KR20140068949A - 선충 방제를 위한 소형 분자 화합물 - Google Patents

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스테판 하인리히 폰 뢰스
안드레아 초애
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보이스 톰슨 인스터튜트 포 플랜트 리서치
캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은 선충 신호전달에서 수반되는 화합물에 관한 것이다.

Description

선충 방제를 위한 소형 분자 화합물 {SMALL MOLECULE COMPOUNDS FOR THE CONTROL OF NEMATODES}
본 출원은 미국 특허 가출원 일련 번호 61/521,295 (2011년 8월 8일자 출원), 및 미국 특허 가출원 일련 번호 61/620,348 (2012년 4월 4일자 출원)을 우선권으로 청구하고, 이들 각각은 본원에 전문이 참고로 포함된다.
본 발명은 미국 국립 보건원이 수여하는 허가 번호 GM088290, GM085285, 및 T32GM008500 하에 미국 정부의 지지로 이루어졌다. 미국 정부는 본 출원에 대한 특정한 권리가 있다.
발명의 분야
본 발명은 선충 신호전달에서 수반되는 소형 분자 화합물에 관한 것이다.
발명의 배경
종의 개체들 간의 통신은 화학적, 기계적, 청각적 또는 시각적 신호가 포함되는 다수의 상이한 감각성 입력 정보에 의존한다 (문헌 [EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS (25th anniv. ed. 2000)]). 화학적 신호전달은 생물간(interorganismal) 통신의 가장 오래된 형태일 것이고 (문헌 [EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS (25th anniv. ed. 2000)]; [Wyatt, Nature 457:262-63 (2009)]), 화학적 신호 및 이러한 신호가 매개하는 거동의 분석은 내부-특이적 및 상호-특이적 상호작용의 생태학적 및 진화적 역학을 이해하는데 매우 중요하다.
선충은 개별적인 계수에 의하면 세계에서 가장 풍부한 동물 중 하나이다 (문헌 [SIEVERT LORENZEN: THE PHYLOGENETIC SYSTEMATICS OF FREELIVING NEMATODES (The Ray Society, London, 1994)]). 이는 유황 침전물, 심해 도랑, 포유동물, 곤충, 식물, 극지방 얼음, 및 다수의 기타 서식지에 서식하여, 이를 지구 상의 가장 성공적인 동물 군 중 하나로 만든다 (문헌 [Nussbaumer et al., Aquat. Microb. Ecol. 34:239-46 (2004)]; [ISTVAN ANDRASSY: EVOLUTION AS A BASIS FOR THE SYSTEMATIZATION OF NEMATODES (Budapest, 1976)]; [Tietjen, Deep-Sea Res. 36:1579-94 (1989)]; [Aben-Athar, Rev. Bras. Med. 2:89-94 (1951)]; [Lutz, Weitere Mittheilungen 3: 425-28 (1888)]; [Blaxter, Science 282:2041-46 (1998)]). 예컨대 뿌리, 박테리아, 모리, 한천, 및 장에서의 짝 찾기와 같은 다수의 선충 거동이 연구되었다 (문헌 [DONALD L. LEE: THE BIOLOGY OF NEMATODES (CRC Press, London, 2002)]). 선충 페로몬 시스템에 관하여 알려진 것이 거의 없다. 선충 페로몬을 확인하려는 다수의 시도가 있었지만 (문헌 [DONALD L. LEE: THE BIOLOGY OF NEMATODES (CRC Press, London, 2002)]), 매우 소수의 종에서만 확인이 성공적이었다 (문헌 [Jaffe et al., J. Chem. Ecol. 15:2031-43 (1989)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Jeong, et al., Nature 433:541-45 (2005)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007)]; [Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009)]).
자유-생활(free-living) 선충인 씨. 엘레간스(C. elegans)가 먹이 찾기, 집단 밀도 감지, 짝짓기, 및 응집과 같은 사회적 거동에 대한 모델 시스템으로서 광범위하게 사용된다 (문헌 [de Bono & Maricq, Annu. Rev. Neurosci. 28:451-501 (2005)]). 곤충병원성 선충 (EPN), 예컨대 헤테로랍디티스(Heterorhabditis) 종 및 스테이네르네마(Steinernema) 종은 공생 박테리아의 도움으로 자신의 숙주를 사망시키고 소비하는 절대적 곤충 기생충이다 (문헌 [Kaya & Gaugler, Annu. Rev. Entomol. 38:181-206 (1993)]). 씨. 엘레간스는 식물 물질을 분해하는데서 전형적으로 발견된다 (문헌 [Barriere & Felix, Curr. Biol. 15:1176-84 (2005)]). 이는 표준 실험실 조건 하에 3.5일 이내에 자신의 생활 주기를 완료한다. 높은 온도, 높은 밀도, 또는 낮은 먹이 이용가능성과 같이, 조건이 정상적인 성장에 유리하지 않으면, 이는 다우어(dauer) 유충 (별법적인 제3 유충)을 형성한다. 이러한 특수한 생활 단계 (먹이를 먹지 않고, 스트레스가 많은 조건에 저항성임 (문헌 [Golden & Riddle, Dev. Biol. 102:368-78 (1984)]; [Golden & Riddle, Science 218:578-80 (1982)]; [Golden & Riddle, PNAS 81:819-23 (1984)]))는 정상적인 성장 및 발달에 불리한 조건에서 생존하도록 균등하게 개조된 곤충병원성 선충의 IJ 및 식물 기생충성 뿌리혹 선충 (멜로이도기네(Meloidogyne) 종)의 제2단계 애벌레 (J2)와 유사하다 (문헌 [PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY (WormBook, ed. The C. elegans Research Community, 2006)]). 먹이 자원의 고갈 시 또는 과밀된 경우에, 곤충병원성 선충의 감염성 애벌레(infectious juvenile) (IJ) 및 자유-생활 선충인 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 다우어 유충은 분산 거동을 나타낸다 (문헌 [Golden & Riddle, Dev. Biol. 102:368-78 (1984)]; [Rolston et al., J. Nematol. 38:221-28 (2006)]; [Abebe et al., J. Exp. Biol. 213:3223-29 (2010)]).
씨. 엘레간스에 대해, 다우몬으로 칭해지는 페로몬에 의해 초기 유충 단계 (L1)가 다우어 단계로 진입하는 것이 조절된다 (문헌 [Jeong et al., Nature 433:541-45 (2005)]). 다우몬의 확인에 이어서, 다수의 관련된 화합물이 씨. 엘레간스에서 확인되었다 (문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Butcher et al., PNAS 105:14288-92 (2008)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009)]; [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134(3):1817-24 (2012)]). 이러한 화합물 모두는 일반적이지 않은 디데옥시당인 아스카릴로스가 있고, 집단적으로 아스카로시드(ascaroside)로 칭해진다.
씨. 엘레간스에서의 연구는 이러한 소형 분자 페로몬 패밀리가 성-특이적 유인, 반발, 응집, 후각 적응성, 및 다우어 (스트레스-저항성 생활 단계)로의 진입을 조절한다는 것을 나타냈고, 이는 아스카로시드가 광범위한 씨. 엘레간스 거동을 매개한다는 것을 총괄적으로 실연한다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [Yamada et al., Science 329:1647-50 (2010)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]). 어떠한 다른 동물 문에서도 아스카로시드가 발견되지 않았기 때문에 (문헌 [Bartley et al., J. Nat. Prod. 59(10):921-26 (1996)]), 아스카로시드는 다중 선충 종에 대한 중요한 신호를 조절할 수 있는 선충-특이적 화학 코드를 포함할 수 있다. 그러나, 씨. 엘레간스 생물학의 다수의 측면에 대한 이의 중요성에도 불구하고, 아스카로시드 구조, 생화학, 및 항상성, 뿐만 아니라 이들이 생산될 수 있는 정도 및/또는 다른 선충에 영향을 미치는 정도는 여전히 불완전하다.
본 발명은 이러한 결함 및 업계에서의 기타 결함을 극복하는 것에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명의 한 측면은 하기 화학식 I의 단리된 화합물이고:
[화학식 I]
Figure pct00001
[식 중,
R1은 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R1'은 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R2는 하기 화학식의 모이어티(moiety)이고:
Figure pct00002
{식 중
각각의 R1은 독립적으로 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이고
(여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
《여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다》>;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
n1, n2, 및 n3은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수이고;
n4는 1 내지 30의 정수이고;
n1, 각각의 n2, 및 각각의 n3의 합계는 1 내지 30이다};
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R5에 연결되는 결합이고
{여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다)};
각각의 R5는 독립적으로 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이다
{여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다)}];
단, 이러한 화합물이 ascr#1, ascr#2, ascr#3, ascr#4, ascr#5, ascr#6.1, ascr#6.2, ascr#7, ascr#8, ascr#12, ascr#19, ascr#21, ascr#23, ascr#25, bhas#24, bhas#26, bhas#28, bhas#30, 또는 icas#9이 아닌 화합물에 관한 것이다. 이러한 단리된 화합물은 하기 화학식 I' 및 화학식 I"의 것을 포함한다:
[화학식 I']
Figure pct00003
[화학식 I"]
Figure pct00004
본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당을 포함하는 단리된 화합물에 관한 것이다. 하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당은 공유 결합으로 연결된다. 이러한 화합물의 분자량은 약 2,000 g/mol 미만이다.
도 1A-E는 인돌 아스카로시드가 씨. 엘레간스 자웅동체 및 수컷을 유인한다는 것을 나타낸다. 도 1A는 벌레에서의 유인 거동을 측정하는데 사용된 생체검정법(bioassay)의 개략도이다. A 구역은 샘플 또는 대조군 용액이 적용된 영역이다. X는 검정된 벌레의 초기 위치를 나타낸다. 도 1B는 사분면 화학주성 검정법의 개략도이다. X는 세정된 벌레가 검정법을 시작할 때 놓인 지점을 나타낸다. 사분면 플레이트의 음영 영역은 화학물질을 함유하는 한천을 가리키는 한편, 백색 영역은 대조군 한천을 나타낸다. 각각의 사분면 내의 동물의 수를 30분 후에 계수하였고, 화학주성 지수를 컴퓨터로 계산하였다 (실시예 9 참조). 개략도에 대한 화학주성 지수는 0.84이다. 도 1C는 icas#1, icas#3, 및 icas#9가 양쪽 씨. 엘레간스 성별 모두에 대해 유인성이라는 것을 나타낸다. 3개의 화합물 모두 N2 자웅동체 및 him-5 수컷을 사용하여 1 pmol에서 검정하였다. 흰색 막대: 화합물이 없는 (용매 비히클) 대조군. 도 1D는 지점 유인 검정법에서의 N2 자웅동체 및 him-5 수컷에 대한 icas#3 반응의 용량 의존성의 차트이다 (*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001, 독립형(unpaired) t 테스트 + 웰치 보정(Welch's correction)). 도 1E는 사분면 화학주성 검정법에서의 N2 자웅동체에 대한 icas#3 유인의 용량 의존성의 그래프이다 (일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트(Dunnett's post-test), **p < 0.01).
도 2A-E는 N2 자웅동체에서의 icas#3에 대한 반응이 ASK 감각 뉴런 및 하류의 AIA 개재뉴런에 의해 매개된다는 것을 실연한다. 도 2A는 ASK 감각 뉴런의 다른 뉴런에 대한 연결성의 개략도이다. ASK의 1차 시냅스 출력은 AIA 개재뉴런이다. 도 2B는 icas#3에 대한 자웅동체의 유인이 ASK 감각 뉴런 및 AIA 개재뉴런에 의존적이라는 것을 나타낸다. RMG 개재뉴런의 절제는 icas#3에 대한 N2 또는 ncs -1::gfp 자웅동체의 유인에 영향을 미치지 않는다 (*p < 0.01, ***p < 0.0001, 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정). 도 2C는 낮은 벌레 밀도 (플레이트 당 벌레 20마리)에서의 N2 및 ASK-절제 자웅동체의 응집의 그래프이다. ASK-절제 벌레는 icas#3에 반응하여 응집하지 않는다. icas#3은 AIA 개재뉴런에서 G-CaMP 형광 신호를 유도한다 (도 2D). 유색 트레이스(trace)는 1 μM icas#3에 대한 노출 시 개별적인 동물의 AIA 뉴런에서의 형광 변화를 나타낸다. 흑색 트레이스는 완충제에 대한 노출 시의 개별적인 동물의 형광 변화를 나타낸다. 회색 음영은 icas#3의 존재를 가리키고, n = 동물 10마리이다. 도 2E는 완충제 또는 icas#3에 노출된 동물에서의 평균 AIA 형광 변화의 그래프이다 (**p < 0.01, 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정). 오차 막대는 평균의 표준 오차 (S.E.M)를 가리킨다.
도 3A-D는 군거성 및 고립성 야생형 자웅동체가 icas#3에 유인되지만, 비-인돌 아스카로시드에 대해서는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. npr -1( ad609 ) 돌연변이체 벌레와 대조적으로, 고립성 및 군거성 야생형 자웅동체는 지점 유인 검정법에서 생리학적 ascr#2,3,5 혼합물에 유인되지 않는다 (도 3A) (***p < 0.0001, 독립형 t 테스트 + 웰치 보정). 사분면 화학주성 검정법에서, ascr#2,3,5 블렌드에 또한 유인된 npr -1( ad609 ) 돌연변이체 벌레를 제외하고는, 테스트된 모든 균주로부터의 자웅동체가 1 pM icas#3에 유인되고, 비-인돌 아스카로시드들의 생리학적 혼합물 (10 nM ascr#2,3,5)에 의해서는 퇴치된다 (도 3B) (30분 후의 화학주성 (15분의 화학주성 지수에 대해서는 도 5C 참조)). 도 3C는 사분면 화학주성 검정법에서의 군거성 자웅동체에 대한 icas#3 유인의 용량-의존성의 그래프이다. 도 3B-C: *p < 0.05, **p < 0.01, 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트. 도 3D는 군거성 야생형 자웅동체 및 npr -1( ad609 ) 돌연변이체 벌레가 지점 유인 검정법에서 icas#3에 유인된다는 것을 나타낸다 (**p < 0.001, ***p < 0.0001, 독립형 t 테스트 + 웰치 보정).
도 4A-C는 신호전달 분자의 모듈형 언어에 대한 신생 모델에 관한 것이다. 도 4A는 icas#3 및 ascr#3이 N2 자웅동체에 대한 경쟁성 신호라는 것을 나타낸다. 120 fmol ascr#3 및 10 fmol icas#3의 혼합물 (조건 1)은 구역 A에 벌레를 유인하는 반면, 더 많은 양의 동일한 비의 혼합물 (조건 2; 12 pmol ascr#3 및 1 pmol icas#3)은 벌레를 구역 A로부터 방지하고, 대신 주변 (구역 B 및 C)으로 유인한다. 조건 2의 실험에서, 1마리의 벌레만이 처리 구역 A로 진입한 반면, 31마리의 벌레는 대조군 구역 A로 진입하였다 (***p < 0.0001, 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정). 도 4B는 비-인돌 아스카로시드들의 상승작용성 블렌드가 나노몰 내지 마이크로몰 농도에서 다우어를 유도하고 피코몰 내지 나노몰 농도에서 수컷 유인물질로서 기능하는 반면, 인돌 아스카로시드 icas#3 및 icas#9는 펨토몰 내지 피코몰 농도에서 자웅동체 유인물질 및 응집 신호로서 작용한다는 것을 나타낸다. 도 4C는 트립토판 ("머리 기"), 지방산 ("지질 측쇄"), p-아미노벤조산 (PABA, "말단"), 및 탄수화물 대사 ("아스카릴로스")로부터 유래된 건축 블록(building block)을 기초로 하는, 씨. 엘레간스 신호전달 분자들의 모듈형 어셈블리(assembly)를 나타낸다.
도 5A-B는 인돌 아스카로시드가 강한 자웅동체 유인물질이라는 것을 나타낸다. 지점 유인 검정법에서, N2 자웅동체는 낮은 농도의 icas#9에 강하게 유인되는 반면, 수컷은 유인되지 않는다 (***p < 0.0001, 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정) (도 5A). 도 5B는 먹이와 함께 또는 먹이 없이 1 pM icas#3을 함유하는 플레이트 상에서의 N2 및 CB4856 자웅동체의 사분면 화학주성 지수의 그래프이다. 사분면 화학주성 검정법에서, ascr#2,3,5 블렌드에 또한 유인된 npr -1( ad609 ) 돌연변이체 벌레를 제외하고는, 테스트된 모든 균주로부터의 자웅동체가 1 pM icas#3에 유인되고, 비-인돌 아스카로시드들의 생리학적 혼합물 (10 nM의 각각의 ascr#2,3,5)에 의해 퇴치된다 (도 5C) (15분 후의 화학주성 (30분의 화학주성 지수에 대해서는 도 3B 참조), *p < 0.05, **p < 0.01, 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트).
도 6A-E는 icas#3에 대한 반응에서의 응집 및 운동(locomotory) 변화에 관한 것이다. 도 6A는 낮은 벌레 밀도 (5 ㎝ 플레이트 당 벌레 20마리)의 icas#9 플레이트 상에서의 고립성 및 군거성 자웅동체의 응집 거동을 나타낸다 (*p < 0.05, **p < 0.01, 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트). 도 6B는 100 fM 또는 100 pM의 icas#3을 함유하는 플레이트 상에서의 him-5 수컷의 응집을 나타낸다 (**p < 0.01, 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트). 도 6C는 daf -22 자웅동체가 지점 유인 검정법에서 icas#3에 유인된다는 것을 나타낸다 (*p < 0.01, **p < 0.01, ***p < 0.0001, 독립형 스튜던트 t-테스트 + 웰치 보정). 도 6D는 여러 icas#3 농도에서의 N2 자웅동체의 전진 속도 (벌레의 전진 이동 동안의 벌레의 속도)를 나타낸다. 도 6E는 여러 icas#3 농도에서의 N2 자웅동체의 역행의 숫자를 나타낸다. 도 6D-E: *p < 0.05, **p < 0.01, 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트.
도 7A-B는 ASK 절제가 자웅동체의 icas#3-의존적 운동 거동에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. ASK-절제 자웅동체는 icas#3에 대한 노출 시 감소된 전진 속도를 나타내지 않는다 (도 7A). ASK-절제 벌레의 역행 빈도가 icas#3에 반응하여 증가하지 않는다 (도 7B). **p < 0.001, 독립형 t 테스트 + 웰치 보정).
도 8A-D는 인돌 아스카로시드가 씨. 엘레간스에서의 응집 거동을 매개한다는 것을 나타낸다. 도 8A는 여러 icas#3 농도에서의 낮은 벌레 밀도 (플레이트 당 벌레 20마리)의 고립성 및 군거성 자웅동체의 응집 거동을 나타낸다. 도 8B는 여러 icas#3 농도에서의 낮은 벌레 밀도 (플레이트 당 벌레 약 120마리)의 고립성 및 군거성 자웅동체의 응집 거동을 나타낸다. 도 8C는 2가지 상이한 icas#3 농도에서의 낮은 벌레 밀도의 daf -22 자웅동체의 응집을 나타낸다. 도 8D는 상이한 icas#3 농도에서의 N2 자웅동체의 평균 정지 기간을 나타낸다. 도 8A-D: *p < 0.05, **p < 0.01 일원 ANOVA + 던넷의 사후 테스트.
도 9A-G는 daf -22-의존적 대사산물로서의 인돌 아스카로시드의 확인에 관한 것이다. 도 9A는 중요한 아스카로시드 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (전문이 이에 의해 참고로 포함됨))의 화학 구조를 나타낸다. 도 9B는 2D-NMR 분광법을 통한 시차 분석 (DANS)의 개략도이다. 야생형 NMR 스펙트럼과 daf -22 돌연변이체 NMR 스펙트럼의 비교로 daf -22-의존적 신호전달 분자를 나타낼 수 있는 분광 신호의 검출이 가능해졌다. 도 9C는 DANS에 사용된 실제 야생형 및 daf -22 NMR 스펙트럼의 소형 섹션이다. 인돌 카르복실산의 신호가 양쪽 스펙트럼 모두에 존재하는 반면 (각각의 패널의 왼쪽 상자), 또 다른 인돌-유래 신호 (각각의 패널의 오른쪽 상자)는 야생형에만 존재하고, daf -22 스펙트럼에는 존재하지 않는다. 도 9D는 야생형 및 daf -22 대사체(metabolome)의 HPLC-MS-기반 비교이다. 야생형으로부터 수득된 이온 크로마토그램은 daf -22 크로마토그램에 부재하는 5가지 상이한 인돌 아스카로시드의 분자성 이온에 대한 피크를 나타낸다. 도 9E는 확인된 인돌 아스카로시드의 구조를 나타낸다. 도 9F는 이러한 연구에서 확인된 추가적인 비-인돌 아스카로시드의 구조를 나타낸다. 도 9G는 배지 추출물의 HPLC-MS 분석에 의해 결정된, 액체 배양으로 성장된 씨. 엘레간스 N2가 분비한 인돌 아스카로시드 icas#3 및 icas#9 및 비-인돌 아스카로시드 ascr#3 및 ascr#9의 상대적인 양의 그래프이다 (ascr#3의 농도에 대해 표준화됨; n = 5, ±SEM). 인돌 및 비-인돌 아스카로시드의 질량 분광법적인 정량을 위해, 신뢰할 수 있는 기준 화합물들의 표준 혼합물을 사용하였다.
도 10은 daf -22 의존적 인돌 유도체 (상자)를 함유하는 야생형 (N2) 대사체 분획의 dqfCOSY NMR 스펙트럼 (CDCl3, 600 MHz)의 중앙 섹션이다.
도 11A-C는 합성 icas#3의 1H NMR 스펙트럼 (CD3OD, 600 MHz) (도 11A), 1H,13C-HSQC 스펙트럼 (CD3OD, 600 MHz) (도 11B), 및 1H,13C-HMBC 스펙트럼 (CD3OD, 600 MHz) (도 11C)이다.
도 12A-E는 인돌 아스카로시드의 HPLC-MS 확인에 관한 것이다. 이들은 각각 icas#9, icas#7, icas#1, icas#3, 및 icas#10의 전기분무 이온화 MS 스펙트럼 (음이온 모드)을 나타낸다.
도 13A-H는 인돌 아스카로시드의 생합성 기원의 HPLC-MS 분석에 관한 것이다. 이들은 각각 icas#9 (도 13A-B), icas#1(도 13E-F), icas#3 (도 13C-D), 및 icas#10 (도 13G-H)의 [D5]- 및 [H]-동위원소이성질체를 나타내는 CeMM 배지 + L-[2,4,5,6,7-D5]-트립토판 및 L-트립토판의 1:1 혼합물에서 배양된 씨. 엘레간스의 전신 추출물의 HPLC-MS 이온 크로마토그램 (음이온 전기분무 이온화 및 단일-이온 기록 모드를 사용하여 취득됨)을 나타낸다.
도 14A-B 또한 인돌 아스카로시드가 씨. 엘레간스에서의 응집 거동을 매개한다는 것을 나타낸다. 도 14E는 대조군 플레이트 상에서의 거동에 비교된 10 pM의 icas#3을 함유하는 플레이트 상에서의 N2 자웅동체 (플레이트 당 벌레 20마리)의 응집 (화살표)을 나타낸다. 도 14F는 대조군 플레이트 상에서의 거동에 비교된 1 pM의 icas#3을 함유하는 플레이트 상에서의 N2 자웅동체 (플레이트 당 벌레 약 120마리)의 응집을 나타낸다.
도 15A-B는 메틸 5-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)펜타노에이트 (3)의 1H NMR 스펙트럼 (도 15A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 15B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 아세톤-d 6 ; 13C NMR: 100 MHz, 아세톤-d 6 .
도 16A-B는 5-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)펜탄산 (oscr #9)의 1H NMR 스펙트럼 (도 16A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 16B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 메탄올-d 4 ); 13C NMR: 100 MHz, 메탄올-d 4 .
도 17A-B는 메틸 9-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)노나노에이트 (5)의 1H NMR 스펙트럼 (도 17A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 17B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 아세톤-d 6 ; 13C NMR: 100 MHz, 아세톤-d 6 .
도 18A-B는 9-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)노난산 (oscr #10)의 1H NMR 스펙트럼 (도 18A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 18B)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; 13C NMR: 100 MHz, 메탄올-d 4 .
도 19는 에틸 (8R)-히드록시-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시노나노에이트 (9)의 1H NMR 스펙트럼 (500 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 20은 에틸 (8R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시노나노에이트 (10)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 21A-D는 (8R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시노난산 (bhas #10)의 1H NMR 스펙트럼 (도 21A), 13C NMR 스펙트럼 (도 21B), HSQC 스펙트럼 (도 21C), 및 HMBC 스펙트럼 (도 21D)이다. 1H NMR: 500 MHz, 메탄올-d 4 ; 13C NMR: 125 MHz, 메탄올-d 4 ; HSQC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 .
도 22A-B는 (8R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-1-엔 (12)의 1H NMR 스펙트럼 (도 22A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 22B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 아세톤-d 6 ; 13C NMR: 100 MHz, 아세톤-d 6 .
도 23은 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시트리데크-5-엔산 에틸 에스테르 (13)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 24는 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시트리데칸산 에틸 에스테르 (14)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 25는 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시트리데칸산 에틸 에스테르 (15)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 26A-D는 (12R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시트리데칸산 (bhas #22)의 1H NMR 스펙트럼 (도 26A), dqfCOSY 스펙트럼 (도 26B), HSQC 스펙트럼 (도 26C), 및 HMBC 스펙트럼 (도 26D)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; HSQC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 .
도 27A-B는 11-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)운데크-1-엔 (17)의 1H NMR 스펙트럼 (도 27A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 27B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 아세톤-d 6 ; 13C NMR: 100 MHz, 아세톤-d 6 .
도 28은 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시펜타데크-5-엔산 에틸 에스테르 (18)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 29는 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시펜타데칸산 에틸 에스테르 (19)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 30은 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시펜타데칸산 에틸 에스테르 (20)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d 1 )이다.
도 31A-D는 15-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시펜타데칸산 (bhos #26)의 1H NMR 스펙트럼 (도 31A), dqfCOSY 스펙트럼 (도 31B), HSQC 스펙트럼 (도 31C), 및 HMBC 스펙트럼 (도 31D)이다. 1H NMR: 400 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; HSQC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 .
도 32A-D는 9-(5'R-(1H-인돌-3-카르보닐옥시)-3'R-히드록시-6'S-메틸-테트라히드로-(2H)-피란-2'-일옥시)노난산 (icos #10)의 1H NMR 스펙트럼 (도 32A), dqfCOSY 스펙트럼 (도 32B), HSQC 스펙트럼 (도 32C), 및 HMBC 스펙트럼 (도 32D)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; HSQC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 .
도 33A-B는 4-tert-부틸디메틸실릴옥시벤조산 (22)의 1H NMR 스펙트럼 (도 33A) 및 13C NMR 스펙트럼 (도 33B)이다. 1H NMR: 400 MHz, 클로로포름-d 1 ; 13C NMR: 100 MHz, 클로로포름-d 1 .
도 34A-C는 (8R)-(3'R-히드록시-5'R-(4-히드록시벤조일옥시)-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-(2E)-엔산 (hbas #3)의 1H NMR 스펙트럼 (도 34A), dqfCOSY 스펙트럼 (도 34B), 및 HMBC 스펙트럼 (도 34C)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 .
도 35A-B는 (8R)-(3'R-히드록시-5'R-(E)-(2-메틸부트-2-에노일옥시)-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-(2E)-엔산 (mbas #3)의 1H NMR 스펙트럼 (도 35A) 및 dqfCOSY 스펙트럼 (도 35B)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 .
도 36A-D는 2-(8R)-(3'R,5'R-디-히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)노나노일-3,4,5-트리히드록시-6-히드록시메틸-(2H)-테트라히드로피란 (glas#10)의 1H NMR 스펙트럼 (도 36A), dqfCOSY 스펙트럼 (도 36B), HMQC 스펙트럼 (도 36C), 및 HMBC 스펙트럼 (도 36D)이다. 1H NMR: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; dqfCOSY: 600 MHz, 메탄올-d 4 ; HMQC: 1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz, 메탄올-d 4 ; HMBC: 600 MHz, 메탄올-d 4 .
도 37A-K는 (ω-1)-산소화 아스카로시드 (ascr) (도 37A), (ω)-산소화 아스카로시드 (oscr) (도 37B), (ω-1)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (bhas) (도 37C), (ω)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (bhos) (도 37D), (ω-1)-산소화 인돌 아스카로시드 (icas) (도 37E), (ω)-산소화 인돌 아스카로시드 (icos) (도 37F), (ω-1)-산소화 인돌 β-히드록시 아스카로시드 (ibha) (도 37G), (ω)-산소화 인돌 β-히드록시 아스카로시드 (ibho) (도 37H), 글루코실 아스카로시드 에스테르 (glas) (도 37I), ascr#8 및 4-(4-히드록시벤조일)- 및 4-(2-(E)-메틸-2-부테노일)-아스카로시드 (hbas 및 mbas) (도 37J), 및 ascr#2 및 ascr#6.1 (도 37K)의 HPLC-ESI-MS 데이터를 나타낸다. * = 합성 표준물질을 사용하여 확증됨; $ SMID: 씨. 엘레간스 및 기타 선충으로부터 확인된 소형 분자에 대한 소형 분자 식별자(Small Molecule IDentifier). SMID 데이터베이스 (www.smid-db.org)는 웸베이스(Wormbase) (www.wormbase.org)와 공동으로 보이스 톰슨 인스티튜트(Boyce Thompson Institute)의 프랭크 씨. 슈뢰더(Frank C. Schroeder) 및 루카스 뮐러(Lukas Mueller)에 의해 유지되는 전자 자원이다. 이러한 데이터베이스의 목적은 씨. 엘레간스 및 기타 선충으로부터 새롭게 확인된 모든 소형 분자에 대해 검색가능한 유전자 스타일 식별자인 "SMID"를 도입하는 것이다.
도 38은 씨. 엘레간스의 야생형 및 돌연변이체 엑스크리톰(excretome) 추출물에서 확인된 아스카로시드의 HPLC 용출 프로파일을 나타낸다 (Δ는 (E)-형상 α,β-불포화 측쇄가 있는 성분을 가리킨다).
도 39A-B는 아스카릴로스 고리 및 측쇄의 메틸 기에 대한 특징적인 신호 (청색), 티글레이트 단위의 알릴 메틸 기 (적색), 및 측쇄 이중 결합에 대한 pH 의존적 신호 (녹색)를 나타내는, 야생형 씨. 엘레간스 배지 추출물로부터의 mbas#3-강화 분획 (도 39A) 및 합성 mbas#3 (도 39B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 섹션들이다.
도 40A-B는 아스카릴로스 고리 및 측쇄의 메틸 기에 대한 특징적인 신호 (청색), 파라-치환 4-히드록시벤조일 단위 (적색), 및 측쇄 이중 결합 (녹색)을 나타내는, 야생형 씨. 엘레간스 배지 추출물로부터의 hbas#3-강화 분획 (도 40A) 및 합성 hbas#3 (도 40B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 섹션들이다.
도 41A-B는 아스카릴로스 고리의 메틸 기에 대한 특징적인 신호 (청색), 및 아스카릴로스 스핀 시스템 (흑색)을 나타내는, 야생형 씨. 엘레간스 배지 추출물로부터의 hbas#3-강화 분획 (도 41A) 및 합성 hbas#3 (도 41B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 확대 섹션들이다.
도 42는 acox -1( ok2257 ) 배지 추출물로부터의 oscr#9-강화 분획의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )이다.
도 43A-B는 아스카릴로스 고리 및 측쇄의 메틸 기에 대한 특징적인 신호 (청색), 글루코스 단위의 아노머(anomer) 수소 (적색), 글루코스 스핀 시스템 (녹색), 및 아스카릴로스 스핀 시스템 (흑색)을 나타내는, acox -1( ok2257 ) 벌레 펠릿 추출물로부터의 glas#10-강화 분획 (도 43A) 및 합성 glas#10 (도 43B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 섹션들이다.
도 44A-P는 아스카로시드 표준물질의 MS/MS 생성물 이온 스펙트럼이다. ascr#5는 아스카릴로스에 대한 m/z 147 [C6H11O4], C3-측쇄 및/또는 동일한 분자 조성의 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73을 나타낸다 (도 44A). oscr#9 (도 44B) 및 ascr#9 (도 44C)는 C5-측쇄에 대한 m/z 99 [C5H7O2], m/z 147 [C6H11O4], 및 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73을 나타낸다. ascr#7은 C7-측쇄에 대한 m/z 125 [C7H9O2], m/z 111 [C6H7O2] 및 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73 (도 44D)을 나타낸다. ascr#1은 C7-측쇄에 대한 m/z 127 [C7H11O2] 및 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73 (도 44E)을 나타낸다. ascr#3은 m/z 111 [C6H7O2] 및 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73 (도 44F)을 나타낸다. ascr#10 (도 44G) 및 oscr#10 (도 44H)은 C9-측쇄에 대한 m/z 173 [C9H15O3] 및 155 [C9H13O2] 및 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73을 나타낸다. β-히드록시 아스카로시드 예컨대 bhas#22 (C13-측쇄) (도 44I) 및 bhos#26 (C15-측쇄) (도 44J)은 아스카릴로스 및 아세트산 상실로부터 유래되는 각각 m/z 185 [C11H21O2] 및 m/z 213 [C13H25O2]의 측쇄 특이적 단편 이온을 나타낸다. 또한, bhas#22 및 bhos#26은 아세테이트에 대한 m/z 59 [C2H3O2]의 강한 생성물 이온, 뿐만 아니라 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73의 진단성 이온을 나타낸다. 인돌 아스카로시드 예컨대 icas#9 (도 44K) 및 icas#1 (도 44L)은 인돌 카르보닐 단위 [C9H5NO]의 상실로부터 유래되는 각각 m/z 247 [C11H19O6] 및 m/z 275 [C13H23O6]의 상응하는 아스카로시드에 대한 측쇄 특이적 단편 이온을 나타낸다. 또한, icas#9 및 icas#1은 인돌 카르복실레이트 이온에 대한 m/z 160 [C9H6NO2]을 나타낸다. 인돌 아스카로시드의 아스카로시드 생성물 이온은 비-인돌 아스카로시드의 단편화 패턴에 상응하는 추가적인 단편 이온, 예컨대 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73의 진단성 단편 이온을 나타낸다. icas#3 (도 44M)은 인돌 카르복실레이트 이온에 대한 m/z 160 [C9H6NO2]과 함께 인돌 카르보닐 단위 [C9H5NO]의 상실로부터의 m/z 301 [C15H25O6]을 나타낸다. mbas#3 (도 44N)은 각각 티글로일 [C5H6O] 및 티글레이트 [C5H8O2] 단위의 상실로부터 유래되는 m/z 301 [C15H25O6] 및 m/z 283 [C15H23O5]을 나타낸다. 또한, mbas#3은 티글레이트 이온에 대한 m/z 99 [C5H7O2]를 나타낸다. 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73의 진단성 단편 이온은 강도가 낮다. hbas#3 (도 44O)은 히드록시벤조일 단위 [C7H4O]의 상실로부터 유래되는 m/z 301 [C15H25O6]을 나타낸다. 또한, hbas#3은 히드록시벤조에이트 및 페놀레이트 이온에 대한 m/z 137 [C7H5O3] 및 m/z 93 [C6H5O]를 나타낸다. 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73의 아스카로시드 진단성 단편 이온은 강도가 낮다. PABA-연결 ascr#8 (도 44P)은 아스카릴로스-유래 C3O2H5 단편에 대한 m/z 73의 진단성 단편 이온과 함께 각각 PABA 및 아닐리드 이온에 대한 m/z 136 [C7H6NO2] 및 m/z 92 [C6H6N]의 특징적인 단편 이온을 나타낸다.
도 45는 ClustalW를 사용하여 수행된, 인간 MFE-2 아이소형(isoform) 2 (NP_000405.1)와 씨. 엘레간스 MAOC-1 (NP_495494.1 (적색)) 및 DHS-28 (NP_509146.1; 옥시도리덕타제(oxidoreductase) 도메인 (녹색), SCP-2 스테롤 캐리어(carrier) 단백질 도메인 (황색)의 정렬을 나타낸다. 촉매 부위를 구성하는 아미노산은 녹색 및 적색 상자로, 과산화소체 표적화 신호는 흑색으로 표시된다. 동일한 아미노산은 회색으로 표시되고, 유사한 아미노산은 담회색으로 표시된다.
도 46A-C는 씨. 엘레간스에서의 신규 아스카로시드의 확인에 관한 것이다. 도 46A는 야생형 씨. 엘레간스 엑스크리톰 (ESI-)의 LC-MS 총 이온 전류 (TIC) 크로마토그램이다. 도 46B는 아스카로시드의 MS/MS 단편화를 도해한다. 도 46C는 야생형 엑스크리톰의 LC-MS/MS 스크린 (m/z 73의 전구체)이고, 공지된 아스카로시드 (흑색), 신규 동족체 (C4, C6, C8, C11, 및 C12), 신규 (ω)-산소화 이성질체 (C5ω, C9ω, 및 C11ω) 및 신규 4'-아실화 유도체 (hbas#3 및 mbas#3) (* 비-아스카로시드)를 나타낸다. 제시된 체류 시간 범위 밖인 6.5분에 고도로 극성인 ascr#5가 용출된다.
도 47A-C는 LC-MS/MS를 통해 야생형, acox -1, maoc -1, dhs -28, 및 daf -22 벌레에서 확인된 아스카로시드를 나타낸다. 도 47A는 (ω-1)-산소화 아스카로시드를 나타내고, 도 47B는 (ω)-산소화 아스카로시드를 나타내며, 도 47C는 4'-아실화 유도체에 대한 예를 나타낸다. 유사성 및 HPLC-MS 체류 시간 (도 38 참조)을 기초로 제시된 바와 같이 합성용으로 합성되지 않은 화합물 및 146개의 특성화된 아스카로시드의 완전한 목록의 입체화학이 제안된다.
도 48A-B은 hbas#3에 대한 유인에 관한 것이다. 야생형 (N2) 자웅동체가 용량 의존적 방식으로 지점 유인 검정법에서 hbas#3에 유인된다 (도 48A). 도 48B는 사분면 화학주성 검정법에서의 야생형 자웅동체에 대한 hbas#3 유인의 용량 의존성을 나타낸다.
도 49A-B는 아스카로시드 생체발생에 관한 것이다. 도 49A는 아스카로시드 생합성에서의 과산화소체 β-산화 효소 ACOX-1, MAOC-1, DHS-28, 및 DAF-22의 제안된 역할을 나타낸다. 도 49B는 점 돌연변이 (수직 막대) 및 결실 (수평 막대)을 나타내면서 acox -1, maoc -1, dhs -28, 및 daf -22 돌연변이체 대립유전자의 유전자 구조를 나타낸다.
도 50A-E는 포화 (청색), α,β-불포화 (적색), 및 β-히드록실화 (녹색) 측쇄의 야생형 (도 50E) 및 β-산화 돌연변이체 (acox -1 (도 50A), maoc -1 (도 50B), dhs-28 (도 50C), 및 daf -22 (도 50D))에서의 (ω-1)-산소화 아스카로시드의 양을 나타낸다.
도 51은 ClustalW을 사용하여 수행된 씨. 엘레간스 ACOX-1 아이소폼 a.1과 기타 과산화소체 아실-CoA 옥시다제(oxidase)의 정렬을 나타낸다. 동일한 아미노산은 회색으로 표시되고, 유사한 아미노산은 담회색으로 표시되며, 과산화소체 표적화 신호는 흑색으로 표시된다.
도 52A-B는 야생형 (도 52A) 및 acox -1 돌연변이체 (도 52B)에서의 (ω)-산소화 아스카로시드의 양을 나타낸다 (도 53A-E를 또한 참조한다).
도 53A-E는 포화 (청색), α,β-불포화 (적색), 및 β-히드록실화 (녹색) 아스카로시드를 나타내는, 야생형 (N2) (도 53A) 및 β-산화 돌연변이체 (acox -1 (도 53B), maoc -1 (도 53C), dhs -28 (도 53D), daf -22 (도 53E))에서의 (ω)-산소화 아스카로시드의 프로파일이다. ((ω-1)-산소화 아스카로시드에 대해서는, 도 50A-E를 참조한다).
도 54A-B는 인돌 아스카로시드 생합성에 관한 것이다. acox -1에서의 (ω-1) 및 (ω)-산소화 C5-아스카로시드 ascr#9 및 oscr#9 및 이의 상응하는 인돌 아스카로시드 icas#9 및 icos#9의 상대 풍부도는 인돌-3-카르보닐 부착이 고도로 특이적이라는 것을 가리킨다 (도 54A). 도 54B는 (ω-1)-산소화 ascr#10에의 인돌-3-카르보닐 부착에 대한 선호를 나타내는, ascr#10 및 oscr#10의 1:1 혼합물과 함께 인큐베이션한 후의 daf -22(m130) 엑스크리톰의 LC-MS 이온 트레이스를 포함한다.
도 55는 야생형 엑스크리톰 추출물에서의 아스카로시드 ascr#3 및 ascr#9 및 이들의 상응하는 인돌 아스카로시드 icas#3 및 icas#9의 상대 풍부도를 나타내고, 인돌 부착이 측쇄 길이에 고도로 의존적이라는 것을 가리킨다.
도 56A-B는 아스카로시드 프로파일에 관한 것이다. 벌레 몸체 아스카로시드 프로파일의 분석 (도 56A)은 아스카로시드 글루코시드 (예를 들어 glas#10)를 나타내고, 불포화 아스카로시드의 우선적인 배출을 가리킨다. dhs -28 돌연변이체 엑스크리톰 내의 (ω-1) 대 (ω)-연결 포화 아스카로시드의 비 (도 56B)는 영양 조건에 대한 강한 의존성을 나타내고 (β-히드록시 아스카로시드에 대해서는 도 59A-C 참조), 이는 야생형 씨. 엘레간스에서의 ascr#3/ascr#5 비의 결핍 의존성을 반영한다 (도 60 참조) (웰치 t-테스트, *: P<0.05; ** P<0.001).
도 57A-C는 글루코실 에스테르 glas#10, glas#18, 및 glas#22 및 상응하는 비-글리코실화 아스카로시드 ascr#10, ascr#18, 및 ascr#22를 나타내는 acox -1(ok2257) 벌레 몸체 추출물의 LC-MS/MS 크로마토그램 (m/z = 73의 전구체 이온)이다.
도 58은 야생형 씨. 엘레간스에 의한 (ω)-산소화 아스카로시드의 차별적인 배출을 나타낸다 ((ω-1)-산소화 아스카로시드에 대해서는, 도 56A 참조).
도 59A-C는 dhs -28( hj8 ) 돌연변이체 벌레에서의 (ω-1) 대 (ω)-연결 아스카로시드의 비를 나타내고, 영양 조건에 대한 강한 의존성을 나타낸다. 도 59A는 dhs-28(hj8) 엑스크리톰 추출물 내의 β-히드록시 아스카로시드들의 비이다. 도 59B는 dhs -28( hj8 ) 벌레 몸체 추출물 내의 β-히드록시 아스카로시드들의 비이다. 도 59C는 dhs -28( hj8 ) 벌레 몸체 추출물 내의 포화 아스카로시드들의 비이다 (dhs -28(hj8) 엑스크리톰 추출물 내의 포화 아스카로시드는 도 56B에서 제시된다).
도 60은 야생형 엑스크리톰에서의 ascr#3/ascr#5 비의 결핍 의존성을 나타낸다.
도 61A-B는 아스카로시드 생체발생에 관한 것이다. 도 61A는 아미노산 (녹색), 지방산 (청색), 및 탄수화물 (적색) 건축 블록으로부터의 아스카로시드의 모듈형 어셈블리를 나타낸다. 도 61B는 아스카로시드 생체발생에 대한 모델을 나타낸다. 지방산의 사슬 신장 (추정 일롱가제(elongase) 상동체 elo -1-9 25 에 의함) (문헌 [Agbaga et al., PNAS 105:12843-48 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 VLCFA의 (ω-1)- 또는 (ω)-산소화 및 아스카릴로스 부착이 이어진다. 생성된 VLCA가 ACOX-1, MAOC-1, DHS-28, 및 DAF-22를 통한 과산화소체 β-산화에 진입하여 짧은 사슬 아스카로시드가 생산되고, 이는 아미노산-유래 모이어티 및 기타 건축 블록에 연결된다.
도 62는 ClustalW을 사용하여 수행된 예르시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis) CDP-3, 6-디데옥시-D-글리세로-D-글리세로-4-헥술로스-5-에피머라제(epimerase) 또는 ascE (AAA88702.1)와 씨. 엘레간스 상동체 C14F11.6 (CCD64543.1)의 정렬이다. 동일한 아미노산은 회색으로 표시되고, 유사한 아미노산은 담회색으로 표시된다.
도 63A-D는 에스. 펠티아에(S. feltiae)의 정량 및 씨. 엘레간스 분산 블렌드에 대한 이의 반응에 관한 것이다. 도 63A는 분산 블렌드에 대한 아스카로시드의 구조를 나타낸다. 도 63B는 이미지 제이(Image J)를 사용한 분산성 씨. 엘레간스의 정량을 나타낸다 (두 번째 칼럼은 반전도를 나타내고, 세 번째 칼럼은 계수된 선충을 나타낸다). 도 63C는 합성 블렌드의 활성에 대한 개별적인 아스카로시드의 기여를 나타낸다. ascr#2 (3.68 pmol/ul), ascr#3 (0.165 pmol/ul), ascr#8 (0.25 pmol/ul), 및 icas#9 (0.005 pmol/ul). 각각의 처리에 대해 7회의 실험을 행하였다. +, 존재 및 -, 부재. 독립형 스튜던트 t-테스트 (p<0.05). 도 63D는 전체 플레이트 내에서 가시화된 씨. 엘레간스 분산 블렌드에 대한 에스. 펠티아에 반응을 나타낸다.
도 64A-D는 분산 검정법에 관한 것이다. 도 64A는 곤충 사체로부터의 에스. 펠티아에의 천연적으로 분산성인 감염성 애벌레 (IJ)를 나타낸다. 도 64B는 수중 한천 플레이트 상에 놓인 약 300개의 IJ를 나타낸다. 도 64C는 물 (대조군) 또는 곤충 사체 추출물로 처리된 IJ를 나타낸다. 영상은 각각의 처리에 대한 6회의 실험을 대표한다. 도 64D는 동일한 플레이트 상에서의 분산 검정법을 나타낸다. 이러한 도면은 2회의 실험을 나타낸다. 거동은 온도 및 계절 의존적이다. RT (22 + 0.5℃)에서 또는 온도 제어 조건 하에 검정법이 수행되었다.
도 65는 여러 아스카로시드의 구조를 나타낸다.
도 66A-E는 아스카로시드 블렌드가 씨. 엘레간스 분산 거동을 조절한다는 것과 다른 선충이 이러한 분산 블렌드를 인식한다는 것을 나타낸다. 도 66A는 분산 블렌드의 확인을 나타낸다. 영상 (~250마리의 선충)은 각각 대조군 (0.25％ 이. 콜라이(E. coli) (HB101)), 합성 블렌드 + 0.25％ E.coli (HB101), 및 다우어 상청액의 9회, 10회 및 11회 실험을 대표한다. 도 66B는 이미지 제이 (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html)를 사용한 정량을 나타낸다. 대조군 대 합성 블렌드의 독립형 스튜던트 t-테스트 (p < 0.02). 도 66C는 씨. 엘레간스 분산 블렌드의 성분에 대한 곤충병원성 선충 또는 뿌리혹 선충으로 감염된 숙주 사체의 분석을 나타낸다. 도 66D는 분산 블렌드에 대한 에스. 펠티아에 IJ (~250마리)의 반응을 나타낸다; 각각의 처리에 대한 4회의 실험. 도 66E는 씨. 엘레간스 분산 블렌드에 대한 뿌리혹 J2 (멜로이도기네 종, 엠. 인코그니타(M. incognita), 엠. 자바니카(M. javanica) 및 엠. 플로리덴시스(M. floridensis)의 혼합물)의 반응을 나타낸다. 데이터는 각각 대조군 물 및 씨. 엘레간스 분산 블렌드로부터의 19회 및 20회의 실험을 나타낸다. 2 h에, 독립형 스튜던트 t-테스트를 사용하여, p < 0.007.
도 67A-E는 에스. 펠티아에 분산 페로몬의 활성-가이드 분획화를 나타낸다. 도 67A는 곤충 사체 추출물의 역상 (C18) 크로마토그래피 분획에 대한 반응을 나타낸다. 이러한 영상은 2회의 독립적인 실험을 대표한다. 추정되는 생리학적으로 관련된 농도가 검정법에서 사용되었다; Frc, 분획. 도 67B는 Frc A에서 확인된 생리학적으로 관련된 농도의 아스카로시드 (ascr#9, 40.3 pmol/㎕ 및 ascr#11, 1.3 pmol/㎕의 테스트에 관한 것이다. 영상은 3회의 실험을 대표한다. 도 67C는 ascr#2 및 ascr#9가 구조적 유사체라는 것을 나타낸다. 천연 및 합성 ascr#9를 분획 B 및 C와 조합하여 테스트하였다. 영상은 4회의 실험을 대표한다. 도 67D는 ascr#11의 구조를 나타낸다. 이것 (1.3 pmol/㎕) 또한 분획 B 및 C와 조합하여 분산을 야기하는데 충분하다. 영상은 3회의 실험을 대표한다.
도 68A-C는 분획 A (도 68A-B) 및 분획 B (도 68C)의 LC-MS 이온 크로마토그램이다. 첫 번째 패널은 m/z 279의 ascr#11을 나타내고, 두 번째 패널은 m/z 293의 ascr#9를 나타낸다.
도 69는 에스. 펠티아에 발달 동안의 ascr#9 및 ascr#11 프로파일을 나타낸다. 각각의 시점에 대해, 6마리의 곤충 사체를 LC-MS로 분석하였다. 0 시점에 대해서는 4마리의 미감염 유충을 분석하였다. * 검출되었지만 정량가능하지 않음.
도 70은 ascr#9가 씨. 엘레간스 분산 블렌드에서 ascr#2의 기능을 대신할 수 있다는 것을 나타낸다. 대표 도면이 제시된다. 0.25％ 이. 콜라이 HB101를 사용하는 음성 대조군 (3회의 실험), 씨. 엘레간스 분산 블렌드에서의 ascr#9 대체 (6회의 실험), 및 양성 대조군: 합성 블렌드 분산 블렌드 (7회의 실험) 및 양성 대조군 다우어 액체 배양물 (3회의 실험).
도 71A-B는 생리학적으로 관련된 선충 종들의 분산 블렌드에 관한 것이다. 도 71A는 곤충병원성 선충, 식물 기생성 선충, 및 씨. 엘레간스에 대한 계통수이다. 이러한 도면은 씨. 엘레간스, 및 선충 생물학으로부터 개조된다 (문헌 [PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY (WormBook, ed. The C. elegans Research Community, 2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 적색은 속의 예를 가리킨다. 도 71B는 스테이네르네마 종 및 헤테로랍디티스 종의 숙주 곤충 사체 내의 ascr#9 및 ascr#11의 존재를 나타낸다. 각각의 종에 대해, 스테이네르네마 종 또는 헤테로랍디티스 종 양쪽 모두로 감염된 4마리의 곤충 (지. 멜로넬라(G. mellonella)) 사체를 LC-MS로 ascr#9 및 ascr#11 프로파일에 대해 분석하였다.
도 72A-D는 (ω-1)-산소화 포화 아스카로시드 (도 72A), (ω-1)-산소화 불포화 아스카로시드 (도 72B), (ω)-산소화 포화 아스카로시드 (도 72C), 및 인돌 아스카로시드 icas#9 및 ascr#2 (도 72D)의 구조 및 HPLC-ESI-MS 데이터를 나타낸다. 1SMID: 씨. 엘레간스 및 기타 선충으로부터 확인된 소형 분자에 대한 소형 분자 식별자.
도 73은 아스카로시드 (ascr) 및 오메가-아스카로시드 (oscr)의 HPLC 체류 시간을 나타낸다. 측쇄는 씨. 엘레간스의 야생형 및 과산화소체 베타-산화 돌연변이체 및 합성 표준물질의 분석으로부터 유래된 3-17개의 탄소 범위이다.
도 74A-B는 성체 에스. 글라세리(S. glaseri)의 벌레 물 추출물 내의 아스카로시드의 확인을 나타낸다. 도 74A는 LC-MS/MS로부터의 총 이온 전류 (TIC) 크로마토그램이다; m/z 73.0의 전구체 이온에 대한 스크린은 아스카로시드 신호를 나타낸다. 도 74B는 LC-MS 측정으로부터의 ascr#9, ascr#12, ascr#1, 및 ascr#14에 대한 상응하는 이온 트레이스이다.
도 75A-K는 하기와 같은 아스카로시드 합성에서의 성분들의 NMR 스펙트럼이다.
Figure pct00005

