蒸干以确保除去过量的乙二酰氯，随后再溶解于2ml的无水DCM中。
将ascr#1甲基酯(10.3mg，0.035mmol)的样品溶解于1ml的无水DCM中，向其中加入二异丙基乙基胺(129mg，1mmol)。将所得溶液安装上有效的搅拌棒并冷却至–20℃。随后，在10分钟的时间内在强烈搅拌下滴加吲哚–3–羧酸氯化物的溶液。将充分搅拌的反应逐渐温热至–7℃，在此温度下加入冰冷的饱和碳酸氢钠水溶液(2ml)。让该两相混合物温热至20℃，并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的乙酸乙酯萃取液在真空中蒸发并采用0–10%在DCM中的甲醇在硅胶上进行柱色谱。
将含有ascr#1甲基酯的双–2,4–O–(–吲哚–3–羰基)–衍生物合并，蒸干，并用3ml0.5M氢氧化锂水溶液和7ml二噁烷的混合物于67℃处理3小时。随后，将反应混合物冷却至23℃，通过添加0.2M盐酸水溶液中和，并在真空中蒸干。将残余物通过Agilent EclipseXDBC–18柱（25cm×9.4mm,5μm粒径）的HPLC纯化。乙腈和0.1%含水的乙酸用作溶剂，乙腈的百分比从0分钟时的15%增加至30分钟时的85%。将含有icas#1的级分蒸发，产生5.8mg(0.014mmol)的蜡样白色固体的目标化合物。
采用甲醇–d4获得icas#1的1H(600MHz)、13C(126MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表1中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。偶合常数以赫兹[Hz]给出；＊：可互换。
表1.icas#1的NMR光谱数据
位置 δ13C[ppm] δ1H[ppm] 1H–1H–偶合常数
1 177.6
2 35.1 2.35 J2,3=7.4
3 26.6＊ 1.45–1.70
4 26.2＊ 1.45–1.70
5 38.1 1.45–1.70
6 72.7 3.86
7 19.4 1.17 J6,7=6.1
1′ 97.7 4.75
2′ 69.6 3.79
3′ 33.5 2.01(ax) J3′ax,3′eq=13.0,J3′ax,4′=11.4,J2′,3′ax=2.9
2.21(eq) J2′,3′eq=3.2,J3′eq,4′=4.7
4′ 70.6 5.12 J4′,5′=9.6
5′ 68.8 4.05 J5′,6′=6.3
6′ 18.3 1.24
2″ 133.5 7.97
3″ 108.4
3″–COO 166.5
3a″ 127.3
4″ 121.9 8.02 J4″,5″=7.2
5″ 122.7 7.16
6″ 123.8 7.29
7″ 113.1 7.44 J6″,7″=7.9
7a″ 138.2
实施例19—吲哚羧基蛔苷icas#3的合成
为了制备icas#3，首先将ascr#3转变为相应的甲基酯。ascr#3(5.2mg，0.017mmol)，按照Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)的报道制备，在此全文引入作为参考，将其溶解于甲苯(1mL)和甲醇(1mL)的混合物中。向该混合物中，加入TMS–重氮甲烷(2M在己烷中的溶液，25μL，0.05mmol)。于23℃搅拌20分钟之后，通过添加乙酸(30μL)破坏过量的TMS–重氮甲烷并在真空中除去溶剂，产生稠油状的ascr#3的甲基酯(5.3mg，0.017mmol)。
按照实施例18中对于制备icas#1的描述使ascr#3甲基酯(10.3mg，0.035mmol)的样品与吲哚碳酰氯起反应，所有试剂使用按比例较少的量。反应产物粗品的纯化采用实施例18中描述的条件通过HPLC纯化，产生无色油状的icas#3(2.3mg，5.2μmol)。
采用甲醇–d4获得icas#3的1H(600MHz)、13C(126MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表2中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm.偶合常数以赫兹[Hz]给出。
表2.icas#3的NMR光谱数据
实施例20—吲哚羧基蛔苷icas#7的合成
按照实施例18中由ascr#1制备icas#1的描述，icas#7(120μg)的标准样品由ascr#7(0.5mg，Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)获得。
采用甲醇–d4获得icas#7的1H(600MHz)NMR光谱数据，并显示于下面的表3中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm.偶合常数以赫兹[Hz]给出。
表3.icas#7的NMR光谱数据
位置 1H[ppm] 1H–1H–偶合常数
2 5.84 J2,3=15.3
3 6.99 J3,4=6.8
4 2.40
2.33
5 1.70
1.65
6 3.91
7 1.18 J6,7=6.1
1′ 4.75
2′ 3.80
3′ 2.03(ax) J3′ax,3′eq=13.0,J3′ax,4′=11.4,J2′,3′ax=2.9
2.21(eq) J2′,3′eq=3.2,J3′eq,4′=4.7
4′ 5.12 J4′,5′=9.6
5′ 4.07 J5′,6′=6.3
6′ 1.24
2″ 7.97
4″ 8.04 J4″,5″=7.5
5″ 7.15
6″ 7.16
7″ 7.43 J6″,7″=7.9
实施例21—吲哚羧基蛔苷icas#9的合成
按照实施例18中由ascr#1制备icas#1的描述，icas#9由ascr#9获得。NMR–光谱数据与公开的数据一致(Butcher等，Org.Lett.11:3100–03(2009)，在此全文引入作为参考)。
实施例22—通过比较代谢组学进行吲哚蛔苷icas#3的鉴定
目前已知的秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的所有小分子信息素由长链脂肪酸通过DAF–22（一种与人固醇载体蛋白SCPx同源性强的蛋白）的过氧化物酶体β–氧化获得（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)；Butcher等，PNAS106:1875–79(2009)，在此全文引入作为参考）。有人怀疑假定的聚集信息素可由相同的途径获得，暗示daf–22突变体将不生产它们。那样的话，野型代谢组（metabolome）与由daf–22突变体蠕虫获得的光谱比较将揭示关于吸引或群聚信号的候选化合物。
在先前的研究中，基于核磁共振光谱学的技术被称为核磁共振光谱的差示分析（“DANS”）用于比较野型代谢组与daf–22突变体蠕虫（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考）。该比较导致ascr#6–8的鉴定，其中ascr#8是雄性吸引信号的主成分（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考）。基于具有改进信噪比的核磁共振光谱，进行野生型和daf–22–突变体较详细的比较，揭示了野型代谢组中daf–22蠕虫不产生的几种含吲哚的化合物（附图9B–C）。该证实的DAF–22在信息素生物合成中的作用（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Butcher等，PNAS106:1875–79(2009);Golden&Riddle,Mol.Gen.Genet.198:534–36(1985)，在此全文引入作为参考）表明这些吲哚衍生物可代表先前未被认识的信号分子族。
为了弄清楚daf–22依赖性吲哚衍生物的结构和生物学作用，通过野型代谢组的核磁共振光谱学引导的分级继续进行这些吲哚衍生物的鉴定。反相色谱产生八个代谢物级分，通过二维核磁共振波谱学对其进行分析。核磁共振光谱显示在两个级分中存在daf–22–依赖性吲哚衍生物，选择其进行NMR–光谱和质谱研究。这些分析表明最丰富的daf–22–依赖性吲哚衍生物由与带有9–碳不饱和侧链的蛔糖连接的吲哚–羧基单元组成，在已知的ascr#3中发现的相同（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）（参见实施例18–19，附图10–13中的NMR和MS数据）。基于其与已知的ascr#3的结构关系，此新鉴定的代谢物命名为吲哚羧基蛔苷“icas#3”（附图9E）。
实施例23—Icas#3是较大族的色氨酸–衍生的小分子的一部分
对其它通过DANS检测的daf–22–依赖性吲哚化合物进行了研究以确定它们是否也代表吲哚蛔苷。为了此研究使用了质谱（MS）方法，因为icas#3的质谱分析揭示了特有的MS裂解方式（吲哚–3–羧基部分的丢失，附图12），这使能筛选相关的化合物。
对具有类似碎裂特性的化合物的MS筛选表明icas#3是较大系列的吲哚蛔苷，特征是具有五至九个碳的侧链（附图9D–E）。该族吲哚蛔苷最丰富的组分是icas#3、icas#9、和icas#10，伴随有较少量的icas#1和icas#7（附图9E）。所有这些化合物都代表新代谢产物，除icas#9以外，其已经被报道具有中度诱导休眠期的活性，且在已知的休眠期信息素之中是独一无二的产生钟形的响应曲线（Butcher等，Org.Lett.11:3100–03(2009)，在此全文引入作为参考）。
还检测到两种新非吲哚蛔苷：ascr#9，其特征是饱和的5–碳侧链，和ascr#10，其特征是饱和的9–碳侧链，代表已知的ascr#3的饱和类似物（附图9F）。
MS分析进一步揭示吲哚蛔苷的定量分布明显不同于相应的非吲哚蛔苷，表明吲哚单元的引入受到强烈调节。最丰富的吲哚蛔苷，icas#3，伴随有10至40倍大量的相应的非吲哚蛔苷，ascr#3；而icas#9比相应的ascr#9更丰富（附图9G）。
为了确定吲哚蛔苷的生物合成来源和排除它们由大肠杆菌（E.coli）食物源产生的可能性，采用化学上定义的CeMM培养基建立秀丽隐杆线虫（C.elegans）（N2）的体外纯培养（无菌的）(Lu&Goetsch,Nematologica39:303–11(1993);Nass&Hamza,Curr.Protoc.Toxicol.31:1.9.1–1.9.18(2007)，在此全文引入作为参考)。纯培养的HPLC–MS分析揭示存在icas#1、icas#3、icas#9、和icas#10，因而表明吲哚蛔苷由秀丽隐杆线虫（C.elegans）产生，而没有饮食细菌的参与。在纯培养基中使用L–[2,4,5,6,7–D5]–色氨酸和L–色氨酸1:1的混合物导致产生[D5]–icas#1、[D5]–icas#3、[D5]–icas#9、和[D5]–icas#10，与等量的未标记的化合物一起（附图13）。总之，这些生化研究证实了吲哚蛔苷中的吲哚–3–羧基部分的色氨酸来源并表明这些化合物是受强烈调节的生物合成途径的产物。
实施例24—吲哚蛔苷强烈吸引两性体
吲哚–3–羧基部分加入到蛔苷下代表明显的结构变化。此化学差别可能表示这些化合物的信号功能不同于它们的非吲哚同源物的信号功能。
对三个合成的不同侧链长的吲哚蛔苷，icas#1、icas#3和icas#9，在点吸引检测中进行试验以证实小分子的社会功能（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）（附图1A）。所有三个试验过的吲哚蛔苷，icas#1、icas#3和icas#9，在高浓度下都既吸引雄性又吸引两性体（附图1C）。在较宽的浓度的范围试验最丰富的吲哚蛔苷，icas#3，显示在低浓度下，icas#3对两性体具有强烈的吸引力，而雄性不再被吸引（附图1D）。类似地，两性体被低浓度的icas#9强烈吸引，但雄性不被强烈吸引（附图5A）。
采用象限趋化性生物测定对两性体吸引到icas#3进行了研究，这在Macosko等，Nature458:1171–75(2009)；Wicks等，Dev.Biol.221:295–307(2000)中报道过，在此全文引入作为参考（附图1B）。与点吸引检测（其测量对每一点化合物源的吸引）相反，象限趋化性检测测量具有定义明确的化合物浓度的板部分上两性体的群聚（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)；Wicks等，Dev.Biol.221:295–307(2000)，在此全文引入作为参考）。发现，低到1pM icas#3的浓度导致对两性体的强烈的吸引（附图1E），在存在和不存在食物的两种情况下均如此（附图5B）。
因此icas#3的生物学作用不同于相应的非吲哚蛔苷ascr#3，其强烈吸引雄性但排斥两性体（Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)；Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）。本发明中的结果显示仅仅通过将吲哚–3–羧基附于蛔糖的4–位上，强烈吸引雄性的ascr#3转变为主要吸引两性体的信号。蠕虫产生ascr#3和icas#3的量的差别对应于它们的相对功效：吸引雄性的ascr#3（其具有比icas#3低得多的效能），以比非常有效的两性体诱引剂icas#3高得多的浓度产生（附图9G）。
实施例25—独居和群居的野型两性体被吸引到icas#3，但不被吸引到非吲哚蛔苷
点吸引检测和象限趋化性检测得到的结果表明两性体被强烈吸引到吲哚蛔苷，表明这些化合物调节秀丽隐杆线虫（C.elegans）群聚行为。秀丽隐杆线虫（C.elegans）在其觅食行为方面表现出天然的差别，一些菌株（例如，普通实验室菌株N2）单个分散于细菌菌苔上，而大多数野型菌株（例如，RC301和CB4856（Hawaii））聚集和集聚在细菌最丰富的地方（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998)；Hodgkin&Doniach,Genetics146:149–64(1997)，在此全文引入作为参考）。这些差别被分别称为“独居”和“群居”（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998)；Rogers等，Nat.Neurosci.6:1178–85(2003)，在此全文引入作为参考）。这些在觅食和群聚行为方面的差别与神经肽Y样受体NPR–1的两种不同的等位基因有关（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Rogers等，Nat.Neurosci.6:1178–85(2003)，在此全文引入作为参考），它们在单一氨基酸位置上有差异：独居的菌株如N2表达NPR–1的高活性变异体（215–缬氨酸），而聚集的菌株如CB4856表达NPR–1的低活性变异体（215–苯丙氨酸）（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Rogers等，Nat.Neurosci.6:1178–85(2003)，在此全文引入作为参考）。功能强烈丢失的突变体npr–1（ad609）和npr–1（ky13），其在N2背景下产生，亦显示高倾向聚集（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Hodgkin&Doniach,Genetics146:149–64(1997)，在此全文引入作为参考）。
先前的研究显示npr–1的功能丧失影响两性体对非吲哚蛔苷的反应（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。尽管表达NPR–1的高活性变异体的野型（N2）蠕虫被非吲哚蛔苷排斥，但npr–1（ad609）突变体显示被吸引到最丰富的非吲哚蛔苷ascr#2、ascr#3和ascr#5接近生理学的混合物（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。
象限趋化性检测和点吸引检测均证实npr–1（ad609）两性体被吸引到ascr#2/3/5混合物；然而，两个试验过的群居野生型菌株（RC301和CB4856）的两性体在任何一个检测中显示不被吸引（附图3A–B）。相反，在象限趋化性和点吸引检测中，群居的野生型菌株（RC301和CB4856）以及npr–1（ad609）两性体均被强烈吸引到icas#3（附图3B–D和5B–C）。这些结果表明icas#3在独居和群居的秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株中均起两性体诱引剂的作用。
实施例26—飞摩尔浓度的吲哚蛔苷促进秀丽隐杆线虫（C.elegans）群聚
对恒定背景浓度的吲哚蛔苷如何影响两性体行为进行了试验。采用两种不同的条件：每个5cm板120只蠕虫的“高蠕虫密度”；和每个5cm板20只蠕虫的“低蠕虫密度”，在对icas#3的响应中对独居的N2蠕虫和几种群居的菌株（包括群居的野生型菌株CB4856和两种npr–1功能丧失的突变体）的群聚进行了测量。
在低蠕虫密度下，观察到对于独居和群居的两性体在低到10fMicas#3的浓度下群聚均非常强烈增加（附图8A和14E）。在pMicas#3下N2两性体的群聚增加到4–倍，icas#3浓度越高导致群聚越少。类似地，天然存在的群居的菌株CB4856显示钟形的响应曲线，在1pM的icas#3下的最大群聚和较低的群聚与在1nM的icas#3下的对照没有显著的差异（附图8A）。相反，在整个试验的浓度范围内icas#3增加了npr–1（ad609）两性体的群聚，而不会在较高的浓度下降低（附图8A）。在高蠕虫密度下，在icas#3板上观察到N2两性体群聚最高3倍增加（附图8B和14F），而所有三个试验过的群居的菌株的两性体即使在缺少icas#3的情况下都显示几乎完全的群聚，这排除了icas#3的任何其它的促进群聚的的效果（附图8B）。这些结果显示即使在缺少浓度梯度的该化合物的情况下icas#3也增加两性体群聚，以及独居和群居的菌株受到类似的影响。类似地，第二丰富的吲哚蛔苷，icas#9，增加独居和群居的两性体两者的群聚（附图6A）。
还研究了icas#3对雄性群聚的影响，其在缺少两性体的情况下通常倾向于群聚（Gems&Riddle,Genetics154:1597–610(2000)，在此全文引入作为参考）。发现在icas#3板上him–5雄性的群聚显著增加（附图6B）。
这些结果显示即使在缺少浓度梯度的情况下吲哚蛔苷也促进群聚行为，表明对icas#3和icas#9的感觉影响对其它促进群聚（化学或其它）信号或条件的反应。例如，在含外源性icas#3的板上蠕虫分泌其它吲哚蛔苷能促进群聚可观察到的增加。为了研究这种可能性，在群聚检测中对daf–22两性体进行试验。在点吸引和象限趋化性检测中daf–22两性体不产生吲哚蛔苷但对icas#3作出反应，跟N2蠕虫一样强烈（附图3B和5C）。发现在1pM icas#3下daf–22两性体显示出比N2蠕虫较少的群聚，但在10pM icas#3下不群聚（附图8C）。这些结果表明蠕虫分泌其它吲哚蛔苷或其它daf–22依赖性化合物可促进在icas#3板上群聚；不过，其它因素，如低氧水平或与其它蠕虫接触（Rogers等，Curr.Biol.16:649–59(2006);Chang等，Publ.Lib.Sci.Biol.4(9):e274(2006);Chang&Bargmann,PNAS105:7321–26(2008)），可能更重要。此外，在icas#3板上运动行为的变化能影响群聚水平（Rogers等，Curr.Biol.16:649–59(2006)，在此全文引入作为参考）。运用自动化机器–视觉系统跟踪蠕虫移动（Cronin等，BMC Genet.6:5(2005)，在此全文引入作为参考），发现诱导群聚浓度的icas#3强烈增加平均停止持续时间并影响其它运动参数（附图6D–E和8D）。蠕虫运动的这些变化，与其它调节群聚因素结合，可促进在icas板上群聚可观察到的增加。
实施例27—对icas#3的反应需要感觉神经元ASK和中间神经元AIA
K型化感器单纤毛感觉神经元（ASK）在调节秀丽隐杆线虫（C.elegans）行为中起重要作用。先前的工作表明雄性和两性体对非吲哚蛔苷的行为响应需要ASK神经元（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。ASK感觉神经元通过解剖缝隙结合部与RMG中间神经元连接，已经表明它基于从ASK及其它感觉神经元的输入起中央枢纽调节群聚和相关行为的作用（Macosko等，Nature458:1171–75(2009);White等，Philos.Trans.R.Soc.London[Biol]314:1–340(1986)，在此全文引入作为参考）（附图2A）。
为了研究icas#3–调节的两性体吸引和群聚所需要的神经回路，进行试验以确定这些行为是否需要ASK神经元。由于哺乳动物半胱天冬酶在发展神经元中的细胞特异性表达产生的缺少ASK神经元的蠕虫（Tokumitsu Wakabayashi,Iwate University Japan）用于这些试验。切除ASK感觉神经元导致吸引到icas#3接近完全丧失（附图2B）。相反，切除ASI神经元（其象ASK神经元参与休眠期信息素感觉），对两性体中icas#3调节的吸引没有明显的影响（附图2B）。另外，与单独切除ASK比较切除ASI和ASK两种神经元不导致吸引的更显著的丧失，表明感觉icas#3需要ASK感觉神经元（附图2B）。
还进行了试验以确定icas#3调节的群聚是否需要ASK神经元。结果表明缺少ASK神经元的两性体对在任何试验浓度下的icas#3没有反应（附图2C）。对在icas#3板上切除ASK的运动分析显示既不增加反转频率也不降低速度，如在野型蠕虫中所观察到的（附图7A–B）。
然后进行试验以确定icas#3调节的行为是否需要RMG中间神经元。采用鉴别干涉对比(DIC)显微镜检查鉴定野型蠕虫和表达ncs–1::gfp的转基因菌株（Bargmann实验室赠予）中RMG中间神经元的单元位置（Sulston等，Dev.Biol.100:64–119(1983)，在此全文引入作为参考）。该转基因表达RMG中间神经元和少量其它感觉神经元中的GFP（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。发现在点吸引检测中切除野型和ncs–1::gfp两种蠕虫中的RMG中间神经元不影响icas#3响应（附图2B）。这些结果表明：与非吲哚蛔苷的行为影响相反（这既需要ASK感觉神经元又需要RMG中间神经元），来自ASK感觉神经元的icas#3衍生的吸引信号的转导不需要RMG中间神经元（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。
鉴于该观测结果，还进行试验以确定对icas#3的反应需要ASK的哪一种中间神经元下游。根据秀丽隐杆线虫（C.elegans）的接线图，ASK神经元的主要突触输出为AIA中间神经元（White等，Philos.Trans.R.Soc.London[Biol]314:1–340(1986)，在此全文引入作为参考）。表达AIA中间神经元中的MEC–4高活性形式的转基因线（Ishihara实验室，日本，赠予）（Shinkai等，J.Neurosci.31:3007–15(2011)，在此全文引入作为参考）用于试验感觉icas#3是否AIA中间神经元。MEC–4、DEG/ENaC钠通道的表达，在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中产生神经元毒性，从而导致AIA神经元的损失（Harbinder等，PNAS94:13128–33(1997)，在此全文引入作为参考）。AIA–不足的蠕虫不显示任何吸引到icas#3，表明icas#3响应需要AIA中间神经元。因此吸引到icas#3所需要的神经回路不同于非吲哚蛔苷。
由于行为检测显示ASK和AIA神经元参与感觉icas#3，因此进行试验以确定是否在这些神经元中icas#3激发钙通量。为了测量Ca2+通量，使用在这些神经元中表达基因编码的钙传感器（GCaMP）的转基因线（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。“嗅觉芯片”用于限制蠕虫并当从这些神经元成像时施加icas#3的开和关步骤（Chronis等，Nat.Methods4:727–31(2007)，在此全文引入作为参考）。即使当施用1pM至1μM的宽范围的浓度时也未检出ASK神经元中的Ca2+瞬变。然后对AIA中间神经元（其为ASK神经元的主要突触靶标）中的钙反应（White等，Philos.Trans.R.Soc.London[Biol]314:1–340(1986)，在此全文引入作为参考）进行监视。结果表明icas#3显著地激发AIA神经元中的G–CaMP荧光增加（附图2D–E），与所报道的以三种非吲哚蛔苷的混合物刺激AIA中间神经元的结果相似（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。这些结果显示对icas的反应需要ASK感觉神经元且这种响应通过AIA中间神经元转导。
实施例28—icas#3和ascr#3是竞争信号
先前的研究显示高诱导休眠期浓度的ascr#3既强烈阻止群居的两性体又强烈阻止独居的两性体（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。为了研究加入ascr#3是否将影响icas#3调节的吸引两性体，在改进的点吸引检测中对含这两种化合物接近12:1（ascr#3:icas#3）的生理学比例的混合物进行试验，其中对N2两性体吸引到三个同心区域A–C评分（附图1A）。结果表明在较低的两个试验浓度下（120fmol ascr#3和10fmol icas#3），ascr#3的存在不干扰icas#3调节的吸引，而较高浓度的ascr#3导致强烈的排斥，即使在按比例增加的icas#3浓度（12pmol ascr#3和1pmol icas#3，附图4A）的存在下。在从区域A的外缘退出之后，许多蠕虫仍然“被截留”在包围中心区域A的圆形区域B中，被区域A内高浓度的icas#3/ascr#3混合物排斥，但被扩散到区域B中的较低浓度的icas#3/ascr#3混合物吸引。这些结果显示在高浓度的生理学icas#3/ascr#3混合物下ascr#3的排斥影响占优势，而在较低的浓度下icas#3的吸引占主导地位。
实施例1–28的讨论
吲哚蛔苷为第一秀丽隐杆线虫（C.elegans）信息素，显示强烈吸引野型两性体和促进群聚。吲哚蛔苷符合聚集信息素的广义定义：它们吸引和/或阻止同种个体到不分性别释放的区域(EDWARD O.WILSON,SOCIOBIOLOGY：THE NEW SYNTHESIS(The Belknap Press ofHarvard University,Cambridge,Mass.,25th Anniv.ed.2000);Shorey,Annu.Rev.Entomol.18:349–80(1973);Wertheim等，Annu.Rev.Entomol.50:321–46(2005)，在此全文引入作为参考)。在促进这些行为中，吲哚蛔苷在低（飞摩尔）的浓度下具有活性，其中浓度低到使得蠕虫的行为的响应必须由感觉仅仅少数分子产生。例如，在10fM的icas#3浓度下，仅有约20个含在与两性体成虫的长度和直径相称的缸中的icas#3分子。假设它们具有高比活性，那么吲哚蛔苷具有比非吲哚蛔苷低得多的丰度是合理的。
吲哚蛔苷强烈吸引的性质表明这些化合物用来吸引同种个体到期望的环境如食物源。然而，由竞争实验得到的结果表明两性体被icas#3的吸引可被高浓度的ascr#3（其对两性体是排斥的）抵消（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）。竞争实验进一步显示在低浓度的icas#3和ascr#3的生理学混合物下，icas#3的吸引性质占主导地位，而在高浓度的相同混合物下，ascr#3的排斥变成占优势（附图4A）。这些研究结果表明在高种群密度的诱导休眠期的条件下，相关的高浓度ascr#3促进分散（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考），而低种群密度和相应地较低浓度的ascr#3导致被icas#3调节的吸引。因此，icas’和ascr’s可代表调节种群密度和群聚水平的相反刺激。从而，种群密度、食物可利用性、及其它环境因素可作为控制回路的一部分影响ascr和icas的生物合成的相对速率。
即使在缺少浓度梯度的情况下吲哚蛔苷也影响群聚行为：极低背景浓度(fM–pM)的icas#3和icas#9强烈增加两性体（和雄性）群聚的倾向。该研究结果表明icas#3和icas#9的感觉增加对促进群聚（化学或其它）信号或条件的敏感性，如由板上蠕虫分泌的icas的额外量。
已知秀丽隐杆线虫（C.elegans）的群聚依赖于不同类的遗传因素和环境条件，包括食物可利用性和氧浓度，表明存在集成不同来源的输入的神经回路（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Cheung等，Curr.Biol.15:905–17(2005);Coates&de Bono,Nature419:925–29(2002);de Bono等，Nature419:899–903(2002);Gray等，Nature430:317–22(2004)，在此全文引入作为参考）。源于几种不同感觉神经元的群聚和吸引信号，包括氧基–感觉URX–神经元和ascr–感觉ASK神经元，最近已经被证明集中于RMG中间神经元，有人提出其充当协调这些行为的中央枢纽（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。RMG中间神经元是神经肽–Y受体同系物NPR–1的作用的中央部位，这区分开独居的菌株（高NPR–1活性）与群居的菌株（低NPR–1活性）（de Bono&Bargmann,Cell94:679–89(1998);Rogers等，Nat.Neurosci.6:1178–85(2003)，在此全文引入作为参考）。在群居的npr–1(lf)突变体两性体中，氧基–感觉URX神经元促进在细菌菌苔的边缘群聚，而独居的N2两性体对氧梯度没有反应。类似地，ascr的排斥依赖于NPR–1，因为独居的两性体被ascr排斥，而群居的npr–1(lf)两性体表现大大减少的排斥或弱的吸引（Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。
相反，icas#3被证明在群居的和独居的菌株中均促进两性体吸引和群聚。icas#3吸引独居的N2以及群居的npr–1(lf)两性体并增加在独居的菌株N2、群居野型菌株RC301和CB4856(Hawaii)中的两性体群聚，其中野型菌株RC301和CB4856携带低活性的NPR–1变异体、和两个试验过的npr–1零等位基因。icas#3调节的吸引和群聚不被高NPR–1活性降低的发现表明这些icas#3调节的行为依赖不同于控制对其它类型的刺激（如低氧水平）反应的群聚的信号途径。这得到如下观察结果的支持：缺少RMG中间神经元（协调经NPR–1的其它群聚反应）的两性体，还能被吸引到icas#3。此外，icas#3调节的群聚与NPR–1–依赖性群聚行为的区别在于在icas#3板上蠕虫的群聚更加动态且不局限于氧有限的细菌菌苔的边缘。蠕虫速度在诱导最大群聚的icas#3浓度（1–10pM，附图6D）下没有显著地降低，且icas#3调节的群聚与比在群聚的NPR–1突变体蠕虫中发现的丛生（平均丛尺寸6–16只蠕虫）较少的丛生（平均丛尺寸3–5只蠕虫）有关（Rogers等，Curr.Biol.16:649–59(2006)，在此全文引入作为参考）。这些观察结果显示icas#3调节的群聚在表型上不同于由NPR–1和RMG中间神经元控制的群聚行为。
icas#3调节的吸引和群聚被证明依赖ASK神经元，与由ascr引起的两性体排斥和雄性吸引相似（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考），证实在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中这对感觉神经元知觉不同类型信息素的中心作用（附图2A–E）。另外，icas#3反应被证明依赖AIA中间神经元且不需要RMG中间神经元。因此，似乎感觉神经元ASK参与知觉两种不同类型的信息素，ascr’s和icas’，而且这些信号通过两种不同的神经生理学途径转导，作为集成结构上不同排列的信息素信号的复合神经和基因回路的一部分。
钙瞬变现象已经根据对非吲哚蛔苷有反应的化感器感觉神经元记录；不过，所报道的G–CaMP荧光变化相对小（大约20%）（Macosko等，Nature458:1171–75(2009);Kim等，Science326:994–98(2009)，在此全文引入作为参考）。最近有报道非吲哚蛔苷ascr#5不激发ASI感觉神经元中的钙瞬变，尽管ASI神经元起ascr#5的感受器作用和表达ascr#5–受体srg–36和srg–37（McGrath等，Nature477:321–25(2011)，在此全文引入作为参考）。类似地，在对宽范围浓度的icas#3有反应的ASK神经元中的未检出显著的Ca2+瞬变。或许在该神经元中任何icas#3激发的Ca2+信号都比非吲哚蛔苷更弱，因为icas#3在极低浓度下（飞摩尔至低皮摩尔）具有活性。另外，在icas#3发信号中可能涉及其它神经元，假使ASK神经元为许多其它感觉神经元的后突触（White等，Philos.Trans.R.Soc.London[Biol]314:1–340(1986)，在此全文引入作为参考）。特别地，如本文中所示，在AIA中间神经元中icas#3激发G–CaMP荧光的显著变化，其为ASK感觉神经元的主要突解后靶标（附图2D–E）。
作为群聚信号的吲哚蛔苷的鉴定揭示在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中群居信号的意想不到的复杂性。本发明中的结果表明蛔糖–衍生的小分子（icas’和ascr’s）在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中至少充当三个不同的功能：休眠期诱导，雄性吸引，和两性体群居的信号（附图4B）。先前的研究已经显示ascr’s通常具有一种以上的功能。例如，ascr#3在休眠期信号和雄性吸引中起显著的作用（Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考）。本发明中的结果证实蛔糖–衍生的小分子的特定的结构变异体与特定的功能有关（附图4C）。将吲哚羧基加入ascr’s改变信号性质使得吲哚改性的化合物可具有与未改性的化合物非常不同的信号作用：icas#3强烈吸引两性体和促进群聚，而ascr#3排斥两性体和吸引雄性。本发明中还证明，除结构变化之外，不同的信号功能与不同的浓度窗口有关：在休眠期形成需要高纳摩尔浓度的ascr’时，低纳摩尔至高皮摩尔浓度的ascr’s促进雄性吸引；皮摩尔至飞摩尔浓度的icas’促进两性体吸引和群聚（附图4B）。
秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的群居信号因此似乎以小分子的模块化语言为基础，其由几种结构不同的结构单元组合装配而获得（附图4C）。这些结构单元的不同组合提供不同的、偶而交叉的、信号功能。相对丰富的具有相同侧链的ascr’s和icas’的结果（附图9G）表明不同结构单元的集成受到小心的控制。在生物化学上，该结构单元由三种基本代谢途径获得：碳水化合物代谢、过氧化物酶脂肪酸β–氧化、和氨基酸代谢。这些结构的观察结果增加了经小分子的群居信号从机体的整体代谢状态转导输入的可能性。食物可利用性和营养含量与其它环境因素结合可控制ascr和icas生物合成途径以产生有区别地调节群聚、伙伴吸引和发育定时的特定信息素混合物。模块化的化学语言的膨胀词汇将使得不同线虫在同种中以及在种间发出信号是可能的，但是否秀丽隐杆线虫（C.elegans）之外的线虫物种依赖蛔糖型小分子进行化学通讯还未知。从几种其它线虫物种中已经鉴定出蛔糖的脂质–衍生糖苷（Bartley等，J.Nat.Prod.59:921–26(1996)，在此全文引入作为参考），这可能表明线虫可具有产生ascr–或icas样化合物的能力。
作为吸引和群聚信号的吲哚蛔苷的鉴定已经证实秀丽隐杆线虫（C.elegans）群聚行为依赖由同种个体产生的专用化学信号而不仅仅是对特定环境条件的共同偏爱。秀丽隐杆线虫（C.elegans）群居的信号因此似乎明显更高度地进化，而非先前的怀疑。
实施例29—分析仪器
核磁共振光谱记录在Varian INOVA600(1H使用600MHz，13C使用151MHz),INOVA500(1H使用500MHz，13C使用125MHz)，或INOVA400(1H使用400MHz，13C使用100MHz)光谱仪上。核磁共振光谱采用Varian VNMR、MestreLabs MestReC和Mnova软件包进行处理。
采用装是二极管阵列检测器和与Quattro II质谱分光计（Micromass/Waters)的Agilent1100系列HPLC系统进行低分辩率HPLC–MS和HPLC–MS/MS。采用LTQ Orbitrap Velos混合傅里叶变换（FT）质谱分光计进行高分辨率的MS/MS（Thermo Scientific,Cornell University Life Sciences Core Laboratories Center）。采用与Xevo G2QTof质谱分光计连接的装有Waters Acquity UPLC HSSC–18柱（2.1×100mm,1.8μm粒径）的Waters nanoACQUITY UPLC系统进行高分辨率的HPLC–MS。MassLynx软件用于MS数据采集和处理。
采用Teledyne ISCO CombiFlash系统进行急骤柱层析。采用与Teledyne ISCO Foxy200级分收集器偶联的装有Agilent EclipseXDB–C18柱（9.4×250mm，5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC进行HPLC分级。
实施例30—秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株和一般培养法
将秀丽隐杆线虫（C.elegans）变种Bristol,菌株N2(野型),acox–1(ok2257),dhs28(hj8),maoc–1(hj13),maoc–1(ok2645),daf–22（m130）,daf–22（ok693）,F58F9.7(tm4033),C48B4.1(ok2619),F59F4.1(ok2119)，和F08A8.3(tm5192)保持在20℃在NGM琼脂板上，其中NGM琼脂板用Bacto琼脂（BD Biosciences）制成并接种过夜培养的大肠杆菌OP50。
实施例31—代谢物提取物的制备
将来自四个10cm NGM板的野型（N2，Bristol)或acox–1(ok2257)、maoc–1(hj13)、dhs–28（hj8）和daf–22（ok693）突变体蠕虫用M9–培养基洗涤变成100mL S–培养基预培养物，其中让它们在旋转摇瓶机上在220转/分（rpm）下于22℃生长四天。第1和3天加入作为食物的由1L细菌培养物获得的浓缩大肠杆菌OP50。随后，在第4天将每种预培养物等分放入四个500mL装有100mL的S–培养基的锥形烧瓶中。将这些培养物中的两份标记非饥饿（NS），让其在旋转摇瓶机上于22℃生长5天，并自第1天至第4天每天供给由500mL的细菌培养物获得的浓缩的OP50。将每组中剩下的两种培养物标记饥饿（S），在第1天以由500mL的细菌培养物获得的浓缩的OP50供给一次，并让其在不供给食物的情况下在旋转摇瓶机上于22℃再生长9天。随后，对于NS在第5天收获培养物，对于S在第10天收获培养物，并离心。将得到的上清液培养基和蠕虫沉淀分别在干冰–丙酮软泥上冷冻并冻干。将由上清液冻干的物料用150mL的95%乙醇于室温提取16小时。用研钵和杵将蠕虫沉淀与～2g粒状NaCl一起碾碎，并用100mL的100%乙醇于室温提取16小时。将所得到的悬浮液过滤。将滤液于室温在真空中蒸干，产生培养基代谢物(蠕虫“排泌组”)提取物和蠕虫沉淀（pellet）代谢物提取物。
实施例32—以daf–22（m130）进行的蛔苷摄食实验
用daf–22（m130）突变体进行蛔苷摄食实验，其中daf–22（m130）突变体对由于加入的蛔苷引起的生长缺陷的敏感性比daf–22（ok693）突变体差。对daf–22（m130）的HPLC–MS分析显示了与daf–22（ok693）相似的蛔苷特性，明显地完全缺乏链长低于12碳的短链蛔苷。让daf–22（m130）非饥饿的培养按照实施例31中的描述生长，但每个培养物加入5μM的ascr#3或1:1的ascr#10和oscr#10混合物，在分离（splitting）预培养物之后在第1天加入。
实施例33—样品制备
将培养基或蠕虫沉淀（pellet）代谢物提取物再悬浮于～15mL甲醇中并离心。然后收集上清液，在真空中于室温浓缩，再悬浮于1mL甲醇中并离心。将30μL所得提取物直接注入用于LC–MS/MS分析。
实施例34—质谱分析
采用10:1分流（split）使用与Quattro II质谱仪连接的装有Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4×250mm,5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC系统进行低分辨率HPLC–MS/MS分析。采用0.1%乙酸–乙腈溶剂梯度洗脱，流速为3.6ml/min，从5%的乙腈含量开始持续5分钟，在40分钟的时间内提高到100%。分别采用3.5kV的毛细管电压和–40V和+20V的锥电压（cone voltage）以负离子和正离子模式，通过HPLC–ESI–MS对代谢物提取物进行分析。在2.1mtorr和30eV下采用氩气作为碰撞气体对m/z=73.0的前体离子（负离子模式）和130.0的中性丢失（阳离子模式）进行HPLC–MS/MS筛选。还通过采用LTQ Orbitrap的高分辨率的MS/MS分析蛔苷碎片。为了证实新化合物的元素成分，还通过采用Xevo G2QTof的高分辨率的HPLC–MS分析了突变体代谢组样品和级分。
实施例35—蛔苷oscr#9的合成
蛔苷oscr#9按照下面的流程图2所示制备。
流程图2
为了制备3，将2,4–二–O–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(1，132mg，263μmol，Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)，在此全文引入作为参考)和甲基5–羟基戊酸酯(2，125mg，950μmol，Huckstep等，Synthesis10:881–82(1982)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(3ml)中的溶液用三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)于0℃处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的20–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的甲基5–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)戊酸酯(3)(66.8mg，142μmol，47%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)1.28(d,J=6.2Hz,3H),1.67–1.80(m,4H),2.23(m,1H),2.40(t,J=6.9Hz,2H),2.48(m,1H),3.58(m,1H),3.64(s,3H),3.83(m,1H),4.13(dq,J=9.8Hz,J=6.0Hz,1H),4.87(s.br,1H),5.15(ddd,J=11.0Hz,J=10.4Hz,J=4.5Hz,1H),5.18(s.br,1H),7.50–7.60(m,4H),7.62–7.72(m,2H),8.05(d,J=7.5Hz,2H),8.11(d,J=7.5Hz,2H);13C NMR(100MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)18.3,22.5,29.6,30.4,34.0,51.5,67.5,67.9,71.4,71.5,97.0,129.4,129.5,130.3,130.4,131.0,131.0,134.1,134.2,165.9,166.0,174.0。参见附图15A–B。
为了制备oscr#9，将3(66.8mg，142μmol)在无水THF(0.5ml)中的溶液加入到LiOH(28mg，1.4mmol)和水(0.6ml)在1,4–二噁烷(4ml)中的混合物中。于66℃搅拌2小时之后，溶液用冰醋酸酸化并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有1%乙酸的在DCM中的5–30%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的5–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)戊酸酸(oscr#9)(26mg，105μmol，74%)。1H NMR(400MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)1.22(d,J=6.0Hz,3H),1.58–1.72(m,4H),1.77(ddd,J=13.1Hz,J=11.1Hz,J=3.2Hz,1H),1.95(ddt,J=13.1Hz,J=3.7Hz,J=0.9Hz,1H),2.33(t,J=7.2Hz,2H),3.43(dt,J=9.6Hz,J=6.0Hz,1H)3.47–3.59(m,2H),3.71(dt,J=9.8Hz,J=6.2Hz,1H),3.77(m,1H),4.50(s,1H);13C NMR(100MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)18.1,23.0,30.1,34.7,36.0,67.9,68.3,69.4,70.9,100.4,177.5。参见附图16A–B。
实施例36—蛔苷oscr#10的合成
蛔苷oscr#10按照下面的流程图3所示制备。
流程图3
为了制备5，将2,4–二–O–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(1，132mg，263μmol，Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)，在此全文引入作为参考)和甲基9–羟基壬酸酯(4,112.8mg,600μmol,Kai等，Tetrahedron64:6760–69(2008)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(3ml)中的溶液用三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)于0℃处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的20–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的甲基9–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬酸酯(5)(99.3mg，190μmol，72%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)1.28(d,J=6.2Hz,3H),1.30–1.40(m,6H),1.40–1.49(m,2H),1.56–1.72(m,2H),2.22(ddd,J=13.6Hz,J=11.5Hz,J=3.2Hz,1H),2.30(t,J=7.5Hz,2H),2.46(m,1H),3.55(dt,J=9.8Hz,J=6.5Hz,1H),3.60(s,3H),3.81(dt,J=9.6Hz,J=6.6Hz,1H),4.13(dq,J=9.7Hz,J=6.2Hz,1H),4.86(s.br,1H),5.15(ddd,J=11.4Hz,J=9.8Hz,J=4.6Hz,1H),5.18(m,1H),7.50–7.60(m,4H),7.63–7.71(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H);13C NMR(100MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)18.3,25.6,26.8,29.7,29.9,30.0,30.2,30.4,34.4,51.4,67.4,68.2,71.4,71.5,97.0,129.4,129.5,130.2,130.3,130.9,131.0,134.1,134.2,165.9,165.9,174.3。参见附图17A–B。
为了制备ascr#10，将5(99.3mg，190μmol)在THF(500μl)中的溶液加入到LiOH(38mg，1.9mmol)和水(800μl)在5ml1,4–二噁烷(5ml)中的混合物中。于66℃搅拌3小时之后，溶液用乙酸酸化并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用含有1%冰醋酸的在DCM中的5–30%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的9–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬酸(oscr#10)(49mg，161μmol，85%)。1H NMR(400MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)1.22(d,J=6.1Hz,3H),1.32–1.43(m,8H),1.56–1.63(m,4H),1.77(ddd,J=13.1Hz,J=11.1Hz,J=3.2Hz,1H),1.96(ddt,J=13.1Hz,J=3.7Hz,J=0.9Hz,1H),2.28(t,J=7.4Hz,2H),3.41(dt,J=9.6Hz,J=6.2Hz,1H)3.49–3.59(m,2H),3.68(dt,J=9.8Hz,J=5.5Hz,1H),3.76(m,1H),4.49(s,1H);13C NMR(100MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)17.3,25.2,26.4,28.0,29.3,29.5,29.6,30.5,34.1,61.1,67.4,68.5,69.9,99.4,176.8。参见附图18A–B。
实施例37—蛔苷bhas#10的合成
蛔苷bhas#10按照下面的流程图4所示制备。
流程图4
为了制备9，将6(366mg，1.91mmol，Guan&Greenberg,J.Am.Chem.Soc.131:15225–31(2009)，在此全文引入作为参考)和7(104mg，380μmol，Evans&Andrews,Angew.Chem.Int.Ed.47:5426–29(2008)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(10ml)中的溶液用在DCM(0.5ml)中的1,4–苯醌(4mg，38μmol)处理并搅拌10分钟。加入在DCM(0.5ml)中的Grubbs第二代催化剂(16mg，19μmol)。将所得混合物在40℃下搅拌。20小时之后，将混合物在一小层的二氧化硅上过滤并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用0–20%在己烷中的乙酸乙酯梯度洗脱得到期望的产物8和6的同型二聚体的混合物。混合物不经进一步的纯化；相反，将粗混合物(160mg)溶解于乙醇(2ml)中，用Pd/C(15mg，10%，w/w)处理、和氢化40小时。将所得混合物过滤，在真空中浓缩，并通过急骤柱层析在硅胶上纯化，采用10–30%在己烷中的乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的乙基(8R)–羟基–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷基氧壬酸酯(9)(48mg，144μmol，经两步的产率38%)。1H NMR(500MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.03(s,3H),0.06(s,3H),0.86(s,9H),1.19(d,J=6.2Hz,3H),1.26(t,J=7.2Hz,3H),1.29–1.47(m,6H),1.47–1.53(m,2H),2.40(dd,J=14.6Hz,J=5.7Hz,1H),2.44(dd,J=14.6Hz,J=7.0Hz,1H),3.75–3.83(m,1H),4.09–4.15(m,3H)。参见附图19。
为了制备10，将2,4–二–邻–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(1，62mg，120μmol，Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(2ml)中的溶液于10℃用9(47mg，141μmol)和三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(10μl)处理。3.5小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的乙基(8R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基壬酸酯(10)(4.0mg，7.2μmol，6%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)1.19(d,J=6.1Hz,3H),1.27(t,J=7.2Hz,3H),1.28(d,J=6.4Hz,3H),1.33–1.72(m,8H),2.20(ddd,J=14.3Hz,J=11.6Hz,J=3.2Hz,1H),2.42(dd,J=16.5Hz,J=9.0Hz,1H),2.38–2.45(m,1H),2.52(dd,J=16.5Hz,J=3.0Hz,1H),3.00(d,J=3.9Hz,1H),3.80–3.89(m,1H),3.98–4.07(m,1H),4.11(dq,J=9.7Hz,J=6.1Hz,1H),4.17(q,J=7.2Hz,2H),4.95(s.br,1H),5.12–5.22(m,2H),7.43–7.50(m,4H),7.55–7.62(m,2H),8.05(d,J=7.5Hz,2H),8.11(d,J=7.5Hz,2H)。参见附图20。
为了制备bhas#10，将10(4mg，7.2μmol)在THF(150μl)的溶液用在水(100μl)中的LiOH(7mg，290μl)和1,4–二噁烷(250ml)于67℃处理5小时。将反应混合物用乙酸(100μl)酸化，在真空中浓缩，用甲醇(2ml)处理，并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用用含0.5%冰醋酸的在DCM中的5–25%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的(8R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基壬酸(bhas#10)(1.5mg，4.7μmol，65%)。
采用甲醇–d4获得bhas#10的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表4中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图21A–D。
表4.bhas#10的NMR光谱数据
实施例38—蛔苷bhas#22的合成
蛔苷bhas#22按照下面的流程图5所示制备。
流程图5
为了制备12，将2,4–二–邻–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(1，132mg，263μmol，Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(3ml)中的溶液于0℃用(8R)–羟基壬–1–烯(11，85.2mg，600μmol,Ferrie等，Synlett18:2891–93(2007)，在此全文引入作为参考)和三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–30%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(8R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–1–烯(12)(71.0mg，148μmol，56%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)1.20(d,J=6.1Hz,3H),1.27(d,J=6.3Hz,3H),1.33–1.72(m,8H),2.09(m,2H),2.23(ddd,J=13.5Hz,J=11.4Hz,J=3.2Hz,1H),2.47(m,1H),3.91(m,1H),4.20(dq,J=9.6Hz,J=6.1Hz,1H),4.93(ddt,J=10.2Hz,J=2.2Hz,J=1.3Hz,1H),5.01(s.br,1H),5.02(ddt,J=17.1,Hz,J=2.2Hz,J=1.6Hz,1H),5.13(m,1H),5.16(ddd,J=11.3Hz,J=9.8Hz,J=4.6Hz,1H),5.84(ddt,J=17.1Hz,J=10.3Hz,J=6.8Hz,1H),7.50–7.60(m,4H),7.63–7.71(m,2H),8.04(m,2H),8.12(m,2H);13CNMR(100MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)18.3,19.5,26.3,29.7,29.7,30.4,34.4,37.8,67.7,71.5,72.1,72.9,94.4,114.8,129.4,129.5,130.2,130.4,131.0,131.0,134.1,134.2,139.8,165.9,166.0。参见附图22A–B。
为了制备13，将12(38mg，80μmol)和7（65mg，240μmol，Evans&Andrews,Angew.Chem.Int.Ed.47:5426–29(2008)，全文引入作为参考）在无水DCM(2ml)中的溶液用在DCM(0.5ml)中1,4–苯醌(1mg，8μmol)处理并搅拌10分钟。加入在DCM(0.5ml)中的Grubbs第二代催化剂(3mg，4μmol)。将所得混合物在40℃下搅拌。20小时之后，将混合物在一小层的二氧化硅上过滤并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用己烷和乙酸乙酯5:1的混合物洗脱，得到无色油状的乙基(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷基氧十三–5–烯酸酯(13)(17.0mg，23μmol，29%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.03(s,3H),0.06(s,3H),0.86(s,9H),1.19(d,J=6.2Hz,3H),1.25(t,J=7.1Hz,3H),1.28(d,J=6.3Hz,3H),1.32–1.44(m,4H),1.44–1.52(m,2H),1.61–1.68(m,2H),1.99–2.06(m,2H),2.17–2.22(m,3H),2.38–2.43(m,3H),3.84(m,1H),4.06–4.18(m,4H),4.95(s,1H),5.14(s.br,1H),5.18(dt,J=4.2Hz,J=10.6Hz,1H),5.39(dt,J=15.2Hz,J=6.8Hz,1H),5.47(dt,J=15.2Hz,J=6.3Hz,1H),7.43–7.49(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(d,J=7.4Hz,2H),8.11(d,J=7.2Hz,2H)。参见附图23。
为了制备14，将13(14.2mg，18.9μmol)在甲醇(1.5ml)中的溶液用Pd/C处理和氢化24小时。将混合物过滤并在真空中浓缩得到无色油状的乙基(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十三烷酸酯(14)(12.8mg，17.0μmol，90%)。1H NMR(600MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.03(s,3H),0.05(s,3H),0.86(s,9H),1.19(d,J=6.1Hz,3H),1.25(t,J=7.1Hz,3H),1.28(d,J=6.3Hz,3H),1.29–1.40(m,10H),1.42–1.53(m,4H),1.58–1.68(m,2H),2.21(ddd,J=14.0Hz,J=11.7Hz,J=2.8Hz,1H),2.37–2.45(m,3H),3.84(m,1H),4.08–4.15(m,4H),4.95(s,1H),5.14(s.br,1H),5.18(dt,J=4.2Hz,J=10.6Hz,1H),7.43–7.49(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(d,J=7.4Hz,2H),8.11(d,J=7.2Hz,2H)。参见附图24。
为了制备15，将14(19.5mg，26.8μmol)在乙腈(1ml)中的溶液用40%氢氟酸(10μl)在乙腈(100μl)中的溶液处理。搅拌1小时之后，将溶液用NaHCO3(100mg)处理15分钟，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的5–80%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的乙基(12R)–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十三烷酸酯(15)(12.0mg，19.6μmol，73%)。1H NMR(501MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)1.19(d,J=6.1Hz,3H),1.27(t,J=7.2Hz,3H),1.28(d,J=6.4Hz,3H),1.30–1.55(m,14H),1.60–1.68(m,2H),2.21(ddd,J=13.5Hz,J=11.6Hz,J=3.1Hz,1H),2.38(dd,J=16.4Hz,J=9.2Hz,1H),2.41(m,1H),2.49(dd,J=16.3Hz,J=3.1Hz,1H),3.84(m,1H),3.99(m,1H),4.12(dq,J=9.8Hz,J=6.2Hz,1H),4.17(q,J=7.1Hz,2H),4.95(s,1H),5.15(s.br,1H),5.18(ddd,J=11.2Hz,J=9.9Hz,J=4.5Hz,1H),7.43–7.49(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H)。参见附图25。
为了制备bhas#22，将15(12mg，19.6μmol)在THF(1ml)中的溶液用在水(200μl)中的LiOH(15mg)和1,4–二噁烷(2ml)于67℃处理3小时。将反应混合物用乙酸(100μl)酸化，在真空中浓缩，用甲醇(2ml)处理，并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用用含0.2%乙酸的在DCM中的5–30%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的(12R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十三烷酸(bhas#22)(7.3mg，19.4μmol，99%)。
采用甲醇–d4获得bhas#22的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表5中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图26A–D。
表5.bhas#22的NMR光谱数据
实施例39—蛔苷bhos#26的合成
蛔苷bhos#26按照下面的流程图6所示制备。
流程图6
为了制备17，将2,4–二–邻–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(1，132mg，263μmol，Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(3ml)中的溶液于0℃用11–羟基十一–1–烯(16，102mg，600μmol)和三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–30%（v/v）乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的11–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)十一–1–烯(17)(92.3mg，182μmol，69%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)1.28(d,J=6.2Hz,3H),1.30–1.49(m,11H),1.63–1.72(m,2H),2.03(m,2H),2.22(ddd,J=13.5Hz,J=11.3Hz,J=3.2Hz,1H),2.46(m,1H),3.55(dt,J=9.7Hz,J=6.5Hz,1H),3.80(dt,J=9.8Hz,J=6.7Hz,1H),4.13(dq,J=9.8Hz,J=6.3Hz,1H),4.86(s.br,1H),4.90(ddt,J=10.2Hz,J=2.2Hz,J=1.3Hz,1H),5.98(ddt,J=17.1,Hz,J=2.2Hz,J=1.6Hz,1H),5.15(ddd,J=11.3Hz,J=9.8Hz,J=4.6Hz,1H),5.18(m,1H),5.80(ddt,J=17.1Hz,J=10.3Hz,J=6.8Hz,1H),7.49–7.59(m,4H),7.62–7.71(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H);13CNMR(100MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)18.28,26.88,29.67,29.83,30.10,30.16,30.28,34.46,67.43,68.25,71.43,71.53,97.00,114.66,129.42,129.48,130.23,130.35,130.95,130.96,134.08,134.19,139.78,165.89,165.91。参见附图27A–B。
为了制备18，将17(30.8mg，60μmol)，此和7(50mg，180μmol，Evans&Andrews,Angew.Chem.Int.Ed.47:5426–29(2008)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(2ml)中的溶液用在DCM(0.5ml)中1,4–苯醌(1mg，8μmol)处理并搅拌10分钟。加入在DCM(0.5ml)中的Grubbs第二代催化剂(3mg，4μmol)。将所得混合物在40℃下搅拌。20小时之后，将混合物在一小层的二氧化硅上过滤并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用己烷和乙酸乙酯5:1的混合物洗脱，得到无色油状的乙基15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十五–5–烯酸酯(18)(14.2mg，18.9μmol，31%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.03(s,3H),0.06(s,3H),0.86(s,9H),1.25(t,J=7.2Hz,3H),1.30(d,J=6.2Hz,3H),1.27–1.43(m,12H),1.61–1.68(m,2H),1.95–2.02(m,2H),2.16–2.25(m,2H),2.35–2.46(m,3H),3.50(dt,J=9.6Hz,J=6.5Hz,1H),3.76(dt,J=9.6Hz,J=6.8Hz,1H),4.04–4.18(m,4H),4.82(s,1H),5.18(ddd,J=11.2Hz,J=9.9Hz,J=4.7Hz,1H),5.21(s.br,1H.),5.37(dt,J=15.2Hz,J=7.0Hz,1H),5.45(dt,J=15.3Hz,J=6.9Hz,1H),7.43–7.50(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H)。参见附图28。
为了制备19，将18(14.2mg，18.9μmol)在甲醇(1.5ml)中的溶液用Pd/C处理(10mg,10%,w/w)和氢化24小时。将混合物过滤并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的5–80%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的乙基15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–叔丁基二甲基甲硅烷氧基十五烷酸酯(19)(12.8mg，17.0μmol，90%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.03(s,3H),0.06(s,3H),0.86(s,9H),1.25(t,J=7.2Hz,3H),1.30(d,J=6.2Hz,3H),1.25–1.36(m,14H),1.36–1.42(m,2H),1.45–1.51(m,2H),1.61–1.68(m,2H),2.21(ddd,J=14.3Hz,J=11.4Hz,J=3.2Hz,1H),2.35–2.46(m,3H),3.50(dt,J=9.6Hz,J=6.5Hz,1H),3.76(dt,J=9.6Hz,J=6.8Hz,1H),4.04–4.18(m,4H),4.82(s,1H),5.18(ddd,J=11.2Hz,J=9.9Hz,J=4.7Hz,1H),5.20(s.br,1H.),7.43–7.50(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H)。参见附图29。
