MX2014001503A - Compuestos de moleculas pequeñas que controlan los nematodos patogenos de plantas e insectos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos de modificación del comportamiento de nematodos usando ciertos compuestos moduladores aislados. También se describen los métodos de promoción o inhibición de la reproducción en una población de nematodos, los métodos de promoción o inhibición de la agregación de nematodos en una primera ubicación, y métodos de tratamiento o prevención de infección por parásitos de una planta.

Description

COMPUESTOS DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS QUE CONTROLAN LOS NEMATODOS PATÓGENOS DE PLANTAS E INSECTOS Esta invención se realizó con el apoyo del Gobierno de los. EE.UU. en virtud de las concesiones Nos. GM088290, GM085285 y T32GM008500 otorgados por los Institutos Nacionales de Salud.

El Gobierno de los EE.UU. tiene ciertos derechos sobre esta invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para modificar el comportamiento de los nematodos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La comunicación entre los individuos de una especie depende de un número de diferentes estímulos sensoriales que incluyen señales químicas, mecánicas, auditivas, o visuales (EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY : THE NEW SYNTHESIS (Edición de 25 aniversario, 2000) ) . La señalización química es quizás la forma más antigua de comunicación entre los organismos ( (EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY: THE NEW SYNTHESIS (edición de 25 aniversario, 2000); Wyatt, Nature 457:262-63 (2009)), y el análisis de las señales químicas y los comportamientos que median es de gran importancia para la comprensión de las dinámicas ecológicas y evolutivas de las interacciones intra e interespecíficas.

Los nematodos se encuentran entre los animales más abundantes en el mundo, según el recuento de los individuos (SIEVERT LORENZEN: THE PHYLOGENETIC SISTEMATIC OF FREELIVING NEMATODES (The Ray Society, Londres, 1994)) . Estos habitan los sedimentos sulfuroso, fosas abisales, en los mamíferos, los insectos, las plantas, el hielo ártico, y muchos otros hábitats, haciéndolos uno de los grupos de animales más exitosos en la tierra (Nussbaumer et al, Aquat. Microb. Ecol. 34:239-46 (2004); ISTVAN ANDRASSY: EVOLUTION AS A BASIS FOR THE SYSTEMATIZATION OF NEMATODES (Budapest, 1976); Tietjen, Deep-Sea Res. 36:1579-94 (1989); Aben-Athar, Rev. Bras. Med. 2:89-94 (1951); Lutz, Weitere Mittheilungen 3: 425-28 (1888); Blaxter, Science 282:2041-46 (1998)) . Se han estudiado muchos de los comportamientos de los nematodos, tales como la búsqueda de pareja en las raíces, bacterias, arena, agar y los intestinos ( DONALD L. LEE: THE BIOLOGY OF NEMATODES (CRC Press, Londres, 2002)) . Poco se sabe acerca de los sistemas de feromonas de los nematodos. Aunque ha habido muchos intentos para identificar las feromonas de los nematodos (DONALD L. Lee: THE BIOLOGY OF NEMATODES (CRC Press, Londres, 2002)), la identificación sólo ha tenido éxito en muy pocas especies (Jaffe et al., J. Chem. Ecol. 15:2031-43 (1989); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Jeong, et al, Nature 433:541-45 (2005) ; Butcher et al, Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007); Pungaliya et al, PNAS 19:7708-13 (2009)) .

El nematodo C. elegans no parasitario se utiliza ampliamente como un sistema modelo para las conductas sociales, tales como la búsqueda de alimento, para detectar la densidad de población, el apareamiento y la agregación (de Bono y Maricq, Annu. Rev. Neurosci. 28:451-501 (2005) ) . Los nematodos entomopatogenos (EPN) , tales como Heterorhabditis spp. y Steinernema spp., son parásitos de insectos, obligados, que matan y consumen a sus anfitriones con la ayuda de bacterias simbióticas (Kaya y Gaugler, Annu. Rev. Entomol. 38:181-206 (1993)) . El C. elegans se encuentra típicamente en el material vegetal en descomposición (Barriere y Félix, Curr. Biol. 15: 1176-1184 (2005)) . Este completa su ciclo de vida en un periodo de 3.5 días en condiciones normales de laboratorio. Cuando las condiciones no son favorables para el crecimiento y desarrollo normal, tales como alta temperatura, alta densidad o baja disponibilidad de alimentos, forma de larvas persistentes (dauer) (alternativamente larvas de tercer estadio) . Esta etapa de vida especializada, que no se alimenta y es resistente a condiciones de estrés (Golden y Riddle, Dev. Biol. 102:368-78 (1984); Gold y Riddle, Science 218:578-80 (1982); Golden y Riddle, PNAS 81:819-23 (1984)), es análoga a los juveniles infecciosos (IJs) de nematodos entomopatogenos y a los Juveniles del segundo estadio (J2) de parásitos nematodos de las plantas (PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY (WormBook, ed. The C. elegans Research Comunity, 2006)) (Meloidogyne spp) que se adaptan por igual a sobrevivir en condiciones desfavorables para el crecimiento y desarrollo normales .

Tras el agotamiento de los recursos alimenticios o cuando hay hacinamiento, los JIs de los nematodos entomopatógenos y las larvas dauer de los nematodos de no parasitarios Caenorhabdit is elegans muestran una conducta de dispersión (Golden y Riddle, Dev. Biol. 102:368-78 (1984); Rolston et al., J. Nematol. 38:221-28 (2006); Abebe et al., J. Exp. Biol. 213:3223-29 (2010) ) .

Para el C. elegans, la entrada de los primeros estadios larvarios (LI) en la etapa dauer está regulada por una feromona, llamado daumona (Jeong et al, Nature 433:541-45 (2005)) . Después de la identificación de la daumona, se han encontrado muchos compuestos relacionados en el C. elegans (Butcher et al, Nat . Chem. Biol. 3:420-22 (2007); Butcher et al., PNAS 105:14288-92 (2008); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009); Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009); von Reuss et al., J. Am. Chem. Soc. 134 (3) : 1817-1824 (2012) ) . Todos estos compuestos tienen la didesoxiazucar inusual ascarilosa y son como un grupo llamado ascarósidos.

Los estudios en C. elegans han demostrado que esta familia de feromonas de moléculas pequeñas regula la atracción de género específico, la repulsión, la agregación, la plasticidad olfativa, y la entrada en la etapa dauer (una etapa de vida de resistente al estrés) , lo que demuestra que colectivamente los ascarósidos median una amplia gama de conductas del C. elegans (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Macosko et al, Nature 458: 1171-1175 (2009); Yamada et al, Science 329: 1647-1650 (2010); Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007)). Puesto que los ascarósidos no se han encontrado todavía en cualquier otro filo de animales (Bartley et al., J. Nat. Prod. 59 (10): 921 - 26 (1996)), los ascarósidos pueden comprender un código químico específico de los nematodos que puede regular las señales importantes para múltiples especies de nematodos. A pesar de su importancia para muchos aspectos de la biología del C. elegans, sin embargo, el conocimiento de las estructuras, la biosíntesis, y la homeostasis de los ascarósidos, así como del grado en que se pueden producir y/o al que afectan a otros nematodos, ha permanecido incompleto.

La presente invención está dirigida a superar estas y otras deficiencias de la técnica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para modificar el comportamiento de los nematodos. Este método implica la administración de uno o más compuestos moduladores aislados a los nematodos, en condiciones eficaces para modificar el comportamiento de los nematodos, donde el uno o más compuestos moduladores se seleccionan del grupo que consiste de: (i) un compuesto de Fórmula I: donde : R1 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo ; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R1' está ausente, H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R2 es un grupo de fórmula donde : cada R1 es independientemente H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R5 es H, -OH, -0R6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I; donde : R6 y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -0R, -N(R) 2, halógeno, un qrupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -OR8, -C(0)R8, -NHC(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde: cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo, y R8 es H, -C(R)3, - [C (R) 2] n4 HC (0) R9, - [C (R) 2] mC (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo , una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R) 3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H , halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, - [C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 21 n4C (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2/ halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sust ituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; n 1 , n2 , y n3 son cada uno independientemente un número entero de 0 a 30; y n4 es un número entero de 1 a 30; y la suma de n1, cada n2, y cada n3 es de 1 a 30; R3 y R4 son cada uno independientemente H, -CR6R7R8, -C(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R5 de otra unidad de Fórmula I; donde : R6 y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -0R8, -C (0) R8, -NHC (O) R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y R8 es H, -C(R)3, - [C (R) 2] n4 HC (0) R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo , un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde: cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde: cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y cada R5 es independientemente H, -OH, -OR6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, - NHR6, -NR6R7, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I; donde: R6 y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -OR, -N(R)2/ halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -OR8, -C(0)R8, -NHC(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y R8 es H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo , un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (O) (NH) Rs, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R) 3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y (ii) un compuesto que comprende: al menos una nucleobase, al menos un ácido graso, al menos un aminoácido, y al menos un azúcar; en el que la al menos una nucleobase, el al menos un ácido graso, el al menos un el aminoácido, y el al menos un azúcar están unidos por enlaces covalentes; y en donde los compuestos tienen un peso molecular menor a aproximadamente 2000 g/mol; con la condición de que el nematodo no sea una especie Caenorhabditis .

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para la promoción o inhibición de la reproducción en una población de nematodos. Este método implica la administración de uno o más compuestos moduladores aislados a la población en condiciones eficaces para promover o inhibir la reproducción en la población de nematodos, donde los uno o más compuestos moduladores aislados se seleccionan del grupo que consiste de ascr#l; ascr#3; ascr#7, ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22 una combinación de ascr#9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr# 9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20, y una combinación de ascr#9 y ascr#22.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método para promover o inhibir la agregación de los nematodos en una primera ubicación. Este método implica: (i) poner en contacto la primera ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones eficaces para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, o (ü) poner en contacto una segunda ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones eficaces para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, donde la primera ubicación y la segunda ubicación están separadas para permitir que dicho contacto en la segunda ubicación tenga un efecto sobre la agregación de los nematodos en la primera ubicación; donde los uno o más compuestos moduladores aislados se seleccionan del grupo que consiste de ascrtl; ascr#2; ascr#3; ascr#7; ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascr#ll; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; icas#9; oscr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20; una combinación de ascr#9 y ascr#22; una combinación de ascr#2, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9 y oscr#9, y una combinación de ascr#9, oscr#9 y ascr#ll.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o prevención de infección por parásitos de plantas. Este método implica: (i) poner en contacto las plantas con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones efectivas para tratar o prevenir la infección por parásitos de las plantas, o (ii) poner en contacto una segunda ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones efectivas para tratar o prevenir la infección por parásitos de las plantas, donde las plantas y la segunda ubicación están separadas para permitir que dicho contacto con la segunda ubicación tenga un efecto sobre la infección por parásitos de las plantas; donde los parásitos son nematodos o un insectos y los uno o más compuestos moduladores aislados se seleccionan del grupo que consiste de ascr#l; ascr#2; ascr#3; ascr#7; ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascr#ll; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; icas#9; oscr#10; una combinación de ascrf 9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16, una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20; una combinación de ascr#9 y ascr#22; una combinación de ascr#2, ascr#3, ascr#8, e icas#9; una combinación de ascr#9, ascr#3, ascr#8, e icas#9; una combinación de ascr#9 y oscr#9, y una combinación de ascr#9, oscr#9, y ascr#ll.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-E muestran que indol ascarósidos atraen a los C. elegans hermafroditas y machos. La Figura 1A es una representación esquemática del bioensayo usado para medir el comportamiento de atracción en los gusanos. La zona A es la región en la que se aplica la solución de muestra o de control. La X indica la posición inicial de los gusanos ensayados. La Figura IB es una representación esquemática de un ensayo de quimiotaxis de cuadrantes. La X indica el lugar donde los gusanos lavados se colocan al comienzo del ensayo. Las regiones sombreadas de la placa de cuadrante indican el agar que contiene el producto químico, mientras que las regiones blancas denotan el agar control. El número de animales en cada cuadrante se contabilizó después de 30 minutos y el índice de quimiotaxis se calculó (véase el Ejemplo 9) . El índice de quimiotaxis para el esquema es de 0.84. La Figura 1C muestra que icas#l, icas#3 e icas#9 son atractivos para ambos sexos de C. elegans. Los tres compuestos se ensayaron a 1 pmol usando hermafroditas N2 y 5 machos him- 5. Barras abiertas: controles sin compuesto (vehículo solvente) . La Figura ID es un gráfico de la dependencia de la dosis de la respuesta del icas#3 de los hermafroditas N2 y los machos him-5 en el ensayo de atracción al punto (*p<0.01, **p<0.001, *** o <0.0001, prueba t no apareada con corrección de elch) . La Figura 1E es un gráfico de la dependencia de la dosis de la atracción de icas#3 para los hermafroditas N2 en el ensayo de quimiotaxis de cuadrante (ANOVA de un factor con el post-prueba de Dunnett, **p<0.01) .