도 76A-D는 아스카로시드의 구조 (도 76A), 검출 (도 76B-C), 및 합성 (도 76D)에 관한 것이다. 아스카로시드 (ascr) 및 인돌 아스카로시드 (icas) 양쪽 모두 씨. 엘레간스 내의 기존에 기술된 아스카로시드였다. (ω-1)-산소화 ascr에 더하여, 이의 (ω)-산소화 이성질체 (oscr)가 이러한 HPLC-MS 스크린에서 확인되었다. 도 76B는 자유-생활 씨. 엘레간스 (혼합 단계), 곤충 기생성 에스. 글라세리 (성체), 및 래트 기생성 엔. 브라실리엔시스(N. brasiliensis) (성체)로부터 수득된 컨디셔닝된 벌레 물 내의 짧은 사슬 및 중간 사슬 아스카로시드의 HPLC-MS 확인을 나타낸다. 씨. 엘레간스 삼출물의 HPLC-MS 분석은 공지된 아스카로시드 (ascr#1, #3, #7, 및 icas#9)를 상응하는 동족체 (ascr#9, #10, #12, #14, 및 #18), 및 (ω)-산소화 이성질체 (oscr#9, #10, #18)와 함께 나타낸다. 제시된 체류 시간 범위 밖인 6.5분에 고도로 극성인 ascr#5가 용출된다. 분자성 이온 신호 및 이의 HPLC-체류 시간의 종 교차 비교는 씨. 엘레간스에 의해 풍부하게 생산된 아스카로시드가 에스. 글라세리 및 엔. 브라실리엔시스가 포함되는 다수의 기타 선충 종에서 또한 발견된다는 것을 가리켰다 (씨. 엘레간스에서 또한 풍부한 화합물들을 나타내는 피크가 청색으로 제시됨). 도 76C는 피. 스트롱길로이데스(P. strongyloides) (혼합 단계) 및 에이치. 박테리오포라(H. bacteriophora) (성체) 내의 중가 사슬 및 긴 사슬 아스카로시드의 HPLC-MS 확인을 나타낸다. ascr#18 (청색)은 씨. 엘레간스에 의해 유의한 양으로 생산되는 반면, 더 긴 사슬의 동족체 (적색 피크)는 피. 스트롱길로이데스 및 에이치. 박테리오포라에 의해 풍부하게 생산되지만 씨. 엘레간스에 의해서는 그렇지 않다. 도 76D는 (ω)-산소화 아스카로시드인 oscr#9 및 oscr#10의 합성을 나타낸다.
도 77은 아스카로시드가 광범위한 선충 종에서 생산된다는 것을 나타내는 열 지도이다. 이는 벌레를 수시간 동안 에스 베이설(S Basal), ddH20, 또는 DMEM에서 인큐베이션하는 것으로부터 수득된 벌레 배지 샘플의 HPLC-MS 분석으로부터의 결과를 기초로 한다. 감염성 애벌레(IJ) 및 성체 (A)로 지시되는 기생충 종이 별도로 수집되었다; 모든 기타 샘플은 혼합 단계 배양물로부터 수득되었다. 이러한 열 지도에서의 색상은 HPLC-MS에 의해 검출된 아스카로시드의 상대 풍부도를 나타내고, 이는 오른쪽의 막대 도표로 지시되는 바와 같다. 예를 들어, 에스. 글라세리 감염성 애벌레에서 검출된 아스카로시드 중에서, 5.7％ ascr#11, 92.2％ ascr#9, 2.1％ ascr#12, 및 0.1％ ascr#10로 총량이 구성되었다.
도 78은 선충이 아스카로시드로 컨디셔닝된 영역에 독특하게 반응한다는 것을 나타낸다. 여러 선충 종을 3가지 농도의 합성 아스카로시드 (채점 영역 당 0.6 ㎕의 1 nM, 1 μM, 및 1 mM (각각 0.6 fmol, 0.6 pmol, 및 0.6 nmol에 상응함))로 컨디셔닝된 영역에 대한 반응에 대해 채점하였다. 컨디셔닝된 영역에서의 이의 점유를 20분 동안 대조군 영역에서의 점유에 비교하였다; 시험 당 10마리의 개체. 선충이 아스카로시드로 컨디셔닝된 영역에서 유의하게 더 많은 시간을 소비한 실험은 녹색으로 강조된다. 선충이 대조군 영역에서 더 많은 시간을 소비한 실험은 적색으로 강조되고, 이는 아스카로시드 회피를 가리킨다. 오차 막대, S.D. 각각의 세트에서 처음에 제시된 물에 대한 반응과 비교하여 각각의 값에 대한 통계적 유의성을 계산하였다. 독립형 스튜던트 t-테스트를 사용하여 P-값을 결정하였다. ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 79는 양쪽 영역 내의 벌레의 존재를 검출하는 소프트웨어를 사용하는 체류 검정법에 관한 것이고, 벌레가 점유한 각각의 채점 영역의 백분율의 출력값을 제공하며, 이는 전체 시험 동안 초 당 1회 계산된다. 이러한 출력값은 양쪽 채점 영역에 대한 벌레 점유비 대 시간의 플롯(plot)이다 (오른쪽 패널). 문헌 [Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 채점 지수를 채택하였다.
도 80A-C는 유인 검정법에 관한 것이다. 씨. 엘레간스 수컷은 상이한 선충 종 및 아스카로시드에 대해 차별적인 긴 범위의 유인을 나타낸다. 10 cm 한천 플레이트 상에서 자웅동체 또는 아스카로시드-컨디셔닝 포인트 소스(point source)에 대한 화학주성을 채점하는 것에 의해 동종 자웅동체에 대한 씨. 엘레간스 수컷의 긴 범위의 유인이 확립되었다 (도 80A). 자웅동체를 M9 완충제에 현탁시키고, 한천 플레이트 상의 구리 실린더 내에 6시간 동안 놓은 후, 이를 제거하고, 마비제 아지드화나트륨을 첨가하였다. 반대쪽에서 구리 실린더 내의 M9 완충제 대조군으로 동일하게 행하였다. 씨. 엘레간스 수컷을 플레이트의 중앙에 놓고, 어느 한쪽 지점에서 마비될 때까지 배회하게 하였다. 그 후, 대조군 대 신호 영역에서 마비된 벌레를 비교하여, 문헌 [Bargmann et al., Cell. 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)으로부터 채택된 유인 지수를 계산하였다. 도 80B는 씨. 엘레간스 수컷이 50마리의 동종 자웅동체로 컨디셔닝된 포인트 소스에 유인된다는 것을 나타낸다. 이들은 동일한 마리수의 피. 레디비부스(P. redivivus) 암컷에 대해 부분적인 유인을 나타내지만, 에스. 카르포캅사에(S. carpocapsae), 피. 파시피쿠스(P. pacificus), 또는 피. 스트롱길로이데스 암컷/자웅동체에 대해서는 그렇지 않다. 도 80C는 씨. 엘레간스 수컷이 6시간에 걸쳐 25마리의 자웅동체로 컨디셔닝된 포인트 소스를 검출할 수 있고 이에 대해 화학주성이 있다는 것을 나타낸다. 이는 ascr#2 및 ascr#3의 포인트 소스에 대해 화학주성이 있지만, ascr#8에 대해서는 그렇지 않다. 오차 막대, S.D. 도 80C에 제시된 대조군과 비교하여 각각의 값에 대한 통계적 유의성을 계산하였다. 독립형 스튜던트 t-테스트를 사용하여 P-값을 결정하였다. ** P < 0.01, * P < 0.05.
도 81은 아스카로시드가 동종 자웅동체에 대한 짝짓기를 증가시키거나 상이한 선충 종에 대한 짝짓기를 유도하지 않는다는 것을 나타낸다. 짝짓기 반응 검정법 (문헌 [Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)을 채택하여, 3분 시험 기간 내에 연속 10초 동안 성공적으로 자신의 밑면 꼬리(ventral tail)를 자웅동체 상에 놓은 수컷의 백분율을 정량하였다. 오차 막대, S.D.
도 82는 선충 및 박테리아에서의 신호전달 분자의 유사한 어셈블리를 나타낸다. N-아실 호모세린 락톤 (AHL)은 박테리아 쿼럼 감지(quorum sensing)를 매개하는 소형-분자들의 패밀리이다. AHL은 호모세린 락톤을 기초로 하고, N-아실 사슬에서의 종-특이적 변경을 특색으로 한다 (문헌 [Dickschat, Nat. Prod. Rep. 27:343-69 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨). 다양한 지질 사슬이 부착되는 디데옥시당 아스카릴로스 스캐폴드를 기초로, 아스카로시드들은 매우 유사한 방식으로 어셈블리된다 (문헌 [Edison, Curr. Opin. Neurobiol. 4:378-88 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이들 양쪽 모두 중요한 생존 전략을 매개하는 것에서 상당한 역할을 한다.
도 83은 엠. 자바니카 및/또는 엠. 하플라(M. hapla)에서 검출된 아스카로시드 화합물의 목록이다.
도 84는 뿌리혹 선충에서 확인된 아스카로시드 신호전달 분자의 고해상도 질량 분광법 데이터를 나타낸다.
도 85A-E는 아스카로시드 ascr#10 (도 85A), ascr#16 (도 85B), ascr#18 (도 85C), ascr#20 (도 85D), 및 ascr#22 (도 85E)의 존재를 나타내는, 뿌리혹 선충 (엠. 자바니카, 엠. 플로리덴시스, 엠. 인코그니타)으로부터의 추출물의 HPLC-MS 크로마토그램이다.
도 86A-E는 아스카로시드 ascr#10 (도 86A), ascr#16 (도 86B), ascr#18 (도 86C), ascr#20 (도 86D), 및 ascr#22 (도 86E)의 존재를 나타내는, 엠. 자바니카 (J2 유충)로부터의 추출물의 HPLC-MS 크로마토그램이다.
도 87A-E는 아스카로시드 ascr#10 (도 87A), ascr#16 (도 87B), ascr#18 (도 87C), ascr#20 (도 87D), 및 ascr#22 (도 87E)의 존재를 나타내는 북부 뿌리혹 선충(Northern Root-Knot Nematode) 엠. 하플라 (J2 유충)로부터의 추출물의 HPLC-MS 크로마토그램이다.
도 88A-E는 합성 아스카로시드 표준물질 (ascr#10 (도 88A), ascr#16 (도 88B), ascr#18 (도 88C), ascr#20 (도 88D), 및 ascr#22 (도 88E))의 HPLC-MS 크로마토그램이다.
도 89는 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (11)의 1H NMR 스펙트럼 (600 MHz, 클로로포름-d)이다.
도 90A-B는 (R)-메틸 4-((2-히드록시-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부타노에이트 (( R )-12)의 1H NMR (400 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 90A) 및 13C NMR (100 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 90B) 스펙트럼이다.
도 91A-B는 (R)-(R)-2-(4-메톡시-4-옥소부탄아미도-1-페닐에틸 4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (18)의 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 91A) 및 13C NMR (125 MHz, 메탄올-d4) (도 91B) 스펙트럼이다.
도 92A-D는 4-(((R)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (pasc#9)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 92A), dqfCOSY (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 92B), HMQC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 92C), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 92D) 스펙트럼이다.
도 93A-C는 4-(((S)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (19)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 93A), HMQC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 93B), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 93C) 스펙트럼이다.
도 94A-B는 (2S,3R,5S,6R)-6-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-5-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일 벤조에이트 (22)의 1H NMR (600 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 94A) 및 13C NMR (151 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 94B) 스펙트럼이다.
도 95A-B는 (2R,3S,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-2-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (24)의 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) (도 95A) 및 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) (도 95B) 스펙트럼이다.
도 96A-D는 (R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (part #9)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 96A), dqfCOSY (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 96B), HMQC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 96C), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 96D) 스펙트럼이다.
도 97A-B는 (2S,3R,5S,6R)-3,5-비스(벤질옥시)-2-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (26)의 1H NMR (400 MHz, 클로로포름-d) (도 97A) 및 13C NMR (100 MHz, 클로로포름-d) (도 97B) 스펙트럼이다.
도 98A-B는 (3R,5S,6R)-3,5-비스(벤질옥시)-2-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (( R )-29, α-아노머)의 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) (도 98A) 및 13C NMR (125 MHz, 클로로포름-d) (도 98B) 스펙트럼이다.
도 99A-B는 (R)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (( R )-30)의 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 99A) 및 13C NMR (125 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 99B) 스펙트럼이다.
도 100A-B는 (2S,3R)-벤질 3-히드록시-2-(3-(9-((3R,4S,5R)-3,4,5-트리스(벤질옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)-9H-퓨린-6-일)우레이도)부타노에이트 (6)의 1H NMR (500 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 100A) 및 13C NMR (125 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 100B) 스펙트럼이다.
도 101A-E는 (2S,3R)-3-(((R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-트리히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)-9H-퓨린-6-일)우레이도)부탄산 (npar #1)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 101A), 13C NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 101B), dqfCOSY (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 101C), HSQCAD (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 101D), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 101E) 스펙트럼이다.
도 102A-C는 (2S,3R)-3-(((S)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-트리히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)-9H-퓨린-6-일)우레이도)부탄산 (36)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 102A), HSQCAD (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 102B), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 102C) 스펙트럼이다.
도 103A-D는 (R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헵타노일)옥시)-3-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헵탄산 (dasc #1)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 103A), dqfCOSY (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 103B), HMQC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 103C), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 103D) 스펙트럼이다.
도 104A-B는 (R)-벤질 4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (38)의 1H NMR (500 MHz, 클로로포름-d) (도 104A) 및 13C NMR (125 MHz, 클로로포름-d) (도 104B) 스펙트럼이다.
도 105는 (R)-벤질 4-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-아지도-2-메틸프로파노일)옥시)-3-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (8)의 1H NMR 스펙트럼 (400 MHz, 클로로포름-d)이다.
도 106A-B는 5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (10)의 1H NMR (500 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 106A) 및 13C NMR (125 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 106B) 스펙트럼이다.
도 107A-B는 (2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-아지도-2-메틸프로파노일)옥시)-2-(((R)-5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄-2-일)옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일 5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (40)의 1H NMR (500 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 107A) 및 13C NMR (125 MHz, 아세톤-d 6 ) (도 107B) 스펙트럼이다.
도 108A-D는 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-((5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-6-메틸-5-(((R)-2-메틸-3-우레이도프로파노일)옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (ubas #1)의 1H NMR (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 108A), dqfCOSY (600 MHz, 메탄올-d 4 ) (도 108B), HMQC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 108C), 및 HMBC (1H에 대해 600 MHz, 151 MHz) (도 108D) 스펙트럼이다.
도 109는 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-(((R)-5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헥사노일)옥시)-6-메틸-5-(((R)-2-메틸-3-우레이도프로파노일)옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (ubas #2)을 함유하는 천연 샘플의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )이다.
도 110A-C는 피. 파시피쿠스 외부(exo)-대사체 및 기존에 확인된 씨. 엘레간스로부터의 신호전달 분자의 분석에 관한 것이다. 도 110A는 씨. 엘레간스에서 발달 및 거동을 조절하는, 아스카로시드를 기초로 하는 소형 분자 신호들의 구조를 나타낸다. 도 110B는 피. 파시피쿠스가 배출한 대사산물이 다우어 정지를 유도하고, 입-형성 이형성에 영향을 미쳐 광구성(eurystomatous) 입 발달을 촉진한다는 것을 나타낸다. 도 110C는 피. 파시피쿠스 외부-대사체 분획의 2D NMR (dqfCOSY) 스펙트럼의 예시적인 섹션으로, 공지된 1차 대사산물, 뿐만 아니라 공지되지 않은 성분을 포함하는 복합적인 대사산물 혼합물을 나타낸다. 크로스피크 미세 구조 및 추가적인 HMBC 스펙트럼의 상세한 분석으로, 아스카릴로스, 파라토스, 트레오닌, 크실로스 및 기타 건축 블록의 조합을 기초로 하는 일련의 일반적이지 않은 화학 구조가 검출되었다.
도 111A-C는 피. 파시피쿠스 대사산물의 HPLC-MS/MS 분석, 모듈형 구조 및 화학 합성에 관한 것이다. 도 111A에 제시된 바와 같이, 고해상도 HPLC-MS 분석으로 종의 분자식이 피. 파시피쿠스 외부-대사체의 NMR-분광법 분석을 기초로 제안된 구조에 대한 추가적인 구속을 제공하는 종이 밝혀졌다. 탄수화물 (흑색), 아미노산 (녹색), 및 뉴클레오시드 (적색) 대사로부터의 건축 블록, 뿐만 아니라 유사한 TCA 사이클-유래 숙시네이트 (심홍색)의 조립으로부터 유래된 피. 파시피쿠스 외부-대사체의 주성분이 도 111B에서 제시된다. 도 111C는 확인된 피. 파시피쿠스 대사산물 및 여러 비-천연 입체이성질체에 대한 단축 합성도를 나타낸다.
도 112는 주요 피. 파시피쿠스 소형 분자인 pasc#9, npar#1, dasc#1, 및 ubas#1을 나타낸다. NMR 분광법을 사용하여 구조가 해명되었다. 진한 선은 dqfCOSY 스펙트럼에서의 스핀 시스템을 가리킨다. 곡선 화살표는 구조를 할당하는데 사용된 주요 HMBC 상관관계를 가리킨다. npar#1에서의 표지된 양성자 (---H)는 N6-카르바모일 아데노신의 특징이고, 1H, HSQCAD, 및 HMBC 스펙트럼에서 관찰된다.
도 113는 아스카로시드 ascr#1, ascr#9, ascr#12, pasc#1, pasc#9, pasc#12, ubas#1, ubas#2, dasc#1, part#9, npar#1, 및 npar#2의 분자식, LC 체류 시간, 분광 데이터, 및 배양 상청액 내의 추정 농도가 확인되는 표이다.
도 114는 천연 pasc#9 (흑색), (R)-N-숙시닐-1-페닐에탄올아미드 모이어티를 포함하는 합성 pasc#9 (적색), 및 (S)-N-숙시닐-1-페닐에탄올아미드 모이어티를 포함하는 합성 pasc#9 (청색)의 1H-NMR 스펙트럼의 섹션들을 나타낸다. 천연 샘플에 대한 1H NMR이 (R)-N-숙시닐-1-페닐에탄올아미드 부분입체이성질체에 대한 것과 매치(match)되고, 이는 천연 pasc#9가 (R)-N-숙시닐-1-페닐에탄올아미드를 함유한다는 것을 가리킨다.
도 115A-B는 dasc#1를 함유하는 HPLC-강화 피. 파시피쿠스 외부-대사체 추출물 분획 (도 115A) 및 dasc#1의 합성 샘플 (도 115B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 섹션들이다. dasc#1에 대한 특징적인 크로스피크는 청색 상자인 반면, 천연 샘플 내에 존재하는 다른 대사산물로부터의 관련되지 않은 크로스피크는 적색 상자이다. 천연 샘플과 합성 샘플 간의 크로스피크의 정확한 매치로 dasc#1 구조 및 입체화학 할당이 증명되고, 피. 파시피쿠스 외부-대사체 내의 dasc#1의 존재가 확증된다.
도 116A-B는 ubas#1의 입체화학의 결정에 관련된 HPLC-MS 트레이스 (도 116A) 및 1H-NMR 스펙트럼 (도 116B)이다. 천연 ubas#1 (적색), ~95:5 비의 3-우레이도-2R-이소부티레이트 및 3-우레이도-2S-이소부티레이트를 함유하는 ubas#1 부분입체이성질체의 합성 혼합물 (청색), 및 천연 및 합성 샘플의 혼합물 (흑색 점선)의 HPLC-MS 체류 시간 (ESI-, m/z = 605에 대한 이온 크로마토그램)의 비교가 도 116A에서 제시된다. 합성 (3-우레이도-2R-이소부티레이트)-유래 ubas#1의 HPLC-체류 시간이 천연 ubas#1의 것과 매치되고, (3-우레이도-2S-이소부티레이트)-유래 ubas#1 부분입체이성질체 (*로 표지됨)와 명확하게 상이하여, 천연 ubas#1가 3-우레이도-2R-이소부티레이트 모이어티를 포함한다는 것을 가리킨다. 도 116B에 제시된 바와 같이, 합성 (3-우레이도-2R-이소부티레이트)-유래 ubas#1 (아래쪽), ubas#1를 함유하는 천연 샘플 (위쪽), 및 이러한 2가지 샘플의 1:1 혼합물 (중간)의 1H-NMR 스펙트럼의 섹션의 비교는 4가지 특징적인 메틸 이중선 (동반되는 구조에서 적색 및 청색 상자로 지시됨)의 상대 강도가 합성 ubas#1을 천연 샘플에 첨가했을 때 증가된다는 것을 나타낸다 (천연 샘플 내의 관련되지 안은 피크는 *로 표지된다). 이는 천연 ubas#1이 3-우레이도-2S-이소부티레이트가 아니라 3-우레이도-2R-이소부티레이트를 함유한다는 것을 확증한다. 천연 샘플과 합성 샘플 간의 pH 및 농도에서의 차이가 메틸 이중선의 화학적 이동에 약간 영향을 미쳐, 천연 샘플 및 합성 샘플의 혼합 시 화학적 이동 값의 작은 변화를 초래한다.
도 117A-B는 part#9의 입체화학의 결정에 관련된 HPLC-MS 트레이스이다. 양쪽 모두 ascr#9 및 part#9의 천연 혼합물 (적색), part#9의 합성 샘플 (청색), 및 천연 샘플 및 합성 샘플의 1:1 혼합물 (흑색 점선)의 HPLC-MS 체류 시간 (ESI-, m/z = 247에 대한 이온 크로마토그램)의 비교를 나타낸다. 합성 D-파라토실-4R-히드록시펜탄산이 도 117A에서 사용되었다. 이의 HPLC-체류 시간이 천연 part#9와 매치되지 않고, 이는 D-파라토실-4R-히드록시펜탄산 또는 이의 거울상이성질체가 천연 part#9일 수 없음을 가리킨다. 합성 D-파라토실-4S-히드록시펜탄산이 도 117B에서 사용되었다. D-파라토실-4S-히드록시펜탄산의 HPLC-체류 시간이 천연 part#9의 것과 매치된다. 이는 천연 part#9가 D-파라토실-4S-히드록시펜탄산 또는 이의 거울상이성질체 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산이라는 것을 가리킨다. 천연 npar#1과 D-파라토실-4S-히드록시펜탄산 또는 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산으로부터 유래된 2개의 합성 npar#1 부분입체이성질체의 NMR 스펙트럼 및 HPLC-체류 시간의 비교 (도 118A-C 참조)는 천연 part#9 및 npar#1이 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산을 기초로 한다는 것을 나타낸다.
도 118A-C는 npar#1의 입체화학의 결정에 관련된 HPLC-UV 트레이스 (도 118A-B) 및 1H-NMR 스펙트럼 (도 118C)이다. 도 118A-B는 npar#1을 함유하는 천연 샘플 (적색), npar#1의 합성 샘플 (청색), 및 천연 샘플 및 합성 샘플의 혼합물 (흑색 점선)의 HPLC-UV 체류 시간 (260 nm)의 비교를 나타낸다. L-트레오닌 및 D-크실로아데노신에 커플링된 D-파라토실-4S-히드록시펜탄산으로부터 유래된 합성 npar#1 부분입체이성질체가 도 118A에서 사용되었다. HPLC-체류 시간이 천연 npar#1의 것과 매치되지 않는다. L-트레오닌 및 D-크실로아데노신에 커플링된 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산으로부터 유래된 합성 npar#1 부분입체이성질체가 도 118B에서 사용되었다. HPLC-체류 시간이 천연 npar#1의 것과 매치된다. 도 118C에 제시된 바와 같이, L-트레오닌 및 D-크실로아데노신에 커플링된 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산으로부터 유래된 합성 npar#1 (아래쪽), 천연 npar#1 (위쪽), 및 2개의 1:1 혼합물 (중간)의 1H-NMR 스펙트럼의 섹션의 비교는 pH 및 농도에서의 변화가 3가지 특징적인 메틸 이중선 (동반되는 구조에서 적색 및 청색 상자로 지시됨)의 이동에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 그러나, 혼합 샘플에서, 새로운 피크가 나타나지 않고, 천연 샘플에서 관련되지 않은 피크와 비교하여 메틸 이중선의 상대 강도가 증가한다 (*로 표지됨). 도 118A-B에 제시된 HPLC-UV 결과와 함께, 이러한 발견은 천연 npar#1이 L-트레오닌 및 D-크실로아데노신에 커플링된 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산으로 이루어진다는 것을 나타낸다.
도 119는 HPLC-강화 피. 파시피쿠스 외부-대사체 추출물 분획 내의 pasc#12에 대한 특징적인 1H NMR 신호를 나타내는 한 쌍의 스펙트럼이다.
도 120A-B는 피. 파시피쿠스 외부-대사체 추출물 (도 120A) 및 이. 콜라이 OP50 대사체 추출물 (도 120B)의 dqfCOSY 스펙트럼 (600 MHz, 메탄올-d 4 )의 섹션들이다. 아스카로시드에 대한 특징적인 크로스피크는 청색 상자이고, 파라토시드의 것은 적색 상자이다. 2개의 스펙트럼의 비교는 피. 파시피쿠스 외부-대사체로부터 확인된 복합적인 소형 분자들이 박테리아에서 기원하지 않는다는 것을 가리킨다. 상응하여, 박테리아 추출물의 HPLC-MS 분석이 피. 파시피쿠스 외부-대사체 샘플에서 검출된 피크 중 어느 것도 나타내지 않았다.
도 121은 에탄올, ascr#1, 또는 npar#1이 투여된 피. 파시피쿠스에서의 다우어 형성의 그래프이고, ascr#1이 매우 높은 농도 (20 μM)에서도 피. 파시피쿠스에서 다우어 형성을 유도하지 않는다는 것을 실연한다.. npar#1 (1 μM)이 피. 파시피쿠스 다우어 형성에 대한 양성 대조군으로서 사용되었다.
도 122A-E는 확인된 대사산물의 기능 검정법 및 진화적으로 보존된 경로에 대한 피. 파시피쿠스에서의 소형 분자 신호전달의 관련성에 관한 것이다. 도 122A-D는 성체 표현형 유연성 (입 형태)의 조절을 나타내는 그래프이다. 도 122A 및 122C 및 활성 피. 파시피쿠스 외부-대사체 분획의 주성분의 합성 샘플에 의한 다우어 유도 (도 122B 및 122D). 모든 실험을 각각의 처리에 대해 삼중으로 수행하였다. 먼저 화합물을 1 μM 농도에서 검정하였다 (*P < 0.01 및 **P < 0.001) (도 122A-B). 이어서, 1 μM 농도에서 유의한 활성이 있는 화합물 (P < 0.01)을 광범위한 농도에서 테스트하였다 (도 122C-D). 도 122E에 도해된 바와 같이, 선충에서의 소형 분자 신호전달이 1차 대사를 DAF-16/FOXO 및 핵 호르몬 수용체 (NHR) DAF-12, 비타민 D 및 간 X 수용체 상동체가 포함되는 진화적으로 보존된 전사 인자에 연결하는 중심적인 위치를 차지한다. npar#1은 다우어 정지 (DAF-12 및 DAF-16를 통한 신호전달 양쪽 모두를 필요로 함)를 유도하는 반면, dasc#1은 성체 형태학 (DAF-12를 또한 필요로 하지만, DAF-16 독립적임)을 조절한다.
도 123A-E는 daf -22 돌연변이체-특이적 VLCA인 7-11의 확인에 관한 것이고, 이는 mvaDANS 및 이어지는 HPLC-MS 분석을 통해 확인되었다. 도 123A는 daf -22 돌연변이체 및 야생형 대사체에 대한 HPLC-MS 스펙트럼을 나타낸다. HPLC-MS 분석에서, 야생형에서는 부재하는 긴 사슬 아스카로시드 및 에탄올아미드가 daf -22 대사체에서 확증되었다. 이러한 대사산물들의 구조가 도 123B에서 제시된다. 도 123C는 daf -22-상향조절 아스카로실메틸케톤의 정량적인 분포를 나타내는 그래프이다. 도 123D는 야생형 및 다양한 돌연변이체의 대사체에서의 EPEA 생산의 그래프이다. maoc-1, dhs -28, 및 daf -22에서의 돌연변이가 EPEA 생산을 크게 감소시켰고, daf -22(m130) 배양물에 아스카로시드 (2.5 μM ascr#3 및 ascr#9)를 첨가하는 것은 EPEA 생산을 구조하지 않는다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 도 123E는 과산화소체 β-산화 및 엔도카나비노이드 생합성의 상호작용을 도해하는 개략도이다. daf-22의 돌연변이는 긴 사슬 아스카로시드 CoA 에스테르의 프로세싱을 폐지하고, 이러한 에스테르가 에탄올아미드로 전환되는 것이 감소된 EPEA 생산 (13)과 연관되는데, 포스파티딜에탄올아민 풀의 결핍으로 인해서일 것이다.
도 124는 야생형 및 다양한 돌연변이체에서의 AEA 생산의 그래프이다. maoc-1, dhs -28, 및 daf -22의 돌연변이는 AEA 생산을 크게 감소시키는 한편, acox -1의 돌연변이는 AEA 생산을 약간 감소시킨다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001.
도 125A-B는 daf -22 돌연변이체에서 상향조절된 대사산물 및 하향조절된 대사산물의 확인에 관한 것이다. mvaDANS의 개략도가 도 125A에서 제시된다. 주성분 분석(Principal Component Analysis) (PCA)에서, PC 1에서는 양쪽 daf -22 돌연변이체 데이터 세트 (적색 및 갈색 점)로부터 4개의 야생형 데이터 세트 (청색 점)가 분리된 반면, PC2에서는 2개의 daf -22 대립유전자가 분리된다. 역투영(back projection) (왼쪽 아래)에서, 크로스피크의 색조는 PC 1 로딩 계수에 상응한다; 청색 피크는 2개의 daf -22 돌연변이체 균주에서 하향조절된 신호를 나타내고, 적색 피크는 상향조절된 신호를 나타낸다. 실제 스펙트럼에 대해 도 130 참조. 도 125B는 daf -22-특이적 크로스피크의 수동 분석으로부터 추론된 부분적인 구조를 나타내고, 이는 α-메틸 분지 지방산, 메틸 케톤, 및 β-케토 지방산 유도체를 시사한다.
도 126은 4개의 씨. 엘레간스 야생형 외부-대사체 추출물 중 하나의 dqfCOSY 스펙트럼의 섹션 (0.85-4.80 ppm)이다.
도 127은 4개의 daf -22(m130) 외부-대사체 추출물 중 하나의 dqfCOSY 스펙트럼의 섹션 (0.85-4.80 ppm)이다.
도 128A-D는 어떻게 mvaDANS가 자동으로 스펙트럼 크로스피크를 확인하는지 및 통계적으로 유래되는 슈도(pseudo)-스펙트럼을 생성하는지를 나타내는 일련의 스펙트럼이다. 도 128A는 씨. 엘레간스 야생형 대사체의 상-민감성 dqfCOSY 스펙트럼의 1-3 ppm 영역이다. 도 128B는 도 128A에 제시된 것과 동일한, 그러나 자동 비닝(binning) 전에 규모 모드로 프로세싱된 NMR 스펙트럼이다. 도 128C는 mvaDANS로 확인된 빈(bin) 영역의 경계와 함께 플롯팅된 도 128A-B로부터의 NMR 스펙트럼의 컨투어(contour) 플롯이다. 도 128D는 씨. 엘레간스 야생형/daf -22 비교 NMR 데이터세트의 주성분 1로부터 유래된 배경-영사 슈도-스펙트럼이다. 크로스피크 색상은 영역 빈의 표준화된 PC 1 로딩 계수를 가리킨다.
도 129는 PLS 성분 점수의 그래프이다. PLS 성분 점수는 4개의 야생형 배양물 (적색 점)을 8개의 daf -22 배양물 (청색 점)로부터 분리시킨다.
도 130A-G는 어떻게 PCA가 야생형 및 2개의 daf -22 돌연변이체 대립유전자를 구별하는 크로스피크를 확인하는지를 나타낸다. 도 130A에 제시된 바와 같이, 규모 모드 dqfCOSY 스펙트럼 상으로의 PC 1 로딩의 역투영으로, 돌연변이체 스펙트럼에 대해 야생형 스펙트럼에서 증가 (적색) 또는 감소 (청색)된 크로스피크가 확인된다. 도 130B-C는 mvaDANS 작업 흐름 및 공지된 화합물의 확인을 통한 방법 평가에 대한 예를 제공한다. 도 130B의 야생형 특이적 적색 크로스피크에 상응하는 도 130C에 제시된 상 민감성 dqfCOSY-스펙트럼의의 크로스피크의 분석에서, 생합성이 daf -22 의존적인 것으로 기존에 나타난 공지된 아스카로시드 ascr#5가 드러났다. 유사하게, 도 130A에서의 기타 야생형 특이적 (적색) 신호들 대부분이 공지된 아스카로시드 페로몬 중 하나에 할당될 수 있다. 도 129를 또한 참조한다. 도 130D-F는 α-메틸 분지 지방산, 메틸 케톤, 및 β-케토 지방산 유도체를 시사하는 daf-22-특이적 크로스피크의 분석으로부터 추측된 부분적인 구조를 나타낸다. 도 130G는 daf -22에 대해 엄격하게 특이적이지 않은 대사산물 (추정 메티오닌 유도체)에 대한 예를 제공한다. 이러한 화합물은 daf -22 돌연변이체에서 상향조절되지만, 야생형에 또한 존재한다.
도 131은 NMR 스펙트럼이다. PCA로부터의 결과 (도 123)와 대부분 매치되는, 1 성분 모델 + 4× 교차 확인으로부터의 PLS-DA 예보물의 역투영 . 야생형에 대한 더 많은 개수의 복제물을 사용하여 더욱 유의한 PLS-DA 결과가 달성될 것이다
도 132는 외부-대사체 추출물에 대한 이. 콜라이 OP50의 dqfCOSY의 섹션 (0.85-4.80 ppm)이다.
도 133은 씨. 엘레간스 내의 아스카로시드를 기초로 하는 신호전달 분자의 예시적인 구조 및 생물학적 기능의 목록을 나타낸다.
도 134는 과산화소체 β-산화 효소 ACOX-1, MAOC-1, DHS-28, 및 추정 3-케토아실-CoA 티올라제 DAF-22의 역할을 나타내는, 아스카로시드 측쇄의 과산화소체 생합성에 대한 모델의 개략도이다.
도 135A-B는 mvaDANS에 의해 확인된 차별적인 크로스피크에 대한 예를 나타내는 스펙트럼이다. 도 135A는 야생형 스펙트럼에서 검출된 ascr#2-크로스피크를 나타낸다. 도 135B는 도 128로부터의 daf -22(m130) 스펙트럼에서 검출된 β-케토 에탄올아미드 및 메틸케톤 크로스피크를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
선충에서 신호전달 분자로서 작용하여 생식, 발달, 다우어 형성, 응집, 유인, 반발, 분산, 저지, 급식, 숙주 발견, 및/또는 숙주 침습이 포함되는 선충 거동을 조절하는 화합물들의 클래스가 본원에서 개시된다.
정의
본원에서 사용되는 경우에, 하기의 용어들은 달리 지시되지 않는 한 하기의 의미를 지니는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 의미가 동일하다. 본원에서의 용어에 대해 다수의 정의가 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한 이러한 섹션에서의 것들이 우세하다.
"알킬"이라는 용어는 선형, 분지형 또는 고리형 탄화수소 구조 또는 이의 조합일 수 있는 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 대표적인 알킬 기는 탄소 원자가 24개 이하인 것, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, t-부틸, n-펜틸, i-펜틸, n-헥실 등이다. 저급 알킬은 사슬 내에 약 1개 내지 약 6개의 탄소 원자가 있는 알킬 기를 지칭한다. 분지형 알킬은 하나 이상의 저급 알킬 기 예컨대 메틸, 에틸, 또는 프로필이 선형 알킬 사슬에 부착되는 것을 의미한다.
알킬이 선형, 분지형 또는 고리형 탄화수소 구조 및 이의 조합을 포함하도록 의도된다는 표현은 "알킬" 기가 선형 및 고리형 구조 요소의 하기의 조합
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(및 유사한 조합)을 또한 포함한다는 것을 의미한다.
"알케닐"은 인접한 탄소 원자들 사이의 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 상기 정의된 바와 같은 알킬을 의미한다. 알케닐에는 시스 및 트랜스 이성질체 양쪽 모두가 포함된다. 분지형 알케닐은 하나 이상의 저급 알킬 기 예컨대 메틸, 에틸, 또는 프로필이 선형 알케닐 사슬에 부착되는 것을 의미한다. 대표적인 직쇄 및 분지형 알케닐은 사슬 내에 약 2개 내지 약 6개의 탄소 원자가 있는 것, 예를 들어, 에틸레닐, 프로필레닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 이소부틸레닐, 1-펜테닐, 2-펜테닐, 3-메틸-1-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 2,3-디메틸-2-부테닐 등이다.
"할로겐"이라는 용어는 플루오로, 클로로, 브로모, 및 아이오도를 지칭한다.
"할로알킬"이라는 용어는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 상기 기술된 바와 같은 분지형 또는 직쇄 알킬을 지칭한다.
"할로알케닐"이라는 용어는 하나 이상의 할로겐으로 치환된 상기 기술된 바와 같은 분지형 또는 직쇄 알케닐을 지칭한다.
"아릴"이라는 용어는 6개 내지 약 19개의 탄소 원자, 예를 들어, 약 6개 내지 약 10개의 탄소 원자의 방향족 단일고리형 또는 다중고리형 (다고리형) 고리 시스템을 의미하고, 아릴알킬 기를 포함한다. 대표적인 아릴 기에는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 페난트레닐, 안트라아세닐, 플루오레닐, 피레닐, 트리페닐레닐, 크리세닐, 및 나프타세닐과 같은 기가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"아릴알킬"이라는 용어는 아릴 고리에 부착된 알킬 잔기를 의미한다. 예는 벤질, 페네틸 등이다.
"헤테로아릴"이라는 용어는 고리 시스템 내의 원자들 중 하나 이상이 탄소 이외의 원소(들), 예를 들어, 질소, 산소 및/또는 황인 약 5개 내지 약 19개의 고리 원자, 예를 들어, 약 5개 내지 약 10개의 고리 원자의 방향족 단일고리형 또는 다중고리형 고리 시스템을 의미한다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 헤테로아릴 고리는 모두 탄소인 이의 대응물보다 덜 방향성인 특성을 지닌다. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, "헤테로아릴" 기는 어느 정도의 방향족 특성만 있을 필요가 있다. 예를 들어, 다중고리형 고리 시스템의 경우에, 고리 시스템이 "헤테로아릴"로 정의되기 위해 고리 중 하나만이 방향족일 필요가 있다. 예시적인 헤테로아릴은 약 5개 내지 6개의 고리 원자를 함유한다. 헤테로아릴 앞의 접두사 아자, 옥사, 티아, 또는 티오는 각각 적어도 질소, 산소 또는 황 원자가 고리 원자로서 존재한다는 것을 의미한다. 헤테로아릴 고리 내의 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있다; 질소는 임의로 4급화될 수 있다. 대표적인 헤테로아릴에는 푸리닐, 피리딜, 2-옥소-피리디닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 피라지닐, 트리아지닐, 푸라닐, 피롤릴, 티오페닐, 피라졸릴, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아졸릴, 옥사디아졸릴, 티아디아졸릴, 테트라졸릴, 인돌릴, 이소인돌릴, 벤조푸라닐, 벤조티오페닐, 인돌리닐, 2-옥소인돌리닐, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로벤조티오페닐, 인다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조옥사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조트리아졸릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 퀴녹살리닐 등이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
"시클로알킬" 및 "시클로알케닐"이라는 용어는 약 3개 내지 약 8개의 탄소 원자, 예를 들어, 약 5개 내지 약 7개의 탄소 원자의 비-방향족, 포화 (시클로알킬) 또는 불포화 (시클로알케닐), 단일- 또는 다중-고리형 고리 시스템을 지칭한다. 예시적인 시클로알킬 및 시클로알케닐 기에는 비제한적으로 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 노르보닐, 시클로프로페닐, 시클로부테닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로페닐, 안티-바이시클로프로판, syn-트리시클로프로판 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 경우에, "헤테로고리" 또는 "헤테로시클릴"은 포화, 불포화 또는 방향족이고, 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1개 내지 5개의 헤테로 원자로 이루어진 안정적인 3- 내지 18-원 고리 (라디칼)을 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로고리은 단일고리형, 이고리형 또는 다고리형 고리 시스템일 수 있고, 이는 융합, 가교 또는 스피로 고리 시스템 (상기 헤테로고리 중 임의의 것이 벤젠 고리에 융합된 이고리형 고리가 포함됨)을 포함할 수 있다. 헤테로고리 내의 질소, 탄소, 또는 황 원자가 임의로 산화될 수 있고; 질소 원자가 임의로 4급화될 수 있으며; 고리가 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 헤테로고리는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자를 통해 부착될 수 있다. 헤테로고리에는 하기에 정의된 바와 같은 헤테로아릴이 포함된다. 이같은 헤테로고리의 예로는 비제한적으로 모르폴리닐, 피롤리디노닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페리지닐, 히단토이닐, 발레로락타밀, 옥시라닐, 옥세타닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로피리디닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로피리미디닐, 테트라히드로티오페닐, 테트라히드로티오피라닐 등이 포함된다. 추가적인 헤테로고리 및 헤테로아릴이 문헌 [Katritzky et al., eds., Comprehensive Heterocyclic Chemistry: The Structure, Reactions, Synthesis and Use of Heterocyclic Compounds, Vol. 1-8, Pergamon Press, N.Y. (1984)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술되어 있다.
"아실"이라는 용어는 카르보닐 관능기를 통해 모체 구조에 부착된, 선형, 분지형 또는 고리형 구성, 포화, 불포화 또는 방향족 및 이의 조합의 1개 내지 8개의 탄소 원자의 기를 지칭한다. 모체에 대한 부착 지점이 카르보닐에 잔존하는 한 아실 잔기 내의 하나 이상의 탄소가 질소, 산소 또는 황으로 교체될 수 있다. 예로는 아세틸 (Ac), 벤조일, 프로피오닐, 이소부티릴, t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 등이 포함된다.
"아미노산"이라는 용어는 아미노산 카르복실 기와 또 다른 분자의 아미노 기의 반응을 통한 아미드 결합 형성 후에 유지되는 아미노산의 단편을 지칭한다. 아미노산은 D- 또는 L-형상일 수 있다. 적절한 아미노산에는 α-아미노산, β-아미노산, γ-아미노산, δ-아미노산, 및 ε-아미노산이 포함되고, 천연 아미노산 (즉, 천연 단백질에서 발견되는 20개의 아미노산이 포함되는, 생물학적 시스템에서 발견되는 것들)뿐만 아니라 이같은 아미노산의 천연-발생 변이체, 뿐만 아니라 당업자에게 공지된 합성 아미노산 및 이의 유사체가 또한 포함된다. 예시적인 아미노산에는 20개의 천연 아미노산, 4-히드록시프롤린, 히드록시라이신, 데모신, 이소데모신, 3-메틸히스티딘, 노르발린, 베타-알라닌, 감마-아미노부티르산, 시트룰린, 호모시스테인, 호모세린, 오르니틴, 및 메티오닌 술폰이 포함된다.
"피리미딘"이라는 용어는 2개의 탄소 원자가 2개의 질소 원자로 교체된 벤젠 고리 (디아진)를 함유하는 헤테로방향족 화합물을 지칭한다. 예를 들어, 위치 1 및 3의 탄소원자가 질소 원자로 교체된 하기의 모이어티가 피리미딘으로 간주된다:
Figure pct00007
. 이러한 용어는, 본원에서 정의되는 경우와 같이, 이의 이성질체 형태의 디아진, 예컨대 위치 1 및 2에 질소 원자가 있는 피리다진; 및 위치 1 및 4에 질소 원자가 있는 피라진을 또한 포함한다. "피리미딘"이라는 용어는 이의 유사체 및 유도체를 또한 일반적으로 포함한다. 예를 들어, 천연 핵염기, 사이토신 (C), 티민 (T), 및 우라실 (U)은 피리미딘 유도체이다. "퓨린"이라는 용어는 이미다졸 고리에 융합된 피리미딘 고리를 함유하는 헤테로방향족 화합물을 지칭한다. "퓨린"이라는 용어는 이의 유사체 및 유도체를 또한 일반적으로 포함한다. 예를 들어, 천연 핵염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G). 천연 발생 퓨린 유도체의 기타 예는 하이포잔틴, 잔틴, 테오브로민, 카페인, 요산, 및 이소구아닌이다. 예시적인 퓨린 및 피리미딘에는 미국 특허 번호 3,687,808; 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859]; [Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]; 및 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 것들이 포함된다.
"핵염기"라는 용어는 모든 천연 및 합성 핵염기, 뿐만 아니라 유니버설(universal) 핵염기를 포함한다. 전형적인 천연 핵염기에는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 우라실 및 티민이 포함된다. 합성 핵염기에는 전형적으로 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 누불라린, 이소구아니신, 또는 투베르시딘이 포함된다. 본원에서 사용되는 경우에, 유니버설 핵염기는 1개를 초과하는 천연 핵염기를 치환할 수 있는 임의의 변형, 미변형, 천연 발생 또는 비-천연 발생 핵염기이다. 유니버설 염기는 전형적으로 질소 원자를 함유할 수 있거나 함유하지 않을 수 있는 방향족 고리 모이어티를 함유하고, 일반적으로 방향족 고리 스태킹(stacking)을 사용하여 올리고뉴클레오티드 듀플렉스를 안정화시킨다. 일부 유니버설 염기는 유니버설 뉴클레오티드가 제조되도록 펜토스 당의 C-1' 탄소에 공유결합으로 부착될 수 있다. 일부 유니버설 염기는 또 다른 핵염기와 특이적으로 수소 결합하지 않는다. 일부 유니버설 염기는모든 천연 발생 핵염기와 염기 쌍을 형성한다. 일부 유니버설 염기는 소수성 스태킹에 의해 동일한 핵산 가닥 상의 인접한 뉴클레오티드 염기와 상호작용할 수 있다. 예시적인 유니버설 핵염기에는 2,4-디플루오로톨루엔, 니트로피롤릴, 니트로인돌릴, 8-아자-7-데아자아데닌, 4-플루오로-6-메틸벤지미다졸, 4-메틸벤지미다졸, 3-메틸 이소카르보스티릴릴, 5-메틸 이소카르보스티릴릴, 3-메틸-7-프로피닐 이소카르보스티릴릴, 7-아자인돌릴, 6-메틸-7-아자인돌릴, 이미디조피리디닐, 9-메틸-이미디조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이소카르보스티릴릴, 7-프로피닐 이소카르보스티릴릴, 프로피닐-7-아자인돌릴, 2,4,5-트리메틸페닐, 4-메틸리놀릴, 4,6-디메틸인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라아세닐, 페난트라아세닐, 피레닐, 스틸벤질, 테트라세닐, 펜타세닐, 및 이의 구조적 유도체가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
적절한 핵염기에는 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌, 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신, 디히드로우라실, 3-데아자-5-아자사이토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 사이토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-디메틸아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트리아졸, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 3-메틸사이토신, 5-메틸사이토신, N4-아세틸 사이토신, 2-티오사이토신, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐아데닌, N-메틸구아닌, 및 O-알킬화 염기가 포함됨)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 추가적인 퓨린 및 피리미딘에는 미국 특허 번호 3,687,808; 문헌 [Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859]; [Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]; 및 [Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)에 개시된 것들이 포함된다.
"뉴클레오시드"라는 용어는 1'-위치에서 펜토스에 연결된 본원에서 정의된 바와 같은 핵염기를 포함하는 화합물을 지칭한다. 핵염기가 퓨린 유도체 또는 유사체인 경우, 펜토스는 전형적으로 퓨린 유도체 또는 유사체의 9-위치에서 핵염기에 부착된다. 핵염기가 피리미딘 유도체 또는 유사체인 경우, 펜토스는 전형적으로 피리미딘의 1-위치에서 핵염기에 부착된다 (예를 들어, 문헌 [Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, 1992] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 뉴클레오시드가 본원에서의 R3, R4, 또는 R5에 존재하는 경우, 뉴클레오시드는 핵염기 또는 펜토스 상의 임의의 원자를 통해 이웃 원자(들)에 연결될 수 있다.
일반적으로 "지방산"이라는 용어는 지방족 꼬리 (사슬)가 있는 카르복실산을 지칭한다. 이러한 지방족 사슬은 길이가 탄소 원자 약 2개 내지 약 36개일 수 있다. 지방산은 포화, 불포화 또는 다불포화일 수 있다. 이러한 지방족 사슬은 선형 또는 분지형 사슬일 수 있다. "지방산"이라는 용어는 하나 이상의 상이한 지방산 유도체, 또는 지방산 유도체들의 혼합물을 포함할 수 있는 "지방산 유도체"를 지칭하도록 본원에서 사용될 수 있다. 예시적인 지방산에는 불포화 지방산, 포화 지방산, 및 이산; 카르복실산 관능기가 있는 아스카로시드의 모노-, 디-, 및 트리-글리세리드; 히드록시산, ω 히드록시산, ω-1 히드록시신, 디-히드록시 지방산 (예를 들어, 오메가- 또는 오메가-1 히드록실화된 디히드록시 지방산, 뿐만 아니라 알파- 또는 베타-히드록실화 지방산)이 포함된다.
"당"이라는 용어는 산소, 질소 또는 황 원자가 각각의 탄소 원자에 결합되어 있는 5개 이상의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 고리형일 수 있음)가 있는 하나 이상의 모노사카라이드 단위로 이루어진 탄수화물 자체이거나, 또는 산소, 질소 또는 황 원자가 각각의 탄소 원자에 결합되어 있는 5개 이상의 탄소 원자 (선형, 분지형 또는 고리형일 수 있음)가 각각 있는 하나 이상의 모노사카라이드 단위로 이루어진 탄수화물 모이어티가 화합물의 일부로서 있는 화합물인 화합물을 지칭한다. 대표적인 당에는 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 및 약 4-9개의 모노사카라이드 단위를 함유하는 올리고사카라이드, 및 폴리사카라이드 예컨대 전분, 글리코겐, 셀룰로스, 및 폴리사카라이드 검이 포함된다. 예시적인 모노사카라이드에는 C5 이상 (예를 들어, C5-C8 또는 C5-C6)의 당이 포함되고, 디사카라이드 및 트리사카라이드에는 2개 또는 3개의 모노사카라이드 단위 (예를 들어, C5-C8 또는 C5-C8)가 있는 당이 포함된다.
"모노사카라이드"라는 용어는 알데히드 (알도스) 또는 케톤 (케토스) 형태의 3-10개의 탄소 원자의 사슬이 있는 당 분자를 의미한다. 적절한 모노사카라이드에는 천연 발생 및 합성 모노사카라이드 양쪽 모두가 포함된다. 적절한 모노사카라이드에는 트리오스, 예컨대 글리세로스 및 디히드록시아세톤; 텍스트로스 예컨대 에리트로스 및 에리트룰로스; 펜토스, 예컨대 크실로스, 아라비노스, 리보스, 크실룰로스, 리불로스; 메틸 펜토스 (6-데옥시헥소스), 예컨대 람노스 및 푸코스; 헥소스, 예컨대 아스카릴로스, 글루코스, 만노스, 갈락토스, 프룩토스 및 소르보스; 및 헵토스, 예컨대 글루코헵토스, 갈라만노헵토스, 세도헵툴로스, 및 만노헵툴로스가 포함된다. 예시적인 모노사카라이드에는 알로스, 알트로스, 아라비노스, 클라디노스, 에리트로스, 에리트룰로스, 프룩토스, D-푸시톨, L-푸시톨, 푸코스마인, 푸코스, 푸쿨로스, 갈락토스아민, D-갈락토사미니톨, N-아세틸-갈락토사민, 갈락토스, 글루코사민, N-아세틸-글루코사민, 글루코사미니톨, 글루코스, 글루코스-6-포스페이트, 글루코스 글리세르알데히드, L-글리세로-D-만노스-헵토스, 글리세롤, 글리세론, 굴로스, 이도스, 릭소스, 만노사민, 만노스, 만노스-6-포스페이트, 사이코스, 퀴노보스, 퀴노바사민, 람니톨, 람노사민, 람노스, 리보스, 리불로스, 세도헵툴로스, 소르보스, 타가토스, 탈로스, 타르타르산, 트레오스, 크실로스, 및 크실룰로스의 라디칼이 포함된다. 모노사카라이드는 D- 또는 L-형상일 수 있다. 본원에서 사용되는 전형적인 모노사카라이드는 헥소스이다.
모노사카라이드는 추가로 데옥시 당 (알콜성 히드록시 기가 수소로 교체됨), 아미노 당 (알콜성 히드록시 기가 아미노 기로 교체됨), 티오 당 (알콜성 히드록시 기가 티올로 교체되거나, 또는 C=O가 C=S로 교체되거나, 또는 고리 형태의 고리 산소가 황으로 교체됨), 셀레노 당, 텔룰로 당, 아자 당 (고리 탄소가 질소로 교체됨), 이미노 당 (고리 산소가 질소로 교체됨), 포스파노 당 (고리 산소가 인으로 교체됨), 포스파 당 (고리 탄소가 인으로 교체됨), C-치환 모노사카라이드 (비-말단 탄소 원자의 수소가 탄소로 교체됨), 불포화 모노사카라이드, 알디톨 (카르보닐 기가 CHOH 기로 교체됨), 알돈산 (알데히드성 기가 카르복시 기로 교체됨), 케토알돈산, 유론산, 알다르산 등일 수 있다. 아미노 당에는 아미노 모노사카라이드, 예컨대 갈락토사민, 글루코사민, 만노사민, 푸코사민, 퀴노바사민, 뉴라민산, 무람산, 락토스디아민, 아소사민, 바실로사민, 다우노사민, 데소사민, 포로사민, 가로사민, 카노사민, 칸소사민, 미카미노스, 미코사민, 페로사민, 뉴모사민, 푸르푸로사민, 로도사민이 포함된다. 이러한 모노사카라이드 등이 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
"디사카라이드", "트리사카라이드" 및 "폴리사카라이드"라는 용어는 아베쿠오스, 아크라보스, 아미세토스, 아밀로펙틴, 아밀로스, 아피오스, 아르카노스, 아스카릴로스, 아스코르브산, 보이비노스, 셀로비오스, 셀로트리오스, 셀룰로스, 카코트리오스, 칼코스, 키틴, 콜리토스, 시클로덱스트린, 시마로스, 덱스트린, 2-데옥시리보스, 2-데옥시글루코스, 디기노스, 디기탈로스, 디기톡소스, 에발로스, 에베미트로스, 프룩토올로고사카라이드, 갈토-올리고사카라이드, 겐티아노스, 겐티오비오스, 글루칸, 글루코겐, 글리코겐, 하마멜로스, 헤파린, 이눌린, 이소레보글루코세논, 이소말토스, 이소말토트리오스, 이소파노스, 코지비오스, 락토스, 락토사민, 락토세디아민, 라미나라비오스, 레보글루코산, 레보글루코세논, β-말토스, 말트리오스, 만난-올리고사카라이드, 만니노트리오스, 멜레지토스, 멜리비오스, 무람산, 미카로스, 미시노스, 뉴라민산, 니게로스, 노지리마이신, 모비오스, 올레안드로스, 파노스, 파라토스, 플란테오스, 프리메베로스, 라피노스, 로디노스, 루티노스, 사르멘토스, 세도헵툴로스, 솔라트리오스, 소포로스, 스타키오스, 스트렙토스, 수크로스, α, α-트레할로스, 트레할로사민, 투라노스, 티벨로스, 크실로비오스, 움벨리페로스 등의 라디칼을 포괄한다. 추가로, "디사카라이드", "트리사카라이드" 및 "폴리사카라이드 등이 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다. 디사카라이드에는 아미노 당 및 이의 유도체, 특히 C-4' 위치에서 유도체화된 미카미노스 또는 C-6' 위치에서 유도체화된 4 데옥시-3-아미노-글루코스가 포함된다.
본원에서 사용된 "다고리형" 또는 "다중고리형"이라는 용어는 융합형, 가교형 또는 스피로 고리를 포함하지만 이에 한정되지 않는 2개 이상의 고리가 있는 분자 구조를 가리킨다.
상기 "알킬", "알케닐","시클로알킬", 및 "시클로알케닐" 라디칼, 뿐만 아니라 상기 아릴, 헤테로시클릴, 또는 헤테로아릴 기의 고리 시스템은 임의 치환될 수 있다.
"치환된" 또는 "임의 치환된"이라는 용어는 기의 각각의 치환가능한 원자에서 기에 치환기 (단일 원자 상의 1개를 초과하는 치환기 포함)가 있을 수 있고, 단 지정된 원자의 정상적인 원자가가 초과되지 않으며, 각각의 치환기의 신원은 서로 독립적이라는 것을 가리키도록 사용된다. 본 발명에 따르면, 각각의 잔기의 3개까지의 H 원자가 알킬, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 히드록시, 알콕시, 아실, 카르복시, 카르보알콕시 (알콕시카르보닐로 또한 지칭됨), 카르복사미도 (알킬아미노카르보닐로 또한 지칭됨), 시아노, 카르보닐, 니트로, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 메르캅토, 알킬티오, 술폭시드, 술폰, 아실아미노, 아미디노, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 아릴옥시, 헤테로아릴옥시, 퓨린 또는 피리미딘 또는 이의 유사체 또는 유도체 ("핵염기"에서 정의된 바와 같음), 또는 당 예컨대 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드 ("모노사카라이드"에서 정의된 바와 같음)로 교체될 수 있다. "치환되지 않은" 원자는 이의 원자가에 의해 좌우되는 수소 원자를 모두 보유한다. 치환체가 케토 (즉, =O)이면, 원자 상의 2개의 수소가 교체된다. 치환체 및/또는 변수들의 조합은 이같은 조합이 안정적인 화합물을 초래하는 경우에만 허용가능하다; "안정적인 화합물" 또는 "안정적인 구조"는 반응 혼합물로부터 유용한 정도의 순도로의 정제 및 효율적인 작용제로의 제형을 견디도록 충분히 강건한 화합물을 의미한다.
일부 치환체의 특성화에서, 특정 치환체들이 조합되어 고리를 형성할 수 있다. 달리 언급되지 않는 한, 이같은 고리들이 다양한 불포화 정도 (완전 포화 내지 완전 불포화)를 나타낼 수 있고, 상기 기술된 바와 같은 다른 치환체 기로 치환될 수 있는 것으로 의도된다.
본원에 기술된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 따라서 거울상이성질체, 부분입체이성질체, 및 기타 입체이성질체 형태를 야기할 수 있다. 각각의 키랄 중심은 절대 입체화학의 관점에서 (R)- 또는 (S)-로 규정될 수 있다. 본 발명은 모든 이같은 가능한 이성질체, 뿐만 아니라 이들의 혼합물 (라세미 형태 및 광학적으로 순수한 형태 포함)을 포함하도록 의도된다. 광학적으로 활성인 (R)- 및 (S)-, (-)- 및 (+)-, 또는 (D)- 및 (L)-이성질체는 키랄 신톤(synthon) 또는 키랄 시약을 사용하여 제조될 수 있거나, 또는 통상적인 기술을 사용하여 분할될 수 있다. 본원에 기술된 화합물이 올레핀계 이중 결합 또는 기타 기하학적 비대칭 중심을 함유하는 경우, 달리 상술되지 않으면, 이러한 화합물이 E 및 Z 기하 이성질체 양쪽 모두를 포함하는 것으로 의도된다. 유사하게, 모든 토토머 형태가 포함되도록 또한 의도된다. 본원에서 나타나는 임의의 탄소-탄소 이중 결합의 형상은 편리를 위해서만 선택되고, 특정 형상을 지정하도록 의도되지 않는다; 따라서, 본원에서 트랜스로 임의로 기술되는 탄소-탄소 이중 결합은 Z, E, 또는 임의 비율의 2가지의 혼합물일 수 있다.
"본 발명의 화합물"이라는 용어 및 등가의 표현은 달리 상술되지 않는 한 전구약물, 제약상 허용되는 염, 산화물, 용매화물, 예를 들어 수화물, 및 이러한 화합물의 내포 착물 (정황적으로 허용되는 경우), 뿐만 아니라 임의의 입체이성질체 형태, 또는 임의 비율의 임의의 이같은 형태의 이러한 화합물의 혼합물을 포괄하도록 의도된다. 내포 착물은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed. 1:176-177 (1995)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술되어 있다. 가장 통상적으로 사용되는 내포 착물은 시클로덱스트린과의 내포 착물이고, 천연 및 합성의 모든 시클로덱스트린 착물이 청구항에 명확하게 포함된다. 따라서, 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 본원에서 기술된 바와 같은 화합물 (제약 조성물, 치료 방법, 및 화합물 자체의 정황에서의 것이 포함됨)이 염 형태로서 제공된다. 유사하게, 중간체 자체가 청구되든지 또는 그렇지 않든지와 관계 없이, 중간체에 대한 언급은 이의 염 및 용매화물 (정황적으로 허용되는 경우)을 포괄하도록 의도된다. 명확성을 위해, 정황이 허용하는 경우의 특정 예들이 때때로 문맥에서 지시되지만, 이러한 예들은 순수하게 설명적이고, 정황에서 허용되는 경우에 다른 예들을 배제하도록 의도되지 않는다.
본원에 개시된 화합물의 임의의 염기성 질소-함유 기의 "4급화"가 또한 구상된다. 염기성 질소는 저급 알킬 할라이드, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 술페이트가 포함되는 디알킬 술페이트; 장쇄 할라이드 예컨대 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오다이드; 및 벤질 및 페네틸 브로마이드가 포함되는 아르알킬 할라이드가 예를 들어 포함되는 당업자에게 공지된 임의의 작용제로 4급화될 수 있다. 수용성 또는 유용성 또는 분산성 생성물이 이같은 4급화로 수득될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 하기 화학식 I의 단리된 화합물이고:
[화학식 I]
Figure pct00008
[식 중,
R1은 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R1'은 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R2는 하기 화학식의 모이어티이고:
Figure pct00009
{식 중
각각의 R1은 독립적으로 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이고
(여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
《여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다》>;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
n1, n2, 및 n3은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수이고;
n4는 1 내지 30의 정수이고;
n1, 각각의 n2, 및 각각의 n3의 합계는 1 내지 30이다};
R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R5에 연결되는 결합이고
{여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다)};
각각의 R5는 독립적으로 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이다
{여기서
R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
<여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다>);
R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
(여기서