为了制备20，将19(9.2mg，12.2μmol)在乙腈(2ml)中的溶液用40%氢氟酸(20μl)的溶液处理。搅拌1小时之后，将溶液用NaHCO(100mg)处理15分钟，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的5–80%乙酸乙酯梯度洗脱，得到乙基15–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十五烷酸酯(20)(4.4mg，6.9μmol，57%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)1.27(t,J=7.2Hz,3H),1.30(d,J=6.2Hz,3H),1.25–1.36(m,16H),1.36–1.42(m,2H),1.45–1.51(m,2H),1.61–1.68(m,2H),2.21(ddd,J=14.3Hz,J=11.4Hz,J=3.2Hz,1H),2.39(dd,J=16.4Hz,J=9.0Hz,1H),2.41(m,1H),2.50(dd,J=16.4Hz,J=3.0Hz,1H),3.50(dt,J=9.6Hz,J=6.5Hz,1H),3.76(dt,J=9.6Hz,J=6.8Hz,1H),3.99(m,1H),4.07(dq,J=10.0Hz,J=6.2Hz,1H),4.17(q,J=7.1Hz,2H),4.82(s,1H),5.18(ddd,J=11.2Hz,J=9.9Hz,J=4.7Hz,1H),5.20(s.br,1H),7.43–7.50(m,4H),7.56–7.61(m,2H),8.04(m,2H),8.11(m,2H)。参见附图30。
为了制备bhos#26，将20(4.4mg，6.9μmol)在THF(1ml)中的溶液用LiOH(5mg)在水(200μl)中的溶液和1,4–二噁烷(2ml)于67℃处理。3小时之后，将溶液用冰醋酸(50μl)酸化并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用用含0.2%乙酸的在DCM中的5–50%甲醇梯度洗脱，得到15–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–(3R)–羟基十五烷酸(bhos#26)(2.3mg，5.7μmol，83%)。
采用甲醇–d4获得bhos#26的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表6中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图31A–D。
表6.bhos#26的NMR光谱数据
实施例40—蛔苷icos#10的合成
蛔苷icos#10按照下面的流程图7所示制备。
流程图7
为了制备icos#10，将oscr#10(12mg，39.5μmol)在甲醇(1ml)和甲苯(1ml)的混合物中的溶液用在乙醚(23μl，46μmol)中的2.0MTMS–重氮甲烷处理。搅拌30分钟之后，过量的试剂通过添加乙酸(20μl)中止并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在DCM中的5–10%甲醇梯度洗脱，得到无色固体形式的甲基酯(11.3mg，35.5μmol，90%)。
将甲基酯在DCM(1ml)中的溶液于–20℃用DIPEA(175μl，1mmol)和吲哚甲酸氯化物处理。吲哚甲酸氯化物通过用DMF(10μl)和SOCl2(72μl，840μmol)于0℃处理在DCM(2ml)中的吲哚–3–羧酸(68mg，420μmol)新鲜制备。反应混合物于室温搅拌20分钟之后，将溶液在真空中浓缩并滴加DCM(2ml)。让溶液达到–7℃然后用饱和NaHCO3水溶液(2ml)中止。水相用DCM(2ml，三次)萃取。合并的有机相经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在DCM中的5–10%甲醇梯度洗脱，得到吲哚羧酸酯的同分异构混合物(8.4mg，18.2μmol，51%)。将所得吲哚羧酸酯的同分异构混合物溶解于THF(1ml)中并用LiOH(2.8mg，116μmol)在水(0.5ml)和1,4–二噁烷(2ml)中的溶液于67℃处理。搅拌2小时之后，将溶液用乙酸(30μl)酸化并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.2%乙酸的在DCM中的5–20%甲醇梯度洗脱，得到icos#10异构体的同分异构混合物。HPLC得到9–(5′R–((1H)–吲哚–3–羰基氧基)–3′R–羟基–6′S–甲基–四氢–(2H)–吡喃–2′–基氧基)壬酸(icos#10)(0.6mg，1.3μmol，7%)的纯样品及其异构体(0.3mg，0.67μmol，3.7%)。
采用甲醇–d4获得icos#10的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表7中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图32A–D。
表7.icos#10的NMR光谱数据
实施例41—蛔苷hbas#3的合成
蛔苷hbas#3按照下面的流程图8所示制备。
流程图8
为了制备22，将4–羟基苯甲酸(21，1.52g，10mmol)在DMF(7ml)中的溶液用DIPEA(5.2ml，30mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯化物(3.7g，24.5mmol)处理。12小时之后，通过添加1M H3PO4使混合物pH变为4。混合物用己烷(15ml)萃取两次。有机相用水(15ml)洗涤两次，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。将残余物(3.7g)溶解于THF(10ml)中，并用水(7ml)和冰醋酸(21ml)处理。搅拌90分钟之后，将混合物加入到冰水中并用乙醚和己烷1:1混合物(v/v)(30ml)萃取两次。有机相用水(30ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.2%乙酸的在DCM中的5–20%甲醇梯度洗脱，得到白色固体形式的4–叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酸(22，1.42g，5.3mol，53%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)0.24(s,6H),0.99(s,9H),6.89(d,J=8.8Hz,2H),8.02(d,J=8.8Hz,2H);13CNMR(100MHz，氯仿–d1)：δ(ppm)–4.22,18.40,25.73,120.08,122.39,132.46,132.46,161.01,172.23。参见附图33A–B。
为了制备hbas#3，将蛔苷＃3甲基酯(23，5.7mg，18μmol，Srinivasan等，Pub.Lib.Sci.Biol.10:e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(500μl)中的溶液用22(11.0mg，41μmol)、1–乙基–3–(3–二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，9.0mg，47μmol)、和4–二甲氨基吡啶(DMAP，6.2mg，51μmol)处理。搅拌48小时之后，将溶液在真空中浓缩并用H2O(500μL)处理。将所得产物用DCM(1ml，三次)萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在DCM中的0–30%甲醇梯度洗脱；得到4–叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酰基–蛔苷#3甲基酯的同分异构混合物(7.3mg，12.9μmol，72%)。
为了将芳香的叔丁基二甲基甲硅烷氧基基团(Jiang&Wang,Tetrahedron Lett.44:3859–61(2003)，在此全文引入作为参考)脱保护，将在DMF(360μl)中的(4–叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯甲酰基)–蛔苷＃3甲基酯(6.0mg，10.7μmol)用在H2O(36μl)中的Cs2CO3(1.9mg，5.4μmol)并搅拌3.5小时。将所得产物用DCM(1ml，两次)萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用在DCM中的0–30%甲醇梯度洗脱；得到4–羟基苯甲酰基–蛔苷#3甲基酯的同分异构混合物(4.5mg，10.0μmol，93%)。为了裂解甲基酯基团，将4–羟基苯甲酰基–蛔苷＃3甲基酯(4.5mg，10.0μmol)在THF(100μl)中的混合物用在H2O(30μl)和1,4–二噁烷(500μl)中的LiOH(2.3mg)于67℃处理。2小时之后，通过添加冰醋酸(50μl)中止反应。将溶液在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含0.2%乙酸的在DCM中的5–20%甲醇梯度洗脱，得到hbas#3异构体的同分异构混合物(1.2mg，2.8μmol，28%)。HPLC得到(8R)–(3′R–羟基–5′R–(4–羟基苯甲酰氧基)–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–(2E)–烯酸(hbas#3)(0.6mg，1.4μmol；14%)及其异构体(0.6mg，1.4μmol；14%)的纯样品。
采用甲醇–d4获得hbas#3的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表8中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图34A–C。
表8.hbas#3的NMR光谱数据
实施例42—蛔苷mbas#3的合成
蛔苷mbas#3按照下面的流程图9所示制备。
流程图9
为了制备mbas#3，将蛔苷＃3甲基酯(23，10mg，31.4μmol，Srinivasan等，Pub.Lib.Sci.Biol.10:e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)在无水DCM(1ml)中的溶液于0℃用DIPEA(110μl，630μmol)处理。滴加在DCM(0.5ml)中的(E)–2–甲基丁–2–烯酸酰氯(35μl，316μmol)。于0℃搅拌1小时之后，让溶液回到室温并用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)处理。产物用乙酸乙酯萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤色谱，采用乙酸酯在己烷中的5–25%乙基梯度洗脱，得到淡黄色固体形式的二–惕各酸酯(5.2mg，10.8μmol，34%)。
将产物(4.5mg，9.4μmol)溶解于THF(1ml)中并用在水(100μl)和1,4–二噁烷(2ml)中的LiOH(0.5mg，22μmol)处理。于67℃搅拌3小时之后，通过添加冰醋酸(100μl)中止反应。将溶液在真空中浓缩。将残余物溶解于甲醇中并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用含有0.2%乙酸的在DCM中的0–20%甲醇梯度洗脱得到mbas#3异构体的混合物(2.1mg，5.45μmol)。HPLC得到(8R)–(3′R–羟基–5′R–(E)–(2–甲基丁–2–烯酰氧基)–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)壬–(2E)–烯酸(mbas#3)(1.2mg，3.1μmol；33%产率)的纯样品，与得自秀丽隐杆线虫（C.elegans）的天然产物相同。
采用甲醇–d4获得mbas#3的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表9中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图35A–B。
表9.mbas#3的NMR光谱数据
实施例43—蛔苷glas#10的合成
蛔苷glas#10按照下面的流程图10所示制备。
流程图10
为了制备glas#10，将ascr#10(3mg，9.9μmol)在无水DMF(2ml)中的溶液用2,3,4,6–四–O–苄基–D–葡萄糖(11mg，20μmol)、DMAP(12.2mg，100μmol)、和EDC(19.2mg，100μmol)处理。于室温搅拌18小时之后，将溶液在真空中浓缩。残余物用含水的乙酸(200μl)处理，浓缩，并通过在硅胶上急骤柱层析采用在DCM中的5–50%甲醇梯度洗脱纯化。
将产物溶解于乙醇(1ml)中，用Pd/C(10mg，10%Pd(w/w))处理、和氢化24小时。将混合物过滤并在真空中浓缩。HPLC得到β–D–葡糖基–蛔苷#10(1.5mg，3.22μmol，33%)和α–D–葡糖基–蛔苷#10(1.2mg，2.58μmol，26%)的纯样品。
采用甲醇–d4获得glas#10的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表10中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD2HOD)=49.05ppm。参见附图36A–D。
表10.glas#10的NMR光谱数据
实施例44—蛔苷的鉴定和定量
为了鉴定在野型和突变体(ascr,oscr,bhas,bhos,icas,icos,ibha,ibho和glas)中检测到的蛔苷，将HPLC–保留时间对m/z(或链长)绘图。(关于HPLC–EMI–MS数据，参见附图37A((ω–1)–氧化蛔苷(ascr))，附图37B((ω)–氧化蛔苷(oscr))，附图37C((ω–1)–氧化β–羟基蛔苷(bhas))，附图37D((ω)–氧化β–羟基蛔苷(bhos))，附图37E((ω–1)–氧化吲哚蛔苷(icas))，附图37F((ω)–氧化吲哚蛔苷(icos))，附图37G((ω–1)–氧化吲哚β–羟基蛔苷(ibha))，附图37H((ω)–氧化吲哚β–羟基蛔苷(ibho))，附图37I(葡糖基蛔苷酯(glas))，附图37J(ascr#8，和4–(4–羟基苯甲酰基)–和4–(2–(E)–甲基–2–丁烯酰基)–蛔苷(hbas和mbas))，和附图37K(ascr#2和ascr#6.1)。)属于同系列的组分表现出准线性的洗脱图（附图38），表明在一个系列内的组分共享相同的相对立体化学。然后基于以下鉴定不同系列的结构和立体化学(1)代表性实例的分离和核磁共振分析（例如参见附图39A–B，40A–B，41A–B，42，和43A–B），(2)将代表性实例与合成的标准品比较，(3)由高分辨率的MS证实的分子式，(4)特征性的MS/MS碎片(参见附图44A–P)，和(5)匹配由合成的样品的那些外推的保留时间的HPLC–保留时间。α,β–不饱和蛔苷的(E)–构型通过和ascr#3、(Z)–构型ascr#3、和ascr#7比较得到证实，还通过酰基辅酶A–氧化酶(ACOX)活性的立体选择性暗示。β–羟基蛔苷(bhas和bhos系列)的(3R)–立体化学由与作为代表性实例的bhas#10、bhas#22、和bhos#26的合成标准品的比较中推断，还由MAOC–1和DHS–28与(R)–选择性MFE–2的序列同源性暗示(附图45)。
蛔苷的定量通过自相应的离子痕迹的LC–MS信号的积分进行。采用ascr#1、ascr#3、ascr#5、ascr#7、ascr#9、ascr#10、oscr#9、oscr#10、bhas#22、bhos#26、icas#3、icas#9、icos#10、和glas#10的合成标准品测定的响应因子计算蛔苷浓度。对于大多数化合物，质谱仪响应对于每次注射1pmol至2nmol的量大致是线性的（小于10%误差）。没有合成的蛔苷的响应因子基于对可得到的标准品发现的数据进行外推。通常，发现在每个系列的短链成员（侧链小于C7）的响应因子之间存在强的差别，而在较长链的同系的响应因子之间的差别小。由于不是所有系列的所有短链的成员都合成了，所报道的一些短链蛔苷的绝对量的系统误差可能比较长链的化合物大。
为了粗略地解释培养持续时间和蠕虫生物量，排泌组和蠕虫沉淀（pellet）样品的蛔苷含量以每mg的蠕虫沉淀（pellet）干重每小时的培养时间产生的fmol蛔苷记录。在附图37–62中所报道的所有定量数据由至少两次独立的生物学重复获得。
实施例45—点吸引检测
按照先前报道的方法用hbas#3进行吸引检测（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Pungaliya等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考）。对于该吸引检测，每天在早期第四幼虫期(L4)收获50–60只两性体蠕虫并于20℃储存过夜以在随后的几天作为年轻的成虫使用。将hbas#3溶于含10%乙醇的水中。将等分试样于–20℃储存在20μL的管内。在水中的10%乙醇用作对照。
实施例46—测量趋化性的象限检测
在10cm四象限陪替氏平皿（petri plates）上评价对hbas#3的趋化性（Wicks等，Dev.Biol.221:295–307(2000)，在此全文引入作为参考）。各象限通过塑料隔片与相邻的象限分开。相反的象限对填充含不同浓度的hbas#3的线虫生长培养基（NGM）琼脂。将动物在S–基础缓冲液中轻轻地洗涤并以交替象限置于含蛔苷的四象限板的中心，在15分钟和30分钟之后评分（scored）。趋化性指数计算如下：(蛔苷象限上的动物数减缓冲液象限上的动物数)/(总动物数)。
实施例47—统计分析
采用Welch氏校正的非配对Student氏t检验用于比较野型和突变体之间的蛔苷特性和比较在hbas#3上的两性体的吸引(＊：P<0.05,＊＊：P<0.001,＊＊＊：P<0.0001)。采用单因素ANOVA之后采用Dunnett氏事后检验(＊：P<0.05,＊＊：P<0.01)用于比较不同浓度hbas#3的趋化指数。
实施例48—LC–MS/MS揭示野型秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的新蛔苷
期望的发展如下的分析方法(1)便于不同秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株和突变体的代谢组中已知的蛔苷的敏感检测和定量和(2)有助于发现新蛔苷衍生物。
由于秀丽隐杆线虫（C.elegans）代谢组非常复杂，代谢物提取物的HPLC–MS分析导致难以解析的非常密集的色谱图（附图46A）。不过，结构相关的蛔苷将表现出特有的MS/MS裂解方式似乎是可能的，这对它们的检测提供了更具选择性和敏感的方式。因此，对一系列的合成蛔苷的ESI–MS/MS碎裂进行了研究。
发现用负离子电喷射电离(ESI–)，蛔苷产生强烈的和高诊断性产物离子，m/z为73.02939[C3H5O2]，其源于蛔糖单元（附图44A–P和46B）。此检测方法证明对所有已知的蛔苷是适合的，除ascr#2和ascr#4以外，它们在ESI–条件下不能很好电离。为了检测只在ESI+条件下电离的蛔苷，对由于蛔糖单元的裂解导致的130.0663amu[C6H10O3]的中性丢失进行监视。然而，发现蛔苷的ESI+MS/MS检测通常比ESI–MS/MS检测灵敏差，因为蛔苷在ESI+条件下分裂不占优势。然后进行试验以确定对m/z73的前体离子的筛选是否能用于检测秀丽隐杆线虫（C.elegans）野型代谢组中已知的和还未鉴定的蛔苷。使用液体培养物代谢物提取物，其含有来自大量蠕虫（蠕虫“排泌组（excretome）”）的积累的排泌代谢产物。所得到的HPLC–MS/MS色谱图显示大量很好分辨的峰，发现其中大多数代表蛔苷，包括若干先前未检测到的化合物族。
已知的蛔苷的鉴定采用合成的标准品进行证实。此外，还发现已知的饱和蛔苷ascr#1、ascr#9、和ascr#10伴随有相当量的具有六–至十五–碳侧链的同系物（附图46C和47A）。此同系列的鉴定基于高分辨率的MS/MS、LC保留时间、和代表成员的合成（参见实施例44和附图38]）。LC–MS/MS筛选进一步显示具有5至11碳侧链的蛔苷伴随有较少量的极性略微小的异构体。这些蛔苷异构体被acox–1突变体蠕虫更丰富地产生。
野型MS/MS色谱图中的若干其它峰不能归属于任何已知的蛔苷类别。至于这些化合物的两个化合物，m/z为301.1651[C15H25O6]的MS/MS产物离子表明它们代表ascr#3衍生物。该推定的ascr#3衍生物通过制备型HPLC分离并采用2D核磁共振光谱进行分析（dqfCOSY,参见附图39A–B,40A–B，和41A–B），这证实了这些化合物为ascr#3类且进一步表明存在附于蛔糖4–位上的4–羟基苯甲酰基或(E)–2–甲基–2–丁烯酰（巴豆酰）部分（附图47C）。这些结构的指定通过全部真实样品的合成确证（参见实例41–42）。与最近所报道的ascr#3的吲哚–3–羧基衍生物(“icas#3”)类似（Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考），ascr#3的4–羟基苯甲酰基和(E)–2–甲基–2–丁烯酰基衍生物分别以SMIDs、“hbas#3”和“mbas#3”命名。hbas#3和mbas#3是第一个引入4–羟基苯甲酰基和(E)–2–甲基–2–丁烯酰基部分的蛔苷，其与在icas#3中的吲哚–3–羧基部分类似（Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考），能由氨基酸前体获得。因为其结构与诱导群聚的吲哚蛔苷相似（Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考），测定了hbas#3对蠕虫行为的影响。发现在浓度低到10飞摩尔下hbas#3强烈吸引秀丽隐杆线虫（C.elegans）（参见附图48A–B），其超过了任何先前已知的秀丽隐杆线虫（C.elegans）小分子信号的效能（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考）。低飞摩尔活性对于动物内的小分子信号不寻常，但与一些类别的肽类激素相称（Rittschof&Cohen,Peptides25:1503–16(2004);Gozes等，CNS Drug Rev.11:353–68(2005)，在此全文引入作为参考）。
实施例49—在蛔苷生物合成中的过氧化物酶体β–氧化
对比的LC–MS/MS用于研究蛔苷生物发生。研究表明蛔苷的侧链由更长链的前体经过氧化物酶体β–氧化获得且酰基辅酶A氧化酶ACOX–1参与蛔苷侧链β–氧化的第一步，引入α,β–不饱和度（附图49A–B）。(Joo等，J.Biol.Chem.285:29319–25(2010)，在此全文引入作为参考)。在脊椎动物中以及在果蝇中，在接下来的双键的过氧化物酶体β–氧化-水合中的两步和随后的脱氢为β–酮脂酰–辅酶A酯由一种蛋白，例如，多功能酶2型（MFE–2）催化。在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中这两个酶的功能似乎是分开的以致脱水酶和脱氢酶为不同的蛋白质（附图45）。(Haataja等，Biochem.J.435:771–81(2011)，在此全文引入作为参考)。研究已经表明秀丽隐杆线虫（C.elegans）DHS–28，一种与人MFE–2的(R)–选择性β–羟酰基–辅酶A脱氢酶结构域同源的蛋白，很可能参与将β–羟酰基–辅酶A–衍生物转化成相应的β–酮脂酰–辅酶A中间物，其随后被β–酮脂酰–辅酶A硫解酶DAF–22裂解。(Butcher等，PNAS106:1875–79(2009);Joo等，Biochem.J.422:61–71(2009)，在此全文引入作为参考)。不过，仍然不清楚哪一种酶充当催化基本第二步骤的β–氧化级联的烯酰辅酶A水合酶。
采用本文中描述的基于MS/MS的蛔苷筛选法，对acox–1(ok2257)、dhs–28（hj8）、和daf–22（ok693）突变体的蛔苷特性进行再研究。另外，又一研究表明maoc–1编码过氧化物酶体2–烯酰辅酶A水合酶（Zhang等，PNAS10:4640–45(2010)，在此全文引入作为参考），其被假设参与蛔苷β–氧化的水合步骤。因此，对若干其它过氧化物酶体突变体的排泌组（excretomes）,包括maoc–1(hj13)蠕虫进行分析。
实施例50—侧链功能化在β–氧化之前
acox–1(ok2257)突变体蠕虫的排泌组的LC–MS/MS分析揭示α,β–不饱和ascr#3（野型培养基的主要成分）的丰度大大降低（附图50A–E）。这种ascr#3及其它α,β–不饱和蛔苷中的降低似乎不是蛔苷产生整体减量调节的结果，而是伴随一系列饱和蛔苷的积聚。例如，在acox–1(ok2257)中ascr#10、二氢–衍生物和ascr#3的直接前体，比在野型排泌组中丰富13.6倍。在acox–1中相应的含11–和13–碳侧链将同系物，ascr#18和ascr#22，比在野型排泌组中分别丰富29倍和66倍。在acox–1(ok2257)排泌组中更长链的饱和蛔苷的积累证实了蛔苷侧链的α,β–脱氢中ACOX–1的重要性（附图49A）。由于在acox–1(ok2257)蠕虫中蛔苷生物合成没有消除，似乎很可能其它的、还未鉴定的ACOX–酶促进长链蛔苷前体的过氧化物酶体β–氧化。不过，对若干其它过氧化物酶体acox突变体的排泌组的LC–MS/MS分析（参见实施例29–34和44–47和附图51]）很大程度上揭示了野型样蛔苷的特性。
对acox–1(ok2257)排泌组的进一步的分析揭示完全不存在ascr#5，在野型蠕虫中大量产生的诱导休眠期的主要蛔苷之一（附图52]）。ascr#5与所有其它先前鉴定的蛔苷的区别在于其侧链经末端碳附着于蛔糖糖（“ω连接”），而不是经倒数第二碳（“ω–1连接”）附着（附图47B）。代替ascr#5，在acox–1(ok2257)中大量新的同系系列的饱和蛔苷被检测到，其中较少量的还存在于野型排泌组之中（附图52]）。该系列异构体的最丰富的成分经制备型HPLC分离，并通过核磁共振光谱鉴定为一种含C5侧链的ω–连接的蛔苷（附图42和47B）。这表明在acox–1中发现的其它系列化合物代表一系列ω–连接的饱和蛔苷（附图37B），这由C5和C9ω–连接的蛔苷的合成证实（参见实施例35–36）。为了将(ω)–连接的蛔苷与它们的先前描述的(ω–1)–连接的异构体区分，将新发现的(ω)–连接的化合物命名为SMID“oscr”，例如，ascr#9和ascr#10的合成的(ω)连接的异构体被命名为oscr#9和oscr#10（附图47]）。
因此，(ω)–连接的ascr#5的产生在acox–1(ok2257)蠕虫中被消除，而含5–13碳侧链的更长链同系物，例如，oscr#9，的产生完全是增量调节（附图52）。这些结果表明在acox–1(ok2257)蠕虫中的β–氧化强烈依赖于侧链是否被(ω–1)–或(ω)–官能化。(ω–1)–氧化的底物的链缩短似乎停止在如ascr#10中的9碳的链长，而将(ω)–氧化的底物进行处理两个额外循环的β–氧化得到大量的以5–碳侧链为特征的(ω)–氧化oscr#9。这表明侧链氧化在过氧化物酶体β–氧化之前。相反，蛔糖连接的时间点似乎不太确定。在所研究的秀丽隐杆线虫（C.elegans）突变体代谢组样品中任何(ω–1)–或(ω)羟基化脂肪酸的缺少都揭示一种生物合成模型，其中极长链的蛔苷充当过氧化物酶体β–氧化的底物。然而，可能β–氧化发生在蛔糖连接之前。
实施例51—MAOC–1和DHS–28为人MFE–2的功能同系物
与野型和acox–1(ok2257)蠕虫相反，在maoc–1（hj13）和dhs–28（hj8）蠕虫中没有检测到短链（<C9）蛔苷，代之以积累的几个系列的(ω–1)–和(ω)–氧化的培养基和长链蛔苷（≥C9）。maoc–1（hj13）排泌组的蛔苷特性由α,β–不饱和蛔苷如ascr#21(C13)和ascr#25(C15)支配(附图50A–E)，这支持了如下的假设：在蛔苷生物合成途径中MAOC–1起烯酰–辅酶A水合酶的作用（附图49A）。此外，maoc–1（hj13）排泌组含有与第三同系列的化合物一起的较少量相应的饱和蛔苷，它的高分辨率的质谱分析（HRMS）和MS/MS碎片表明它们代表一系列长链β–羟基化蛔苷（附图37C–D，44A–P，和50A–E）。这些结构的指定通过该系列的代表成员C9和C13β–羟基化(ω–1)–蛔苷bhas#10和bhas#22、以及C15β–羟基化(ω)–蛔苷bhos#26（(ω–1)–和(ω)–氧化的β–羟基化蛔苷的SMIDs：“bhas”和“bhos”）的合成证实（参见实施例37–39）。由于β–羟基化蛔苷为烯酰基–辅酶A水合酶如MAOC–1推定的产物，它们在所研究的maoc–1突变株maoc–1（hj13）（其在活性位点载有点突变（D186N））、和2110碱基对缺失突变体maoc–1（ok2645）中均存在（附图49B），表明其它烯酰基–辅酶A水合酶可能参与蛔苷生物合成。
与maoc–1（hj13）的结果相似，发现dhs–28（hj8）蛔苷特性由含范围在C9–C21的侧链的化合物支配（附图50A–E）。然而，与maoc–1（hj13）相反，饱和的和α,β–不饱和蛔苷仅构成dhs–28（hj8）中全部蛔苷的较小部分。另外，发现含C13–C21奇数侧链的(ω–1)–和(ω)–氧化的β–羟基蛔苷（bhas和bhos）是主要成分（附图50A–E和53A–E），这与所提出的DHS–28作为β–羟酰基–辅酶A脱氢酶的生物合成作用一致(Butcher等，PNAS106:1875–79(2009);Joo等，Biochem.J.422:61–71(2009)，在此全文引入作为参考)。对daf–22（ok693）排泌组的分析揭示所有含短于12碳侧链的蛔苷不存在，如早期的报道(Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Butcher等，PNAS106:1875–79(2009);Joo等，Biochem.J.422:61–71(2009)，在此全文引入作为参考）（附图50A–E和53A–E）。daf–22（ok693）排泌组含有少量的以饱和（ascr和oscr）和β–羟基化侧链（bhas和bhos）为特征的同系列的(ω–1)和(ω)氧化长链蛔苷。此外，daf–22（ok693）排泌组含有侧链长最多33碳的极长链的蛔苷（VLCA,>C22），如早期报道的(Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Zagoriy等，Chem.Biodivers.7:2016–22(2010)，在此全文引入作为参考)。
实施例52—新吲哚蛔苷的鉴定
吲哚–3–羰基化蛔苷比相应的非官能化蛔苷的丰度低很多，且已经被证明起非常有效的群聚信号作用(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)。LC–MS/MS筛选揭示了几种新型的吲哚蛔苷（附图37E–H和47C）。icas#3、icas#9、和icas#1合成样品的结果（Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考）显示吲哚蛔苷表现出特有的裂解方式，包括由于吲哚–3–羰基单元的裂解产生的143amu[C9H5NO]的中性丢失、以及m/z73的蛔苷–诊断性产物离子（参见附图44A–P）。对具有该裂解方式的组分的LC–MS/MS筛选显示acox–1(ok2257)中已知的(ω–1)–氧化的异构体icas#1、icas#9、和icas#10伴随一系列的(ω)–氧化的吲哚蛔苷（SMID：icos#1，icos#9，和icos#10），这由作为典型实例的icos#10的化学合成证实（参见实施例40）。过氧化物酶体β–氧化突变体不产生短链蛔苷（<9碳侧链），例如maoc–1和dhs–28蠕虫，也不产生任何相应的吲哚蛔苷。相反，maoc–1和dhs–28排泌组含有大量的(ω–1)–和(ω)–氧化的长链吲哚蛔苷（SMIDs icas和icos）和含9–17碳的侧链的吲哚β–羟基蛔苷（SMIDsibha和ibho）（参见附图37E–H）。
实施例53—吲哚蛔苷的生物发生
以氘–标记的色氨酸进行的实验和无菌体外培养已经显示吲哚蛔苷的吲哚–3–羰基部分源于L–色氨酸（Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考）。类似的L–酪氨酸或L–苯丙氨酸来源似乎很可能是hbas#3的4–羟基苯甲酰基部分，而mbas#3的巴豆酰基团可能由L–异亮氨酸而来（Attygalle等，J.Chem.Ecol.33:963–70(2007)，在此全文引入作为参考）。然而，仍然不清楚吲哚–3–羰基部分是在蛔苷生物合成的哪一阶段连接上的。
蛔苷和吲哚蛔苷特性的比较显示吲哚蛔苷的生物合成被紧紧地控制。例如，发现在acox–1突变体中，(ω)–蛔苷oscr#9比(ω–1)–蛔苷ascr#9丰富100倍以上，而(ω–1)–吲哚蛔苷icas#9比(ω)–吲哚蛔苷icos#9更突出（附图54A）。类似地，icas#3和icas#9，野型排泌组中的主要吲哚蛔苷，以大致等量产生，而ascr#3比ascr#9丰富约20倍（附图55）。吲哚蛔苷生物合成对侧链长和(ω–1)–对(ω)–氧化的强烈依赖表明这些化合物源于吲哚–3–羰基单元与相应的非吲哚蛔苷的特定连接。
为了试验非吲哚蛔苷是否充当吲哚蛔苷的前体，将daf–22（m130）（缺少所有短链的吲哚和非吲哚蛔苷）用1:1ascr#10和oscr#10的混合物温育5天。随后通过LC–MS分析显示部分转化为icas#10和icos#10（附图54B），表明非吲哚蛔苷充当它们相应的吲哚衍生物的特定前体。而且，(ω–1)–蛔苷ascr#10的转化优先于(ω)–蛔苷oscr#10的转化，反映野型和acox–1突变体中这些化合物的比例。类似地，发现daf–22（m130）蠕虫将所加入的ascr#3转变成icas#3。另外没有观察到吲哚或非吲哚蛔苷转变成较短链的衍生物（例如，ascr#1或icas#1）。这些结果表明L–色氨酸–衍生的吲哚–3–羰基单元的连接代表吲哚蛔苷生物合成中的最后步骤。
实施例54—蛔苷排泌具有选择性
尽管进行了蛔苷功能的详细研究，但关于蛔苷如何释放和从它们的生物合成位点转运的情况知道得很少。将野型排泌组（液体培养物上清液提取物）和蠕虫身体代谢组（蠕虫沉淀提取物）的蛔苷特性比较以鉴定可能的非排泌蛔苷衍生物和确定量的差别。蠕虫沉淀提取物的蛔苷特性与排泌到培养基中的蛔苷特性有显著的差别，表明蛔苷被秀丽隐杆线虫（C.elegans）有区别地释放（附图56A）。在蠕虫沉淀中，最丰富的蛔苷，如野型中的ascr#3和acox–1蠕虫中的ascr#10，伴随明显更极性的衍生物，这是培养基提取物所没有的（附图57）。MS/MS分析表明这些组分代表蛔苷O–糖苷酯。推定的ascr#10糖苷从acox–1(ok2257)蠕虫沉淀提取物中分离和随后的NMR光谱分析（附图43A–B）表明ascr#10用β–葡萄糖的异构羟基基团酯化，这随后通过合成证实（1–β–D–葡糖基ascr#10的SMID：glas#10，附图56A）。大量高极性的glas#10及其它蛔苷葡糖苷（参见附图37I）保留在蠕虫体内但不排泌的事实表明它们代表最终排泌的信号分子的转运或储存形式。