Las figuras 2A-E demuestran que la respuesta al icas#3 en los hermafroditas N2 está mediada por neuronas sensoriales ASK y las interneuronas de AIA corriente abajo. La Figura 2A es una representación esquemática de la conectividad de las neuronas sensoriales ASK a otras neuronas. La salida sináptica primaria de las neuronas ASK sin las interneuronas AIA. La Figura 2B muestra que la atracción de los hermafroditas por el icas#3 depende de las neuronas sensoriales ASK y las interneuronas de AIA. La extirpación de las interneuronas RMG no afecta a la atracción de los hermafroditas N2 o ncs-l: :gfp al icas#3 (*p<0.01, ***p<0.0001, prueba t de Student con corrección de Welch) . La Figura 2C es una gráfica de la agregación de los hermafroditas N2 y ASK extirpados a baja densidad de gusanos (20 gusanos por placa) . Los gusanos ASK extirpados no se agregan en respuesta al icas#3. El icas#3 induce señales de fluorescencia de G-cAMP en las interneuronas de AIA (Figura 2D) . Los rastros de colores representan los cambios de fluorescencia en las neuronas de AIA de animales individuales, previa exposición a 1 µ? de icas#3. Los rastros negros representan los cambios de fluorescencia de animales individuales al ser expuestos al amortiguador. El sombreado gris indica la presencia de icas#3, n = 10 animales. La Figura 2E es un gráfico de la variación media de la fluorescencia AIA en animales expuestos ya sea al amortiguador o a icas#3 (**p<0.01, prueba t de Student no apareada con corrección de Welch) . Las barras de error indican el error estándar de la media (S.E.M. ) .

Las figuras 3A-D muestran que de los hermafroditas de tipo nativo sociales y solitarios son atraídos al icas#3, pero no a los no indol ascarósidos. Los hermafroditas solitarios y sociales de tipo nativo no se sienten atraídos por una mezcla fisiológica de ascr#2,3,5 en los ensayos de atracción al punto, en contraste con los gusanos mutantes npr-1 (ad609) (Figura 3A) (***p<0.0001, prueba t no apareada con la corrección de Welch) . En el ensayo de quimiotaxís de cuadrantes, los hermafroditas de todas las cepas evaluadas son atraídos a icas#3 1 pM y repelidos por una mezcla fisiológica de no indol ascarósidos ( ascr#2 , 3 , 5 ) , a excepción de los gusanos mutantes npr-1 (ad609) gusanos mutantes, que también se sienten atraídos por la mezcla de ascr#2,3,5 (Figura 3B) (quimiotaxis después de 30 minutos (para los índices de quimiotaxis de 15 minutos, ver Figura 5C) . La Figura 3C es un gráfico de la dependencia de la dosis para la atracción al icas#3 de los hermafroditas sociales en el ensayo de quimiotaxis de cuadrantes. Las Figuras 3B-C: *p<0.05, **p<0.01, ANOVA de un factor con post-prueba de Dunnett . Las Figuras 3D muestra los hermafroditas de tipo nativo, sociales, y los gusanos mutantes npr-1 (ad609) mutantes se sienten atraídos por el icas#3 en el ensayo de atracción al punto (**p<0.001, ***p<0.0001, prueba t no apareada con la corrección de Welch) .

Las Figuras 4A-C se refieren a un modelo emergente para un lenguaje modular de moléculas de señalización. La Figura 4 muestra que el icas#3 y el ascr#3 son señales competitivas para los hermafroditas N2. Las mezclas de 120 fmol de ascr#3 y 10 fmol de icas#3 (Condición 1) atraen a los gusanos a la zona A, mientras que cantidades mayores de una mezcla de la misma relación (Condición 2; 12 pmol de ascr#3 y 1 pmol de icas#3) disuaden a los gusanos de la zona A y en su lugar los atraen a la periferia (zonas B y C) . En los experimentos con la Condición 2, sólo un gusano entró en la zona de tratamiento A, mientras que 31 gusanos entraron a zona de control A ( ***p<0.0001, prueba t de Student no apareada con corrección de Welch) . La Figura 4B muestra que las mezclas sinérgicas de ascarósidos no-indol inducen las larvas Dauer a concentraciones nanomolares a micromolares y funcionan como un atrayente masculino a concentraciones picomolares a nanomolares, mientras que los indol ascarósidos icas#3 e icas#9 actúan como atrayentes de hermafroditas y señales de agregación a concentraciones femtomolares a picomolares. La Figura 4C muestra el ensamblaje modular de las moléculas de señalización de C. elegans, con base en los bloques de construcción derivados de triptófano ("grupo principal"), ácidos grasos ("cadena lateral lipidica"), ácido p-aminobenzoico (PABA, "terminal"), y el metabolismo de los hidratos de carbono ( "ascarilosa" ) .

Las figuras 5A-B muestran que los indol ascarósidos son fuertes atrayentes de hermafroditas . En el ensayo de atracción al punto, los hermafroditas N2 son fuertemente atraídos a bajas concentraciones de icas#9, mientras que los machos no se sienten atraídos ( ***p<0.0001, prueba t de Student con corrección de Welch) (Figura 5A) . La Figura 5B es un gráfico de los índices de quimiotaxis de cuadrantes de los hermaf oditas N2 y CB4856 en placas que contienen IpM de icas#3 con o sin comida. En el ensayo de quimiotaxis de cuadrantes, los hermafroditas de todas las cepas evaluadas son atraídos a por IpM de icas#3 y repelidos por una mezcla fisiológica de no indol ascarósidos (10 nM de cada ascr#2,3,5), excepto por los gusanos mutantes npr-l(ad609) mutantes, que también se sienten atraídos por la mezcla de ascr#2,3,5 (Figura 5C) (quimiotaxis después de 15 minutos (para los índices de quimiotaxis a los 30 minutos, ver Figura 3B) , *p<0.05, **p<0.01, ANOVA de un factor con post-prueba de Dunnett ) .

Las Figuras 6A-E se refieren a los cambios de agregación y locomotores en respuesta al icas#3. La figura 6A muestra el comportamiento de agregación de los hermafroditas solitarios y sociales sobre placas de icas#9 a baja densidad de gusanos (20 gusanos por cada 5 cm de placa) (*p<0.05, **p<0.01, ANOVA de un factor con la post-prueba de Dunnett) . La Figura 6B muestra la agregación de los machos him-5 sobre placas que contienen 100 fM o 100 pM de icas#3 (**p<0.01, ANOVA de un factor con postprueba de Dunnett) . La Figura 6C muestra que los hermafroditas daf-22 se sienten atraídos por el icas#3 en el ensayo de atracción al punto (*p<0.01, **p<0.01, ***p<0.0001, prueba t de Student con la corrección de Welch) . La Figura 6D muestra la velocidad de avance (velocidad de los gusanos durante el movimiento hacia delante de los gusanos) de los hermafroditas N2 a diferentes concentraciones de icas#3. La Figura 6E muestra el número de cambios de rumbo por minuto de los hermafroditas N2 a diferentes concentraciones de icas#3. La Figura 6D-E: *p<0.05, **p<0.01, ANOVA de un factor con postprueba de Dunnett.

Las figuras 7A-B muestran que la extirpación afecta el comportamiento locomotor dependiente de icas#3. Los hermafroditas con ASK extirpado no muestran velocidad reducida hacia adelante tras la exposición al icas#3 (Figura 7A) . La frecuencia de cambios de rumbo los de gusanos con ASK extirpado no aumenta en respuesta al icas#3 (Figura 7B) . **p<0.001, prueba t no apareada con la corrección de Welch) .

Las Figuras 8A-D muestran que los indol ascarósidos median el comportamiento de agregación en C. elegans. La Figura 8A muestra el comportamiento de agregación de los hermafroditas solitarios y sociales en a densidades bajas de los gusanos (20 gusanos por placa) a diferentes concentraciones de icas#3. La Figura 8B muestra el comportamiento de agregación de los hermafroditas solitarios y sociales a densidades altas de gusanos (~120 gusanos por placa) a diferentes concentraciones de icas#3. La Figura 8C muestra la agregación de los hermafroditas daf-22 a baja densidad los gusano a dos concentraciones diferentes de icas#3. La Figura 8D muestra la duración de detención media de los hermafroditas N2 a diferentes concentraciones de icas#3. Figuras 8A-D: *p<0.05, **p<0.01 ANOVA de un factor con postprueba de Dunnett .