각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
n4는 1 내지 30의 정수이다)}];
단, 이러한 화합물이 ascr#1, ascr#2, ascr#3, ascr#4, ascr#5, ascr#6.1, ascr#6.2, ascr#7, ascr#8, ascr#12, ascr#19, ascr#21, ascr#23, ascr#25, bhas#24, bhas#26, bhas#28, bhas#30, 또는 icas#9이 아닌 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 이러한 측면의 한 실시양태는 R1이 H, 알킬 (예를 들어, -CH3), 또는 알케닐이고; R'이 부재하거나 H인 화학식 I의 화합물이다. 알킬 또는 알케닐은 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R3 및 R4가 각각 독립적으로 H, -C(O)R8, 또는 탄수화물, 예컨대 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드 (예를 들어, 헥소스, 예컨대 글리코실)인 화학식 I의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 적절한 화합물에는, 예를 들어, 하기 화학식 I'의 화합물이 포함되고:
[화학식 I']
Figure pct00010
예를 들어, R3이 H 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드인 것; 및 R4가 H 또는 -C(O)R8인 것이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R5가 -OH, -NHR6, -OCHR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 알킬, 또는 탄수화물, 예컨대 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드인 화학식 I의 화합물이다. 알킬 또는 탄수화물은 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R5가 -OH, -NHR6, 알킬, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드 (예를 들어, 헥소스, 예컨대 글리코실)인 것이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R6 및 R7 중 하나 이상이 존재하는 화학식 I의 화합물이다. 이러한 실시양태에서, R6 및 R7은 전형적으로 각각 독립적으로 알킬 또는 아릴이다. 알킬 또는 아릴 기는 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기들이 -C(O)R8 및 -NHC(O)R8로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환될 수 있다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R6이 존재하고 하나 이상의 -C(O)R8 치환기로 임의 치환된 아릴인 것이 포함된다 .
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R8이 존재하는 화학식 I의 화합물이다. 이러한 실시양태에서, R8은 전형적으로 -OH, -NH2, 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 퓨린, 또는 피리미딘이다. 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 퓨린, 또는 피리미딘은 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기들이 -OR9, -NHC(O)R9, 알킬, 및 탄수화물 예컨대 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환될 수 있다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R8이 -OH, -NH2, 또는 퓨린 또는 피리미딘 (하나 이상의 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드 (예를 들어, 헥소스, 예컨대 글리코실)로 임의 치환됨)인 것이 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 R8 모이어티에는 인돌릴, 히드록시페닐, 카르복시페닐, 및 부테닐이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R9가 존재하는 화학식 I의 화합물이다. 이러한 실시양태에서, R9는 전형적으로 H, -NH2, 또는 알킬, 바람직하게는 H 또는 알킬이다.
화학식 I'의 화합물에는 하기 화학식 I'a의 입체이성질체가 포함된다:
[화학식 I'a]
Figure pct00011
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "ascr"로 표지되는 화합물), (ω-1)-산소화 인돌 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "icas"로 표지되는 화합물), (ω-1)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "bhas"로 표지되는 화합물), (ω-1)-산소화 인돌 β-히드록시아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "ibha"로 표지되는 화합물), 4-(2-(E)-메틸-2-부테노일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "mhas"로 표지되는 화합물), 글리코실 아스카로시드 에스테르 (예를 들어, 본원에서 "glas"로 표지되는 화합물), 및 4-(4-히드록시벤조일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "hbas"로 표지되는 화합물)가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 (ω)-산소화 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "oscr"로 표지되는 화합물), (ω)-산소화 인돌 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "icos"로 표지되는 화합물), (ω)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "bhos"로 표지되는 화합물), 및 (ω)-산소화 인돌 β-히드록시아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "ibho"로 표지되는 화합물)가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R4가 -C(O)R8이고 R8이 인돌릴 (예를 들어, 3-인돌릴)인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω-1)-산소화 인돌 아스카로시드가 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω)-산소화 아스카로시드가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R4가 4-히드록시벤조일인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω)-산소화 4-(4-히드록시벤조일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "hbos"로 표지되는 화합물)가 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω-1)-산소화 4-(4-히드록시벤조일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "hbas"로 표지되는 화합물)가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R4가 2-메틸-2-부테노일인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω)-산소화 4-(2-(E)-메틸-2-부테노일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "mbos"로 표지되는 화합물)가 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω-1)-산소화 4-(2-(E)-메틸-2-부테노일)-아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "mbas"로 표지되는 화합물)가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R5가 α-D-글루코실인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω)-산소화 글리코실 아스카로시드 에스테르 (예를 들어, 본원에서 "glos"로 표지되는 화합물)가 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 (ω-1)-산소화 글리코실 아스카로시드 에스테르 (예를 들어, 본원에서 "glas"로 표지되는 화합물)가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R5가 -OCHR6R7인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 R5가 -CR6R7C(O)NHR8인 화학식 I 또는 화학식 I'a의 화합물이다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 하기 화학식 IA의 화합물이다:
[화학식 IA]
Figure pct00012
[식 중, n은 1 내지 30의 정수이다]. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 하기 화학식 IA'의 것들이 포함된다:
[화학식 IA']
Figure pct00013
예시적인 화학식 IA 및 IA'의 화합물에는 ascr#1, 2, 4-5, 9-12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 및 38; oscr#1, 3, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 및 38; icas#1, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 및 22; icos#1, 9, 10, 16, 및 18; glas#1, 10, 16, 18, 20, 22, 24, 및 26; hbas#10; 및 mbas#10가 예를 들어 포함되는, SMID "ascr", "oscr", "icas", "icos", "glas", "hbas", 및 "mbas"로 표지되는 화합물이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 하기 화학식 IB의 화합물의 화합물이다:
[화학식 IB]
Figure pct00014
[식 중, m은 1 내지 28의 정수이다]. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 하기 화학식 IB'의 것들이 포함된다:
[화학식 IB']
Figure pct00015
예시적인 화학식 IB 및 IB'의 화합물에는 ascr#3, 7-8, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 및 37; oscr#7, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 및 37; icas#3, 7, 15, 17, 19, 및 21; icos#3, 15, 및 17; glas#3; hbas#3; 및 mbas#3이 예를 들어 포함되는, SMID "ascr", "oscr", "icas", "icos", "glas", "hbas", 및 "mbas"로 표지되는 화합물이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 하기 화학식 IC의 화합물이다:
[화학식 IC]
Figure pct00016
[식 중, q1 및 q2는 각각 독립적으로 1 내지 28의 정수이고, q1 및 q2의 합은 29 이하이다]. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 하기 화학식 IC'의 것들이 포함된다:
[화학식 IC']
Figure pct00017
예시적인 화학식 IC 및 화학식 IC'의 화합물에는 R1이 -CH3이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 SMID "bhas" 및 "ibha"로 표지되는 화합물, 예를 들어, bhas#10, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 42; 및 ibha#10, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 및 30이 포함된다. 예시적인 화학식 IC 및 화학식 IC'의 화합물에는 R1이 H이고 R1'이 부재하거나 H인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 SMID "bhos" 및 "ibho"로 표지되는 화합물, 예를 들어, bhos#10, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 및 42; 및 ibho#10, 16, 18, 20, 22, 24, 및 26이 포함된다. 예시적인 화학식 IC 및 화학식 IC'의 화합물에는 R1이 H 또는 -CH3이고, R1'이 부재하거나 H이며, R4가 -C(O)R8이고, R8이 3-인돌릴인 것이 또한 포함된다. 이같은 화합물에는 SMID "ibha" (R1이 -CH3임) 및 "ibho" (R1이 H임)로 표지되는 화합물이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 하기 화학식 ID의 화합물이다:
[화학식 ID]
Figure pct00018
[식 중, 각각의
Figure pct00019
은 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고; q1, q2, 및 q3은 각각 독립적으로 1 내지 26의 정수이고; q4 및 q5는 각각 독립적으로 0 내지 26의 정수이고; q1, q2, q3, q4, 및 q5의 합계는 28 이하이며; q4 및 q5의 합계는 1 이상이다]. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는 하기 화학식 ID'의 것들이 포함된다:
[화학식 ID']
Figure pct00020
본 발명의 이러한 측면의 화합물은 2개 이상의 화학식 I 단위를 또한 함유할 수 있다. 이러한 단위들은 단위의 6-원 고리로부터 연장된 치환기 중 임의의 것을 통해 서로 연결될 수 있다. 예를 들어, 1개의 화학식 I 단위가 또 다른 화학식 I 단위의 하기에 제시된 1', 2', 3', 4', 또는 5' 위치의 임의의 치환기에 동일한 위치 또는 상이한 위치를 통해 연결될 수 있다.
[화학식 I]
Figure pct00021
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 1개의 화학식 I 단위 내의 R5가 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이어서, 2개 이상 (오직 2개가 포함됨)의 화학식 I 단위를 함유하는 화합물을 형성하는 화합물이다. 이러한 실시양태에 따른 예시적인 화합물에는, 예를 들어, 하기 화학식 IE 및 화학식 IF의 화합물이 포함된다:
[화학식 IE]
Figure pct00022
[화학식 IF]
Figure pct00023
[식 중, R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 하기 화학식의 모이어티이고:
Figure pct00024
; 각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고; R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이다]. 적절한 화합물에는, 예를 들어, 하기 화학식 IE' 및 화학식 IF'의 화합물이 포함된다:
[화학식 IE']
Figure pct00025
[화학식 IF']
Figure pct00026
IE, IE', IF 및 IF의 화합물에는 이량체성 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "dasc"로 표지되는 화합물), 예를 들어 dasc#1, dascs#2 및 dasc#3이 포함된다:
　
Figure pct00027
,
Figure pct00028
,
Figure pct00029
.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는 하기 화학식 I"의 화합물이다:
[화학식 I"]
Figure pct00030
화학식 I"은 화학식 I'의 입체이성질체이다. 화학식 I'의 화합물에 대해 상기 기술된 R1, R1', R2, R3, R5, R6, R7, R8, 및 R9의 모든 바람직한 정의 및 예시적인 정의가 화학식 I"의 화합물에 대해 또한 적절한 예이다. 이러한 실시양태에 따른 적절한 화합물에는 R5가 -OCHR6R7이고 R6 및 R7 중 하나 이상이 -NHC(O)R8로 치환된 알킬인 것이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 또 다른 실시양태는
(i) R1이 독립적으로 -C(R')3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이며, 각각의 R'은 독립적으로 할로겐 또는 알케닐이고;
R1'이 독립적으로 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐임;
(ii) R2가
Figure pct00031
이고,
여기서
각각의
Figure pct00032
은 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;
q1, q2, 및 q3은 각각 독립적으로 1 내지 26의 정수이고;
q4 및 q5는 각각 독립적으로 0 내지 26의 정수이고;
q1, q2, q3, q4, 및 q5의 합계는 28 이하이며;
q4 및 q5의 합계는 2 이상임;
(iii) R5가 H, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 또는 뉴클레오시드임;
(iv) R5가 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이어서, 2개 이상의 화학식 I 단위를 함유하는 화합물을 형성함;
(v) R3 및 R4가 각각 독립적으로 -CR6R7R8, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 -(CO)R8이고, 여기서 R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이며, 이때 알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드가 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환됨;
(vi) 화합물이 화학식 I"의 화합물임;
의 조건 중 적어도 하나 이상이 충족되고,
단, 화합물이
Figure pct00033
이 아닌 화학식 I의 화합물이다.
이러한 실시양태의 한 예는 조건 (i)이 충족되는 화합물이다. 알킬 또는 알케닐 기가 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 이러한 예는 R1이 알케닐이고 R1'이 부재하거나 H인 화합물을 포함한다.
이러한 실시양태의 또 다른 예는 조건 (ii)가 충족되는 화합물이다. 이같은 화합물에는, 예를 들어, 화학식 ID 및 ID'의 화합물, 예를 들어
Figure pct00034
이 포함된다.
이러한 실시양태의 또 다른 예는 조건 (iii)이 충족되는 화합물이다. 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 또는 뉴클레오시드 기가 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환된다. 바람직하게는, 이러한 예에서의 R5는 -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NR6R7, 또는 -CR6R7C(O)NHR8이다. -OCHR6R7이 특히 바람직하다. 이러한 바람직한 예에서, R6 및 R7은 전형적으로 각각 독립적으로 알킬 또는 아릴이다. 알킬 또는 아릴 기는 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기들이 -OR8, -C(O)R8, 및 -NHC(O)R8로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환될 수 있다. 바람직하게는, R8은 H, -OH, -NH2, 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘이다. 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘 기는 -COOH 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환될 수 있다.
이러한 예에 따른 적절한 화합물에는 R5가:
Figure pct00035
인 것이 포함된다. 이같은 화합물에는 페닐에탄올아민 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "pasc"로 표지되는 화합물), 및 아스카로시드 에탄올아미드가 포함된다. 이러한 예에 따른 예시적인 화합물에는:
Figure pct00036
[식 중, m1은 1 (즉, pasc#9), 2 (즉, pasc#12), 또는 3 (즉, pasc#1)이다]가 포함된다. 이러한 예에 따른 추가적인 예시적인 화합물에는 하기에 제시된 바와 같은 화합물이 또한 포함된다:
Figure pct00037
[식 중, RI은 -NH3이고 m2는 20이거나; 또는 RI은 H이고 m2는 22이다].
이러한 실시양태의 또 다른 예는 조건 (iv)가 충족되는 화합물이다. 2개 이상의 화학식 I 단위가 상기 기술된 바와 같이 연결될 수 있다. 이러한 예에 따른 적절한 화합물에는, 예를 들어, 화학식 IE, 화학식 IF, 화학식 IE', 화학식 IF'의 화합물, 및 2개의 화학식 I 단위만 함유하는 화합물이 포함된다. 일부 예에서, R1은 독립적으로 H 또는 알킬 (예를 들어, -CH3)이다. 예시적인 화합물에는 R2a가 -(CH2)nC(O)-이고, R2b가 -(CH2)nC(O)-이며, R2a 및 R2b 양쪽 모두가 -(CH2)nC(O)-인 화학식 IE 및 IE'의 화합물; R2a가 -(CH2)nC(O)-이고, R2b가 -(CH2)nC(O)-이며, R2b 및 R2b 양쪽 모두가 -(CH2)nC(O)-인 화학식 IF 및 IF'의 화합물; R3이 H인 화합물; 각각의 R1이 독립적으로 H 또는 알킬 (예를 들어, -CH3)인 화학식 IE, IE', IF, 및 IF'의 화합물; R3이 H인 화학식 IE, IE', IF, 및 IF'의 화합물; R4가 독립적으로 H 또는 -C(O)R8이고, R8이 -NHC(O)R9로 임의 치환된 알킬이며, R9가 H 또는 -NH2인 IE, IE', IF, 및 IF'의 화합물이 포함된다. IE, IE', IF, 및 IF의 화합물에는 이량체성 아스카로시드 (예를 들어, 본원에서 "dasc" 또는 "ubas" ("3-우레이도 이소부티레이트 아스카로시드(3- u reido iso b utyrate as caroside)"에 대해)로 표지되는 화합물), 예를 들어 dasc#1, dasc#2 (ubas#1로도 칭해짐), 및 dasc#3 (ubas#2로도 칭해짐)이 포함된다:
Figure pct00038
.
이러한 실시양태의 또 다른 예는 조건 (v)가 충족되는 화합물이다. 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 또는 뉴클레오시드가 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환될 수 있다. 이러한 예에 따른 적절한 화합물에는 R3 및 R4가 각각 -C(O)R8이고; 바람직하게는 R8이 -NHC(O)NH2 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드 (예를 들어, 헥소스, 예컨대 글리코실)로 치환된 알킬인 것이 포함된다. 이러한 예에 따른 적절한 화합물에는 R8이 -[CH2]n4NHC(O)R9 또는 -[CH2]n4C(O)(NH)R9이고; 바람직하게는 R9가 -OH, 페닐, 페놀, 및 카르복시페닐로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 알킬 또는 아릴인 것이 포함된다. 이러한 예에 따른 예시적인 화합물에는 R3 및/또는 R4가:
Figure pct00039
인 것이 또한 포함된다.
이러한 실시양태의 또 다른 예는 조건 (vi)이 충족되는 화합물이다. 이러한 예에 따른 예시적인 화합물에는, 예를 들어, 하기 화학식 I"a의 화합물이 포함된다:
[화학식 I"a]
Figure pct00040
조건 (i)-(iv)에 대해 상기 기술된 R1, R1', R2, R3, R5, R6, R7, R8, 및 R9의 모든 바람직한 정의 및 예시적인 정의가 이러한 예에서 또한 적절하다. 이러한 예에 따른 적절한 화합물에는, 예를 들어, R1이 H 또는 알킬 (예를 들어, -CH3)이고, R'이 부재하거나 H이고, 이때 알킬 또는 알케닐 기가 본원에서 정의된 치환기 중 하나 이상으로 임의 치환되고; R2가 -(CH2)nC(O)R5이고; R3이 H이고; R4가 H이고; R5가 -OH 또는 -OCHR6R7이며, 이때 R6, R7, R8, 및 R9가 예를 들어 조건 (iii)이 충족되는 상기에서 언급된 바와 같이 임의로 정의되는 화학식 I" 및 I"a의 화합물이 포함된다. 이러한 예에 따른 화합물에는 파라토시드 (예를 들어, 본원에서 "part"로 표지되는 화합물) 및 뉴클레오시드-함유 파라토시드 (예를 들어, 본원에서 "npar"로 표지되는 화합물), 예를 들어 part#9, npar#1, npar#2, 및 npar#3이 또한 포함된다:
Figure pct00041
.
본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당을 포함하는 단리된 화합물에 관한 것이다. 하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당은 공유 결합으로 연결된다. 바람직하게는 이러한 화합물의 분자량은 약 2,000 g/mol 미만이다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 적절한 핵염기에는 상기 기술된 바와 같은 천연 또는 합성 핵염기, 및 유니버설 염기가 포함된다. 하나 이상의 실시양태에서, 하나 이상의 핵염기가 퓨린, 피리미딘, 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실, 사이토신, 이노신, 잔틴, 하이포잔틴, 누불라린, 이소구아니신, 투베르시딘, 및 이의 유도체 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나 이상의 실시양태에서, 핵염기는 임의 치환된 퓨린, 예를 들어, 치환기 (예를 들어, 하나 이상의 당 (예를 들어, 피라노스, 3,6-디데옥시 당))가 9 위치에 연결되어 있는 퓨린이다. 이러한 하나 이상의 핵염기가 핵염기 또는 뉴클레오시드의 경우의 리보스 당 상의 임의의 원자를 통해 하나 이상의 당, 하나 이상의 아미노산, 및/또는 하나 이상의 지방산에 연결될 수 있다. 예를 들어, 핵염기가 핵염기 상의 고리밖 아미노 기에 대한 연결을 통해 하나 이상의 아미노산에 연결될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 적절한 지방산에는 상기 기술된 바와 같은 포화, 불포화, 및 다중불포화 지방산이 포함된다. 하나 이상의 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 지방산은 히드록시산 (예를 들어, C4 -32 히드록시산)을 포함한다. 지방산의 지방족 사슬 상에 다중 히드록실 치환기가 있을 수 있다. 하기 반응식 1에 제시된 바와 같이, 하나 이상의 히드록시 기가 β 위치에 있다.
[반응식 1]
Figure pct00042
하나 이상의 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 지방산은 β-산소화의 생성물이다. 이같은 실시양태에서, 하나 이상의 이중 결합이 지방산의 α 및 β 위치 사이에서 발생한다. 하나 이상의 실시양태에서, 하나 이상의 지방산이 예를 들어 히드록시 산의 히드록실 기에 대한 에테르 결합을 통해 하나 이상의 당에 연결된 C4 -32 히드록시산이다. 이는, 예를 들어, 이의 아노머 히드록실 기에 대한 에테르 결합을 통해 연결되는 것, 베타 피라노시드 결합을 통해 연결되는 것 등을 포함한다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 적절한 아미노산에는 상기 기술된 바와 같은 천연 또는 합성 아미노산이 포함된다. 하나 이상의 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산은 알파 아미노산, 베타 아미노산, 감마 아미노산, L-아미노산, 및 D-아미노산으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나 이상의 아미노산의 측쇄에는, 예를 들어, *-OR, *-NRR', *-SR, *-C(O)NRR', 및 *-Im-R [식 중, *-는 아미노산의 탄소 원자에 대한 치환기의 부착 부위를 나타내고, R은 하나 이상의 지방산의 카르복시기에 대한 결합으로부터 생겨나는 아실 기이고, Im은 이미다졸 고리이며, R'는 -H, 임의 치환된 C1 -12 지방족, 또는 임의 치환된 아릴이다]로 이루어진 군으로부터 선택된 치환기가 포함된다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 적절한 당에는 모노사카라이드가 예를 들어 포함되는, 당업자에게 공지된 임의의 탄수화물이 포함된다. 하나 이상의 실시양태에서, 이러한 하나 이상의 당은 아스카릴로스, 만노스, 펜토스, 헥소스, 리보스, 및 데옥시리보스가 예를 들어 포함되는 데옥시 당, 디데옥시 당, 및 3',6'-디데옥시 당으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당은, 연결이 유효하고 생성된 화합물이 안정적인 한, 다양한 연결 원자를 통해 임의의 순서로 서로 연결될 수 있다.
본 발명의 이러한 측면에 따른 적절한 실시양태에는, 예를 들어, 상기 반응식 1에 제시된 바와 같이, 하나 이상의 지방산이 하나 이상의 당 (예를 들어, 아스카릴로스)에 ω-결합 또는 ω-1 결합을 통해 연결된 것이 포함된다.
본 발명의 이러한 측면의 하나 이상의 실시양태에서, 화합물은 하나 이상의 제2 당을 추가로 포함한다. 적절한 당에는 상기에서 확인되는 것들이 포함된다. 바람직한 실시양태에서, 하나 이상의 제2 당이 펜토스 예컨대 리보스 당 또는 변형된 리보스 당이다. 바람직하게는, 하나 이상의 제2 당이 베타-글리코시드 결합을 통해 하나 이상의 핵염기와 하나 이상의 뉴클레오시드를 형성할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 실시양태는 화학식 [NB]-[AA]-[FA]-[S]의 화합물, 화학식 [S1]-[NB]-[AA]-[FA]-[S2], 및 화학식 [S1]-[S2]-[NB]-[AA]-[FA]-[S3]의 화합물을 포함하고, 식 중 NB는 핵염기이고, AA는 아미노산이고, FA는 지방산이며, S, S1, S2, 및 S3은 각각 독립적으로 당이다. 두 번째 화학식의 S1 및 NB, 및 세 번째 화학식의 S2 및 NB는 임의로 뉴클레오시드를 형성할 수 있다. 뉴클레오시드는, 예를 들어, 우레아 결합을 통해 아미노산의 α-아미노 기에 연결될 수 있다. 아미노산은 하나 이상의 헤테로원자가 있는 측쇄를 포함할 수 있다. 지방산은, 예를 들어, 아미노산의 측쇄 상에 존재하는 헤테로원자와 지방산의 카르복시 모이어티 사이의 공유결합을 통해 아미노산에 연결될 수 있다. 예를 들어, 아미노산이 에스테르 결합, 아미드 결합, 티오에스테르 결합, 이미드 결합, 아실 아미딘 결합, 아실 구아니딘 결합 등에 의해 지방산의 카르복시 기에 연결될 수 있다. 별법적으로, 아미노산이, 예를 들어, 지방산 카르복시 기와 아미노산 측쇄 상에 존재하는 히드록시 기 사이의 에스테르 결합을 통해 지방산에 연결될 수 있다.
본 발명의 모든 측면에 따른 단리된 화합물을 공지된 방법의 적용 또는 개조에 의해 제조할 수 있다. 적절한 방법에는 천연에서 생산된 화합물의 단리, 뿐만 아니라 지금까지 사용된 또는 문헌에 기술된 방법, 예를 들어, 문헌 [LAROCK: COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (윌리-VCH(Wiley-VCH) 출판사, 뉴욕 (1989))] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 것을 사용하는 합성이 포함된다. 화합물을 합성하기 위한 적절한 방법에는 실시예 15-21, 35-43, 및 80-81에 기술된 것들이 포함된다.
하기의 실시예를 참조로 본 발명이 추가로 설명될 수 있다.
실시예
하기의 실시예는 첨부된 청구항에 기재된 바와 같은 본 발명의 범주를 설명하도록 의도되고, 결코 이를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시예 1 - 분석 기기 조작 및 절차
핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼을 배리안(Varian) INOVA 600 NMR (1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz) 상에서 기록하였다. 배리안 VNMR 및 메스트레랩스 메스트렉(MestreLabs MestReC) 소프트웨어 패키지를 사용하여 NMR-스펙트럼을 프로세싱하였다. NMR 스펙트럼으로부터 유래된 비트맵의 추가적인 프로세싱을 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 어도비 포토샵(Adobe Photoshop) CS3를 사용하여 수행하였다. 다이오드 어레이 검출기가 장착되고 쿼트로(Quattro) II 분광계 (마이크로매스/워터스(Micromass/Waters))에 연결된 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피-질량 분광법 (HPLC-MS)을 수행하였다. 매스링크스(MassLynx) 소프트웨어로 데이트 취득 및 프로세싱을 제어하였다. 텔레다인 ISCO(Teledyne ISCO)의 콤비플래시(CombiFlash) 시스템을 사용하여 플래시 크로마토그래피를 수행하였다.
실시예 2 - 씨. 엘레간스 균주 및 일반적인 배양 방법
모든 균주를 박토(Bacto) 한천 (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))으로 제조되고 철야 성장된 OP50 박테리아가 시딩(seeding)된 NGM 한천 플레이트 상에서 달리 언급되지 않는 한 20℃에서 유지시켰다. 씨. 엘레간스 변종 N2 브리스톨(Bristol), 및 him -5( e1490 ) 균주 CB1490으로부터 제조된 수컷을 유인 생체검정법 및 자동 추적자 실험에서 사용하였다. him -5( e1490 ) 돌연변이체는 감수분열 동안 X-염색체 비분리에 의해 XO 수컷 자손으로 분리된다 (문헌 [Hodgkin et al., Genetics 91:67-94 (1979)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). sra -9 프로모터의 영향 하에 ASK 뉴런에서 포유동물 카스파제(caspase)를 발현하는 이러한 트랜스제닉(transgenic) 균주 PS6025 qrIs2 [ sra -9:: mCasp1 ] (이와테 대학교(Iwate University)의 토쿠미츠 와카바야시(Tokumitsu Wakabayashi)의 기증품)가 ASK 뉴런의 유전적 절제에 사용되었다. 사용된 기타 균주는 하기와 같다: CB4856, 씨. 엘레간스 하와이(Hawaii) 단리물 (문헌 [Hodgkin & Doniach, Genetics 146:149-64 (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); RC301, 씨. 엘레간스 프라이부르크(Freiburg) 단리물 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Hodgkin & Doniach, Genetics 146:149-64 (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); DA609 npr -1( ad609 ); CX4148 npr -1( ky13 ) (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); CX9740 씨. 엘레간스 (N2); kyEx2144 [ ncs -1:: GFP ] (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); N2;Ex(gcy -28:: dp :: mec -4D) (문헌 [Shinkai et al., J. Neurosci. 31:3007-15 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); CX10981 kyEx2866 [" ASK :: GCaMP2 .2b" sra -9:: GCaMP2 .2b SL2 GFP , ofm -1:: GFP ] (ASK 영상화 세포주); CX11073 kyEx2916 [" AIA :: GCaMP2 .2b" T01A4 .1:: GCaMP2 .2b SL2 GFP, ofm -1:: GFP ] (AIA 영상화 세포주) (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); DR476 daf -22 (m130) (문헌 [Golden & Riddle, Mol. Gen. Genet. 198:534-36 (1985)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); 및 daf -22 ( ok693 ) (문헌 [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
실시예 3 - 씨. 엘레간스 대사산물 명명
모든 새롭게 확인된 아스카로시드를 4문자 "SMID" (SMID: 소형 분자 식별자(Small Molecule IDentifiers)), 예를 들어, "icas#3" 또는 "ascr#10"으로 명명하였다. SMID 데이터베이스 (본원에 전문이 참고로 포함됨)는 폴 스턴버그(Paul Sternberg) 및 웸베이스와 공동으로 보이스 톰슨 인스티튜트의 프랭크 슈뢰더(Frank Schroeder) 및 루카스 뮐러에 의해 유지되는 전자 자원이다. 이러한 데이터베이스는 씨. 엘레간스 및 기타 선충으로부터의 새롭게 확인된 씨. 엘레간스 소형 분자를 카탈로그화하고, 독특한 4-문자 SMID (검색가능한 유전자-스타일 소형 분자 식별자)를 확인된 소형 분자에 할당하며, 각각의 화합물에 대한 문헌에서 사용되는 다른 명칭 및 약어의 목록을 포함한다.
실시예 4 - 대사산물 추출물의 제조
하기와 같이 변형된, 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기존에 기술된 방법에 따라 대사산물 추출물을 제조하였다.
3개의 10 ㎝ NGM 플레이트로부터의 벌레 (N2 또는 daf -22)를 M9-배지를 사용하여 100 ㎖ S-배지 예비배양물 내로 세정하고, 여기서 5일 동안 22℃에서 회전식 진탕기 상에서 성장시켰다. 1 ℓ의 박테리아 배양물 (LB 배지에서 16시간 동안 성장됨)로부터 유래된 농축된 이. 콜라이 OP50을 제1일 및 제3일에 먹이로서 첨가하였다. 이어서, 예비배양물을 425 ㎖의 S-배지의 조합 부피로 400 ㎖의 S-배지를 함유하는 4개의 1 ℓ 삼각 플라스크 내로 균등하게 분할한 후, 이를 추가로 10일의 기간 동안 22℃에서 회전식 진탕기 상에서 성장시켰다. 1 ℓ의 박테리아 배양물로부터 유래된 농축된 OP50을 제1일부터 제9일까지 매일 먹이로서 첨가하였다. 이어서, 배양물을 원심분리하고, 상청액 배지 및 벌레 펠릿을 별도로 동결건조시켰다. 동결건조된 물질을 실온에서 12시간 동안 95％ 에탄올 (250 ㎖, 2회)로 추출하였다. 생성된 황색 현탁액을 여과하였다. 그 후, 여과액을 진공, 실온에서 증발시켜, 배지 및 벌레 펠릿 대사산물 추출물이 생산되었다.
실시예 5 - 크로마토그래프 분획화
2개의 배양물로부터의 배지 대사산물 추출물을 6 g의 옥타데실-관능화 실리카 겔 상에 흡착시키고, 빈 25 g 레디셉(RediSep) Rf 샘플 로딩(loading) 카트리지 내로 건식-로딩하였다. 그 후, 흡착된 물질을 물-메탄올 용매 시스템을 사용하여 역상 레디셉 Rf GOLD 30 g HPLC18 칼럼을 통해 분획화하였다. 4분 동안 100％ 물로 용매가 시작된 후, 메탄올 함량의 선형 증가가 이어져서 42분에 100％ 메탄올이었으며, 이는 55분까지 계속되었다. 이러한 분획화로부터 생성된 8개의 분획을 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 HPLC-MS 및 2차원 핵 자기 공명 (2D-NMR) 분광법으로 분석하였다.
실시예 6 - 질량 분광법 분석
벌레 배지 추출물 또는 크로마토그래프 분획화로부터 유래된 대사산물 분획을 1.5 ㎖ 메탄올에 재현탁시키고, 2,000 g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 HPLC-MS 분석에 제출하였다. 애질런트의 이클립스(Eclipse) XDB-C18 칼럼 (9.4 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)으로 HPLC를 수행하였다. 0.1％ 아세트산-아세토니트릴 용매 구배를 사용하였고, 이때 5분 동안 5％의 아세토니트릴 함량으로 시작하여, 40분의 기간에 걸쳐 100％로 증가되었다. 음이온 또는 양이온 모드로 전기분무 이온화를 사용하여 질량 분광법을 수행하였다.
실시예 7 - 씨. 엘레간스 무균 배양 및 생합성 연구
씨. 엘레간스 유지 배지 (CeMM, 문헌 [Lu & Goetsch, Nematologica 39:303-11 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) + 시토스테롤 대신의 콜레스테롤 (5 ㎎/ℓ) 및 뉴클레오시드-5-포스페이트를 사용하여, 문헌 [Nass & Hamza, Curr. Protoc. Toxicol. 31:1.9.1-1.9.18 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 씨. 엘레간스 (N2, 브리스톨)의 시험관내 무균 배양물을 확립하였다. 21일 후, 배양물을 원심분리하였다. 생성된 상청액 배지 및 벌레 펠릿을 별도로 동결건조시켰다. 동결건조된 벌레 펠릿 (1.2-2.0 ㎎)을 2 ㎖ 메탄올로 추출하고, 여과한 후, 진공에서 농축하였다. 동결건조된 벌레 배지를 에틸 아세테이트-메탄올 (95:5, 100 ㎖, 2회)로 추출하고, 여과한 후, 진공에서 농축하였다. 잔류물을 150 ㎕ 메탄올에 용해시키고, 고성능 액체 크로마토그래피-전기분무 이온화 직렬-질량 분광법 (HPLC-ESI-MS)으로 조사하였다. 적용 실험을 위해, 50 ㎖ CeMM 배지에 캠브리지 동위원소 연구소(Cambridge Isotope Laboratories)로부터의 9.2 ㎎ L-[2,4,5,6,7-D5]-트립토판을 보충하였다.
실시예 8 - 지점 유인 검정법
기존에 보고된 방법 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 따라 지점 유인 검정법을 수행하였다. 씨. 엘레간스 자웅동체 및 수컷 양쪽 모두에 대해, 50-60마리의 벌레를 제4 유충 단계 (L4)에 매일 수확하고, 20℃에서 철야로 성별로 분리하여 보관하여, 다음날 초기 성체로서 사용하였다. 경쟁 실험을 위해, 2가지 조건을 사용하였다: 10％ 에탄올을 함유하는 물 내의 120 nM ascr#3 및 10 nM icas#3 (조건 1), 또는 12 μM ascr#3 및 1 μM icas#3 (조건 2). 분취량을 -20℃에서 20 ㎕ 튜브에서 보관하였다. 물 내의 10％ 에탄올이 대조군으로서 사용되었다.
실시예 9 - 사분면 화학주성 검정법
비-인돌 및 인돌 아스카로시드 양쪽 모두에 대한 화학주성을 10 cm 4-사분면 페트리 접시 상에서 평가하였다 (문헌 [Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 각각의 사분면은 플라스틱 스페이서로 인접한 사분면으로부터 분리되었다 (도 1B). 마주보는 사분면들의 쌍을 상이한 농도의 인돌 아스카로시드 또는 비-인돌 아스카로시드를 함유하는 선충 성장 배지 (NGM) 한천으로 채웠다. 동물을 S-기본 완충제로 부드럽게 세정하고, 교대되는 사분면 내의 4-사분면 플레이트 + 아스카로시드의 중앙에 놓고, 15분 및 30분 후에 채점하였다. (아스카로시드 사분면 상의 동물수 - 완충제 사분면 상의 동물수) / (총 동물수)로서 화학주성 지수가 계산되었다.
실시예 10 - 운동 파라미터 측정
역행 빈도 및 속도를 자동 벌레-추적 시스템 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하여 측정하였다.
실시예 11 - 응집 검정법
문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 검정법을 사용하여 벌레의 응집 거동을 측정하였다. 표준 NGM 플레이트 상에서 응집 검정법을 수행하였다. NGM 배지를 플레이트 상에 붓기 전에 NGM 배지에 인돌 아스카로시드 모액을 첨가함으로써 인돌 아스카로시드를 함유하는 플레이트를 제조하였다. 이러한 플레이트를 실온에서 2일 내지 3일 동안 건조하였다. icas 용액을 통해 도입된 에탄올의 양에 상응하도록 icas 용액 대신 에탄올 용액을 플레이트에 첨가한 것을 제외하고는 대조군 플레이트를 유사하게 처리하였다. 모든 조건에 대해 플레이트의 최종 에탄올 농도는 0.1％ 미만이었다. 건조 후, 대조군 플레이트 및 인돌 아스카로시드를 함유하는 플레이트 양쪽 모두에 마이크로파이펫을 사용하여 150 ㎕의 이. 콜라이 OP50의 철야 배양물을 시딩하고, 2일 동안 실온에서 건조시켰다.
"낮은 벌레 밀도" 실험을 위해, 20마리의 벌레를 잔디 상에 놓고, 20℃에서 3시간 동안 방치하였다. "높은 벌레 밀도" 실험을 위해, 약 120마리의 벌레를 박테리아 잔디 상에 놓고, 20℃에서 3시간 동안 방치하였다. 동물들의 몸체 길이의 50％ 초과로 2마리 이상의 동물과 접촉하고 있는 동물의 수로서 응집 거동이 정량되었다.
실시예 12 - 칼슘 영상화 및 분석
ASK (kyEx2866) 및 AIA (kyEx2916) (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 내의 유전적으로 코딩된 Ca2+ 센서를 발현하는 트랜스제닉 계통이 칼슘 영상화에 사용되었다. 초기 성체 또는 성체 벌레를 "후각 칩(Olfactory chip)" 미세유체 장치 (문헌 [Chronis et al., Nat. Methods 4:727-31 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 내로 삽입하였다. icas#3를 S-기본 완충제 (콜레스테롤 없음)로 희석하였다. icas#3의 모액이 소량의 에탄올을 함유하였기 때문에, 등가량의 에탄올을 S-기본 대조군 흐름에 첨가하였다.
안도르(Andor) 카메라가 장착된 도립 짜이스(Zeiss) 현미경을 사용하여 영상화를 수행하였다. 영상 취득을 위한 노출 시간은 300 밀리세컨드였다. ASK가 청색광 자체에 반응하기 때문에 ASK 뉴런을 영상화하기 전에, 벌레를 청색광에 3분 동안 노출시켰다. 이러한 단계는 뉴런이 Ca2 + 측정에 사용되는 청색광에 적응하는데 필요하다. 맞춤 제작 매트랩(Matlab) 스크립트를 사용하여 영상을 분석하였다. 완충제 또는 icas#3에 대한 노출 직후의 제1 형광 피크를 완충제 또는 icas#3에 대한 노출 시 형광에서의 평균 변화를 계산하는데 선택하였다. 그 후, 이러한 최대치에 대한 값을 icas#3/완충제 전달 전의 5초 동안의 평균 형광 (도 2D의 5초 내지 10초 사이의 영영에 상응함)으로부터 차감하였다.
실시예 13 - 통계 분석
(i) 인돌 아스카로시드 상에서 자웅동체 및 수컷의 유인을 비교하기 위해 (*: p < 0.01, **: p < 0.001, ***: p < 0.0001) (도 1C-1D, 3A, 3D, 4A, 5A, 및 6C); (ii) 미절제 계통과 ASK 절제 계통 사이의 역행을 비교하기 위해 (*: p < 0.01, **: p < 0.001) (도 7A-B); (iii) 야생형 벌레의 유인을 ASK 및 AIA에 대한 유전적으로 절제된 계통, 뿐만 아니라 ASI 및 RMG 뉴런 절제에 비교하기 위해 (***: p < 0.0001) (도 2B); (iv) 완충제 및 icas#3에 대한 G-CaMP 형광 변화를 비교하기 위해 (**: p < 0.001) (도 2E), 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정을 사용하였다. (i) 다양한 균주의 사분면 화학주성 지수를 비교하기 위해 (*: p < 0.05, **: p < 0.01) (도 1E 및 3B-C); (ii) 인돌 아스카로시드를 함유하는 플레이트 상에서의 고립성, 군거성 벌레 및 Cel-daf-22의 응집을 비교하기 위해 (*: p < 0.05, **: p < 0.01) (도 5C, 6A-B, 및 8A-C); (iii) 인돌 아스카로시드가 있는 플레이트 상에서의 벌레의 정지 기간을 비교하기 위해 (*: p < 0.05, **: p < 0.01) (도 8D); (iv) 인돌 아스카로시드가 있는 플레이트 상에서의 속도 및 역행 빈도를 비교하기 위해 (*:p < 0.05, **: p < 0.01) (도 6D-E), 일원 ANOVA에 이어지는 던넷의 사후 테스트를 사용하였다. 모든 오차 막대는 평균의 표준 오차 (S.E.M)를 가리킨다.
실시예 14 - 100 fM 에서의 1마리의 L4 벌레 부피 내의 icas #3의 분자수의 계산
100 fM (페토몰)에서의 1마리의 L4 벌레 부피 내의 icas#3의 분자수 (n)를 등식 1을 사용하여 계산하였다:
[등식 1]
n = VYA * c * NA
[식 중
VYA = 씨. 엘레간스 초기 성체의 부피 (문헌 [Knight et al., Evol. Dev. 4:16-27 (2002)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))
c = 농도 (100 fM)
NA = 아보가드로 수]
이러한 경우에, VYA = 3*106 ㎛3 = 3*10-9 ℓ이고, c = 10 fM = 10-14 M이다. n을 풀면, n = VYA * c * NA = 3*10-9 ℓ * 10-14 mol*ℓ-1 * 6.022*1023 mol-1 = 18개의 분자이다. 따라서, 10 fM의 icas#3 농도에서 한천의 벌레 1마리 부피 내에 18개의 icas#3 분자가 함유되어 있다.
실시예 15 - 화학 합성
생물학적 검정법에서, 그리고 HPLC-MS용 표준물질로서 사용하기 위한 인돌 아스카로시드 icas#1, icas#7, icas#3, 및 icas#9의 샘플을 화학 합성을 통해 제조하였다. 상세한 합성 절차 및 NMR-분광 데이터가 실시예 16-21에서 기재된다.
실시예 16 - 아스카로시드 ascr #9의 합성
Figure pct00043
ascr#9를 제조하기 위해, (R)-헥스-5-엔-2-올 2 (32 ㎎, 0.32 mmol) (ascr#6의 합성에 대해 기술된 조건을 사용하여 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 제조됨)를 트리클로로아세트이미드 1 (150 ㎎, 0.3 mmol, 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 커플링시켰다. 생성된 글리코시드 3 (92 ㎎, 0.21 mmol)을 아세톤 (2 ㎖)에 용해시키고, 2 ㎖의 1 M 과망간산칼륨 용액으로 처리하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 빙냉 포화 수성 염화나트륨 용액 (5 ㎖), 아세트산 (0.1 ㎖), 및 디클로로메탄 (DCM) (5 ㎖)의 혼합물 내로 부었다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 2회의 5 ㎖ 분량의 DCM으로 추출하였다. 조합된 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 건조 상태로 증발시키고, 0.5 M 수성 수산화리튬 (2 ㎖) 및 디옥산 (6 ㎖)의 혼합물에 재용해시켰다. 혼합물을 3시간 동안 70℃에서 교반한 후, 23℃로 냉각하고, 0.2 M 수성 염산으로 산성화시켰다. 혼합물을 건조 상태로 증발시키고, 메탄올-DCM 용매 구배를 사용하여 콤비플래시(Combiflash) 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 15.6 ㎎ (0.063 mmol)의 순수한 ascr#9가 점성 오일로서 산출되었다.
ascr#9에 대한 1H (600 MHz) 및 13C (126 MHz) NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 에서 취득되었다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 커플링 상수는 헤르쯔 [Hz]로 제공된다.
Figure pct00044
실시예 17 - 아스카로시드 ascr #10의 합성
Figure pct00045
ascr#10을 제조하기 위해, 10 ㎖의 에탄올 내의 ascr#3 (3.2 ㎎, 10.6 μmol, 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 교반 용액을 활성탄 상의 팔라듐 (10％ Pd, 1 대기 H2 압력)을 사용하여 23℃에서 18시간 동안 수소화시켰다. 완료 후, 반응물을 건조 상태로 증발켰다. 잔류물을 메탄올 및 DCM의 1:8 (v/v) 혼합물을 사용하여 짧은 실리카 패드에서 여과하여, 3.0 ㎎ (9.9 μmol)의 순수한 ascr#10이 산출되었다.
ascr#10에 대한 1H (600 MHz) 및 13C (126 MHz) NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 에서 취득되었다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 커플링 상수는 헤르쯔 [Hz]로 제공된다.
Figure pct00046
실시예 18 - 인돌 카르복시 아스카로시드 icas #1의 합성
Figure pct00047
icas#1을 제조하기 위해, 먼저 ascr#1을 상응하는 메틸 에스테르로 전환시켰다. 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 바와 같이 제조된 ascr#1 (10 ㎎, 0.036 mmol)을 톨루엔 (1 ㎖) 및 메탄올 (1 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 이러한 혼합물에, 트리메틸실릴디아조메탄 (TMS-디아조메탄)의 용액 (헥산 내의 2 M 용액, 50 ㎕, 0.1 mmol)을 첨가하였다. 20분 동안 23℃에서 교반한 후, 아세트산 (40 ㎕) 첨가에 의해 과량의 TMS-디아조메탄을 파괴하고, 진공에서 용매를 제거하여, ascr#1의 메틸 에스테르 (10.3 ㎎, 0.035 mmol)가 점성 오일로서 산출되었다.
다음으로, 인돌-3-카르보닐 클로라이드의 용액을 제조하였다. 소량의 디메틸포름아미드 (DMF) (20 ㎕)를 함유하는 건조 DCM (2 ㎖) 내의 인돌-3-카르복실산 (67.7 ㎎, 0.42 mmol)의 잘 교반된 현탁액을 옥살릴 클로라이드 (0.84 mmol, 107 ㎎, 72 ㎕)로 0℃에서 처리하였다. 옥살릴 클로라이드에 첨가한 후, 혼합물을 20분 동안 23℃에서 교반하여, 약간 황색인 투명한 용액이 생산되었다. 이러한 용액을 진공, 0.1 토르에서 건조 상태로 증발시켜, 과량의 옥살릴 클로라이드의 제거를 확실하게 하였고, 이어서 2 ㎖의 건조 DCM에 재용해시켰다.
ascr#1 메틸 에스테르 (10.3 ㎎, 0.035 mmol)의 샘플을 1 ㎖의 건조 DCM에 용해시키고, 여기에 디이소프로필에틸아민을 첨가하였다 (129 ㎎, 1 mmol). 생성된 용액에 효과적인 교반 막대를 장착하고, -20℃로 냉각하였다. 이어서, 격렬하게 교반하면서 인돌-3-카르복실산 클로라이드의 용액을 10분 기간에 걸쳐 적가하였다. 잘 교반된 반응물을 -7℃로 점진적으로 가온시키고, 이러한 온도에서 빙냉 포화 수성 중탄산나트륨 용액 (2 ㎖)을 첨가하였다. 이러한 2상 혼합물을 20℃로 가온되게 하고, 에틸 아세테이트로 3회 추출하였다. 조합된 에틸 아세테이트 추출물을 진공에서 증발시키고, DCM 내의 0-10％ 메탄올을 사용하는 실리카 겔 상에서의 칼럼 크로마토그래피에 적용하였다.
ascr#1 메틸 에스테르의 비스-2,4-O-(-인돌-3-카르보닐)-유도체를 함유하는 분획들을 조합하고, 진공 상태로 증발시키고, 3 ㎖ 수성 0.5 M 수산화리튬 용액 및 7 ㎖ 디옥산의 혼합물로 67℃에서 3시간 동안 처리하였다. 이어서, 반응 혼합물을 23℃로 냉각하고, 0.2 M 수성 염산의 첨가로 중화하고, 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 애질런트의 이클립스 XDB C-18 칼럼 (25 cm × 9.4 mm, 5 ㎛ 입자 직경)으로 HPLC에 의해 정제하였다. 아세토니트릴 및 0.1％ 수성 아세트산이 용매로 사용되었고, 이때 아세토니트릴의 농도를 0분의 15％에서 30분의 85％로 증가시켰다. icas#1-함유 분획을 증발시켜, 5.8 ㎎ (0.014 mmol)의 표적 화합물이 왁스-유사 백색 고체로서 산출되었다.
icas#1에 대한 1H (600 MHz), 13C (126 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 에서 취득되었고, 하기 표 1에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 커플링 상수는 헤르쯔 [Hz]로 제공된다; *: 교체가능.
Figure pct00048
실시예 19 - 인돌 카르복시 아스카로시드 icas #3의 합성
Figure pct00049
icas#3을 제조하기 위해, 먼저 ascr#3을 상응하는 메틸 에스테르로 전환시켰다. 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 바와 같이 제조된 ascr#3 (5.2 ㎎, 0.017 mmol)을 톨루엔 (1 ㎖) 및 메탄올 (1 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 이러한 혼합물에, TMS-디아조메탄의 용액 (헥산 내의 2 M 용액, 25 ㎕, 0.05 mmol)을 첨가하였다. 20분 동안 23℃에서 교반한 후, 아세트산 (30 ㎕) 첨가에 의해 과량의 TMS-디아조메탄을 파괴하고, 진공에서 용매를 제거하여, ascr#3의 메틸 에스테르 (5.3 ㎎, 0.017 mmol)가 점성 오일로서 산출되었다.
ascr#3 메틸 에스테르 (10.3 ㎎, 0.035 mmol)의 샘플을 icas#1의 제조를 위해 실시예 18에 기술된 바와 같이 인돌 카르보닐 클로라이드와 반응시켰고, 이때 모든 시약을 비례하여 더 적은 양으로 사용하였다. 실시예 18에 기술된 조건을 사용하는 HPLC에 의한 미정제 반응 생성물의 정제로 icas#3 (2.3 ㎎, 5.2 μmol)이 무색 오일로서 산출되었다.
icas#3에 대한 1H (600 MHz), 13C (126 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 에서 취득되었고, 하기 표 2에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 커플링 상수는 헤르쯔 [Hz]로 제공된다.
Figure pct00050
실시예 20 - 인돌 카르복시 아스카로시드 icas #7의 합성
Figure pct00051
ascr#1로부터의 icas#1 제조에 대해 실시예 18에 기술된 바와 같이 ascr#7 (0.5 ㎎, 문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))로부터 icas#7 (120 ㎍)의 표준 샘플을 수득하였다.
icas#7에 대한 1H (600 MHz) NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 3에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm을 기준으로 한다. 커플링 상수는 헤르쯔 [Hz]로 제공된다.
Figure pct00052
실시예 21 - 인돌 카르복시 아스카로시드 icas #9의 합성
Figure pct00053
ascr#1로부터의 icas#1 제조에 대해 실시예 18에 기술된 바와 같이 ascr#9로부터 icas#9를 수득하였다. NMR-분광 데이터는 공개된 데이터 (문헌 [Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))와 일치한다.
실시예 22 - 비교 대사체학을 통한 인돌 아스카로시드 icas #3의 확인
씨. 엘레간스에서의 현재 공지된 모든 소형-분자 페로몬은 인간 스테롤 캐리어 단백질 SCPx에 대한 강한 상동성이 있는 단백질인 DAF-22를 통한 장쇄 지방산의 과산화소체 β-산화로부터 유래된다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 추정되는 응집 페로몬들이 동일한 경로로부터 유래될 수 있는 것으로 추측되었고, 이는 daf -22 돌연변이체가 이들을 생산하지 않을 것임을 시사한다. 이러한 경우에, 야생형 대사체와 daf -22 돌연변이체로부터 수득된 것의 분광 비교에서 유인 또는 응집 신호에 대한 후보 화합물이 드러날 것이다.
기존의 연구에서, NMR 스펙트럼의 시차 분석 ("DANS")으로 명명된 NMR 분광법-기반 기술을 사용하여 야생형 대사체를 daf -22 돌연변이체로부터 수득된 것과 비교하였다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 비교로 ascr#6-8이 확인되었고, 이중 ascr#8이 수컷-유인 신호의 주요 성분이다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 신호-대-잡음 비가 개선된 NMR 스펙트럼을 기초로, 야생형 및 daf -22-돌연변이체 대사체의 더욱 상세한 비교가 수행되어, 여러 daf -22 벌레에 의해 생산되지 않는 야생형 대사체에서의 여러 인돌-함유 화합물이 밝혀졌다 (도 9B-C). 페로몬 생합성에서의 DAF-22의 확립된 역할 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)]; [Golden & Riddle, Mol. Gen. Genet. 198:534-36 (1985)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))은 이러한 인돌 유도체들이 신호전달 분자들의 기존에 인식되지 않은 패밀리를 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
daf -22-의존적 인돌 유도체의 구조 및 생물학적 역할을 명확히 하기 위해, 야생형 대사체의 NMR 분광법-안내 분획화를 통해 이러한 인돌 유도체들의 완전한 확인을 추구하였다. 역상 크로마토그래피로 8개의 대사산물 분획이 생산되었고, 이를 2차원 NMR 분광법으로 분석하였다. NMR 스펙트럼에서 2개의 분획 내의 daf -22-의존적 인돌 유도체의 존재가 나타났고, 이들을 추가적인 NMR-분광 및 질량 분광측정 연구용으로 선택하였다. 이러한 분석들은 가장 풍부한 daf -22-의존적 인돌 유도체가 공지된 ascr#3 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에서 발견되는 것과 동일한 9-탄소 불포화 측쇄를 보유하는 아스카릴로스에 연결된 인돌-카르복시 단위로 이루어진다는 것을 가리켰다 (실시예 18-19, 도 10-13의 NMR 및 MS 데이터 참조). 공지된 ascr#3에 대한 이의 구조적 관련성을 기초로, 이러한 새롭게 확인된 대사산물이 인돌 카르복시 아스카로시드 "icas#3"으로 명명되었다 (도 9E).
실시예 23 - icas #3은 트립토판-유래 소형 분자들의 더 큰 패밀리의 일부이다
DANS에 의해 검출된 일부 기타 daf-22-의존적 인돌 화합물을 조사하여 이들이 또한 인돌 아스카로시드를 나타내는지 여부를 결정하였다. 질량 분광측정 (MS) 접근법을 이러한 조사에 사용하였는데, 관련 화합물들에 대한 스크린을 가능하게 한 특징적인 MS 단편화 패턴 (인돌-3-카르복시 모이어티의 상실, 도 12)이 icas#3의 질량 스펙트럼의 분석에서 밝혀졌기 때문이다.
유사한 단편화 프로파일의 화합물에 대한 MS 스크리닝은 icas#3이 5개 내지 9개의 탄소가 있는 측쇄를 특색으로 하는 인돌 아스카로시드들의 더 큰 시리즈의 구성원이라는 것을 가리킨다 (도 9D-E). 이러한 인돌 아스카로시드 패밀리의 가장 풍부한 성분은 icas#3, icas#9, 및 icas#10이고, 더 적은 양의 icas#1 및 icas#7이 이에 동반된다 (도 9E). 중등도의 다우어-유도 활성을 지니는 것으로 보고되었고, 종 모양의 반응 곡선을 만드는 것에서 공지된 다우어 페로몬들 중에서 독특한 icas#9를 제외하고는, 이러한 화합물 모두가 신규 대사산물을 나타낸다 (문헌 [Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
2개의 신규 비-인돌 아스카로시드가 또한 검출되었다: 포화 5-탄소 측쇄를 특색으로 하는 ascr#9, 및 포화 9-탄소 측쇄를 특색으로 하는 ascr#10 (공지된 ascr#3의 포화 유사체를 나타냄) (도 9F).
이러한 인돌 아스카로시드들의 정량적인 분포가 상응하는 비-인돌 아스카로시드의 것과 명확하게 상이하다는 것이 MS 분석에서 추가로 밝혀졌고, 이는 인돌 단위의 혼입이 강하게 조절된다는 것을 시사한다. 가장 풍부한 인돌 아스카로시드인 icas#3에는 10배 내지 40배 더 많은 양의 상응하는 비-인돌 아스키로시드인 ascr#3이 동반되는 반면, icas#9는 상응하는 ascr#9보다 더 풍부하다 (도 9G).
인돌 아스카로시드의 생합성 기원을 결정하기 위해, 그리고 이들이 이. 콜라이 먹이원에 의해 생산된다는 가능성을 배제하기 위해, 화학적으로 규정된 CeMM 배지 (문헌 [Lu & Goetsch, Nematologica 39:303-11 (1993)]; [Nass & Hamza, Curr. Protoc. Toxicol. 31:1.9.1-1.9.18 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))를 사용하여 씨. 엘레간스 (N2)의 무균 (박테리아가 없음) 시험관내 배양물을 확립하였다. 무균 배양물의 HPLC-MS 분석에서 icas#1, icas#3, icas#9, 및 icas#10의 존재가 밝혀졌고, 따라서 인돌 아스카로시드가 식이성 박테리아의 참여 없이 씨. 엘레간스에 의해 생산된다는 것을 가리킨다. 무균 배지에서 L-[2,4,5,6,7-D5]-트립토판 및 L-트립토판의 1:1 혼합물을 사용하면, 등가량의 미표지 화합물과 함께 [D5]-icas#1, [D5]-icas#3, [D5]-icas#9, 및 [D5]-icas#10의 생산이 초래되었다 (도 13). 결론적으로, 이러한 생화학적 연구는 인돌 아스카로시드 내의 인돌-3-카르복시 모이어티의 트립토판 기원을 확립되게 하고, 이러한 화합물이 강하게 조절되는 생합성 경로의 생성물이라는 것을 가리킨다.
실시예 24 - 인돌 아스카로시드가 자웅동체를 강하게 유인한다
아스카로시드에 인돌-3-카르복시 모이어티가 부가되는 것은 유의한 구조적 변화를 나타낸다. 이러한 화학적 차이는 이러한 화합물들의 비-인돌 동족체의 것과 다른 이러한 화합물들에 대한 신호전달 기능을 가리킬 수 있다.
측쇄 길이가 다양한 3개의 합성 인돌 아스카로시드인 icas#1, icas#3, 및 icas#9를 지점 유인 검정법에서 테스트하여, 소형 분자의 군거성 기능을 실연하였다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 1A). 테스트된 3개의 인돌 아스카로시드인 icas#1, icas#3, 및 icas#9 모두가 높은 농도에서 수컷 및 자웅동체 양쪽 모두를 유인하였다 (도 1C). 가장 풍부한 인돌 아스카로시드인 icas#3의 더 넓은 농도 범위에서의 테스트에서, icas#3이 낮은 농도에서 자웅동체에 대해 강하게 유인성인 반면, 수컷은 더 이상 유인되지 않았음이 밝혀졌다 (도 1D). 유사하게, 자웅동체가 낮은 농도의 icas#9에 강하게 유인되었지만, 수컷은 그렇지 않았다 (도 5A).
icas#3에 대한 자웅동체 유인을 문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 바와 같은 사분면 화학주성 생체검정법을 사용하여 추가로 조사하였다 (도 1B). 화합물의 포인트 소스에 대한 유인을 측정하는 지점 유인 검정법에 대조적으로, 사분면 화학주성 검정법은 잘 규정된 화합물 농도의 플레이트 섹션 상에서의 자웅동체의 응집을 측정한다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 먹이의 존재 및 부재 양쪽 모두에서 (도 5B), 1 pM만큼 낮은 농도의 icas#3이 강한 자웅동체 유인을 초래하였음이 발견되었다 (도 1E).