此外，饱和蛔苷保留在蠕虫体内程度远远大于它们的α,β–不饱和衍生物（附图56A）。还观察到(ω)–氧化的组分的有差别的释放（附图58）。因此，似乎秀丽隐杆线虫（C.elegans）在蛔苷信号释放的过程中表现出显著的控制。
实施例55—营养状态影响蛔苷生物合成
已经报道蛔苷的生物合成依赖各种的环境因素，包括食物可利用性（Butcher等，PNAS106:1875–79(2009)，在此全文引入作为参考）、发育阶段（Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)，在此全文引入作为参考）、和温度（Joo等，J.Biol.Chem.285:29319–25(2010)，在此全文引入作为参考）。
LC–MS用于通过比较野型和突变体蠕虫的营养充足的排泌组和饥饿培养物来研究营养状态对蛔苷生物合成的影响。结果表明(ω–1)与(ω)连接的蛔苷的比例强烈依赖于营养状态。在dhs–28的饥饿培养物中长链(ω–1)–氧化的蛔苷的产生比营养充足的培养物中的高约5倍（附图56B和59A–C）。类似地，饥饿的野型蠕虫排泌(ω–1)–连接的ascr#3的量（相对于(ω)–连接的ascr#5的总量）明显大于营养充足的蠕虫（附图60）。ascr#5和ascr#3两者都是休眠期信息素的主要成分；不过，它们影响蠕虫行为有差别（Jeong等，Nature433:541–45(2005);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Butcher等，PNAS105:14288–92(2008);Macosko等，Nature458:1171–75(2009)，在此全文引入作为参考）。
因此，似乎蛔苷信号在对营养利用度的变化响应中通过调节过氧化物酶体β–氧化的极长链脂肪酸上游的(ω–1)–和(ω)的官能化受到主动调节。与近来发现的(ω)–和(ω–1)–官能化的蛔苷被不同族的G蛋白偶联受体受体感觉（Kim等，Science326:994–98(2009);McGrath等，Nature477:321–25(2011)，在此全文引入作为参考）一起，这些结果表明(ω)–和(ω–1)官能化的蛔苷以独立的下游信号途径为靶标。
实施例29–55的讨论
蛔苷在秀丽隐杆线虫（C.elegans）生物学的若干不同方面起重要作用。这种功能多样性与相应的结构的多样性和复杂的生物合成途径平行。描述于实施例34–43和附图37A–37K中的基于MS/MS的研究揭示了146种蛔苷，包括124种先前没有报道的类似物（它们显示出未预料到的特征包括脂肪酸衍生的侧链的(ω)–氧化、蛔糖单元的4–羟基苯甲酰化或(E)–2–甲基–2–丁烯酰化）、葡糖基酯。大多数蛔苷以含范围在3至21（偶而更多）碳之间的(ω–1)–或(ω)–连接的饱和、α,β–不饱和、或β–羟基化侧链的同系列化合物的形式存在。重要的是，各个系列中仅仅少数成员在野型线虫中大量地产生，引入特定的构造特征如在蛔糖（例如，如在吲哚蛔苷中）的4位上的修饰或引入α,β–不饱和度似乎受到紧紧地控制。
假使它们由碳水化合物、脂质、和氨基酸–衍生的结构单元装配，那么蛔苷表现为集成了来自三个基本代谢途径的输入的模块化小分子信号库（附图61A）。然后蛔苷通过它们在秀丽隐杆线虫（C.elegans）的行为和发育（包括休眠期形成、伙伴吸引、两性体排斥、和群聚）中的不同信号功能转导来自这些途径的输入(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012);Edison,A.S.,Curr.Opin.Neurobiol.19:378–88(2009)，在此全文引入作为参考)。它们的特定生物合成表明许多新鉴定的蛔苷也有助于秀丽隐杆线虫（C.elegans）中已知的或迄今未确定的功能。例如，hbas#3被证明充当吸引信号，它的效能超过这个模型机体中所有先前已知的小分子。
在附图61B中提出了蛔苷生物发生的工作模型。蛔苷是若干含最高21（和更多）碳的侧链的同系列的成员，该发现表明它们源自极长链前体的过氧化物酶体β–氧化。先前的研究报道在野型和daf–22突变体中存在含C29和C31侧链的极长链蛔苷（VLCA），其可能代表蛔苷生物合成中的前体或中间物(Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Zagoriy等，Chem.Biodivers.7:2016–22(2010)，在此全文引入作为参考)。或者，极长链脂肪酸（VLCFAs）可能在(ω–1)–或(ω)–官能化之前经历过氧化物酶体β–氧化并随后连接蛔糖。acox–1变异有差别地影响(ω–1)–和(ω)–氧化的蛔苷的观察结果表明(ω–1)–和(ω)–官能化的VLCFA前体在它们被过氧化物酶体β–氧化分解的上游。假使侧链长范围大，似乎很可能所得到的(ω–1)–和(ω)–羟基VLCFAs在进入β–氧化途径之前与蛔糖连接，尽管存在偶然的（promiscuous）蛔糖基转移酶也有可能（附图61B）。
然后VLCA的链缩短可通过重复的过氧化物酶体β–氧化循环进行。由LC–MS/MS筛选得到的结果允许提出参与四步β–氧化循环的每个步骤中的酶的确切作用：酰基辅酶A氧化酶ACOX–1，烯酰辅酶A水合酶MAOC–1，β–羟酰基–辅酶A脱氢酶DHS–28，和β–酮脂酰–辅酶A硫解酶DAF–22。acox–1、maoc–1、和dhs–28中的变异被证明导致相应的蛔苷特性的特定变化，与所提出的它们的功能一致。
酰基辅酶A氧化酶ACOX–1曾经是先前研究的对象，研究表明acox–1中的变异主要影响ascr#2和ascr#3的生物合成，但不影响ascr#1的生物合成(Joo等，J.Biol.Chem.285:29319–25(2010)，在此全文引入作为参考)。然而，实施例50中描述的结果表明acox–1(ok2257)突变体处理C9(ω–1)–官能化蛔苷的能力降低，导致所有较短链的蛔苷的产生减少和C9和较长链的饱和蛔苷的积累（build–up）。maoc–1（以及dhs–28和daf–22）的变异已经被证明会导致肠脂滴和导致禁食–和脂解–抵抗的甘油三酯增加（Zhang等，PNAS10:4640–45(2010)，在此全文引入作为参考）。实施例51中描述的结果显示MAOC–1参与蛔苷的生物合成，充当先前未鉴定的烯酰辅酶A水合酶。这些发现进一步证实秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的烯酰基–辅酶A的水合和β–羟酰基–辅酶A被两种不同的酶MAOC–1和DHS–28催化，这已经被它们与人MFE–2的独立的功能域同源表明（Zhang等，PNAS10:4640–45(2010)，在此全文引入作为参考）。
实施例52–53中描述的结果进一步表明吲哚蛔苷中色氨酸衍生的吲哚–3–羰基单元的连接很可能代表它们生物合成中的最后步骤，以及此步骤具有高度的特异性。由于吲哚–3–羰基基团与蛔苷的连接可显著地改变它们的生物功能，因此这样的紧密调节很有意义。例如，吲哚–3–羰基添加到诱导休眠期的和强烈排斥的信号ascr#3上产生有效的两性体诱引剂icas#3(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)。
秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的蛔糖的生物合成还未研究。然而，纯净的秀丽隐杆线虫（C.elegans）培养物中蛔苷的检测证实秀丽隐杆线虫（C.elegans）内源性产生蛔糖(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)。细菌中蛔糖的生物合成很好理解，秀丽隐杆线虫（C.elegans）基因组包括若干此途径中的同系细菌基因，例如源自假结核耶尔森氏菌的ascE（附图62）（Thorson等，J.Bacteriol.176:5483–93(1994)，在此全文引入作为参考），提供了研究线虫中蛔糖生物合成及其调节的潜在入口。而且，催化VLCFA前体的(ω–1)–或(ω)–官能化的氧化酶仍将被鉴定。野型和过氧化物酶体β–氧化突变体中(ω–1)/(ω)–氧化蛔苷的比例受饥饿的强烈影响，该发现表明此步骤可能编码与营养状态有关的信息。此外，蛔苷排泌被证明有令人惊奇的特异性。鉴于LC–MS/MS的高灵敏性和选择性，采用实施例29–55中描述的方法分析蛔苷可有助于鉴定参与蛔苷的生物合成和体内平衡的其它基因和环境因素。
实施例56—休眠期产生
在诱导休眠期的液体培养条件下在含20,000只蠕虫/ml和0.5%（湿重）大肠杆菌（E.coli）S–完全液（HB101）中培养秀丽隐杆线虫（C.elegans）（Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)，在此全文引入作为参考）。在为L1幼虫线虫给食之后将线虫于22℃在摇动器中（250rpm）温育112小时。此后，线虫用1％十二烷基硫酸钠（SDS）处理15分钟。亚在采集之前让存活的线虫与死线虫在琼脂板上分开。在真空除去死线虫之后，采用M9缓冲液收集休眠期动物并于4℃放置。
实施例57—夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）的饲育
夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）从ARBICO Organics订购（Tucson，AZ）。蜡螟（G.mellonella）幼虫(蜡蠕虫，Grubco,Hamilton,OH)以每个幼虫50只夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）休眠期幼体感染。两天之后，将感染的幼虫放入6cm直径的新陪替氏培养皿中并采用白色陷阱方法收集侵染期幼虫（IJs）（Lawrence Lacey：Manual of Techniquesin Insect Pathology(1997)，在此全文引入作为参考）。
夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）IJs采用源自ITS rDNA区域的种特异性引物通过聚合酶链反应（PCR）得到证实，这在Campos–Herrera等，Ann.Appl.Biol.158:55–68(2011)中有描述，在此全文引入作为参考。在MJ研究PTC200珀尔帖热循环仪（MJ Research PTC200Peltier Thermal Cycler）中进行PCR扩增。按照Campos–Herrera等，Ann.Appl.Biol.158:55–68(2011)（在此全文引入作为参考）中的描述，采用无菌去离子水和由Steinernema riobrave制备的DNA作为阴性对照，在含1μL DNA模板的25μL终体积中进行扩增。循环参数为94℃15分钟，之后进行35个循环的94℃下变性30秒，于59℃退火20秒，和于72℃扩展20秒，其中最后一次扩展是在72℃下10分钟。扩增子的尺寸通过在tris–乙酸酯–EDTA(TAE)2%琼脂糖凝胶上的电泳得到证实并在UVP BioDoc–itTM系统中显现。
在常规的PCR中对于所有源自实验室种群的含IJs的样品夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）引物产生特异性扩增。该引物显示S.riobrave和去离子水对照没有扩增。
实施例58—根癌线虫的饲育
从Florida田地现场收集感染的番茄。检查根的根结感染，按照Hussey&Barker,Plant Dis.Rep.57:1025–28(1973)中的描述（在此全文引入作为参考），其中有改变，收集根结线虫卵。感染的根用1%漂白剂处理2分钟。用收集植物碎片的嵌套过滤系统（85μm）和收集蛋的25μm尼龙过滤器（Nytex）收集从卵块基体中释放的卵。将卵用MILLI–Q水充分洗涤并在含少量孵化水的8cm直径陪替氏培养皿上在20μm过滤器上置于室温下3天。
对从侵染的番茄中提取的根结线虫提取物基于形态学和酯酶（EST）和苹果酸脱氢酶（MDH）的表型同工酶进行鉴定。采用描述于Joseph Neal Sasser&Cathy Cameron Carter：An AdvancedTreatise on Meloidogyne(1985)（在此全文引入作为参考）中的成熟雌性的会阴花纹进行形态鉴定。简而言之，使用25个年轻的产卵雌性进行同工酶表型。将直接从根系分割的雌性的提取物在两个聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）操作（Brito等，Nematology10:757–66(2008)，在此全文引入作为参考）。对一个凝胶进行染色用于测定MDH和EST两者的活性（Kenneth Reece Barker,Cathy Cameron Carter&JosephNeal Sasser：An Advanced Treatise on Meloidogyne(1985)，在此全文引入作为参考），而对另一个凝胶进行染色仅用于EST。
实施例59—秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物的鉴定
采用LC–MS对饲养L1s67小时之后诱导60%休眠期（2次实验和40%休眠期）的液体培养物进行分析。对全部三种液体培养基四种蛔苷是共同的。各自的浓度由产生60%休眠期的液体培养物测量。
实施例60—分散检测
夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）IJs用MILLI–Q水洗涤三次并在含少量（4–5ml）MILLI–Q水的6cm陪替氏培养皿中温育36小时。随后的几天将线虫放置在1010g/cm2胶凝强度的10.7g/L琼脂上（PhytoTechnology Lab.Shawnee Mission,KS）。在多个板上检测线虫行为，其中进行内板复制以排除行为受板组合物影响的可能性。将在10μl中的大约300IJs置于琼脂培养基上并将试验化合物或提取物（1–2μl）放入线虫悬浮液中。在液体吸收（～15分钟）时，对自由移动的线虫进行视频记录5–10分钟。分散行为具有温度和季节依赖性。在冬季，检测在室温下（22±1℃）是有效的。在夏季，由于在23℃以上影响线虫行为检测需要温度受控环境。
秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期幼体用MILLI–Q水洗涤3次，置于含少量水的6cm陪替氏培养皿中，并使其休息过夜。将在10μl水中的大约200–300只线虫置于琼脂板上，向其中加入2μl的处理物。将产生60%休眠期动物的液体培养物离心，用0.45μm过滤器过滤，并用作分散的阳性对照。此后，将培养基冻干并再悬浮于MILLI–Q水中5次。2μl至10μl的线虫悬浮液用于检测。作为阴性对照，在S–完全液中制备0.5%大肠杆菌（E.coli）（HB101），冻干，并检测在中调至终体积为0.25%大肠杆菌（E.coli）。观察分散行为12–15分钟。
为了检测根结线虫的分散，收集在1–3天内孵化的根结线虫，并采用10μm尼龙过滤器（Nytex）用MILLI–Q水洗涤3次。之后，将它们置于1.5mlEppendorf管中。将在10μl水中的线虫置于琼脂板上。在1小时和2小时时对在远离它们最初放置位置发现的线虫进行计数。各个处理用展开的线虫的总数标准化。对于各个处理，在不同的三天进行20次实验。线虫密度在14次实验中为～30每板，在6次实验中为100每板。实验在早晨进行。
实施例61—秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散的定量
运用Image J软件（Image Processing和Analysis in Java,National Institutes of Health）对线虫进行定量。运用Image J显现和计数的线虫数如附图63B所示。由于它们的放置位置，在圆内侧的线虫从所计数的蠕虫总数中人工减去。各个处理重复9–11次。将图表标准化至阳性对照、休眠期限制的培养基。
实施例62—夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）分散混合物的纯化
活性指引的分级按照Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)（在此全文引入作为参考）中的报道进行，有所改变。将总共33只昆虫宿主尸体（蜡螟（G.mellonella）幼虫）置于70%EtOH中并在萃取以前于–20℃储存。采用Precellys24匀化器使用1g的陶瓷锆珠粒（1.25mm）（ZIRMIL）将昆虫尸体在2ml管中匀化37秒。将样品在18400相对离心力（rcf）下离心15分钟并将上清液冻干和再悬浮于MILLI–Q水中。采用实施例60中描述的分散检测和生理学相关浓度的昆虫宿主尸体提取物或分级的提取物对线虫的分散活性进行试验。为了便于计算生理学相关浓度的蛔苷，将蜡蠕虫体积估计为～200μl；蜡蠕虫的平均重量为232+57mg（n=19）。
采用Sep–Pak Plus C18柱实施第一反相固相提取（Waters公司，Milford，MA）。最初收集的流过被称为级分A。之后，柱子用水洗涤，收集，并保存。随后，柱子用50%（级分B）和90%（级分C）MeOH洗脱。对级分单独和组合试验分散活性。还有，单独的级分通过LC–MS分析。级分A含有ascr#9，其通过LC–MS收集并与级分B+C一起试验活性。
实施例63—夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）蛔苷产生的时程研究
采用一对一的分析法（Lawrence Lacey：Manual of Techniques inInsect Pathology(1997)，在此全文引入作为参考）。将一个蜡蠕虫放入24孔板的一个孔中。对于感染，将50只夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）IJ放入每个孔中25μl的水中。24小时之后，检查板的感染昆虫幼虫。将感染的昆虫幼虫放入白色陷阱中（Lawrence Lacey：Manual ofTechniques in Insect Pathology(1997)，在此全文引入作为参考），并将那些48小时之后感染的置于单独的白色陷阱上。在48小时之后进行初次取样。之后，每天取样，持续9天并在第14天取一次。对于每次实验，样品包含六只昆虫宿主尸体。将昆虫尸体置于装有1ml水的2ml Eppendorf管中。用针将尸体穿孔以允许内容物散逸然后进行涡旋。将样品在3380rcf下离心10分钟，并回收0.5–1ml的上清液。将上清液在–20℃下冷冻然后冻干。之后，将其再悬浮于200μl的50%MeOH中并用0.1%甲酸以1:1稀释。样品pH为4.3。在这一点上，使20μl的各个样品进行LC–MS以分析ascr#9。
实施例64—斯氏线虫属（Steinernema spp）和异小杆线虫属种（Heterorhabditis spp.）的昆虫宿主尸体中的Asrc#9
昆虫宿主（G.mellonella）用嗜菌异小杆线虫（H.bacteriophora），齐兰迪亚异小杆线虫（H.zealandica）,H.floridensis,小卷蛾斯氏线虫（S.carpocapsae）,S.riobrave，或S.diaprepesi感染。当线虫开始从昆虫尸体中显露出来时，将它们置于1.5ml的70%EtOH中并在使用以前于–20℃储存。之后，采用Precellys24匀化器使用1g的陶瓷锆珠粒（1.25mm）（ZIRMIL）将昆虫尸体在2ml管中匀化39秒。匀化的尸体在3380rcf下离心10分钟。上清液用1ml的HPLC水稀释，置于–20℃下，然后放入(Speed Vac Plus SC210A,Savant)中过夜。将各尸体提取物再悬浮于1ml的50%MeOH中并在18400rcf下离心15–20分钟。之后，样品用0.1%甲酸以1:1的比例稀释，产生pH4.2的样品。通过LC–MS测定存在或不存在arc#9。
实施例65—LC–MS分析
采用Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)中报道的方法进行蛔苷分析，在此全文引入作为参考。
实施例66—分散检测
关于昆虫致病性线虫（EPN），已知昆虫尸体促进IJ阶段的分散行为(Shapiro–Ilan等，J.Invertebr.Pathol.83:270–72(2003)，在此全文引入作为参考)。因此发展了检测方法以鉴定促进分散的耗尽的昆虫尸体中的化合物。将在10μl水中的大约300只夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）的IJs置于琼脂板上（附图64B）。然后，将2μl水（附图64C）或用夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）感染的蜡螟（Galleria mellonella）幼虫尸体的水提物（附图64D）放入线虫悬浮液中。在水吸收入培养基中之后，线虫能自由地移动。水处理的线虫仍然在放置位置附近，没有分散行为。相反，尸体提取物处理的线虫很活跃，离开释放位点。这是线虫离开尸体所观察到的同样的明显的分散行为。尸体提取物的LC–MS分析显示存在蛔苷（ascr#9）(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)，支持了夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）可能利用蛔苷作为分散信号的假说。
实施例67—秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散受蛔苷混合物调节
然后研究实施例66中的分散生物测定以确定它是否也用于试验秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期幼虫的分散。为此检测，使用得自的秀丽隐杆线虫（C.elegans）液体培养物中的生长培养基，其已经产生60%休眠期幼虫。除去所有线虫之后，该休眠期限制的培养基强烈诱导秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期中的分散行为。采用LC–MS，发现休眠期形成培养基含有四种已知的蛔苷（ascr#2，ascr#3，ascr#8，和icas#9）(Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)（附图63A和65），先前被证明它们单独促进秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期的进入(Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Butcher等，Org.Lett.11:3100–03(2009);Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)。估计休眠期形成培养基中蛔苷的浓度为ascr#2(3.68pmol/μl)，ascr#3(0.165pmol/μl)，ascr#8(0.25pmol/μl)，和icas#9(0.005pmol/μl)。
然后采用休眠期限制的培养基作为阳性对照，试验这些蛔苷的合成混合物的分散活性。估计培养基含有大约原始0.5%大肠杆菌（E.coli）（HB101）食物源的一半。因此将0.25%大肠杆菌（E.coli）加入到合成试样中以及水对照品中以阻止因缺少食物诱发的觅食行为。将分散的线虫数标准化至阳性对照响应的百分比。在仅仅存在食物的情况下（阴性对照），大约35%的休眠期幼虫离开释放位置。然而，加入合成蛔苷混合物，几乎两倍多的线虫（62%）离开释放位置（附图63B和66A–B）。在生理学浓度下单独试验，ascr#8（50%）和ascr#2（40%）产生最强的响应，但所有四种物质都比混合物的活跃性差（附图63C）。这表明秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期幼虫能感知和对分散混合物的单组分作出反应，但完整的四成分混合物对恢复活性说来是必需的。
实施例68—EPN和植物寄生的线虫感觉秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物
假设许多线虫物种可能感觉和对其它线虫物种释放的信号作出反应。因而，秀丽隐杆线虫（C.elegans）释放的蛔苷能起有效避免信号的作用。在分散检测中，夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）的IJs当暴露于水时表现出没有可觉察的移动，但当暴露于秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物时很活跃和离开释放位置（附图63D和66C）。也试验了从番茄根中分离出来的野生根结线虫的可移动J2形式（根结线虫属（Meloidogyne spp）的混合物；爪哇根结线虫（M.javanica）,M.floridensis，和南方根结线虫（M.incognita））对分散混合物的反应（附图66D）。此外，与对照相比较较多的线虫（10–12%）离开引入秀丽隐杆线虫（C.elegans）混合物的区域。这表明至少一些线虫物种能对远亲的线虫物种的分散混合物作出反应。
实施例69—夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）和秀丽隐杆线虫（C.elegans）混合物的主要成分为结构类似物
为了表征夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）迁散信息素，将昆虫宿主尸体用70%EtOH提取，通过反相（C18）色谱分级，并进行试验（附图67A–D）。生物测定显示所有三种级分（A，B，和C）的组合是活性所必需（附图67A）。通过LC–MS分析级分（附图68A–C）揭示了级分A中的2种蛔苷，借助于合成标准品其被鉴定为ascr#9和ascr#11(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012);vonReuss等，J.Am.Chem.Soc.134(3):1817–24(2012)，在此全文引入作为参考)。生物测定显示ascr#9和ascr#11在生理学相关浓度下单独不具有活性（附图67B）。这是由于当单独试验时天然级分A是非活性的（附图67A）。然而，将生物学相关浓度下（40pmol/μl）的合成ascr#9与天然级分B和C组合能恢复原始分散活性（附图67C），证实ascr#9为夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）分散混合物的一种活性成分。在级分A中发现的第二种蛔苷，ascr#11，当与级分B和C组合时亦恢复完全的活性（附图67D），表明ascr#9或ascr#11中任何一种都单独与级分B和C组合足以重构完全的分散活性。
先前已经证实了主成份秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散信息素成分ascr#2的发展特性（Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)，在此全文引入作为参考）。在夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）分散混合物中级分A的主要蛔苷，ascr#9，是一种ascr#2的结构类似物（附图67C）。因此在时程实验中对夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）感染的昆虫尸体中ascr#9的积聚进行了分析（附图69）。结果表明ascr#9具有与先前证实的秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的ascr#2很相似的积聚特性。此外，ascr#9的积聚最直接在IJ分散之前并在IJ耗尽的尸体中保持恒定至少6天。这与ascr#2和秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期形成的观察结果非常相似(Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)，在此全文引入作为参考)。相反，ascr#11的特性（附图69）不同于ascr#9。它在最初可检测出但在第8天（分散天）不可定量，直至第14天（这是分散之后6天）才可在昆虫宿主尸体中定量。
亦对ascr#9进行了试验并发现能替代秀丽隐杆线虫（C.elegans）中它的结构类似物ascr#2（附图70）。因此，一种在夜蛾斯氏线虫（S.feltiae）中发现的交叉的物种知觉，可能对秀丽隐杆线虫（C.elegans）来说是正确的。
实施例70—ascr#9可能是种系发生相关的EPNs的分散混合物中的共同成分
在鞘翅目和蝇类中，种系发生相关的物种共享它们的聚集信息素混合物中的成分(Symonds&Elgar,Proc.Biol.Sci.271:839–46(2004);Symonds&Wertheim,J.Evol.Biol.18:1253–63(2005)，在此全文引入作为参考)。为了进一步试验何种程度的分散混合物成分被种系发生相关的线虫物种共享，分析感染了斯氏线虫属种（Steinernema spp.）和异小杆线虫属种（Heterorhabditis spp.）的昆虫宿主尸体中ascr#9、ascr#2和ascr#11的存在（附图71A–B）。
发现两种物种的昆虫宿主尸体均含有ascr#9（附图71A–B），这表明ascr#9可能被大范围的EPN物种作为它们的分散混合物的一部分使用。在所有试验过的斯氏线虫属种（Steinernema spp.）中均发现了ascr#11，但在异小杆线虫属（Heterorhabditis spp）中没有发现，表明ascr#11对于斯氏线虫属种（Steinernema spp.）是特异性的。
实施例56–70的讨论
对于秀丽隐杆线虫（C.elegans），共享的和独一无二的蛔苷组合物调节不同的行为。例如，交配和分散混合物共享ascr#2、ascr#3、和ascr#8(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Pungaliya等，PNAS106:7708–13(2009);Kaplan等，Publ.Lib.Sci.ONE6:e17804(2011)，在此全文引入作为参考)。秀丽隐杆线虫（C.elegans）交配混合物的特征为独一无二的成分，ascr#4（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考），分散混合物具有独一无二的成分，icas#9(Srinivasan等，Publ.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)。因此认为这对于许多线虫物种可能是共同的。
尚不清楚根结线虫属是否也利用分散混合物，但本发明中已经证明这些线虫物种能探测和对表现出分解和腐蚀植物体的其它线虫物种释放的信号作出反应。秀丽隐杆线虫（C.elegans）分散混合物在种系发生相关的物种的发育类似阶段显示类似的活性，表明它可用于鉴定基因靶标以及配制用于控制寄生植物、人、和牲畜的物种的分散混合物。实施例56–70不仅证实了若干线虫物种利用物种特异性的小分子信号调节分散行为，而且也证实了线虫分散行为可能被种间通讯广泛地诱导。
实施例71—保留检测
使OP50大肠杆菌（E.coli）生长在标准的5cm琼脂板（用标准的线虫生长培养基制成）上。细菌菌苔直径为16mm并在用于试验之前在20℃下过夜培养。将两个4mm点（0.6μL）置于细菌菌苔的对边上（使用指引点放置的透明模板），几分钟过去时在检测放置线虫之前液体迁入。在放置蠕虫时立即开始记录。将0.6μL的对照品置于菌苔的一侧，并将0.6μL的实验的指示（cue）置于菌苔的另一侧，在整个试验过程中在左/右和顶端/底部之间变化指示的位置以避免偏差。
在L4阶段作为发育了的成虫用于试验的前一天将线虫根据性别分离开。将蠕虫均匀分开并放置在与评分（scoring）区域的中心等距的两个点上。记录试验20分钟，收集框架（frames）用于以每秒1构架的分析。将至少三次不同试验的结果平均。对于该研究中的每个线虫物种，试验不同总数的蠕虫（在两个评分区域内均使用水）以确定为得到在20分钟试验内一致的不偏的结果所必需的最低蠕虫数。用于多物种检测中的蠕虫总数依赖于物种的最佳的参数。10只蠕虫用于腐生线虫（P.redivivus）雄性和雌性，20只蠕虫用于秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性和O.dolichuridae雄性，14只蠕虫用于格氏斯氏线虫（S.glaseri）雄性。自动化软件用于比较蠕虫随时间变化的在各评分区域中的占位性，使趋化性指数（Bargmann等，Cell74:515–27(1993)，在此全文引入作为参考）适应对偏爱或避免各种蛔苷的评分。
实施例72—吸引检测
制备10cm标准趋化性板（Bargmann等，Cell74:515–27(1993)，在此全文引入作为参考）并于4℃储存直至临用前当天。将标准的1cm–直径铜管切成1cm高的段用于静置室。将雌性/两性体分离过夜，在M9缓冲液中洗涤3次，然后让其在以50uL的1000×链霉素预调的板上漫步2小时以杀死任何可能产生假阳性吸引剂的细菌。然后将线虫洗涤3次，并将由最后洗涤的上清液作为对照置入铜室中，离10cm板的边缘1cm。将线虫悬浮在铜室内的M9中，离对照室对面边缘1cm。6小时之后，将它们随后移除并用3μL的1M叠氮化钠置换。将100只秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性成虫分离过夜，在ddH2O中洗涤若干次，并放置在琼脂板的中心。几小时之后，对在2cm的各区域内的麻痹了的雄性评分。趋化性指数（Bargmann等，Cell74:515–27(1993)，在此全文引入作为参考）然后用于对任一点源的雄性趋化性评分。
实施例73—交配检测
采用描述于Peden等，Curr.Biol.15:394–404(2005)（在此全文引入作为参考）中的交配检测。简而言之，将40只年轻的成虫两性体/雌性置于8mm细菌菌苔上。将秀丽隐杆线虫（C.elegans）L4雄性分离过夜。将5只雄性置于富含两性体/雌性的板上。对在3–分钟时间内对两性体作出反应的雄性数计数（单个雄性只被计数一次）。反应定义为雄性停在两性体上并附着它们的腹面尾部在潜在的配偶上连续10秒以上。对它们的反应效率评分，也适用Peden等，Curr.Biol.15:394–404(2005)，在此全文引入作为参考，其采用下式计算：反应效率=[#反应的雄性/5只雄性]×100%。
实施例74—自动化软件(用于保留检测)
安装在显微镜上的摄像机产生数字的视频流，然后对其进行分析。计算每个试验蠕虫花在每个兴趣部位上的平均时间的比率。为了便于实施，将单次试验中所有的蠕虫假设为具有大致相同的尺寸。这样对蠕虫象素计数代替整体蠕虫，让在兴趣区域内的蠕虫部分被考虑到。它也消除了对基于形状的蠕虫鉴定算法的需要，并允许对每个框架（frame）进行独立地分析。带通滤波器应用于每个框架（frame）以消除不均匀照明的影响以及突出相对背景的蠕虫。然后在定出过滤像的临界值之后鉴定蠕虫。每次实验整个过程中，兴趣区域的位置和尺寸是已知的。通过上述的过滤，获知哪些象素被蠕虫占据和哪些没有被占据。这样，可以计算蠕虫–象素与兴趣区域内侧全部象素之比以得到蠕虫占据比例。对每个框架（frame）进行这种计算，得到每个区域的蠕虫占据比例对时间的图形输出（output）。