Las Figuras 9A-G se refieren a la identificación de los indol ascarósidos como metabolitos dependientes de daf-22. La Figura 9A muestra las estructuras químicas de los ascarósidos importantes (Srinivasan et al., Nature 454:. 1115-1118 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La Figura 9B es una representación esquemática del Análisis diferencial a través de espectroscopia 2D-RMN (DANS) . La Comparación de los espectros de RMN de tipo nativo con los espectros de RMN de mutantes daf-22 permite la detección de las señales espectroscópicas que pueden representar las moléculas de señalización dependientes de daf-22. La figura 9C es una pequeña sección de los espectros de RMN de tipo nativo real y daf-22 RMN utilizados para DANS. Las señales de ácido indol carboxilico están presentes en ambos espectros (recuadro izquierdo en cada panel), mientras que otra señal de derivada de indol (cuadro de la derecha en cada panel) sólo está presente en el espectro de tipo nativo, pero no el espectro de daf-22. (La Figura 9D es una comparación basada en HPLC-MS de los metabolomas de tipo nativo y daf-22. Los cromatogramas de iones obtenidos para el tipo nativo muestran picos para los iones moleculares de cinco indol ascarósidos diferentes que están ausentes en los cronogramas de daf-22. La Figura 9E muestra las estructuras de los indol ascarósidos identificados. La figura 9F muestra las estructuras de los ascarósidos no-indol adicionales identificados en este estudio. La figura 9G es un gráfico de las cantidades relativas de los ascarósidos icas#3 e icas#9 y los ascarósidos no-indol ascr#3 y ascr#9 secretados por el C. elegans N2 cultivados en cultivo liquido, tal como se determina por medio del HPLC-MS análisis de extractos de medios (normalizado a la concentración de ascr#3, n = 5, ±SEM) . Para la notificación de espectrometría de masas de los ascarósidos de indol y no-indol, se usaron mezclas estándar de compuestos de referencia auténticos .

La Figura 10 es la sección central del espectro de RMN de dqfCOSY (CDC13, 600 MHz) de la fracción del metaboloma de tipo nativo (N2) que contiene derivados de indol dependientes de daf-22 (recuadros) .

Las figuras 11A-C son el espectro de XH RMN (CD3OD, 600 MHz) (Figura 11A) , el espectro de 2H, 13C-HSQC (CD3OD, 600 MHz) (Figura 11B) , y el espectro de 1H, 13C-HMBC (CD3OD, 600 MHz) (Figura 11C) de icas#3 sintético.

Las figuras 12A-E se refieren a la identificación por HPLC-MS de los indol ascarósidos. Estas muestran los espectros de MS de ionización por electroaspersion (modo de iones negativos) de icas#9, icas#7, icas#l, icas#3, e icas#10, respectivamente .

Las figuras 13 A-H se refieren al análisis de HPLC-MS del origen biosintético de los ascarósidos de indol. Estas muestran los cromatogramas de iones HPLC-MS (adquiridos usando ionización por electroaspersion de iones negativos y el modo de registro de iones individuales) de los extractos de todo el cuerpo de C. elegans cultivados en medio CeMM con una mezcla 1:1 de L- [ 2 , 4 , 5 , 6 , 7 -D5 ] -triptófano y L-triptófano que muestra los isotopomeros [D5] y [H] de icas#9 (Figuras 13A-B) , icas#l (Figuras 13E-F) , icas#3 (Figuras 13C-D) , e icas#10 (Figuras 13G-H) , respectivamente.

Las Figuras 14A-B muestran también que los indol ascarósidos median el comportamiento de agregación en C. elegans. La Figura 14E muestra la agregación (flecha) de los hermafroditas N2 (20 gusanos por placa) en placas que contienen 10 pM de icas#3 en comparación con el comportamiento en las placas de control. La Figura 14F muestra la agregación de los hermafroditas N2 (~120 gusanos por placa) en placas que contienen 1 pM de icas#3 en comparación con el comportamiento sobre las placas de control.

Las figuras 15A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 15A) y espectro de 13C RMN (Figura 15B) del 5- ( 3' R, 5' R-Dibenzoiloxi-6 ' S ' -metil- ( 2H ) -tetrahidropiran-21 -iloxi ) pentanoato de metilo (3) . :H RMN: 400 Hz, acetona-d6; 13C RMN: 100 MHz , acetona-d6.

Las figuras 16A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 16A) y el espectro de 13C RMN (Figura 16B) del ácido 5-(3'R,5'R-dihidroxi-6'S1 -metil- ( 2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi ) pentanoico (oscr#9) . ¾ RMN: 400 MHz, metanol-d4 ) ; 13C RMN: 100 MHz , metanol-d4.

Las figuras 17A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 17A) y el espectro de 13C RMN (Figura 17B) del 9-(3'R, 5'R-dibenzoiloxi-6'S' -metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) nonanoato de metilo (5) . XH RMN: 400 MHz , acetona-d6; 13C RMN: 100 MHz , acetona-d6.

Las Figuras 18A-B son el espectro de XH RMN (Figura 18A) y el espectro de i3C RMN (Figura 18B) del ácido 9-(3'R,5'R-dihidroxi-6 ' S ' -metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) nonanoico (oscr#10) . 1R RMN: 600 MHz, metanol-d6; 13C RMN: 100 MHz , metanol-d6.

La Figura 19 es el espectro de XH RMN (500 MHz, cloroformo-di) del ( 8R) -hidroxi- ( 3R) -ter-butildimetilsililoxinonanoato de etilo (9) .

La Figura 20 es el espectro de lü RMN (400 MHz, cloroformo-di) (8R)-(3'R,5' R-Dibenzoiloxi- 6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) -( 3R) -hidroxinonanoato de etilo (10) .

Las Figuras 21A-D son el espectro de 1ti RMN (Figura 21 A), el espectro de 13C RMN (Figura 21B) , espectro de HSQC (Figura 21C) , y el espectro de HMBC (Figura 21D) del ácido (8R) - (3' R, 5' R) -dihidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxinonanoico (bhas#10) . 1R RMN: 500 MHz, metanol-d4; 13C RMN: 125 MHz, metanol-d4 HSQC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4; HMBC: 600 MHz para 2H, 151 MHz para 13C, metanol-d4.

Las figuras 22A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 22A) y el espectro de 13C RMN (Figura 22B) del ( 8R) - ( 3 ' R, 5' R-Dibenzoiloxi-61 S ' -metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi ) non-1-eno (12) . XH RMN: 400 MHz, acetona-d6; 13C RMN: 100 MHz, acetona-d6.

La Figura 23 es el espectro de 1H RMN (400 MHz, cloroformo-di) del Etil éster del Ácido ( 12R) - ( 3 ' R, 5' R- dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) -ter-butildimetilsililoxitridec-5-enoico (13) .

La Figura 24 es el espectro de 1H RMN (400 MHz, cloroformo-di) del Etil éster del ácido ( 12R) - ( 3 ' R, 5 ' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -ter-butildimetilsililoxit r i decanoico (14) .

La Figura 25 es el espectro de lE RMN (400 MHz, cloroformo-di) del Etil éster de ácido ( 12R) - ( 3 ' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxitridecanoico (15) .

Las figuras 26A-D son el espectro de 1H RMN (Figura 26A), el espectro de dqfCOSY (Figura 26B) , el espectro de HSQC (Figura 26C) , y el espectro de HMBC (Figura 26D) del Ácido (12R) - (3' R, 5' R-dihidroxi-6' sg-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi- (3R) -hidroxitridecanoico (bhas#22) . 1H RMN: 600 MHz, metanol-d4; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4; HSQC: 600 MHz para 1ti, 151 MHz para 13C, metanol-d4; HMBC: 600 MHz para XH, 151 MHz para C, metanol-d4.

Las Figuras 27A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 27A) y el espectro de 13C RMN (Figura 27B) del 11-(3'R,5'R-Dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) undec-1-eno (17) . XH RMN: 400 MHz, acetona-d6; 13C RMN: 100 MHz, acetona-dg .

La Figura 28 es el espectro de ?? RMN (400 MHz, cloroformo-di) del Etil éster del ácido 15-(3'R,5'R- Dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) ) -ter-butildimetilsililoxipentadec-5-enoico (18) .

La Figura 29 es el espectro de XH RMN (400 MHz, cloroformo-di ) del etil éster del Ácido 15- ( 3 ' R, 5 ' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -ter-butildimetilsililoxipentadecanoico (19) .

La Figura 30 es el espectro de 1H RMN (400 MHz, cloroformo-dl ) del etil éster del ácido 15-(3'R,5'R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxipentadecanoico (20) .

Las figuras 31A-D son el espectro de 1H RMN (Figura 31 A), el espectro de dqfCOSY (Figura 31B) , el espectro de HSQC (Figura 31C) , y el espectro de HMBC (Figura 31D) del ácido 15- ( (3' R, 5' R-dihidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxipentadecanoico (bhos#26) . 1H RMN: 400 MHz, metanol-d4; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4 ; HSQC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4; HMBC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4.

Las Figuras 32A-D son el espectro de 1H RMN (Figura 32A) , el espectro de dqfCOSY (Figura 32B) , el espectro de HSQC (Figura 32C) , y el espectro de HMBC (Figura 32D) del ácido 9- (5 ' R- (lH-indol-3-carboniloxi) -3' R-hidroxi-ß' S-metil-tetrahidro- (2H) -piran-2 ' -iloxi ) nonanoico (icos#10) . """H RMN: 600 MHz, metanol-d ; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4; HSQC: 600 MHz para 1H, 151 MHz para 13C, metanol-d4; HMBC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4.

Las figuras 33A-B son el espectro de 1E RMN (Figura 33A) y el espectro de 13C RMN (Figura 33B) del ácido 4-ter-butildimetilsililoxibenzoico (22) . ½ RMN: 400 MHz, cloroformo-di; 13C RMN: 100 MHz, cloroformo-di .

Las figuras 34A-C son el espectro de 1H RMN (Figura 34A) , el espectro de dqfCOSY (Figura 34B) , y el espectro de HMBC (Figura 34C) del ácido ( 8R) - ( 3 ' R-hidroxi-5' R- ( 4-hidroxibenzoiloxi ) -6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) -non- (2E) -enoico (hbas#3) . XH RMN: 600 MHz, metanol-d ; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4; HMBC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4.

Las Figuras 35A-B son el espectro de 1H RMN (Figura 35A) y el espectro de dqfCOSY (Figura 35B) del ácido (8R)-(3'R-hidroxi-5' R- (E) - ( 2-metilbut-2-enoiloxi ) -6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) non- (2E) -enoico (mbas#3) . 1H RMN: 600 MHz, metanol-d4; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4.

Las Figuras 36A-D son el espectro de H RMN (Figura 36A) , el espectro de dqfCOSY (Figura 36B) , el espectro de HMQC (Figura 36C) , y el espectro HMBC (Figura 36D) del 2-(8R)-(3' R, 5' R-di-hidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-21 -iloxi) nonanoil-3, 4 , 5-trihidroxi-6-hidroximetil- (2H) -tetrahidropirano (glas#10) . 1H RMN: 600 MHz, metanol-d ; dqfCOSY: 600 MHz, metanol-d4; HMQC: 600 MHz para XH, 151 MHz para 13C, metanol-d4; HMBC: 600 MHz, metanol-d4.