따라서 icas#3의 생물학적 역할은 수컷을 강하게 유인하지만 자웅동체는 퇴치하는 상응하는 비-인돌 아스카로시드 ascr#3의 것과 완전히 상이하다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 본원에서의 결과는 단순히 인돌-3-카르복시 기를 아스카릴로스의 4-위치에 부착하는 것에 의해, 강하게 수컷을 유인하는 ascr#3이 자웅동체를 주로 유인하는 신호로 전환된다는 것을 나타낸다. 벌레에 의해 ascr#3 및 icas#3이 생산되는 양에서의 차이는 이의 상대적인 효능에 상응한다: icas#3보다 훨씬 더 효능이 낮은, 수컷-유인성 ascr#3은 고도로 강력한 자웅동체 유인물질 icas#3보다 훨씬 더 높은 농도로 생산된다 (도 9G).
실시예 25 - 고립성 및 군거성 야생형 자웅동체가 icas #3에 유인되지만, 비-인돌 아스카로시드에는 유인되지 않는다
지점 유인 및 사분면 화학주성 검정법으로부터의 결과는 자웅동체가 인돌 아스카로시드에 강하게 유인된다는 것을 가리키고, 이는 이러한 화합물들이 씨. 엘레간스 응집 거동을 조절한다는 것을 시사한다. 씨. 엘레간스는 이의 수렵채집 거동에서 천연적인 변동을 나타내어, 일부 균주 (예를 들어, 통상적인 실험실 균주 N2)는 박테리아 잔디 상에서 개별적으로 분산되는 반면, 대부분의 야생형 균주 (예를 들어, RC301 및 CB4856 (하와이))는 박테리아가 가장 풍부한 경우에 축적 및 응집된다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Hodgkin & Doniach, Genetics 146:149-64 (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 변이체들은 각각 "고립성" 및 "군거성"으로 지칭된다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-85 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 수렵채집 및 응집 거동에서의 이러한 차이는 단일 아미노산 위치에서 상이한 뉴로펩티드 Y-유사 수용체 NPR-1의 2가지 상이한 대립유전자와 연관된다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-85 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)): 고립성 균주 예컨대 N2는 NPR-1의 고활성 변이체 (215-발린)을 발현하는 반면, 응집성 균주 예컨대 CB4856은 NPR-1의 저활성 변이체 (215-페닐알라닌)을 발현한다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-85 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 강한 기능 상실 돌연변이체인 npr -1( ad609 ) 및 npr -1( ky13 ) (N2 배경에서 생성됨) 또한 높은 응집 경향을 나타낸다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Hodgkin & Doniach, Genetics 146:149-64 (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
기존의 연구에서, npr -1의 기능 상실이 비-인돌 아스카로시드에 대한 자웅동체의 반응에 영향을 미치는 것으로 나타났다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). NPR-1의 고활성 변이체를 발현하는 야생형 (N2) 벌레는 비-인돌 아스카로시드에 의해 거부되는 한편, npr-1(ad609) 돌연변이체는 가장 풍부한 비-인돌 아스카로시드인 ascr#2, ascr#3, 및 ascr#5의 거의 생리학적인 혼합물에 대한 유인을 나타냈다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
사분면 화학주성 및 지점 유인 검정법 양쪽 모두에서 ascr#2/3/5 혼합물에 대한 npr -1( ad609 ) 자웅동체의 유인이 확증되었다; 그러나, 테스트된 2가지 군거성 야생형 균주 (RC301 및 CB4856)의 자웅동체는 어느 검정법에서도 유인을 나타내지 않았다 (도 3A-B). 대조적으로, 양쪽 모두의 군거성 야생형 균주 (RC301 및 CB4856), 뿐만 아니라 npr -1( ad609 ) 자웅동체가 사분면 화학주성 및 spot-유인 검정법 양쪽 모두에서 icas#3에 강하게 유인되었다 (도 3B-D 및 5B-C). 이러한 결과들은 icas#3이 고립성 및 군거성 씨. 엘레간스 양쪽 모두에서 자웅동체 유인물질로서 기능한다는 것을 가리킨다.
실시예 26 - 페토몰 농도의 인돌 아스카로시드가 씨. 엘레간스 응집을 촉진한다
어떻게 일정한 배경 농도의 인돌 아스카로시드가 자웅동체 거동에 영향을 미치는지를 테스트하였다. 고립성 N2 벌레 및 여러 군거성 균주 (군거성 야생형 균주 CB4856 및 2마리의 npr -1 기능 상실 돌연변이체가 포함됨)의 응집을 2가지 상이한 조건을 사용하여 icas#3에 대한 반응에서 측정하였다: 5 cm 플레이트 당 벌레 120마리의 "높은 벌레 밀도"; 및 5 cm 플레이트 당 벌레 20마리의 "낮은 벌레 밀도".
낮은 벌레 밀도에서, 응집의 매우 강한 증가가 10 fM (페토몰)만큼 낮은 농도의 icas#3에서 관찰되었다 (도 8A 및 14E). 1 pM icas#3에서 N2 자웅동체의 응집이 4배 더 증가되었고, 더 높은 icas#3 농도는 더 적은 응집을 일으켰다. 유사하게, 1 pM의 icas#3에서의 최대 응집 및 1 nM의 icas#3에서의 대조군과 유의하게 상이하지 않은 더 낮은 응집으로 천연 발생 군거성 균주 CB4856은 종-형상 반응 곡선을 나타냈다 (도 8A). 대조적으로, icas#3은 더 높은 농도에서 쇠퇴하지 않으면서 테스트된 전체 농도 범위에 걸쳐 npr -1( ad609 ) 자웅동체의 응집을 증가시켰다 (도 8A). 높은 벌레 밀도에서, N2 자웅동체의 응집의 3배까지의 증가가 icas#3 플레이트에서 관찰된 반면 (도 8B 및 14F), 테스트된 3개의 군거성 균주 모두로부터의 자웅동체는 icas#3의 부재하에서도 거의 완전한 응집을 나타냈고, 이는 icas#3의 임의의 추가적인 응집-촉진 효과의 검출을 불가능하게 하였다 (도 8B). 이러한 결과들은 icas#3이 이러한 화합물의 농도 구배의 부재 하에서도 자웅동체 응집을 증가시킨다는 것과 고립성 및 군거성 균주가 유사하게 영향을 받는다는 것을 나타낸다. 유사하게, 2번째로 풍부한 인돌 아스카로시드인 icas#9가 고립성 및 군거성 자웅동체 양쪽 모두의 응집을 증가시켰다 (도 6A).
일반적으로 자웅동체의 부재 하에 응집하는 경향이 있는 수컷 (문헌 [Gems & Riddle, Genetics 154:1597-610 (2000)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 응집에 대한 icas#3의 효과를 또한 조사하였다. icas#3 플레이트 상에서의 him -5 수컷의 응집이 유의하게 증가되는 것으로 확인되었다 (도 6B).
이러한 결과들은 인돌 아스카로시드가 농도 구배의 부재 하에서도 응집 거동을 촉진한다는 것을 나타내고, 이는 icas#3 및 icas#9의 감지가 응집을 촉진하는 다른 (화학적 또는 기타) 신호 또는 조건에 대한 반응에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 예를 들어, 외인성 icas#3을 함유하는 플레이트 상에서의 벌레에 의한 추가적인 인돌 아스카로시드의 분비가 관찰된 응집 증가에 기여할 수 있다. 이러한 가능성을 조사하기 위해, 응집 검정법에서의 daf -22 자웅동체를 테스트하였다. daf-22 자웅동체는 인돌 아스카로시드를 생산하지 않았지만, 지점 유인 및 사분면 화학주성 검정법 양쪽 모두에서 N2 벌레만큼 강하게 icas#3에 반응하였다 (도 3B 및 5C). daf -22 자웅동체는 1 pM icas#3에서 N2 벌레보다 덜한 응집을 나타내는 것으로 확인되었지만, 10 pM icas#3에서는 그렇지 않았다 (도 8C). 이러한 결과는 벌레에 의한 추가적인 인돌 아스카로시드 또는 기타 daf -22-의존적 화합물의 분비가 icas#3 플레이트 상에서의 응집에 기여할 수 있다는 것을 시사한다; 그러나, 기타 요인, 예컨대 낮은 산소 수준 또는 다른 벌레와의 접촉 (문헌 [Rogers et al., Curr. Biol. 16:649-59 (2006)]; [Chang et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 4(9):e274 (2006)]; [Chang & Bargmann, PNAS 105:7321-26 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))이 더욱 중요할 수 있다. 추가로, icas#3 플레이트 상에서의 운동 거동에서의 변화가 응집 수준에 영향을 미칠 수 있다 (문헌 [Rogers et al., Curr. Biol. 16:649-59 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 벌레 움직임을 추적하는 자동 기계-시각 시스템 (문헌 [Cronin et al., BMC Genet. 6:5 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하여, 응집-유도 농도의 icas#3이 평균 정지 기간을 강하게 증가시키고 다른 운동 파라미터에 영향을 미치는 것으로 확인되었다 (도 6D-E 및 8D). 벌레 운동에서의 이러한 변화가, 다른 응집-매개 요인과 함께, icas 플레이트 상에서의 관찰된 응집 증가에 기여할 수 있다.
실시예 27 - icas #3에 대한 반응이 감각 뉴런 ASK 및 개재뉴런 AIA 을 필요로 한다
앰피드(amphid) 단일-섬모(single-ciliated) 감각 뉴런 유형 K (ASK)는 씨. 엘레간스 거동을 매개하는데 중용한 역할을 한다. 기존의 작업에서, ASK 뉴런이 비-인돌 아스카로시드에 대한 수컷 및 자웅동체의 거동 반응에 필요한 것으로 나타났다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). ASK 감각 뉴런은 해부학적 간극 결합(gap-junction)을 통해 RMG 개재뉴런에 연결되고, 이는 ASK 및 기타 감각 뉴런으로부터의 입력을 기초로 응집 및 관련 거동을 조절하는 중앙 허브로서 작용하는 것으로 나타났다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [White et al., Philos. Trans. R. Soc. London [Biol] 314:1-340 (1986)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 2A).
icas#3-매개 자웅동체 유인 및 응집에 필요한 신경 회로를 조사하기 위해, 테스트를 수행하여 ASK 뉴런이 이러한 거동에 필요한지 여부를 결정하였다. 발달 중인 뉴런에서의 포유동물 카스파제의 세포-특이적 발현으로 인해 ASK 뉴런이 결여된 벌레 (일본 이와테 대학교의 토쿠미츠 와카바야시)를 이러한 테스트에 사용하였다. ASK 감각 뉴런의 절제는 icas#3에 대한 거의 완전한 유인 상실을 초래하였다 (도 2B). 대조적으로, ASK 뉴런과 유사하게 다우어 페로몬 감지에 참여하는 ASI 뉴런의 절제는 자웅동체에서 icas#3-매개 유인에 대한 유의한 효과가 없었다 (도 2B). 추가로, ASI 및 ASK 뉴런 양쪽 모두의 절제가 ASK 절제 단독과 비교하여 더욱 유의한 유인 상실을 초래하지 않았고, 이는 ASK 감각 뉴런이 icas#3의 감지에 필요하다는 것을 시사한다 (도 2B).
ASK 뉴런이 icas#3-매개 응집에 필요한지 여부를 결정하기 위해 테스트를 또한 수행하였다. 결과는 ASK 뉴런이 결여된 자웅동체가 어떠한 테스트 농도에서도 icas#3에 반응하여 응집하지 않았음을 나타낸다 (도 2C). icas#3 플레이트 상에서의 ASK-절제 자웅동체의 운동 분석은 야생형 벌레에 대해 관찰된 바와 같이 증가된 역행 빈도 또는 감소된 속도를 나타내지 않았다 (도 7A-B).
그 후, RMG 개재뉴런이 icas#3-매개 거동에 필요한지를 결정하기 위해 테스트를 수행하였다. 야생형 벌레 및 ncs -1:: gfp를 발현하는 트랜스제닉 균주 (바그만(Bargmann) 실험실로부터의 기증품)에서의 RMG 개재뉴런의 세포 위치를 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경을 사용하여 확인하였다 (문헌 [Sulston et al., Dev. Biol. 100:64-119 (1983)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 트랜스진(transgene)은 RMG 개재뉴런 및 약간의 기타 감각 뉴런에서 GFP를 발현한다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 야생형 및 ncs -1:: gfp 벌레 양쪽 모두에서의 RMG 개재뉴런의 절제가 지점 유인 검정법에서 icas#3 반응에 영향을 미치지 않았다는 것이 발견되었다 (도 2B). 이러한 결과는 ASK 감각 뉴런 및 RMG 개재뉴런 양쪽 모두를 필요로 하는 비-인돌 아스카로시드의 거동 효과 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 대조적으로, RMG 개재뉴런이 ASK 감각 뉴런으로부터의 icas#3-유래 유인 신호의 변환에 필요하지 않다는 것을 가리킨다.
이러한 관찰 하에, ASK 하류의 어떤 개재뉴런이 icas#3에 대한 반응에 필요한지를 결정하기 위해 테스트를 또한 수행하였다. 씨. 엘레간스의 배선 다이어그램(wiring diagram)에 따르면, ASK 뉴런의 1차 시냅스 출력은 AIA 개재뉴런이다 (문헌 [White et al., Philos. Trans. R. Soc. London [Biol] 314:1-340 (1986)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). AIA 개재뉴런에서 과활성 형태의 MEC-4를 발현하는 트랜스제닉 계통 (일본 이시하라 실험실(Ishihara lab)의 기증품) (문헌 [Shinkai et al., J. Neurosci. 31:3007-15 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하여 AIA 개재뉴런이 icas#3 감지에 필요한지 여부를 테스트하였다. DEG/ENaC 나트륨 채널인 MEC-4의 발현은 씨. 엘레간스에서 뉴런 독성을 야기함으로써 AIA 뉴런의 상실을 초래한다 (문헌 [Harbinder et al., PNAS 94:13128-33 (1997) (본원에 전문이 참고로 포함됨)]). AIA-결핍 벌레는 icas#3에 대한 어떠한 유인도 나타내지 않았고, 이는 AIA 개재뉴런이 icas#3 반응에 필요하다는 것을 시사한다. 따라서, icas#3에 대한 유인에 필요한 신경 회로가 비-인돌 아스카로시드의 것과 상이하다.
거동 검정법이 ASK 및 AIA 뉴런이 icas#3 감지에 참여하는 것을 나타냈기 때문에, icas#3이 이러한 뉴런에서의 칼슘 유동을 유발하는지 여부를 결정하기 위해 테스트를 수행하였다. Ca2 + 유동을 측정하기 위해, 이러한 뉴런에서 유전적으로 코딩되는 칼슘 센서 (GCaMP)를 발현하는 트랜스제닉 계통 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하였다. 이러한 뉴런으로부터의 영상화 동안, 벌레를 제지하고 icas#3의 온(ON) 및 오프(OFF) 단계를 적용하는데 "후각 칩"을 사용하였다 (문헌 [Chronis et al., Nat. Methods 4:727-31 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 1 pM 내지 1 μM 범위의 광범위한 농도 범위가 적용된 경우에도, ASK 뉴런에서의 Ca2 + 트랜션트(transient)가 검출되지 않았다. 그 후, ASK 뉴런의 1차 시냅스 표적인 AIA 개재뉴런에서의 칼슘 반응 (문헌 [White et al., Philos. Trans. R. Soc. London [Biol] 314:1-340 (1986)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 모니터링하였다. 결과는 icas#3이 AIA 뉴런에서 유의하게 증가된 G-CaMP 형광을 유발하였음을 나타냈고 (도 2D-E), 이는 3가지 비-인돌 아스카로시드의 혼합물로 AIA 개재뉴런을 자극하는 것에 대해 보고된 결과와 유사하였다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 결과들은 ASK 감각 뉴런이 icas에 대한 반응에 필요하다는 것과 이러한 반응이 AIA 개재뉴런을 통해 변환된다는 것을 나타낸다.
실시예 28 - icas #3 및 ascr #3이 경쟁 신호이다
기존의 연구에서, 높은 다우어-유도 농도의 ascr#3이 군거성 및 고립성 자웅동체 양쪽 모두를 강하게 방지하는 것으로 나타났다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). ascr#3의 추가가 자웅동체의 icas#3-매개 유인에 영향을 미칠 것인지 여부를 조사하기 위해, 12:1 (ascr#3:icas#3)의 거의 생리학적인 비율의 이러한 2가지 화합물을 함유하는 혼합물을 N2 자웅동체 유인이 3개의 동심 구역 A-C에서 채점되는 변형된 지점 유인 검정법에서 테스트하였다 (도 1A). 결과는 테스트된 2가지 농도 중 더 낮은 것 (120 fmol ascr#3 및 10 fmol icas#3),에서는 ascr#3의 존재가 icas#3-매개 유인에 영향을 미치지 않은 반면, 더 높은 농도의 ascr#3은 비례적으로 증가된 icas#3 농도에도 불구하고 강한 반발을 초래하였음을 나타낸다 (12 pmol ascr#3 및 1 pmol icas#3, 도 4A). 구역 A의 바깥쪽 가장자리로부터의 재처리 후, 다수의 벌레가 중앙 구역 A를 둘러싸는 원형 구역 B 내에 계속 "포획"되었고, 구역 A 내부의 높은 농도의 icas#3/ascr#3 블렌드에 의해 거부되었지만, 구역 B 내로 확산된 더 낮은 농도의 icas#3/ascr#3 블렌드에 의해서 유인되었다. 이러한 결과들은 높은 농도의 생리학적 icas#3/ascr#3 혼합물에서는 ascr#3의 반발 효과가 압도하는 반면, 더 낮은 농도에서는 icas#3에 의한 유인이 우세하다는 것을 나타낸다.
실시예 1-28의 논의
인돌 아스카로시드는 강하게 야생형 자웅동체를 유인하고 응집을 촉진하는 것으로 나타난 첫 번째 씨. 엘레간스 페로몬이다. 인돌 아스카로시드는 성별과 관계없이 방출 영역에 동종을 유인하고/하거나 구속시킨다는 점에서 응집 페로몬의 광범위한 정의에 합치한다 (문헌 [EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS (The Belknap Press of Harvard University, Cambridge, Mass., 25th Anniv. ed. 2000)]; [Shorey, Annu. Rev. Entomol. 18:349-80 (1973)]; [Wertheim et al., Annu. Rev. Entomol. 50:321-46 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 거동을 촉진하는 것에서, 벌레의 거동 반응이 단지 소수의 분자의 감지로부터 초래되어야 하도록 인돌 아스카로시드가 낮은 (페토몰) 농도에서 활성이다. 예를 들어, 10 fM의 icas#3 농도에서, 성체 자웅동체의 길이 및 직경에 상응하는 실린더 내에 단지 약 20개의 icas#3 분자가 함유되어 있다. 이의 높은 특이적 활성을 고려하면, 인돌 아스카로시드의 풍부도가 비-인돌 아스카로시드보다 훨씬 더 낮은 것이 합리적이다.
인돌 아스카로시드의 강한 유인성 성질은 이러한 화합물들이 동종을 바람직한 환경 예컨대 먹이원으로 유인하는 역할을 한다는 것을 시사한다. 그러나, 경쟁 실험으로부터의 결과는 icas#3에 의한 자웅동체의 유인이 높은 농도의 ascr#3 (자웅동체에 대해 반발성임)에 의해 상쇄될 수 있다는 것을 가리킨다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 경쟁 실험은 icas#3 및 ascr#3의 낮은 농도의 생리학적 블렌드에서는 icas#3의 유인성 성질이 우세한 반면, 높은 동도의 동일한 블렌드에서는 ascr#3에 의한 반발이 우세해진다는 것을 추가로 나타낸다 (도 4A). 이러한 발견은 다우어-유도 조건 + 높은 집단 밀도 하에, 회합된 높은 농도의 ascr#3은 분산을 촉진하는 반면 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 낮은 집단 밀도 및 이에 따른 더 낮은 농도의 ascr#3은 icas#3에 의해 매개되는 유인을 초래한다는 것을 시사한다. 따라서, icas 및 ascr는 집단 밀도 및 응집 수준을 조절하는 반대되는 자극을 나타낼 수 있다. 차례로, 집단 밀도, 먹이 이용가능성, 및 기타 환경 요인이 조절 회로의 일부로서 ascr 및 icas의 상대적인 생합성 속도에 영향을 미칠 수 있다.
인돌 아스카로시드는 농도 구배의 부재 하에서도 응집 거동에 영향을 미친다: 매우 낮은 배경 농도 (fM-pM)의 icas#3 및 icas#9가 자웅동체 (및 수컷)의 응집 경향을 강하게 증가시켰다. 이러한 발견은 icas#3 및 icas#9의 감지가 응집-촉진 (화학적 또는 기타) 신호 또는 조건, 예컨대 플레이트 상의 벌레에 의해 분비되는 추가적인 양의 icas에 대한 감수성을 증가시킨다는 것을 시하한다.
씨. 엘레간스에서의 응집은 먹이 이용가능성 및 산소 농도가 포함되는 다양한 세트의 유전 인자 및 환경 조건에 좌우되는 것으로 공지되어 있어, 상이한 소스들로부터의 입력물을 통합하는 뉴런 회로의 존재를 시사한다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Cheung et al., Curr. Biol. 15:905-17 (2005)]; [Coates & de Bono, Nature 419:925-29 (2002)]; [de Bono et al., Nature 419:899-903 (2002)]; [Gray et al., Nature 430:317-22 (2004)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 최근, 산소-감지 URX-뉴런 및 ascr-감지 ASK 뉴런이 포함되는 여러 상이한 감각 뉴런으로부터 유래되는 응집 및 유인 신호가 이러한 거동들을 조절하는 중심 허브로서 작용하는 것으로 제안된 RMG 개재뉴런 상에 집중되는 것으로 나타났다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). RMG 개재뉴런은 고립성 균주 (높은 NPR-1 활성)을 군거성 균주 (낮은 NPR-1 활성)와 구별하는 뉴로펩티드-Y 수용체 상동체 NPR-1의 작용의 중심 부위이다 (문헌 [de Bono & Bargmann, Cell 94:679-89 (1998)]; [Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-85 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 군거성 npr -1( lf ) 돌연변이체 자웅동체에서, 산소-감지 URX 뉴런은 박테리아 잔디의 가장자리에서 응집을 촉진하는 반면, 고립성 N2 자웅동체는 산소 구배에 반응하지 않는다. 유사하게, 고립성 자웅동체는 ascr에 의해 퇴치되는 반면, 군거성 npr-1(lf) 자웅동체는 크게 감소된 반발 또는 약한 유인을 나타내는 바와 같이, ascr에 의한 반발이 NPR-1에 좌우된다 (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
대조적으로, icas#3은 군거성 및 고립성 균주 양쪽 모두에서 자웅동체 유인 및 응집을 촉진하는 것으로 나타났다. icas#3은 고립성 N2, 뿐만 아니라 군거성 npr-1(lf) 자웅동체를 유인하였고, 고립성 균주 N2, NPR-1의 저활성 변이체를 보유하는 군거성 야생형 균주 RC301 및 CB4856 (하와이), 및 테스트된 2개의 npr -1 무효 대립유전자에서 자웅동체 응집을 증가시켰다. icas#3-매개 유인 및 응집이 높은 NPR-1 활성에 의해 감소되지 않았다는 발견은 이러한 icas#3-매개 거동이 다른 유형의 자극, 예컨대 낮은 산소 수준에 대한 응집 반응을 제어하는 것과 별개의 신호전달 경로에 의존한다는 것을 시사한다. 이는 NPR-1을 통해 다른 응집 반응을 조정하는 RMG 개재뉴런이 결여된 자웅동체가 icas#3에 여전히 유인되었다는 관찰에 의해 지지된다. 추가로, icas#3 플레이트 상에서의 벌레의 응집이 더욱 동적이었고 산소가 제한된 박테리아 잔디의 가장자리에 제한되지 않았다는 점에서 icas#3-매개 응집은 NPR-1-의존적 응집 거동과 상이하였다. 최대 응집을 유도하는 icas#3 농도 (1-10 pM, 도 6D)에서 벌레 속도가 유의하게 감소되지 않았고, icas#3-매개 응집이 응집성 NPR-1 돌연변이체 벌레에 대해 발견되는 것 (벌레 6-16마리의 평균 클럼프 크기)보다 더 적은 클럼핑 (벌레 3-5마리의 평균 클럼프 크기)과 연관되었다 (문헌 [Rogers et al., Curr. Biol. 16:649-59 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 관찰들은 icas#3-매개 응집이 NPR-1 및 RMG 개재뉴런에 의해 제어되는 응집 거동과 표현형 면에서 별개임을 나타낸다.
ascr에 의한 자웅동체 반발 및 수컷 유인과 유사하게 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), icas#3-매개 유인 및 응집이 ASK 뉴런에 의존적인 것으로 나타났고, 이는 씨. 엘레간스에서의 상이한 유형의 페로몬의 인지에 대한 이러한 감각 뉴런 쌍의 중심 역할을 확증한다 (도 2A-E). 추가로, icas#3 반응이 AIA 개재뉴런에 의존적인 것으로 나타났고, RMG 개재뉴런을 필요로 하지 않았다. 따라서, 감각 뉴런 ASK가 2가지 상이한 유형의 페로몬인 ascr 및 icas의 인지에 참여하는 것으로, 그리고 페로몬 신호의 구조적으로 다양한 어레이를 통합하는 복합적인 신경 및 유전 회로의 일부로서 2가지 상이한 신경생리학적 경로를 통해 이러한 신호들이 변환되는 것으로 보인다.
칼슘 트랜션트가 비-인돌 아스카로시드에 반응하여 앰피드 감각 뉴런로부터 기록되었다; 그러나, G-CaMP 형광에서의 보고된 변화가 비교적 작다 (약 20％ 정도) (문헌 [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [Kim et al., Science 326:994-98 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 최근, ASI 뉴런이 ascr#5의 센서로서 기능하고 ascr#5-수용체인 srg-36 및 srg-37을 발현함에도 불구하고, 비-인돌 아스카로시드 ascr#5가 ASI 감각 뉴런에서 칼슘 트랜션트를 유발하지 않는다는 것이 보고되었다 (문헌 [McGrath et al., Nature 477:321-25 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 유사하게, 광범위한 농도의 icas#3에 반응하여 ASK 뉴런에서 유의한 Ca2 + 트랜션트가 검출되지 않았다. icas#3은 매우 낮은 농도 (페토몰 내지 낮은 피코몰)에서 활성이기 때문에, 아마도 이러한 뉴런에서의 임의의 icas#3-유발 Ca2 + 신호가 비-인돌 아스카로시드의 것보다 심지어 더 낮을 것이다. 또한, ASK 뉴런이 다수의 다른 감각 뉴런에 대해 시냅스후라는 것을 고려하면, icas#3 신호전달에서의 추가적인 뉴런의 개선이 있을 수 있다 (문헌 [White et al., Philos. Trans. R. Soc. London [Biol] 314:1-340 (1986)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 특히, 본원에서 제시된 바와 같이, icas#3은 ASK 감각 뉴런의 주요 시냅스후 표적인 AIA 개재뉴런에서 G-CaMP 형광의 유의한 변화를 유발하였다 (도 2D-E).
응집 신호로서의 인돌 아스카로시드의 확인은 씨. 엘레간스에서의 군거성 신호전달의 뜻밖의 복잡성을 드러낸다. 본원에서의 결과들은 아스카릴로스-유래 소형 분자 (icas 및 ascr)가 씨. 엘레간스에서의 3가지 이상의 별개의 기능에서 역할을 한다는 것을 가리킨다: 다우어 유도, 수컷 유인, 및 자웅동체 군거성 신호전달 (도 4B). 기존의 연구에서, ascr에 종종 1가지를 초과하는 기능이 있는 것으로 나타났다. 예를 들어, ascr#3은 다우어 신호전달 및 수컷 유인 양쪽 모두에 대해 상당한 역할을 한다 (문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 본원에서의 결과들은 아스카릴로스-유래 소형 분자의 특정한 구조 변이체가 특정 기능과 연관된다는 것을 실연한다 (도 4C). ascr에 인돌 카르복시 기가 부가되는 것은 이러한 인돌-변형 화합물에 미변형 화합물의 것과 매우 상이한 신호전달 효과가 있을 수 있도록 신호전달 성질을 변화시킨다: icas#3은 강하게 자웅동체를 유인하고 응집을 촉진하는 반면, ascr#3은 자웅동체를 반발시키고 수컷을 유인한다. 구조적 변동에 더하여, 별개의 신호전달 기능이 상이한 농도 창과 연관된다는 것이 본원에서 또한 제시되었다: 높은 나노몰 농도의 ascr가 다우어 형성에 필요한 한편, 낮은 나노몰 내지 높은 피코몰 농도의 ascr는 수컷 유인을 촉진하고, 피코몰 내지 페토몰 농도의 icas는 자웅동체 유인 및 응집을 촉진한다(도 4B).
따라서 씨. 엘레간스에서의 군거성 신호전달이 여러 구조적으로 상이한 건축 블록의 조합형 어셈블리로부터 유래되는, 소형 분자들의 모듈형 언어를 기초로 하는 것으로 보인다 (도 4C). 이러한 건축 블록들의 상이한 조합은 상이한, 때로는 중첩되는 신호전달 기능의 역할을 한다. 동일한 측쇄가 있는 ascr 및 icas의 상대 풍부도에 대한 결과 (도 9G)는 상이한 건축 블록의 통합이 신중하게 제어된다는 것을 가리킨다. 생화학적으로, 건축 블록은 3가지 기본적인 대사 경로로부터 유래된다: 탄수화물 대사, 과산화소체 지방산 β-산화, 및 아미노산 대사. 이러한 구조적인 관찰은 소형 분자를 통한 군거성 신호전달이 생물의 전체적인 대사 상태로부터의 입력물을 변환시킨다는 가능성을 제기한다. 기타 환경 요인과 조합된 먹이 이용가능성 및 영양소 함량이 응집, 짝 유인 및 발달 시기결정을 차별적으로 조절하는 특정 페로몬 블렌드를 생성하도록 ascr 및 icas 생합성 경로를 제어할 수 있다. 모듈형 화학 언어의 확장성 어휘는 상이한 선충이 동종성으로, 뿐만 아니라 이종성으로 신호를 전달하는 것을 가능하게 할 것이지만, 씨. 엘레간스 이외의 선충 종이 화학적 통신을 위해 아스카릴로스를 기초로 하는 소형 분자에 의존하는지 여부는 공지되지 않았다. 아스카릴로스의 지질-유래 글리코시드가 여러 다른 선충 종으로부터 확인되었고 (문헌 [Bartley et al., J. Nat. Prod. 59:921-26 (1996)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이는 선충이 ascr- 또는 icas-유사 화합물을 생산하는 능력이 있을 수 있다는 것을 가리킬 수 있다.
유인 및 응집 신호로서의 인돌 아스카로시드의 확인은 씨. 엘레간스 응집 거동이 특정 환경 조건에 대한 단지 공유된 선호도가 아니라 동종에 의해 생산된 전용 화학 신호에 좌우된다는 것을 실연하였다. 따라서 씨. 엘레간스 군거성 신호전달은 기존에 예측된 것보다 유의하게 더욱 고도로 진화된 것으로 보인다.
실시예 29 - 분석 기기 조작
NMR 스펙트럼을 배리안 INOVA 600 (1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz), INOVA 500 (1H에 대해 500 MHz, 13C에 대해 125 MHz), 또는 INOVA 400 (1H에 대해 400 MHz, 13C에 대해 100 MHz) 분광계 상에서 기록하였다. 배리안 VNMR, 메스트레랩스 메스트렉 및 엠노바(Mnova) 소프트웨어 패키지를 사용하여 NMR-스펙트럼을 프로세싱하였다.
다이오드 어레이 검출기가 장착되고 쿼트로 II 질량 분광계 (마이크로매스/워터스)에 연결된 애질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 저해상도 HPLC-MS 및 HPLC-MS/MS를 수행하였다. LTQ 오비트랩 벨로스(Orbitrap Velos) 하이브리드 푸리에 변환 (FT) 질량 분광계 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 커넬 유니버시티 라이프 사이언시즈 코어 래버러토리즈 센터(Cornell University Life Sciences Core Laboratories Center))를 사용하여 고해상도 MS/MS를 수행하였다. 제보(Xevo) G2 QTof 질량 분광계에 연결된 워터스(Waters)의 어퀴티(Acquity) UPLC HSS C-18 칼럼 (2.1 × 100 mm, 1.8 ㎛ 입자 직경)이 장착된 워터스의 나노어퀴티(nanoACQUITY) UPLC 시스템을 사용하여 고해상도 HPLC-MS를 수행하였다. 매스링크스 소프트웨어를 MS 데이터 취득 및 프로세싱에 사용하였다.
텔레다인 ISCO의 콤비플래시 시스템을 사용하여 플래시 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. 텔레다인 ISCO의 폭시(Foxy) 200 분획 수집기에 커플링된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4×250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 분획화를 수행하였다.
실시예 30 - 씨. 엘레간스 균주 및 일반적인 배양 방법
씨. 엘레간스 변종 브리스톨, 균주 N2 (야생형), acox -1( ok2257 ), dhs -28(hj8), maoc -1( hj13 ), maoc -1( ok2645 ), daf -22(m130), daf -22( ok693 ), F58F9.7(tm4033), C48B4.1(ok2619), F59F4.1(ok2119), 및 F08A8.3(tm5192)를 박토 한천 (BD 바이오사이언시즈)으로 제조되고 철야 성장된 이. 콜라이 OP50이 시딩된 NGM 한천 플레이트 상에서 20℃에서 유지시켰다.
실시예 31 - 대사산물 추출물의 제조
4개의 10 cm NGM 플레이트로부터의 야생형 (N2, 브리스톨) 또는 acox -1(ok2257), maoc -1( hj13 ), dhs -28( hj8), 및 daf -22( ok693 ) 돌연변이체 벌레를 M9-배지를 사용하여 100 ㎖ S-배지 예비배양물 내로 세정하고, 여기서 4일 동안 22℃에서 220 회전/분 (rpm)의 회전식 진탕기 상에서 성장시켰다. 1 ℓ의 박테리아 배양물로부터 유래된 농축된 이. 콜라이 OP50을 제1일 및 제3일에 먹이로서 첨가하였다. 이어서, 제4일에 각각의 예비배양물을 100 ㎖의 S-배지를 함유하는 4개의 500 ㎖ 삼각 플라스크 내로 균등하게 분할하였다. 이러한 배양물 중 2개 (비-결핍 (NS)으로 표지됨)를 5일 동안 22℃에서 회전식 진탕기 상에서 성장시켰고, 500 ㎖의 박테리아 배양물로부터 유래된 농축된 OP50을 제1일부터 제4일까지 매일 공급하였다. 각각의 세트의 나머지 2개의 배양물 (결핍 (S)로 표지됨)에는 500 ㎖의 박테리아 배양물로부터 유래된 농축된 OP50을 제1일에 공급하였고, 추가로 9일 동안 22℃에서 회전식 진탕기 상에서 먹이 없이 성장시켰다. 이어서, NS는 제5일, S는 제10일에 배양물을 수확하고, 원심분리하였다. 생성된 상청액 배지 및 벌레 펠릿을 별도로 드라이 아이스-아세톤 슬러시 상에서 냉동시키고, 동결건조시켰다. 상청액으로부터의 동결건조된 물질을 실온에서 16시간 동안 150 ㎖의 95％ 에탄올로 추출하였다. 벌레 펠릿을 모르타르 및 막자를 사용하여 ~2 g의 과립형 NaCl로 분쇄하고, 실온에서 16시간 동안 100 ㎖의 100％ 에탄올로 추출하였다. 생성된 현탁액을 여과하였다. 여과액을 진공, 실온에서 증발시켜, 배지 대사산물 (벌레 "엑스크리톰") 추출물 및 벌레 펠릿 대사산물 추출물이 생산되었다.
실시예 32 - daf -22(m130)를 이용한 아스카로시드 급식 실험
daf -22( ok693 ) 돌연변이체보다 아스카로시드 첨가로 인한 성장 결함에 대해 덜 민감성인 daf -22(m130) 돌연변이체로 아스카로시드 급식 실험을 수행하였다. daf-22(m130)의 HPLC-MS 분석은 daf -22( ok693 )과 유사한 아스카로시드 프로파일, 특히 사슬 길이가 탄소 12개 미만인 짧은 사슬 아스카로시드의 총체적인 결여를 나타냈다. 예비 배양물 분할 후 제1일에 첨가된 배양물 당 5 μM의 ascr#3 또는 ascr#10과 oscr#10의 1:1 혼합물의 첨가를 제외하고는 daf -22 (m130)의 비-결핍 배양물을 실시예 31에 기술된 바와 같이 성장시켰다.
실시예 33 - 샘플 제조
배지 또는 벌레 펠릿 대사산물 추출물을 ~15 ㎖ 메탄올에 재현탁시키고, 원심분리하였다. 그 후, 상청액을 수집하고, 진공, 실온에서 원심분리하고, 1 ㎖ 메탄올에 재현탁시키고, 원심분리하였다. 30 ㎕의 생성된 추출물을 LC-MS/MS 분석을 위해 직접적으로 주입하였다.
실시예 34 - 질량 분광측정 분석
10:1 분할을 사용하여 쿼트로 II 질량 분광계에 연결된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 저해상도 HPLC-MS/MS 프로파일링을 수행하였다. 0.1％ 아세트산-아세토니트릴 용매 구배를 3.6 ㎖/분의 유속으로 사용하였고, 이때 5분 동안 5％의 아세토니트릴 함량으로 시작하여 40분의 기간에 걸쳐 100％로 증가시켰다. 3.5 kV의 모세관 전압 및 각각 -40 V 및 +20 V의 콘(cone) 전압을 사용하여, 음이온 및 양이온 모드의 HPLC-ESI-MS로 대사산물 추출물을 분석하였다. m/z = 73.0의 전구체 이온 (음성 모드) 및 130.0의 중성 상실 (양성 모드)에 대한 HPLC-MS/MS 스크리닝을 2.1 mtorr 및 30 eV에서 아르곤을 충돌 기체로 사용하여 수행하였다. LTQ 오비트랩을 사용하여 고해상도 MS/MS에 의해 아스카로시드 단편화를 추가로 분석하였다. 신규 화합물의 원소 조성을 확인하기 위해, 제보 G2 QTof를 사용하여 고해상도 HPLC-MS에 의해 돌연변이체 대사체 샘플 및 분획을 추가적으로 분석하였다.
실시예 35 - 아스카로시드 oscr #9의 합성
아스카로시드 oscr#9를 하기 반응식 2에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 2]
Figure pct00054
3을 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (1, 132 ㎎, 263 μmol, 문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 및 메틸 5-히드록시펜타노에이트 (2, 125 ㎎, 950 μmol, 문헌 [Huckstep et al., Synthesis 10:881-82 (1982)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 20-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 메틸 5-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)펜타노에이트 (3) (66.8 ㎎, 142 μmol, 47％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00055
도 15A-B 참조.
oscr#9를 제조하기 위해, 건조 THF (0.5 ㎖) 내의 3 (66.8 ㎎, 142 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (4 ㎖) 내의 LiOH (28 ㎎, 1.4 mmol) 및 물 (0.6 ㎖)의 혼합물에 첨가하였다. 66℃에서 2시간 동안 교반한 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 1％ 아세트산을 함유하는 DCM 내의 5-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 5-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)펜탄산 (oscr#9) (26 ㎎, 105 μmol, 74％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00056
도 16A-B 참조.
실시예 36 - 아스카로시드 oscr #10의 합성
아스카로시드 oscr#10을 하기 반응식 3에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 3]
Figure pct00057
5를 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (1, 132 ㎎, 263 μmol, 문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 및 메틸 9-히드록시노나노에이트 (4, 112.8 ㎎, 600 μmol, 문헌 [Kai et al., Tetrahedron 64:6760-69 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 20-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 메틸 9-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)노나노에이트 (5) (99.3 ㎎, 190 μmol, 72％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00058
도 17A-B 참조.
ascr#10을 제조하기 위해, THF (500 ㎕) 내의 5 (99.3 ㎎, 190 μmol)의 용액을 5 ㎖ 1,4-디옥산 (5 ㎖) 내의 LiOH (38 ㎎, 1.9 mmol) 및 물 (800 ㎕)의 혼합물에 첨가하였다. 66℃에서 3시간 동안 교반한 후, 용액을 아세트산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 1％ 빙초산을 함유하는 DCM 내의 5-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 9-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)노난산 (oscr#10) (49 ㎎, 161 μmol, 85％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00059
도 18A-B 참조.
실시예 37 - 아스카로시드 bhas #10의 합성
아스카로시드 bhas#10을 하기 반응식 4에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 4]
Figure pct00060
9를 제조하기 위해, 건조 DCM (10 ㎖) 내의 6 (366 ㎎, 1.91 mmol, 문헌 [Guan & Greenberg, J. Am. Chem. Soc. 131:15225-31 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 및 7 (104 ㎎, 380 μmol, 문헌 [Evans & Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 DCM (0.5 ㎖) 내의 1,4-벤조퀴논 (4 ㎎, 38 μmol)으로 처리하고, 10분 동안 교반하였다. DCM (0.5 ㎖) 내의 그룹스(Grubbs) 2세대 촉매 (16 ㎎, 19 μmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 교반하였다. 20시간 후, 혼합물을 소형 실리카 층에서 여과하고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-20％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 원하는 생성물 8 및 동종이량체 6의 혼합물이 산출되었다. 혼합물을 추가로 정제하지 않았다; 대신, 미정제 혼합물 (160 ㎎)을 에탄올 (2 ㎖)에 용해시키고, Pd/C (15 ㎎, 10％, w/w)로 처리하고, 40시간 동안 수소화시켰다. 생성된 혼합물을 여과하고, 진공에서 농축하고, 헥산 내의 10-30％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하여, 에틸 (8R)-히드록시-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시노나노에이트 (9) (48 ㎎, 144 μmol, 2단계에 걸쳐 38％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00061
도 19 참조.
10을 제조하기 위해, -10℃의 건조 DCM (2 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (1, 62 ㎎, 120 μmol, 문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 9 (47 ㎎, 141 μmol) 및 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (10 ㎕)로 처리하였다. 3.5시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 (8R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시노나노에이트 (10) (4.0 ㎎, 7.2 μmol, 6％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00062
도 20 참조.
bhas#10을 제조하기 위해, THF (150 ㎕) 내의 10 (4 ㎎, 7.2 μmol)의 용액을 67℃의 물 (100 ㎕) 및 1,4-디옥산 (250 ㎖) 내의 LiOH (7 ㎎, 290 ㎕)로 5시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 아세트산 (100 ㎕)으로 산성화시키고, 진공에서 농축하고, 메탄올 (2 ㎖)로 처리하고, 진공에서 농축하였다. DCM + 0.5％ 빙초산 내의 5-25％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (8R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시노난산 (bhas#10) (1.5 ㎎, 4.7 μmol; 65％)이 무색 오일로서 산출되었다.
bhas#10에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 4에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 21A-D 참조.
Figure pct00063
실시예 38 - 아스카로시드 bhas #22의 합성
아스카로시드 bhas#22를 하기 반응식 5에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 5]
Figure pct00064
12를 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (1, 132 ㎎, 263 μmol, 문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 (8R)-히드록시논-1-엔 (11, 85.2 ㎎, 600 μmol, 문헌 [Ferrie et al., Synlett 18:2891-93 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 및 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-30％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (8R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-1-엔 (12) (71.0 ㎎, 148 μmol, 56％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00065
도 22A-B 참조.
13을 제조하기 위해, 건조 DCM (2 ㎖) 내의 12 (38 ㎎, 80 μmol) 및 7 (65 ㎎, 240 μmol, 문헌 [Evans & Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 DCM (0.5 ㎖) 내의 1,4-벤조퀴논 (1 ㎎, 8 μmol)으로 처리하고, 10분 동안 교반하였다. DCM (0.5 ㎖) 내의 그룹스 2세대 촉매 (3 ㎎, 4 μmol)의 용액을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 교반하였다. 20시간 후, 혼합물을 소형 실리카 층에서 여과하고 진공에서 농축하였다. 헥산 및 에틸 아세테이트의 5:1 혼합물을 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시트리데크-5-에노에이트 (13) (17.0 ㎎, 23 μmol, 29％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00066
도 23 참조.
14를 제조하기 위해, 메탄올 (1.5 ㎖) 내의 13 (14.2 ㎎, 18.9 μmol)의 요액을 Pd/C로 처리하고, 24시간 동안 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 진공에서 농축하여, 에틸 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시트리데카노에이트 (14) (12.8 ㎎, 17.0 μmol, 90％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00067
도 24 참조.
15를 제조하기 위해, 아세토니트릴 (1 ㎖) 내의 14 (19.5 ㎎, 26.8 μmol)의 용액을 아세토니트릴 (100 ㎕) 내의 40％ 수성 플루오린화수소산 (10 ㎕)으로 처리하였다. 1시간 동안 교반한 후, 용액을 NaHCO3 (100 ㎎)로 15분 동안 처리하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 5-80％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 (12R)-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시트리데카노에이트 (15) (12.0 ㎎, 19.6 μmol; 73％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00068
도 25 참조.
bhas#22를 제조하기 위해, THF (1 ㎖) 내의 15 (12 ㎎, 19.6 μmol)의 용액을 67℃의 물 (200 ㎕) 및 1,4-디옥산 (2 ㎖) 내의 LiOH (15 ㎎)로 3시간 동안 처리하였다. 반응 혼합물을 아세트산 (100 ㎕)으로 산성화시키고, 진공에서 농축하고, 메탄올 (2 ㎖)로 처리하고, 진공에서 농축하였다. DCM + 0.2％ 아세트산 내의 5-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (12R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시트리데칸산 (bhas#22) (7.3 ㎎, 19.4 μmol; 99 ％)이 무색 오일로서 산출되었다.
bhas#22에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 5에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 26A-D 참조.
Figure pct00069
실시예 39 - 아스카로시드 bhos #26의 합성
아스카로시드 bhos#26을 하기 반응식 6에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 6]
Figure pct00070
17을 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (1, 132 ㎎, 263 μmol, 문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 11-히드록시운데크-1-엔 (16, 102 ㎎, 600 μmol) 및 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-30％ (v/v) 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 11-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)운데크-1-엔 (17) (92.3 ㎎, 182 μmol, 69％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00071
도 27A-B 참조.
18을 제조하기 위해, 건조 DCM (2 ㎖) 내의 17 (30.8 ㎎, 60 μmol) 및 7 (50 ㎎, 180 μmol, 문헌 [Evans & Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 DCM (0.5 ㎖) 내의 1,4-벤조퀴논 (1 ㎎, 8 μmol)으로 처리하고, 10분 동안 교반하였다. DCM (0.5 ㎖) 내의그룹스 2세대 촉매 (3 ㎎, 4 μmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 40℃에서 교반하였다. 20시간 후, 혼합물을 소형 실리카 층에서 여과하고 진공에서 농축하였다. 헥산 및 에틸 아세테이트의 5:1 혼합물을 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시펜타데크-5-에노에이트 (18) (14.2 ㎎, 18.9 μmol, 31％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00072
도 28 참조.
19를 제조하기 위해, 메탄올 (1.5 ㎖) 내의 18 (14.2 ㎎, 18.9 μmol)의 용액을 Pd/C (10 ㎎, 10％, w/w)로 처리하고, 24시간 동안 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 5-80％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-tert-부틸디메틸실릴옥시펜타데카노에이트 (19) (12.8 ㎎, 17.0 μmol, 90％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00073
도 29 참조.
20을 제조하기 위해, 아세토니트릴 (2 ㎖) 내의 19 (9.2 ㎎, 12.2 μmol)의 용액을 40％ 플루오린화수소산 (20 ㎕)으로 처리하였다. 1시간 동안 교반한 후, 용액을 NaHCO3 (100 ㎎)로 15분 동안 처리하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 5-80％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 에틸 15-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시펜타데카노에이트 (20) (4.4 ㎎, 6.9 μmol; 57％)이 산출되었다.
Figure pct00074
도 30 참조.
bhos#26을 제조하기 위해, THF (1 ㎖) 내의 20 (4.4 ㎎, 6.9 μmol)의 용액을 물 (200 ㎕) 및 1,4-디옥산 (2 ㎖) 내의 LiOH (5 ㎎)의 용액으로 처리하고, 67℃에서 교반하였다. 3시간 후, 용액을 빙초산 (50 ㎕)으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. DCM + 0.2％ 아세트산 내의 5-50％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 15-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-(3R)-히드록시펜타데칸산 (bhos#26) (2.3 ㎎, 5.7 μmol; 83％)이 산출되었다.
bhos#26에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 6에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 31A-D 참조.
Figure pct00075
실시예 40 - 아스카로시드 icos #10의 합성
아스카로시드 icos#10을 하기 반응식 7에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 7]
Figure pct00076
icos#10을 제조하기 위해, 메탄올 (1 ㎖) 및 톨루엔 (1 ㎖)의 혼합물 내의 oscr#10 (12 ㎎, 39.5 μmol)의 용액을 디에틸 에테르 (23 ㎕, 46 μmol) 내의 2.0 M TMS-디아조메탄으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후, 아세트산 (20 ㎕) 첨가로 과량의 시약을 켄칭(quenching)시키고, 용액을 진공에서 농축하였다. DCM 내의 5-10％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 메틸 에스테르 (11.3 ㎎, 35.5 μmol, 90％)가 무색 고체로서 산출되었다.
-20℃의 DCM (1 ㎖) 내의 메틸 에스테르의 용액을 DIPEA (175 ㎕, 1 mmol) 및 인돌카르복실산 클로라이드로 처리하였다. 0℃의 DCM (2 ㎖) 내의 인돌-3-카르복실산 (68 ㎎, 420 μmol)을 DMF (10 ㎕) 및 SOCl2 (72 ㎕, 840 μmol)로 처리함으로써 인돌카르복실산 클로라이드를 신선하게 제조하였다. 반응 혼합물을 20분 동안 실온에서 교반한 후, 용액을 진공에서 농축하고, DCM (2 ㎖)을 적가하였다. 용액을 -7℃에 도달하게 한 후, 포화 수성 NaHCO3 용액 (2 ㎖)으로 켄칭시켰다. 수성 상을 DCM (2 ㎖, 3회)으로 추출하였다. 조합된 유기 상을 Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. DCM 내의 5-10％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 인돌 카르복실레이트 에스테르 (8.4 ㎎, 18.2 μmol, 51％)의 이성질체성 혼합물이 산출되었다. 생성된 인돌 카르복실레이트 에스테르의 이성질체성 혼합물을 THF (1 ㎖)에 용해시키고, 67℃의 물 (0.5 ㎖) 및 1,4-디옥산 (2 ㎖) 내의 LiOH (2.8 ㎎, 116 μmol)의 용액으로 처리하였다. 2시간 동안 교반한 후, 용액을 아세트산 (30 ㎕)으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 0.2％ 아세트산을 함유하는 DCM 내의 5-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 icos#10 이성질체의 이성질체성 혼합물이 산출되었다. HPLC로 9-(5'R-((1H)-Indole-3-카르보닐옥시)-3'R-히드록시-6'S-메틸-테트라히드로-(2H)-피란-2'-일옥시)노난산 (icos#10) (0.6 ㎎, 1.3 μmol, 7％) 및 이의 이성질체 (0.3 ㎎, 0.67 μmol, 3.7％)의 순수한 샘플이 산출되었다.
icos#10에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 7에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 32A-D 참조.
Figure pct00077
실시예 41 - 아스카로시드 hbas #3의 합성
아스카로시드 hbas#3을 하기 반응식 8에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 8]
Figure pct00078
22를 제조하기 위해, DMF (7 ㎖) 내의 4-히드록시벤조산 (21, 1.52 g, 10 mmol)의 용액을 DIPEA (5.2 ㎖, 30 mmol) 및 tert-부틸디메틸 실릴 클로라이드 (3.7 g, 24.5 mmol)로 처리하였다. 12시간 후, 1 M H3PO4를 첨가하여 혼합물의 pH를 4로 만들었다. 혼합물을 헥산 (15 ㎖)으로 2회 추출하였다. 유기 상을 물 (15 ㎖)로 2회 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 잔류물 (3.7 g)을 THF (10 ㎖)에 용해시키고, 물 (7 ㎖) 및 빙초산 (21 ㎖)으로 처리하였다. 90분 동안 교반한 후, 혼합물을 얼음물에 첨가하고, 디에틸 에테르 및 헥산 (30 ㎖)의 1:1 혼합물 (v/v)로 2회 추출하였다. 유기 상을 물 (30 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 0.2％ 아세트산을 함유하는 DCM 내의 5-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 4-tert-부틸디메틸실릴옥시벤조산 (22, 1.42 g, 5.3 mol, 53％)이 백색 고체로서 산출되었다.
Figure pct00079
도 33A-B 참조.
hbas#3을 제조하기 위해, 건조 DCM (500 ㎕) 내의 아스카로시드#3 메틸 에스테르 (23, 5.7 ㎎, 18 μmol, 문헌 [Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10:e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 22 (11.0 ㎎, 41 μmol), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC, 9.0 ㎎, 47 μmol), 및 4-디메틸아미노피리딘 (DMAP, 6.2 ㎎, 51 μmol)으로 처리하였다. 48시간 동안 교반한 후, 용액을 진공에서 농축하고, H2O (500 ㎕)로 처리하였다. 생성된 생성물을 DCM (1 ㎖, 3회)으로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. DCM 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 4-tert-부틸디메틸실릴옥시벤조일-아스카로시드#3 메틸 에스테르의 이성질체성 혼합물 (7.3 ㎎, 12.9 μmol; 72％)이 산출되었다.
방향족 tert-부틸디메틸실릴옥시 기 (문헌 [Jiang & Wang, Tetrahedron Lett. 44:3859-61 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 탈보호를 위해, DMF (360 ㎕) 내의 (4-tert-부틸디메틸실릴옥시벤조일)-아스카로시드#3 메틸 에스테르의 혼합물 (6.0 ㎎, 10.7 μmol)을 H2O (36 ㎕) 내의 Cs2CO3 (1.9 ㎎, 5.4 μmol)으로 처리하고, 3.5시간 동안 교반하였다. 생성된 생성물을 DCM (1 ㎖, 2회)으로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. DCM 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 4-히드록시벤조일-아스카로시드#3 메틸 에스테르의 이성질체성 혼합물 (4.5 ㎎, 10.0 μmol; 93％)이 산출되었다. 메틸 에스테르 기의 절단을 위해, THF (100 ㎕) 내의 4-히드록시벤조일-아스카로시드#3 메틸 에스테르의 혼합물 (4.5 ㎎, 10.0 μmol)을 67℃의 H2O (30 ㎕) 및 1,4-디옥산 (500 ㎕) 내의 LiOH (2.3 ㎎)로 처리하였다. 2시간 후, 빙초산 (50 ㎕)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 용액을 진공에서 농축하였다. DCM + 0.2％ 아세트산 내의 5-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 hbas#3 이성질체의 이성질체성 혼합물 (1.2 ㎎, 2.8 μmol, 28％)이 산출되었다. HPLC로 (8R)-(3'R-히드록시-5'R-(4-히드록시벤조일옥시)-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-(2E)-엔산 (hbas#3) (0.6 ㎎, 1.4 μmol; 14％) 및 이의 이성질체 (0.6 ㎎, 1.4 μmol; 14％)의 순수한 샘플이 산출되었다.
hbas#3에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 8에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 34A-C 참조.
Figure pct00080
실시예 42 - 아스카로시드 mbas #3의 합성
아스카로시드 mbas#3을 하기 반응식 9에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 9]
Figure pct00081
mbas#3을 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (1 ㎖) 내의 아스카로시드#3 메틸 에스테르 (23, 10 ㎎, 31.4 μmol, 문헌 [Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10:e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 용액을 DIPEA (110 ㎕, 630 μmol)로 처리하였다. DCM (0.5 ㎖) 내의 (E)-2-메틸부트-2-엔산 클로라이드 (35 ㎕, 316 μmol)를 적가하였다. 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, 용액을 실온으로 되돌리고, 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 처리하였다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 5-25％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 크로마토그래피로 디-티글레이트 에스테르 (5.2 ㎎, 10.8 μmol, 34％)가 황색을 띠는 고체로서 산출되었다.
생성물 (4.5 ㎎, 9.4 μmol)을 THF (1 ㎖)에 용해시키고, 물 (100 ㎕) 및 1,4-디옥산 (2 ㎖) 내의 LiOH (0.5 ㎎, 22 μmol)로 처리하였다. 67℃에서 3시간 동안 교반한 후, 빙초산 (100 ㎕)을 첨가하여 반응을 켄칭시켰다. 용액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 진공에서 농축하였다. 0.2％ 아세트산을 함유하는 DCM 내의 0-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 mbas#3 이성질체의 혼합물 (2.1 ㎎, 5.45 μmol)이 산출되었다. HPLC로 씨. 엘레간스로부터의 천연 생성물과 동일한 (8R)-(3'R-히드록시-5'R-(E)-(2-메틸부트-2-에노일옥시)-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)논-(2E)-엔산 (mbas#3)의 순수한 샘플 (1.2 ㎎, 3.1 μmol; 33％ 수율)이 제공되었다.
mbas#3에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 9에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 35A-B 참조.
Figure pct00082
실시예 43 - 아스카로시드 glas #10의 합성
아스카로시드 glas#10을 하기 반응식 10에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 10]
Figure pct00083
glas#10을 제조하기 위해, 건조 DMF (2 ㎖) 내의 ascr#10 (3 ㎎, 9.9 μmol)의 용액을 2,3,4,6-테트라-O-벤질-D-글루코스 (11 ㎎, 20 μmol), DMAP (12.2 ㎎, 100 μmol), 및 EDC (19.2 ㎎, 100 μmol)로 처리하였다. 실온에서 18시간 동안 교반한 후, 용액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 수성 아세트산 (200 ㎕)으로 처리하고, 농축하고, DCM 내의 5-50％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 정제하였다.
생성물을 에탄올 (1 ㎖)에 용해시키고, Pd/C (10 ㎎, 10％ Pd (w/w))로 처리하고, 24시간 동안 수소화시켰다. 혼합물을 여과하고, 진공에서 농축하였다. HPLC로 β-D-글루코실-아스카로시드#10 (1.5 ㎎, 3.22 μmol, 33％) 및 α-D-글루코실-아스카로시드#10 (1.2 ㎎, 2.58 μmol, 26％)의 순수한 샘플이 제공되었다.
glas#10에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 10에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD2HOD) = 49.05 ppm을 기준으로 한다. 도 36A-D 참조.
Figure pct00084
실시예 44 - 아스카로시드의 확인 및 정량