实施例75—HPLC分析。
在50–1000AMU范围内以阳离子模式的电喷射电离使用Thermo Finnigan LCQ Deca XP Max。热分离光谱HPLC系统由P4000四元泵、AS3000自动取样器、和UV6000二极管阵列检测器组成。溶剂为含(a)0.1%甲酸和(b)90%乙腈的水–含10mM甲酸铵的10%水，柱温保持在60℃和溶剂流速为1.0ml/min。反相柱（PLRP–S聚合物反相柱，250x4.6mmid，Varian Inc.）用溶剂组合物洗脱，从90:10(a,b)开始持续2分钟，之后在20分钟内梯度洗脱至5:95并以5:95再洗脱5分钟。监测190和400nm下的紫外吸收。紫外检测器和质谱电喷雾接口之间的溶剂流用低容量显微针P450分流器阀门（Upchurch Scientific,Oak Harbor,WA）分流9:1，使获得洗脱化合物的光谱成为可能，同时收集90%的注入物质用于生物测定。在生物测定中保留时间为9.7分钟的纯化峰对雄性具有活性。带化学电离（阳性模式）的LC–MS显示主峰的m/z为294(M+NH4)。这被核磁共振法分析证实是ascr#1。
实施例76—系统演化树的结构：
用于此分析的小亚基核糖体DNA（SSU rDNA）序列由GenBank获得。首先采用MUSCLE对该序列进行排列（aligned），随后进行修整以便于不同长度的序列的比较。已修整的排列产生代表全部分类单位（taxa）的690个字母。采用得自PHYLIP3.68程序包的“Dnadist”和“Neighbor”程序进行邻接法（N–J）分析，运用“Consense”产生多数–规律共识树（majority–rule consensus tree）。
实施例77—线虫的培养和蠕虫排泌物和的收集
将C.elegans,Rhabditis sp.、O.tipulae,C.sp.7、P.pacificus、腐生线虫（P.redivivus）,Koernia sp.和P.strongyloides在含大肠杆菌OP50的标准6cm琼脂板上供养。为了大量生长，让它们在液体培养物—含大肠杆菌HB101的S完全培养基中在培养箱摇动器内在250rpm下于20℃生长。将蠕虫经历若干洗涤和过滤步骤，用S Basal除去细菌。通过在3000rpm下离心5分钟在多次洗涤之间收集蠕虫。将蠕虫在S Basal中在1只蠕虫/μL下温育6小时。然后滤出蠕虫并在储存于–20℃之前将剩余的上清液通过0.22μm过滤器。
小卷蛾斯氏线虫（S.carpocapsae）,格氏斯氏线虫（S.glaseri）,S.riobrave，和嗜菌异小杆线虫（H.bacteriophora）按照Hallem,等，Curr.Biol.21(5):377–83(2011)（在此全文引入作为参考）中的报道供养。简而言之，将若干最后龄期的蜡螟（Galleria mellonella）幼虫置于有55mm Whatman1滤纸的6cm陪替氏培养皿上。大约500–1000IJs放置在此滤纸上。7天之后，将昆虫尸体放置在载有Whatman1滤纸的倒转的6cm陪替氏平皿上并浸于10cm陪替氏培养皿内的小体积的ddH2O中。收集出现的IJs并如上所述洗涤若干次，之后在ddH2O中在1只蠕虫/μL下温育6小时。在3天感染后将成虫从昆虫尸体中解剖，并如上所述进行洗涤/温育。
巴西日圆线虫（N.brasiliensis）、猪蛔虫（A.suum）、穿刺短体线虫（P.penetrans）和Romanomermis spp.由合作者提供，如下表11中的鉴定。列出所有本实施例中使用的菌株。没有进行菌种鉴别的物种标记为“没有名称”。
表11.线虫菌株的来源
将巴西日圆线虫（N.brasiliensis）在0.85%盐水中在1只蠕虫/5μL（鉴于它们的尺寸大）下于30℃温育。将猪蛔虫（A.suum）在无菌盐水中洗涤，之后在DMEM中温育于37℃温育3、6、和13小时。将上清液单独地试验随后合并对于合并的分析。将穿刺短体线虫（P.penetrans）和Romanomermis spp.是在ddH2O中于20℃在250rpm下温育过夜。
实施例78—蠕虫样品制备
将蠕虫水样品冻干，用1–10ml甲醇提取两次，并经过棉絮过滤。提取物在真空中浓缩。将所得到的残余物再悬浮于150μL甲醇中然后过滤。
实施例79—MS分析
采用10:1分流（split）使用与Quattro II光谱仪（Micromass/Waters）连接的装有Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4×250mm,5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC系统进行HPLC–MS。采用0.1%乙酸–乙腈溶剂梯度洗脱，流速为3.6ml/min，从5%的乙腈含量开始持续5分钟然后在40分钟的时间内提高到100%。分别采用3.5kV的毛细管电压和–40V和+20V的锥电压（cone voltage）以阴离子和阳离子模式通过HPLC–ESI–MS对代谢物提取物进行分析。通过与从野生型秀丽隐杆线虫（C.elegans）和秀丽隐杆线虫（C.elegans）的过氧化物酶体β氧化突变体中已鉴定的150种组分的库中的那些比较准分子离子（quasi molecular ion）信号（附图72A–D）和HPLC保留时间（附图73）来鉴定蛔苷。为了证实蛔苷结构的指定，对m/z=73.0的前体离子运用MS/MS筛选（附图74A–B），因为先前的工作表明所有蛔苷在MS/MS使都提供强烈的C3H5O2产物离子（在2.1mtorr和30eV下氩作为碰撞气体）。通过自相应的痕量离子（ion–traces）的LC–MS信号的积分进行蛔苷的定量。最后采用对ascr#1，ascr#2，ascr#3，ascr#5，ascr#7，ascr#9，ascr#10，oscr#9，oscr#10，和icas#9的合成标准品所测定的响应因子计算相对的蛔苷浓度。还没有合成的蛔苷的响应因子还基于观察到的可得到的标准品的数据进行外推。
实施例80—蛔苷oscr#9的合成
蛔苷oscr#9按照下面的流程图11所示制备。
流程图11
为了制备2，将在甲醇(17ml)中的新鲜蒸馏的δ–戊内酯(1)(856mg)用浓缩的H2SO4(100μl)处理并回流12小时。将溶液冷却至–20℃，用NaHCO3(80mg)处理，并搅拌10分钟。将反应混合物过滤并在真空中除去溶剂。将残余物以DCM(10ml)收纳，经Na2SO4干燥，过滤，并在真空中浓缩得到无色油状的甲基5–羟基戊酸酯(2)(Huckstep等，Synthesis10:881–82(1982)，在此全文引入作为参考)(1071mg，94%)，其不经任何进一步的纯化而直接使用。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ1.55(2H,m),1.68(2H,m),2.35(2H,t,J=7.4Hz),3.57(2H,m),3.64(3H,s);13C NMR(100MHz，丙酮–d6)：32.9,34.1,51.5,61.9,174.2。参见附图75A–B。
为了制备4，将壬二酸一甲基酯(3)(923mg，4.6mmol)在无水THF(3ml)中的溶液于–20℃用在THF中的1M BH3(4.6ml，4.6mmol)处理10分钟以上。于室温搅拌4小时之后，将反应用0.77M K2CO3水溶液（10ml）于0℃中止。产物用二乙醚(3×20ml)萃取，用饱和NaCl水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩得到无色油状的甲基9–羟基壬酸酯(4)(Kai K.等，Tetrahedron64:6760–69(2008)，在此全文引入作为参考)(850mg，99%产量)，其不经任何进一步的纯化直接使用。1H NMR(400MHz，氯仿–d1)：δ1.27–1.37(8H,m),1.50–1.66(4H,m),2.29(2H,t,J=7.5Hz),3.62(2H,t,J=6.5Hz),3.66(3H,s)。参见附图75C。
为了制备6，将2,4–二–邻–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)(5)(11116)(132mg，263μmol)，和2(125mg，950μmol)在无水DCM(3ml)中的溶液于0℃用三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用在正己烷中的20–40%（v/v）乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的5–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2–基氧基)–戊酸甲基酯(6)(66.8mg，142μmol，47%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：(3H,d,J=6.2Hz),1.67–1.80(4H,m),2.23(1H,m),2.40(2H,t,J=6.9Hz),2.48(1H,m),3.58(1H,m),3.64(3H,s),3.83(1H,m),4.13(1H,dq,J=9.8Hz,J=6.0Hz),4.87(1H,s.br),5.15(1H,ddd,J=11.0Hz,J=10.4Hz,J=4.5Hz),5.18(1H,s.br),7.50–7.60(4H,m),7.62–7.72(2H,m),8.05(2H,d,J=7.5Hz),8.11(2H,d,J=7.5Hz);13C NMR(100MHz，丙酮–d6):δ18.3,22.5,29.6,34.0,51.5,67.5,67.9,71.4,71.5,97.0,129.4,129.5,130.03,130.4,131.0(2X),134.1,134.2,165.9,166.0,174.0。参见附图75D–E。
为了制备oscr#9(7)，将6(66.8mg，142μmol)在无水THF(0.5ml)中的溶液加入到LiOH(28mg，1.4mmol)和水(0.6ml)在1,4–二噁烷(4ml)中的混合物中。于66℃搅拌2小时之后，溶液用冰醋酸酸化并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用含有1%冰醋酸的在DCM中的5–30%（v/v）甲醇梯度洗脱，得到无色油状的5–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2–基氧基)戊酸酸(oscr#9)(7)(26mg，105μmol，74%)。1H NMR(400MHz，甲醇–d4)：δ1.22(3H,d,J=6.0Hz),1.58–1.72(4H,m),1.77(1H,ddd,J=13.1Hz,J=11.1Hz,J=3.2Hz),1.95(1H,ddt,J=13.1Hz,J=3.7Hz,J=0.9Hz),2.33(2H,t,J=7.2Hz),3.43(1H,dt,J=9.6Hz,J=6.0Hz)3.47–3.59(2H,m),3.71(1H,dt,J=9.8Hz,J=6.2Hz),3.77(1H,m),4.50(1H,s);13C NMR(100MHz，甲醇–d4)：23.0,30.1,34.7,36.0,67.9,68.3,69.4,70.9,100.4,177.5;ESI–MS（负离子模式）m/z=247.1[M–H]。参见附图75F–G。
实施例81—蛔苷oscr#10的合成
蛔苷oscr#10按照下面的流程图12所示制备。
流程图12
为了制备8，将2,4–二–邻–苯甲酰基–蛔糖–1–(2,2,2–三氯乙酰亚胺)（5）(132mg，263μmol，Hallem,等，Curr.Biol.21(5):377–83(2011)，在此全文引入作为参考)和4(112.8mg,600μmol)在无水DCM(3ml)中的溶液用三甲基甲硅烷氧三氟甲磺酸盐(5μl)于0℃处理。3小时之后，将溶液用饱和NaHCO3水溶液(0.5ml)洗涤，经Na2SO4干燥，和在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用在正己烷中的20–40%（v/v）乙酸乙酯梯度洗脱得到无色油状的99.3mg9–(3′R,5′R–二苯甲酰基氧基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2–基氧基)–壬酸甲基酯(8)(190μmol，72%产率)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ1.28(3H,d,6.2Hz),1.30–1.40(6H,m),1.40–1.49(2H,m),1.56–1.72(2H,m),2.22(1H,ddd,J=13.6Hz,J=11.5Hz,J=3.2Hz),2.30(2H,t,J=7.5Hz),2.46(1H,m),3.55(1H,dt,J=9.8Hz,J=6.5Hz),3.60(3H,s),3.81(1H,dt,J=9.6Hz,J=6.6Hz),4.13(1H,dq,J=9.7Hz,J=6.2Hz),4.86(1H,s.br),5.15(1H,ddd,J=11.4Hz,J=9.8Hz,J=4.6Hz),5.18(1H,m),7.50–7.60(4H,m),7.63–7.71(2H,m),8.04(2H,m),8.11(2H,m);13CNMR(100MHz，丙酮–d6)：25.6,26.8,29.7,29.9,30.0,30.2,30.4,34.4,51.4,67.4,68.2,71.4,71.5,97.0,129.4,129.5,130.2,130.3,130.9,131.0,134.1,134.2,165.9(2C),174.3。参见附图75H–I。
为了制备oscr#10，将8(99.3mg，190μmol)在THF(500μl)中的溶液加入到LiOH(38mg，1.9mmol)和水(800μl)在5ml1,4–二噁烷(5ml)中的混合物中。于66℃搅拌3小时之后，溶液用乙酸酸化并在真空中浓缩。在硅胶上急骤柱层析，采用含有1%冰醋酸的在DCM中的5–30%（v/v）甲醇梯度洗脱，得到无色油状的9–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2–基氧基)壬酸酸(oscr#10)(9)(49mg，161μmol，85%)。1H NMR(400MHz，甲醇–d4)：δ1.22(3H,d,J=6.1Hz),1.32–1.43(8H,m),1.56–1.63(4H,m),1.77(1H,ddd,J=13.1Hz,J=11.1Hz,J=3.2Hz),1.96(1H,ddt,J=13.1Hz,J=3.7Hz,J=0.9Hz),2.28(2H,t,J=7.4Hz),3.41(1H,dt,J=9.6Hz,J=6.2Hz)3.49–3.59(2H,m),3.68(1H,dt,J=9.8Hz,J=5.5Hz),3.76(1H,m),4.49(1H,s);13C NMR(100MHz，甲醇–d4)：25.2,26.4,28.0,29.3,29.5,29.6,30.5,34.1,61.1,67.4,68.5,69.9,99.4,176.8;ESI–MS（负离子模式）m/z=303.2[M–H]。参见附图75J–K。
实施例82—许多线虫物种产生蛔苷
在线虫物种的各种各样的选择中基于质谱的筛选引发了对蛔苷的研究（附图76A–D），其中线虫物种既包括自由生活的线虫又包括寄生（植物、昆虫、和哺乳动物）的线虫。先前的研究已经显示秀丽隐杆线虫（C.elegans）蛔苷产生是发育阶段特异性的(Kaplan等，Pub.Lib.Sci.ONE6(3):e17804(2011)，在此全文引入作为参考)。为了获得全面的样品，对自发育混合的培养基进行试验，这样培养基含有由所有幼虫和成虫期释放的蛔苷的积累。如果可行，对寄生的侵染期幼虫和成虫进行分开试验，以便鉴定分别与寻找宿主或寻找配偶唯一相关的蛔苷。采用检测复合代谢组样品中蛔苷的最佳化方案通过HPLC–MS分析线虫分泌物（实施例79）。这些分析显示在大多数线虫样品中存在蛔苷。将样品与自先前鉴定的既来自野型秀丽隐杆线虫（C.elegans）又来自突变株的150种蛔苷库的质谱数据比较。这些分析显示在大多数已分析的线虫样品中存在蛔苷。
蛔苷通常以混合物的形式存在，包括含饱和和不饱和支链的化合物。侧链长度高度可变，范围从在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中也发现的较短链到Pelodera strongyloides和嗜菌异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）中的含相当长侧链的化合物。如在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中，大多数已鉴定的蛔苷在侧链的倒数第二个碳上有蛔糖糖（“ω–1–官能化”），除广杆属线虫7（Caenorhabditissp.7）和Rhabditissp.以外，其产生其中蛔糖附于侧链的末端碳的蛔苷（“ω–官能化”，例如附图76D中的oscr#9和oscr#10）。吲哚蛔苷，例如icas#9（附图76A），最近显示其在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中充当群聚信号（Srinivasan等，Pub.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考），仅在Caenorhabitis spp.中发现。然而，在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中，吲哚蛔苷浓度比简单蛔苷的浓度（附图76A中的“ascr”和“oscr”）低很多。因为本发明中研究的大多数物种的可得到的代谢物样品尺寸比秀丽隐杆线虫（C.elegans）属可得到的代谢物样品尺寸小很多，因而由于对于HPLC–MS检测而言量太小在一些线虫中不能检测到吲哚蛔苷是可能的。
蛔苷特性通常在物种之间有变化（附图77）。然而，来自生态学差异很大的物种在某些情况下却产生相同的蛔苷。例如，ascr#9由住留在肥料的腐生线虫（Panagrellus redivivus）、小杆线虫属（Rhabditissp.）、和秀丽隐杆线虫（C.elegans）属；住留在土壤的Oschieus tipulae；与昆虫相关的Pristionchus pacificus；和昆虫–感染的嗜菌异小杆线虫（Heterorhabditis bacteriophora）、小卷蛾斯氏线虫（Steinernemacarpocapsae）、Steinernema riobrave、和格氏斯氏线虫（Steinernemaglaseri）产生。
在17种分析过的线虫物种中的3种（即穿刺短体线虫（Pratylenchus penetrans）、猪蛔虫（Ascaris suum）、和Romanomermis物种）中没有检测到已知的蛔苷。有可能这些物种只产生非常少量的蛔苷，或者它们产生具有意想不到的构造特征的不能用所使用的方法检测到的蛔苷，假定与自野生型和突变株的秀丽隐杆线虫（C.elegans）中鉴定的那些相似的蛔苷被筛选过。先前的研究已经报道在猪蛔虫（Ascaris sum）中存在脂质样长链蛔苷；然而，它们限于卵母细胞和卵中(Bartley等，J.Nat.Prod.59(10):921–26(1996);Tarr,Comp.Biochem.Physiol.46B:167–76(1973)，在此全文引入作为参考)。鉴于它们具有高亲脂性特征，这些化合物在水介质中溶解性差，这解释了它们在本文上述分析中不存在，因而不可能充当信息素。地丝虫物种，如Romanomermis spp.，具有独一无二的储存一生的脂质–组成的营养物（sustenance）供应的能力（Platzer,J.Am.Mosquito Contr.Association Bulletin7:58–64(2007);Ittycheriah等，Nematologica23:165–71(1977)，在此全文引入作为参考）。有可能它们具有不同的脂肪酸代谢机制，或者可能蛔苷合成还没有进化，假定Romanomermisspp.是试验过的最原始的物种。
实施例83—蛔苷调节不同的线虫行为
采用若干不同的行为检测法对线虫行为对一系列的合成的蛔苷的反应进行试验。使用保留检测（附图78），其采用自动化软件以检测偏爱或避免用单独的蛔苷（附图79）调节的区域。对HPLC/MS研究的线虫物种进行筛选该生物测定的适合性，这种生物测定需要跨过细菌菌苔的足够的移动。由于它们需要与它们的宿主环境相似的底物，寄生的线虫大部分被排除。该研究还限于雄性，因为在大多数物种中，雄性比雌性或两性体移动性好得多，除腐生线虫（P.redivivus）雌性外，其能很好移动因此包括在内。Oscheius tipulae被排除在外是由于雄性只偶而存在于该两性物种中；相反，雄性–雌性物种，Oscheiusdolichuroides，被加上。在先前的研究中，～1pmol（自1μm浓度）的ascr#2和ascr#3的样品被证明对于秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的吸引是最具活性的浓度(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考)。因此，对可得到的合成蛔苷在1nM、1μm、和1mM的浓度下进行试验。
几种试验过的线虫物种偏爱许多相同的蛔苷特别是ascr#1、ascr#3、ascr#7、ascr#8、ascr#9、和ascr#10调节的区域（附图78）。然而，活性阈值在不同物种之间不同。例如，秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性偏爱ascr#10的1μM调节的区域，而格氏斯氏线虫（S.glaseri）和腐生线虫（P.redivivus）雄性只偏爱ascr#10的1mM调节的区域。此外，若干线虫物种对不是由它们自己的物种产生的蛔苷作出反应，表明可能存在种间通讯。试验过的物种之一，O.dolichuroides，不对任何试验过的蛔苷作出反应。有可能该物种对其它蛔苷作出反应或者需要特定的环境条件激发它对蛔苷的反应。
另外，还观察到腐生线虫（P.redivivus）雄性和雌性对不同类的蛔苷作出反应，之前在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中描述过的现象(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008)，在此全文引入作为参考)。这些性别–特异性反应证实蛔苷可能在物种之间和物种内部起不同的作用。例如，icas#9在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中起群聚兴奋剂的作用（Srinivasan等，Pub.Lib.Sci.Biol.10(1):e1001237(2012)，在此全文引入作为参考）；然而，它排斥腐生线虫（P.redivivus）雌性和不激发对来自腐生线虫（P.redivivus）雄性的反应。由于icas#9不由腐生线虫（P.redivivus）产生，所以它能起种间提示（cue）的作用。
还对秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体吸引远处秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性的能力进行了试验。先前的研究已经报道秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体在含有由单个两性体调节的点源的5cm板上或在固定两性体–温育的上清液的琼脂安装的玻片上不能吸引雄性。（Bargmann等，Cell.74:515–27(1993)，在此全文引入作为参考）。在本文描述的实验中，采用10cm板并试验1–300个两性体，检测场地的直径和两性体的数目均扩大（附图80A）。结果证实秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体确实吸引远处的雄性（附图80B）。将秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性对50只秀丽隐杆线虫（C.elegans）两性体的化学趋向的能力同对等同数量的其它物种的雌性或两性体的化学趋向进行比较。由于发现秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性被吸引到7种不同的蛔苷（附图78），因此预测产生这些蛔苷的物种吸引秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性，而几乎不或不产生这些蛔苷的物种将不能吸引秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性。本发明的结果显示秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性证实了对腐生线虫（P.redivivus）雌性有部分吸引（附图80A–C），它的物种产生7种已知的秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性吸引剂中的3种（附图77）(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Pungaliya等，PNAS19:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)。还发现秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性不显示对来自物种小卷蛾斯氏线虫（S.carpocapsae）、P.pacificus、或P.strongyloides的雌性或两性体的远程吸引，上述物种分别产生两种、一种、和不产生已知的秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性吸引剂。这些发现进一步提供了证明蛔苷调节的不同线虫物种之间的相互作用的可能性的证据。还对之前描述的秀丽隐杆线虫（C.elegans）寻找配偶的信息素（ascr#2，ascr#3，和ascr#8）的单独作用（Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Butcher等，Nat.Chem.Biol.7:420–22(2007)，在此全文引入作为参考）进行了试验其激发从远处吸引雄性的能力。结果表明ascr#2和ascr#3激发秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性吸引，量分别低至500attomol和5femtomol，而ascr#8在检测中不具有活性。这些结果表明ascr#2和ascr#3用来吸引远处的秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性，而ascr#8用来留住到达某个点源附近的雄性。
还研究了秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性和同种两性体之间的交配以及不同线虫物种的雌性/两性体之间的交配。描述于Peden&Barr,Curr.Biol.15:394–404(2005)中的交配检测是适用的，在此全文引入作为参考，它给试图与两性体/雌性交配的雄性的百分比评分（附图81）。该研究将试验秀丽隐杆线虫（C.elegans）是否与远亲的线虫物种交配。结果表明它们不试图与腐生线虫（P.redivivus）、小卷蛾斯氏线虫（S.carpocapsae）、P.pacificus、或P.stronglyoides交配10秒（附图81）。此外，加入蛔苷的混合物不诱导与这些线虫物种中的任何物种交配。先前的研究表明秀丽隐杆线虫（C.elegans）雄性交配行为主要由两性体识别通过mechanosensory或局部化学暗示（cues）引导(Liu等，Neuron14:79–89(1995)，在此全文引入作为参考)。本发明中的结果表明蛔苷性信息素用来帮助秀丽隐杆线虫（C.elegans）交配定位，但不影响物理（physical）交配。
实施例71–83的讨论
实施例71–83的发现表明蛔苷包括广义的线虫词汇，鉴于它们被不同线虫物种广泛产生和识别。这些发现让人想起细菌群体感应，其中酰基高丝氨酸内酯（AHLs）被许多革兰氏阴性菌物种产生和感觉(Miller等，Annu.Rev.Microbiol.55:165–99(2001)，在此全文引入作为参考)(附图82)。不同的AHLs在结构上很相似但在N–酰基链上具有物种特异性的差异(Miller等，Annu.Rev.Microbiol.55:165–99(2001)，在此全文引入作为参考)。蛔苷以很相似的方式组织：它们由相同的蛔糖糖环构成但在所连接的脂肪酸侧链上有变化(Dickschat,Nat.Prod.Rep.27:343–69(2010)，在此全文引入作为参考)(附图82)。本发明的结果表明线虫分泌来自相同指令集合（repertoire）的蛔苷的组合物以提供对它们周围环境的特定的化学信号。
蛔苷和AHLs两者共有的结构组织和广泛达到的特性产生了对生物化学沟通网络体系的新了解。许多细菌行为由群体感应调节，如生物荧光、生物膜形成、致病因子表达、抗生素产生、和运动(Boyer&Wisnieski–Dye,FEMS Microbiol.Ecol.1:1–19(2009)，在此全文引入作为参考)。类似地，许多秀丽隐杆线虫（C.elegans）行为由蛔苷调节，如寻找配偶、排斥、群聚、嗅觉适应性、和进入滞育（diapausal）生活期(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Jeong,等，Nature433:541–45(2005);Butcher等，Nat.Chem.Biol.7:420–22(2007);Pungaliya等，PNAS19:7708–13(2009);Niblack等，Annu.Rev.Phytopathol.44:283–303(2006);Macosko等，Nature458:1171–75(2009);Yamada等，Science329:1647–50(2010);Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Golden&Riddle,Science218:578–80(1982)，在此全文引入作为参考)。
此外，秀丽隐杆线虫（C.elegans）的蛔苷特性在对生长和环境干扰的反应中会变化(Kaplan等，Pub.Lib.Sci.ONE6(3):e17804(2011)，在此全文引入作为参考)。鉴于线虫和线虫行为的广泛的多样性，蛔苷的模块化（modular）特性似乎对采用单一机制传达个体或种群的变化需要是适宜的。可以合成在结构上与细菌AHLs相似的分子以开发新类别的干扰细菌通讯的抗菌药(Schauder等，Genes Dev.15:1468–80(2001)，在此全文引入作为参考)。线虫的类似研究能允许在寄生虫–宿主模型中设计合成的蛔苷混合物以干扰线虫繁殖和生存。
由于线虫目前是造成全球农业每年约$100万亿损失的原因(JOSEPH A.VEECH：VISTAS ON NEMATOLOGY(Society of Nematologists,Inc.,Hyatsville,MD,1987)，在此全文引入作为参考)和感染全世界3万亿人(Blumenthal&Davis,Nat.Genet.36:1246–47(2004)，在此全文引入作为参考)，寄生虫的控制存在重大需要。利用物种特异性的信息素管理害虫的概念已经驱动了50多年的用在病虫害治理中使用的>100种信息素进行的昆虫外激素研究(Witzgall等，J.Chem.Ecol.36:80–100(2010)，在此全文引入作为参考)。然而，信息素–调节的中止仅实际上应用于单一的线虫信息素，香草酸，目的是控制大豆寄生的线虫Heterodera glycines(Meyer等，J.Nematol.29:282–88(1997)，在此全文引入作为参考)。这很可能归因于缺乏线虫信息素的鉴定，除在H.glycines和秀丽隐杆线虫（C.elegans）中发现那些以外(Jaffe等，J.Chem.Ecol.15:2031–43(1989);Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Jeong,等，Nature433:541–45(2005);Butcher等，Nat.Chem.Biol.7:420–22(2007);Pungaliya等，PNAS19:7708–13(2009)，在此全文引入作为参考)。线虫信息素广泛延伸（reaching）的、模块化库的发现无疑能证明致力于此必要的努力是有用的，而体系的解释能产生对生物化学讯号进化的新的了解。
实施例84—根结线虫（Root Knot Nematodes）中的蛔苷产生
蛔苷ascr#10、ascr#16、ascr#18、ascr#20、和ascr#22在根结线虫属植物寄生的线虫的某些物种中检测到（附图83）并采用高分辨率质谱鉴定（附图84–88）。预测这些蛔苷和/或它们的结构衍生物（单独，一起，和/或与ascr#9或其它蛔苷一起）在根结线虫属物种中起分散剂和排斥剂的作用。(还预测ascr#18和ascr#22和/或它们的结构衍生物（单独，一起，和/或与ascr#9或其它蛔苷一起）在Heterorhabditis中起分散剂和排斥剂的作用。)
实施例85—P.pacificus代谢物命名
所有新鉴定的化合物以四个字母SMIDs命名，如实施例3中所述。新的四字母SMIDs(pasc(苯基乙醇酰胺蛔苷)、ubas(3–脲基异丁酸酯蛔苷)、dasc(二聚体的蛔苷)、part(泊雷糖苷)、和npar(核苷–型泊雷糖苷)引入本文中。
实施例86—分析仪器
核磁共振光谱记录在Varian INOVA–600(1H使用600MHz，13C使用151MHz),INOVA–500(1H使用500MHz和13C使用125MHz)，和INOVA–400(1H使用400MHz，13C使用100MHz)仪器上。按照实施例1中的描述进行HPLC–MS和急骤层析。采用与Teledyne ISCOFoxy200级分收集器偶联的装有Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4x250mm，5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC系统进行HPLC分级。采用Xevo G2QTOF质谱仪获得高分辨率质谱。
实施例87—P.pacificus菌株和培养物条件
使用Pristionchus pacificus菌株RS2333(外代谢组制备)、RS5134(休眠期形成检测)、和RSB020(嘴形二态性检测)。板和蠕虫的液体培养物按照Ogawa等，Curr.Biol.19:67–71(2009)中的描述制备，在此全文引入作为参考。
实施例88—外代谢组提取物的制备和初步分级