Las Figuras 37?-? muestran los datos de HPLC-ESI-MS de: los ascarósidos (D-l ) -oxigenados (ascr) (Figura 37A) , los ascarósidos (?) -oxigenados (oscr) (Figura 37B) , los ß-hidroxiascarósidos (?-l) -oxigenados (bhas) (Figura 37C) , los ß-hidroxiascarósidos (?) -oxigenados (bhas) (Figura 37D) , los indol ascarósidos (?-l) -oxigenados (icas) (Figura 37E) , los indol ascarósidos (?) -oxigenados (icos) (Figura 37F) , los ß-hidroxi ascarósidos (?-l) oxigenados (ibha) (Figura 37G) , los indol ß-hidroxi ascarósidos (?) -oxigenados (ibho) (Figura 37H) , los glucosil ascarósido ésteres (glas) (Figura 371), ascr#8 y los 4- (4-hidroxibenzoil) - y 4- (2- (E) -metil-2-butenoilo) -ascarósidos (hbas y mbas) (Figura 37J) , y ascr#2 y ascr#6.1 (Figura 37K) . = Confirmados utilizando los estándares sintéticos; S ID: IDentificador de Moléculas Pequeñas para las moléculas pequeñas identificadas para el C. elegans y otros nematodos. La base de datos de SMID (www.smid-db.org) es un recurso electrónico mantenido por Frank C. Schroeder y Lukas Mueller en el Instituto Boyce Thompson en colaboración con Wormbase (www.wormbase.org). El objetivo de esta base de datos es introducir, identificadores de estilo genético, que puedan ser buscados, "SMIDs" para todas las moléculas pequeñas recién identificadas del C. elegans y de otros nematodos.

La FIG. 38 muestra los perfiles de elución de HPLC de los ascarósidos identificados en los extractos del excretoma de tipo nativo y mutante del C. elegans (? indica los componentes con cadenas laterales a, ß-insaturadas con configuración (E) ) .

Las figuras 39A-B son secciones de los espectros de dqfCOSY (600 MHz, metanol-d4) de la fracción enriquecida en mbas#3 de extractos de medios de C. elegans de tipo nativo (Figura 39A) y mbas#3 sintético (Figura 39B) que muestran las señales características para los grupos metilo del anillo de ascarilosa y la cadena lateral (azul) el grupo metil alilico de la unidad de tiglato (rojo), y la señal dependiente del pH para el doble enlace de la cadena lateral (verde) .

Las Figuras 40A-B son secciones de los espectros de dqfCOSY 8600 MHz, metanol-d4) de la fracción enriquecida en hbas#3 de extracción del medio de C. elegans de tipo nativo (Figura 40A) y hbas#3 sintético (Figura 40B) que muestran las señales características para los grupos metilo del anillo de ascarilosa y la cadena lateral (azul) la unidad de 4-hidroxibenzoilo para-substituida (rojo), y el doble enlace de la cadena lateral (verde) .

Las Figuras 41A-B son secciones agrandadas de los espectros de dqfCOSY (600 MHz, metanol-d4) de la fracción enriquecida con hbas#3 de extractos de medios del C. elegans de tipo nativo (Figura 41A) y el hbas#3 sintético (Figura 41B) que muestran las señales características para los grupos metilo del anillo de ascarilosa (azul), y el sistema de giro de la ascarilosa (negro) .

La Figura 42 es el espectro de dqfCOSY (600 MHz, metanol- d4) de la fracción enriquecida en oscr#9 de extractos de medios acox-1 (ok2257 ) .

Las Figuras 43A-B son secciones de los espectros de dqfCOSY (600 MHz, metanol-d4) de la fracción enriquecida con glas#10 de extractos de pelotillas de gusanos acox-1 (ok2257) (Figura 43A) y glas#10 sintético (Figura 43B) que muestran las señales características de los grupos metilo del anillo de ascarilosa y la cadena lateral (azul) el hidrógeno anomérico de la unidad de glucosa (rojo), el sistema de giro de la glucosa (verde) , y el sistema de giro de la ascarilosa (negro) .

Las Figuras 44A-P son espectros de iones del producto MS/MS de los estándares de ascarósido. Ascr#5 muestra m/ z 147 [C6H11O4] para la ascarilosa y m/ z 73 para la cadena lateral de C3 y/o el fragmento de C3O2H5 derivado de la ascarilosa de composición molecular idéntica (Figura 44A) . El oscr#9 (Figura 44B) y el ascr#9 (Figura 44C) muestran m/z o [C5H-7O2] para la cadena lateral de C5, m/z 146 [C6Hn04] , y m/z 73 para el fragmento de C3O2H5 derivad de ascarilosa. Ascr#7 muestra m/z 125 [C7H9O2] para la cadena lateral de C7, m/z 111 [CsH702] y m/z 73 para el fragmento de C3O2H5 derivado de ascarilosa (Figura 44D) . ascrtl muestra m/z 127 [C7Hn02] para la cadena lateral de C7 y m/ z 73 para el fragmento C3O2H5 derivado de ascarilosa (Figura 44E) . Ascr#3 muestra m/z 111 [C6H702] y m/z 73 para el fragmento C302H5 derivado de ascarilosa (Figura 44F.

Ascr#10 (Figura 44G) y oscr#10 (Figura 44H) muestran m/z 173 [C9H15O3] y 155 [C9H13O2] para la cadena lateral de C9 y m/z 73 para el fragmento C302H5 derivado de ascarilosa. Los ß-hidroxi ascarósidos tales como bhas#22 (cadena lateral de C13) (Figura 441) y bhos#26 (cadena lateral de C15) (Figura 44J) muestran los iones del fragmento especifico de la cadena lateral en m/z 185 [C11H21O2] y m/z 213 [C13H25O2] , respectivamente, los cuales se originen de la pérdida de ascarilosa y el ácido acético. Además, bhas#22 y bhos#26 muestran un ion del producto intensivo en m/z 59 [C2H3O2] para el acetato, asi como el ion de diagnóstico en m/z 73 para el fragmento C302H5 derivado de ascarilosa. Los indol ascarósidos tales como icas#9 (Figura 44K) e icas#l (Figura 44L) muestran los iones de fragmentos específicos de la cadena lateral para los ascarósidos correspondientes a m/z 247 [CnHi906] y m/z 275 [Ci3H2306] respectivamente, los cuales se originan de la pérdida de la unidad de indol carbonilo [C9H5NO] . Además, icas#9 e icas#l muestran m/z miembro 160 de fijación de gancho [C9H6N02] para los iones indol carboxilato. Los iones de los productos de ascarósido de los indol ascarósidos muestran iones de fragmentos adicionales correspondientes al patrón de fragmentación de los no indol ascarósidos, tales como los iones de fragmentos de diagnóstico en m/z 73 para al fragmento C3H2O5 derivado de ascarilosa. Icas#3 (Figura 44M] ) muestra m/z 301 [C15H25O6] de la pérdida de la unidad de indol carbonilo [C9H5NO] , junto con m/z miembro 160 de fijación de gancho [CgH6N02] para los iones de indol carboxilato. Mbas#3 (Figura 44N] ) muestra m/z 301 [Ci5H2506] y m/z 283 [Ci5H2305] , los cuales se originen de la pérdida de las unidades de tigliol [05?d?] y tiglato [C5H8O2] , respectivamente. Además, mbas#3 muestra m/z 99 [C5H7O2] para los iones tiglato. Los iones del fragmento del diagnóstico en m/z 73 para el fragmento C3O2H5 derivado de ascarilosa son de baja intensidad. Hbas#3 (Figura 440]) muestra m/z 301 [C15H25O6] el cual se origina de la pérdida de una unidad hidroxibenzoilo [C7H4O] . Además, hbas#3 muestra m/z 137 [C7H5O3] y m/z 93 [?ß?50] para los iones hidroxibenzoato y fenolato. Los iones de fragmentos de diagnóstico de ascarósido en m/z 73 para el fragmento C3O2H5 derivado de ascarilosa son de baja intensidad. El ascr#8 enlazado a PABA Figura 44P]) muestra los iones de fragmentos característicos en m/z [C7H6N02] y m/z 92 [C6H6N] para los iones de PABA y anilida, respectivamente, junto con los iones del fragmento de diagnóstico en m/z 73 para el fragmento C302H5 derivado de ascarilosa .

La Figura 45 muestra la alineación de la isoforma 2 de MFE-2 (NP_000405.1) con MAOC-1 de C. elegans (NP_495494.1 (rojo)) y DHS-28 (NP_509146.2 ; dominio de oxidoreductasa (verde) , dominio de proteína potadora de esterol SCP-2 (amarillo)) llevado a cabo usando ClustalW. Los aminoácidos que constituyen los sitios catalíticos están marcados con recuadros verdes y rojos y la señal de reconocimiento peroxisomal en negro. Los aminoácidos idénticos están marcados en gris y los aminoácidos similares están marcados en gris claro .

Las Figuras 46A-C se refieren a la identificación de nuevos ascarósidos en C. elegans. La Figura 46A es el cromatograma de iones totales (TIC) del excretoma de C. elegans de tipo nativo. La Figura 46B ilustra la fragmentación MS/MS de los ascarósidos. La Figura 46C es el tamizado por LC-MS/MS (precursores de m/z 73) del excretoma de tipo nativo, y revela los ascarósidos conocidos (negro) , los nuevos homólogos (C4, C6, C8, Cll, y C12), los nuevos isómeros (?) -oxigenados (05?, C9U y C11J y los nuevos derivados 4'-acilados (hbas#3 y mbas#3 (*no ascarósidos) . El ascr#5 altamente polar se eluye en 6.5 min, fuera del rango de tiempo de retención mostrado.

Las Figuras 47A-C muestran los ascarósidos identificados en los gusanos acox-1, maoc-1, dhs-28, y daf-22 de tipo nativo, a través de LC-MS/MS. La Figura 47A muestra los ascarósidos (?-l) -oxigenados, la Figura 47B muestra los ascarósidos (?) -oxigenados , y la Figura 47C muestra los ejemplos de derivados 4'-acilados. La estereoquímica de los compuestos que no fueron sintetizados para las síntesis, y una lista completa de los 146 ascarósidos caracterizados) se propuso como se muestra con base en análogas y los tiempos de retención de HPLC-MS (ver la Figura 38) .

Las Figuras 48A-B se refieren a la tracción a hbas#3. Los hermafroditas de tipo nativo (N2) son atraídos por el hbas#3 en el ensayo de atracción al punto en una manera dependiente de la dosis (Figura 48A) .

La Figura 48B muestra la dependencia de la dosis de la atracción al hbas#3 para los hermafroditas de tipo nativo en el ensayo de quimiotaxis de cuadrantes.

Las Figuras 49A-B se refieren a la biogénesis del ascarósido, la Figura 49A muestra las funciones propuestas de las enzimas de ß oxidación peroxisomal ACOX-1, MAOC-1, DHS-28, y DAF-22 en la biosíntesis de los ascarósidos. La Figura 49B muestra las estructuras de los alelos mutantes acox-1, maoc-1, dhs-28, y daf-22, que muestran mutaciones puntuales (barras verticales) y eliminaciones (barras horizontales) .

Las Figuras 50A-E muestran la cantidad de ascarósidos (?- 1) oxigenados en los mutantes de tipo nativo y de ß-oxidación (acox-1 (Figura 50A) , maoc-1 (Figura 50B), dhs-28 (Figura 50C) , y daf-22 (Figura 50D) con cadenas laterales saturadas (azul), , -insaturadas (rojo) , y ß-hidroxiladas (verde) .

La Figura 51 muestra la alineación de la isoforma a.l de C. elegans ACOX-1 con otras acil-CoA oxidasas, llevada a cabo usando ClustalW. Los aminoácidos idénticos están marcados en gris, los aminoácidos similares están marcados en gris claro, y la señal de reconocimiento peroxisomal está marcada en negro.