야생형 및 돌연변이체에서 검출된 아스카로시드 (ascr, oscr, bhas, bhos, icas, icos, ibha, ibho 및 glas)의 확인을 위해, HPLC-체류 시간을 m/z (또는 사슬 길이)에 대해 플롯팅하였다. (HPLC-EMI-MS 데이터에 대해, 도 37A ((ω-1)-산소화 아스카로시드 (ascr)), 도 37B ((ω)-산소화 아스카로시드 (oscr)), 도 37C ((ω-1)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (bhas)), 도 37D ((ω)-산소화 β-히드록시아스카로시드 (bhos)), 도 37E ((ω-1)-산소화 인돌 아스카로시드 (icas)), 도 37F ((ω)-산소화 인돌 아스카로시드 (icos)), 도 37G ((ω-1)-산소화 인돌 β-히드록시 아스카로시드 (ibha)), 도 37H ((ω)-산소화 인돌 β-히드록시 아스카로시드 (ibho)), 도 37I (글루코실 아스카로시드 에스테르 (glas)), 도 37J (ascr#8, 및 4-(4-히드록시벤조일)- 및 4-(2-(E)-메틸-2-부테노일)-아스카로시드 (hbas 및 mbas)), 및 도 37K (ascr#2 및 ascr#6.1) 참조.) 동족체 시리즈에 속하는 성분들은 거의 선형인 용출 프로파일을 나타냈고 (도 38), 이는 시리즈 내의 성분들이 동일한 상대적인 입체화학을 공유한다는 것을 가리킨다. 그 후, 다양한 시리즈의 구조 및 입체화학을 (1) 대표적인 예의 단리 및 NMR 분석 (예를 들어, 도 39A-B, 40A-B, 41A-B, 42, 및 43A-B 참조), (2) 대표적인 예와 합성 표준물질의 비교, (3) 고해상도 MS로부터 확립된 바와 같은 분자식, (4) 특징적인 MS/MS 단편화 (도 44A-P 참조), 및 (5) 합성 샘플의 것으로부터 외삽된 체류 시간 값에 필적하는 HPLC-체류 시간을 기초로 확인하였다. α,β-불포화 아스카로시드의 (E)-형상이 ascr#3, (Z)-형상 ascr#3, 및 ascr#7과의 비교에 의해 확립되었고, 아실-CoA-옥시다제 (ACOX) 활성의 입체선택성에 의해 또한 시사되었다. β-히드록시아스카로시드 (bhas 및 bhos 시리즈)의 (3R)-입체화학은 대표적인 예로서의 bhas#10, bhas#22, 및 bhos#26의 합성 표준물질과의 비교로부터 추론되었고, MAOC-1 및 DHS-28과 (R)-선택적 MFE-2의 서열 상동성으로부터 또한 시사되었다 (도 45).
상응하는 이온 트레이스들로부터의 LC-MS 신호의 통합에 의해 아스카로시드의 정량을 수행하였다. ascr#1, ascr#3, ascr#5, ascr#7, ascr#9, ascr#10, oscr#9, oscr#10, bhas#22, bhos#26, icas#3, icas#9, icos#10, 및 glas#10의 합성 표준물질에 대해 결정된 반응 인자를 사용하여 아스카로시드 농도를 계산하였다. 대부분의 화합물에 대해, 질량 분광계 반응은 주입 당 1 pmol 내지 2 nmol의 양에 대해 대략적으로 선형이었다 (10％ 미만의 오차). 합성되지 않은 아스카로시드에 대한 반응 인자는 입수가능한 표준물질에 대해 관찰된 데이터를 기초로 외삽하였다. 일반적으로, 각각의 시리즈의 짧은 사슬 구성원들 (C7 미만의 측쇄)의 반응 인자 간에서는 강한 차이가 관찰된 반면, 더 긴 사슬 동족체들의 반응 인자 간에서는 차이가 작았다. 모든 시리즈의 모든 짧은 사슬 구성원이 합성되지 않았기 때문에, 일부 짧은 사슬 아스카로시드에 대해 보고된 절대량의 계통 오차가 더 긴 사슬 화합물에 대한 것보다 더 클 수 있었다.
배양 기간 및 벌레 바이오매스를 대략적으로 설명하기 위해, 엑스크리톰 및 벌레 펠릿 샘플의 아스카로시드 함량을 아스카로시드 (fmol)/배양 시간 (시간)/벨레 펠릿 건조 중량 (㎎)으로 기록하였다. 도 37-62에서 보고된 모든 정량적 데이터는 2회 이상의 독립적인 생물학적 반복으로부터 유래되었다.
실시예 45 - 지점 유인 검정법
hbas#3으로의 유인 검정법을 기존에 보고된 바와 같이 수행하였다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Pungaliya et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:7708-13 (2009]) (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 유인 검정법을 위해, 50-60마리의 자웅동체 벌레를 초기 제4 유충 단계 (L4)에 매일 수확하였고, 20℃에서 철야로 보관하여, 다음날 초기 성체로서 사용하였다. Hbas#3을 10％ 에탄올을 함유하는 물에 용해시켰다. 분취량을 -20℃에서 20 ㎕ 튜브에 보관하였다. 물 내의 10％ 에탄올을 대조군으로서 사용하였다.
실시예 46 - 화학주성을 측정하기 위한 사분면 검정법
10 cm 4-사분면 페트리 접시 상에서 hbas#3에 대한 화학주성을 평가하였다 (문헌 [Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 각각의 사분면은 플라스틱 스페이서로 인접한 사분면으로부터 분리되었다. 마주보는 사분면들의 쌍을 상이한 농도의 hbas#3을 함유하는 선충 성장 배지 (NGM) 한천으로 채웠다. 동물을 S-기본 완충제로 부드럽게 세정하고, 교대되는 사분면 내의 4-사분면 플레이트 + 아스카로시드의 중앙에 놓고, 15분 및 30분 후에 채점하였다. (아스카로시드 사분면 상의 동물수 - 완충제 사분면 상의 동물수) / (총 동물수)로서 화학주성 지수가 계산되었다.
실시예 47 - 통계 분석
야생형 및 돌연변이체 대사체 간의 아스카로시드 프로파일을 비교하기 위해, 그리고 hbas#3 상에서의 자웅동체의 유인을 비교하기 위해, 독립형 스튜던트 t 테스트 + 웰치 보정을 사용하였다 (*: P<0.05, **: P< 0.001, ***: P<0.0001). 여러 농도의 hbas#3의 화학주성 지수를 비교하기 위해 일원 ANOVA에 이어지는 던넷의 사후 테스트를 사용하였다 (*: P<0.05, **: P< 0.01).
실시예 48 - LC - MS / MS 가 야생형 씨. 엘레간스의 새로운 아스카로시드를 나타낸다
(1) 여러 씨. 엘레간스 균주 및 돌연변이체의 대사체 내의 공지된 아스카로시드의 감도 높은 검출 및 정량을 용이하게 하고, (2) 신규 아스카로시드 유도체의 발견을 촉진할 분석 방법을 개발하는 것이 바람직하였다.
씨. 엘레간스 대사체의 광대한 복잡성으로 인해, 대사산물 추출물의 HPLC-MS 분석은 극도로 혼잡한 크로마토그램을 초래하고, 이는 해석하기가 어렵다 (도 46A). 그러나, 구조적으로 관련된 아스카로시드들이 이의 검출을 위한 더욱 더 선택적이고 감도 높은 수단을 제공하는 특징적인 MS/MS 단편화 패턴을 나타낼 것 같았다. 따라서, 일련의 합성 아스카로시드의 ESI-MS/MS 단편화를 조사하였다.
음이온 전기분무 이온화 (ESI-)로, 아스카로시드가 아스카릴로스 단위로부터 유래된 m/z 73.02939 [C3H5O2]에서 강하고 고도로 진단성인 생성물 이온을 초래한 것이 발견되었다 (도 44A-P 및 46B). 이러한 검출 방법은 ESI- 조건 하에 잘 이온화되지 않는 ascr#2 및 ascr#4를 제외한 모든 공지된 아스카로시드에 대해 적절한 것으로 증명되었다. ESI+ 조건 하에서만 이온화하는 아스카로시드의 검출을 위해, 아스카릴로스 단위의 절단으로 인한 130.0663 amu [C6H10O3]의 중성 상실을 모니터링하였다. 그러나, 아스카로시드가 ESI+ 조건 하에 덜 검출가능하게 분해되기 때문에, 아스카로시드의 ESI+ MS/MS 검출이 ESI- MS/MS 검출보다 일반적으로 덜 민감한 것으로 발견되었다. 그 후, m/z 73의 전구체 이온에 대한 스크린을 씨. 엘레간스 야생형 대사체 내의 공지된 아스카로시드, 뿐만 아니라 미확인 아스카로시드를 검출하는데 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 테스트를 수행하였다. 다수의 벌레로부터의 축적된 배출된 대사산물 (벌레 "엑스크리톰")을 함유하는 액체 배양 대사산물 추출물을 사용하였다. 생성된 HPLC-MS/MS 크로마토그램은 다수의 잘 해상되는 피크를 나타냈고, 이들 중 대부분은 이전에 검출되지 않은 화합물들의 여러 패밀리를 포함하여 아스카로시드를 나타내는 것으로 확인되었다.
공지된 아스카로시드의 신원을 합성 표준물질을 사용하여 확증하였다. 또한, 공지된 포화 아스카로시드 ascr#1, ascr#9, 및 ascr#10에 6- 내지 15-탄소 측쇄가 있는 동족체가 실질적인 양으로 동반되는 것이 확인되었다 (도 46C 및 47A). 이러한 동족체성 시리즈의 확인은 고해상도 MS/MS, LC-체류 시간, 및 대표적인 구성원의 합성을 기초로 하였다 (실시예 44 및 도 38 참조). LC-MS/MS 스크린은 탄소 5개 내지 11개의 측쇄가 있는 아스카로시드에 더 적은 양의 약간 덜 극성인 이성질체가 동반되었음을 추가로 나타냈다. acox -1 돌연변이체 벌레들이 이러한 아스카로시드 이성질체들을 더욱 풍부하게 생산하였다.
야생형 MS/MS 크로마토그램에서의 여러 추가적인 피크들이 공지된 아스카로시드 시리즈 중 어느 것에도 할당될 수 없었다. 이러한 화합물 중 2개에 대해, m/z 301.1651 [C15H25O6]의 MS/MS 생성물 이온은 이들이 ascr#3 유도체를 나타낸다는 것을 시사한다. 추정 ascr#3 유도체를 분취용 HPLC로 단리하고, 2D NMR 분광법을 사용하여 분석하였으며 (dqfCOSY, 도 39A-B, 40A-B, 및 41A-B 참조), 이는 이러한 화합물들이 ascr#3을 기초로 하였음을 증명하였고, 추가로 아스카릴로스의 4-위치에 부착된 4-히드록시벤조일 또는 (E)-2-메틸-2-부테노일 (티글로일) 모이어티의 존재를 가리켰다 (도 47C). 이러한 구조적인 할당이 신뢰할 수 있는 샘플의 전합성을 통해 확인되었다 (실시예 41-42 참조). 최근에 보고된 ascr#3의 인돌-3-카르복시 유도체 ("icas#3") (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))와 유사하게, ascr#3의 4-히드록시벤조일 및 (E)-2-메틸-2-부테노일 유도체를 SMID으로 각각 "hbas#3" 및 "mbas#3"으로 명명하였다. hbas#3 및 mbas#3은 4-히드록시벤조일 및 (E)-2-메틸-2-부테노일 모이어티가 혼입된 최초의 아스카로시드였고, 이는 icas#3에서의 인돌-3-카르복시 모이어티 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))와 유사하게 아미노산 전구체로부터 유래될 수 있었다. 응집-유도성 인돌 아스카로시드 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 대한 구조적 유사성으로 인해, hbas#3을 벌레 거동에 대한 이의 효과에 대해 테스트하였다. hbas#3이 10 페토몰만큼 낮은 농도에서 씨. 엘레간스를 강하게 유인하였음이 발견되었고 (도 48A-B 참조), 이는 임의의 기존에 공지된 씨. 엘레간스 소형 분자 신호의 효능을 능가한다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 낮은 페토몰 활성은 동물에서의 소형 분자 신호에 대해 일반적이지 않지만, 일부 펩티드 호르몬 클래스의 것에 필적한다 (문헌 [Rittschof & Cohen, Peptides 25:1503-16 (2004)]; [Gozes et al., CNS Drug Rev. 11:353-68 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
실시예 49 - 아스카로시드 생합성에서의 과산화소체 β-산화
비교용 LC-MS/MS를 사용하여 아스카로시드 생체발생을 조사하였다. 연구는 아스카로시드의 측쇄가 더 긴 사슬의 전구체의 과산화소체 β-산화로부터 유래된다는 것과 아실-CoA 옥시다제 ACOX-1가 아스카로시드 측쇄 β-산화의 제1 단계에 참여하여 α,β-불포화를 도입한다는 것을 가리켰다 (도 49A-B) (문헌 [Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 척추동물, 뿐만 아니라 드로소필라(Drosophila)에서, 과산화소체 β-산화-이중 결합의 수화 및 β-케토아실-CoA 에스테르로의 탈수소화에서의 다음의 2개 단계가 1개의 단백질, 예를 들어, 다기능성 효소 유형 2 (MFE-2)에 의해 촉매된다. 이러한 2개의 효소 기능이 씨. 엘레간스에서는 데히드라타제(dehydratase) 및 데히드로게나제(dehydrogenase)가 별도의 단백질이도록 분리되는 것으로 보인다 (도 45) (문헌 [Haataja et al., Biochem. J. 435:771-81 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 인간 MFE-2의 (R)-민감성 β-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 도메인에 대한 상동성이 있는 단백질인 씨. 엘레간스 DHS-28이 β-히드록시아실-CoA-유도체를 상응하는 β-케토아실-CoA 중간체로 전환시키는데 참여하는 것 같고, 이어서 이러한 중간체가 β-케토아실-CoA 티올라제(thiolase) DAF-22 에 의해 절단되는 것으로 연구에서 나타났다 (문헌 [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)]; [Joo et al., Biochem. J. 422:61-71] (2009) (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 어떤 효소가 β-산화 케스케이드의 필수적인 제2 단계를 촉매하는 에노일-CoA 히드라타제(hydratase)로서의 역할을 하는지는 여전히 불명확하다.
본원에 기술된 MS/MS-based 아스카로시드 스크리닝 방법을 사용하여, acox -1(ok2257), dhs -28( hj8 ), 및 daf -22( ok693 ) 돌연변이체 벌레의 아스카로시드 프로파일을 다시 조사하였다. 추가적으로, 또 다른 연구가 maoc -1이 과산화소체 2-에노일-CoA 히드라타제를 코딩하였음을 가리켰고 (문헌 [Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이는 아스카로시드 β-산화의 수화 단계에 참여하는 것으로 가정되었다. 따라서, maoc -1( hj13 ) 벌레가 포함되는 여러 다른 과산화소체 돌연변이체의 엑스크리톰을 분석하였다.
실시예 50 - 측쇄 관능화가 β-산화에 선행한다
acox -1( ok2257 ) 돌연변이체 벌레의 엑스크리톰의 LC-MS/MS 분석에서, 야생형 배지의 우세한 성분인 α,β-불포화 ascr#3의 풍부도가 크게 감소되는 것으로 밝혀졌다 (도 50A-E). ascr#3 및 기타 α,β-불포화 아스카로시드의 이러한 감소는 아스카로시드 생산의 전체적인 하향 조절의 결과인 것으로 보이지 않았고, 오히려 일련의 포화 아스카로시드의 축적이 동반되었다. 예를 들어, ascr#3의 디히드로-유도체 및 직접적인 전구체인 ascr#10이 야생형 엑스크리톰보다 acox -1( ok2257 )에서 13.6배 더 풍부하였다. 11- 및 13-탄소 측쇄가 있는 상응하는 상동체인 ascr#18 및 ascr#22는 야생형 엑스크리톰보다 acox -1에서 각각 29배 및 66배 더 풍부하였다. acox -1( ok2257 ) 엑스크리톰 내의 더 긴 사슬의 포화 아스카로시드의 증강으로 아스카로시드 측쇄의 α,β-탈수소화에서의 ACOX-1의 중요성이 확증되었다 (도 49A). 아스카로시드 생합성이 acox -1( ok2257 ) 벌레에서 폐지되지 않기 때문에, 아직 확인되지 않은 다른 ACOX-효소가 긴 사슬 아스카로시드 전구체의 과산화소체 β-산화에 기여하는 것으로 보인다. 그러나, 여러 다른 과산화소체 acox 돌연변이체의 엑스크리톰의 LC-MS/MS 분석 (실시예 29-34 및 44-47 및 도 51] 참조)은 대부분 야생형과 유사한 아스카로시드 프로파일을 나타냈다.
acox -1( ok2257 ) 엑스크리톰의 추가적인 분석은 야생형 벌레에서 풍부하게 생산되는 주요 다우어 유도 아스카로시드 중 하나인 ascr#5의 완전한 부재를 나타냈다 (도 52). ascr#5는 이의 측쇄가 끝에서 두 번째의 탄소 ("ω-1 결합")가 아니라 말단 탄소 ("ω 결합")를 통해 아스카릴로스 당에 부착된다는 점에서 모든 다른 기존에 확인된 아스카로시드와 상이하다 (도 47B). ascr#5 대신, acox -1( ok2257 ) 내의 포화 아스카로시드의 신규 동족체 시리즈가 다량으로 검출되었고, 이는 더 적은 양으로 야생형 엑스크리톰에 또한 존재하였다 (도 52). 이러한 이성질체 시리즈의 가장 풍부한 성분을 분취용 HPLC를 통해 단리하였고, 이는 NMR 분광법에 의해 C5 측쇄가 있는 ω-연결 아스카로시드인 것으로 확인되었다 (도 42 및 47B). 이것은 acox -1에서 관찰된 추가적인 화합물 시리즈가 ω-연결 포화 아스카로시드 시리즈를 나타낸다는 것을 시사하고 (도 37B), 이는 C5 및 C9 ω-연결 아스카로시드의 합성에 의해 확증되었다 (실시예 35-36 참조). 이러한 (ω)-연결 아스카로시드를 이의 기존에 기술된 (ω-1)-연결 이성질체와 구별하기 위해, 새롭게 발견된 (ω)-연결 화합물을 SMID으로 "oscr"로 명명하였고, 예를 들어, ascr#9 및 ascr#10의 합성된 (ω)-연결 이성질체를 oscr#9 및 oscr#10로 명명하였다 (도 47).
따라서, (ω)-연결 ascr#5의 생산이 acox -1( ok2257 ) 벌레에서 폐지된 반면, 5-13 탄소 측쇄가 있는 더 긴 사슬의 동족체, 예를 들어, oscr#9의 생산은 활발하게 상향조절되었다 (도 52). 이러한 결과는 acox -1( ok2257 ) 벌레에서의 β-산화가 측쇄가 (ω-1)-관능화되는지 또는 (ω)-관능화되는지 여부에 강하게 의존적이라는 것을 가리킨다. (ω-1)-산소화 기질의 사슬 축소는 ascr#10에서와 같이 탄소 9개의 사슬 길이에서 멎는 것으로 보이는 반면, (ω)-산소화 기질은 2회의 추가적인 β-산화 라운드에 대해 진행되어 5-탄소 측쇄를 특색으로 하는 다량의 (ω)-산소화 oscr#9가 산출되었다. 이것은 측쇄 산소화가 과산화소체 β-산화에 선행한다는 것을 시사한다. 대조적으로, 아스카릴로스 부착 시점이 덜 확실한 것으로 보였다. 조사된 씨. 엘레간스 돌연변이체 대사체 샘플 내의 임의의 (ω-1)- 또는 (ω)-히드록실화 지방산의 부재는 매우 긴 사슬의 아스카로시드가 과산화소체 β-산화의 기질로서의 역할을 하는 생합성 모델을 시사한다. 그러나, β-산화가 아스카릴로스 부착 이전에 발생하는 것이 가능할 수 있다.
실시예 51 - MAOC -1 및 DHS -28이 인간 MFE -2의 기능성 상동체이다
야생형 및 acox -1( ok2257 ) 벌레와 대조적으로, 짧은 사슬 (< C9) 아스카로시드가 maoc -1( hj13 ) 및 dhs -28( hj8 ) 벌레에서 검출되지 않았고, 대신 이들은 여러 시리즈의 (ω-1)- 및 (ω)-산소화 중간 사슬 및 긴 사슬 아스카로시드 (≥ C9)를 축적하였다. maoc -1( hj13 ) 엑스크리톰의 아스카로시드 프로파일은 α,β-불포화 아스카로시드 예컨대 ascr#21 (C13) 및 ascr#25 (C15) (도 50A-E)가 우세하였고, 이는 MAOC-1이 아스카로시드 생합성 경로에서 에노일-CoA 히드라타제로서 기능한다는 가설을 지지한다 (도 49A). 또한, maoc -1( hj13 ) 엑스크리톰은 제3 동족체 시리즈의 화합물과 함께 더 적은 양의 상응하는 포화 아스카로시드를 함유하였고, 이의 고해상도 질량 분광법 (HRMS) 및 MS/MS 단편화는 이들이 긴 사슬 β-히드록실화 아스카로시드의 시리즈를 나타낸다는 것을 시사하였다 (도 37C-D, 44A-P, 및 50A-E). 이러한 구조적인 할당이 이러한 시리즈의 대표적인 구성원인 C9 및 C13 β-히드록실화 (ω-1)-아스카로시드인 bhas#10 및 bhas#22, 뿐만 아니라 C15 β-히드록실화 (ω)-아스카로시드인 bhos#26 ((ω-1)- 및 (ω)-산소화 β-히드록실화 아스카로시드에 대한 SMID: "bhas" 및 "bhos")의 합성을 통해 확증되었다 (실시예 37-39 참조). β-히드록실화 아스카로시드는 에노일-CoA 히드라타제 예컨대 MAOC-1의 추정 생성물이기 때문에, 연구된 maoc -1 돌연변이체 균주 maoc -1( hj13 ) (활성 부위 내의 점 돌연변이 (D186N)를 보유함) 및 2110 염기쌍 결실 돌연변이체 maoc -1( ok2645 ) 양쪽 모두의 엑스크리톰 내의 이의 존재 (도 49B)는 추가적인 에노일-CoA 히드라타제가 아스카로시드 생합성에 참여할 수 있음을 시사한다.
maoc -1( hj13 )에 대한 결과와 유사하게, dhs -28( hj8 ) 아스카로시드 프로파일이 C9-C21 범위의 측쇄가 있는 화합물이 우세한 것으로 확인되었다 (도 50A-E). 그러나, maoc -1( hj13 )과 대조적으로, 포화 및 α,β-불포화 아스카로시드가 dhs -28(hj8) 내의 총 아스카로시드의 상대적으로 더 적은 부분을 구성하였다. 추가로, C13-C21의 홀수 측쇄가 있는 (ω-1)- 및 (ω)-산소화 β-히드록시 아스카로시드 (bhas 및 bhos)가 주요 성분인 것으로 확인되었고 (도 50A-E 및 53A-E), 이는 β-히드록시아실-CoA 데히드로게나제로서의 DHS-28의 제안된 생합성 역할과 일치한다 (문헌 [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)]; [Joo et al., Biochem. J. 422:61-71] (2009) (본원에 전문이 참고로 포함됨)). daf -22( ok693 ) 엑스크리톰의 분석은, 앞서 보고된 바와 같이 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)]; [Joo et al., Biochem. J. 422:61-71] (2009) (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 탄소 12개보다 짧은 측쇄가 있는 모든 아스카로시드의 부재를 나타냈다 (도 50A-E 및 53A-E). daf -22(ok693) 엑스크리톰은 포화 (ascr 및 oscr) 및 β-히드록실화 측쇄 (bhas 및 bhos)를 특색으로 하는 (ω-1)- 및 (ω)-산소화 긴 사슬 아스카로시드들의 동족체 시리즈를 소량으로 함유하였다. 또한, daf -22( ok693 ) 엑스크리톰은, 앞서 보고된 바와 같이 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Zagoriy et al., Chem. Biodivers. 7:2016-22 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 측쇄 길이가 탄소 33개까지인 매우 긴 사슬의 아스카로시드 (VLCA, >C22)를 함유하였다.
실시예 52 - 신규 인돌 아스카로시드의 확인
인돌-3-카르보닐화 아스카로시드는 상응하는 관능화되지 않은 아스카로시드보다 훨씬 덜 풍부하였고, 고도로 강력한 응집 신호로서 기능하는 것으로 나타났다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). LC-MS/MS 스크리닝에서 여러 새로운 유형의 인돌 아스카로시드가 밝혀졌다 (도 37E-H 및 47C). icas#3, icas#9, 및 icas#1의 합성 샘플의 결과 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))는 인돌 아스카로시드가 인돌-3-카르보닐 단위의 절단으로 인한 143 amu [C9H5NO]의 중성 상실, 뿐만 아니라 m/z 73의 아스카로시드-진단성 생성물 이온을 포함하는 특징적인 단편화 패턴을 나타낸다는 것을 나타낸다 (도 44A-P 참조). 이러한 단편화 패턴의 성분에 대한 LC-MS/MS 스크리닝은 acox -1( ok2257 ) 내의 공지된 (ω-1)-산소화 이성질체인 icas#1, icas#9, 및 icas#10에 (ω)-산소화 인돌 아스카로시드의 시리즈 (SMID: icos#1, icos#9, 및 icos#10)가 동반된다는 것을 나타냈고, 이는 대표적인 예로서의 icos#10의 화학 합성으로 확증되었다 (실시예 40 참조). 짧은 사슬 아스카로시드 (탄소 <9개의 측쇄)를 생산하지 않는 과산화소체 β-산화 돌연변이체, 예를 들어 maoc -1 및 dhs -28 벌레는 어떠한 상응하는 인돌 아스카로시드도 또한 생산하지 않았다. 대신, maoc -1 및 dhs -28 엑스크리톰은 (ω-1)- 및 (ω)-산소화 긴 사슬 인돌 아스카로시드 (SMID icas 및 icos) 및 탄소 9-17개의 측쇄가 있는 인돌 β-히드록시 아스카로시드 (SMID ibha 및 ibho)를 유의한 양으로 함유하였다 (도 37E-H 참조).
실시예 53 - 인돌 아스카로시드 생체발생
중수소로 표지된 트립토판 및 무균성 시험관내 배양으로의 실험에서, 인돌 아스카로시드의 인돌-3-카르보닐 모이어티가 L-트립토판으로부터 유래되는 것으로 나타났다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 유사한 L-타이로신 또는 L-페닐알라닌 기원은 hbas#3의 4-히드록시벤조일 모이어티에 대한 것으로 보이는 한편, mbas#3의 티글로일 기는 L-이소류신으로부터 유래될 수 있었다 (문헌 [Attygalle et al., J. Chem. Ecol. 33:963-70 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 아스카로시드 생합성의 어느 단계에서 인돌-3-카르보닐 모이어티가 부착되는지는 여전히 불명확하다.
아스카로시드 및 인돌 아스카로시드 프로파일의 비교는 인돌 아스카로시드 생합성이 엄격하게 제어된다는 것을 나타냈다. 예를 들어, acox -1 돌연변이체에서, (ω)-아스카로시드 oscr#9가 (ω-1)-아스카로시드 ascr#9보다 100배 더 풍부한 반면 (ω-1)-인돌 아스카로시드 icas#9가 (ω)-인돌 아스카로시드 icos#9보다 훨씬 더 우세한 것으로 확인되었다 (도 54A). 유사하게, 야생형 엑스크리톰에서 우세한 인돌 아스카로시드인 icas#3 및 icas#9는 비교적 동일한 양으로 생산된 반면, ascr#3이 ascr#9보다 약 20배 더 풍부하였다 (도 55). 측쇄 길이 및 (ω-1)- 대 (ω)-산소화에 대한 인돌 아스카로시드 생합성의 이러한 강한 의존성은 이러한 화합물들이 상응하는 비-인돌 아스카로시드에 대한 인돌-3-카르보닐 단위의 특이적인 부착으로부터 기원한다는 것을 시사한다.
비-인돌 아스카로시드가 인돌 아스카로시드에 대한 전구체로서의 역할을 하는지 여부를 테스트하기 위해, daf -22(m130) 벌레 (모든 짧은 사슬 인돌 및 비-인돌 아스카로시드가 결핍됨)를 ascr#10 및 oscr#10의 1:1 혼합물과 함께 5일 동안 인큐베이션하였다. 이어진 LC-MS 분석은 icas#10 및 icos#10으로의 부분적인 전환을 나타내고 (도 54B), 이는 비-인돌 아스카로시드가 이의 상응하는 인돌 유도체에 대한 특이적인 전구체로서의 역할을 한다는 것을 가리킨다. 또한, (ω-1)-아스카로시드 ascr#10의 전환이 (ω)-아스카로시드 oscr#10의 전환보다 선호되었고, 이는 야생형 및 acox-1 돌연변이체 내의 이러한 화합물들의 비를 반영한다. 유사하게, daf-22(m130) 벌레는 첨가된 ascr#3을 icas#3으로 변환시키는 것으로 발견되었다. 더 짧은 사슬의 유도체 (예를 들어, ascr#1 또는 icas#1)로의 인돌 또는 비-인돌 아스카로시드의 추가적인 변환은 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 L-트립토판-유래 인돌-3-카르보닐 단위의 부착이 인돌 아스카로시드 생합성에서의 최종 단계를 나타낸다는 것을 가리킨다.
실시예 54 - 아스카로시드 배출이 선택적이다
아스카로시드 기능의 상세한 조사에도 불구하고, 어떻게 아스카로시드가 이의 생합성 부위로부터 방출 및 운반되는지에 관하여 거의 알려져 있지 않았다. 야생형 엑스크리톰 (액체 배양 상청액 추출물) 및 벌레 몸체 대사체 (벌레 펠릿 추출물)의 아스카로시드 프로파일을 비교하여, 가능한 비-배출 아스카로시드 유도체를 확인하였고, 정량적인 차이를 결정하였다. 벌레 펠릿 추출물의 아스카로시드 프로파일이 배지 내로 배출된 것과 유의하게 상이하였고, 이는 아스카로시드가 씨. 엘레간스에 의해 차별적으로 방출된다는 것을 가리킨다 (도 56A). 벌레 펠릿에서, 가장 풍부한 아스카로시드, 예컨대 야생형의 ascr#3 및 acox -1 벌레의 ascr#10에 유의하게 더욱 극성인 유도체가 동반되었고, 이는 배지 추출물에 부재하였다 (도 57). MS/MS 분석은 이러한 성분들이 아스카로시드 O-글리코시드 에스테르를 나타낸다는 것을 시사하였다. acox -1( ok2257 ) 벌레 펠릿 추출물로부터의 추정 ascr#10 글리코시드의 단리 및 이어지는 NMR 분광 분석 (도 43A-B)은 β-글루코스의 아노머 히드록시 기로의 ascr#10의 에스테르화를 가리키고, 이는 이어서 합성을 통해 확증되었다 (1-β-D-글루코실 ascr#10에 대한 SMID: glas#10, 도 56A). 다량의 고도로 극성인 glas#10 및 기타 아스카로시드 글루코시드 (도 37I 참조)가 벌레 몸체에서 유지되었고 배출되지 않았다는 사실은 이들이 궁극적으로 배출되는 신호전달 분자의 운반 또는 보관 형태를 나타낸다는 것을 시사한다.
또한, 포화 아스카로시드가 이의 α,β-불포화 유도체보다 훨씬 더 큰 정도로 벌레 몸체 내에 유지되었다 (도 56A). (ω)-산소화 성분에 대해 차별적인 방출이 또한 관찰되었다 (도 58). 따라서, 씨. 엘레간스가 아스카로시드 신호의 방출에 대해 현저한 제어를 나타내는 것으로 보인다.
실시예 55 - 영양 상태가 아스카로시드 생합성에 영향을 미친다
아스카로시드 생합성이 먹이 이용가능성 (문헌 [Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 발달 단계 (문헌 [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 및 온도 (문헌 [Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))가 포함되는 다양한 환경 인자에 의존적인 것으로 보고되었다.
LC-MS를 사용하여, 야생형 및 돌연변이체 벌레의 먹이가 충분한 배양물 및 결핍된 배양물의 엑스크리톰을 비교하는 것에 의해 아스카로시드 생합성에 대한 영양 상태의 효과를 조사하였다. 결과는 (ω-1) 대 (ω)-연결 아스카로시드의 비가 영양 상태에 강하게 의존적이라는 것을 가리킨다. dhs -28의 결핍 배양물에서의 긴 사슬 (ω-1)-산소화 아스카로시드 생산이 먹이가 충분한 배양물의 것보다 약 5배 더 높았다 (도 56B 및 59A-C). 유사하게, (ω)-연결 ascr#5의 양과 비교하여, 결핍된 야생형 벌레가 먹이가 충분한 벌레보다 유의하게 더 많은 양의 (ω-1)-연결 ascr#3을 배출하였다 (도 60). ascr#5 및 ascr#3 양쪽 모두 다우어 페로몬의 주요 성분이다; 그러나, 이들은 벌레 거동에 상이하게 영향을 미친다 (문헌 [Jeong et al., Nature 433:541-45 (2005)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Butcher et al., PNAS 105:14288-92 (2008)]; [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
따라서, 과산화소체 β-산화의 상류의 매우 긴 사슬의 지방산의 (ω-1)- 및 (ω)-관능화의 조절을 통해 영양물 이용가능성에서의 변화에 반응하여 아스카로시드 신호전달이 활발하게 조절되는 것으로 보인다. (ω)- 및 (ω-1)-관능화 아스카로시드가 상이한 G-단백질 커플링(coupled) 수용체 패밀리에 의해 감지된다는 최근의 발견 (문헌 [Kim et al., Science 326:994-98 (2009)]; [McGrath et al., Nature 477:321-25 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))과 함께, 이러한 결과들은 (ω)- 및 (ω-1)-관능화 아스카로시드가 별도의 하류 신호전달 경로를 표적으로 한다는 것을 시사한다.
실시예 29-55의 논의
아스카로시드는 씨. 엘레간스 생물학의 여러 상이한 측면에 대해 중요한 역할을 한다. 이러한 기능적인 다양성은 상응하는 구조적인 다양성 및 복합적인 생합성 경로에 부합한다. 실시예 34-43 및 도 37A-37K에 기술된 MS/MS를 기초로 하는 연구에서 지방산-유래 측쇄의 (ω)-산소화, 아스카릴로스 단위의 4-히드록시벤조일화 또는 (E)-2-메틸-2-부테노일화, 및 글루코실 에스테르가 포함되는 여러 뜻밖의 특색을 나타내는 기존에 보고되지 않은 124개의 유사체를 포함하여 146개의 아스카로시드가 밝혀졌다. 대부분의 아스카로시드는 탄소 3개 내지 21개 (때대로 더 많은 개수) 범위의 (ω-1)- 또는 (ω)-연결 포화, α,β-불포화, 또는 β-히드록실화 측쇄가 있는 화합물들의 동족체 시리즈의 구성원으로서 발생한다. 중요하게, 각각의 시리즈의 몇몇 구성원만 야생형 선충에서 풍부하게 생산되고, 특정한 구조적 특색의 혼입 예컨대 아스카릴로스의 위치 4에서의 변형 (예를 들어, 인돌 아스카로시드에서와 같음) 또는 α,β-불포화의 혼입이 엄격하게 제어되는 것으로 보인다.
탄수화물, 지질, 및 아미노산-유래 건축 블록으로부터의 이의 어셈블리를 고려하여, 아스카로시드는 3가지 기본 대사 경로로부터의 입력물을 통합하는 소형 분자 신호들의 모듈형 라이브러리로서 나타난다 (도 61A). 그 후, 아스카로시드가 이러한 경로들로부터의 입력물을 다우어 형성, 짝 유인, 자웅동체 반발, 및 응집이 포함되는 씨. 엘레간스의 거동 및 발달에서 이의 다양한 신호전달 기능을 통해 변환시킨다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)]; [Edison, A. S., Curr. Opin. Neurobiol. 19:378-88 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이의 특이적인 생합성은 새롭게 확인된 아스카로시드 중 다수가 씨. 엘레간스에서의 공지된 기능 또는 아직 결정되지 않은 기능에 또한 기여한다는 것을 시사한다. 예를 들어, hbas#3은 유인 신호로서 작용하는 것으로 나타났고, 이의 효능은 이러한 모델 생물 내의 모든 기존에 공지된 소형 분자의 것을 능가한다.
아스카로시드 생체발생에 대한 작동 모델이 도 61B에서 제안된다. 아스카로시드가 탄소 21개 (및 이를 초과하는 개수)까지의 측쇄가 있는 여러 동족체성 시리즈의 구성원이라는 발견은 이들이 매우 긴 사슬의 전구체의 과산화소체 β-산화로부터 기원한다는 것을 시사한다. 기존의 연구에서, 야생형 및 daf -22 돌연변이체 내의 C29 및 C31 측쇄가 있는 매우 긴 사슬의 아스카로시드 (VLCA)의 존재가 보고되었고, 이는 아스카로시드 생합성에서의 전구체 또는 중간체를 나타낼 수 있었다 (문헌 [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Zagoriy et al., Chem. Biodivers. 7:2016-22 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 별법적으로, 매우 긴 사슬의 지방산 (VLCFA)이 (ω-1)- 또는 (ω)-관능화 및 이어지는 아스카릴로스의 부착 전에 과산화소체 β-산화를 겪을 수 있었다. acox -1 돌연변이가 (ω-1)- 및 (ω)-산소화 아스카로시드가 상이하게 영향을 미쳤다는 관찰은 VLCFA 전구체의 (ω-1)- 및 (ω)-관능화가 과산화소체 β-산화에 의한 이의 분해의 상류에서 발생한다는 것을 시사한다. 광범위한 측쇄 길이를 고려하여, 생성된 (ω-1)- 및 (ω)-히드록시 VLCFA가 β-산화 경로에 진입하기 전에 아스카릴로스에 연결되는 것으로 보이지만, 무차별적인 아스카로실 트랜스퍼라제의 존재가 또한 가능할 수 있다 (도 61B).
그 후, 반복적인 과산화소체 β-산화 사이클을 통해 VLCA의 사슬 단축이 진행된다. LC-MS/MS 스크리닝으로부터의 결과는 4-단계 β-산화 사이클 각각에 참여하는 효소에 대한 정확한 역할의 제안을 허용한다: 아실-CoA 옥시다제 ACOX-1, 에노일-CoA 히드라타제 MAOC-1, β-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 DHS-28, 및 β-케토아실-CoA 티올라제 DAF-22. acox -1, maoc -1, 및 dhs -28에서의 돌연변이는 이들의 제안된 기능에 일치하는, 상응하는 아스카로시드의 특이적인 변화를 초래하는 것으로 나타났다.
아실-CoA 옥시다제 ACOX-1은 acox -1에서의 돌연변이가 주로 ascr#2 및 ascr#3의 생합성에 영향을 미치지만 ascr#1에 대해서는 그렇지 않다는 것을 가리키는 기존의 연구의 주제였다 (문헌 [Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 실시예 50에 기술된 결과는 acox-1(ok2257) 돌연변이체가 C9 (ω-1)-관능화 아스카로시드를 프로세싱하는 능력이 감소되어, 모든 더 짧은 사슬의 아스카로시드의 생산 감소 및 C9 및 더 긴 사슬의 포화 아스카로시드의 증강을 초래하였음을 가리킨다. maoc -1 (뿐만 아니라 dhs-28 및 daf -22)의 돌연변이는 장 지질 액적의 확장을 초래하는 것으로, 그리고 공복- 및 지질분해-저항성 트리글리세리드의 증가를 야기하는 것으로 나타났다 (문헌 [Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 실시예 51에 기술된 결과는 MAOC-1이 아스카로시드 생합성에 참여하여 기존에 확인되지 않은 에노일-CoA 히드라타제로서 작용한다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 2가지 별개의 효소인 MAOC-1 및 DHS-28에 의해, 인간 MFE-2의 별도의 기능성 도메인들에 대한 이들의 상동성에 의해 지시되는 바와 같이 (문헌 [Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 씨. 엘레간스에서의 에노일-CoA의 수화 및 β-히드록시아실-CoA의 탈수소화가 촉매된다는 것을 추가로 실연한다.
실시예 52-53에 기술된 결과는 인돌 아스카로시드에서의 트립토판-유래 인돌-3-카르보닐 단위의 부착이 이의 생합성에서의 마지막 단계를 나타낼 것이라는 것과 이러한 단계가 고도로 특이적이라는 것을 추가로 나타낸다. 아스카로시드에 대한 인돌-3-카르보닐 기의 부착이 이의 생물학적 기능을 극적으로 변경시킬 수 있기 때문에, 이같은 엄격한 조절이 이치에 맞는다. 예를 들어, 다우어를 유도하고 강하게 반발성인 신호인 ascr#3에 인돌-3-카르보닐이 부가되는 것은 강력한 자웅동체 유인물질 icas#3을 초래한다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
씨. 엘레간스에서의 아스카릴로스의 생합성은 조사되지 않았다. 그러나, 무균성 씨. 엘레간스 배양물에서의 아스카로시드의 검출은 씨. 엘레간스가 내인성으로 아스카릴로스를 생산한다는 것을 나타낸다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 박테리아에서의 아스카릴로스 생합성이 잘 이해되어 있고, 씨. 엘레간스 게놈은 이러한 경로에서의 박테리아 유전자의 여러 상동체, 예를 들어 예르시니아 슈도투베르쿨로시스로부터의 ascE를 포함하고 (도 62) (문헌 [Thorson et al., J. Bacteriol. 176:5483-93 (1994)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이는 선충에서의 아스카릴로스 생합성 및 이의 조절 연구에 잠재적인 진입 지점을 제공한다. 또한, VLCFA 전구체의 (ω-1)- 또는 (ω)-관능화를 촉매하는 옥시다제들이 확인되어야 한다. 야생형 및 과산화소체 β-산화 돌연변이체에서의 (ω-1)/(ω)-산소화 아스카로시드의 비가 결핍에 의해 강하게 영향을 받았다는 발견은 이러한 단계가 영양 상태에 관한 정보를 코딩할 수 있다는 것을 가리킨다. 또한, 아스카로시드 배출이 놀랄게도 특이적인 것으로 나타났다. LC-MS/MS의 높은 민감성 및 선택성을 고려하여, 실시예 29-55에 기술된 방법을 사용하는 아스카로시드 프로파일링은 아스카로시드 생합성 및 항상성에서 참여하는 추가적인 유전자 및 환경 인자를 확인하는 것을 도울 수 있다.
실시예 56 - 다우어 생산
씨. 엘레간스를 다우어 유도 액체 배양 조건 (문헌 [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 하에 S-완전 배지 + 20,000마리의 벌레/㎖ 및 0.5％ (습식 중량) 이. 콜라이 (HB101)에서 배양하였다. L1 유충 선충을 공급한 후, 22℃에서 진탕기 (250 rpm)에서 112시간 동안 선충을 인큐베이션하였다. 그 후, 선충을 1％ 소듐 도데실 술페이트 (SDS)로 15분 동안 처리하였다. 수집 전에, 생존한 선충을 한천 플레이트 상에서 죽은 선충으로부터 분리되게 하였다. 죽은 선충을 진공으로 제거한 후, 다우어 동물을 M9 완충제를 사용하여 수집하고, 4℃에 놓았다.
실시예 57 - 에스 . 펠티아에의 사육
에스. 펠티아에를 ARBICO 오르가닉스(ARBICO Organics) (애리조나주 투손)로부터 주문하였다. 지. 멜로넬라 유충 (왁스 벌레(wax worm), 그룹코(Grubco), 오하이오주 해밀튼)을 유충 당 50 마리의 에스. 펠티아에 다우어 애벌레로 감염시켰다. 2일 후, 감염된 유충을 새로운 6 cm 직경 페트리 접시 상에 놓고, 백색 포획 방법을 사용하여 감염성 애벌레 (IJ)를 수집하였다 (문헌 [LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
문헌 [Campos-Herrera et al., Ann. Appl. Biol. 158:55-68 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같은 ITS rDNA 영역으로부터의 종 특이적 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 에스. 펠티아에 IJ를 확인하였다. MJ 리서치(MJ Research)의 PTC 200 펠티에 써멀 사이클러(Peltier Thermal Cycler)에서 PCR 증폭을 수행하였다. 무균성 탈이온수 및 스테이네르네마 리오브라베로부터 제조된 DNA를 음성 대조군으로서 사용하여, 1 ㎕ DNA 주형을 함유하는 25 ㎕ 최종 부피로 문헌 [Campos-Herrera et al., Ann. Appl. Biol. 158:55-68 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 증폭을 수행하였다. 사이클 파라미터는 15분 동안 94℃, 이어서 30초 동안 94℃에서의 변성, 20초 동안 59℃에서의 어닐링(annealing) 및 20초 동안 72℃에서의 확장의 사이클 35회, 10분 동안 72℃에서 최종 확장이었다. 앰플리콘 크기를 트리스-아세테이트-EDTA (TAE) 2％ 아가로스 겔 상에서의 전기영동을 통해 확인하였고, UVP의 바이오독-잇(BioDoc-it)™ 시스템에서 가시화하였다.
에스. 펠티아에 프라이머는 통상적인 PCR에서 실험실 집단으로부터의 IJ를 함유하는 모든 샘플에 대해 특이적인 증폭을 일으켰다. 이러한 프라이머들은 에스. 리오브라베(S. riobrave) 및 탈이온수 대조군에 대해 증폭을 나타내지 않았다.
실시예 58 - 뿌리혹 선충의 사육
감염된 토마토 식물을 플로리다의 들판으로부터 수집하였다. 뿌리를 뿌리혹 감염에 대해 검사하였고, 문헌 [Hussey & Barker, Plant Dis. Rep. 57:1025-28 (1973)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바를 변형시켜 뿌리혹 선충의 알을 수집하였다. 감염된 뿌리를 1％ 블리치(bleach)로 2분 동안 처리하였다. 알 덩어리 매트릭스로부터 방출된 알을 네스티드(nested) 필터 시스템 (85 ㎛)으로 수집하여 식물 잔해물을 수집하고, 25 ㎛ 나일론 필터 (니텍스(Nytex))로 수집하여 알을 수집하였다. 알을 MILLI-Q 물로 철저히 세정하고, 실온에서 3일 동안 소량의 물과 함께 8 cm 직경 페트리 접시 상의 20 ㎛ 필터 상에 놓아 부화시켰다.
만연된 토마토 뿌리로부터 추출된 뿌리혹 선충을 형상 및 에스테라제 (EST) 및 말레이트 데히드로게나제 (MDH)에 대한 이소자임 표현형결정을 기초로 확인하였다. 문헌 [JOSEPH NEAL SASSER & CATHY CAMERON CARTER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE (1985)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 성숙한 암컷의 회음 패턴을 사용하여 형상학적 확인을 수행하였다. 간략하게, 25마리의 젊은 산란 암컷을 사용하여 이소자임 표현형결정을 수행하였다. 뿌리계로부터 직접적으로 절제된 암컷의 추출물을 2개의 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 상에 러닝(running)시켰다 (문헌 [Brito et al., Nematology 10:757-66 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 1개의 겔은 MDH 및 EST 활성 양쪽 모두에 대해 염색한 반면 (문헌 [KENNETH REECE BARKER, CATHY CAMERON CARTER & JOSEPH NEAL SASSER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE (1985)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 두 번째 겔은 EST에 대해서만 염색하였다.
실시예 59 - 씨. 엘레간스 분산 블렌드의 확인
L1 공급 67시간 후 60％ 다우어 (2회의 실험) 및 40％ 다우어를 유도한 액체 배양물을 LC-MS를 사용하여 분석하였다. 4개의 아스카로시드가 3개의 액체 배지 모두에 공통적이었다. 각각의 농도를 60％ 다우어를 생산한 액체 배양물로부터 측정하였다.
실시예 60 - 분산 검정법
에스. 펠티아에 IJ를 MILLI-Q 물로 3회 세정하고, 6 cm 페트리 접시에서 36시간 동안 소량 (4-5 ㎖)의 MILLI-Q 물과 함께 인큐베이션하였다. 다음 날, 선충을 1010 g/㎠ 겔 강도의 10.7 g/L 한천 (파이토테크놀러지 랩(PhytoTechnology Lab.), 캔자스주 쇼니 미션) 상에 놓았다. 거동이 플레이트 조성에 영향을 받은 가능성을 배제하기 위한 내부 플레이트 복제물과 함께 다중 플레이트 상에서 선충 거동을 검정하였다. 10 ㎕ 물 내의 약 300마리의 IJ를 한천 배지 상에 놓았고, 테스트 화합물 또는 추출물 (1-2 ㎕)을 선충 현탁액 내에 놓았다. 액체 흡수 시 (~15분), 자유롭게 이동하는 선충을 5-10분 동안 비디오로 기록하였다. 분산 거동은 온도 및 계절 의존적이다. 겨울 동안에는, 검정법이 실온 (22±1℃)에서 효과적이다. 여름 동안에는, 23℃ 초과에서의 선충 거동에 대한 효과로 인해 검정법이 온도 제어 환경을 필요로 한다.
씨. 엘레간스 다우어 애벌레를 MILLI-Q 물로 3회 세정하고, 소량의 물과 함께 6 cm 페트리 접시 내에 놓고, 철야로 휴식시켰다. 10 ㎕의 물 내의 약 200-300마리의 선충을 한천 플레이트 상에 놓고, 여기에 2 ㎕의 처리를 첨가하였다. 60％ 다우어 동물을 생산한 액체 배양물을 원심분리하고, 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 분산에 대한 양성 대조군으로서 사용하였다. 그 후, 배지를 동결건조시키고, MILLI-Q 물에 5회 재현탁시켰다. 2 ㎕ 내지 10 ㎕의 선충 현탁액을 검정법에 사용하였다. 음성 대조군으로서, 0.5 ％ 이. 콜라이 (HB101)를 S-완전 배지에서 제조하고, 동결건조시키고, 검정법에서의 0.25 ％ 이. 콜라이의 최종 부피로 조정하였다. 12-15분 동안 분산 거동을 관찰하였다.
뿌리혹 선충의 분산을 검정하기 위해, 1-3일 이내에 부화한 뿌리혹 선충을 10 ㎛ 나일론 필터 (니텍스)를 사용하여 수집하고 MILLI-Q 물로 3회 세정하였다. 그 후, 이를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브 내에 놓았다. 10 ㎕ 물 내의 선충을 한천 플레이트 상에 놓았다. 최초로 놓인 곳에서 떨어진 장소에서 발견된 선충을 1시간 및 2시간에 계수하였다. 배치된 선충의 총수를 사용하여 각각의 처리를 표준화하였다. 각각의 처리에 대해, 20회의 실험을 상이한 3일에 수행하였다. 선충 밀도는 14회의 실험에서는 ~30마리/플레이트였고, 6회의 실험에서는 100마리/플레이트였다. 아침에 실험을 수행하였다.
실시예 61 - 씨. 엘레간스 분산의 정량
이미지 제이 소프트웨어 (<Image Processing and Analysis in Java>, 미국 국립 보건원)를 사용하여 선충을 정량하였다. 이미지 제이를 사용하여 가시화 및 계수된 선충의 수가 도 63B에서 도해된다. 원 내부의 선충을 배치 장소로 인해 계수된 벌레의 총수로부터 수동으로 차감하였다. 각각의 처리를 9-11회 반복하였다. 그래프는 양성 대조군인 다우어 컨디셔닝 배지에 대해 표준화되었다.
실시예 62 - 에스 . 펠티아에 분산 블렌드의 정제
문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바를 변형시켜 활성-안내 분획화를 수행하였다. 총 33마리의 곤충 숙주 사체 (지. 멜로넬라 유충)를 70％ EtOH 내에 놓고 추출할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 곤충 사체를 프리셀라이스24(Precellys24) 균질화기를 사용하여 37초 동안 2 ㎖ 튜브에서 1 g의 세라믹 지르코늄 비드 (1.25 mm) (ZIRMIL)를 사용하여 균질화하였다. 샘플을 15분 동안 18400의 상대 원심력 (rcf)에서 원심분리하고, 상청액을 동결건조하고, MILLI-Q 물에 재현탁시켰다. 실시예 60에 기술된 분산 검정법 및 생리학적으로 관련된 농도의 곤충 숙주 사체 추출물 또는 분획화된 추출물을 사용하여 선충의 분산 활성을 테스트하였다. 생리학적으로 관련된 농도의 아스카로시드에 대한 계산을 용이하게 하기 위해, 왁스 벌레 부피를 ~200 ㎕로 추정하였다; 왁스 벌레의 평균 중량은 232 + 57 ㎎였다 (n=19).
셉-팩 플러스(Sep-Pak Plus) C18 카트리지 (워터스 코포레이션, 매사추세츠주 밀포드)를 사용하여 1차 역상 고체상 추출을 수행하였다. 초기에 수집된 통과물을 분획 A로 명명하였다. 그 후, 칼럼을 물로 세정하고, 수집하고, 저장하였다. 이어서, 칼럼을 50％ (분획 B) 및 90％ (분획 C) MeOH로 용출시켰다. 분획들을 개별적 및 조합 양쪽 모두로 분산 활성에 대해 테스트하였다. 또한, 개별적인 분획들을 LC-MS로 분석하였다. 분획 A는 ascr#9를 함유하였고, 이를 LC-MS로 수집하였으며, 분획 B + C와 함께 활성에 대해 테스트하였다.
실시예 63 - 에스 . 펠티아에 아스카로시드 생산의 경시적인 연구
1-대-1 검정 방법 (문헌 [LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하였다. 1마리의 왁스 벌레를 24웰 플레이트의 웰 1개 내에 놓았다. 감염을 위해, 50마리의 에스. 펠티아에 IJ를 각각의 웰 내의 25㎕의 물 내에 놓았다. 24시간 후, 플레이트를 감염된 곤충 유충에 대해 시험하였다. 감염된 것을 백색 트랩(trap) 내에 놓았고 (문헌 [LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)),48시간 후 감염된 것을 별도의 백색 트랩 상에 놓았다. 48시간 후에 최초 샘플을 채취하였다. 그 후, 샘플을 9일 동안 매일, 그리고 14일에 1회 채취하였다. 각각의 실험에 대해, 샘플은 6마리의 곤충 숙주 사체를 포함하였다. 곤충 사체를 1 ㎖의 물과 함께 2 ㎖ 에펜도르프 튜브 내에 놓았다. 바늘로 사체를 구멍 내서 내부 내용물이 소실되게 한 후, 와류시켰다. 샘플을 3380 rcf에서 10분 동안 원심분리하고, 0.5-1 ㎖의 상청액을 회수하였다. 상청액을 -20℃에서 냉동시킨 후, 동결건조시켰다. 그 후, 이를 200 ㎕의 50％ MeOH에 재현탁시키고, 0.1％ 포름산으로 1:1 희석하였다. 샘플 pH는 4.3이었다. 이러한 시점에, 20 ㎕의 각각의 샘플을 ascr#9 분석을 위해 LC-MS에 적용하였다.
실시예 64 - 스테이네르네마 종 및 헤테로랍디티스 종의 곤충 숙주 사체 내의 Asrc #9
곤충 숙주 (지. 멜로넬라)를 에이치. 박테리오포라, 에이치. 제알란디카(H. zealandica), 에이치. 플로리덴시스(H. floridensis), 에스. 카르포캅사에, 에스. 리오브라베(S. riobrave), 또는 에스. 디아프레페시(S. diaprepesi)로 감염시켰다. 선충이 곤충 사체로부터 출현하기 시작했을 때, 이를 1.5 ㎖의 70％ EtOH 내에 놓고, 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다. 그 후, 프리셀라이스24 균질화기를 사용하여 39초 동안 2 ㎖ 튜브 내에서 1 g의 세라믹 지르코늄 비드 (1.25 mm) (ZIRMIL)를 사용하여 곤충 사체를 균질화하였다. 균질화된 사체를 3380 rcf에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 1 ㎖의 HPLC 물로 희석하고, -20℃에서 보관한 후, 철야로 스피드백(SpeedVac)® (스피드 백 플러스(Speed Vac Plus) SC210A, 사반트(Savant)) 내에 놓았다. 각각의 사체 추출물을 1 ㎖의 50％ MeOH에 재현탁시키고, 18400 rcf에서 15-20분 동안 원심분리하였다. 그 후, 샘플을 0.1％ 포름산으로 1:1 비로 희석하여, 4.2의 샘플 pH가 산출되었다. arc#9의 존재 또는 부재를 LC-MS로 결정하였다.
실시예 65 - LC - MS 분석
문헌 [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 방법을 사용하여 아스카로시드 분석을 수행하였다.
실시예 66 - 분산 검정법
곤충병원성 선충 (EPN)에 대해, 곤충 사체는 IJ 단계의 분산 거동을 촉진하는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Shapiro-Ilan et al., J. Invertebr. Pathol. 83:270-72 (2003)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 따라서, 분산을 촉진하는 소비된 곤충 사체 내의 화합물을 확인하기 위한 검정법이 개발되었다. 10 ㎕의 물 내의 약 300마리의 에스. 펠티아에 IJ를 한천 플레이트 상에 놓았다 (도 64B). 그 후, 2 ㎕의 물 (도 64C) 또는 에스. 펠티아에로 감염된 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella) 유충 사체의 수성 추출물 (도 64D)을 선충 현탁액 내에 놓았다. 물이 배지 내로 흡수된 후, 선충이 자유롭게 이동할 수 있었다. 물로 처리된 선충은 분산 거동 없이 배치 부위 근처에 남아 있었다. 대조적으로, 사체 추출물로 처리된 선충은 매우 활동적이었고, 방출 지점에서 멀리 이동하였다. 이는 사체를 떠나는 선충에 대해 관찰된 독특한 분산 거동과 동일하였다. 사체 추출물의 LC-MS 분석은 아스카로시드 (ascr#9)의 존재를 나타냈고 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol.10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이는 에스. 펠티아에가 아스카로시드를 분산 신호로서 활용할 수 있다는 가설을 지지한다.
실시예 67 - 씨. 엘레간스 분산이 아스카로시드들의 블렌드에 의해 조절된다
이어서, 실시예 66에서의 분산 생체검정법을 씨. 엘레간스 다우어 유충의 분산에 대해 테스트하는데 또한 이를 사용할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 조사하였다. 이러한 검정법을 위해, 60％ 다우어 유충을 생산한 씨. 엘레간스 액체 배양물로부터의 성장 배지를 사용하였다. 모든 선충의 제거 후, 이러한 다우어-컨디셔닝 배지가 씨. 엘레간스 다우어에서 분산 거동을 강하게 유도하였다. LC-MS를 사용하여, 다우어 형성 배지가 4개의 공지된 아스카로시드를 함유하는 것으로 확인되었고 (ascr#2, ascr#3, ascr#8, 및 icas#9) (문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol.10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 63A 및 65), 이들은 기존에 개별적으로 씨. 엘레간스에서 다우어 진입을 촉진하는 것으로 기존에 나타났다 (문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009)]; [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨). 다우어 형성 배양 배지 내의 아스카로시드의 농도는 ascr#2 (3.68 pmol/㎕), ascr#3 (0.165 pmol/㎕), ascr#8 (0.25 pmol/㎕), 및 icas#9 (0.005 pmol/㎕)인 것으로 추정되었다.
그 후, 다우어 컨디셔닝 배지를 양성 대조군으로서 사용하여, 이러한 아스카로시드들의 합성 블렌드를 분산 활성에 대해 테스트하였다. 배지는 원래의 0.5％ 이. 콜라이 (HB101) 먹이원의 약 절반을 함유하는 것으로 추정되었다. 따라서, 0.25％ 이. 콜라이를 합성 테스트 샘플, 뿐만 아니라 물 대조군에 첨가하여, 먹이 부재에 의해 유도되는 먹이 탐색 거동을 방지하였다. 분산성 선충의 수를 양성 대조군 반응의 백분율에 대해 표준화하였다. 먹이만 존재하는 경우 (음성 대조군), 다우어 유충의 약 35％가 방출 장소에 남았다. 그러나, 합성 아스카로시드 블렌드를 첨가하면, 거의 2배로 많은 선충 (62％)이 방출 장소로부터 멀리 이동하였다 (도 63B 및 66A-B). 생리학적 농도에서 개별적으로 테스트되었을 때, ascr#8 (50％) 및 ascr#2 (40％)가 가장 강한 반응을 제공하였지만, 4개 모두 블렌드보다 덜 활성이었다 (도 63C). 이는 씨. 엘레간스 다우어 유충이 분산 블렌드의 단일 성분을 인지하고 이에 반응할 수 있지만, 완전한 4-성분 블렌드가 활성을 복원하는데 필요하였음을 시사한다.
실시예 68 - EPN 및 식물 기생성 선충이 씨. 엘레간스 분산 블렌드를 감지한다
다수의 선충 종이 다른 선충 종이 방출하는 신호를 감지하고 이에 반응할 수있을 것으로 가정되었다. 따라서, 씨. 엘레간스가 방출하는 아스카로시드가 유효한 회피 신호로서 기능할 수 있었다. 분산 검정법에서, 에스. 펠티아에의 IJ가 물에 노출되었을 때는 두드러진 이동을 나타내지 않았지만, 씨. 엘레간스 분산 블렌드에 노출되었을 때는 매우 활동적이었고 방출 장소로부터 멀리 이동하였다 (도 63D 및 66C). 토마토 뿌리로부터 단리된 야생 뿌리혹 선충으로부터의 이동성 J2 (멜로이도기네 종의 혼합물; 엠. 자바니카, 엠. 플로리덴시스, 및 엠. 인코그니타)를 또한 씨. 엘레간스 분산 블렌드에 대한 반응에 대해 테스트하였다 (도 66D). 또다시, 대조군과 비교하여 씨. 엘레간스 블렌드가 도입된 구역에 더 많은 선충 (10-12％)이 남았다. 이는 적어도 일부 선충 종이 멀리 관련된 선충 종의 분산 블렌드에 반응할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 69 - 에스 . 펠티아에 및 씨. 엘레간스 블렌드의 주요 성분이 구조적 유사체이다
에스. 펠티아에 분산 페로몬의 특성화를 위해, 곤충 숙주 사체를 70％ EtOH로 추출하고, 역상 (C18) 크로마토그래피로 분획화하고, 검정하였다 (도 67A-D). 이러한 생체검정법에서, 모든 3가지 분획 (A, B, 및 C)의 조합이 활성에 필요한 것으로 밝혀졌다 (도 67A). LC-MS에 의한 분획 분석에서 (도 68A-C), 분획 A에서 2개의 아스카로시드가 밝혀졌고, 이는 합성 표준물질의 도움으로 ascr#9 및 ascr#11인 것으로 확인되었다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol.10(1):e1001237 (2012)]; [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134(3):1817-24 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 생체검정법은 ascr#9 및 ascr#11이 생리학적으로 관련된 농도에서 혼자서는 활성이 없었음을 나타냈다 (도 67B). 이는 천연 분획 A가 단독으로 테스트되었을 때 불활성이었기 때문이다 (도 67A). 그러나, 생리학적으로 관련된 농도 (40 pmol/㎕)의 합성 ascr#9를 천연 분획 B 및 C와 조합하면 원래의 분산 활성이 회복되었고 (도 67C), 이는 ascr#9를 에스. 펠티아에 분산 블렌드의 활성 성분으로서 확증한다. 분획 A에서 확인된 제2 아스카로시드인 ascr#11 또한 분획 B 및 C와 조합되었을 때 완전한 활성을 회복하였고 (도 67D), 이는 ascr#9 또는 ascr#11이 분획 B 및 C와 조합되어 완전한 분산 활성을 재구성하는데 혼자서 충분하였음을 가리킨다.
본질적인 씨. 엘레간스 분산 페로몬 성분인 ascr#2에 대해 발달 프로파일이 기존에 확립되었다 (문헌 [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 에스. 펠티아에 분산 블렌드 내의 분획 A의 주요 아스카로시드인 ascr#9는 ascr#2에 대한 구조적 유사체이다 (도 67C). 따라서, 에스. 펠티아에로 감염된 곤충 사체 내의 ascr#9의 축적을 경시적 실험에서 분석하였다 (도 69). 결과는 ascr#9의 축적 프로파일이 기존에 씨. 엘레간스에서 ascr#2에 대해 확립된 것과 매우 유사하였음을 나타낸다. 또한, ascr#9의 축적은 IJ 분산 직전에 최고였고, IJ-고갈 사체에서 6일 이상 동안 일정하게 유지되었다. 이는 씨. 엘레간스에 대한 ascr#2 및 다우어 형성의 관찰과 매우 유사하다 (문헌 [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 대조적으로, ascr#11 프로파일 (도 69)은 ascr#9의 것과 상이하다. 이는 초기에는 검출가능하게 되었지만, 제8일 (분산일)에는 정량가능하지 않게 되었고, 분산 6일 후인 제14일까지 곤충 숙주 사체에서 정량될 수 없었다.
ascr#9가 또한 테스트되었고, 씨. 엘레간스 분산 블렌드에서 이의 구조적 유사체인 ascr#2를 대체할 수 있는 것으로 발견되었다 (도 70). 따라서, 에스. 펠티아에로 발견된 바와 같이, 종-교차 인지가 씨. 엘레간스에 대해서도 사실일 수 있다.
실시예 70 - ascr #9가 생리학적으로 관련된 EPN 들의 분산 블렌드 내의 공통적인 성분일 수 있다
딱정벌레 및 파리에서, 계통발생학적으로 관련된 종들이 이들의 응집 페로몬 블렌드 내에 성분들을 공유한다 (문헌 [Symonds & Elgar, Proc. Biol. Sci. 271:839-46 (2004)]; [Symonds & Wertheim, J. Evol. Biol. 18:1253-63 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 계통발생학적으로 관련된 선충 종들이 분산 블렌드 성분들을 어느 정도로 공유하였는지를 추가로 테스트하기 위해, 스테이네르네마 종 및 헤테로랍디티스 종으로 감염된 곤충 숙주 사체를 ascr#9, ascr#2 및 ascr#11의 존재에 대해 분석하였다 (도 71A-B).
양쪽 종에 대한 곤충 숙주 사체가 ascr#9를 함유하는 것으로 발견되었고 (도 71A-B), 이는 ascr#9가 광범위한 EPN 종에 의해 이들의 분산 블렌드의 일부로서 사용될 수 있다는 것을 시사한다. 모든 테스트된 스테이네르네마 종에서 ascr#11이 발견되었지만, 헤테로랍디티스 종에서는 그렇지 않았고, 이는 ascr#11이 스테이네르네마 종에 대해 특이적일 수 있음을 시사한다.
실시예 56-70의 논의
씨. 엘레간스에 대해, 공유되고 독특한 조성의 아스카로시드들이 상이한 거동을 조절한다. 예를 들어, 짝짓기 및 분산 블렌드가 ascr#2, ascr#3, 및 ascr#8을 공유한다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009)]; [Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 씨. 엘레간스 짝짓기 블렌드는 독특한 성분인 ascr#4를 특징으로 하고 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 분산 블렌드는 독특한 성분인 icas#9를 특징으로 한다 (문헌 [Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol.10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 따라서, 이것이 다수의 선충 종에 대해 통상적일 수 있는 것으로 생각된다.
멜로이도기네 종이 또한 분산 블렌드를 활용하는지 여부는 아직 명확하지 않지만, 이러한 선충 종이 식물 물질을 분해하고 부패시키는 것을 가리키는 다른 선충 종이 방출하는 신호를 검출하고 이에 반응할 수 있는 것이 본원에서 제시되었다. 이러한 씨. 엘레간스 분산 블렌드는 계통발생적으로 관련된 종들의 발달 면에서 유사한 단계에서 비슷한 활성을 나타내고, 이는 이것이 유전자 표적을 확인하는데, 뿐만 아니라 식물, 인간 및 가축에 대해 기생성인 종의 방제를 위한 분산 블렌드를 제형하는데 사용될 수 있음을 시사한다. 실시예 56-70은 여러 선충 종이 종-특이적 소형 분자 신호를 분산 거동을 조절하는데 활용한다는 것뿐만 아니라, 선충 분산 거동이 종간 통신에 의해 널리 유도될 수 있다는 것을 또한 실연한다.
실시예 71 - 체류 검정법
OP50 이. 콜라이를 표준 5 cm 한천 플레이트 (표준 선충 성장 배지로 제조됨)에서 성장시켰다. 이러한 박테리아 잔디는 직경이 16 mm였고, 시험에서 사용되기 전에 이를 20℃에서 철야로 성장시켰다. 2개의 4 mm 지점 (0.6 ㎕)을 박테리아 잔디의 양쪽 측면 상에 놓고 (투명한 주형을 사용하여 지점 배치를 도움), 액체가 침강되도록 수분이 지난 후에, 검정법에서 선충을 내려 놓았다. 벌레를 배치하고 즉각적으로 기록을 시작하였다. 0.6 ㎕의 대조군을 잔디의 한쪽 측면에 놓고, 0.6 ㎕의 실험 신호를 잔디의 다른 쪽 측면에 놓았고, 이때 시험 전반에 걸쳐 신호의 위치를 왼쪽/오른쪽 및 위/아래 사이에서 변화시켜 편향을 방지하였다.
발달된 성체로서 시험에서 사용되기 전날에 L4 단계에서 선충을 성별로 단리하였다. 벌레들을 균일하게 분할하였고, 채점 영역의 중심으로부터 등거리인 2개의 지점에 놓았다. 시험을 20분 동안 기록하였고, 초 당 1 프레임으로 분석을 위해 프레임을 수집하였다. 3회 이상의 상이한 시험으로부터 결과를 평균하였다. 이러한 연구에서의 모든 선충 종에 대해, 상이한 총수의 벌레 (양쪽 채점 영역에서 물을 사용함)를 테스트하여 20분 시험에 걸쳐 일관된 편향되지 않은 결과에 필요한 벌레의 최소수를 결정하였다. 다중 종 검정법에서 사용된 벌레의 총수는 종의 최적 파라미터에 좌우되었다. 10마리의 벌레가 피. 레디비부스 수컷 및 암컷에 사용되었고, 20마리의 벌레가 씨. 엘레간스 수컷 및 오. 돌리쿠리다에(O. dolichuridae) 수컷에 사용되었으며, 14마리의 벌레가 에스. 글라세리 수컷에 사용되었다. 자동 소프트웨어를 사용하여 경시적으로 각각의 채점 영역에서의 벌레 점유를 비교하였고, 화학주성 지수 (문헌 [Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))를 개조하여 각각의 아스카로시드에 대한 선호 또는 회피를 채점하였다.
실시예 72 - 유인 검정법
10 cm 표준 화학주성 플레이트를 제조하고 (문헌 [Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 사용 전날까지 4℃에서 보관하였다. 표준 1 cm-직경 구리 파이프를 1 cm-길이의 분절로 절단하여 홀딩 챔버(holding chamber)용으로 사용하였다. 암컷/자웅동체를 철야로 단리하고, M9 완충제에서 3회 세정한 후, 거짓 양성 유인물질을 생산할 수 있는 임의의 박테리아가 사망하도록 2시간 동안 50 ㎕의 1000× 스트렙토마이신으로 예비-컨디셔닝된 플레이트 상에서 배회시켰다. 그 후, 선충을 3회 세정하고, 마지막 세정으로부터의 상청액을 10 cm 플레이트의 가장자리로부터 1 cm의 대조군으로서의 구리 챔버 내에 놓았다. 대조군 챔버 반대쪽의 가장자리로부터 1 cm의 구리 챔버 내의 M9에 선충을 현탁시켰다. 6시간 후, 이어서 이들을 제거하고, 3 ㎕의 1M 아지드화나트륨으로 교체하였다. 100마리의 씨. 엘레간스 성체 수컷을 철야로 단리하고, ddH2O에서 여러번 세정하고, 한천 플레이트의 중앙에 놓았다. 수시간 후, 각각의 영역의 2 cm 이내에 정체된 수컷을 채점하였다. 그 후, 화학주성 지수 (문헌 [Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))를 사용하여 어느 한쪽 포인트 소스에 대한 수컷 화학주성을 채점하였다.
실시예 73 - 짝짓기 검정법
문헌 [Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 짝짓기 검정법을 개조하였다. 간략하게, 40마리의 초기 성체 자웅동체/암컷을 8 mm 박테리아 잔디에 놓았다. 씨. 엘레간스 L4 수컷을 철야로 단리하고, 5마리의 수컷을 자웅동체/암컷-풍부 플레이트 상에 놓았다. 3분 기간 이내에 자웅동체에 반응한 수컷의 수를 계수하였다 (한번에 한마리의 수컷만 계수함). 수컷이 자웅동체에서 정지하고 연속 10초 초과 동안 자신의 밑면 꼬리를 잠재적인 짝 상에 붙였을 때 반응이 정의되었다. 이들을 문헌 [Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)으로부터 또한 개조된 반응 효율에 대해 채점하였고, 이는 하기 식을 사용하여 계산되었다: 반응 효율 = [반응한 수컷 #/5마리의 수컷] × 100％.
실시예 74 - 자동 소프트웨어 (체류 검정법용 )