将3L的P.pacificus菌株RS2333将培养物上清液过滤并在10,000rpm下离心10分钟。将培养物上清液施加于C18柱（Chromabond,Macherey Nagel）上，之后以在H2O中的50%MeOH洗脱。该步骤除去强亲脂性组分（例如甘油三酯，长链脂肪酸）但不降低生物活性。将洗脱液蒸发并用氯仿和甲醇（2：1）的混合物再悬浮。将样品施加于用氯仿/甲醇（2：1）平衡过的SiOH柱（Chromabond,Macherey Nagel）上。柱子用氯仿/甲醇(2：1，级分I)、氯仿/甲醇(1：5，级分II)、和氯仿/甲醇/水(6:10:1，级分III)洗涤。级分II在随后的休眠期形成检测中显示最强活性，用于初步2D–NMR光谱–型分析。将几种其它1L–批的培养物上清液进行类似的处理以获得较大量的在初始的2D NMR光谱分析中检测到的化合物。
对于其它未分级的物料的高分辨率的HPLC–MS分析，将100ml的培养物上清液样品冻干成细粉，随后用50ml的乙醇和水的95:5混合物提取16小时。将提取物在真空中浓缩，过滤，并不经进一步处理用于HPLC–MS。对于细菌对照实验，将1L的过夜培养的大肠杆菌OP50（E.coli OP50）细菌培养物冻干并如上所述处理。
实施例89—2D NMR光谱代谢组分析
非梯度洗脱相–循环的dqfCOSY光谱采用下述参数获得：0.8s采集时间，400–600复合增量，每个增量8–32次扫描。将dqfCOSY光谱零填满至8k×4k，并在傅里叶转换之前在两个维度中应用余弦钟形的窗口函数。梯度洗脱和非梯度洗脱HSQCAD和HMBC光谱采用次0.25s采集时间和256–500复合增量获得。核磁共振光谱采用VarianVNMR、MestreLabs’MestReC、和MNova软件包进行处理。
实施例90—HPLC方案和LC–MS/MS分析
采用10:1分流（split）使用与Quattro II光谱仪（Micromass/Waters）连接的装有Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4x250mm,5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC系统进行HPLC–MS。采用0.1%乙酸–乙腈溶剂梯度洗脱，流速为3.6mL/min，从5%的乙腈含量开始持续5分钟，在40分钟的时间内提高到100%。分别采用4.0kV的毛细管电压和–40V和+20V的锥电压（cone voltage）以负离子和正离子模式通过HPLC–ESI–MS对外代谢组级分进行分析。在2.1mtorr和40eV下采用氩气作为碰撞气体对m/z=73.0的前体离子（负离子模式）进行LC–MS/MS筛选。此HPLC方案亦用于合成的样品纯化以及P.pacificus外代谢组的微量组分的富集。
实施例91—化学合成的一般方法
薄层色谱(TLC)用于监测反应的进度，除非另有说明使用J.T.Baker Silica Gel IB2–F。除非另有说明，试剂购自Sigma–Aldrich且不经进一步纯化使用。N,N–二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)临用之前经分子筛干燥。将四氢呋喃(THF)和1,4–二噁烷在临用之前蒸馏。在Perkin Elmer241偏光计上测量旋光度。用来测量旋光度的溶剂（甲醇）使用之前不进一步纯化。
实施例92—休眠期形成检测
休眠期形成检测按照Ogawa等，Curr.Biol.19:67–71(2009)（在此全文引入作为参考）中的描述热灭活的或卡那霉素灭活的大肠杆菌OP50（E.coli OP50）进行。将合成的化合物溶解于乙醇(0.5mM，原液)中并与水混合以制备100μl溶液，并随后将其加入到3mL不含蛋白胨的NGM–琼脂中(3，1，0.3，0.1μm终浓度)。
实施例93—嘴形二态性检测
采用P.pacificus菌株RSB020进行嘴形二态性检测。将溶解于乙醇(0.5mM)中的合成的化合物用水稀释以制备100μl溶液并随后将其加入到3mL NGM–琼脂中(1μm终浓度)。检测板用在LB培养基中的50μl OP50培养物接种并于20℃温育过夜以让细菌生长。每次复制包括两个母体的后代，挑选出年龄一致的（携带4–6个卵）成虫两性体且它们都来自相同的P.pacificus培养板。将母体放置在检测板上之后，让板在20℃下保持六天，使得在筛选时整窝都是成虫。每个板筛选50个两性体后代的随机样本。所有动物在Zeiss Axiskop上通过鉴别干涉对比（DIC显微镜检查）进行筛选。下列不连续的字母分别用于区别阔口的与口狭窄的个体：(1)爪形的背齿对燧石形的（即背腹对称）背齿；(2)存在侧腹齿对不存在侧腹齿；(3)强硬化的口壁对弱硬化的口壁。没有观察到中间的嘴形。对每种处理以一式三份进行实验。
在对几种浓度(1，0.3，0.1，0.03，0.01μm终浓度)的化合物的反应检测中，进行如上所述的实验，有以下改变。为了允许对较低浓度反应的更大分辨率，在每个化合物每个浓度的各五次重复中的60个随机筛选的个体进行检测。采用从相同的两个源种群中挑选的母体平行进行所有的浓度–曲线实验。为了准备大量的用于这些实验的个体母体，由纯的（virgin）两性体建立源种群以限制雄性的存在并在挑选母体用于检测之前调节至少一代至营养充足和环境的条件。
实施例94—统计分析
误差条线代表附图122A–D中的95%置信区间。所有的实验对每种处理以一式三份进行（或五次重复用于嘴形浓度–曲线检测）。附图122A–B中的每种化学处理和对照（EtOH）处理之间的显著性差异（＊P<0.05和＊＊P<0.001）采用在程序R中Fisher精确检验进行确定。
实施例95—蛔苷pasc#9的合成
蛔苷pasc#9按照下面的流程图13所示制备。
流程图13
为了制备11，将ascr#9(Srinivasan等，PLoS Biol.10:e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)(30mg，121μmol)在甲醇和甲苯(2mL)的3：2混合物（v/v）中的溶液用2.0M(三甲基硅烷基)重氮甲烷在乙醚中的溶液(120μl)处理。搅拌30分钟之后，过量的试剂通过添加乙酸破坏并将溶液在真空中浓缩。粗品残余物不经进一步纯化在下一步中使用。将残余物13溶解于无水DMF(1.5mL)中，冷却至0℃，用咪唑(91mg，1.34mmol)处理并搅拌5分钟。该混合物用叔丁基氯二甲基甲硅烷(182mg，1.21mmol)处理并留下搅拌过夜。反应用盐水(5mL)中止,用乙醚萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–25%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的14(55mg，112μmol，93%经两步)。将14(55mg，112μmol)在无水四氢呋喃(1mL)中的溶液加入到LiOH(11mg，457μmol)和水(0.4mL)在1,4–二噁烷(2mL)中的混合物中。于67℃搅拌3小时之后溶液用冰醋酸酸化并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的含0.1%乙酸的0–30%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双((叔–叔丁基二甲基硅烷基)氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(11)(50mg，105μmol，94%)。1HNMR(600MHz，氯仿–d)：δ(ppm)4.55(s,1H),3.87–3.80(m,1H),3.78–3.75(m,1H),3.68–3.61(m,1H),3.58–3.52(m,1H),2.56–2.42(m,2H),1.89–1.71(m,4H),1.18(d,J=6.3Hz,3H),1.13(d,J=6.2Hz,3H),0.91–0.87(m,18H),0.07–0.03(m,12H)。参见附图89。
为了制备(R)–12，将(R)(–)–2–氨基–1–苯基乙醇((R)–15)(281mg，2.05mmol)和琥珀酸酐(220mg，2.2mmol)在无水二氯甲烷(7mL)中的溶液搅拌过夜。然后将反应在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.25%乙酸的在二氯甲烷中的0–30%甲醇梯度洗脱，得到白色粉末形式的(R)–16(470mg，1.98μmol，97%)。将(R)–16(288mg，1.22mmol)在甲醇和甲苯(10mL)3：2混合物（v/v）中的溶液用2.0M(三甲基硅烷基)重氮甲烷在乙醚中的溶液(900μl)处理。搅拌30分钟之后，过量的试剂通过添加乙酸破坏并将溶液在真空中浓缩。得到粗品(R)–甲基4–((2–羟基–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸酯((R)–12)并不经进一步纯化在下一步中使用。(300mg,1.20mmol,98%)。1H NMR(400MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)7.41–7.20(m,5H),4.76(dd,J=7.7Hz,J=3.8Hz,1H),3.62(s,3H),3.50(ddd,J=13.6Hz,J=6.4Hz,J=4.0Hz,1H),3.26(ddd,J=13.6Hz,J=8.0Hz,J=5.2Hz,1H),2.60–2.54(m,2H),2.52–2.46(m,2H)。13C NMR(100MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)173.7,172.7,144.3,128.9,127.9,126.8,73.6,51.7,48.5,31.0,29.7。参见附图90A–B。
为了制备18，将11(17mg，36μmol)在3mL无水二氯甲烷中的溶液用4–二甲氨基吡啶(1mg，8.2μmol)和EDC盐酸盐(11mg，57μmol)处理。搅拌30分钟之后，将在1mL无水二氯甲烷中的(R)–12(18mg，71μmol)加入该混合物中。搅拌2小时之后，将反应在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–70%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的17(17mg，24μmol，67%)。将17(17mg，24μmol)在乙腈(750μL)中的溶液冷却至0℃并用1滴的40%HF处理，同时搅拌。让反应温热至室温并搅拌1.5小时。将反应再冷却至0℃和用饱和NaHCO3水溶液(4滴)中止并立即用冰醋酸酸化。将反应在真空中浓缩并在硅胶上急骤柱层析采用在二氯甲烷中的0–30%甲醇梯度洗脱得到无色油状的(R)–(R)–2–(4–甲氧基–4–氧代丁酰胺)–1–苯基乙基4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(18)(6.6mg，13.7μmol，57%)。1H NMR(500MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)7.41–7.27(m,5H),5.84(dd,J=8.4Hz,J=4.4Hz,1H),4.64(s,1H),3.84–3.76(m,1H),3.73–3.68(m,1H),3.66(s,3H),3.61–3.45(m,4H),2.6–2.44(m,6H),1.98–1.91(m,1H),1.88–1.71(m,3H),1.20(d,J=6.1Hz,3H),1.14(d,J=6.1Hz,3H)。13C NMR(125MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)174.7,174.6,174.3,139.7,129.6,129.3,127.5,97.4,75.7,71.6,71.4,69.9,68.3,52.2,45.4,36.0,33.3,31.6,31.3,30.1,19.1,18.1。参见附图91A–B。
为了制备pasc#9，将18(6.6mg，14μmol)在无水四氢呋喃(200μl)中的溶液用LiOH(0.3mg，12μmol)和水(80μl)在1,4–二噁烷(400μl)中的混合物处理。于60℃搅拌5分钟之后，溶液用冰醋酸酸化并在真空中浓缩。将反应混合物粗品经HPLC纯化(参见方法)得到无色油状的4–(((R)–2–(((R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸(pasc#9)(1.8mg，4μmol，29%)。(c.0.18，甲醇)。
采用甲醇–d4获得pasc#9的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表12中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD3OD)=49.00ppm。参见附图92A–D。
表12.pasc#9的NMR光谱数据
实施例96—4–(((S)–2–(((R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸的合成
按照与实施例95中描述的类似反应步骤但以(S)(+)–2–氨基–1–苯基乙醇(S)–15为起始原料，制备4–(((S)–2–(((R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–苯基乙基)氨基)–4–氧代丁酸(19)，pasc#9的非天然异构体，如下面的流程图14所示。1H NMR(600MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)7.40–7.34(m,4H),7.32–7.28(m,1H),5.86(dd,J=8.5Hz,J=4.3Hz,1H),4.63(s,1H),3.84–3.78(m,1H),3.67–3.64(m,1H),3.60–3.53(m,2H),3.52–3.47(m,2H),2.62–2.43(m,6H),1.95–1.89(m,1H),1.88–1.77(m,2H),1.77–1.71(m,1H),1.16(d,J=6.2Hz,3H),1.14(d,J=6.1Hz,3H)。13CNMR(151MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)176.1,174.6,174.1,139.4,129.4,129.0,127.3,97.0,75.4,71.3,71.1,69.6,68.0,45.3,35.6,33.0,31.29,31.25,30.2,18.8,17.9。参见附图93A–C。
流程图14
实施例97—蛔苷part#9的合成
蛔苷part#9按照流程图15所示制备。
流程图15
为了制备22，将3（Srinivasan et al.,PLoS Biol.10:e1001237(2012)，在此全文引入作为参考）（181.5，413μmol）在无水四氢呋喃(0.5mL)中的溶液加入到LiOH(8.9mg，371μmol)和水(0.2mL)在1,4–二噁烷(1mL)中的混合物中。于67℃搅拌40分钟之后溶液用几滴冰醋酸酸化并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的20(48.5mg，145μmol，35%)。将20(48.5mg，145μmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液用Dess–Martin periodinane(88mg,208μmol)处理。5小时之后将溶液用10mL二氯甲烷稀释并用5%Na2S2O3在H2O中的溶液洗涤三次。有机层经Na2SO4干燥并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–30%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的21(26.8mg，81μmol，56%)。将21(24.5mg，74μmol)在1:1二氯甲烷∶甲醇(0.7mL)中的溶液用NaBH4(12mg,317μmol)处理。10分钟之后将溶液用冰醋酸酸化和用二氯甲烷稀释并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(2S,3R,5S,6R)–6–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–5–羟基–2–甲基四氢–2H–吡喃–3–基苯甲酸酯(22)(18.2mg，54μmol，74%)。1H NMR(600MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)8.04–8.01(m,2H),7.67–7.63(m,1H),7.55–7.50(m,2H),5.89(ddt,J=17.1Hz,J=10.3Hz,J=6.6Hz,1H),5.09–5.04(m,1H),4.99–4.95(m,1H),4.84(d,J=3.7,1H),4.69(ddd,J=11.4Hz,J=9.8Hz,J=4.6Hz,1H),4.04–3.98(m,1H),3.89–3.82(m,1H),3.78–3.71(m,1H),2.29–2.16(m,3H),1.93–1.86(m,1H),1.79–1.72(m,1H),1.65–1.58(m,1H),1.19(d,J=6.1Hz,3H),1.16(d,J=6.3Hz,3H).13C NMR(151MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)165.9,139.6,134.1,131.1,130.2,129.5,114.9,96.4,73.7,72.9,67.8,66.8,37.3,34.3,30.7,19.5,17.9。参见附图94A–B。
为了制备24，将22(18.2mg，54μmol)在无水四氢呋喃(0.5mL)中的溶液加入到LiOH(13.5mg，563μmol)和水(0.2mL)在1,4–二噁烷(1mL)中的混合物中。于67℃搅拌3小时之后溶液用冰醋酸酸化并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–30%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的23(8.5mg，37μmol，67%)。将23(8.5mg，37μmol)在DMF(700μL)中的溶液冷却至0℃，用氢化钠(10mg,60%在矿物油中的悬浮液，250μmol)处理。搅拌20分钟之后，加入苄基溴(15μl)并将混合物搅拌过夜。过量的试剂通过添加甲醇(300μl)破坏，残余物用乙酸乙酯(2mL)稀释，并将有机相用水洗涤(3×0.5mL)，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–25%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(2R,3S,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–2–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–6–基–甲基四氢–2H–吡喃(24)(13mg，32μmol，80%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d)：δ(ppm)7.38–7.25(m,10H),5.82(ddt,J=17.1Hz,J=10.4Hz,J=6.5Hz,1H),5.06–4.99(m,1H),4.98–4.93(m,1H),4.89(d,J=3.4Hz,1H),4.65(d,J=11.6Hz,1H),4.59(s,2H),4.46(d,J=11.6Hz,1H),3.86–3.74(m,2H),3.51–3.43(m,1H),3.07(ddd,J=11.1Hz,J=9.4Hz,J=4.3Hz,1H),2.33–2.06(m,3H),1.93–1.82(m,1H),1.83–1.73(m,1H),1.63–1.52(m,1H),1.22(d,J=6.2Hz,3H),1.19(d,J=6.1Hz,3H)。总共34H。13C NMR(100MHz，氯仿–d)：δ(ppm)138.6,138.41,138.38,128.55(2C),127.92,127.89,127.85(2C),114.7,93.2,78.2,74.1,71.6,70.90,70.86,67.6,52.4,36.5,30.3,19.7,17.9。参见附图95A–B。
为了制备part#9，将24(5.4mg，13μmol)在二氯甲烷：乙腈：H2O(300μL)的1:1:1混合物(v/v/v)中的溶液首先用NaIO4(13mg，61μmol)处理，然后用RuCl3·H2O(145μg,0.7μmol)在H2O(50μL)中的溶液处理。1.75小时之后，混合物用H2O(1mL)稀释,用二氯甲烷(3×1mL)萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.25%冰醋酸的在二氯甲烷中的0–20%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的4(4.6mg，11μmol，81%)。将含有10%甲酸的Pd/C(11mg，10%，w/w)在500μL的甲醇中的溶液，首先用氩气冲洗5分钟，随后用中等流的H2气体冲洗。向该搅拌的溶液中加入4(4.1mg，9.3μmol)在500μL甲醇中的溶液。4.5小时之后，将反应在二氧化硅垫上过滤并在真空中浓缩。经HPLC纯化(参见实施例90)得到无色油状的(R)–4–(((2R,3S,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸)(part#9)(1.5mg，6.0μmol，65%)。(c.0.15，甲醇)。
采用甲醇–d4获得part#9的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表13中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD3OD)=49.00ppm。参见附图96A–D。
表13.part#9的NMR光谱数据
实施例98—D–泊雷糖基–4R–羟基戊酸酸((R)–30)的合成
(R)–30，part#9的非天然的非对映异构体，按照下面的流程图16所示制备。
流程图16
为了制备26，将25（Zhao&Liu,J.Org.Chem.66:6810–15(2001)，在此全文引入作为参考）(137mg，845μmol)在DMF(2mL)中的溶液冷却至0℃，并用氢化钠(203mg,60%在矿物油中的悬浮液，5.1mmol)处理。30分钟之后加入溴化苄(630μL)并将混合物搅拌过夜。将反应混合物冷却至0℃后，过量的试剂通过添加甲醇(3mL)破坏，残余物用乙醚(5mL)稀释，并将有机相用水洗涤(3×2mL)，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–25%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(2S,3R,5S,6R)–3,5–双(苄氧基)–2–甲氧基–6–基–甲基四氢–2H–吡喃(26)(217mg，634μmol，75%)。1HNMR(400MHz，氯仿–d)：δ(ppm)7.41–7.27(m,10H),4.68–4.56(m,4H),4.46(d,J=11.6Hz,1H),3.75–3.66(m,1H),3.53–3.45(m,1H),3.43(s,3H),3.12–3.03(m,1H),2.36–2.29(m,1H),1.92–1.81(m,1H),1.26(d,J=6.4Hz,3H)。13C NMR(100MHz，氯仿–d)：δ(ppm)138.3,138.2,128.49,128.46,127.90,127.86,127.78,127.75,97.1,77.9,74.1,71.1,70.7,67.0,54.8,30.0,17.8。参见附图97A–B。
为了制备(R)–29，将26(217mg，634μmol)在3M H2SO4(0.5mL)和乙酸(2mL)的混合物中的溶液于100℃加热2小时。冷却后，将反应混合物在真空中干燥并向其中加入饱和NaHCO3(5mL)水溶液，搅拌10分钟，并用二氯甲烷(3×2mL)萃取。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–30%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的27(177mg，539μmol，85%)。将27(177mg，539μmol)在无水二氯甲烷(4mL)中的溶液用三氯乙腈(115μL，1.15mmol)和1,8–二氮杂双环[5.4.0]十一碳–7–烯(9μL，60.3μmol)处理。30分钟之后，将反应在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的10–20%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的28(110mg，233μmol，43%)。将28(110mg，233μmol)在无水二氯甲烷(2mL)中的溶液冷却至0℃并用(R)–2–己烯醇(60μL，500μmol)和三甲硅烷基三氟甲烷磺酸酯(5μL，28μmol)处理。于0℃搅拌3小时之后，反应用饱和NaHCO3水溶液中止，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–20%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(3R,5S,6R)–3,5–双(苄氧基)–2–((R)–己–5–烯–2–基氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃((R)–29)α–异头物(40.5mg，99μmol，43%)和β–异头物(35mg，85μmol，37%)。For(R)–29α–anomer,1H NMR(500MHz，氯仿–d)：δ(ppm)7.38–7.26(m,10H),5.82(ddt,J=17.0Hz,10.3Hz,6.6Hz,1H),5.04–4.98(m,1H),4.97–4.93(m,1H),4.87(d,J=3.4Hz,1H),4.65(d,J=11.5Hz,1H),4.59(s,2H),4.46(d,J=11.5Hz,1H),3.86–3.78(m,1H),3.78–3.72(m,1H),3.49–3.43(m,1H),3.80(ddd,J=11.1Hz,9.4Hz,4.4Hz,1H),2.34–2.28(m,1H),2.25–2.11(m,2H),1.94–1.85(m,1H),1.75–1.66(m,1H),1.58–1.49(m,1H),1.25(d,J=6.3Hz,3H),1.22(d,J=6.3Hz,3H)。13C NMR(125MHz，氯仿–d)：δ(ppm)138.7,138.39,138.37,128.54,128.52,127.91,127.86,127.84,127.80,114.6,95.7,78.2,74.5,74.4,71.0,70.9,67.4,35.9,30.2,29.7,21.5,17.9。参见附图98A–B。
为了制备(R)–30，将(R)–29α–异头物(20.3mg，49μmol)在二氯甲烷：乙腈：H2O(360μL)的1:1:1混合物(v/v/v)中的溶液首先用NaIO4(43mg，203μmol)处理，然后用RuCl3·H2O(547μg,2.6μmol)在H2O(80μL)中的溶液处理。2.75小时之后，混合物用H2O(1.2mL)稀释,用二氯甲烷(3×1mL)萃取，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.25%冰醋酸的在二氯甲烷中的0–20%甲醇梯度洗脱，得到无色油状的(R)–2(16mg，37μmol，76%)。将含有10%甲酸的Pd/C(20mg，10%，w/w)在500μL甲醇中的溶液，首先用氩气冲洗5分钟，随后用中等流的H2气体冲洗。向搅拌的该溶液中加入(R)–2(7.0mg，16.3μmol)在500μL甲醇中的溶液。1小时之后，将反应在二氧化硅垫上过滤并在真空中浓缩,得到无色油状的(R)–4–(((2S,3R,5S,6R)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸((R)–30)(4.0mg，16.1μmol，98%)。1H NMR(500MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)4.70(d,J=3.6Hz,1H),3.81–3.72(m,1H),3.63–3.54(m,2H),3.16(ddd,J=11.4Hz,9.4Hz,4.6Hz,1H),2.45(t,J=7.6Hz,2H),2.04–1.97(m,1H),1.85–1.77(m,2H),1.77–1.69(m,1H),1.26(d,J=6.2Hz,3H),1.17(d,J=6.3Hz,3H)。13C NMR(125MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)178.0,99.6,76.1,71.9,69.9,69.0,37.0,33.1,31.0,21.8,17.7。参见附图99A–B。
实施例99—(S)–4–(((2S,3R,5S,6R)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸((S)–30)的合成
按照实施例98中描述的类似反应步骤但使用(S)–2–己烯醇，制备(S)–30，part#9的对映体，如下面的流程图17所示。(S)–30的NMR光谱表征与part#9相同。
流程图17
实施例100—蛔苷npar#1的合成
蛔苷npar#1按照下面的流程图18所示制备。
流程图18
为了制备32，在不断搅拌下将冷却至–40℃的5（Lucero&Woerpel,J.Org.Chem.71:2641–47(2006)，在此全文引入作为参考）(550mg，1.19mmol)在无水二氯甲烷(1.5mL)中的溶液滴加至三甲基硅烷基溴化物(3.2mL，24.2mmol)中。然后让反应混合物温热至室温并搅拌45分钟。在真空中除去过量的试剂和溶剂。产物((3R,4S,5R)–3,4,5–三(苄氧基)–2–溴四氢–2H–吡喃(32))不再表征直接用于下一步骤，因为该产物接触湿气产生分解。
为了制备6，将31(Chheda&Hong,J.Med.Chem.14:748–53(1971)，在此全文引入作为参考)(500mg,1.12mmol)在真空中充分干燥并加入到32在12mL无水甲苯中的溶液中。将反应混合物回流2.5小时。在真空中蒸发甲苯以将体积减少至～3mL并将3mL的石油醚加入到其中。将所得棕色悬浮液过滤并将沉淀用温热的氯仿（3x10mL）洗涤。将滤液和洗液合并并用10mL30%KI水溶液、10mL水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–20%甲醇梯度洗脱，得到浅黄色油状的33(160mg，262μmol，22%经两步，比例为～2：3的α和β异头物的混合物)。将33与L–苏氨酸反应并按照对相应的2,3,5–三–O–乙酰基呋喃核糖苷–衍生物所报道的条件精制（Chheda&Hong,J.Med.Chem.14:748–53(1971)，在此全文引入作为参考）。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.25%乙酸的在二氯甲烷中的0–30%甲醇梯度洗脱，得到黄色固体形式的34(117mg，172μmol，66%，比例为～2：3的α和β–异头物的混合物)。将34(72mg，106μmol)和15μl三乙基胺(210μmol)在300μl三氟甲基苯中的混合物用2–苄氧基–1–甲基吡啶三氟甲磺酸盐（Tummatorn et al.,J.Org.Chem.72:8962–64(2007)，在此全文引入作为参考）(71mg，210μmol)并在83℃下搅拌15小时。将产物在2mL乙酸乙酯和2mL水之间分配，有机相用1mL水、1mL盐水洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–20%异丙醇梯度洗脱，得到黄色固体形式的(2S,3R)–苄基3–羟基–2–(3–(9–((3R,4S,5R)–3,4,5–三(苄氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸酯(6)(8.1mg，10μmol，10%,β–异头物)。1H NMR(500MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)8.39(s,1H),8.27(s,1H),7.43–7.25(m,15H),6.99–6.95(m,1H),6.91–6.86(m,2H),6.67–6.62(m,2H),5.53(d,J=8.9Hz,1H),5.25(d,J=12.7Hz,1H),5.23(d,J=12.7Hz,1H),5.01(d,J=11.2Hz,1H),4.88(d,J=11.2Hz,1H),4.74(s,2H),4.62–4.56(m,2H),4.48(dq,J=6.4Hz,2.5Hz,1H),4.26–4.15(m,3H),3.94–3.88(m,1H),3.84–3.79(m,1H),3.53–3.46(m,1H),1.31(d,J=6.5Hz,3H)。13C NMR(125MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)172.2,156.6,152.1,151.5,151.4,143.7,139.9,139.7,138.4,137.2,129.65,129.53,129.46,129.37,129.24,129.13,129.08,129.06,128.90,128.88,128.74,128.71,121.5,86.5,85.6,79.6,78.8,76.5,75.7,74.1,68.5,68.1,67.7,60.6,20.7。参见附图100A–B。
为了制备npar#1，将4(4mg，9μmol)在450μL无水二氯甲烷中的溶液用4–二甲氨基吡啶(2.5mg，20μmol)和EDC盐酸盐(4mg，21μmol)处理。搅拌15分钟之后，将在300μL无水二氯甲烷中的6(7.3mg，9μmol)加入该混合物中。搅拌12小时之后，将反应在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–15%异丙醇梯度洗脱，得到35(5.5mg，4.6μmol，51%)。将含有10%甲酸的Pd/C(7mg，10%，w/w)在500μL甲醇中的溶液，首先用氩气冲洗5分钟，随后用中等流的H2气体冲洗。向搅拌的该溶液中加入35(5.5mg，4.6μmol)在500μL甲醇中的溶液。4小时之后，将反应在二氧化硅垫上过滤并在真空中浓缩。经HPLC纯化(参见实施例90)得到无色油状的(2S,3R)–3–(((R)–4–(((2R,3S,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–(3–(9–((2R，3R,4S,5R)–3,4,5–三羟基四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸(npar#1)(1.1mg，1.7μmol，37%)。(c.0.11，甲醇)。