Las Figuras 52A-B muestra la cantidad de ascarósidos (?)-oxigenados en el tipo nativo (Figura 52A) y los mutantes acox-1 (Figura 52B) (ver también las Figuras 53A-E) .

Las Figuras 53A-E son los perfiles de ascarósidos (o)-oxigenados en los gusanos de tipo nativo (N2) (Figura 53A) y los mutantes de ß-oxidación (acox-1 (Figura 53B) , maoc-1 (Figura 53C), dhs-28 (Figura 53D) , daf-22 (Figura 53E) que muestran los ascarósidos saturados (azul), , ß-insaturados (rojo), y ß-hidroxilados (verde) . (para los ascarósidos (?-1)-oxigenados, ver las Figuras 50A-E) .

Las Figuras 54A-B se refieren a la biosintesis de los indol ascarósidos. La abundancia relativa de los ascarósidos de C5 ( -1) y (?) -oxigenados ascr#9, y oscr#9 y sus indol ascarósidos correspondientes icas#9 e icos#9 en acox-1 indica que el enlace del indol-3-carbonilo es muy especifico (Figura 54A) . La Figura 54B incluye las trazas de iones LC-MS del excretoma de daf-22 (ml30) enseguida de la incubación con una mezcla 1:1 de ascr#10 y oscrtlO, que muestran una preferencia por el enlace del indol-3-carbonilo al ascr#10 (?-1)-oxigenado.

La Figura 55 muestra la abundancia relativa de los ascarósidos ascr#3 y ascr#9 y de sus indol ascarósidos correspondientes icas#3 e icas#9 en los extractos de excretoma de tipo nativo, e indica que el enlace del indol es altamente dependiente de la longitud de la cadena lateral.

Las Figuras 56A-B se refieren a los perfiles de ascarósido. El análisis de los perfiles de ascarósido del cuerpo de los gusanos (Figura 56A) revela glucósidos de ascarósido (por ejemplo, glas#10) e indica la excreción preferencial de ascarosidos insaturados . La proporción de ascarosidos saturados (co-l) a (?) enlazados en el excretoma del mutante dhs-28 (Figura 56B) muestra una fuerte dependencia de las condiciones nutricionales (para los ß-hidroxi ascarosidos ver las Figuras 59A-C) , lo que refleja la dependencia de la falta de alimento de la relación ascr#3/ascr#5 en el C. elegans de tipo nativo (véase la Figura 60) (prueba t de Welch, *:P<0.05; P<0.001) .

Las Figuras 57A-C son cromatogramas de LC-MS/MS (iones precursores de m/z = 73) de extractos de cuerpos de gusanos acox-1 (ok2257 ) que muestran los glucosil esteres glas#10, glas#18, y glas#22 y los correspondientes ascarosidos no glicosilados ascr#10, ascr#18, y ascr#22.

La Figura 58 muestra la excreción diferencial de los ascarosidos (?) -oxigenados) por el C. elegans de tipo nativo (para los ascarosidos (co-l ) -oxigenados véase la Figura 56A) .

Las Figuras 59A-C muestran la relación de los ascarosidos (co-l) a (?) -enlazados en los gusanos mutantes dhs-28 (hj8) y muestran la fuerte dependencia sobre las condiciones nutricionales. La Figura 59A es la proporción de los ß-hidroxi ascarosidos en los extractos del excretoma de dhs-28 (hj 81 ) . La Figura 59B es la proporción de los ß-hidroxi ascarósidos en extractos de cuerpos de gusanos dhs-28(hj8) . La Figura 59C es la proporción de los ascarósidos saturados en extractos de cuerpos de gusanos dhs-28(hj8) (los ascarósidos saturados en extractos de excretoma de dhs-28(hj8) se muestran en la Figura 56B) .

La Figura 60 muestra la dependencia de la falta de alimento de la relación ascr#3/ascr#5 en el excreto de tipo nativo .

Las Figuras 61A-B se refieren a la biogénesis de los ascarósidos. La Figura 61A muestra el ensamblaje modular de los ascarósidos a partir de bloque de construcción de aminoácidos (verde) ácidos grasos (azul), y carbohidratos (rojo) . La Figura 61B muestra un modelo para la biogénesis de los ascarósidos. El alargamiento de la cadena de los ácidos grasos (por medio de los homólogos de elongasa putativa elo-1-925) (Agbaga et al., PNAS 105: 12843-48 (2008), la cual incorpora aqui como referencia en su totalidad) es segundo por la oxigenación (?-1) o (?) de los VLCFSs y el enlazamiento de la ascarilosa. Los VLCAs resultantes entran en ß-oxidación a través de ACOX-1, AOC-1, DHS-28, y DAF-22 que producen ascarósidos de cadena corta, los cuales se enlazan a las porciones derivadas de aminoácidos y a otros bloques de construcción .

La Figura 62 es la alineación de la CDP-3, 6-didesoxi-D- glicero-D-glicero-4-hexulosa-5-epimerasa o ascE de Yersinia pseudotuberculosis (AAA88702.1) con el homólogo C14F11.6 de C. elegans (CCD64533.1) llevada a cabo usando ClustalW. Los aminoácidos idénticos se marcan en gris y los aminoácidos similares se marcan en gris claro.

Las figuras 63A-D se refieren a la cuantificación y la respuesta de S. feltiae a la mezcla de dispersión de C. elegans. La Figura 63A muestra las estructuras de los ascarósidos para la mezcla de dispersión. La Figura 63B muestra la cuantificación del C. elegans de dispersión usando ImageJ. (La segunda columna muestra las imágenes invertidas y la tercera columna muestra los nematodos contabilizados) . La Figura 63C muestra la contribución de los ascarósidos individuales a la actividad de la mezcla sintética. El ascr#2 (3.68 pmol/ul), ascr#3 (0.165 pmol/ul), ascr#8 (0.25 pmol/ul), e icas#9 (0.005 pmol/ul) . Se realizaron siete experimentos para cada tratamiento. El signo +, representa presente y el signo -, representa ausente. Prueba t de Student no apareada (p<0.05) . La Figura 63D muestra la respuesta del S. feltiae a la mezcla de dispersión de C. elegans visualizada dentro de una placa completa.

Las Figuras 64A-D se refieren al ensayo de dispersión. La Figura 64A muestra los juveniles infectivos (IJ) que se dispersan naturalmente de s. feltiae desde un cadáver de insecto. La Figura 64B muestra aproximadamente 300 IJs clocados sobre una placa de agar en agua. La Figura 64C muestra los IJs tratados ya sea con agua (control) o extractos de cadáver de insecto. Las imágenes son representativas de seis experimentos para cada tratamiento. La Figura 64D muestra el ensayo de dispersión sobre la misma placa. La ilustración representa dos experimentos. El comportamiento es dependiente de la temperatura y de la estación. Los ensayos se realizaron a TA (22+0.5°C) bajo condiciones de temperatura controlada.

La Figura 65 muestra las estructuras de varios ascarósidos.

Las Figuras 66A-E muestran que una mezcla de ascarósidos regula el comportamiento de dispersión del C. elegans, y la mezcla de dispersión es reconocida por otros nematodos. La Figura 66A muestra la identificación de la mezcla de dispersión. Las imágenes (~250 nematodos) son representativas de 9, 10, 11 experimentos de control (0.25% de E. coli (HB101)), una mezcla sintética con 0.25% de E. coli (HB101), y un sobrenadante de larvas dauer, respectivamente. La Figura 66B muestra la cuantificación usando ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html) . Prueba de t de Student non apareada de la mezcla de control vs la muestra sintética (p<0.02) . La Figura 66C muestra el análisis de los cadáveres hospederos infectados por nematodos entomopatógenos o nematodos de los nodos de la raíz para los componentes de la mezcla de dispersión del C. elegans. La Figura 66D muestra la respuesta de los IJs de S. feltiae ~250) a la mezcla de dispersión; cuatro experimentos por tratamiento. La Figura 66E muestra la respuesta de los J2s de los nodulos de la raíz (Meloidogyne spp . , mezcla de M. incógnita, M. javanica, y M. fluoridensis ) a la mezcla de dispersión de C. elegans. Los datos representan 19 y 20 experimentos de agua de control y la mezcla de dispersión de C. elegans, respectivamente. A las 2 h, usando una prueba t de Student, no apareada, p<0.007.

Las Figuras 67A-E muestran el fraccionamiento de la feromona de dispersión de S feltiae. La Figura 67A muestra la respuesta a las fracciones de cromatografía en fase invertida (C18) del extracto de cadáver de insecto. La imagen representa dos experimentos independientes. La concentración fisiológicamente relevante se usó en los ensayos; Frc, significa fracción. La Figura 67B se refiere a la evaluación de la concentración fisiológicamente relevante de los ascarósidos encontrados en la Frc A (ascr#3, 40.3 pmol/µ? y ascr#ll, 1.3 pmol/µ?) . La imagen representa tres experimentos. La Figura 67C muestra que el ascr#2 y el ascr#9 son análogos estructurales. La Figura 67C muestra que el ascr#2 y el ascr#9 son análogos estructurales. El ascr#9 natural y sintético se evaluaron en combinación con las fracciones B y C. La imagen representa cuatro experimentos. La Figura 67D muestra la estructura del ascr#ll. Este (1.3 pmol/µ?) también es suficiente para provocar la dispersión en combinación con las fracciones B y C. La imagen representa tres experimentos.

Las Figuras 68A-C son cromatogramas de iones LC-MS de la fracción A (Figuras 68A-B) y la fracción B (Figura 68C) . El primer panel muestra el ascrtll a m/z 279, el segundo panel muestra el ascr#9 a m/z 293.

La Figura 69 muestra el perfil del ascr#9 y el ascr#ll durante el desarrollo del S. feltiae. Para cada punto de tiempo, se analizaron seis cadáveres de insectos mediante LC-MS. Para el punto de tiempo 0, se analizaron 4 larvas no infectadas. * Detectado pero no cuantificable .

La Figura 70 muestra que el ascr#9 puede reemplazar la función del ascr#2 en la mezcla de dispersión del C. elegans. Se representa las imágenes representativas. El control negativo uso 0.25% de E. coli HB101 (3 experimentos), sustitución de ascr#9 en la mezcla de dispersión de C. elegans (6 experimentos, y los controles positivos fueron: la mezcla de dispersión de mezcla sintética (7 experimentos) y el cultivo liquido de larvas dauer de control positivo (3 experimentos ) .

Las Figuras 71A-B se refieren a la mezcla de dispersión de las especies de nematodos relacionadas filogenét icamente . La Figura 71A es el árbol filogenético de los nematodos entomopatógenos , los nematodos parásitos de plantas, y el C. elegans. La Figura se adapta de C. elegans and the biology of nematodes (PAUL DE LEY: A QUICK TOUR OF NEMATODE DIVERSITY AND THE BACKBONE OF NEMATODE PHYLOGENY (WormBook, ed. The C. elegans Research Community, 2006) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El color rojo indica el ejemplo por género. La Figura 71B muestra la presente del ascr#9 y el ascr#ll en los cadáveres de insectos hospederos de Steinernema spp. y Heterorhiabditis spp. Para cada especie, cuatro cadáveres de insectos se analizaron cuadro cadáveres de insectos infectados tanto con Steinernema spp. y Heterorhiabditis spp. , mediante LC—MS para los perfiles de ascr#9 y ascr#ll.