현미경에 부착된 비디오 카메라로 디지털 비디오 스트림이 생산되었고, 그 후 이를 분석하였다. 각각의 관심 영역에서 벌레가 소비한 평균 시간의 비를 각각의 시험에 대해 계산하였다. 용이한 실행을 위해, 단일 실험에서의 모든 벌레를 대략적으로 동일한 크기로 가정하였다. 따라서, 전체 벌레 대신 벌레 픽셀을 계수하여, 관심 영역 내의 벌레의 분획이 고려되게 하였다. 이는 또한 형상을 기초로 하는 벌레 확인 알고리즘에 대한 요구를 제거하였고, 각각의 프레임이 독립적으로 분석되게 하였다. 밴드-패스(band-pass) 필터를 각각의 프레임에 적용하여, 균일하지 않는 조명의 효과를 제거하였고, 또한 배경에 대해 벌레를 강조하였다. 그 후, 필터링된 영상의 쓰레스홀딩(thresholding) 후에 벌레가 확인되었다. 각각의 실험에 걸쳐, 관심 영역의 위치 및 크기가 공지되었다. 상기 기술된 필터링을 통해, 어떤 픽셀을 벌레가 점유하는지 및 어떤 것이 그렇지 않은지가 알려진다. 따라서, 관심 영역 내의 벌레-픽셀 대 모든 픽셀의 비를 계산하여 벌레 점유비를 산출할 수 있다. 이러한 계산을 모든 프레임에 대해 행하여, 각각의 영역에 대한 벌레 점유비 대 시간의 플롯 출력이 제공되었다.
실시예 75 - HPLC 분석.
써모 피니건 LCQ 데카 XP 맥스(Thermo Finnigan LCQ Deca XP Max)를 50-1000 AMU 범위에서 양이온 방식으로 전기분무 이온화와 함께 사용하였다. 이러한 열 분리(Thermo Separation) 스펙트럼 HPLC 시스템은 P4000 4요소 펌프, AS 3000 자동 샘플러, 및 UV 6000 다이오드 어레이 검출기로 이루어졌다. 용매는 물과 (a) 0.1％ 포름산 및 (b) 90％ 아세토니트릴-10％ 물 + 10 mM 포름산암모늄이었다. 칼럼 온도는 60℃에서 유지되었고, 용매 흐름은 1.0 ㎖/분이었다. 2분 동안 90:10 (a,b)로 시작하여, 5:95로의 구배가 20분 동안 이어지고, 추가로 5분 동안 5:95인 용매 조성으로 역상 칼럼 (PLRP-S 중합체성 역상 칼럼, 250×4.6 mmid, 배리안 인크(Varian Inc.))이 용출되었다. 자외선 흡수를 190 및 400 nm에서 모니터링하였다. 자외선 검출기와 질량 분광법 전기분무 계면 사이의 용매 흐름이 저부피 미세바늘 P450 분할기 밸브 (업처치 사이언티픽(Upchurch Scientific), 워싱턴주 오크 하버)로 9:1로 분할되어, 용출된 화합물의 스펙트럼을 수득하고 동시에 주입된 물질의 90％를 생체검정법을 위해 수집하는 것을 가능하게 하였다. 체류 시간 9.7분의 정제된 피크가 생체검정법에서 수컷에 대해 활성이었다. LC-MS + 화학적 이온화 (양성 모드)는 주요 피크의 m/z가 294(M+NH4)였음을 나타낸다. 이는 NMR 분석을 사용하여 ascr#1인 것으로 확증되었다.
실시예 76 - 계통발생수의 구축
이러한 분석을 위한 소형 서브유닛 리보솜 DNA (SSU rDNA) 서열을 진뱅크(GenBank)에서 수득하였다. 먼저 서열들을 MUSCLE을 사용하여 정렬한 후, 이어서 다양한 길이의 서열들의 비교를 용이하게 하기 위해 트리밍(trimming)하였다. 트리밍된 정렬로 모든 분류군을 대표하는 690개의 특징이 초래되었다. PHYLIP 3.68 패키지로부터의 "Dnadist" 및 "Neighbor" 프로그램을 사용하여 네이버-조이닝(Neighbor-Joining) (N-J) 분석을 행하였고, 이때 "컨센스(Consense)"를 사용하여 다수결 종합수(consensus tree)가 만들어졌다.
실시예 77 - 선충 배양 및 벌레 배출물 및 분비물 수집
씨. 엘레간스, 랍디티스(Rhabditis) 종, 오. 티풀라에(O. tipulae), C. sp.7, 피. 파시피쿠스, 피. 레디비부스, 코에르니아(Koernia) 종, 및 피. 스트롱길로이데스를 표준 6 cm 한천 플레이트+ 이. 콜라이 OP50에서 유지시켰다. 다량으로 성장시키기 위해, 이들을 액체 배양물 - S 완전 배지 + 이. 콜라이 HB101에서 인큐베이터 진탕기에서 250 rpm으로 20℃에서 성장시켰다. 박테리아를 제거하도록 에스 베이설을 사용하여, 벌레를 여러 세정 및 여과 단계에 노출시켰다. 3000 rpm에서 5분 동안의 원심분리로 세정들 사이에 벌레를 수집하였다. 벌레를 1마리의 벌레/에스 베이설 ㎕로 6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 벌레를 여과하고, 나머지 상청액을 0.22 ㎛ 필터에 통과시킨 후, -20℃에서 보관하였다.
에스. 카르포캅사에, 에스. 글라세리, 에스. 리오브라베, 및 에이치. 박테리오포라를 문헌 [Hallem, et al., Curr. Biol. 21(5):377-83 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 바와 같이 유지시켰다. 간략하게, 여러 최종령 갈레리아 멜로넬라 유충을 6 ㎝ 페트리 접시 + 55 mm 와트만(Whatman) 1 여과지 상에 놓았다. 약 500-1000마리의 IJ를 이러한 여과지 상에 놓았다. 7일 후, 곤충 사체를 와트만 1 여과지를 보유하는 뒤집힌 6 cm 페트리 접시에 놓고, 10 cm 페트리 접시 내의 소량의 ddH2O에 함침시켰다. 출현하는 IJ를 수집하고, 상기 기술된 바와 같이 여러 번 세정한 후, ddH2O에서 1 마리의 벌레/㎕로 6시간 동안 인큐베이션하였다. 감염 3일 후에 곤충 사체로부터 성체를 절단하고, 상기 기술된 바와 같이 세정/인큐베이션하였다.
엔. 브라실리엔시스, 에이. 수움(A. suum), 피. 페네트란스(P. penetrans), 및 로마노메르미스(Romanomermis) 종은 하기 표 11에서 확인된 공동 연구자들이 제공하였다. 이러한 실시예에서 사용된 모든 균주가 열거된다. 균주 확인이 없는 종은 "지정되지 않음"으로 표지된다.
Figure pct00085
엔. 브라실리엔시스를 0.85％ 염수에서 1마리의 벌레/5 ㎕ (이의 대형 크기를 고려함)로 30℃에서 인큐베이션하였다. 에이. 수움을 멸균 염수로 세정하고, DMEM에서 3, 6, 및 13시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 상청액을 개별적으로 테스트한 후, 이어서 조합 분석용으로 풀링(pooling)하였다. 피. 페네트란스 및 로마노메르미스 종은 ddH2O에서 20℃에서 250 rpm으로 철야로 인큐베이션하였다.
실시예 78 - 벌레 샘플 제조
벌레 물 샘플을 동결건조시키고, 1-10 ㎖ 메탄올로 2회 추출하고, 탈지면에서 여과하였다. 추출물을 진공에서 농축하였다. 생성된 잔류물을 150 ㎕ 메탄올에 재현탁한 후, 여과하였다.
실시예 79 - MS 분석
10:1 분할을 사용하여 쿼트로 II 분광계 (마이크로매스/워터스)에 연결된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC-MS를 수행하였다. 0.1％ 아세트산-아세토니트릴 용매 구배를 3.6 ㎖/분의 유속으로 사용하였고, 이때 5분 동안 5％의 아세토니트릴 함량으로 시작한 후 40분의 기간에 걸쳐 100％로 증가되었다. 3.5 kV의 모세관 전압 및 각각 -40 V 및 +20 V의 콘 전압을 사용하여, 음이온 및 양이온 모드의 HPLC-ESI-MS로 대사산물 추출물을 분석하였다. 준-분자 이온 신호 (도 72A-D) 및 HPLC 체류 시간 (도 73)을 씨. 엘레간스의 야생형 및 과산화소체 베타-산화 돌연변이체로부터 확인된 150개 성분의 라이브러리의 것과 비교함으로써 아스카로시드가 확인되었다. 아스카로시드 구조의 할당을 확증하기 위해, MS/MS 스크린을 m/z = 73.0의 전구체 이온에 대해 사용하였는데 (도 74A-B), 기존의 작업이 모든 아스카로시드가 MS/MS 시 강한 C3H5O2 생성물 이온을 산출하였음을 가리켰기 때문이다 (충돌 기체로서의 아르곤, 2.1 mtorr 및 30 eV). 상응하는 이온 트레이스들로부터의 LC-MS 신호의 통합에 의해 아스카로시드의 정량을 수행하였다. ascr#1, ascr#2, ascr#3, ascr#5, ascr#7, ascr#9, ascr#10, oscr#9, oscr#10, 및 icas#9의 합성 표준물질에 대해 결정된 반응 인자를 사용하여 상대적인 아스카로시드 농도가 최종적으로 계산되었다. 아직 합성되지 않은 아스카로시드에 대한 반응 인자는 입수가능한 표준물질에 대해 관찰된 데이터를 기초로 외삽하였다.
실시예 80 - 아스카로시드 oscr# 9의 합성
아스카로시드 oscr#9를 하기 반응식 11에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 11]
Figure pct00086
2를 제조하기 위해, 메탄올 (17 ㎖) 내의 신선하게 증류된 δ-발레로락톤 (1) (856 ㎎)을 진한 H2SO4 (100 ㎕)로 처리하고, 12시간 동안 환류시켰다. 용액을 -20℃로 냉각하고, NaHCO3 (80 ㎎)로 처리하고, 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 DCM (10 ㎖)에 용해시키고, Na2SO4에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축하여, 메틸 5-히드록시펜타노에이트 (2) (문헌 [Huckstep et al., Synthesis 10:881-82 (1982)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (1071 ㎎, 94％)가 무색 오일로서 제공되었고, 이를 임의의 추가적인 정제 없이 직접적으로 사용하였다.
Figure pct00087
도 75A-B 참조.
4를 제조하기 위해, -20℃의 건조 THF (3 ㎖) 내의 노난디온산 모노메틸 에스테르 (3) (923 ㎎, 4.6 mmol)의 용액을 10분에 걸쳐 THF 내의 1 M BH3 (4.6 ㎖, 4.6 mmol)으로 처리하였다. 실온에서 4시간 동안 교반한 후, 0℃의 0.77 M 수성 K2CO3 용액 (10 ㎖)으로 반응을 켄칭시켰다. 생성물을 디에틸 에테르 (3 × 20 ㎖)로 추출하고, 포화 수성 NaCl 용액으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하여, 메틸 9-히드록시노나노에이트 (4) (문헌 [Kai K. et al., Tetrahedron 64:6760-69 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (850 ㎎, 99％ yield)가 무색 오일로서 산출되었고, 이를 임의의 추가적인 정제 없이 직접적으로 사용하였다.
Figure pct00088
도 75C 참조.
6을 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (5) (11116) (132 ㎎, 263 μmol) 및 2 (125 ㎎, 950 μmol)의 용액을 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. n-헥산 내의 20-40％ (v/v) 에틸 아세테이트 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 5-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2-일옥시)-펜탄산 메틸 에스테르 (6) (66.8 ㎎, 142 μmol, 47％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00089
도 75D-E 참조.
oscr#9 (7)를 제조하기 위해, 건조 THF (0.5 ㎖) 내의 6 (66.8 ㎎, 142 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (4 ㎖) 내의 LiOH (28 ㎎, 1.4 mmol) 및 물 (0.6 ㎖)의 혼합물에 첨가하였다. 66℃에서 2시간 동안 교반한 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 1％ 빙초산을 함유하는 DCM 내의 5-30％ (v/v) 메탄올 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 5-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2-일옥시)-펜탄산 (oscr#9) (7) (26 ㎎, 105 μmol, 74％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00090
도 75F-G 참조.
실시예 81 - 아스카로시드 oscr# 10의 합성
아스카로시드 oscr#10을 하기 반응식 12에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 12]
Figure pct00091
8을 제조하기 위해, 0℃의 건조 DCM (3 ㎖) 내의 2,4-디-O-벤조일-아스카릴로스-1-(2,2,2-트리클로로아세트이미드) (5) (132 ㎎, 263 μmol, 문헌 [Hallem, et al., Curr. Biol. 21(5):377-83 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 및 4 (112.8 ㎎, 600 μmol)의 용액을 트리메틸실릴옥시 트리플레이트 (5 ㎕)로 처리하였다. 3시간 후, 용액을 포화 수성 NaHCO3 용액 (0.5 ㎖)으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. n-헥산 내의 20-40％ (v/v) 에틸 아세테이트 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 99.3 ㎎ 9-(3'R,5'R-디벤조일옥시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2-일옥시)-노난산 메틸 에스테르 (8) (190 μmol, 72％ 수율)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00092
도 75H-I 참조.
oscr#10을 제조하기 위해, THF (500 ㎕) 내의 8 (99.3 ㎎, 190 μmol)의 용액을 5 ㎖ 1,4-디옥산 (5 ㎖) 내의 LiOH (38 ㎎, 1.9 mmol) 및 물 (800 ㎕)의 혼합물에 첨가하였다. 66℃에서 3시간 동안 교반한 후, 용액을 아세트산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 1％ 빙초산을 함유하는 DCM 내의 5-30％ (v/v) 메탄올 구배를 사용하는 실리카 겔 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 9-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2-일옥시)-노난산 (oscr#10) (9) (49 ㎎, 161 μmol, 85％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00093
도 75J-K 참조.
실시예 82 - 다수의 선총 종이 아스카로시드를 생산한다
질량 분광법을 기초로 하는 스크린을 자유-생활 및 기생성 (식물, 곤충 및 포유동물) 선충이 포함되는 다양한 선충 종 선집에서 아스카로시드에 대해 시작하였다 (도 76A-D). 기존의 연구는 씨. 엘레간스 아스카로시드 생산이 발달 단계-특이적임을 나타냈다 (문헌 [Kaplan et al., Pub. Lib. Sci. ONE 6(3):e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 포괄적인 샘플을 수득하기 위해, 모든 유충 및 성체 단계에 의해 방출되는 아스카로시드의 축적물을 함유하는, 발달 면에서 혼합형인 배양물로부터의 삼출물을 테스트하였다. 실행가능한 경우, 숙주 탐색 또는 짝 발견과 독특하게 연관된 아스카로시드를 확인하기 위한 목적으로 기생성인 감염성 애벌레 및 성체를 별도로 테스트하였다. 선충 분비물을 복합적인 대사체 샘플 내의 아스카로시드의 검출에 최적화된 프로토콜을 사용하여 HPLC-MS를 통해 분석하였다 (실시예 79). 이러한 분석에서 대부분의 선충 샘플 내의 아스카로시드의 존재가 밝혀졌다. 샘플들을 씨. 엘레간스의 야생형 및 돌연변이체 균주 양쪽 모두로부터 기존에 확인된 150개의 아스카로시드의 라이브러리로부터의 질량 분광 데이터와 비교하였다. 이러한 분석에서, 분석된 선충 샘플 대부분에서의 아스카로시드의 존재가 밝혀졌다.
일반적으로 아스카로시드는 포화 및 불포화 측쇄가 있는 화합물을 포함하여 혼합물로서 발생한다. 측쇄 길이가 고도로 가변적이었고, 씨. 엘레간스에서 또한 발견되는 더 짧은 사슬부터 펠로데라 스트롱길로이데스 및 헤테로랍디티스 박테리오포라에서의 상당히 더 긴 측쇄가 있는 화합물까지의 범위에 이르렀다. 씨. 엘레간스에서와 같이, 아스카릴로스가 측쇄의 말단 탄소에 부착되어 있는 아스카로시드 ("ω-관능화", 예를 들어 도 76D의 oscr#9 및 oscr#10)를 생산하는 카에노랍디티스 종 7 및 랍디티스 종을 제외하고는, 대부분의 확인된 아스카로시드는 측쇄의 끝에서 두 번째 탄소에 아스카릴로스 당을 보유한다 ("ω-1-관능화"). 최근 씨. 엘레간스에서 응집 신호로서 작용하는 것으로 나타난 인돌 아스카로시드, 예를 들어 icas#9 (도 76A) (문헌 [Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))는 카에노랍디티스 종에서만 발견되었다. 그러나, 씨. 엘레간스에서, 인돌 아스카로시드 농도가 단순 아스카로시드 (도 76A의 "ascr" 및 "oscr")의 것보다 훨씬 더 낮았다. 본원에서 연구된 대부분의 종에 대한 이용가능한 대사산물 샘플 크기가 카에노랍디티스 종에 대해 이용가능한 것보다 훨씬 더 작았으므로, 인돌 아스카로시드가 양이 HPLC-MS로 검출되기에는 양이 너무 작았기 때문에 일부 선충에서 검출될 수 없는 것이 가능하다.
아스카로시드 프로파일은 일반적으로 종 간에 변하였다 (도 77). 그러나, 일부 경우의 매우 상이한 생태 환경으로부터의 종이 동일한 아스카로시드들을 생산하였다. 예를 들어, ascr#9가 퇴비-거주 파나그렐룰스 레디비부스, 랍디티스 종, 및 카에노랍디티스 종; 토양-거주 오스케이우스 티풀라에; 곤충-연관 프리스티온쿠스 파시피쿠스; 및 곤충-감염성 헤테로랍디티스 박테리오포라, 스테이네르네마 카르포캅사에, 스테이네르네마 리오브라베, 및 스테이네르네마 글라세리에 의해 생산된다.
17개의 분석된 선충 종 중 3가지, 즉 프라틸렌쿠스 페네트란스, 아스카리스 수움, 및 로마노메르미스 종에서 에서 공지된 아스카로시드가 검출되지 않았다. 이러한 종들이 매우 소량의 아스카로시드만 생산하거나, 또는 씨. 엘레간스의 야생형 및 돌연변이체 균주로부터 확인된 것들과 유사한 아스카로시드가 스크리닝되었다는 것을 고려하여, 이들이 사용된 방법으로 검출될 수 없는 뜻밖의 구조적 특색이 있는 아스카로시드를 생산하는 것이 가능하다. 기존의 연구에서, 지질-유사 긴 사슬 아스카로시드의 존재가 아스카리스 수움에서 보고되었다; 그러나, 이들은 난모세포 및 난에 한정되었다 (문헌 [Bartley et al., J. Nat. Prod. 59(10):921-26 (1996)]; [Tarr, Comp. Biochem. Physiol. 46B:167-76 (1973)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이들의 고도로 친지성인 특징을 고려하여, 이러한 화합물들은 수성 배지에 불량하게 가용성이고 (이는 본원에서의 상기 분석에서의 이들의 부재를 설명한다), 따라서 페로몬으로서의 역할을 할 것 같지 않다. 메르미티드(Mermithid) 종, 예컨대 로마노메르미스 종은 지질로 구성된 영양물의 평생 공급량을 저장하는 독특한 능력이 있다 (문헌 [Platzer, J. Am. Mosquito Contr. Association Bulletin 7:58-64 (2007)]; [Ittycheriah et al., Nematologica 23:165-71 (1977)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 상이한 지방산 대사 메커니즘이 있거나 또는 로마노메르미스 종이 테스트된 가장 선조성인 종이라는 것을 고려하여 아마도 아스카로시드 합성이 아직 진화되지 않은 것이 가능하다.
실시예 83 - 아스카로시드가 별개의 선충 거동을 매개한다
일련의 합성된 아스카로시드에 대한 선충 거동 반응을 여러 상이한 거동 검정법을 사용하여 테스트하였다. 개별적인 아스카로시드로 컨디셔닝된 영역의 선호 또는 회피를 검출하는 자동 소프트웨어 (도 79)를 사용하는 체류 검정법 (도 78)을 사용하였다. HPLC/MS 연구에서의 선충 종을 이러한 생체검정법과의 상용성에 대해 스크리닝하였고, 이는 박테리아 잔디를 가로지르는 적당한 이동을 필요로 한다. 기생 선충은 이들이 이의 숙주 환경과 유사한 물질을 필요로 하는 것으로 인해 대부분 배제되었다. 추가로 이러한 조사는 잘 이동하고, 따라서 포함된 피. 레디비부스 암컷을 제외하고는 수컷에 한정되었는데, 이는 대부분의 종에서 수컷이 암컷 또는 자웅동체보다 훨씬 더 이동성이었기 때문이었다. 오스케이우스 티풀라에는 이러한 자웅동체 종에서 수컷이 가끔씩만 존재한다는 사실로 인해 배제되었다; 대신, 밀접하게 관련된 수컷-암컷 종인 오스케이우스 돌리쿠로이데스(Oscheius dolichuroides)가 부가되었다. 기존의 연구에서, ascr#2 및 ascr#3의 ~1 pmol (1 μM 농도부터)의 샘플이 씨. 엘레간스에서의 유인을 위한 가장 활발한 농도인 것으로 증명되었다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 따라서, 이용가능한 합성 아스카로시드를 1 nM, 1μM, 및 1 mM의 농도에서 테스트하였다.
테스트된 선충 종 중 몇몇이 다수의 동일한 아스카로시드, 특히 ascr#1, ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9, 및 ascr#10으로 컨디셔닝된 구역을 선호하였다 (도 78). 그러나, 활성 역치가 종들 간에 달랐다. 예를 들어, 씨. 엘레간스 수컷은 ascr#10의 1 μM-컨디셔닝 영역을 선호한 반면, 에스. 글라세리 및 피. 레디비부스 수컷은 ascr#10의 1 mM-컨디셔닝 영역만 선호하였다. 또한, 몇몇 선충 종은 자신의 종에서 생산되지 않은 아스카로시드에 반응하였고, 이는 가능한 종간 통신을 시사한다. 테스트된 종 중 하나인 오. 돌리쿠로이데스(O. dolichuroides)는 어떠한 검정된 아스카로시드에도 반응하지 않았다. 이러한 종이 다른 아스카로시드에 반응하거나 또는 특정 환경 조건이 아스카로시드에 대한 이의 반응을 일으키는데 필요한 것이 가능하다.
추가로, 피. 레디비부스 수컷 및 암컷을 씨. 엘레간스에서 기존에 기술된 현상 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))인 상이한 아스카로시드 세트에 대한 반응에 대해 관찰하였다. 이러한 성별-특이적 반응은 아스카로시드들이 종들 사이 및 종들 내 양쪽 모두에서 상이한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, icas#9는 씨. 엘레간스에서 응집 자극물로서 작용하였지만 (문헌 [Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10(1):e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)); 이는 피. 레디비부스 암컷을 퇴치하였고, 피. 레디비부스 수컷으로부터 반응을 유발하지 않았다. icas#9는 피. 레디비부스에 의해 생산되지 않았기 때문에, 이는 종간 신호로서의 역할을 할 수 있었다.
멀리서 씨. 엘레간스 수컷을 유인하는 씨. 엘레간스 자웅동체의 능력을 또한 테스트하였다. 기존의 연구에서, 씨. 엘레간스 자웅동체가 단일 자웅동체로 컨디셔닝된 포인트 소스를 함유하는 5 cm 플레이트 또는 자웅동체-인큐베이션 상청액을 보유하는 한천-마운팅 슬라이드 상에서 수컷을 유인하지 못했다는 것이 보고되었다 (문헌 [Bargmann et al., Cell. 74:515-27 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 본원에 기술된 실험에서, 10 cm 플레이트를 사용하여 1-300마리의 자웅동체를 사용하여 검정법 영역의 직경 및 자웅동체의 수 양쪽 모두가 확장되었다 (도 80A). 결과는 씨. 엘레간스 자웅동체가 실제로 멀리서 수컷을 유인하였음을 나타낸다 (도 80B). 50마리의 씨. 엘레간스 자웅동체를 향한 씨. 엘레간스 수컷의 화학주성 능력을 동일한 수의 다른 종으로부터의 암컷 또는 자웅동체의 것과 비교하였다. 씨. 엘레간스 수컷이 7가지 상이한 아스카로시드에 유인된 것으로 발견되었기 때문에 (도 78), 이러한 아스카로시드를 생산하는 종은 씨. 엘레간스 수컷을 유인할 것인 반면 이러한 아스카로시드를 거의 생산하지 않는 또는 생산하지 않는 것들은 씨. 엘레간스 수컷을 유인하지 못할 것으로 예상되었다. 본원에서의 결과는 씨. 엘레간스 수컷이 피. 레디비부스 암컷에 대한 부분적인 유인을 실연하였음을 나타내고 (도 80A-C), 이러한 종은 7개의 공지된 씨. 엘레간스 수컷 유인물질 중 3개를 생산하였다 (도 77) (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 씨. 엘레간스 수컷이 에스. 카르포캅사에, 피. 파시피쿠스, 또는 피. 스트롱길로이데스 종 (각각 공지된 씨. 엘레간스 수컷 유인물질 중 2개, 1개 및 0개를 생산함)으로부터의 암컷 또는 자웅동체에 대한 긴 범위 유인을 나타내지 않았음이 또한 발견되었다. 이러한 발견은 상이한 선충 종들 간의 아스카로시드-매개 상호작용의 가능성에 대한 추가적인 증거를 제공한다. 3가지의 기존에 기술된 씨. 엘레간스 짝-발견 페로몬 (ascr#2, ascr#3, 및 ascr#8) (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007) (본원에 전문이 참고로 포함됨))의 개별적인 역할을 또한 테스트하여 멀리서의 수컷 유인을 유발하였다. 결과는 ascr#2 및 ascr#3이 각각 500 애토몰 및 5 페토몰만큼 낮은 양으로 씨. 엘레간스 수컷 유인을 유발한 반면, ascr#8은 이러한 검정법에서 활성이지 않았음을 나타낸다. 이러한 결과는 ascr#2 및 ascr#3운 멀리서 씨. 엘레간스 수컷을 유인하는 역할을 하는 반면,ascr#8은 포인트 소스에 도달 시 인근 내에서 수컷을 유지시키는 역할을 한다는 것을 시사한다.
씨. 엘레간스 수컷과 동종 자웅동체, 뿐만 아니라 상이한 선충 종의 암컷/자웅동체 간의 짝짓기를 또한 조사하였다. 자웅동체/암컷과 교미하려고 시도하는 수컷의 백분율을 채점하는 문헌 [Peden & Barr, Curr. Biol. 15:394-404 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 짝짓기 검정법을 개조하였다 (도 81). 조사는 씨. 엘레간스가 멀리 관련된 선충 종과 짝짓기를 할 것인지 여부를 테스트하기 위한 것이었다. 결과는 이들이 10초 동안 피. 레디비부스, 에스. 카르포캅사에, 피. 파시피쿠스, 또는 피. 스트롱길로이데스와 교미하려고 시도하지 않았음을 나타낸다 (도 81). 또한, 아스카로시드들의 블렌드의 첨가가 이러한 선충 종들 중 어떤 것에 대해서도 짝짓기를 유도하지 않았다. 기존의 연구는 씨. 엘레간스 수컷 짝짓기 거동이 기계적 감각 신호 또는 국소적인 화학 신호를 통한 자웅동체 인지에 의해 주로 안내되었음을 가리켰다 (문헌 [Liu et al., Neuron 14:79-89 (1995)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 본원에서의 결과는 아스카로시드 성 페로몬이 씨. 엘레간스 짝 위치를 보조하는 역할을 하지만 신체적인 짝짓기에 영향을 미치지는 않는다는 것을 시사한다.
실시예 71-83의 논의
실시예 71-83의 발견은 여러 선충 종에 의한 아스카로시드의 광범위한 생산 및 인지를 고려하여 아스카로시드가 광범위한 목록(lexicon)을 포함한다는 것을 가리킨다. 이러한 발견은 아실 호모세린 락톤 (AHL)이 그람-음성 박테리아의 다수의 종에 의해 생산 및 감지되는 박테리아 쿼럼 감지를 환기시킨다 (문헌 [Miller et al., Annu. Rev. Microbiol. 55:165-99 (2001)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 82). 상이한 AHL들이 구조적으로 매우 유사하지만, N-아실 사슬에서의 종-특이적인 변동이 있다 (문헌 [Miller et al., Annu. Rev. Microbiol. 55:165-99 (2001)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 아스카로시드들은 매우 유사한 방식으로 구성된다: 이들은 동일한 아스카릴로스 당 고리로 구성되지만, 부착된 지방산 측쇄에서의 변동이 있다 (문헌 [Dickschat, Nat. Prod. Rep. 27:343-69 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 82). 본원에서의 결과는 선충이 아스카로시드들의 동일한 레퍼토리로부터의 조합물을 분비하여 자신을 주변 환경에 특이적인 화학적 서명을 제시한다는 것을 가리킨다.
아스카로시드 및 AHL 양쪽 모두의 공유된 구조적 구성 및 광범위하게 도달되는 성질은 생화학적 통신 네트워크의 구문론에 새로운 견지를 제공한다. 다수의 박테리아 거동, 예컨대 생물발광, 바이오필름 형성, 발병 인자 발현, 항생제 생산 및 운동성이 쿼럼 감지에 의해 매개된다 (문헌 [Boyer & Wisnieski-Dye, FEMS Microbiol. Ecol. 1:1-19 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 유사하게, 다수의 씨. 엘레간스 거동, 예컨대 짝 발견, 반발, 응집, 후각 적응성, 및 휴면 생애 단계로의 진입이 아스카로시드에 의해 매개된다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Jeong, et al., Nature 433:541-45 (2005)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007)]; [Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009)]; [Niblack et al., Annu. Rev. Phytopathol. 44:283-303 (2006)]; [Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009)]; [Yamada et al., Science 329:1647-50 (2010)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Golden & Riddle, Science 218:578-80 (1982)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
또한, 씨. 엘레간스의 아스카로시드 프로파일이 성장 및 환경적인 교란에 반응하여 변화된다 (문헌 [Kaplan et al., Pub. Lib. Sci. ONE 6(3):e17804 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 선충 및 선충 거동의 광범위한 다양성을 고려하여, 아스카로시드의 모듈형 성질이 개체 또는 집단의 변화되는 요구를 전달하도록 단일 메커니즘을 사용하기 위한 적합한 전략인 것으로 보인다. 박테리아 AHL과 구조적으로 유사한 분자들을 합성하여 박테리아 통신을 방해하는 새로운 클래스의 항균 약물을 개발할 수 있다 (문헌 [Schauder et al., Genes Dev. 15:1468-80 (2001)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 선충에서의 유사한 연구가 기생충-숙주 모델에서 선충 생식 및 생존을 방해하는 합성 아스카로시드 블렌드의 디자인을 가능하게 할 수 있다.
현재 선충이 매년 세계 농업에 약 천억 달러의 손실을 초래하고 (문헌 [JOSEPH A. VEECH: VISTAS ON NEMATOLOGY (Society of Nematologists, Inc., Hyatsville, MD, 1987)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 세계적으로 30억명의 인간을 감염시키기 때문에 (문헌 [Blumenthal & Davis, Nat. Genet. 36:1246-47 (2004)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 기생충 방제에 대한 상당한 요구가 존재한다. 곤충 해충 관리를 위해 종-특이적 페로몬을 사용하는 개념은 50년에 걸쳐 곤충 페로몬 연구를 구동시켰고, > 100가지의 페로몬이 해충 관리에 활용되었다 (문헌 [Witzgall et al., J. Chem. Ecol. 36:80-100 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 페로몬-매개 개입은 대두 기생 선충인 헤테로데라 글리세네스(Heterodera glycines)의 방제를 향하여 단일 선충 페로몬인 바니린산에만 실용적으로 적용되었다 (문헌 [Meyer et al., J. Nematol. 29:282-88 (1997)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이는 아마 에이치. 글리세네스(H. glycines) 및 씨. 엘레간스(C. Elegans)에서 발견된 것들을 제외하고는 선충 페로몬 확인의 결여에 기인할 것이다 (문헌 [Jaffe et al., J. Chem. Ecol. 15:2031-43 (1989)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Jeong, et al., Nature 433:541-45 (2005)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007)]; [Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 선충 페로몬의 이러한 광범위하게 도달되는 모듈형 라이브러리의 발견은 틀림없이 이러한 필수적인 시도에 유용한 것으로 입증될 수 있는 한편, 구문론의 해석은 생화학적 서명의 진화에 새로운 견지를 제공할 수 있다.
실시예 84 - 뿌리혹 선충에서의 아스카로시드 생산
아스카로시드 ascr#10, ascr#16, ascr#18, ascr#20, 및 ascr#22이 멜로이도기네 식물 기생 선충의 특정 종에서 검출되었고 (도 83), 고해상도 질량 분광법을 사용하여 확인되었다 (도 84-88). 이러한 아스카로시드 및/또는 이의 구조적 유도체 (단독, 조합됨, 및/또는 ascr#9 또는 기타 아스카로시드와 조합됨)가 멜로이도기네 종에서 분산제 및 퇴치제로서 작용하는 것이 예상된다. (ascr#18 및 ascr#22 및/또는 이의 구조적 유도체 (단독, 조합됨, 및/또는 ascr#9 또는 기타 아스카로시드와 조합됨)가 헤테로랍디티스에서 분산제 및 퇴치제로서 작용하는 것이 또한 예상된다.)
실시예 85- 피. 파시피쿠스 대사산물 명명
모든 새롭게 확인된 화합물을 실시예 3에 기술된 바와 같이 4문자 SMID로 명명하였다. 새로운 4문자 SMID (pasc (페닐에탄올아미드 아스카로시드( p henylethalnolamide asc aroside)), ubas (3-우레이도 이소부티레이트 아스카로시드(3- u reido iso b utyrate ascaroside)), dasc (이량체성 아스카로시드( d imeric asc aroside)), part (파라토시드( par a t oside)), 및 npar (뉴클레오시드계 파라토시드( n ucleoside-based par atoside))가 여기서 도입된다.
실시예 86 - 분석 기기 조작
NMR 스펙트럼을 배리안 INOVA 600 (1H에 대해 600 MHz, 13C에 대해 151 MHz), INOVA 500 (1H에 대해 500 MHz, 13C에 대해 125 MHz), 또는 INOVA 400 (1H에 대해 400 MHz, 13C에 대해 100 MHz) 기기 상에서 기록하였다. HPLC-MS 및 플래시 크로마토그래피를 실시예 1에 기술된 바와 같이 수행하였다. 텔레다인 ISCO의 폭시 200 분획 수집기에 커플링된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4×250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC 분획화를 수행하였다. 제보 G2 QTOF 질량 분광계를 사용하여 고해상도 질량 스펙트럼을 취득하였다.
실시예 87 - 피. 파시피쿠스 균주 및 배양 조건
프리스티온쿠스 파시피쿠스 균주 RS2333 (외부-대사체 제조), RS5134 (다우어 형성 검정법), 및 RSB020 (마우스 입 이형성 검정법)을 사용하였다. 문헌 [Ogawa et al., Curr. Biol. 19:67-71 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 벌레의 액체 배양물 및 플레이트를 제조하였다.
실시예 88 - 외부- 대사체 추출물의 제조 및 예비 분획화
피. 파시피쿠스 균주 RS2333의 배양 상청액 3 L를 여과하고, 10,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 배양 상청액을 C18 칼럼 (크로마본드(Chromabond), 마커리 네이글(Macherey Nagel))에 적용한 후, H2O 내의 50％ MeOH로 용출시켰다. 이러한 단계로 강하게 친지성인 성분 (예를 들어 트리글리세리드, 긴 사슬 지방산)이 제거되었지만, 생물활성이 감소되지는 않았다. 용출액을 증발시키고, 클로로포름 및 메탄올 (2:1)의 혼합물로 재현탁시켰다. 샘플을 클로로포름/메탄올 (2:1)으로 평형화된 SiOH 칼럼 (크로마본드, 마커리 네이글)에 적용하였다. 칼럼을 클로로포름/메탄올 (2:1, 분획 I), 클로로포름/메탄올 (1:5, 분획 II), 및 클로로포름/메탄올/물 (6:10:1, 분획 III)로 세정하였다. 분획 II가 이어지는 다우어 형성 검정법에서 최고의 활성을 나타냈고, 이를 예비 2D-NMR 분광법-기반 분석용으로 사용하였다. 여러 추가적인 1 L-뱃치(batch)의 배양 상청액을 유사하게 프로세싱하여, 초기 2D NMR 분광 분석에서 검출된 화합물을 더 많은 양으로 수득하였다.
분획화되지 않은 물질의 추가적인 고해상도 HPLC-MS 분석을 위해, 배양 상청액의 100 ㎖ 샘플을 미세 분말로 동결건조시키고, 이어서 이를 50 ㎖의 에탄올 및 물의 95:5 혼합물로 16시간 동안 추출하였다. 추출물을 진공에서 농축하고, 여과하고, 추가적인 프로세싱 없이 HPLC-MS에 사용하였다. 박테리아 대조군 실험을 위해, 1 L의 철야로 성장된 이. 콜라이 OP50 박테리아 배양물을 동결건조하고, 상기 기술된 바와 같이 처리하였다.
실시예 89 - 대사체의 2D NMR 분광 분석
하기의 파라미터를 사용하여 비-구배 상-사이클(phase-cycled) dqfCOSY 스펙트럼을 취득하였다: 0.8 s 취득 시간, 400-600 복합 증분, 8-32회의 스캔/증분. dqfCOSY 스펙트럼을 8k × 4k로 제로-필(zero-fill)하고, 코사인 종 모양의 윈도우 함수를 푸리에 변환 전에 양쪽 치수에 적용하였다. 0.25 s 취득 시간 및 256-500 복합 증분을 사용하여 구배 및 비-구배 HSQCAD 및 HMBC 스펙트럼을 취득하였다. 배리안 VNMR, 메스트레랩스의 메스트렉, 및 MNova 소프트웨어 패키지를 사용하여 NMR 스펙트럼을 프로세싱하였다.
실시예 90 - HPLC 프로토콜 및 LC - MS / MS 분석
10:1 분할을 사용하여 쿼트로 II 질량 분광계 (마이크로매스/워터스)에 연결된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC-MS를 수행하였다. 0.1％ 아세트산-아세토니트릴 용매 구배를 3.6 ㎖/분의 유속으로 사용하였고, 이때 5분 동안 5％의 아세토니트릴 함량으로 시작하여 40분의 기간에 걸쳐 100％로 증가시켰다. 4.0 kV의 모세관 전압 및 각각 -40 V 및 +20 V의 콘 전압을 사용하여 음이온 및 양이온 모드의 HPLC-ESI-MS로 외부-대사체 분획을 분석하였다. m/z = 73.0 (음성 모드)의 전구체 이온에 대한 LC-MS/MS 스크리닝을 2.1 mtorr 및 40 eV에서 아르곤을 충돌 기체로서 사용하여 수행하였다. 이러한 HPLC 프로토콜을 합성 샘플 정제, 뿐만 아니라 피. 파시피쿠스 외부-대사체의 미량 성분의 강화에 또한 사용하였다.
실시예 91 -화학 합성을 위한 일반적인 방법
달리 언급되지 않는 한 J. T. 베이커(J. T. Baker)의 실리카 겔 IB2-F를 사용하여 박층 크로마토그래피 (TLC)를 사용하여 반응의 진행을 모니터링하였다. 달리 언급되지 않는 한, 시약을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구입하였고, 추가적인 정제 없이 사용하였다. N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 및 디클로로메탄 (DCM)을 사용 전에 4 Å 분자체에서 건조시켰다. 테트라히드로푸란 (THF) 및 1,4-디옥산을 사용 전에 증류시켰다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) 241 편광계에서 광학 회전을 측정하였다. 광학 회전을 취하는데 사용된 용매 (메탄올)는 사용 전에 추가로 정제하지 않았다.
실시예 92 - 다우어 형성 검정법
열 또는 카나마이신으로 사망시킨 이. 콜라이 OP50을 사용하여, 문헌 [Ogawa et al., Curr. Biol. 19:67-71 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 기술된 바와 같이 다우어 형성 검정법을 수행하였다. 합성 화합물을 에탄올 (0.5 mM, 모액)에 용해시키고, 100 ㎕ 용액이 제조되도록 물과 합치고, 이어서 3 ㎖의 펩톤이 없는 NGM-한천에 첨가하였다 (3, 1, 0.3, 0.1 μM 최종 농도).
실시예 93 - 입-형태 이형성 검정법
입-형태 이형성 검정법을 피. 파시피쿠스 균주 RSB020을 사용하여 수행하였다. 에탄올 (0.5 mM)에 용해된 합성 화합물을 물로 희석하여 100 ㎕ 용액으로 만들고, 이어서 3 ㎖ NGM-한천에 첨가하였다 (1 μM 최종 농도). 이러한 검정법 플레이트에 LB 배지 내의 OP50 배양물 50 ㎕를 시딩하고, 철야로 20℃에서 인큐베이션하여, 박테리아가 성장하도록 하였다. 각각의 복제물은 모체 2마리의 자손을 포함하였고, 이를 일관된 나이 (4-6개의 알을 보유함)의 성체 자웅동체로서 채집하였으며, 이들은 모두 동일한 피. 파시피쿠스 배양 플레이트로부터의 것이었다. 모체를 검정법 플레이트 상에 놓은 후, 전체 브루드(brood)가 스크리닝 시점에 성체이도록 플레이트를 20℃에서 6일 동안 유지시켰다. 플레이트 당 자웅동체 자손 50마리의 무작위 샘플을 스크리닝하였다. 모든 동물을 짜이스 악시스콥(Zeiss Axiskop) 상의 차등 간섭 대비 (DIC) 현미경에 의해 스크리닝하였다. 하기의 개별적인 특성들이 광구성 개체를 협구성(stenostomatous) 개체와 구별하는데 각각 사용되었다: (1) 갈고리(claw)-형상 대 부싯돌(flint)-형상 (즉, 배복 면에서 대칭임)의 등쪽 이빨; (2) 배아래 이빨의 존재 대 부재; (3) 강하게 대 약하게 경화된 숨구멍 벽. 중간체 입-형태는 관찰되지 않았다. 각각의 처리에 대해 3중으로 실험을 수행하였다.
여러 농도 (1, 0.3, 0.1, 0.03, 0.01 μM 최종 농도)의 화합물에 대한 반응의 검정법에서, 하기와 같이 변형시켜서 상기 기술된 바와 같이 실험을 수행하였다. 더 낮은 농도에 대한 반응의 더 양호한 해명을 위해, 5개의 복제물/농도/화합물 각각 내의 60마리의 무작위로 스크리닝된 개체를 검정하였다. 모든 농도-곡선 실험을 동일한 2개의 원천 집단으로부터 무작위로 채집된 모체를 사용하여 병행으로 수행하였다. 이러한 실험을 위해 다수의 개별적인 모체를 제조하기 위해, 수컷의 존재를 구속하도록 버진(virgin) 자웅동체로부터 원천 집단을 확립하였고, 이를 적어도 1세대 동안 먹이가 충분한 주위 조건으로 컨디셔닝한 후에 검정법을 위해 모체를 채집하였다.
실시예 94 - 통계 분석
도 122A-D에서 오차 막대는 95％ 신뢰 구간을 나타낸다. 모든 실험을 각각의 처리에 대해 3중으로 (또는 입-형태 농도-곡선 검정법에 대해서는 5개의 복제물로) 수행하였다. 프로그램 R의 피셔의 정확 검정(Fisher's exact test)을 사용하여 도 122A-B에서의 각각의 화학 처리 및 대조군 (EtOH) 처리 간의 유의한 차이 (*P<0.05 및 **P<0.001)를 결정하였다.
실시예 95 - 아스카로시드 pasc #9의 합성
아스카로시드 pasc #9를 하기 반응식 13에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 13]
Figure pct00094
11을 제조하기 위해, 메탄올 및 톨루엔의 3:2 혼합물 (v/v) (2 ㎖) 내의 ascr#9 (문헌 [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (30 ㎎, 121 μmol)의 용액을 디에틸 에테르 내의 2.0 M (트리메틸실릴)디아조메탄 용액 (120 ㎕)으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후, 과량의 시약을 아세트산 첨가로 파괴시키고, 용액을 진공에서 농축하였다. 미정제 잔류물을 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 잔류물 13을 건조 DMF (1.5 ㎖)에 용해시키고, 0℃로 냉각하고, 이미다졸 (91 ㎎, 1.34 mmol)로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. 이러한 혼합물을 tert-부틸클로로디메틸실란 (182 ㎎, 1.21 mmol)으로 처리하고, 철야로 교반하면서 방치하였다. 반응을 염수 (5 ㎖)로 켄칭시키고, 디에틸 에테르로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-25％ 에틸 아세테이트 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 14 (55 ㎎, 112 μmol, 2단계에 걸쳐 93％)가 무색 오일로서 산출되었다. 건조 테트라히드로푸란 (1 ㎖) 내의 14 (55 ㎎, 112 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (2 ㎖) 내의 LiOH (11 ㎎, 457 μmol) 및 물 (0.4 ㎖)의 혼합물에 첨가하였다. 67℃에서 3시간 동안 교반한 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-30％ 에틸 아세테이트 + 0.1％ 아세트산의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스((tert-부틸디메틸실릴)옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (11) (50 ㎎, 105 μmol, 94％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00095
도 89 참조.
( R )-12를 제조하기 위해, 건조 디클로로메탄 (7 ㎖) 내의 (R)(-)-2-아미노-1-페닐에탄올 ((R)-15) (281 ㎎, 2.05 mmol) 및 숙신산 무수물 (220 ㎎, 2.2 mmol)의 용액을 철야로 교반하였다. 그 후, 진공에서 반응물을 농축하였다. 0.25％ 아세트산을 함유하는 디클로로메탄 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 ( R )-16 (470 ㎎, 1.98 μmol, 97％)이 백색 분말로서 산출되었다. 메탄올 및 톨루엔의 3:2 혼합물 (v/v) (10 ㎖) 내의 ( R )-16 (288 ㎎, 1.22 mmol)의 용액을 디에틸 에테르 내의 2.0 M (트리메틸실릴)디아조메탄 용액 (900 ㎕)으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후, 과량의 시약을 아세트산 첨가로 파괴시키고, 용액을 진공에서 농축하였다. 미정제 (R)-메틸 4-((2-히드록시-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부타노에이트 (( R )-12)를 수득하였고, 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. (300 ㎎, 1.20 mmol, 98％).
Figure pct00096
도 90A-B 참조.
18을 제조하기 위해, 3 ㎖ 건조 디클로로메탄 내의 11 (17 ㎎, 36 μmol)의 용액을 4-디메틸아미노피리딘 (1 ㎎, 8.2 μmol) 및 EDC 히드로클로라이드 (11 ㎎, 57 μmol)로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후, 1 ㎖ 건조 디클로로메탄 내의 ( R )-12 (18 ㎎, 71 μmol)를 혼합물에 첨가하였다. 2시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-70％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 17 (17 ㎎, 24 μmol, 67％)이 무색 오일로서 산출되었다. 아세토니트릴 (750 ㎕) 내의 17 (17 ㎎, 24 μmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 교반하면서 1 방울의 40％ HF로 처리하였다. 반응물을 실온으로 가온되게 하고, 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 0℃로 다시 냉각하고, 포화 수성 NaHCO3 용액 (4 방울)으로 켄칭하고, 즉각적으로 빙초산으로 산성화시켰다. 반응물을 진공에서 농축하고, 디클로로메탄 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (R)-(R)-2-(4-메톡시-4-옥소부탄아미도-1-페닐에틸 4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (18) (6.6 ㎎, 13.7 μmol, 57％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00097
도 91A-B 참조.
pasc #9를 제조하기 위해, 건조 테트라히드로푸란 (200 ㎕) 내의 18 (6.6 ㎎, 14 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (400 ㎕) 내의 LiOH (0.3 ㎎, 12 μmol) 및 물 (80 ㎕)의 혼합물로 처리하였다. 60℃에서 5분 동안 교반한 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 미정제 반응 혼합물의 HPLC 정제 (방법 참조)로 4-(((R)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (pasc #9) (1.8 ㎎, 4 μmol, 29％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00098
= -110.0 (c. 0.18, 메탄올).
pasc #9에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 12에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD3OD) = 49.00 ppm을 기준으로 한다. 도 92A-D 참조.
Figure pct00099
실시예 96 - 4-((( S )-2-((( R )-4-(((2 R ,3 R ,5 R ,6 S )-3,5-디히드록시-6- 메틸테트라히드로 -2 H -피란-2-일) 옥시 ) 펜타노일 ) 옥시 )-2- 페닐에틸 )아미노)-4- 옥소부탄산의 합성
pasc #9의 비-천연 이성질체인 4-(((S)-2-(((R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-페닐에틸)아미노)-4-옥소부탄산 (19)을 하기 반응식 14에 제시된 바와 같이 (S)(+)-2-아미노-1-페닐에탄올 (S)-15로부터 시작한 것을 제외하고는 실시예 95에 기술된 것과 유사한 반응 단계들을 따라 제조하였다.
Figure pct00100
도 93A-C 참조.
[반응식 14]
Figure pct00101
실시예 97 - 아스카로시드 part #9의 합성
아스카로시드 part#9를 반응식 15에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 15]
Figure pct00102
22를 제조하기 위해, 건조 테트라히드로푸란 (0.5 ㎖) 내의 3 (문헌 [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (181.5, 413 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (1 ㎖) 내의 LiOH (8.9 ㎎, 371 μmol) 및 물 (0.2 ㎖)의 혼합물에 첨가하였다. 67℃에서 40분 동안 교반한 후, 용액을 빙초산 몇 방울의 첨가로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 20 (48.5 ㎎, 145 μmol, 35％)이 무색 오일로서 산출되었다. 건조 디클로로메탄 (2 ㎖) 내의 20 (48.5 ㎎, 145 μmol)의 용액을 데스-마틴(Dess-Martin) 페리오디난 (88 ㎎, 208 μmol)으로 처리하였다. 5시간 후, 용액을 10 ㎖ 디클로로메탄으로 희석하고, H2O 내의 5％ Na2S2O3의 용액으로 3회 세정하였다. 유기 층을 Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-30％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 21 (26.8 ㎎, 81 μmol, 56％)이 무색 오일로서 산출되었다. 1:1 디클로로메탄: 메탄올 (0.7 ㎖) 내의 21 (24.5 ㎎, 74 μmol)의 용액을 NaBH4 (12 ㎎, 317 μmol)로 처리하였다. 10분 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 디클로로메탄으로 희석하고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (2S,3R,5S,6R)-6-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-5-히드록시-2-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일 벤조에이트 (22) (18.2 ㎎, 54 μmol, 74％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00103
도 94A-B 참조.
24를 제조하기 위해, 건조 테트라히드로푸란 (0.5 ㎖) 내의 22 (18.2 ㎎, 54 μmol)의 용액을 1,4-디옥산 (1 ㎖) 내의 LiOH (13.5 ㎎, 563 μmol) 및 물 (0.2 ㎖)의 혼합물에 첨가하였다. 67℃에서 3시간 동안 교반한 후, 용액을 빙초산으로 산성화시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 23 (8.5 ㎎, 37 μmol, 67％)이 무색 오일로서 산출되었다. 0℃로 냉각된, DMF (700 ㎕) 내의 23 (8.5 ㎎, 37 μmol)의 용액을 수소화나트륨 (10 ㎎, 미네랄 오일 내의 60％ 현탁액, 250 μmol)으로 처리하였다. 20분 동안 교반한 후, 벤질브로마이드 (15 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 철야로 교반하였다. 과량의 시약을 메탄올 (300 ㎕) 첨가로 파괴시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (2 ㎖)로 희석하고, 유기 상을 물 (3 × 0.5 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-25％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (2R,3S,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-2-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (24) (13 ㎎, 32 μmol, 80％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00104
도 95A-B 참조.
part #9를 제조하기 위해, 디클로로메탄:아세토니트릴:H2O의 1:1:1 혼합물 (v/v/v) (300 ㎕) 내의 24 (5.4 ㎎, 13 μmol)의 용액을 NaIO4 (13 ㎎, 61 μmol)로 처리한 후, H2O (50 ㎕) 내의 RuCl3·H2O (145 ㎍, 0.7 μmol)의 용액으로 처리하였다. 1.75시간 후, 혼합물을 H2O (1 ㎖)로 희석하고, 디클로로메탄 (3 × 1 ㎖)으로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 0.25％ 빙초산을 함유하는 디클로로메탄 내의 0-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 4 (4.6 ㎎, 11 μmol, 81％)가 무색 오일로서 산출되었다. 10％ 포름산을 함유하는 메탄올 500 ㎕ 내의 Pd/C (11 ㎎, 10％, w/w)의 용액을 먼저 아르곤으로 5분 동안, 이어서 중등도 흐름의 H2 기체로 플러싱(flushing)하였다. 이러한 교반 용액에 500 ㎕ 메탄올 내의 4 (4.1 ㎎, 9.3 μmol)의 용액을 첨가하였다. 4.5시간 후, 반응물을 실리카 패드에서 여과하고, 진공에서 농축하였다. HPLC 정제 (실시예 90 참조)로 (R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (part #9) (1.5 ㎎, 6.0 μmol, 65％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00105
= -128.6 (c. 0.15, 메탄올).
part #9에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 13에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD3OD) = 49.00 ppm을 기준으로 한다. 도 96A-D 참조.
Figure pct00106
실시예 98 - D- 파라토실 -4 R - 히드록시펜탄산 (( R )-30)의 합성
part #9의 비-천연 부분입체이성질체인 ( R )-30을 하기 반응식 16에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 16]
Figure pct00107
26을 제조하기 위해, DMF (2 ㎖) 내의 25 (문헌 [Zhao & Liu, J. Org. Chem. 66:6810-15 (2001)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (137 ㎎, 845 μmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, 수소화나트륨 (203 ㎎, 미네랄 오일 내의 60％ 현탁액, 5.1 mmol)으로 처리하였다. 30분 후, 벤질 브로마이드 (630 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 철야로 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각한 후, 과량의 시약을 메탄올 (3 ㎖) 첨가로 파괴시키고, 잔류물을 디에틸 에테르 (5 ㎖)로 희석하고, 유기 상을 물 (3 × 2 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-25％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (2S,3R,5S,6R)-3,5-비스(벤질옥시)-2-메톡시-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (26) (217 ㎎, 634 μmol, 75％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00108
도 97A-B 참조.
( R )-29를 제조하기 위해, 3 M H2SO4 (0.5 ㎖) 및 아세트산 (2 ㎖)의 혼합물 내의 26 (217 ㎎, 634 μmol)의 용액을 100℃에서 2시간 동안 가열하였다. 냉각 후, 반응 혼합물을 진공에서 건조시키고, 여기에 포화 수성 NaHCO3 (5 ㎖)을 첨가하고, 10분 동안 교반하고, 디클로로메탄 (3 × 2 ㎖)으로 추출하였다. 헥산 내의 0-30％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 27 (177 ㎎, 539 μmol, 85％)이 무색 오일로서 산출되었다. 건조 디클로로메탄 (4 ㎖) 내의 27 (177 ㎎, 539 μmol)의 용액을 트리클로로아세토니트릴 (115 ㎕, 1.15 mmol) 및 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (9 ㎕, 60.3 μmol)으로 처리하였다. 30분 후, 반응물을 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 10-20％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 28 (110 ㎎, 233 μmol, 43％)이 무색 오일로서 산출되었다. 건조 디클로로메탄 (2 ㎖) 내의 28 (110 ㎎, 233 μmol)의 용액을 0℃로 냉각하고, (R)-2-헥세놀 (60 ㎕, 500 μmol) 및 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (5 ㎕, 28 μmol)로 처리하였다. 0℃에서 3시간 동안 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3로 반응을 켄칭시키고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-20％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (3R,5S,6R)-3,5-비스(벤질옥시)-2-((R)-헥스-5-엔-2-일옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란 (( R )-29) α-아노머 (40.5 ㎎, 99 μmol, 43％) 및 β-아노머 (35 ㎎, 85 μmol, 37 ％)가 무색 오일로서 산출되었다. ( R )-29 α-아노머에 대해,
Figure pct00109
도 98A-B 참조.
( R )-30을 제조하기 위해, 디클로로메탄:아세토니트릴:H2O의 1:1:1 혼합물 (v/v/v) (360 ㎕) 내의 ( R )-29 α-아노머 (20.3 ㎎, 49 μmol)의 용액을 NaIO4 (43 ㎎, 203 μmol)로 처리한 후, H2O (80 ㎕) 내의 RuCl3·H2O (547 ㎍, 2.6 μmol)의 용액으로 처리하였다. 2.75시간 후, 혼합물을 H2O (1.2 ㎖)로 희석하고, 디클로로메탄 (3 × 1 ㎖)으로 추출하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 0.25％ 빙초산을 함유하는 디클로로메탄 내의 0-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 ( R )-2 (16 ㎎, 37 μmol, 76％)가 무색 오일로서 산출되었다. 10％ 포름산을 함유하는 메탄올 500 ㎕ 내의 Pd/C (20 ㎎, 10％, w/w)의 용액을 먼저 아르곤으로 5분 동안, 이어서 중등도 흐름의 H2 기체로 플러싱하였다. 이러한 교반 용액에 500 ㎕ 메탄올 내의 ( R )-2 (7.0 ㎎, 16.3 μmol)의 용액을 첨가하였다. 1시간 후, 반응물을 실리카 패드에서 여과하고, 진공에서 농축하여, (R)-4-(((2S,3R,5S,6R)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (( R )-30) (4.0 ㎎, 16.1 μmol, 98％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00110
도 99A-B 참조.
실시예 99 - ( S )-4-(((2 S ,3 R ,5 S ,6 R )-3,5-디히드록시-6- 메틸테트라히드로 -2 H -피란-2-일) 옥시 ) 펜탄산 (( S )-30)의 합성
part #9의 거울상이성질체인 ( S )-30을 하기 반응식 17에 제시된 바와 같이 S)-2-헥세놀을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 98에 기술된 것과 유사한 반응 단계들을 따라 제조하였다. ( S )-30의 NMR 분광 특성화는 part #9의 것과 동일하였다.
[반응식 17]
Figure pct00111
실시예 100 - 아스카로시드 npar #1의 합성
아스카로시드 npar #1을 하기 반응식 18에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 18]
Figure pct00112
32를 제조하기 위해, -40℃로 냉각된 건조 디클로로메탄 (1.5 ㎖) 내의 5 (문헌 [Lucero & Woerpel, J. Org. Chem. 71:2641-47 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (550 ㎎, 1.19 mmol)의 용액을 일정하게 교반하면서 트리메틸실릴 브로마이드 (3.2 ㎖, 24.2 mmol)에 적가하였다. 그 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온되게 하고, 45분 동안 교반하였다. 과량의 시약 및 용매를 진공에서 제거하였다. 생성물 ((3R,4S,5R)-3,4,5-트리스(벤질옥시)-2-브로모테트라히드로-2H-피란 (32))을 추가로 특성화하지 않았고, 다음 단계에 직접적으로 사용하였는데, 이는 생성물이 수분과 접촉 시 분해되었기 때문이다.
6을 제조하기 위해, 31 (문헌 [Chheda & Hong, J. Med. Chem. 14:748-53 (1971)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (500 ㎎, 1.12 mmol)을 진공에서 완전히 건조시키고, 12 ㎖ 건조 톨루엔 내의 32의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2.5시간 동안 환류시켰다. 진공에서 톨루엔을 증발시켜 부피를 ~3 ㎖로 감소시키고, 3 ㎖의 페르롤륨 에테르를 여기에 첨가하였다. 생성된 갈색 현탁액을 여과하고, 침전물을 따뜻한 클로로포름 (3 x 10 ㎖)으로 세정하였다. 여과액 및 세정물을 합치고, 10 ㎖ 30％ 수성 KI 용액, 10 ㎖ 물로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 33 (160 ㎎, 262 μmol, 2단계에 걸쳐 22％, ~ 2:3 비의 α 및 β-아노머의 혼합물)이 담황색 오일로서 산출되었다. 33을 L-트레오닌과 반응시키고, 상응하는 2,3,5-트리-O-아세틸리보푸라노시드-유도체 (문헌 [Chheda & Hong, J. Med. Chem. 14:748-53 (1971)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 대해 보고된 조건을 따라 작업하였다. 0.25％ 아세트산을 함유하는 디클로로메탄 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 34 (117 ㎎, 172 μmol, 66％, ~ 2:3 비의 α 및 β-아노머의 혼합물)가 담황색 고체로서 산출되었다. 300 ㎕ 트리플루오로메틸벤젠 내의 34 (72 ㎎, 106 μmol) 및 15 ㎕ 트리에틸아민 (210 μmol)의 혼합물을 2-벤질옥시-1-메틸피리디늄 트리플레이트 (문헌 [Tummatorn et al., J. Org. Chem. 72:8962-64 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (71 ㎎, 210 μmol)으로 처리하고, 83℃에서 15시간 동안 교반하였다. 생성물을 2 ㎖ 에틸 아세테이트와 2 ㎖ 물 사이에 분배시키고, 유기 상을 1 ㎖ 물, 1 ㎖ 염수로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-20％ 이소프로판올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (2S,3R)-벤질 3-히드록시-2-(3-(9-((3R,4S,5R)-3,4,5-트리스(벤질옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)-9H-퓨린-6-일)우레이도)부타노에이트 (6) (8.1 ㎎, 10 μmol, 10％, β-아노머)가 황색 고체로서 산출되었다.
Figure pct00113
도 100A-B 참조.
npar #1을 제조하기 위해, 450 ㎕ 건조 디클로로메탄 내의 4 (4 ㎎, 9 μmol)의 용액을 4-디메틸아미노피리딘 (2.5 ㎎, 20 μmol) 및 EDC 히드로클로라이드 (4 ㎎, 21 μmol)로 처리하였다. 15분 동안 교반한 후, 300 ㎕ 건조 디클로로메탄 내의 6 (7.3 ㎎, 9 μmol)을 혼합물에 첨가하였다. 12시간 동안 교반한 후, 반응물을 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-15％ 이소프로판올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 35 (5.5 ㎎, 4.6 μmol, 51％)가 산출되었다. 10％ 포름산을 함유하는 메탄올 500 ㎕ 내의 Pd/C (7 ㎎, 10％, w/w)의 용액을 먼저 아르곤으로 5분 동안, 이어서 중등도 흐름의 H2 기체로 플러싱하였다. 이러한 교반 용액에, 500 ㎕ 메탄올 내의 35 (5.5 ㎎, 4.6 μmol)의 용액을 첨가하였다. 4시간 후, 반응물을 실리카 패드에서 여과하고, 진공에서 농축하였다. HPLC 정제 (실시예 90 참조)로 (2S,3R)-3-(((R)-4-(((2R,3S,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-2-(3-(9-((2R,3R,4S,5R)-3,4,5-트리히드록시테트라히드로-2H-피란-2-일)-9H-퓨린-6-일)우레이도)부탄산 (npar #1) (1.1 ㎎, 1.7 μmol, 37％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00114