采用甲醇–d4获得npar#1的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表14中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD3OD)=49.00ppm。参见附图101A–E。
表14.npar#1的NMR光谱数据
实施例101—(2S,3R)–3–(((S)–4–(((2S,3R,5S,6R)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–2–(3–(9–((2R,3R,4S,5R)–3,4,5–三羟基四氢–2H–吡喃–2–基)–9H–嘌呤–6–基)脲基)丁酸(36)的合成
按照实施例100中对于npar#1描述的类似的反应步骤但使用(S)–2制备36，如下面的流程图19所示。1H NMR(600MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)8.65(s,1H),8.46(s,1H),5.59–5.54(m,1H),5.55(d,J=9.4Hz,1H),4.71(d,J=3.8Hz,1H),4.67–4.63(m,1H),4.14(t,J=9.1Hz,1H),4.04(dd,J=11.3Hz,5.5Hz,1H),3.84–3.73(m,2H),3.62–3.56(m,1H),3.55–3.47(m,3H),3.13(ddd,J=11.3Hz,9.3Hz,4.4Hz,1H),2.60–2.47(m,2H),2.04–1.98(m,1H),1.94–1.84(m,2H),1.75–1.68(m,1H),1.37(d,J=6.3Hz,3H),1.16(d,J=6.1Hz,3H),1.15(d,J=6.3Hz,3H)。13C NMR(151MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)173.7,173.5,153.5,152.3,151.8,151.5,143.3,121.1,96.0,85.7,78.6,72.8,72.4,71.9,71.6,70.5,70.1,69.7,68.4,58.5,36.8,33.2,31.5,19.1,17.61,17.57。参见附图102A–C。
流程图19
实施例102—蛔苷dasc#1的合成
蛔苷dasc#1按照下面的流程图20所示制备。
流程图20
为了制备dasc#1，将ascr#1(15mg，54μmol)在15mL无水DMF中的溶液加入到4–二甲氨基吡啶(13.5mg，110.7μmol)和EDC盐酸盐(11mg，57.3μmol)在7mL无水DMF中的溶液中。通过ESI–MS监测反应，当观察到显著数量的聚合物峰（m/z=791等）时用几滴冰醋酸中止反应并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用含有0.25%的在二氯甲烷中的0–30%甲醇梯度洗脱，并将粗产物进一步经HPLC纯化(参见实施例90)得到无色油状的(R)–6–(((2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–6–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)庚酰基)氧基)–3–羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)庚酸(dasc#1)(1.1mg，2.1μmol，7.8%)。(c.0.11，甲醇)。
采用甲醇–d4获得dasc#1的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表15中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD3OD)=49.00ppm。参见附图103A–D。
表15.dasc#1的NMR光谱数据
实施例103—蛔苷ubas#1的合成
蛔苷ubas#1按照下面的流程图21所示制备。
流程图21
为了制备38，将ascr#9(Srinivasan等，PLoS Biol.10:e1001237(2012)，在此全文引入作为参考)(24.0mg，97μmol)和28μl三乙基胺(200μmol)在300μl三氟甲基苯中的混合物用70mg2–苄氧基1–甲基吡啶三氟甲磺酸盐(Tummatorn等，J.Org.Chem.72:8962–64(2007)，在此全文引入作为参考)(200μmol)处理并于83℃搅拌18小时。将产物在2mL乙酸乙酯和2mL水之间分配，有机相用1mL水、1mL饱和NaCl水溶液洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–10%甲醇梯度洗脱得到无色油状的(R)–苄基4–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(38)(22.6mg，66.8μmol，69%)。1H NMR(500MHz，氯仿–d)：δ(ppm)7.39–7.30(m,5H),5.12(s,2H),4.68(s,1H),3.88–3.80(m,1H),3.80–3.74(m,1H),3.63–3.52(m,2H),2.54–2.41(m,2H),2.06–2.01(m,1H),1.90–1.84(m,2H),1.82–1.75(m,1H),1.24(d,J=6.1Hz,3H),1.14(d,J=6.2Hz,3H).13C NMR(125MHz，氯仿–d)：δ(ppm)173.6,136.0,128.7,128.39,128.37,95.8,70.3,70.1,69.3,68.1,66.5,35.3,32.2,30.8,18.8,17.8。参见附图104A–B。
为了制备8，将38(22.6mg，66.8μmol)和3–叠氮基–(2R)–甲基丙酸（Rej et al.,J.Org.Chem.61:6289–95(1996)，在此全文引入作为参考）(37,8.6mg,66.8μmol)在2mL二氯甲烷中的溶液用4–二甲氨基吡啶(16.3mg，133.6μmol)和EDC盐酸盐(25.7mg，133.6μmol)处理。于室温搅拌12小时之后反应通过添加5%含水的乙酸(100μl)中止，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–10%异丙醇梯度洗脱得到无色油状的(R)–苄基4–(((2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–3–叠氮基–2–甲基丙酰基)氧基)–3–羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(8)(5.2mg，11.6μmol，17%)。1H NMR(400MHz，氯仿–d)：δ(ppm)7.40–7.31(m,5H),5.15(d,J=13.6Hz,1H),5.11(d,J=13.6Hz,1H),4.86(ddd,J=10.9Hz,9.4Hz,4.6Hz,1H),4.73–4.70(m,1H),3.90–3.76(m,3H),3.52(dd,J=12.2Hz,7.5Hz,1H),3.38(dd,J=12.2Hz,5.6Hz,1H),2.71–2.60(m,1H),2.57–2.42(m,2H),2.13–2.05(m,2H),1.93–1.83(m,3H),1.20(d,J=7.0Hz,3H),1.17(d,J=6.3Hz,3H),1.16(d,J=6.2Hz,3H)。参见附图105。
为了制备10，将oscr#9(von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817–24(2012)，在此全文引入作为参考)(17.6mg，71μmol)在甲醇和甲苯(2mL)的1:1混合物（v/v）中的溶液用2.0M(三甲基硅烷基)重氮甲烷在乙醚中的溶液(200μl)处理。搅拌30分钟之后过量的试剂通过添加乙酸破坏并将溶液在真空中浓缩。将残余物溶解于DMF(500μL)中，冷却至0℃，并用氢化钠(17mg,60%在矿物油中的悬浮液，425μmol)处理。10钟之后加入溴化苄(51μl)并将混合物搅拌过夜。过量的试剂通过添加甲醇(300μl)破坏，残余物用乙酸乙酯(2mL)稀释，并将有机相用水洗涤(3×1mL)，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–40%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的39(14.4mg，33μmol，46%经两步)。将39(14.4mg，33μmol)在THF(1mL)中的溶液用3.3M氢氧化锂在二噁烷(2mL)中的水溶液(100μl，330μmol)于67℃处理。3小时之后通过添加乙酸中止反应，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在二氯甲烷中的0–20%甲醇梯度洗脱得到无色油状的5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(10)(11.8mg，28μmol，85%)。1H NMR(500MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)7.32–7.38(m,8H),7.30–7.25(m,2H),4.69(s,1H),4.62(d,J=11.8Hz,1H),4.58(s,2H),4.48(d,J=11.8Hz,1H),3.73–3.64(m,2H),3.64–3.60(m,1H),3.46–3.38(m,2H),2.37–2.30(m,3H),1.73–1.57(m,5H),1.21(d,J=6.2Hz,3H)。13C NMR(125MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)174.6,140.0,139.9,129.1,129.0,128.6,128.4,128.19,128.21,97.7,76.4,76.0,71.4,71.2,68.9,67.3,33.9,30.2,29.8,22.6,18.6。参见附图106A–B。
为了制备40，将8(5.2mg，11.6μmol)和10(6.4mg,14.9μmol)在1mL二氯甲烷中的溶液用4–二甲氨基吡啶(3.7mg，30μmol)和EDC盐酸盐(5.8mg，30μmol)处理。于室温搅拌12小时之后反应通过添加5%含水的乙酸(50μl)中止，经Na2SO4干燥，并在真空中浓缩。在二氧化硅上急骤柱层析，采用在己烷中的0–50%乙酸乙酯梯度洗脱，得到无色油状的(2R,3R,5R,6S)–5–(((R)–3–叠氮基–2–甲基丙酰基)氧基)–2–(((R)–5–(苄氧基)–5–氧代戊–2–基)氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–3–基5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–双(苄氧基)–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸酯(40)(9.6mg，11.2μmol，97%)。1H NMR(500MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)7.40–7.25(m,15H),5.15(d,J=12.3Hz,1H),5.12(d,J=12.3Hz,1H),4.84–4.78(m,2H),4.66(s,1H),4.74(s,1H),4.58(d,J=12.3Hz,1H),4.57(d,J=11.4Hz,1H),4.53(d,J=12.3Hz,1H),4.46(d,J=11.4Hz,1H),3.87–3.80(m,2H),3.75–3.67(m,2H),3.60–3.56(m,1H),3.51(dd,J=12.2Hz,7.6Hz,1H),3.47–3.34(m,3H),2.68–2.60(m,1H),2.55–2.41(m,2H),2.38(t,J=7.4Hz,2H),2.24–2.18(m,1H),2.12–2.06(m,1H),1.96–1.85(m,3H),1.77–1.65(m,3H),1.64–1.55(m,2H),1.29(d,J=6.2Hz,3H),1.19(d,J=7.1Hz,3H),1.16(d,J=6.2Hz,3H),1.15(d,J=6.1Hz,3H)。13C NMR(125MHz，丙酮–d6)：δ(ppm)173.4,173.2,172.9,138.6,138.5,136.0,128.7,128.52,128.51,128.45,128.38,128.0,127.79,127.77,97.2,93.5,75.6,75.4,71.4,71.24,71.22,70.5,70.4,68.3,67.0,66.8,66.5,55.8,40.1,34.1,32.1,30.6,29.9,29.7,29.5,29.1,21.8,18.9,18.3,17.7,14.9.ESI+MS：m/z=882.5[M+Na+]和898.5[M+K+]。参见附图107A–B。
为了制备ubas#1，将含有5%1M HCl水溶液的Pd/C(5.4mg，10%，w/w)在0.7mL甲醇中的溶液用氩气冲洗5分钟，随后用中等流的H2气体冲洗5分钟。向搅拌的该溶液中通过注射器加入40(4.3mg，5.0μmol)在1.3mL甲醇中的溶液，并让H2气体不断地流过反应。通过直接注入ESI–MS监测反应。20分钟之后，将反应在二氧化硅垫上用另外的甲醇过滤。将产物在真空中浓缩并将40和41(3.7mg)的粗品混合物不经进一步纯化在下一步中使用。制备含水的HCl(200μL，50μmol)、含水的KCNO(200μL，50μmol)和H2O(100μL)的溶液。将该含水的HCl/KCNO溶液加入到40和41的粗品混合物(3.7mg)中并置入75℃油浴中5分钟。将另外的含水的HCl溶液(50μL，12.5μmol)加入到反应中并让此反应物再搅拌2.5分钟。定期检查反应混合物的pH以确保pH不为碱性。通过直接注入ESI–MS监测反应。将混合物在真空中浓缩并经HPLC纯化(参见实施例90)得到无色油状的(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3–((5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酰基)氧基)–6–甲基–5–(((R)–2–甲基–3–脲基丙酰基)氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(ubas#1)(200μg，0.3μmol，7%经两步)。
采用甲醇–d4获得ubas#1的1H(600MHz)、13C(151MHz)、和HMBC NMR光谱数据，并显示于下面的表16中。化学位移参考(CD2 HOD)=3.31ppm和(CD3OD)=49.00ppm。参见附图108A–D。
表16.ubas#1的NMR光谱数据
实施例104—ubas#2的富集
按照粗品P.pacificus外代谢组提取物的HPLC富集获得(R)–4–(((2R,3R,5R,6S)–3–(((R)–5–(((2R,3R,5R,6S)–3,5–二羟基–6–甲基四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)己酰基)氧基)–6–甲基–5–(((R)–2–甲基–3–脲基丙酰基)氧基)四氢–2H–吡喃–2–基)氧基)戊酸(ubas#2)的富集样品。1H NMR(600MHz，甲醇–d4)：δ(ppm)4.80(m,1H),4.79(s,1H),4.74(m,1H),4.65(s,1H),3.99(m,1H),3.84(m,1H),3.82(m,1H),3.72(m,1H),3.62(m,1H),3.51(m,1H),3.26(m,2H),2.68(m,1H),2.42(m,2H),2.34(m,2H),2.10(m,1H),2.01(m,1H),1.95(m,1H),1.83(m,2H),1.78(m,1H),1.64–1.57(m,4H),1.23(d,J=6.3Hz,3H),1.157(d,J=6.2Hz,3H),1.156(d,J=6.3Hz,3H),1.147(d,J=6.2Hz,3H),1.142(d,J=7.0Hz,3H)。参见附图109。
实施例85–104的讨论
小分子提供多种基本的生物功能（Meinwald,J.Nat.Prod.74:305–09(2011)，在此全文引入作为参考）。它们便于互相间和内部的特定的化学通讯，用于化学防御和捕食，在动物和植物中起激素第二信使的作用，和充当生物大分子的结构单元。与大多类别的微生物和植物相反，它们的基因组已经显示多种多样的“第二”小分子生物合成途径，例如聚酮化合物和非核糖体肽（Walsh,Acc.Chem.Res.41:4–10(2008)，在此全文引入作为参考），已知大多数后生动物不具有产生结构复杂的小分子的专用生物合成机制。相应地，从动物源中分离出来的大多数不寻常的代谢产物已经被证明是饮食–衍生的。例外包括从基底动物（例如海绵皂和节肢动物）中分离出来的化合物，不过，其中有一些也可以是微生物来源的(Piel,Nat.Prod.Rep.26:338–62(2009);Dossey,Nat.Prod.Rep.27:1737–57(2010);Gronquist&Schroeder,in2COMPREHENSIVE NATURAL PRODUCTS II—CHEMISTRY和BIOLOGY67–108(Bradley S.Moore&Phillip Crews eds.,2010)，在此全文引入作为参考)。模型机体秀丽隐杆线虫（C.elegans）的研究显示这种线虫产生一族小分子信号，蛔苷，例如ascr#1–ascr#3、和hbas#3（附图110A），其控制秀丽隐杆线虫（C.elegans）生活史的多方面，包括幼虫发育、交配、和社会行为(Srinivasan等，Nature454:1115–18(2008);Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420–22(2007);Srinivasan等，PLoS Biol.10:e1001237(2012);von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817–24(2012)，在此全文引入作为参考)。这些由二脱氧糖蛔糖与各种脂质–和氨基酸–代谢衍生的部分组合衍生而来的秀丽隐杆线虫（C.elegans）信号分子的结构，表明线虫、和可能其它的动物，还隐藏有未被认识的生物合成能力。
作为线虫代谢组的广义2D NMR–光谱筛选的一部分，对necromenic蛔虫的外代谢组（所有的分泌和排泌代谢产物）进行了分析。象秀丽隐杆线虫（C.elegans），P.pacificus是一种已经被确定为研究发育和进化生物学的模型机体的自由生活线虫(Hong&Sommer,Bioessays28:651–59(2006)，在此全文引入作为参考)。P.pacificus形成了与甲虫的necromenic共生体（association），其可以代表对真正寄生进化的预适应(Rae等，J.Exp.Biol.211:1927–36(2008)，在此全文引入作为参考)。P.pacificus表现出对其在野生环境中生存是关键的两种类型的表型可塑性。象在许多其它线虫物种中的一样，严酷的环境条件，例如食物短缺，触发作为休眠期蠕虫的发育停止，一种高度抗紧张的替代的幼虫期(Weller等，J.Parasitol.96:525–31(2010)，在此全文引入作为参考)。P.pacificus还表现出独一无二的嘴发育的二态性，代表成虫后生动物中的形态学表型可塑性的实例（附图110B）。蠕虫成虫可具有狭窄的（“口狭窄的”）或阔的和更复杂的（“阔口的”）口孔，后一种发育响应于低食物可利用性的条件。两种不同的嘴形与不同的摄食习性有关：口狭窄的蠕虫被认为是主要进食细菌，而阔口形适于对其它线虫的掠夺行为。先前的研究显示休眠期形成和嘴二态性均通过种群密度调节，表明表型可塑性的这两个实例由互相间生物的小分子信号驱动（附图110B）（Bento等，Nature466:494–97(2010)，在此全文引入作为参考）。
具有诱导休眠期活性的P.pacificus外代谢组级分的2D NMR–型代谢产物学显示暗示初级代谢产物的显著多样性，例如木糖、苏氨酸、腺苷、短链脂肪酸、琥珀酸盐、苯基乙醇胺、和若干二脱氧糖衍生物（附图110C）；然而，它们的NMR数据表明这些部分的大多数是较大装配的一部分。二脱氧糖衍生物属于两个化学上有差异的亚类。一类以蛔糖为基础，一种线虫广泛产生的糖（Choe等，Curr.Biol.22:772–80(2012)，在此全文引入作为参考），而另一类化合物似乎包括相关性糖，泊雷糖，先前报道只来自细菌（附图110C）。通过HPLC–MS/MS对P.pacificus外代谢组分析～150种最近从秀丽隐杆线虫（C.elegans）中鉴定的蛔苷中的任何蛔苷的存在（von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817–24(2012)，在此全文引入作为参考），检测到ascr#1、ascr#9、和ascr#12，如先前报道的（附图111A）（Choe等，Curr.Biol.22:772–80(2012)，在此全文引入作为参考）。然而，这三种化合物仅解释了一小部分的2D核磁共振光谱检测的结构。
结合由NMR和高分辨率HPLC–MS/MS分析得到的结果（附图111A、112、和113），在某些情况下在额外分级以提高微量组分的含量之后（附图111B），提出了P.pacificus外代谢组的主要未知组分。最丰富的蛔苷衍生物，所命名的pasc#9被认为是通过4–羟基戊酸链与蛔糖连接的N–琥珀酰1–苯基乙醇酰胺（附图111B）。该化合物伴随有两个二聚的蛔苷衍生物，一种已知的ascr#1的二聚体（dasc#1），其中一个ascr#1–单元与另一个ascr#1单元的碳4连接，而另一个二聚体（ubas#1）由ascr#9构成，其中(ω)–氧化蛔苷oscr#9在2位上与其连接（附图111B）。第二种二聚体，ubas#1，还带有与碳4连接的3–脲基异丁酸盐部分。二聚的蛔苷和脲基异丁酸盐–取代的代谢产物从特性上看先前似乎都未报道过。
这些蛔苷伴随有两个丰富的包含泊雷糖而不是蛔糖的代谢产物，npar#1和part#9（附图111B）。在npar#1中，泊雷糖部分与短脂质侧链连接，随后与苏氨酸连接。该氨基酸通过氨基甲酰基进一步与核苷腺苷的衍生物连接（附图111B）。显著地，发现该腺苷包含吡喃木糖（而不是DNA、RNA中的呋喃核糖或脱氧呋喃核糖）、和已知的核苷–型信号分子。伴随的part＃9代表泊雷糖和npar#1的侧链部分（附图111B）。
为了证实这些结构的指定、为了确定立体化学、和为了探究生物功能，利用它们的模块化特性，展开了该拟议结构的合成（附图111C，参见实施例95–104）。比较合成的和天然的样品核磁共振光谱确定天然pasc#9中的N–琥珀酰1–苯基乙醇酰胺部分的构型为R（附图114）。类似地，比较NMR光谱数据和HPLC保留时间能够指定二聚的蛔苷dasc#1和ubas#1的立体化学（附图115和116）。ubas#1中3–脲基异丁酸盐部分的R–构型与其很可能的胸腺嘧啶分解代谢来源一致(van Kuilenburg等，Biochem.J.379:119–24(2004)，在此全文引入作为参考)。最后合成了泊雷糖苷part＃9和不寻常的木糖腺苷（xyloadenosine）衍生物，npar#1。比较天然part＃9和几种合成的part＃9非对映异构体的HPLC–保留时间，发现天然的part＃9必定是D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸或L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸（附图117）。最初设想part＃9和npar#1含有D–泊雷糖，先前已经描述其来自没有发现L–泊雷糖特性的细菌。此外，D–泊雷糖为一种推定的L–蛔糖生物合成中的中间物（Thorson等，J.Bacteriol.176:5483–93(1994)，在此全文引入作为参考），线虫中所有的蛔苷都是基于L–蛔糖。然而，合成的npar#1非对映异构体包括D–泊雷糖基–4S–羟基戊酸的HPLC保留时间和核磁共振光谱与天然npar#1所得到的数据不匹配（附图118A）。因此，推断npar#1必定以L–泊雷糖基–4R–羟基戊酸为基础，这通过该非对映异构体的合成及其光谱数据与天然npar#1的光谱数据比较得到证实（附图118B–C）。先前没有该糖L–泊雷糖的特性；然而，其在线虫中的存在似合理地由L–蛔糖在2位上的差向异构化产生。
下一步询问是否已鉴定的糖、氨基酸、脂质、和核苷–衍生的结构单元的组合为特定的。为了解决这个问题，对整个P.pacificus外代谢组通过高分辨率HPLC–MS/MS进行小心地再分析和筛选同系物或已鉴定的结构中的主要代谢–衍生的结构单元的可替代的组合。发现pasc#9伴有痕量的两个包含六–和七–碳侧链的同系物，这也通过核磁共振光谱学检测到（附图119）。此外，检测到少量的ubas#1的同系物（附图113中的ubas#2）以及npar#1的衍生物，其MS数据表明木糖丢失（附图113中的npar#2）。重要的是，没有观察到表明已鉴定的化合物的非酶发生的结构单元的非特异性或表面上任意的组合。这些结果显示已鉴定的化合物的模块化装配是高特异性的。为了排除已鉴定的化合物为细菌代谢产物的可能性，还分析了用作P.pacificus食物的大肠杆菌OP50（E.coli OP50）细菌的代谢组。发现没有任何已鉴定的化合物在细菌代谢组中存在（附图120）。此外，所有已鉴定的化合物在用假单胞菌属而不是大肠杆菌（E.coli）补给的P.pacificus培养物中检测到。
然后对已鉴定的化合物的合成样品试验它们在P.pacificus休眠期和嘴形二态性检测中的活性。如根据先前的研究显示在P.pacificus嘴形二态性和休眠期检测中秀丽隐杆线虫（C.elegans）外代谢组样品不具有活性所期望的那样（Ogawa等，Curr.Biol.19:67–71(2009)，在此全文引入作为参考），发现ascr#1，一种由秀丽隐杆线虫（C.elegans）大量排泌的化合物（Jeong等，Nature433:541–45(2005)，在此全文引入作为参考），没有在P.pacificus中诱导休眠期的活性，即使在非常高的浓度下（附图121）。相反，核苷衍生物npar#1强烈诱导休眠期形成，似乎解释了未分级的外代谢组的大部分报道的诱导休眠期的活性（Mayer&Sommer,Proc.Biol.Sci.278:2784–90(2011)，在此全文引入作为参考）（附图122A和122C）。另外，观察到part＃9较弱的休眠期，而所有的其它试验化合物在该检测中是非活性的。在嘴二态性检测中试验合成的化合物，发现二聚体化合物dasc#1（在休眠期形成检测中是非活性的），强烈诱导阔口嘴形（附图122B和122D）。此外，发现高浓度的pasc#9、ascr#1、和npar#1能较弱诱导阔口嘴形，而二聚体的ubas#1以及单体的ascr#9和part＃9是非活性的。
这些结果显示P.pacificus中的成虫表型可塑性和幼虫发育由有差别的但还部分交叉的多组信号分子控制。嘴形二态性主要由dasc#1（高特异性的蛔苷二聚化的产物）调节，休眠期形成由泊雷糖苷与不寻常的核苷的分子组合控制。先前的工作显示控制P.pacificus中的表型可塑性信号分子作用于进化保守的转录因子包括DAF–16/FOXO和核激素受体DAF–12（附图122E）（Ogawa等，Development138:1281–84(2011);Sommer&Ogawa,Curr.Biol.21:R758–R66(2011)，在此全文引入作为参考），因此休眠期诱导和嘴形二态性均需要daf–12，而休眠期诱导需要daf–16但对于调节嘴形二态性是可有可无的（Ogawa等，Development138:1281–84(2011)，在此全文引入作为参考）。因此，调节休眠期形成和嘴形二态性的不同亚组的小分子似乎以不同的下游效应子为靶标。本发明的实施例进一步证实调节不同类型表型可塑性的小分子生物合成途径的物种特异性的竞合（co–option），因为ascr#1促进秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的休眠期而其二聚体dasc#1调节P.pacificus中的成虫形态学。基于最近的鉴定GPCRs为秀丽隐杆线虫（C.elegans）休眠期信息素的受体（McGrath等，Nature477:321–25(2011)，在此全文引入作为参考），很有可能P.pacificus中的特异性GPCRs将npar#1、dasc#1与它们各自的下游途径连接。
已鉴定的小分子信号的结构似乎集成了来自主要的初级代谢途径的特定输入：脂肪酸、碳水化合物、氨基酸、和核苷代谢（附图122E）。来自这些途径的结构单元的模块化装配产生不同的分子建筑结构，其还不同于任何先前已知的经不寻常的核苷修饰的动物代谢产物，产生吡喃木糖–型腺苷。这种前所未有的核苷很可能由典型的(核糖)–苏氨酰基氨甲酰基腺苷（t6A）（一种在直接邻近于tRNAs亚组的反密码子三联体（triplet）发现的高度保守的核苷）的代谢获得(Deutsch等，J.Biol.Chem.287:13666–73(2012)，在此全文引入作为参考)。t6A对于保持平移的准确性（fidelity）起重要作用；然而，它通常只解释非常小部分的tRNA，且P.pacificus中大量吡喃木糖衍生物的产生是令人惊奇的。
本发明的实施例提供证明小分子控制后生动物中的成虫表型可塑性的直接证据，其依赖保守的内分泌信号途径。是否已鉴定的信号分子的生物合成还涉及保守的途径或依赖于对P.pacificus（和可能其它线虫）特异性的专用酶还是未知的。然而，该P.pacificus化合物由改性的初级代谢产物的装配产生的发现表明它们的生物合成很大程度上基于保守的生化途径（附图122E）。值得注意的是，该P.pacificus基因组含有25,000个以上基因预测与属于基因编码的初级代谢酶的许多特定的基因复制事件(Dieterich等，Nat.Genet.40:1193–98(2008);Borchert等，Genome Res.20:837–46(2010)，在此全文引入作为参考)。支持涉及线虫信号分子的生物合成中初级代谢，最近的秀丽隐杆线虫（C.elegans）中蛔苷生物发生的研究显示脂质样蛔苷侧链由保守的过氧化物酶体–β–氧化产生(von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817–24(2012);Butcher等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:1875–79(2009)，在此全文引入作为参考)。已知的高等动物中的信号分子和辅助因子，例如S–腺苷甲硫氨酸或磷脂酰肌醇，通常依赖由一个或两个不同的初级代谢途径获得的结构单元的组合。本发明的实施例证实后生动物可能延伸了这种策略以产生构造复杂得多的信号分子，表明对来自高等动物包括哺乳动物的代谢组的详细的光谱再分析，也可能揭示新类型的模块化小分子信号。
实施例105—秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株和一般培养法
野型秀丽隐杆线虫（C.elegans）(N2，Bristol)、daf–22（m130）、daf–22（ok693）、acox–1(ok2257)、maoc–1(hj13)、和dhs–28（hj8）突变株得自Caenorhabditis Genetics Center(CGC)。将菌株在20℃下保持在含作为食物的细菌（大肠杆菌OP50）NGM板上。
实施例106—秀丽隐杆线虫（C.elegans）代谢物提取物的制备
按照(Pungaliya等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:7708(2009)（在此全文引入作为参考）中报道的方法让液体培养物生长。简而言之，让野型或daf–22突变体蠕虫在接种OP50的NGM板上生长两代。将三个密集的6cmNGM板冲洗到500mL锥形烧瓶中的100mLS–培养基溶液中并在22℃和220pm下生长。在第1天和第3天提供来自1L过夜培养的细菌培养物的浓缩的OP50。在第5天将液体培养物分入两个500mL锥形烧瓶中，生长培养基体积维持在100mL。在分离时再提供1L OP50沉淀（pellet）作为食物。在第7天通过在4750rpm下离心收获培养物。将上清液冻干并将残余物用95%乙醇（300mL）于室温萃取12小时。将所得悬浮液过滤并于室温在真空中蒸干产生粗提取物。用这种方式制备野型(N2)、daf–22（m130）、和daf–22（ok693）培养物各四份提取物。为了NAE定量，让突变株如上所述一式两份生长。按照上面的描述在第0天加入2.5μM的ascr#3和2.5μM的ascr#9准备蛔苷混合物实验的液体培养物。
在NMR–光谱分析的准备中，将粗提取物悬浮于1:8甲醇(MeOH):二氯甲烷(DCM)中，使用每1克的粗提取物7.5mL的该溶剂混合物。离心之后，将每种样品的2ml等份的上清液在1g二氧化硅（EMD Chemicals Inc.）上采用10mL的1:8MeOH：DCM洗脱过滤。分析之前将滤液在真空中蒸干。对于NMR光谱分析，使用10–20mg的所得代谢物提取物。
实施例107—细菌代谢物提取物的制备
将大肠杆菌OP50（E.coli OP50）在37℃和220rpm下过夜培养至于在2L的溶原性肉汤(LB)中OD为1.2。将细菌肉汤在4750rpm下旋转20分钟。然后将上清液冻干，用研钵和杵碾碎，并用150mL95%乙醇提取（2次）。提取物通过烧结坩埚过滤并在分析之前在真空中浓缩。
实施例108—质谱分析
将如上所述制备的代谢物提取物再悬浮于1.5mL甲醇中，离心，并将30μL的此样品注入HPLC–MS用于分析。采用10:1分流（split）使用与Quattro II质谱仪连接的装有Agilent Eclipse XDB–C18柱（9.4x250mm,5μm粒径）的Agilent1100系列HPLC系统进行HPLC–MS分析。对于短链蛔苷，采用0.1%含水的乙酸–乙腈进行梯度洗脱。梯度洗脱从5%乙腈开始持续5分钟，然后在32分钟内增加至100%乙腈。对于长链蛔苷，采用乙腈–异丙醇进行梯度洗脱，从5%在乙腈中的异丙醇开始持续5分钟；然后在32分钟内将异丙醇增加至75%。分别采用3.5kV的毛细管电压和–40V和+20V的锥电压（cone voltage）以负离子和阳离子模式通过HPLC–ESI–MS对样品进行分析。长链蛔苷的元素成分采用Xevo G2QTof通过高分辨率MS和HPLC–MS进行分析。
用如上所述的用于短链蛔苷的水（0.1%乙酸）–乙腈梯度洗脱通过HPLC–MS（采用Quattro II）对EPEA和AEA(14)定量。EPEA和AEA的保留时间通过注射可信的标准品（分别得自Enzo LifeSciences和Cayman Chemicals）确定。野型和突变株中相对的内源性大麻素含量通过(M–H)–或(M+Cl)–相应的离子痕迹的LC–MS信号的积分来定量。所有的积分值通过液体培养物沉淀（pellet）的质量标准化。在附图123中所报道的所有定量数据由至少两次独立的生物学重复获得。
实施例109—NMR光谱分析