Las Figuras 72A-D muestran la estructura y los datos de HPLC-ESI-MS de los ascarósidos saturados (?-l ) -oxigenados (Figuras 72A) , los ascarósidos insaturados (?-l ) -oxigenados (Figura 72B) , los ascarósidos saturados (?) -oxigenados (Figura 72C) , y los indol ascarósidos icas#9 y ascr#2 (Figura 72D) . 1S ID: IDentificador de Moléculas Pequeñas, para las molculas pequeñas identificadas de C. elegans y de otros nematodos.

La Figura 73 muestra los tiempos de retención de HPLC de los ascarósidos (ascr's) y de los omega-ascarósidos (oscr's) . El rango de las cadenas laterales es de 3-17 átomos de carbono, se derivó de los análisis de los mutantes de tipo nativo y de beta-oxidación peroxisomal de C. elegans y de los estándares sintéticos. Las Figuras 74A-B muestran la identificación de los ascarósidos en extractos de gusanos en agua, de S. glaseri adultos. La Figura 74A es el cromatograma de corriente total de iones (TIC) de LC-MS/MS; el tamizado de los iones precursores de m/z 73.0 revela señales de ascarósidos. La Figura 74B son las trazas de iones correspondientes para ascr#9, ascr#12, ascrf 1 , y ascrf 14 de las mediciones de LC-MS.

Las Figuras 75A-K son los espectros de RMN de los componentes en la síntesis de los ascarósidos, como los siguientes .

Las Figuras 76A-D se refieren a la estructura (Figura 76A, la detección (Figuras 76B-C) , y la síntesis (Figura 76D) de los ascarósidos. Tanto los ascarósidos (ascr) y los indol ascarósidos (icas) han sido ascarósidos descritos previamente en C. elegans. Además de los ascr (?-l ) -oxigenados, sus isómeros de (?) -oxigenación (oscr) fueron identificados en este tamizado por HPLC-MS. La Figura 76B muestra la identificación por HPLC-MS de los ascarósidos de cadena corta y mediana, en agua de gusanos acondicionada obtenida de C. elegans no parasitario (etapas mixtas), el parásito de insectos S. glaseri (adultos), y los parásitos de ratas N. brasiliensis (adultos) . El análisis de HPLC-MS de exudado de C. elegans muestra los ascarósidos conocidos (ascrf 1, #3, #7, e icas#9), junto con los homólogos correspondientes (ascrtlO, #12, #14, y #18), y los isómeros (?) -oxigenados (oscr#9, #10, #18) . El ascrl altamente polar se eluye en 6.5 minutos, fuera del rango del tiempo de retención mostrado. La comparación cruzada de especies de las señales de iones moleculares y de sus tiempos de retención de HPLC indica que los ascarósidos producidos de forma abundante por el C. elegans también se encuentran en muchas otras especies de nematodos, incluyendo S glaseri y N. brasiliensis (los picos representan los compuestos abundantes también en C. elegans mostrados en azul) . La Figura 76C muestra la identificación por HPLC-MS de los ascarósidos de cadena mediana y larga en P. strongyloides (etapas mixtas) y H. bacteriophora (adultos) . El ascr#18 (azul) es producido en cantidades importantes por la especie C. elegans en tanto que los homología de cadena más larga (picos rojos) son producidos de forma abundante por la especie P. strongyloides y la especie H. bacteriophora, pero no por la especie C. elegans. La Figura 76D muestra la síntesis de los ascarósidos (?) -oxigenados, oscr#9 y oscr#10.

La Figura 77 es un mapa de calor que muestra que los ascarósidos son producidos por una amplia gama de especies de nematodos. Esto se basa en los resultados del análisis de HPLC-MS de muestras de medios de gusanos obtenidas de gusanos en incubación por varias horas en Suero Basal, ddH2Ü, o DMEM. Las especies parasitarias indicadas como juveniles infecciosos (IJ) y adultos infecciosos (A) se recolectaron por separado; todas las otras muestras se obtuvieron de cultivos de etapas mixtas. Los colores en este mapa de calor representan la abundancia relativa de los ascarósidos detectados por HPLC-MS, como se indica en el diagrama de barras a la derecha. Por ejemplo, de los ascarósidos detectados en S. glaseri los juveniles infecciosos, el total se compone de 5.7% de ascrtll, 92.2% de ascr#9, 2.1% de ascr#12, y 0.1% de ascr#10.

La Figura 78 muestra que los nematodos responden de forma univoca a las áreas acondicionadas por los ascarósidos. Se calificaron varias especies de nematodos en cuanto a su respuesta a las áreas condicionadas con tres concentraciones de los ascarósidos sintetizados (0.6 µL de lnm, ?µ?, y ImM, correspondientes a 0.6 fmol, 0.6 pmol, y 0.6 nmol, respectivamente, por área de calificación) . Su ocupación en la región acondicionada se comparó con su ocupación en la región de control durante 20 minutos; 10 individuos por prueba. Los experimentos en los cuales los nematodos que pasaron significativamente más tiempo en las regiones acondicionadas con los ascarósidos, se resaltan en verde. Los experimentos en los cuales los nematodos pasaron significativamente más tiempo en las regiones de control se resaltan en rojo, lo que indica la evasión del ascarósido. Las barras de error, la significación estadistica de la S.D. para cada valor se calculó comparando la respuesta al agua, mostrada primero en cada conjunto. Los valores de P se determinaron usando una prueba t de Student no apareada. **P<0.001, *P<0.05.

La Figura 79 se refiere al ensayo de retención usando un conjunto de programas que detecta la presencia de los gusanos en ambas regiones y proporciona un resultado del porcentaje de cada región de calificación ocupada por los gusanos, los cual se calcula una vez por segundo durante la prueba completa. El resultado es una gráfica de la ocupación de los gusanos vs . El tiempo para ambas regiones de calcificación (panel derecho) . Se adoptó el índice de calificación descrito por Barmann et al., Cell 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Las Figuras 80A-C se refieren al ensayo de atracción. Los machos de C. elegans demuestran una atracción diferencial de largo alcance para las diferentes especies de nematodos y ascarósidos. La atracción de largo alcance de los machos de C. elegans a los hermafroditas conespecificos se estableció calificando la quimiotaxis para fuente hermafrodita o puntos acondicionados con el ascarósido sobre una placa de agar de 10 cm (Figura 80A) . Los hermafroditas se suspendieron en amortiguador M9 y se colocaron dentro de un cilindro de cobre sobre la placa de agar durante 6 horas antes que estos se retiraran y se agregara el agente paralizante de azida de sodio. Lo mismo se hizo con un control de amortiguador M9 en un cilindro de cobre, en el lado opuesto. Los machos de C. elegans se colocaron en el centro de la placa y se les permitió deambular hasta que estos quedaron paralizados en algún punto. El índice de atracción, adaptado de Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, se calculó entonces, comparando el número de gusanos que quedaron paralizados en el control vs la región de referencia. La Figura 80B muestra que los machos de C. elegans son atraídos a la fuente puntual acondicionada con 50 hermafroditas conespecificos . Esto demuestra la atracción parcial a números iguales de hembras de P. redivivus, pero no a hembras/hermaf oditas de S. carpocapsae, P. pacificus, o P. strongyloides . La Figura 80C muestra que los machos de C. elegans pueden detectar y realizar la quimiotaxis hacia una fuente puntual acondicionada con 25 hermafroditas durante 6 horas. Estos realizan la quimiotaxis hacia una fuente puntual de ascr#2 y ascr#3, pero no de ascr#8. Las barras de error Significación estadística de la D.E. para cada valor se calculó en comparación con el control, mostrado en la Figura 80C. Los valores de P se determinaron usando la prueba t de Student. **P<0.01, *P<0.05.

La Figura 81 muestra que los ascarósidos no aumentan el apareamiento con los hermafroditas conespecificos , ni inducen el apareamiento con especies de nematodos diferentes. Un ensayo de respuesta de apareamiento (Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , se adaptó, cuantificando el porcentaje de machos que colocan su cola ventral exitosamente sobre los hermafroditas durante 10 segundos consecutivos, dentro del intervalo de una prueba de 3 minutos. Barras de error, S.D.

La Figura 82 muestra el ensamblaje similar de las moléculas de señalización en nematodos y bacterias. Las N-acil homoserina lactonas (AHLs) son una familia de moléculas pequeñas que median la detección del quorum bacteriano. Las AHLs se basan en la homoserina lactona y presentan variaciones especificas de la especia en la cadena de N-acilo (Dickschat, Nat. Prod. Rep. 27:343-69 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Los ascarósidos se ensamblan de una manera muy similar, con base en el andamio de la didesoxiazucar ascarilosa, a la cual se une una cadena lipidica variable (Edison, Curr. Opin. Neurobiol. 4:378-88 (2009) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Ambos tienen funciones significativas en la mediación de estrategias de supervivencia importantes.

La Figura 83 es una lista de los compuestos ascarósidos detectados en la especie M. javanica y/o la especie M. hapla.

La Figura 84 muestra los datos de espectrometría de masas de alta resolución de las moléculas de reconocimiento de ascarósidos identificadas en nematodos de los nudos de raíces.

Las Figuras 85A-E son cromatogramas de HPLC-MS de extractos de nematodos de los nudos de raíces (M. javanica, M. floridensis, M. incógnita) que demuestran la presencia de los ascarósidos ascr#10 (Figura 85A) , ascr#16 (Figura 85B) , ascr#18 (Figura 85C) , ascr#20 (Figura 85D) , y ascr#22 (Figura 85E) .

Las Figuras 86A-E son cromatogramas de HPLC-MS de extractos de M. javanica (larvas J2 ) que demuestran la presencia de los ascarósidos ascr#10 (Figura 86A), ascr#16 (Figura 86B) , ascr#18 (Figura 86C) , ascr#20 (Figura 86D) y asce#22 (Figura 86E) .

Las Figuras 87A-E son cromatogramas de HPLC-MS de extractos del Nematodo de Nodos de Raíces septentrional M. hapla (larvas J2) que demuestran la presencia de los ascarósidos ascr#10 (Figura 87A) , ascr#16 (Figura 87B) , ascr#18 (Figura 87C) , ascr#20 (Figura 87D) , y ascr#22 (Figura 87E) .

Las Figuras 88A-E son cromatogramas de HPLC-MS de estándares de ascarósidos sintéticos (ascr#10 (Figura 88A) , ascr#16 (Figura 88B) , ascr#18 (Figura 88C), ascr#20 (Figura 88D) , y ascr#22 (Figura 88E)).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En este documento se describen los métodos para modificar el comportamiento de los nematodos usando ciertos compuestos moduladores aislados.

DEFINICIONES Como se usan aquí, se entenderá que los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, tendrán los siguientes significados. Si no se define de otra manera en este documento, todos los términos científicos y técnicos usados aquí tienen el mismo significado entendido comúnmente por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. En caso de que haya una pluralidad de definiciones para un término de este documento, aquellos en esta sección prevalecen, a menos que se establezca de otra manera.