= -14.5 (c. 0.11, 메탄올).
npar #1에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 14에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD3OD) = 49.00 ppm을 기준으로 한다. 도 101A-E 참조.
Figure pct00115
실시예 101 - (2 S ,3 R )-3-((( S )-4-(((2 S ,3 R ,5 S ,6 R )-3,5-디히드록시-6- 메틸테트라히 드로-2 H -피란-2-일) 옥시 ) 펜타노일 ) 옥시 )-2-(3-(9-((2 R ,3 R ,4 S ,5 R )-3,4,5- 트리히드록시테트라히드로 -2 H -피란-2-일)-9 H -퓨린-6-일) 우레이도 )부탄산 (36)의 합성
36을 하기 반응식 19에 제시된 바와 같이 ( S )-2를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 100에 npar #1에 대해 기술된 것과 유사한 반응 단계들을 따라 제조하였다.
Figure pct00116
도 102A-C 참조.
[반응식 19]
Figure pct00117
실시예 102 - 아스카로시드 dasc #1의 합성
아스카로시드 dasc #1을 하기 반응식 20에 제시된 바와 같이 제조하였다.
[반응식 20]
Figure pct00118
dasc #1을 제조하기 위해, 15 ㎖ 건조 DMF 내의 ascr #1 (15 ㎎, 54 μmol)의 용액을 7 ㎖ 건조 DMF 내의 4-디메틸아미노피리딘 (13.5 ㎎, 110.7 μmol) 및 EDC 히드로클로라이드 (11 ㎎, 57.3 μmol)의 용액에 첨가하였다. 반응을 ESI- MS로 모니터링하고, 중합체 피크 (m/z = 791 등)가 유의한 양으로 관찰되었을 때 빙초산 몇 방울로 켄칭시키고 진공에서 농축하였다. 0.25％를 함유하는 디클로로메탄 내의 0-30％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피 및 미정제 생성물 혼합물의 추가적인 HPLC 정제 (실시예 90 참조)로 (R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-6-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헵타노일)옥시)-3-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헵탄산 (dasc #1) (1.1 ㎎, 2.1 μmol, 7.8 ％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00119
= -115.0 (c. 0.11, 메탄올).
dasc #1에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 15에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD3OD) = 49.00 ppm을 기준으로 한다. 도 103A-D 참조.
Figure pct00120
실시예 103 - 아스카로시드 ubas #1의 합성
아스카로시드 ubas #1을 하기 반응식 21에 제시된 바와 같이 제조하였다..
[반응식 21]
Figure pct00121
38을 제조하기 위해, 300 ㎕ 트리플루오로메틸 벤젠 내의 ascr #9 (문헌 [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (24.0 ㎎, 97 μmol) 및 28 ㎕ 트리에틸아민 (200 μmol)의 혼합물을 70 ㎎ 2-벤질옥시-1-메틸피리디늄 트리플레이트 (문헌 [Tummatorn et al., J. Org. Chem. 72:8962-64 (2007)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (200 μmol)로 처리하고, 83℃에서 18시간 동안 교반하였다. 생성물을 2 ㎖ 에틸아세테이트와 2 ㎖ 물 사이에 분배시키고, 유기 상을 1 ㎖ 물, 1 ㎖ 포화 수성 NaCl 용액으로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-10％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (R)-벤질 4-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (38) (22.6 ㎎, 66.8 μmol, 69％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00122
도 104A-B 참조.
8을 제조하기 위해, 2 ㎖ 디클로로메탄 내의 38 (22.6 ㎎, 66.8 μmol) 및 3-아지도-(2R)-메틸프로판산 (문헌 [Rej et al., J. Org. Chem. 61:6289-95 (1996)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (37, 8.6 ㎎, 66.8 μmol)의 용액을 4-디메틸아미노피리딘 (16.3 ㎎, 133.6 μmol) 및 EDC 히드로클로라이드 (25.7 ㎎, 133.6 μmol)로 처리하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 5％ 수성 아세트산 (100 ㎕) 첨가로 반응을 켄칭시키고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-10％ 이소프로판올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 (R)-벤질 4-(((2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-아지도-2-메틸프로파노일)옥시)-3-히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (8) (5.2 ㎎, 11.6 μmol, 17％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00123
도 105 참조.
10을 제조하기 위해, 메탄올 및 톨루엔의 1:1 혼합물 (v/v) (2 ㎖) 내의 oscr#9 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817-24 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (17.6 ㎎, 71 μmol)의 용액을 디에틸 에테르 내의 2.0 M (트리메틸실릴)디아조메탄 용액 (200 ㎕)으로 처리하였다. 30분 동안 교반한 후, 아세트산 첨가로 과량의 시약을 파괴시키고, 용액을 진공에서 농축하였다. 잔류물을 DMF (500 ㎕)에 용해시키고, 0℃로 냉각하고, 수소화나트륨 (17 ㎎, 미네랄 오일 내의 60％ 현탁액, 425 μmol)으로 처리하였다. 10분 후, 벤질 브로마이드 (51 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 철야로 교반하였다. 메탄올 (300 ㎕) 첨가로 과량의 시약을 파괴시키고, 잔류물을 에틸 아세테이트 (2 ㎖)로 희석하고, 유기 상을물 (3 × 1 ㎖)로 세정하고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-40％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 39 (14.4 ㎎, 33 μmol, 2단계에 걸쳐 46％)가 무색 오일로서 산출되었다. THF (1 ㎖) 내의 39 (14.4 ㎎, 33 μmol)의 용액을 67℃의 디옥산 (2 ㎖) 내의 3.3 M 수성 수산화리튬 용액 (100 ㎕, 330 μmol)으로 처리하였다. 3시간 후, 아세트산 첨가로 반응을 켄칭시키고, 진공에서 농축하였다. 디클로로메탄 내의 0-20％ 메탄올의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (10) (11.8 ㎎, 28 μmol, 85％)이 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00124
도 106A-B 참조.
40을 제조하기 위해, 1 ㎖ 디클로로메탄 내의 8 (5.2 ㎎, 11.6 μmol) 및 10 (6.4 ㎎, 14.9 μmol)의 용액을 4-디메틸아미노피리딘 (3.7 ㎎, 30 μmol) 및 EDC 히드로클로라이드 (5.8 ㎎, 30 μmol)로 처리하였다. 실온에서 12시간 동안 교반한 후, 5％ 수성 아세트산 (50 ㎕) 첨가로 반응을 켄칭시키고, Na2SO4에서 건조시키고, 진공에서 농축하였다. 헥산 내의 0-50％ 에틸 아세테이트의 구배를 사용하는 실리카 상에서의 플래시 칼럼 크로마토그래피로 2R,3R,5R,6S)-5-(((R)-3-아지도-2-메틸프로파노일)옥시)-2-(((R)-5-(벤질옥시)-5-옥소펜탄-2-일)옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-3-일 5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-비스(벤질옥시)-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노에이트 (40) (9.6 ㎎, 11.2 μmol, 97％)가 무색 오일로서 산출되었다.
Figure pct00125
도 107A-B 참조.
ubas #1을 제조하기 위해, 5％ 1 M 수성 HCl을 함유하는 메탄올 0.7 ㎖ 내의 Pd/C (5.4 ㎎, 10％, w/w)의 용액을 아르곤 기체로 5분 동안, 이어서 중등도 흐름의 H2 기체로 5분 동안 플러싱하였다. 이러한 교반 용액에, 1.3 ㎖ 메탄올 내의 40 (4.3 ㎎, 5.0 μmol)의 용액을 주사기를 통해 첨가하였고, 반응 전반에 걸쳐 H2 기체를 계속 유동시켰다. 직접 주입 ESI- MS로 반응을 모니터링하였다. 20분 후, 반응물을 추가적인 메탄올로 실리카 패드에서 여과하였다. 생성물을 진공에서 농축하고, 40 및 41의 미정제 혼합물 (3.7 ㎎)을 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용하였다. 수성 HCl (200 ㎕, 50 μmol), 수성 KCNO (200 ㎕, 50 μmol) 및 H2O (100 ㎕)의 용액을 제조하였다. 이러한 수성 HCl/KCNO 용액을 40 및 41의 미정제 혼합물 (3.7 ㎎)에 첨가하고, 75℃ 오일 배스(oil bath) 내에 5분 동안 놓았다. 추가적인 수성 HCl 용액 (50 ㎕, 12.5 μmol)을 반응에 첨가하고, 이를 추가로 2.5분 동안 교반하였다. 반응 혼합물의 pH를 주기적으로 점검하여 pH가 염기성이 아닌 것을 확실하게 하였다. 직접 주입 ESI- MS로 반응을 모니터링하였다. 혼합물을 진공에서 농축하였고, HPLC 정제 (실시예 90 참조)로 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-((5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜타노일)옥시)-6-메틸-5-(((R)-2-메틸-3-우레이도프로파노일)옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (ubas #1) (200 ㎍, 0.3 μmol, 2단계에 걸쳐 7％)이 무색 오일로서 산출되었다.
ubas #1에 대한 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), 및 HMBC NMR 분광 데이터가 메탄올-d 4 를 사용하여 수득되었고, 하기 표 16에서 제시된다. 화학적 이동은 (CD2 HOD) = 3.31 ppm 및 (CD3OD) = 49.00 ppm을 기준으로 한다. 도 108A-D 참조.
Figure pct00126
실시예 104 - ubas #2 강화
미정제 피. 파시피쿠스 외부-대사체 추출물의 HPLC 강화 후에 (R)-4-(((2R,3R,5R,6S)-3-(((R)-5-(((2R,3R,5R,6S)-3,5-디히드록시-6-메틸테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)헥사노일)옥시)-6-메틸-5-(((R)-2-메틸-3-우레이도프로파노일)옥시)테트라히드로-2H-피란-2-일)옥시)펜탄산 (ubas #2)의 강화 샘플이 수득되었다.
Figure pct00127
도 109 참조.
Figure pct00128
실시예 85-104의 논의
소형 분자들이 광범위한 필수적인 생물학적 기능을 수행한다 (문헌 [Meinwald, J. Nat. Prod. 74:305-09 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이들은 상호-특이적 및 내부-특이적 화학 통신을 용이하게 하고, 화학적 방어 및 포식에 사용되며, 동물 및 식물에서 호르몬 및 제2 메신저로서의 기능을 하고, 생물학적 거대 분자에 대한 건축 블록으로서의 역할을 한다. 게놈에서 매우 다양한 "2차" 소형-분자 생합성 경로가 밝혀진 대부분의 미생물 및 식물 군과 대조적으로 (문헌 [Walsh, Acc. Chem. Res. 41:4-10 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 대부분의 후생동물은 구조적으로 복잡한 소형 분자를 생성시키기 위한 전용 생합성 기구가 있는 것으로 공지되어 있지 않다. 이에 상응하여, 동물 원천으로부터 단리된 대부분의 일반적이지 않은 대사산물은 식이-유래인 것으로 나타났다. 예외로는 기부(basal) 동물 (예를 들어, 해면) 및 절지동물로부터 단리된 화합물이 포함되지만, 이들 중 일부 또한 미생물에서 기원할 수 있다 (문헌 [Piel, Nat. Prod. Rep. 26:338-62 (2009)]; [Dossey, Nat. Prod. Rep. 27:1737-57 (2010)]; [Gronquist & Schroeder, 2 COMPREHENSIVE NATURAL PRODUCTS II-CHEMISTRY 및 BIOLOGY 67-108 (Bradley S. Moore & Phillip Crews eds., 2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 모델 생물인 씨. 엘레간스에서의 연구는 이러한 선충이 소형 분자 신호인 아스카로시드 패밀리, 예를 들어 ascr#1-ascr#3, 및 hbas#3을 생산한다는 것을 나타냈고 (도 110A), 이는 유충 발달, 짝짓기 및 군거성 거동이 포함되는 씨. 엘레간스 생활사의 다중 측면을 제어한다 (문헌 [Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008)]; [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)]; [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)]; [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817-24 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 씨. 엘레간스 신호전달 분자의 구조는 디데옥시당 아스카릴로스와 다양한 지질- 및 아미노산-대사 유래 모이어티의 조합으로부터 유래되고, 이는 이러한 선충, 및 아마도 기타 동물이 아직 인식되지 않은 생합성 능력을 보유한다는 것을 시사한다.
선충 대사체의 광범위한 2D NMR-분광 스크린의 일부로서, 네크로메닉(necromenic)한 회충(roundworm)인 프리스티온쿠스 파시피쿠스의 외부-대사체 (모든 분비 및 배출된 대사산물 전체)를 분석하였다. 씨. 엘레간스와 유사하게, 피. 파시피쿠스는 발달 및 진화 생물학의 연구를 위한 모델 생물로서 확립된 자유-생활 선충이다 (문헌 [Hong & Sommer, Bioessays 28:651-59 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 피. 파시피쿠스는 딱정벌레와 네크로메닉한 회합을 형성을 형성하고, 이는 진정 기생(true parasitism)의 진화에 대한 전-적응(pre-adaptation)을 나타낼 수 있다 (문헌 [Rae et al., J. Exp. Biol. 211:1927-36 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 피. 파시피쿠스는 야생에서의 이의 생존에 중요한 2가지 유형의 표현형 유연성을 나타낸다. 다수의 기타 선충 종에서와 같이, 가혹한 환경 조건, 예를 들어 먹이 부족은 고도로 스트레스-저항성인 별법적인 유충 단계인 다우어 벌레로서의 발달 정지를 촉발한다 (문헌 [Weller et al., J. Parasitol. 96:525-31 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 피. 파시피쿠스는 성체 후생동물에서의 형태학의 표현형 유연성에 대한 예를 대표하는, 입 발달에서 독특한 이형성을 추가로 나타낸다 (도 110B). 성체 벌레는 좁은 입 구멍 ("협구성") 또는 넓고 더욱 복잡한 ("광구성") 입 구멍을 지닐 수 있고, 후자는 먹이 이용가능성이 낮은 조건에 반응하여 발달된다. 2가지 상이한 입 형태는 상이한 급식 습성과 연관된다: 협구성 벌레는 주로 박테리아를 먹이로 하는 것으로 고려되는 반면, 광구성 형태는 다른 선충을 향한 포식성 거동에 적합하다. 기존의 연구는 다우어 형성 및 입 이형성 양쪽 모두가 집단 밀도에 의해 조절된다는 것을 나타냈고, 이는 표현형 유연성의 이러한 2가지 예가 생물간(inter-organismal) 소형 분자 신호전달에 의해 구동된다는 것을 시사한다 (도 110B) (문헌 [Bento et al., Nature 466:494-97 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)).
다우어-유도 활성이 있는 피. 파시피쿠스 외부-대사체 분획의 2D NMR-기반 대사체학에서 1차 대사산물, 예를 들어 크실로스, 트레오닌, 아데노신, 짧은 사슬 지방산, 숙시네이트, 페닐에탄올아민 및 여러 디데옥시 당 유도체를 시사하는 인상적으로 다양한 신호가 밝혀졌다 (도 110C); 그러나, 이들의 NMR 데이터는 이러한 모이어티 대부분이 더 큰 어셈블리의 일부분이라는 것을 가리켰다. 디데옥시당 유도체는 2가지 화학적으로 상이한 하위군으로 나뉘었다. 1개의 군은 선충이 광범위하게 생산하는 당인 아스카릴로스를 기초로 한 반면 (문헌 [Choe et al., Curr. Biol. 22:772-80 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 제2 화합물 군은 기존에 박테리아로부터만 보고된, 관련된 당인 파라토스를 포함하는 것으로 나타났다 (도 110C). 최근 씨. 엘레간스로부터 확인된 ~150개의 아스카로시드 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817-24 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 중 임의의 것의 존재에 대해 HPLC-MS/MS에 의해 피. 파시피쿠스 외부-대사체를 분석하여, 기존에 보고된 바와 같이 ascr#1, ascr#9, 및 ascr#12가 검출되었다 (도 111A) (문헌 [Choe et al., Curr. Biol. 22:772-80 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 이러한 3개의 화합물은 2D NMR 분광법에 의해 검출된 구조 중 작은 부분만 차지하였다.
NMR 및 고해상도 HPLC-MS/MS 분석으로부터의 결과를 조합하여 (도 111A, 112, 및 113), 일부 경우에는 미량 성분의 함량을 증가시키기 위한 추가적인 분획화 후에, 피. 파시피쿠스 외부-대사체의 주요 미지 성분에 대한 구조가 제안되었다 (도 111B). pasc#9로 명명된 가장 풍부한 아스카로시드 유도체는 4-히드록시펜탄산 사슬을 통해 아스카릴로스에 연결된 N-숙시닐 1-페닐에탄올아미드로서 제안되었다 (도 111B). 이러한 화합물에 2개의 이량체성 아스카로시드 유도체가 동반되었고, 이는 1개의 ascr#1-단위가 다른 ascr#1 단위의 탄소 4에 부착되어 있는 공지된 ascr#1의 이량체 (dasc#1), 및 (ω)-산소화 아스카로시드 oscr#9가 위치 2에서 부착되어 있는 ascr#9로 이루어지는 제2 이량체 (ubas#1)였다 (도 111B). 이러한 제2 이량체 ubas#1은 탄소 4에 부착된 3-우레이도 이소부티레이트 모이어티를 추가로 보유한다. 이량체성 아스카로시드 또는 우레이도 이소부티레이트-치환 대사산물은 기존에 천연에서 보고된 것으로 보이지 않는다.
이러한 아스카로시드에 아스카릴로스 대신 파라토스를 포함하는 2개의 풍부한 대사산물인 npar#1 및 part#9가 동반되었다 (도 111B). npar#1에서, 파라토스 모이어티가 짧은 지질 측쇄에 연결되었고, 이는 차례로 트레오닌에 연결되었다. 이러한 아미노산이 추가로 카르바모일 기를 통해 뉴클레오시드 아데노신의 유도체에 연결되었다 (도 111B). 놀랍게도, 이러한 아데노신은 DNA, RNA, 및 공지된 뉴클레오시드-기반 신호전달 분자에서와 같은 리보푸라노스 또는 데옥시리보푸라노스가 아니라 크실로피라노스를 포함하는 것으로 발견되었다. 동반되는 part#9는 npar#1의 파라토스 및 측쇄 부분을 나타낸다 (도 111B).
이러한 구조적 할당을 확증하기 위해, 입체화학을 결정하기 위해, 그리고 생물학적 기능을 탐구하기 위해, 제안된 구조에 대한 합성이 이들의 모듈형 성질의 장점을 취하여 개발되었다 (도 111C, 실시예 95-104 참조). 합성 및 천연 샘플의 NMR 스펙트럼의 비교로 천연 pasc#9 내의 N-숙시닐 1-페닐에탄올아미드 모이어티의 형상이 R로 확립되었다 (도 114). 유사하게, NMR 분광 데이터 및 HPLC 체류 시간의 비교는 이량체성 아스카로시드 dasc#1 및 ubas#1의 입체화학을 지정하는 것을 가능하게 하였다 (도 115 및 116). ubas#1 내의 3-우레이도 이소부티레이트 모이어티의 R-형상은 이의 티민 대사로부터 기원 가능성에 부합한다 (문헌 [van Kuilenburg et al., Biochem. J. 379:119-24 (2004)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 최근, 파라토시드 part#9 및 일반적이지 않은 크실로아데노신 유도체 npar#1의 샘플이 합성되었다. 천연 part#9 및 여러 합성 part#9 부분입체이성질체의 HPLC-체류 시간을 비교하여, 천연 part#9가 D-파라토실-4S-히드록시펜탄산 또는 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산이어야 한다는 것이 발견되었다 (도 117). L-파라토스는 천연에서 발견된 적이 없었던 반면, 기존에 박테리아로부터 기술된 적이 있는 D-파라토스를 part#9 및 npar#1이 함유한 것으로 초기에 가정되었다. 또한, D-파라토스는 L-아스카릴로스 생합성에서의 추정 중간체이고 (문헌 [Thorson et al., J. Bacteriol. 176:5483-93 (1994)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 선충에서의 모든 아스카로시드가 이를 기초로 한다. 그러나, D-파라토실-4S-히드록시펜탄산이 포함되는 합성 npar#1 부분입체이성질체의 HPLC 체류 시간 및 NMR 스펙트럼은 천연 npar#1에 대해 수득된 데이터와 매치되지 않았다 (도 118A). 따라서, npar#1이 L-파라토실-4R-히드록시펜탄산을 기초로 하여야 하는 것으로 결론지어졌고, 이는 이러한 부분입체이성질체의 합성 및 이의 분광 데이터와 천연 npar#1의 것의 비교를 통해 확증되었다 (도 118B-C). 당 L-파라토스는 기존에 천연에서 발견되지 않았다; 그러나, 선충에서의 이의 출현이 위치 2에서의 L-아스카릴로스의 에피머화로부터 초래될 수 있었다.
다음으로, 당, 아미노산, 지질, 및 뉴클레오시드-유래 건축 블록의 확인된 조합이 특이적인지 여부를 질문하였다. 이를 다루기 위해, 전체 피. 파시피쿠스 외부-대사체를 고해상도 HPLC-MS/MS로 주의 깊게 재분석하고, 이미 확인된 구조에서의 1차 대사-유래 건축 블록의 상동성 또는 별법적 조합에 대해 스크리닝하였다. pasc#9에 6- 및 7-탄소 측쇄를 포함하는 미량의 2개의 동족체가 동반되는 것으로 발견되었고, 이는 NMR 분광법에 의해 또한 검출되었다 (도 119). 또한, 소량의 ubas#1의 동족체 (도 113의 ubas#2), 뿐만 아니라 MS 데이터가 크실로스의 상실을 가리킨 npar#1의 유도체 (도 113의 npar#2)가 검출되었다. 중요하게, 확인된 화합물의 비-효소적 발생을 시사할 건축 블록의 비-특이적이거나 또는 겉보기에 무작위인 조합이 관찰되지 않았다. 이러한 결과들은 확인된 화합물의 모듈형 어셈블리가 고도로 특이적이라는 것을 나타낸다. 확인된 화합물이 박테리아 대사산물인 가능성을 배제하기 위해, 피. 파시피쿠스에 대한 먹이로서 사용된 이. 콜라이 OP50 박테리아의 대사체를 또한 분석하였다. 확인된 화합물 중 어느 것도 박테리아 대사체에 존재하는 것으로 발견되지 않았다 (도 120). 또한, 확인된 화합물 모두가 이. 콜라이 대신 슈도모나스(Pseudomonas) 종이 공급된 피. 파시피쿠스 배양물에서 검출되었다.
그 후, 확인된 화합물의 합성 샘플을 피. 파시피쿠스 다우어 및 입-형태 이형성 검정법에서의 이의 활성에 대해 테스트하였다. 씨. 엘레간스 외부-대사체 샘플이 피. 파시피쿠스 입 형태 이형성 및 다우어 검정법에서 활성이지 않다는 것을 나타낸 기존의 연구로부터 예상된 바와 같이 (문헌 [Ogawa et al., Curr. Biol. 19:67-71 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 씨. 엘레간스가 풍부하게 배출하는 화합물인 ascr#1 (문헌 [Jeong et al., Nature 433:541-45 (2005)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))이 매우 높은 농도에서도 피. 파시피쿠스에서의 다우어-유도 활성이 없었음이 발견되었다 (도 121). 대조적으로, 뉴클레오시드 유도체 npar#1은 다우어 형성을 강하게 유도하였고, 분획화되지 않은 외부-대사체의 보고된 다우어-유도 활성의 대부분을 차지하는 것으로 보인다 (문헌 [Mayer & Sommer, Proc. Biol. Sci. 278:2784-90 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 122A 및 122C). 추가적으로, part#9로의 더 약한 다우어 유도가 관찰된 반면, 테스트된 모든 다른 화합물은 이러한 검정법에서 불활성이었다. 마우스 이형성 검정법에서 합성 화합물을 테스트하여, 다우어 형성 검정법에서 불활성인 이량체성 화합물 dasc#1이 광구성 입 형태를 강하게 유도한 것으로 발견되었다 (도 122B 및 122D). 또한, 광구성 입 형태의 더 약한 유도가 높은 농도의 pasc#9, ascr#1, 및 npar#1에 대해 관찰된 반면, 이량체성 ubas#1, 뿐만 아니라 단량체성 ascr#9 및 part#9는 불활성이었다.
이러한 결과들은 피. 파시피쿠스에서의 성체 표현형 유연성 및 유충 발달이 신호전달 분자들의 별개이지만 부분적으로 중첩되는 세트에 의해 제어된다는 것을 나타낸다. 입-형태 이형성은 고도로 특이적인 아스카로시드 이량체화의 생성물인 dasc#1에 의해 주로 조절되는 반면, 다우어 형성은 파라토시드가 일반적이지 않은 뉴클레오시드와 조합된 분자에 의해 제어된다. 기존의 연구는 피. 파시피쿠스에서의 표현형 유연성을 제어하는 신호전달 분자가 DAF-16/FOXO 및 핵 호르몬 수용체 DAF-12가 포함되는 진화적으로 보존된 전사 인자의 상류에서 작용하고 (도 122E) (문헌 [Ogawa et al., Development 138:1281-84 (2011)]; [Sommer & Ogawa, Curr. Biol. 21:R758-R66 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이에 의해 daf -12는 다우어 유도 및 입-형태 이형성 양쪽 모두에 요구되는 반면, daf -16은 다우어 유도에는 요구되지만 입-형태 이형성의 조절에는 없어도 된다는 것을 나타냈다 (문헌 [Ogawa et al., Development 138:1281-84 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 따라서, 다우어 형성 및 입-형태 이형성을 조절하는 소형 분자들의 상이한 하위 세트가 상이한 하류 이펙터를 표적으로 하는 것으로 보인다. ascr#1이 씨. 엘레간스에서 다우어에 기여하는 반면, 이의 이량체인 dasc#1이 피. 파시피쿠스에서 성체 형태학을 조절하는 바와 같이, 본 실시예들은 상이한 유형의 표현형 유연성을 조절하기 위한 소형 분자 생합성 경로의 종-특이적 코-옵션(co-option)을 추가로 실연한다. 최근에 GPCR이 씨. 엘레간스 다우어 페로몬의 수용체로서 확인된 것을 기초로 (문헌 [McGrath et al., Nature 477:321-25 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 피. 파시피쿠스에서의 특이적 GPCR이 npar#1, dasc#1을 이들 각각의 하류 경로와 연결하는 것이 가능하다.
확인된 소형-분자 신호의 구조는 주요 1차 대사 경로로부터의 특이적 입력들을 통합하는 것으로 보인다: 지방산, 탄수화물, 아미노산, 및 뉴클레오시드 대사 (도 122E). 이러한 경로들로부터의 건축 블록의 모듈형 어셈블리로 다양한 분자 구조가 생성되고, 이는 일반적이지 않은 뉴클레오시드 변형에 의해 임의의 기존에 공지된 동물 대사산물로부터 추가로 구별되어, 크실로피라노스-기반 아데노신을 초래한다. 이러한 전례없는 뉴클레오시드는 tRNA의 부분집합의 안티코돈 삼중자에 직접적으로 인접하여 발견되는 고도로 보존된 뉴클레오시드인 정규 (리보)-트레오닐카르바모일 아데노신 (t6A)의 대사로부터 유래될 것이다 (문헌 [Deutsch et al., J. Biol. Chem. 287:13666-73 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). t6A는 번역 정확도를 유지하는데 중요한 역할을 한다; 그러나, 이는 일반적으로 tRNA의 매우 적은 분획만을 차지하고, 피. 파시피쿠스에서의 다량의 크실로피라노스 유도체의 생산은 놀랍다.
본 실시예들은 보존된 내분비 신호전달 경로에 의존하는 후생동물에서의 성체 표현형 유연성의 소형-분자 제어에 대한 직접적인 증거를 제공한다. 확인된 신호전달 분자들의 생합성 또한 보존된 경로를 수반하는지 또는 피. 파시피쿠스 (및 아마도 기타 선충)에 특이적인 전용 효소에 의존하는지 여부는 공지되어 있지 않다. 그러나, 피. 파시피쿠스 화합물이 변형된 1차 대사산물의 어셈블리로부터 유래된다는 발견은 이들의 생합성이 보존된 생화학 경로를 널리 기초로 한다는 것을 시사한다 (도 122E). 특히, 피. 파시피쿠스 게놈은 1차 대사 효소를 코딩하는 유전자 중에서 다수의 특이적인 유전자 중복 이벤트가 있는 25,000개를 초과하는 유전자 예측물을 함유한다 (문헌 [Dieterich et al., Nat. Genet. 40:1193-98 (2008)]; [Borchert et al., Genome Res. 20:837-46 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 선충 신호전달 분자의 생합성에서의 1차 대사의 수반을 지지하여, 최근의 씨. 엘레간스에서의 아스카로시드 생체발생의 연구는 지질-유사 아스카로시드 측쇄가 보존된 과산화소체-β-산화로부터 유래된다는 것을 나타냈다 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817-24 (2012)]; [Butcher et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:1875-79 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 고급 동물에서의 공지된 신호전달 분자 및 보조인자, 예를 들어 S-아데노실 메티오닌 또는 포스파티딜이노시톨은 1개 또는 2개의 상이한 1차 대사 경로로부터 유래된 건축 블록의 조합에 종종 의존한다. 본 실시예는 후생동물이 구조가 훨씬 더 복잡한 신호전달 분자들을 생산하는데 이같은 전략을 확장할 수 있다는 것을 실연하여, 포유동물이 포함되는 고급 동물로부터의 대사체의 상세한 분광 재분석이 신규 유형의 모듈형 소형 분자 신호를 또한 드러낼 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 105 - 씨. 엘레간스 균주 및 일반적인 배양 방법
야생형 씨. 엘레간스 (N2, 브리스톨), daf -22(m130), daf -22( ok693 ), acox -1(ok2257), maoc -1 ( hj13 ), 및 dhs -28 ( hj8 ) 돌연변이체 균주를 카에노랍디티스 제네틱스 센터(Caenorhabditis Genetics Center) (CGC)로부터 수득하였다. 균주들을 먹이로서의 박테리아 (이. 콜라이 OP50)가 있는 NGM 플레이트 상에서 20℃에서 유지시켰다.
실시예 106 - 씨. 엘레간스 대사산물 추출물의 제조
액체 배양물을 문헌 [Pungaliya et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:7708 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)에 보고된 바와 같이 성장시켰다. 간략하게, 야생형 또는 daf -22 돌연변이체 벌레를 OP50이 시딩된 NGM 플레이트에서 2세대 동안 성장시켰다. 3개의 밀집된 6 cm NGM 플레이트를 500 ㎖ 삼각 플라스크 내의 S-배지의 100 ㎖ 용액 내로 세정하고, 22℃ 및 220 pm에서 성장시켰다. 철야로 성장된 1 L 박테리아 배양물로부터의 농축된 OP50을 제1일 및 제3일에 제공하였다. 제5일에, 액체 배양물을 2개의 500 ㎖ 삼각 플라스크 내로 분할하고, 성장 배지 부피를 100 ㎖에서 유지시켰다. 분할 시 추가적인 1 L OP50 펠릿을 먹이로서 제공하였다. 제7일에 4750 rpm에서의 원심분리에 의해 배양물을 수확하였다. 상청액을 동결건조시키고, 잔류물을 실온에서 12시간 동안 95％ 에탄올 (300 ㎖)로 추출하였다. 생성된 현탁액을 여과하고, 진공에서 실온에서 농축하여 미정제 추출물이 산출되었다. 이러한 방식으로, 야생형 (N2), daf -22(m130), 및 daf -22(ok693) 배양물의 각각 4개의 추출물을 제조하였다. NAE 정량을 위해, 돌연변이체 균주를 이중으로 상기와 같이 성장시켰다. 2.5 μM의 ascr#3 및 2.5 μM의 ascr#9를 제0일에 첨가하여 아스카로시드 혼합물 실험에 대한 액체 배양물을 상기 기술된 바와 같이 제조하였다.
NMR-분광 분석을 준비하기 위해, 미정제 추출물을 1:8 메탄올 (MeOH):디클로로메탄 (DCM)에 현탁시켰고, 이때 미정제 추출물 1 g 당 7.5 ㎖의 이러한 용매 혼합물을 사용하였다. 원심분리 후, 각각의 샘플의 상청액의 2 ㎖ 분취량을 1 g의 실리카 (EMD 케미컬스 인크.(EMD Chemicals Inc.))에서 여과하였고, 이때 용출을 위해 10 ㎖의 1:8 MeOH:DCM을 사용하였다. 분석 전에 여액을 진공에서 건조 상태로 증발시켰다. NMR 분광 분석을 위해, 10-20 ㎎의 생성된 대사산물 추출물을 사용하였다.
실시예 107 - 박테리아 대사산물 추출물의 제조
37℃ 및 220 rpm에서 이. 콜라이 OP50을 2 L의 용원성 브로스(Lysogeny broth) (LB)내에서 철야로 OD 1.2로 성장시켰다. 박테리아 브로스를 20분 동안 4750 rpm에서 회전시켰다. 그 후, 상청액을 동결건조시키고, 모르타르 및 막자로 분쇄하고, 150 ㎖ 95％ 에탄올 (2회)로 추출하였다. 추출물을 소결 도가니로 여과하고, 분석 전에 진공에서 농축하였다.
실시예 108 - 질량 분광측정 분석
상기 기술된 바와 같이 제조된 대사산물을 1.5 ㎖ 메탄올에 재현탁시키고, 원심분리하고, 30 ㎕의 이러한 샘플을 분석을 위해 HPLC-MS 내로 주입하였다. 10:1 분할을 사용하여 쿼트로 II 질량 분광계에 연결된 애질런트의 이클립스 XDB-C18 칼럼 (9.4 × 250 mm, 5 ㎛ 입자 직경)이 장착된 애질런트의 1100 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 HPLC-MS 분석을 수행하였다. 짧은 사슬 아스카로시드의 경우에는, 0.1％ 수성 아세트산-아세토니트릴 구배가 사용되었다. 5분 동안 5％ 아세토니트릴로 구배가 시작된 후, 32분에 걸쳐 100％ 아세토니트릴로 증가되었다. 긴 사슬 아스카로시드의 경우에는, 아세토니트릴 - 이소프로판올 구배가 사용되었고, 이때 5분 동안 아세토니트릴 내의 5％ 이소프로판올로 시작된 후, 32분에 걸쳐 이소프로판올이 75％로 증가되었다. 3.5 kV의 모세관 전압 및 각각 -40 V 및 +20 V의 콘 전압을 사용하여, 음이온 및 양이온 모드의 HPLC-ESI-MS로 샘플을 분석하였다. 제보 G2 QTof를 사용하여 고해상도 MS 및 HPLC-MS에 의해 긴 사슬 아스카로시드의 원소 조성을 수행하였다.
짧은 사슬 아스카로시드에 대해 상기 기술된 바와 같은 물 (0.1％ 아세트산) - 아세토니트릴 구배를 사용하여 HPLC-MS (쿼트로 II를 사용함)에 의해 EPEA 및 AEA (14)를 정량하였다. 신뢰할 수 있는 표준물질 (각각 엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences) 및 케이만 케미컬스(Cayman Chemicals))의 주입에 의해 EPEA 및 AEA의 체류 시간이 확립되었다. 야생형 및 돌연변이체 균주 내의 상대적인 엔도카나비노이드 함량을 (M-H)- 또는 (M+Cl)-에 대한 상응하는 이온 트레이스들로부터의 LC-MS 신호의 적분에 의해 정량하였다. 모든 적분 값을 액체 배양물 펠릿의 질량에 의해 표준화하였다. 도 123에서 보고된 모든 정량적 데이터는 2회 이상의 독립적인 생물학적 반복으로부터의 것이었다.
실시예 109 - NMR 분광측정 분석
0.6 ㎖의 CD3OD 내에 대사산물 추출물 (실시예 107 참조)의 10-20 ㎎ 몫을 용해시킴으로써 NMR 샘플을 제조하였다. 배리안 INOVA 600 MHz NMR 분광계를 사용하여 샘플을 분석하였다. 하기의 파라미터를 사용하여 비-구배 상-사이클 dqfCOSY 스펙트럼을 취득하였다: 0.8 s 취득 시간, 600 복합 증분, 16회의 스캔/증분. mvaDANS로 프로세싱하기 위해, 스펙트럼을 2048 × 1024 데이터 포인트로 제로-필하고, 사인-제곱 모양의 윈도우 함수를 푸리에 변환 전에 양쪽 차원에 적용하고, MATLAB으로 전달하기 전에 규모 모드로 스펙트럼을 전환시켰다.
상-민감성 모드에서의 상세한 분석을 위해, dqfCOSY 스펙트럼을 8192 × 4096 데이터 포인트로 제로-필하고, 코사인 종 모양의 윈도우 함수를 푸리에 변환 전에 양쪽 차원에 적용하였다. 8-32회의 스캔, 0.25 s 취득 시간, 및 256-500 복합 증분을 사용하여 daf -22-상향조절 대사산물의 정제된 분획의 구배 및 비-구배 HSQCAD 및 HMBC 스펙트럼을 취득하였다. 브루커 탑스핀(Bruker TopSpin), 배리안 VNMR, 메스트레랩스의 메스트렉, 및 MNova 소프트웨어 패키지를 사용하여 NMR 스펙트럼을 프로세싱하였다.
실시예 110 - 주요 daf -22 -상향조절 대사산물의 단리
8 g의 셀라이트(Celite) (에틸 아세테이트로 예비 세정됨)에 16개의 100 ㎖ 액체 배양물로부터의 daf -22 대사산물 추출물의 용액을 첨가하였다. 용매 증발 후, 물질을 빈 25 g 레디셉® Rf 로딩 카트리지 내로 건식-로딩하였다. 정상 디클로로메탄 - 메탄올 용매 시스템을 사용하여 레디셉® Rf 골드(GOLD) 40 g HP 실리카 칼럼에서 텔레다인 ISCO 콤비플래시® 시스템을 사용하여 분획화를 수행하였고, 이때 6분의 100％ 디클로로메탄로 시작하였고, 24분의 10％까지의 메탄올 함량의 선형 증가가 이어졌고, 40분의 40％까지 메탄올 함량의 또다른 선형 증가가 이어졌으며, 45분의 95％까지의 메탄올 함량의 또 다른 선형 증가가 이어진 후, 이러한 함량이 48분까지 계속되었다. 이에 의해 70개의 분획 (각각 ~20 ㎖)이 산출되었고, 이를 개별적으로 진공에서 증발시키고, NMR 분광법 (1H NMR, dqfCOSY) 및 HPLC-MS에 의해 분석하였다. daf -22-상향조절 대사산물을 나타내는 것으로 mvaDANS를 통해 확인된 1H NMR-분광 신호가 분획 35-45에서 검출되었다. 긴 사슬 아스카로시드의 HPLC-MS 분석에 대해 실시예 90에서 기술된 것과 동일한 HPLC 방법을 사용하여 분취용 HPLC에 의해 주요 daf -22-상향조절 대사산물의 단리가 달성되었다. 단리된 분획들을 dqfCOSY, HSQC, 및 HMBC, 뿐만 아니라 제보 G2 QTof를 사용하는 고해상도 HPLC-MS에 의해 추가로 특성화하였다.
실시예 111 - 통계 분석
야생형 및 돌연변이체 균주에서의 EPEA 및 AEA의 상대 풍부도를 비교하기 위한 독립형 스튜던트 t-테스트 + 웰치 보정을 사용하였다. * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001. 도 123D 및 도 124 참조.
실시예 112 - mvaDANS 분석
mvaDANS를 통한 daf -22-상향조절 대사산물의 확인을 위해, 2가지 상이한 daf-22 대립유전자 (m130, ok693) 및 야생형 씨. 엘레간스로부터 수득된 대사체 추출물에 대해 dqfCOSY 스펙트럼을 취득하였다 (도 125, 126, 및 127). 4개의 독립적인 생물학적 복제물으로부터의 dqfCOSY 스펙트럼을 매트랩 내의 mvaDANS 알고리즘을 사용하여 규모 모드로 프로세싱하였고, 이는 동적 비닝 및 다변량 패턴 인식 분석을 혼입시켰다 (도 128). 자동 크로스피크 확인 및 비닝으로 각각의 dqfCOSY 스펙트럼이 크로스피크 적분 세트로 전환되었고, 이를 희석에 대해 확률적 지수 표준화(Probabilistic Quotient Normalization) (문헌 [Dieterle et al., Anal. Chem. 78:4281 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))를 사용하여 보정하고, 평균 중심점을 구하고, 단위 분산으로 척도화하였다. 그 후, 빈 적분의 이러한 행렬을 이원 계층 클러스터링, 주성분 분석 (PCA) (도 125A) (문헌 [Wold et al., Chemometr. Intell. Lab. Syst. 2:37 (1987)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 및 부분 최소 제곱 - 판별 분석 (PLS-DA) (도 129) (문헌 [de Jong, Chemometr. Intell. Lab. Syst. 18:251 (1993)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))이 포함되는 통계 분석에 적용하였다. 3개의 씨. 엘레간스 균주에서 차별적으로 발현된 화합물을 나타내는 NMR 분광 신호의 검출을 가능하게 하도록 PCA 로딩으로부터의 계수 및 PLS-DA 예언물을 dqfCOSY 스펙트럼 상으로 역-투영하였다 (도 130 및 131).
mvaDANS 를 위한 자동 크로스피크 확인 및 적분
스펙트럼 스택(stack)의 3차원을 따라 평균으로부터 계산된 평균 스펙트럼인 본원에서의 대표적인 슈도-스펙트럼으로부터 스펙트럼 분절을 검출하였다. 크로스피크 영역에 상응하는 슈도-스펙트럼의 분절을 확인하기 위해, AUTOPSY (문헌 [Koradi, J. Magnetic Res. 135:288 (1998)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 방법 (수학식 1-4)을 사용하여 국소적인 노이즈(noise) 표면이 계산된다. AUTOPSY는 하기와 같이 기저 노이즈의 포인트 방식 추정을 계산한다.
[수학식 1]
Figure pct00129
[수학식 2]
Figure pct00130
[수학식 3]
Figure pct00131
[수학식 4]
Figure pct00132
여기서, d x 및 d y는 2D NMR 스펙트럼의 직접적인 차원 및 간접적인 차원에서의 각각의 슬라이스 x 및 y에 대한 노이즈 값이다. 소정의 슬라이스 δ x 또는 δ y에 대한 노이즈 값은 슬라이스를 직접적인 차원에 대해서는 n=F1/16, 간접적인 차원에 대해서는 n=F2/16의 크기의 16개 이하의 영역으로 분할함으로써 계산된다. 그러면, 이러한 트레이스에 대한 노이즈는 수학식 1 및 2에서 제시된 바와 같은 최소 표준 편차의 영역의 표준 편차이다. 노이즈 값이 d x 및 d y인 2개의 슬라이스 x 및 y가 스펙트럼 내의 각각의 포인트 p에서 교차한다. 포인트 p xy에서의 노이즈는 수학식 3 및 4에서와 같이 기저 노이즈 값 b로 슬라이스 x에서의 노이즈를 슬라이스 y에서의 노이즈와 조합한다. 노이즈를 계산하는 이러한 방법은 수직 노이즈 예컨대 T1 및 물 노이즈를 특징으로 하는 2D NMR 데이터의 노이즈 구조에 매우 적합하다.
노이즈 표면 p xy가 계산되었으면, 노이즈 표면의 특정 배수를 초과하는 국소적인 최대값을 확인하는 것에 의해 피크를 검출할 수 있다. 정확한 역치는 변할 수 있는 한편, 5-10의 값으로 대다수의 크로스피크가 검출된다. 역치 10이 본원에서 사용된 고농도 씨. 엘레간스 샘플에 대해 사용되었다. 그 후, 검출된 피크에 인접한 영역으로서 분절들이 정의된다.
동종핵 스펙트럼의 1H 차원에서의 피크의 0.04 ppm 이내의 영역으로서 초기 스펙트럼 분절이 확인된다. 다수인 경우에, 국소적인 최대값이 단일 초기 분절로 함께 그룹화된다. 그 후, 각각의 분절을 독특한 정수 값으로 표지하고, 반복된 최소 및 최대 필터링으로 이러한 초기 분절이 확장된다. 최소/최대 필터링은 또 다른 스펙트럼 분절을 만날 때까지 또는 1H에 대해 약 0.2 ppm의 최대 주파수 범위에 도달할 때까지 분절을 성장시키는 효과가 있다. 이러한 절차로 인접한 공명에 의해 경계지워지지만 크로스피크 선 형상의 근접 크로핑(close cropping)은 피하는 비-사각형 경계의 스펙트럼 분절이 생성된다. 그 후, 이러한 분절들을 사다리꼴 수치 적분을 사용하여 적분한다.
스펙트럼 빈을 사용한 패턴 인식
검출된 스펙트럼 분절의 적분은 2D NMR 데이터세트를 완전 해상도의 2D 스펙트럼의 3차원 스택 (ω1, ω2,N)으로부터 특징의 2차원 행렬 (N,P) [식 중, P는 검출된 분절의 개수이다]로 변환시킨다. 그 후, 빈 강도의 생성된 행렬을 확률적 지수 표준화 (문헌 [Dieterle et al., Anal. Chem. 78:4281 (2006)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))를 사용하여 표준화하고, 단변량 척도법을 사용하여 분산을 안정화시켰다. 종종 열-방식 및 행-방식 표준화로 지칭되는 이러한 접근법은 샘플들 간의 희석 또는 스펙트럼들 사이의 리시버 획득 차이를 설명하기 위해, 그리고 높은 강도 및 낮은 강도 신호의 분산을 균형맞추기 위해 대사체 데이터 프로세싱에서 빈번하게 적용된다. 그 후, 패턴 인식 방법 PCA 및 PLS-DA를 변환된 빈 행렬에 직접적으로 적용하였다. 패턴 인식의 결과는, 모델 내의 각각의 성분에 대해, 서로에 대한 샘플의 유사성을 나타내는 N 점수 및 샘플들 간의 분리에 대한 각각의 빈의 기여를 가리키는 P 계수 (로딩 또는 예측물로 지칭됨)의 벡터의 세트이다.
피크 적분의 행렬이 중앙값 열지도에 대한 log2-배수 변화로서 또한 표현되었다. UPGMA 계층 클러스터링 알고리즘 (문헌 [Gordon, J. Royal Stat. Soc. Ser. A Stat. Soc. 150:119 (1987)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))을 사용하여 열지도가 클러스터링되었다. 빈 행렬을 클러스터링된 열지도로 나타내는 것은 이의 차별적인 수준이 실험 클래스를 구별짓는 크로스피크들의 군의 신속한 확인을 허용한다. 추가적으로, PLS-DA 예측물 및 PCA 로딩을 크로스피크 영역의 클러스터링된 지수를 사용하여 순서화하였다. 이러한 표시는 패턴 인식에 의해 확인된 데이터의 특색을 나타낸다.
모델을 해석하고 중요한 대사산물을 확인하기 위해, 스펙트럼 분절을 사용함으로써 전체 해상도 스펙트럼 상에 계수를 역투영한다. 전체 해상도 행렬에 대한 모든 절편에 대해, 절편 내의 데이터 포인트가 이러한 절편으로부터 추출된 빈의 패턴 인식으로부터의 계수 값으로 교체되어, 전체 해상도 로딩 행렬이 생산된다. 안정화된 데이터를 위해, 로딩 계수는 신호 강도에 독립적이고, 따라서 피크 형상이 가시적이지 않다. 2D NMR 스펙트럼처럼 보이는 전체 해상도 역투영 로딩을 생산하기 위해, 이러한 행렬을 2D NMR 스택의 3차원을 따라 표준 편차와 포인트-방식으로 곱한다. 로딩을 가시화하기 위해, 역투영된 로딩에 의해 컨투어 선이 정의되고, 계수 자체에 의해 이러한 선의 색상이 정의된다. 국소적인 최소/최대의 수를 감소시키도록 규모 모드로 프로세싱된 dqfCOSY 데이터에 mvaDANS 알고리즘이 적용된 한편, mvaDANS에 의해 확인된 관심 영역이 더 큰 구조적 상세사항을 위해 원래의 상-민감성 데이터와 교차-참조되었다. mvaDANS는 TOCSY, COSY, 및 NOESY가 포함되는 다른 1H-1H NMR 실험과 태생적으로 상용성이고, 파라미터에서의 약간만의 변화로 1H-13C HSQC가 포함되는 이종핵 실험에 대해 상용성이다.
평가 및 스펙트럼 해석
daf -22 특이적 크로스피크의 분석을 위해, 역투영 이온 스펙트럼을 상-민감성 모드로 프로세싱된 원래의 daf -22 dqfCOSY 스펙트럼에 오버레이하였다. 화학적 이동 및 커플링 상수 값이 포함되는 스핀 시스템이 원래의 상-민감성 스펙트럼의 수동 해석을 통해 수득되었다. 입수가능한 데이터베이스 (Reaxys, Beilstein, Scifinder, HMDB, NMRshiftDB, BMRB)를 사용하여, 확인된 스핀 시스템을 나타내는 부분적인 구조에 관한 가설이 개발되었다. HMQC 및 HMBC를 통한 추가적인 NMR-분광 분석을 위한 확인된 대사산물의 강화된 샘플을 생성시키기 위해 daf -22 외부-대사체의 부분적인 분획화가 사용되었다 (실시예 110 참조).
PCA 분석으로부터의 역투영을 사용하여 daf -22 특이적 크로스피크를 확인하였다. PLS-DA 분석을 사용하여 야생형 및 daf -22 대사체의 통계를 기초로 하는 분리를 확인하였다 (도 129). PLS-DA 예측물로부터의 역투영 (도 131)이 PC 1 로딩으로부터의 역투영 (도 130)과 대부분 매치된다. 이. 콜라이 OP-50 대사산물 추출물의 dqfCOSY 스펙트럼 내에 우세하게 존재하는 피크 (도 132)는 추가적인 분석으로부터 배제하였다.
실시예 113 - daf -22 돌연변이체-특이적인 매우 긴 사슬의 아스카로시드
daf -22 돌연변이체-특이적 VLCA인 24R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-2-메틸-3-옥소펜타코산산 에탄올아미드 (7), (26R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-3-옥소-헵타코산산 에탄올아미드 (8), 24R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-2-메틸-2E-펜타코센산 에탄올아미드 (9), 24R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-2-메틸-2E-펜타코센산 (10), 및 (24R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-2-메틸-펜타코산산 (11) (도 123B 참조)이 실시예 105-112에 기술된 방법을 사용하여 확인되었다. 이들의 구조 및 분광 데이터가 하기 표 17에서 제시된다.
Figure pct00133
Figure pct00134
실시예 114 - daf -22 돌연변이체-특이적인 매우 긴 사슬의 아스카로시드 (ω-1)- O -아스카로실 2-케톤 (12)
(23R)-(3'R,5'R-디히드록시-6'S-메틸-(2H)-테트라히드로피란-2'-일옥시)-테트라코산-2-온 (12a)이 포함되는 daf -22 돌연변이체-특이적 VLCA (ω-1)-O-아스카로실 2-케톤 시리즈 (12) (도 123C 참조)가 실시예 105-112에 기술된 방법을 사용하여 확인되었다. 12a의 구조 및 분광 데이터가 하기 표 18에서 제시된다.
Figure pct00135
이러한 VLCA (ω-1)-O-아스카로실 2-케톤 시리즈 (12)의 구조 및 HPLC/HR-MS (ESI+) 데이터가 하기 표 19에서 제시된다.
Figure pct00136
실시예 105-114의 논의
씨. 엘레간스 대사체의 분석에서 구조적으로 다양한 소형 분자인 아스카로시드의 패밀리가 보존된 과산화소체 β-산화의 생성물로서 밝혀졌다 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817 (2012)]; [Butcher et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:1875 (2009)]; [Pungaliya et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:7708 (2009)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 133 및 134 참조). 아스카로시드는 지질, 탄수화물 및 아미노산 대사로부터의 건축 블록을 씨. 엘레간스 생물학의 핵심 측면들을 조절하는 소형 분자 신호로 통합하는 모듈형 화합물 라이브러리를 형성한다 (문헌 [Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420 (2007)]; [Srinivasan et al., Nature 454:1115 (2008)]; [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)]; [Macosko et al., Nature 458:1171 (2009)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)). 기존의 연구는 질량 분광법을 기초로 하는 비교 대사체학을 사용하여 아스카로시드 생합성에서의 3가지 효소인 아실-CoA 옥시다제 ACOX-1, 에노일-CoA 히드라타제 MAOC-1, 및 3-히드록시아실-CoA 데히드로게나제 DHS-28의 기능을 특성화하였다 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (도 134 참조). 그러나, 포유동물 3-케토-아실-CoA 티올라제의 밀접한 상동체인 유전자 daf -22가 코딩하는 과산화소체 β-산화 케스케이드 내의 네 번째 효소의 예상 역할이 확증될 수 없었는데, 이는 특징적인 측로 대사산물이 발견되지 않았기 때문이다. 제안된 과산화소체 β-산화 경로에서의 daf -22의 중추적인 역할을 고려하여, 아직 확인되지 않은 다른 대사산물이 daf -22 돌연변이체에서 축적되는 것으로 가설되었고, 이는 이러한 효소의 생화학적 기능을 확증하는 것을 도울 수 있다.
따라서, 편향되지 않은 NMR 분광법을 기초로 하는 대사체학을 사용하여 daf -22 대사체를 다시 연구하였다. 기존에, 야생형 및 daf -22 대사체의 2D NMR 스펙트럼의 수동 비교가 아스카로시드 신호전달 분자 패밀리의 추가적인 구성원을 확인하는데 사용되었다 (문헌 [Pungaliya et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:7708 (2009)]; [Srinivasan et al., PLoS Biol. 10:e1001237 (2012)]; [Robinette et al., Acc. Chem. Res. 45:288 (2012)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 연구는 비교 대사체학에 대한 2D NMR 스펙트럼의 유용성을 강조하였지만, 여러 돌연변이체들로부터의 일련의 스펙트럼의 통계 분석을 가능하게 할 전산 툴(tool)에 대한 요구를 또한 나타냈다. 이러한 목적을 위해, 2D NMR 스펙트럼 세트의 자동 프로세싱 및 비교 전산 분석을 가능하게 하는 2D NMR 분광학에 의한 다변량 시차 분석(multivariate Differential Analysis by 2D NMR Spectroscopy) (mvaDANS)이 개발되었다.
mvaDANS는 동적 신호 검출 및 패턴 인식을 혼입시킴으로써 대사체 분석을 위해 2D NMR을 사용하는 기존의 시도를 발판으로 한다 (문헌 [Hedenstrom et al., Mol. Plant 2:933 (2009)]; [Hedenstrom et al., Chemometr. Intell. Lab. 92:110 (2008)]; [Robinette et al., Anal. Chem. 83:1649 (2011)]; [Robinette et al., Anal. Chem. 80:3606 (2008)]; [Zhang et al., Anal. Chem. 79:7748 (2007)]; [Zhang & Bruschweiler, Angew. Chem. Int. Ed. 46:2639 (2007)]; [Zhang et al., Anal. Chem. 80:7549 (2008)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)) (실시예 112 참조). 도 125는 daf -22 돌연변이체에서 상향조절되고 따라서 측로 대사산물 또는 생합성 중간체를 나타낼 수 있는 화합물을 확인하기 위해 이러한 접근법을 사용하는 것을 요약한다. 4개의 독립적인 생물학적 복제물이 포함되는, 2가지 상이한 daf-22 대립유전자 (m130, ok693) 및 야생형 씨. 엘레간스로부터 수득된 대사체 추출물에 대해 dqfCOSY 스펙트럼을 취득하였다 (도 125, 126, 및 127). 자동 크로스피크 확인 및 비닝 (도 128)으로 주성분 분석 ("PCA")을 통한 통계 분석을 위한 dqfCOSY 스펙트럼이 제조되었고 (문헌 [Wold et al., Chemometr. Intell. Lab. 2:37 (1987)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) (실시예 112 참조), 이는 데이터를 유전자형에 의해 클러스터링하였다 (도 125A). PCA 로딩으로부터의 계수를 dqfCOSY 스펙트럼에 역투영하였고, 이는 야생형에 비해 daf -22 돌연변이체에서 상향- 또는 하향-조절된 다수의 크로스피크를 드러냈다 (도 125A, 130, 및 135).
이러한 연구에 대해, 양쪽 daf -22 대립유전자로부터의 스펙트럼에서 강하게 특징을 이루었지만 야생형에서는 매우 약하거나 검출가능하지 않은 크로스피크로 분석을 제한하였다. 또한, 이. 콜라이 먹이원 내에 또한 존재하는 크로스피크를 배제하였다. 나머지의 daf -22에서 강하게 상향조절된 크로스피크 및 상응하는 HMBC 스펙트럼으로부터의 입력물의 수동 분석은 메틸 케톤, α-메틸 분지 지방산 및 상응하는 에탄올아미드, 뿐만 아니라 β-케토 지방산 유도체 (도 125B)가 포함되는 일련의 부분적인 구조들을 시사하였다. 아스카로시드 생합성에서의 daf -22의 제안된 역할을 고려하여 (도 134), 이러한 구조적 특색이 축적된 측로 대사산물에 속하는 것으로 가정되었다. daf -22-특이적 NMR 신호에 의해 안내되는 daf -22 대사체의 후속 분획화로 6개의 상이한 매우 긴 사슬의 아스카로시드(very long-chain ascaroside) (VLCA)가 단리되었고, 이들은 예측된 구조적 특색 모두를 설명한다 (도 123; 전체 분광 데이터에 대해 실시예 113-114 참조). (ω-1)-O-아스카로실 2-케톤 시리즈 (12), 뿐만 아니라 (ω-1)-O-아스카로실 3-케토 지방산 에탄올아미드 (2-메틸 펜타코산산 유도체 7 및 직쇄 헵타코산산 유도체 8이 포함됨)가 가장 우세하였다. 화합물 7 및 8에 더 적은 양의 상응하는 비스-노르호몰로그(bis-norhomologue)가 동반된다. 유사하게, 2-메틸 펜타코스-2-엔산 에탄올아미드 9 및 2개의 지방산 10 및 11에 비스-노르호몰로그가 동반된다. 대조적으로, (ω-1)-O-아스카로실 2-케톤 (12)의 사슬 길이는 더욱 광범위하게 변하고, 우선적으로 홀수이지 않다 (도 123C). HPLC-MS 분석에서, 야생형 샘플 내의 이러한 성분의 부재가 확증되었다 (도 123A).
daf -22 특이적 VLCA 내의 에탄올아민의 혼입이 뜻밖이었고, 과산화소체 β-산화와 에탄올아미드-기반 신호전달 경로 사이의 상호작용의 가능성을 시사하였다. 최근, N-아실-에탄올아민 (NAE)이 씨. 엘레간스에서의 엔도카나비노이드-유사 신호전달 분자로서 확인되었고, 식이 제한-의존적 수명 조절에 연결되었다 (문헌 [Lucanic et al., Nature 473:226 (2010)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). daf-22 돌연변이체에서의 VLCA의 상향조절이 NAE 수준에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 가장 활성인 엔도카나비노이드, 에이코사펜타에노일 에탄올아미드 (13, EPEA), 및 아라키도노일 에탄올아미드 (AEA)가 포함되는 NAE 생산이 양쪽 daf-22 대립유전자에서 극적으로 하향조절되었음이 발견되었고 (도 123D 및 124), 이는 NAE에서 VLCA로의 에탄올아민 활용의 이동을 시사한다. 유사하게, 크게 감소된 EPEA 및 AEA 생산이 maoc -1 및 dhs -28의 돌연변이체에서 발견되었고 (도 123D 및 124), 이들은 daf -22의 상류에서 직접적으로 작용한다 (도 134). acox -1 돌연변이체 벌레에서의 EPEA-수준은 유의하게 영향을 받지 않았고, AEA 수준은 약간만 감소하였으며, 이는 과산화소체 β-산화에서의 acox -1 돌연변이의 훨씬 더 약한 효과에 상응한다 (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 합성 아스카로시드를 첨가하여 daf -22 벌레를 성장시키는 것에 의해 EPEA 및 AEA 생산이 구조되지 않았고 (도 123D 및 124), 이는 과산화소체 β-산화 돌연변이체에서의 관찰된 NAE 수준 감소가 아스카로시드 페로몬 결여의 간접적인 효과가 아니라는 것을 시사한다. 이러한 발견은 씨. 엘레간스에서, 과산화소체 β-산화에서의 특이적인 결함이 엔도카나비노이드 풀의 고갈을 초래한다는 것을 가리킨다 (도 123E). 건강한 동물에서 과산화소체 β-산화 유전자의 발현을 감소시키는 조건이 지방 대사 및 아스카로시드 신호전달을 식이 제한 경로로 속박하는 조절 메커니즘으로서의 역할을 할 수 있는 엔도카나비노이드의 하향-조절을 촉발하는지 여부는 공지되어 있지 않다. 짧은 사슬 아스카로시드의 에탄올아미드는 기생 선충 종에서 페로몬으로서의 역할을 하고 (문헌 [Noguez et al., ACS Chem. Biol. 7:961 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 이는 과산화소체 β-산화와 에탄올아미드 대사의 상호작용이 다른 선총 속에 또한 존재한다는 것을 시사한다.
daf -22의 포유동물 상동체는 분지쇄 지방산 예컨대 파이탄산의 사슬 단축에 특이적으로 요구되는 것으로 생각된다 (문헌 [Wanders & Waterham, Annu. Rev. Biochem. 75:295 (2006)]; [Wanders, Mol. Genet. Metab. 83:16 (2004)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, daf -22 돌연변이체-특이적 VLCA에서의 직쇄 및 메틸-분지형 유도체의 공동-출현은 daf -22가 분지형 및 직쇄 지방산 양쪽 모두의 프로세싱에서 수반된다는 것을 시사한다. daf -22 돌연변이체-특이적 VLCA의 사슬 길이는 23- 내지 27-탄소 지방산이 최종 사슬 확장 단계에서 말로네이트 또는 메틸말로네이트가 혼입되는 씨. 엘레간스 지방산 생체발생의 종점을 나타낼 수 있다는 것을 가리킨다. 명백하게, 본 발명의 대사체 분석은 이러한 지방산 유도체의 생합성의 더 이전 단계에서의 메틸말로네이트의 혼입에 대한 증거를 제공하지 않았다. daf -22-돌연변이체에서 상향조절된 씨. 엘레간스 내의 VLCA의 사슬 길이는 과산화소체 β-산화에서의 결합을 수반하는 인간 장애 예컨대 젤베거(Zellweger) 증후군에서 축적되는 매우 긴 사슬의 지방산의 것과 유사하다 (문헌 [Wanders & Waterham, Annu. Rev. Biochem. 75:295 (2006)]; [Wanders, Mol. Genet. Metab. 83:16 (2004)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)). 그러나, 인간 지방산 생합성은 α-메틸-분지형 변이체를 형성하는 최종 사슬 확장 단계에서 프로피오네이트 또는 메틸말로네이트를 선택적으로 혼입시키는 것으로 공지되어 있지 않다.
생합성 모델에서 (도 134 및 123E), 확인된 daf -22 돌연변이체-특이적 화합물이 지방산 및 β-케토-산 CoA 에스테르로부터 유래된 측로 대사산물을 가능하게 나타내고, 이때 α,β-불포화 및 β-케토 관능기는 ACOX-1, MAOC-1, 및 DHS-28의 상류 작용으로부터 초래된다. daf -22-상향조절 긴 사슬 메틸 케톤은 탈카르복실화 경향이 높은 상응하는 β-케토 지방산으로부터 유래될 수 있다. 이전의 연구에서 기술되었지만 (문헌 [Butcher et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 106:1875 (2009)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)), 현재의 대사산물 추출물 내의 β-케토 지방산에 대한 증거가 NMR 분광법 또는 HPLC-MS에 의해 발견되지 않았다. daf -22-상향조절 아스카로실-지방산의 홀수 측쇄 길이는 과산화소체 β-산화의 공지된 최종 생성물인 짧은 사슬 아스카로시드 페로몬의 구조에 부합하고, 이들 대부분은 탄소 3, 5, 7, 또는 9개의 측쇄를 포함한다 (도 133) (문헌 [von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134:1817 (2012)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)). 이러한 홀수 측쇄는 아스카로시드 측쇄 생합성이 3-탄소 (메틸말로네이트) 주형으로 시작한다는 것 또는 씨. 엘레간스가 먹이로부터 수득된 홀수 지방산을 신장시킨다는 것을 추가로 시사한다.
결론적으로, daf -22 및 야생형 대사체의 mvaDANS-기반 비교에서 긴 사슬 아스카로실에탄올아미드가 daf -22 돌연변이체 벌레에서의 뜻밖의 측로 대사산물 클래스로서 밝혀졌다. 확인된 긴 사슬 아스카로시드 중 β-케토 유도체 및 메틸 케톤이 풍부한 것은 daf -22가 포유동물 과산화소체 티올라제에 대한 상동성을 기초로 추측된 바와 같이 아스카로시드 페로몬 생합성에서 티올라제로서 작용한다는 것을 시사한다.
미표적 비교 대사체학은 후생동물 생화학을 재조사하기 위한 중요한 도구를 형성할 것이다. mvaDANS는 자동 크로스피크 확인 및 통합을 도입하는 것에 의해 2D NMR-기반 대사체 분석 (문헌 [Wishart, Brief. Bioinform. 8(5):279-93 (2007)]; [Nicholson et al., Nature Rev. Drug Discov. 1:153 (2002)]; [Gartland et al., Mol. Pharmacol. 39:629 (1991)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)의 범주를 확장시킨다. 패턴 인식 기술이 기존에 2D NMR 스펙트럼에 적용된 적이 있지만, 이러한 접근법은 수동 피크 선별 (문헌 [Van et al., J. Proteome Res. 7:630 (2008)] (본원에 전문이 참고로 포함됨)) 또는 파라미터 접근법 (문헌 [Chylla et al., Anal. Chem. 83:4871 (2011)] (본원에 전문이 참고로 포함됨))에 의존하였거나, 또는 스펙트럼 언폴딩(unfolding)/리폴딩(refolding) 기술을 사용하였다 (문헌 [Robinette et al., Anal. Chem. 83:1649 (2011)]; [Hedenstrom et al., Chemometr. Intell. Lab. 92:110 (2008)] (각각 본원에 전문이 참고로 포함됨)). 통계적 분광법에서의 발전으로 생물 기원의 소형 분자의 구조 및 기능 특성화가 계속 가속화될 것으로 예상된다.
바람직한 실시양태가 본원에서 상세하게 묘사 및 설명되었지만, 다양한 변형, 부가, 치환 등이 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있고, 따라서 이들이 하기의 청구항에서 정의된 바와 같은 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다는 것이 관련 업계의 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (50)