NMR样品通过将10–20mg份代谢物提取物(参见实施例107)溶解于0.6ml的CD3OD中来制备。采用Varian INOVA600MHz核磁共振仪分析样品。非梯度洗脱相–循环的dqfCOSY光谱采用下述参数获得：0.8s采集时间，600复合增量，每个增量16次扫描。为了用mvaDANS处理，将光谱零填满（zero–filled）至2048×1024数据点，在傅里叶转换之前在两个维度中应用正弦正方形的（sine–square–shaped）窗口函数，并在转入MATLAB之前将光谱转变成幅度（magnitude）模式。
对于相敏模式中的详细分析，将dqfCOSY光谱零填满至8192×4096数据点，并在傅里叶转换之前在两个维度中应用余弦钟形的窗口函数。daf–22–增量调节的代谢产物的纯化级分的梯度洗脱和非梯度洗脱HSQCAD和HMBC光谱采用8–32次扫描、0.25s采集时间、和256–500复合增量获得。核磁共振光谱采用Bruker TopSpin,VarianVNMR,MestreLabs’MestReC，和MNova软件包处理。
实施例110—主要的daf–22–增量调节的代谢产物的分离
向8g的Celite(用乙酸乙酯预先洗涤)中加入自16100–ml液体培养物的daf–22代谢物提取物的溶液。蒸发溶剂之后，将物料干装到25gRf空定量装载器中。采用Teledyne ISCO系统在Rf GOLD40g HP硅柱上用正相二氯甲烷–甲醇溶剂系统进行分级，从6分钟的100%二氯甲烷开始，之后线性增加甲醇含量直至在24分钟时增加至10%，之后再线性增加甲醇含量直至在40分钟时增加至40%，之后再线性增加甲醇含量直至在45分钟时增加至95%，然后继续至48分钟。这产生70个级分（各～20mL），将它们单独在真空中蒸干并通过核磁共振光谱（1H NMR，dqfCOSY）和HPLC–MS分析。在级分35–45中检测到经mvaDANS鉴定为代表daf–22–增量调节的代谢产物的1H NMR–光谱信号。采用与实施例90中描述的长链蛔苷的HPLC–MS分析相同的HPLC法通过制备型HPLC实现主要的daf–22–增量调节的代谢产物的分离。分离的级分进一步通过dqfCOSY、HSQC、和HMBC以及采用Xevo G2QTof将高分辨率的HPLC–MS来表征。
实施例111—统计分析
采用以Welch氏校正的未配对Student氏t检验比较野型和突变株中EPEA和AEA的相对丰度。＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001。参见附图123D和附图124。
实施例112—mvaDANS分析
为了通过mvaDANS鉴定daf–22–增量调节的代谢产物，获得从两种不同的daf–22等位基因(m130，ok693)和野型秀丽隐杆线虫（C.elegans）得到的代谢组提取物的dqfCOSY光谱(附图125、126、和127)。从四次独立的生物学重复中得到的dqfCOSY光谱采用Matlab中的mvaDANS算法以幅度模式处理，其引入了动态面元（dynamicbinning）和多变量模式识别分析（附图128）。自动交叉峰鉴别和面元（binning）将dqfCOSY光谱转化为一组交叉峰积分，采用概率系数归一化（Probabilistic Quotient Normalization）将其对稀释液进行修正（Dieterle等，Anal.Chem.78:4281(2006)，在此全文引入作为参考），均值中心化、并规模至单位方差。然后将该本积分（bin integrals）的矩阵进行统计分析包括双向分级群聚、主成分分析（PCA）（附图125A）（Wold等，Chemometr.Intell.Lab.Syst.2:37(1987)，在此全文引入作为参考）、最小偏二乘判别分析（PLS–DA）（附图129）（de Jong,Chemometr.Intell.Lab.Syst.18:251(1993)，在此全文引入作为参考）。将从PCA载量和PLS–DA预测因子得到的系数反投影到dqfCOSY光谱上使得能够检测代表在三个秀丽隐杆线虫（C.elegans）菌株中不同表达的化合物的NMR光谱信号（附图130和131）。
mvaDANS的自动交叉峰鉴别和积分
从代表性的伪光谱—本文中—检测到光谱段，一种由沿叠加光谱（spectral stack）第三维度的平均值计算的平均光谱。为了鉴别与交叉峰区域相对应的伪光谱段，采用AUTOPSY法计算局部噪声表面（Koradi,J.Magnetic Res.135:288(1998)，在此全文引入作为参考）（方程式1–4）。AUTOPSY计算基础噪声的逐点估算如下。
d x = min ( 1 n &Sigma; i = 1 n ( &delta; xi - &delta; x &OverBar; ) 2 ) ( 1 ) d y = min ( 1 n &Sigma; i = 1 n ( &delta; iy - &delta; y &OverBar; ) 2 ) ( 2 ) b = min ( [ d x , d y ] ) ( 3 ) p xy = ( d x 2 - b 2 ) 2 + ( d y 2 - b 2 ) 2 + b 2 ( 4 )
本文中，dx和dy分别为2DNMR光谱的直接和间接维度上的每个部分x和的y噪声值。通过分割该部分成16个尺寸为直接维度n=F1/16和间接维度n=F2/16的区域计算给定的片δx或δy的噪声值。那么微量的噪声为区域的标准差，最小标准差如方程式1和2中所示。光谱中每个点p通过两个部分x和y分割，其噪声值为dx和dy。在pxy点的噪声将部分x中的噪声与部分y中的噪声结合，其中具有方程式3和4中的基线噪声值b。该计算噪声的方法非常适合于2D NMR数据的噪声结构，其特征为垂直的噪声如T1和水噪声。
一旦计算了噪声表面pxy，可通过鉴定某种多噪声表面上的局部最大值来检测峰。尽管精确的阈值可能变化，但5–10的值检测大多数交叉峰。10的阈值用于本文中使用的高强度秀丽隐杆线虫（C.elegans）样品。然后将段定义为邻近于所检测的峰的区域。
将初始光谱段确认为同核光谱的1H维度中0.04ppm内的区域。在多重性的情况下，将局部最大值集合变成单一的初始段。然后以独一无二的整数值标记各段，迭代的最小和最大过滤扩展这些初始段。Min/max过滤具有扩大段的作用直至它们遇到另一光谱段或直至它们达到1H的大约0.2ppm的最大频率范围。此程序以附近的共振限制的非矩形界限创建光谱段还避免了交叉峰线形的附近的截弃。然后将这些段采用梯形数值积分法进行积分。
采用光谱面元的模式识别
所检测的光谱段的积分将全分辨率2D光谱(ω1,ω2,N)的2DNMR数据集转化为特征(N,P)二维矩阵，其中P为所检测段数。然后将所得面元强度的矩阵采用概率系数归一化（Dieterle等，Anal.Chem.78:4281(2006)，在此全文引入作为参考）标准化并将方差采用单变量缩放（univariate scaling）稳定。这些方法，有时候称为逐列和逐行标准化，在代谢产物学数据处理中经常应用解释样品之间的稀释或光谱之间的接收器增益差别和平衡高强度和低强度信号的差异。然后直接应用模式识别法PCA和PLS–DA转化面元矩阵。模式识别的结果为，对于模型中的各组分，一组显示样品相互间相似性的N得分和表示各面元对样品之间分离的贡献的P系数矢量。
峰积分的矩阵亦表示为log2–倍–变化对中间值热图。采用UPGMA分级的聚类算法对热图聚合（Gordon,J.Royal Stat.Soc.Ser.A Stat.Soc.150:119(1987)，在此全文引入作为参考）。将面元基质描述为集聚的热图允许迅速鉴定多组交叉峰，它们的差别的水平区分实验级别。另外，采用交叉峰区域的聚合指数对PLS–DA预测因子和PCA载量排序。这种表示法显示通过模式识别鉴定的数据的特征。
为了解析模型和鉴定重要的代谢产物，通过采用光谱段将系数反投影到全分辨率光谱上。对于全分辨率矩阵中的所有段，段内的数据点用从那个段的面元提取物的模式识别中得到的系数值置换以产生全分辨率载量矩阵。对于稳定数据，加载系数与信号强度无关，因此峰形不可见。为了产生像2D核磁共振光谱的全分辨率反投影的载量，然后将该矩阵逐点乘以沿2D NMR叠加的第三维度的标准差。为了显现载量，将外廓线通过反投影载量定义，这些线的颜色通过系数本身定义。在将mvaDANS算法应用于幅度模式中处理过的dqfCOSY数据以减少局部最小值/最大值的数的同时，将通过mvaDANS鉴定的兴趣区域与更大结构细部的原始相敏数据进行交叉对照。mvaDANS与其它1H–1H NMR实验包括TOCSY、COSY、和NOESY本来一致，且与仅仅几个异核实验包括1H–13C HSQC的参数变化一致。
确认和光谱的解释
为了分析daf–22特异性的交叉峰，将反投影光谱用原始daf–22dqfCOSY光谱覆盖，以相敏模式处理。自旋系统包括化学位移和偶合常数值通过对原始相敏光谱的人工解释获得。利用可得到的数据库（Reaxys,Beilstein,Scifinder,HMDB,NMRshiftDB,BMRB），发展了关于代表已鉴定的自旋系统的部分结构的假设。使用daf–22外代谢组的部分分级产生已鉴定的代谢产物的富集样品用于通过HMQC和HMBC的进一步的NMR–光谱分析（参见实施例110）。
来自PCA分析的反投影用于鉴定daf–22特异性交叉峰。PLS–DA分析用于证实野型和daf–22代谢组的基于统计学的分离（附图129）。来自PLS–DA预测因子的反投影（附图131）很大程度上与来自PC1载量的反投影匹配（附图130）。凸出地存在于大肠杆菌OP–50代谢物提取物的dqfCOSY光谱之中的峰（附图132）被排除在进一步的分析外。
实施例113—daf–22突变体–特异性的极长链蛔苷
daf–22突变体–特异性的VLCAs24R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–2–甲基–3–氧代二十五烷酸乙醇酰胺(7)，(26R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–3–氧代–二十七烷酸乙醇酰胺(8)，24R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–2–甲基–2E–十五烯酸乙醇酰胺(9)，24R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–2–甲基–2E–十五烯酸(10)，和(24R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–2–甲基–二十五烷酸(11)(参见附图123B)采用实施例105–112中描述的方法进行鉴定。它们的结构和光谱数据如下面的表17所示。
表17.VLCAs7–11的光谱数据
＊(CDCl3,600MHz)
＊＊(CDCl3,151MHz)
实施例114—daf–22突变体–特异性的极长链蛔苷(ω–1)–O–蛔糖基2–酮(12)
采用实施例105–112中描述的方法鉴定，一系列的daf–22突变体–特异性的VLCA(ω–1)–O–蛔糖基2–酮(12)(参见附图123C)，包括(23R)–(3′R,5′R–二羟基–6′S–甲基–(2H)–四氢吡喃–2′–基氧基)–二十四烷–2–酮(12a)。12a的结构和光谱数据如下面的表18所示。
表18.VLCA12a的光谱数据
一系列VLCA(ω–1)–O–蛔糖基2–酮(12)的结构和HPLC/HR–MS(ESI+)数据如下面的表19所示。
表19.(ω–1)–蛔糖基–2–氧代烷烃(12)的HPLC/HR–MS(ESI+)数据
实施例105–114的讨论
秀丽隐杆线虫（C.elegans）代谢组的分析显示了一族结构不同的小分子，蛔苷，作为保守的过氧化物酶体β–氧化的产物(von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817(2012);Butcher等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:1875(2009);Pungaliya等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:7708(2009)，各自在此全文引入作为参考)(参见附图133和134)。蛔苷形成了模块化化合物库，将由脂质、碳水化合物、和氨基酸代谢的结构单元集成为调节秀丽隐杆线虫（C.elegans）生物学的关键因素的小分子信号(Butcher等，Nat.Chem.Biol.3:420(2007);Srinivasan等，Nature454:1115(2008);Srinivasan等，PLoS Biol.10:e1001237(2012);Macosko等，Nature458:1171(2009)，各自在此全文引入作为参考)。先前的工作运用基于质谱的比较代谢产物学以表征蛔苷的生物合成中三个酶酰基辅酶A氧化酶ACOX–1、烯酰辅酶A水合酶MAOC–1、和3–羟酰基–辅酶A脱氢酶DHS–28的功能(von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817(2012)，其在此全文引入作为参考)(参见附图134)。然而，过氧化物酶体β–氧化级联中的第四种酶（其由daf–22编码，一种哺乳动物3–氧代酰基辅酶A的亲近同系物）的预测作用，不能得到证实，因为没有发现特征性的分路代谢产物。鉴于daf–22在提出的过氧化物酶体β–氧化途径中的中心作用，假设其它还未鉴定的代谢产物在daf–22突变体中聚集，其可能帮助证实该酶的生物化学功能。
因此，采用基于不偏核磁共振光谱的代谢产物学对daf–22代谢组进行再研究。先前，已经采用人工比较野型和daf–22代谢组的2D核磁共振光谱以鉴定蛔苷族信号分子的其它成员(Pungaliya等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:7708(2009);Srinivasan等，PLoS Biol.10:e1001237(2012);Robinette等，Acc.Chem.Res.45:288(2012)，各自在此全文引入作为参考)。这些研究突出显示应用2D核磁共振光谱用于比较代谢产物学，而且证实了需要能对不同突变体的系列光谱进行统计分析的计算工具。为此，发展了通过2D核磁共振光谱的多变量差示分析（mvaDANS），其能够对多组2D核磁共振光谱进行自动化处理和比较计算分析。
mvaDANS建立在先前的努力上通过结合动态信号检测和模式识别应用2D NMR用于代谢产物学分析(Hedenstrom等，Mol.Plant2:933(2009);Hedenstrom等，Chemometr.Intell.Lab.92:110(2008);Robinette等，Anal.Chem.83:1649(2011);Robinette等，Anal.Chem.80:3606(2008);Zhang等，Anal.Chem.79:7748(2007);Zhang&Bruschweiler,Angew.Chem.Int.Ed.46:2639(2007);Zhang等，Anal.Chem.80:7549(2008)，各自在此全文引入作为参考)(参见实施例112)。附图125总结了使用该方法用于鉴定在daf–22突变体中增量调节因而可代表分路代谢产物或生物合成中间物的化合物。获得从两种不同的daf–22等位基因(m130，ok693)和野型秀丽隐杆线虫（C.elegans）中得到的代谢组提取物的dqfCOSY光谱，包括四次独立的生物学重复(附图125、126、和127)。自动交叉峰鉴定和面元（附图128）得到dqfCOSY光谱用于通过主成分分析（“PCA”）的统计分析(Wold等，Chemometr.Intell.Lab.2:37(1987)，其在此全文引入作为参考)(参见实施例112)，其聚合了基因型的数据(附图125A)。将PCA载量的系数反投影到dqfCOSY光谱上，其显示大量的相对于野型在daf–22突变体中增量调节或减量调节的交叉峰（附图125A、130、和135）。
对于此研究，分析被仅限于在由两个daf–22等位基因得到的光谱中均有强烈特征但在野型中非常弱或探测不到的交叉峰。此外，排除亦存在于大肠杆菌食物源之中的交叉峰。对剩余的daf–22–强增量调节的交叉峰和来自相应HMBC光谱的输入进行人工分析，提出了一系列的局部结构，包括甲基酮、α–甲基分支脂肪酸和相应的乙醇酰胺、以及β–脂肪酮酸衍生物（附图125B）。鉴于所提出的daf–22在蛔苷的生物合成中的作用（附图134），假定这些结构特征属于积累的分路代谢产物。随后由daf–22–特定的NMR信号引导的daf–22代谢组的分级导致六种不同的极长链蛔苷（VLCA）的分离，这解释了所有预测的结构特征（附图123；对于全光谱数据参见实施例113–114）。最突出的是一系列的(ω–1)–O–蛔糖基2–酮(12)以及(ω–1)–O–蛔糖基3–脂肪酮酸乙醇酰胺，其包括2–甲基二十五烷酸衍生物7和直链二十七烷酸衍生物8。化合物7和8伴随有较少量的相应的双–norhomologues。类似地，2–甲基二十五–2–烯酸乙醇酰胺9和两个脂肪酸10和11伴随有双–norhomologues。相反，(ω–1)–O–蛔糖基2–酮(12)变化范围大得多和优选地不是奇数(附图123C)。HPLC–MS分析证实在野型样品中不存在这些组分(附图123A)。
在daf–22特异性的VLCAs中引入乙醇胺是意想不到的并表明过氧化物酶体β–氧化和基于乙醇酰胺的信号途径之间的相互作用的可能性。最近，N–酰基–乙醇胺（NAEs）被确认为是秀丽隐杆线虫（C.elegans）中的内源性大麻素样信号分子且与饮食限制–依赖性寿命调节有联系。(Lucanic等，Nature473:226(2010)，在此全文引入作为参考)。对daf–22突变体中VLCAs的上调是否影响NAE水平进行评价。发现NAE的产生，包括活性最强的内源性大麻素、eicosapentaenoyl乙醇酰胺(13,EPEA)、和乙醇酰胺(AEA)，在两个daf–22等位基因中被显著地下调（附图123D和124），暗示从NAEs到VLCAs乙醇胺利用的转移。类似地，在maoc–1和dhs–28的突变体中发现EPEA和AEA产生的大大减少（附图123D和124），它们直接作用于daf–22的上游（附图134）。acox–1突变体中的EPEA–水平没有明显受影响和AEA水平只略微地降低，符合acox–1变异对过氧化物酶体β–氧化的作用弱很多（von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817(2012)，在此全文引入作为参考）。EPEA和AEA的产生没有被通过加入合成的蛔苷使daf–22蠕虫的生长恢复（附图123D和124），表明所观察到的过氧化物酶体β–氧化突变体中NAE水平的降低不是缺乏蛔苷信息素的间接作用。这些发现表明在秀丽隐杆线虫（C.elegans）中过氧化物酶体β–氧化的特异性缺陷导致内源性大麻素池耗尽（附图123E）。在健康动物中过氧化物酶体β–氧化基因的表达降低的条件是否触发内源性大麻素下调是未知的，其中内源性大麻素能充当连接给饮食限制途径发信号的脂肪代谢和蛔苷的调节机制。短链蛔苷的乙醇酰胺充当寄生线虫物种中的信息素（Noguez等，ACS Chem.Biol.7:961(2012)，在此全文引入作为参考），表明过氧化物酶体β–氧化和乙醇酰胺代谢的相互作用亦存在于其它线虫属中。
认为支链脂肪酸如植烷酸的链缩短特别需要哺乳动物daf–22的同系物(Wanders&Waterham,Annu.Rev.Biochem.75:295(2006);Wanders,Mol.Genet.Metab.83:16(2004)，各自在此全文引入作为参考)。然而，在daf–22突变体–特异性的VLCAs中直链和甲基–分支的衍生物的共同存在与支链和直链脂肪酸两者的处理均有关。daf–22突变体–特异性的VLCAs的链长表明23–至27–碳脂肪酸可能代表秀丽隐杆线虫（C.elegans）脂肪酸生物发生的端点，其中最后的链–延长步骤引入丙二酸酯或丙二酸二甲酯。值得注意的是，本发明的代谢产物学分析没有提供在这些脂肪酸衍生物的生物合成早期引入丙二酸二甲酯的证据。秀丽隐杆线虫（C.elegans）中daf–22–突变体上调的VLCAs的链长类似于人机能障碍中积累的极长链脂肪酸的那些情形，其中人机能障碍涉及过氧化物酶体β–氧化方面的缺陷如Zellweger综合症(Wanders&Waterham,Annu.Rev.Biochem.75:295(2006);Wanders,Mol.Genet.Metab.83:16(2004)，各自在此全文引入作为参考)。不过，已知人脂肪酸生物合成在最后的形成α–甲基–分支变体的链–延长步骤中不是选择性地引入丙酸酯或丙二酸二甲酯。
中生物合成模型中(附图134和123E)，已鉴定的daf–22突变体–特异性的化合物似合理地代表由脂肪酸和β–酮酸辅酶A酯产生的分路代谢产物，其中α,β–不饱和和β–酮官能团由ACOX–1、MAOC–1、和DHS–28的上游作用产生。daf–22–上调的长链甲基酮可能由相应的β–脂肪酮酸衍生而来，其有脱羧的高度倾向。尽管在早期的研究中有记载（Butcher等，Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.106:1875(2009)，在此全文引入作为参考），没有通过核磁共振光谱或HPLC–MS发现本发明的代谢物提取物中β–脂肪酮酸的证据。daf–22–上调的蛔糖基–脂肪酸的奇数侧链长度与已知的过氧化物酶体β–氧化的最后产物短链蛔苷信息素的结构一致，其中大多数短链蛔苷信息素包括含3、5、7、或9个碳的侧链（附图133）（von Reuss等，J.Am.Chem.Soc.134:1817(2012)，在此全文引入作为参考）。这些奇数侧链进一步表明蛔苷侧链生物合成从三–碳（丙二酸二甲酯）模板开始或秀丽隐杆线虫（C.elegans）延长了从食物获得的奇数脂肪酸。
总而言之，daf–22和野型代谢组的mvaDANS–型比较显示长链蛔糖基乙醇酰胺为daf–22突变体蠕虫中的一类意想不到的分路代谢产物。在已鉴定的长链蛔苷中的β–酮衍生物和甲基酮的丰度支持daf–22充当蛔苷信息素生物合成中的硫解酶，这曾经因为与哺乳动物过氧化物酶体的同源性遭到怀疑。
非靶向比较代谢产物学将形成一种再研究后生动物生物化学的重要工具。mvaDANS扩大了通过引入自动化交叉峰鉴定和积分进行2D NMR–型代谢产物学分析的范围（Wishart,Brief.Bioinform.8(5):279–93(2007);Nicholson et al.,Nature Rev.Drug Discov.1:153(2002);Gartland et al.,Mol.Pharmacol.39:629(1991)，各自在此全文引入作为参考）。鉴于模式识别技术分析先前已经应用于2D核磁共振光谱，这些方法依赖人工峰选择（Van等，J.Proteome Res.7:630(2008)，在此全文引入作为参考）、参数方法（Chylla等，Anal.Chem.83:4871(2011)，在此全文引入作为参考）或所用的光谱展开/再折叠技术（Robinette等，Anal.Chem.83:1649(2011);Hedenstrom等，Chemometr.Intell.Lab.92:110(2008)，各自在此全文引入作为参考）。人们期望统计光谱学的发展将继续加速生物源小分子的结构和功能的表征。
尽管本文中已经详细描述了优选的实施方案，在不背离本发明的精神的情况下进行各种改变、增加、置换等将对相关领域的技术人员是显而易见的，因此这些要考虑在随后权利要求中定义的本发明范围之内。

Claims (50)

1.一种分离的式I化合物：
其中：
R1为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R1′为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R2为下式的部分
其中：
每个R1独立地为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
n1，n2，和n3各自独立地为0至30的整数；
n4为1至30的整数；且
n1的总和、每个n2、和每个n3为1至30；
R3和R4各自独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R5连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
每个R5独立地为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
其中满足下列条件的中至少一个：
(i)R1独立地为–C(R′)3，–OR，–N(R)2，卤素，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基，且每个R′独立地为卤素或链烯基；且
R1′独立地为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；
(ii)R2为
其中：
每个独立地为单键或双键；
q1、q2、和q3各自独立地为1至26的整数；
q4和q5各自独立地为0至26的整数；
q1、q2、q3、q4和q5的总和小于或等于28；且
q4和q5的总和大于等于2；
(iii)R5为H，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，或核苷；
(iv)R5为与式I的另一单元的R3或R4连接的直连键，形成含有至少两个式I的单元的化合物；
(v)R3和R4各自独立地为–CR6R7R8，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或–(CO)R8其中R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
(vi)化合物为式I″化合物：
条件是该化合物不是
2.根据权利要求1的化合物，其中R1独立地为–C(R′)3，–OR，–N(R)2，卤素，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基，且每个R′独立地为卤素或链烯基；且R1′独立地为不存在，H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基。
3.根据权利要求2的化合物，其中R1为链烯基且R1′不存在或为H。
4.根据权利要求1的化合物，其中R2为其中每个独立地为单键或双键；q1、q2、和q3各自独立地为1至26的整数；q4和q5各自独立地为0至26的整数；q1、q2、q3、q4、和q5的总和小于或等于28；且q4和q5的总和大于或等于2。
5.根据权利要求4的化合物，其中化合物为式ID化合物：
6.根据权利要求4的化合物，其中化合物为式ID′化合物：
7.根据权利要求6的化合物，其中化合物为：
8.根据权利要求1的化合物，其中R5为H，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，或核苷。
9.根据权利要求8的化合物，其中R5为–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NR6R7或–CR6R7C(O)NHR8。
10.根据权利要求9的化合物，其中R5为–OCHR6R7。
11.根据权利要求9的化合物，其中R6和R7各自独立地为烷基或芳基，其中烷基或芳基任选地被独立地选自–OR8、–C(O)R8、和–NHC(O)R8的一个或多个取代基取代。
12.根据权利要求8的化合物，其中R8为H、–OH、–NH2、烷基、嘌呤、或嘧啶，其中烷基、嘌呤、或嘧啶任选地被独立地选自–COOH和含5或6个碳原子的单糖中的一个或多个取代基取代。
13.根据权利要求8的化合物，其中R5选自：
14.根据权利要求8的化合物，其中化合物为下式的化合物：
其中m1为1至3的整数。
15.根据权利要求8的化合物，其中化合物为下式的化合物：
其中R1为–NH3或H，且m2为20至22的整数。
16.根据权利要求1的化合物，其中R5为与式I另一单元的R3或R4连接的直连键，形成含有至少两个式I的单元的化合物。
17.根据权利要求16的化合物，其中每个R1独立地为H或烷基。
18.根据权利要求16的化合物，其中化合物为式IE、IE′、IF、或IF′化合物：
其中：
R2a和R2b各自独立地为下式的部分
每个R3和R4独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或含5或6个碳原子的单糖；且
R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或含5或6个碳原子的单糖。
19.根据权利要求18的化合物，其中化合物为式IE或IE′化合物。
20.根据权利要求18的化合物，其中化合物为式IF或IF′化合物。
21.根据权利要求18的化合物，其中每个R1独立地为H或烷基。
22.根据权利要求21的化合物，其中R1为–CH3。
23.根据权利要求18的化合物，其中R2a和R2b之一为–(CH2)nC(O)–。
24.根据权利要求18的化合物，其中R2a和R2b均为–(CH2)nC(O)–。
25.根据权利要求18的化合物，其中R3为H。
26.根据权利要求18的化合物，其中每个R4独立地为H或–C(O)R8。
27.根据权利要求26的化合物，其中R8为任选地被–NHC(O)R9取代的烷基。
28.根据权利要求27的化合物，其中R9为H或–NH2。
29.根据权利要求18的化合物，其中化合物选自：
30.根据权利要求1的化合物，其中R3和R4各自独立地为–CR6R7R8，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，或–(CO)R8其中R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖。
31.根据权利要求30的化合物，其中R3和R4各自为–C(O)R8。
32.根据权利要求31的化合物，其中R8为被–NHC(O)NH2或含5或6个碳原子的单糖二者之一取代的烷基。
33.根据权利要求32的化合物，其中R8为被己糖取代的烷基。
34.根据权利要求33的化合物，其中己糖为葡基。
35.根据权利要求30的化合物，其中R8为–[CH2]n4NHC(O)R9或–[CH2]n4C(O)(NH)R9。
36.根据权利要求35的化合物，其中R9为被选自–OH、苯基、酚、和羧基苯基的一个或多个取代基取代的烷基或芳基。
37.根据权利要求30的化合物，其中R3和R4中至少一个选自：
38.根据权利要求1的化合物，其中化合物为式I″化合物。
39.根据权利要求38的化合物，其中化合物为式I″化合物：
40.根据权利要求38的化合物，其中R1为H或烷基；且R1′不存在或为H。
41.根据权利要求40的化合物，其中R1为–CH3。
42.根据权利要求38的化合物，其中R2为–(CH2)nC(O)R5。
43.根据权利要求38的化合物，其中R3为H。
44.根据权利要求38的化合物，其中R4为H。
45.根据权利要求38的化合物，其中R5为–OH或–OCHR6R7。
46.根据权利要求45的化合物，其中R6和R7各自独立地为烷基或芳基，其中烷基或芳基任选地被独立地选自–OR8、–C(O)R8、和–NHC(O)R8的一个或多个取代基取代。
47.根据权利要求45的化合物，其中R8存在且为H、–OH、–NH2、烷基、嘌呤、或嘧啶，其中烷基、嘌呤、或嘧啶任选地被独立地选自–COOH和含5或6个碳原子的单糖中的一个或多个取代基取代。
48.根据权利要求38的化合物，其中化合物选自：
49.一种分离的式I化合物：
其中：
R1为H，–C(R)3,–OR,–N(R)2,卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R1′为不存在，H，–C(R)3,–OR,–N(R)2,卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R2为下式的部分
其中：
每个R1独立地为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，或卤代烯基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R5为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
n1、n2、和n3各自独立地为0至30的整数；
n4为1至30的整数；且
n1的总和、每个n2、和每个n3为1至30；
R3和R4各自独立地为H，–CR6R7R8，–C(O)R8，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R5连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
每个R5独立地为H，–OH，–OR6，–OCR6R7R8，–CR6R7R8，–NH2，–NHR6，–NR6R7，–CR6R7C(O)NHR8，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，芳基烷基，杂环基，环烷基，环烯基，酰基，氨基酸，核苷，含5或6个碳原子的单糖，或与式I另一单元的R3或R4连接的直连键；
其中：
R6和R7各自独立地为H，–CR3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，或环烯基，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、或环烯基任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–OR8，–C(O)R8，–NHC(O)R8，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；且
R8为H，–C(R)3，–[C(R)2]n4NHC(O)R9，–[C(R)2]n4C(O)(NH)R9，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR9，–C(O)R9，–NHC(O)R9，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，和含5或6个碳原子的单糖；
其中：
每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；
R9为H，–C(R)3，–OR，–N(R)2，卤素，烷基，卤代烷基，链烯基，卤代烯基，芳基，杂芳基，杂环基，环烷基，环烯基，嘌呤，嘧啶，或含5或6个碳原子的单糖，其中烷基、链烯基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、嘌呤、嘧啶、或单糖任选地被独立地选自下列的一个或多个取代基取代：–C(R)3，–OR，–C(O)R，卤素，烷基，卤代烷基，芳基，杂芳基，杂环基，和环烷基；其中每个R独立地为H，卤素，烷基，或链烯基；且
n4为1至30的整数；
条件是化合物不是ascr#1，ascr#2，ascr#3，ascr#4，ascr#5，ascr#6.1，ascr#6.2，ascr#7，ascr#8，ascr#12，ascr#19，ascr#21，ascr#23，ascr#25，bhas#24，bhas#26，bhas#28，bhas#30，或icas#9。
50.一种分离的化合物，其包含：
至少一个核碱基，
至少一个脂肪酸，
至少一个氨基酸，和
至少一个糖；
其中至少一个核碱基、至少一个脂肪酸、至少一个氨基酸、和至少一个糖通过共价键连接；且
其中化合物的分子量低于约2,000g/mol。
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