El término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que puede ser una estructura hidrocarbúrica lineal, ramificada, o cíclica o combinaciones de las mismas. Los grupos alquilo representativos son los que tienen 24 o menos átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i- propilo, n-butilo, s-butilo, t-butilo, n-pentilo, i-pentilo, n-hexilo, y los similares. Alquilo inferior se refiere a los grupos alquilo que tienen aproximadamente 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono en la cadena. Alquilo ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferiores tales como metilo, etilo, o propilo están unidos a una cadena alquilo lineal.

La afirmación de que alquilo tiene la intención de incluir estructuras hidrocarbúricas lineales, ramificadas, o cíclicas y combinaciones de las mismas significa que un grupo "alquilo" también incluye la siguiente combinación de elementos estructurales lineales y cíclicos (y combinaciones similares) .

"Alquenilo" significa un grupo alquilo, como se define anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen tanto los isómeros cis y trans. Alquenilo ramificado significa que uno o más grupos alquilo inferior tales como grupos metilo, etilo, o propilo están unidos a una cadena alquenilo lineal. Los alquenilos de cadena lineal y ramificados representativos son aquellos que tienen aproximadamente 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono en la cadena, por ejemplo, etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2, 3-dimetil-2-butenilo, y los similares.

El término "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo, y yodo .

El término "haloalquilo" se refiere a un alquilo ramificado o de cadena lineal como se describe anteriormente, sustituido con uno o más halógenos.

El término "haloalquenilo" se refiere a un alquenilo ramificado o de cadena lineal como se describe anteriormente, sustituido con uno o más halógenos.

El término "arilo" significa un sistema de anillo aromático monociclico o multi-ciclico (policiclico ) de 6 a aproximadamente 19 átomos de carbono, por ejemplo, aproximadamente 6 a aproximadamente 10 átomos de carbono, e incluye grupos arilalquilo. Los grupos arilo representativos incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como fenilo, naftilo, azulenilo, fenantrenilo, antracenilo, fluorenilo, pirenilo, trifenilenilo, crisenilo, y naftacenilo.

El término "arilalquilo" significa un residuo de alquilo unido a un anillo arilo. Los ejemplos son bencilo, fenetilo, y los similares.

El término "heteroarilo" significa un sistema de anillo aromático, monociclico o multi-cíclico de aproximadamente 5 a aproximadamente 19 átomos en el anillo, por ejemplo, aproximadamente 5 a aproximadamente 10 átomos en el anillo, en el que uno o más de los átomos en el sistema de anillo es/son elemento (s) distintos al carbono, por ejemplo, nitrógeno, oxigeno y/o azufre. Como es bien conocido por los expertos en la técnica, los anillos de heteroarilo tienen menos carácter aromático que sus homólogos compuestos completamente de carbono. Por lo tanto, para los fines de la invención, un grupo "heteroarilo" necesita tener sólo algún grado de carácter aromático. Por ejemplo, en el caso de sistemas de anillos multi-ciclicos , sólo uno de los anillos tiene que ser aromático para que el sistema de anillos se defina como "heteroarilo". Los heteroarilos ejemplares contienen aproximadamente 5 a 6 átomos en el anillo. El prefijo aza, oxa, tia, o tío antes de heteroarilo significa que al menos un átomo de nitrógeno, oxigeno, o azufre, respectivamente, está presente como un átomo del anillo. Un átomo de nitrógeno, carbono o azufre en el anillo heteroarilo puede estar opcionalmente oxidado; el nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado . Los heteroarilos representativos incluyen, pero no se limitan a, purinilo, piridilo, 2-oxo-piridinilo, pirimidinilo, piridazinilo, pirazinilo, triazinilo, furanilo, pirrolilo, tiofenilo, pirazolilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, triazolilo, oxadiazolilo, tiadiazolilo, tetrazolilo, indolilo, isoindolilo, benzofuranilo, benzotiofenilo, indolinilo, 2- oxoindolinilo, dihidrobenzofuranilo, dihidrobenzotiofenilo , indazolilo, bencimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzoisoxazolilo, benzoisotiazolilo, benzotriazolilo, quinolinilo, isoquinolinilo , quinazolinilo, cinolinilo, ftalazinilo, quinoxalinilo, y los similares.

Los términos "cicloalquilo" y "cicloalquenilo" se refieren a un sistema de anillos no aromático, saturado (cicloalquilo) o insaturado (cicloalquenilo) , mono- o multi-ciclico de aproximadamente 3 a aproximadamente 8 átomos de carbono, por ejemplo, de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo y cicloalquenilo ejemplares incluyen, sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo , ciclohexilo, cicloheptilo, norbornilo, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, ciclofenilo, anti-biciclopropano, sin-triciclopropano, y los similares.

Como se usa en este documento, "heterociclo" o "heterociclilo" se refiere a un anillo (radical) de 3- a 18-miembros, estable, que está saturado, insaturado, o aromático, y que consiste de átomos de carbono y de uno a cinco heteroátomos seleccionados de entre el grupo que consiste de nitrógeno, oxigeno y azufre. Para los propósitos de esta invención, el heterociclo puede ser un sistema de anillos monociclico, biciclico, o policiclico, que puede incluir sistema de anillos fusionados, con puente, o espiro, incluyendo los anillos biciclicos, en los que cualquiera de los heterociclos anteriores está fusionado a un anillo de benceno. Los átomos de nitrógeno, carbono, azufre en el heterociclo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el anillo puede estar parcial o totalmente saturado. El heterociclo puede estar unido a través de cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se definen a continuación. Los ejemplos de tales heterociclos incluyen, sin limitación, morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tet rahidroprimidinilo, tetrahidrot iofeni lo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, y los similares. Otros heterociclos y heteroarilos se describen en Katritzky et al., eds . , Comprehensive Heterocyclic Chemistry: The Structure, Reactions, Synthesis and Use of Heterocyclic Compounds, Vol . 1-8, Pergamon Press, N.Y. (1984), que se incorpora aqui como referencia en su totalidad.

El término "acilo" se refiere a grupos de 1 a 8 átomos de carbono de una configuración lineal, ramificada, o cíclica, saturados, insaturados, o aromáticos, y combinaciones de los mismos, unidos a la estructura principal a través de una funcionalidad carbonilo. Uno o más átomos de carbono en el residuo de acilo pueden ser reemplazados por nitrógeno, oxigeno, o azufre, siempre y cuando el punto de unión a la porción principal permanezca en el carbonilo. Los ejemplos incluyen acetilo (Ac) , benzoilo, propionilo, isobutirilo, t-butoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, y los similares.

El término "aminoácido" se refiere al fragmento de un aminoácido que permanece enseguida de la formación del enlace de amida a través de la reacción del grupo carboxilo del aminoácido con un grupo amino de otra molécula. El aminoácido puede estar en la configuración D o L. Los aminoácidos adecuados incluyen a-aminoácidos, ß-aminoácidos , ?-aminoácidos, d-aminoácidos , y e-aminoácidos, e incluyen no sólo los aminoácidos naturales (es decir, aquellos que se encuentran en los sistemas biológicos, incluyendo los veinte aminoácidos que se encuentran en las proteínas naturales), sino también las variantes de origen natural de tales aminoácidos, así como los aminoácidos sintéticos y sus análogos conocidos por los expertos en la técnica. Los Aminoácidos e emplificantes incluyen los veinte aminoácidos naturales, 4-hidroxiprolina, hidroxilisina, demosina, isodemosina, 3-metilhistidina, norvalina, beta-alanina, ácido gamma-aminobutírico, citrulina, homocisteína, homoserina, ornitina, y metionina sulfona.

El término "pirimidina" se refiere a un compuesto heteroaromático que contiene un anillo de benceno con dos átomos de carbono reemplazados por dos átomos de nitrógeno (diazina) . Por ejemplo, la siguiente porción que tiene los átomos de carbono en las posiciones 1 y 3 sustituidos por átomos de nitrógeno se considera una pirimidina: término, tal como se define en el presente documento, también incluye sus formas isoméricas de diazina, tales como piridazina, con los átomos de nitrógeno en las posiciones 1 y 2; y pirazina, con los átomos de nitrógeno en las posiciones 1 y 4. El término "pirimidina" también incluye de forma general sus análogos y derivados. Por ejemplo, las nucleobases naturales, citosina (C) , timina (T) , y uracilo (U) , son derivados de pirimidina. El término "purina" se refiere a un compuesto heteroaromático que contiene un anillo de pirimidina fusionado a un anillo de imidazol. El término "purina" también incluye de forma general sus análogos y derivados. Por ejemplo, las nucleobases naturales, adenina (A) y guanina (G) . Otros ejemplos de derivados de purina de origen natural son hipoxantina, xantina, teobromina, cafeína, ácido úrico, e isoguanina. Las purinas y pirimidinas ejemplificantes incluyen aquellas descritas en la patente Norteamericana No. 3,687,808; Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859; Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

El término "nucleobase" incluye todas las nucleobases naturales y sintéticas, asi como las nucleobases universales. Las nucleobases naturales típicas incluyen adenina, guanina, citosina, uracilo y timina. Las nucleobases sintéticas típicamente incluyen inosina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina o tubercidina. Como se usa aquí, una nucleobase universal es cualquier nucleobase modificada, no modificada, de origen natural o de origen no natural que puede sustituir más de una de las nucleobases naturales. Las bases universales contienen típicamente una porción de anillo aromático que puede o no contener átomos de nitrógeno y, en general que usan anillos aromáticos de apilamiento para estabilizar un dúplex oligonucleotidico . Algunas bases universales se pueden unir covalentemente al átomo de carbono C-l' de un azúcar pentosa para formar un nucleótido universal. Algunas bases universales no forman enlaces de hidrógeno específicamente con otra nucleobase. Algunas bases universales se aparean con todas las nucleobases naturales. Algunas bases universales -pueden interactuar con bases nucleótidicas adyacentes en la misma hebra de ácido nucleico mediante apilamiento hidrofóbico. Las nucleobases universales ejemplificantes incluyen, pero no se limitan a, 2,4- difluorotolueno, nitropirrolilo, nitroindolilo, 8-aza-7-desazaadenina, 4-fluoro-6-metilbenzimidazol , 4-met ilbenzimidazol , 3-metil isocarbostirililo, 5-metil isocarbost irililo, 3-metil-7-propinil isocarbostirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-imetil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinil, isocarbostirililo, 7-propinil isocarbostirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5 -trimetilfenilo, 4-metilinolilo, 4 , 6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbencilo, tetracenilo, pentacenilo, y los derivados estructurales de los mismos.

Las nucleobases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquidicos de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados alquidicos de adenina y guanina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, ß-azo uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 5-halouracilo, 5- (2 -aminopropil) uracilo, 5-amino alil uracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina, pirimidinas 5-sust ituidas , 6-azapirimidinas y purinas N-2, N-6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, dihidrouracilo, 3-desaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracilo, 7-alquilguanina, 5-alquil citosina, 7-desazaadenina, N6, N6-dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracilo, N3-metiluracilo, 1,2,4-triazoles sustituidos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-methoxiuracilo, ácido uracilo-5-oxiacético, 5-methoxicarbonilmetiluracilo , 5-metil-2-tiouracilo, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo, 5-met ilaminometil-2-tiouracilo, 3- (3-amino-3-carboxipropil) uracilo, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N4-acetil citosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N- 6-isopenteniladenina , N-met ilguaninas , y bases O-alquiladas . Otras purinas y pirimidinas incluyen aquellas descritas en la Patente Norteamericana No. 3,687,808; Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, páginas 858-859; Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, y Englisch et al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, cada uno de los cuales se incorpora aquí como referencia en su totalidad .