  1. 하기 화학식 I의 단리된 화합물이고:
    [화학식 I]
    Figure pct00137

    [식 중,
    R1은 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R1'은 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R2는 하기 화학식의 모이어티이고:
    Figure pct00138

    {식 중
    각각의 R1은 독립적으로 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이고
    (여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    《여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다》>;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    n1, n2, 및 n3은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이고;
    n1, 각각의 n2, 및 각각의 n3의 합계는 1 내지 30이다};
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R5에 연결되는 결합이고
    {여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다)};
    각각의 R5는 독립적으로 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이다
    {여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다)}];
    하기 조건 (i) 내지 (vi) 중 하나 이상이 충족되며:
    (i) R1이 독립적으로 -C(R')3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이며, 각각의 R'은 독립적으로 할로겐 또는 알케닐이고;
    R1'이 독립적으로 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐임;
    (ii) R2가
    Figure pct00139
    이고,
    여기서
    각각의
    Figure pct00140
    은 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고;
    q1, q2, 및 q3은 각각 독립적으로 1 내지 26의 정수이고;
    q4 및 q5는 각각 독립적으로 0 내지 26의 정수이고;
    q1, q2, q3, q4, 및 q5의 합계는 28 이하이며;
    q4 및 q5의 합계는 2 이상임;
    (iii) R5가 H, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 또는 뉴클레오시드임;
    (iv) R5가 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이어서, 2개 이상의 화학식 I 단위를 함유하는 화합물을 형성함;
    (v) R3 및 R4가 각각 독립적으로 -CR6R7R8, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 -(CO)R8이고, 여기서 R8이 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이며, 이때 알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드가 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환됨;
    (vi) 화합물이 하기 화학식 I"의 화합물임
    [화학식 I"]
    Figure pct00141
    ;
    단,
    Figure pct00142
    이 아닌 화합물.
  2. 제1항에 있어서, R1이 독립적으로 -C(R')3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고, 각각의 R'은 독립적으로 할로겐 또는 알케닐이고; R1'이 독립적으로 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R1이 알케닐이고, R1'이 부재하거나 H인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R2가
    Figure pct00143
    이고, 여기서 각각의
    Figure pct00144
    은 독립적으로 단일 또는 이중 결합이고; q1, q2, 및 q3은 각각 독립적으로 1 내지 26의 정수이고; q4 및 q5는 각각 독립적으로 0 내지 26의 정수이고; q1, q2, q3, q4, 및 q5의 합계는 28 이하이며; q4 및 q5의 합계는 2 이상인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, 하기 화학식 ID의 화합물인 화합물.
    [화학식 ID]
    Figure pct00145
  6. 제4항에 있어서, 하기 화학식 ID'의 화합물인 화합물.
    [화학식 ID']
    Figure pct00146
  7. 제6항에 있어서,
    Figure pct00147
    인 화합물.
  8. 제1항에 있어서, R5가 H, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 또는 뉴클레오시드인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, R5가 -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NR6R7 또는 -CR6R7C(O)NHR8인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, R5가 -OCHR6R7인 화합물.
  11. 제9항에 있어서, R6 및 R7이 각각 독립적으로 알킬 또는 아릴이고, 이때 알킬 또는 아릴이 -OR8, -C(O)R8, 및 -NHC(O)R8로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 것인 화합물.
  12. 제8항에 있어서, R8이 H, -OH, -NH2, 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘이고, 이때 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘이 -COOH 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 것인 화합물.
  13. 제8항에 있어서, R5가
    Figure pct00148
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  14. 제8항에 있어서, 하기 화학식의 화합물인 화합물.
    Figure pct00149

    [식 중, m1은 1 내지 3의 정수이다]
  15. 제8항에 있어서, 하기 화학식의 화합물인 화합물.
    Figure pct00150

    [식 중, RI는 -NH3 또는 H이고, m2는 20 내지 22의 정수이다]
  16. 제1항에 있어서, R5가 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이어서, 2개 이상의 화학식 I 단위를 함유하는 화합물을 형성하는 것인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, 각각의 R1이 독립적으로 H 또는 알킬인 화합물.
  18. 제16항에 있어서, 하기 화학식 IE, IE', IF, 또는 IF'의 화합물인 화합물.
    [화학식 IE]
    Figure pct00151

    [화학식 IF]
    Figure pct00152

    [화학식 IE']
    Figure pct00153

    [화학식 IF']
    Figure pct00154

    [식 중,
    R2a 및 R2b는 각각 독립적으로 하기 화학식의 모이어티이고:
    Figure pct00155

    각각의 R3 및 R4는 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고;
    R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이다]
  19. 제18항에 있어서, 화학식 IE 또는 IE'의 화합물인 화합물.
  20. 제18항에 있어서, 화학식 IF 또는 IF'의 화합물인 화합물.
  21. 제18항에 있어서, 각각의 R1이 독립적으로 H 또는 알킬인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, R1이 -CH3인 화합물.
  23. 제18항에 있어서, R2a 및 R2b 중 하나가 -(CH2)nC(O)-인 화합물.
  24. 제18항에 있어서, R2a 및 R2b가 양쪽 모두 -(CH2)nC(O)-인 화합물.
  25. 　제18항에 있어서, R3이 H인 화합물.
  26. 　제18항에 있어서, 각각의 R4가 독립적으로 H 또는 -C(O)R8인 화합물.
  27. 제26항에 있어서, R8이 -NHC(O)R9로 임의 치환된 알킬인 화합물.
  28. 제27항에 있어서, R9가 H 또는 -NH2인 화합물.
  29. 제18항에 있어서,
    Figure pct00156
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  30. 제1항에 있어서, R3 및 R4가 각각 독립적으로 -CR6R7R8, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 또는 -(CO)R8이고, 여기서 R8이 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이며, 이때 알킬, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드가 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 것인 화합물.
  31. 제30항에 있어서, R3 및 R4가 각각 -C(O)R8인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, R8이 -NHC(O)NH2 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 치환된 알킬인 화합물.
  33. 제32항에 있어서, R8이 헥소스로 치환된 알킬인 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 헥소스가 글리코실인 화합물.
  35. 제30항에 있어서, R8이 -[CH2]n4NHC(O)R9 또는 -[CH2]n4C(O)(NH)R9인 화합물.
  36. 제35항에 있어서, R9가 -OH, 페닐, 페놀, 및 카르복시페닐로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 알킬 또는 아릴인 화합물.
  37. 제30항에 있어서, R3 및 R4 중 적어도 하나가
    Figure pct00157
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  38. 제1항에 있어서, 화학식 I"의 화합물인 화합물.
  39. 제38항에 있어서, 하기 화학식 I"a의 화합물인 화합물.
    [화학식 I"a]
    Figure pct00158
  40. 제38항에 있어서, R1이 H 또는 알킬이고; R1'이 부재하거나 H인 화합물.
  41. 제40항에 있어서, R1이 -CH3인 화합물.
  42. 제38항에 있어서, R2가 -(CH2)nC(O)R5인 화합물.
  43. 제38항에 있어서, R3이 H인 화합물.
  44. 제38항에 있어서, R4가 H인 화합물.
  45. 제38항에 있어서, R5가 -OH 또는 -OCHR6R7인 화합물.
  46. 제45항에 있어서, R6 및 R7이 각각 독립적으로 알킬 또는 아릴이고, 이때 알킬 또는 아릴이 -OR8, -C(O)R8, 및 -NHC(O)R8로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 것인 화합물.
  47. 제45항에 있어서, R8이 존재하고, H, -OH, -NH2, 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘이며, 이때 알킬, 퓨린, 또는 피리미딘이 -COOH 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된 것인 화합물.
  48. 제38항에 있어서,
    Figure pct00159
    으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
  49. 하기 화학식 I의 단리된 화합물이고:
    [화학식 I]
    Figure pct00160

    [식 중,
    R1은 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R1'은 부재하거나, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R2는 하기 화학식의 모이어티이고:
    Figure pct00161

    {식 중
    각각의 R1은 독립적으로 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 또는 할로알케닐이고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R5는 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이고
    (여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    《여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다》>;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    n1, n2, 및 n3은 각각 독립적으로 0 내지 30의 정수이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이고;
    n1, 각각의 n2, 및 각각의 n3의 합계는 1 내지 30이다};
    R3 및 R4는 각각 독립적으로 H, -CR6R7R8, -C(O)R8, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R5에 연결되는 결합이고
    {여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다)};
    각각의 R5는 독립적으로 H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, -CR6R7C(O)NHR8, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 아실, 아미노산, 뉴클레오시드, 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드, 또는 또 다른 화학식 I 단위의 R3 또는 R4에 연결되는 결합이다
    {여기서
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 H, -CR3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 또는 시클로알케닐은 -OR8, -C(O)R8, -NHC(O)R8, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    <여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다>);
    R8은 H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(O)R9, -[C(R)2]n4C(O)(NH)R9, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR9, -C(O)R9, -NHC(O)R9, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 및 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환된다
    (여기서
    각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    R9는 H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 알케닐, 할로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 탄소 원자가 5개 또는 6개 있는 모노사카라이드이고, 이때 알킬, 알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 퓨린, 피리미딘, 또는 모노사카라이드는 -C(R)3, -OR, -C(O)R, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의 치환되고, 여기서 각각의 R은 독립적으로 H, 할로겐, 알킬, 또는 알케닐이고;
    n4는 1 내지 30의 정수이다)}];
    단, ascr#1, ascr#2, ascr#3, ascr#4, ascr#5, ascr#6.1, ascr#6.2, ascr#7, ascr#8, ascr#12, ascr#19, ascr#21, ascr#23, ascr#25, bhas#24, bhas#26, bhas#28, bhas#30, 또는 icas#9가 아닌 화합물.
  50. 하나 이상의 핵염기,
    하나 이상의 지방산,
    하나 이상의 아미노산, 및
    하나 이상의 당
    을 포함하고, 하나 이상의 핵염기, 하나 이상의 지방산, 하나 이상의 아미노산, 및 하나 이상의 당이 공유 결합으로 연결되어 있으며, 분자량이 약 2,000 g/mol 미만인 단리된 화합물.
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