El término "nucleósido" se refiere a un compuesto que comprende una nucleobase, tal como se define en el presente documento, ligada a una pentosa en la posición 1' . Cuando la nucleobase es un derivado o análogo de purina, la pentosa se une típicamente a la nucleobase en la posición 9 del derivado o el análogo de purina. Cuando la nucleobase es un derivado o análogo de pirimidina, la pentosa se une típicamente a la nucleobase en la posición 1 de la pirimidina (por ejemplo, (por ejemplo,, Kornberg y Baker, DNA Replication, 2da Ed., Freeman, San Francisco, 1992, el cual se incorpora como referencia en su totalidad) . Cuando un nucleósido está presente en R3, R4, o R5 en el presente documento, el nucleósido puede estar conectado al átomo (s) vecino (s) a través de cualquier átomo en la nucleobase o la pentosa.

El término "ácido graso" se refiere de forma general a un ácido carboxilico con una cola (cadena) alifática) . La cadena alifática puede tener entre aproximadamente 2 y aproximadamente 36 átomos de carbono de longitud. Los ácidos grasos pueden estar saturados, insaturados, o poliinsaturados . La cadena alifática puede ser una cadena lineal o ramificada. El término "ácido graso" se puede usar en el presente documento para referirse a un "derivado de ácido graso", que puede incluir uno o más derivados de ácidos grasos diferentes, o mezclas de derivados de ácidos grasos. Los ácidos grasos e emplificantes incluyen ácidos grasos insaturados, ácidos grasos saturados, y diácidos; mono-, d¿- y tri-glicéridos de ascarósidos que tienen una funcionalidad de ácido carboxilico; hidroxiácidos , ? hidroxi ácidos, ?-l hidroxi ácidos, d±-hidroxi ácidos grasos (por ejemplo, dihidroxi ácidos grasos dihidroxilados que están omega- u omega-l-hidroxilados u hidroxilados , asi como ácidos grasos como alfa- o beta-hidroxilados ) .

El término "azúcar" se refiere a un compuesto que es o bien un hidrato de carbono per se, compuestos de una o más unidades de monosacáridos que tienen al menos 5 átomos de carbono (los cuales puede ser lineales, ramificados, o cíclicos) con un átomo de oxígeno, nitrógeno, azufre unido a cada átomo de carbono, o un compuesto que tiene, como una parte del mismo, una porción de carbohidrato compuesta de una o más unidades de monosacáridos cada una que tiene al menos 5 átomos de carbono (que puede ser lineal, ramificado o cíclico), con un átomo de oxígeno, nitrógeno o azufre unido a cada átomo de carbono. Los azúcares representativos incluyen los mono-, di-, tri-, y oligosacáridos que contienen desde aproximadamente 4-9 unidades de monosacáridos, y los polisacáridos tales como almidones, glucógeno, celulosa, y gomas de polisacáridos. Los ejemplos de monosacáridos incluyen azúcares de C5 o superiores (por ejemplo, azúcares de C5-C8 o de Ci,-C6) ; los di- y trisacáridos incluyen azúcares que tienen dos o tres unidades de monosacárido (por ejemplo, C5-C8 o C5-C8) - El término "monosacárido" significa una molécula de azúcar que tiene una cadena de 3-10 átomos de carbono en la forma de un aldehido (aldosa) o cetona (cetosa) . Los monosacáridos adecuados incluyen monosacáridos tanto de origen natural y sintético. Los monosacáridos adecuados incluyen triosas, tales como glicerosa y la dihidroxiacetona; textrosas tales como eritrosa y eritrulosa; pentosas, tales como xilosa, arabinosa, ribosa, ribulosa xilulosa; metil pentosas (6-desoxihexosas ) , tales como rhamnosa y fucosa; hexosas, tales como ascarilosa, glucosa, mañosa, galactosa, fructosa, y sorbosa; y heptosas, tales como glucoheptosa , galamannoheptosa, sedoheptulosa, y manoheptulosa . Los ejemplos de monosacáridos abarcan radicales que alosa, altrosa, arabinosa, cladinosa, eritrosa, eritrulosa, fructosa, D-fucitol, L-fucitol, fucosamina, fucosa, fuculosa, galactosamina, D-galactosaminitol , N-acetil-galactosamina, galactosa, glucosamina, N -acetil-glucosamina, glucosaminitol, glucosa, glucosa-6-fosfato, gulosa gliceraldehido , L-glicero-D-manosa-heptosa, glicerol, glicerona, gulosa, idosa, lixosa, manosamina, mañosa, manosa-6-fosfato, psicosa, quinovosa, quinovasamina, rhamnitol, rhamnosamina, rhamnosa, ribosa, ribulosa, sedoheptulosa, sorbosa, tagatosa, talosa, ácido tartárico, treosa, xilosa, y xilulosa. El monosacárido puede estar en la configuración De o L. Un monosacárido típico utilizado en el presente documento es la hexosa.

El monosacárido puede ser además un desoxi azúcar (grupo hidroxi alcohólico sustituido por hidrógeno) , amino azúcar (grupo hidroxi alcohólico reemplazado por grupo amino) , un tio azúcar (grupo hidroxi alcohólico reemplazado por tiol, o C= 0 reemplazado por C=S, o un oxígeno del anillo de forma cíclica reemplazado por azufre) , una seleno azúcar, una teluro azúcar, un aza azúcar (carbono del anillo reemplazado por nitrógeno) , una imino azúcar (oxígeno del anillo reemplazado por nitrógeno) , una fosfano azúcar (oxigeno del anillo reemplazado con fósforo) , un fosfa azúcar (carbono del anillo reemplazado con fósforo) , un monosacárído C-sustituido (hidrógeno en un átomo de carbono no terminal reemplazado con carbono) , un monosacárído insaturado, un alditol (grupo carbonilo reemplazado con un grupo CHOH) , ácido aldónico (grupo aldehídico reemplazado por grupo carboxi) , un ácido cetoaldónico, un ácido urónico, un ácido aldárico, y así sucesivamente. Los amino azúcares incluyen amino monosacáridos , tales como galactosamina, glucosamina, manosamina, fucos'amina, quinovasamina, ácido neuramínico, ácido murámico, lactosediamina, acosamina, bacilosamina, daunosamina, desosamina, forosamina, garosamina, kanosamina, kansosamina, micaminosa, micosamina, perosamina, pneumosamina, purpurosamina, rodosamina. Se entiende que el monosacárído y los similares pueden estar sustituidos adicionalmente .

Los términos "disacárido" , "trisacárido" , y "polisacárido" abarcan los radicales de abecuosa, acrabosa, amicetosa, amilopectina, amilosa, apiosa, arcanosa, ascarilosa, ácido ascórbico, boivinosa, celobiosa, celotriosa, acelulosa, chacotriosa, chalcosa, quitina, colitosa, ciclodextrina, cimarosa, dextrina, 2-desoxirribosa, 2-desoxiglucosa, diginosa, digitalosa, digitoxosa, evalosa, evemitrosa, fructoologosacarido, galto-oligosacárido, gentianosa, gentiobiosa, glucano, glucógeno, glucógeno, hamamelosa, heparina, inulina, xsolevoglucosenona, isomaltosa, isomaltotriosa, isopanosa, kojibiosa, lactosa, lactosamina, lactosediamina , laminarabiosa , levoglucosano, levoglucosenona, [beta] -maltosa, maltriosa, manano-oligosacáridos , manninotriosa, melecitosa, melibiosa, ácido murámico, micarosa, micinosa, ácido neuraminico, nigerosa, noj irimicina, moviosa, oleandrosa, panosa, paratosa, planteosa, primeverosa, raffmosa, rodinosa, rutinosa, sarmentosa, sedoheptulosa, solatriosa, soforosa, estaquiosa, estreptosa, sacarosa, a, -trehalosa, trehalosamina, turanosa, tivelosa, xilobiosa, umbeliferosa, y los similares. Además, se entiende que el "disacárido" , "trisacárido" , y "polisacárido" y los similares pueden estar sustituidos adicionalmente . El disacárido también incluye amino azúcares y sus derivados, en particular, una micaminosa derivatizado en la posición C-4' o una desoxi-3-amino-glucosa derivatizada en la posición C-6' .

El término "policíclico" o "multi-cíclico" usado aqui indica una estructura molecular que tiene dos o más anillos, incluyendo, pero no limitados a, anillos fusionados, en puente, o espiro.

Los radicales "alquilo", "alquenilo", "cicloalquilo" , y "cicloalquenilo" anteriores, así como el sistema de anillos de los grupos arilo, heterociclilo, o heteroarilo anteriores, puede estar opcionalmente sustituido.

El término "sustituido" u "opcionalmente sustituido" se utiliza para indicar que un grupo puede tener un sustituyente en cada átomo sustituible del grupo (incluyendo más de un sustituyente en un solo átomo), a condición de que la valencia normal del átomo designado no sea superada y la identidad de cada sustituyente sea independiente de los otros. De acuerdo con la presente invención, hasta tres átomos de H en cada residuo pueden ser sustituidos con alquilo, halógeno, haloalquilo, alquenilo, haloalquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, hidroxi, alcoxi, acilo, carboxi, carboalcoxi (conocido también como alcoxicarbonilo), carboxamido (conocido también como alquilaminocarbonilo) , ciano, carbonilo, nitro, amino, alquilamino, dialquilamino, mercapto, alquiltio, sulfóxido, sulfona, acilamino, amidino, arilo, heteroarilo, heterociclilo, ariloxi, heteroariloxi , una purina o piridimina o un análogo o derivado de los mismos (tal como se define en "nucleobase" ) , o un azúcar tal como un monosacárido que tenga 5 o 6 átomos de carbono (tal como se define en "monosacárido") . Los átomos "no sustituidos" tienen todos los átomos de hidrógeno dictados por su valencia. Cuando un sustituyente es ceto (es decir, = O) , entonces se reemplazan dos hidrógenos en el átomo. Las combinaciones de sustituyentes y/o variables son permisibles sólo si tales combinaciones dan como resultado compuestos estables; por "compuesto estable" o "estructura estable" se entiende un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir al aislamiento hasta un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y su formulación en un agente eficaz.

En la caracterización de algunos de los sustituyentes, ciertos sustituyentes pueden combinarse para formar anillos. A menos que se indique lo contrario, se pretende que tales anillos puedan presentar diversos grados de insaturación (de completamente saturado a totalmente insaturado) , puedan incluir heteroátomos , y puedan estar sustituidos con otros grupos sustituyentes como se describió anteriormente.

Los compuestos descritos aqui pueden contener uno o más centros asimétricos y por lo tanto pueden dar lugar a enantiómeros , diastereómeros , y otras formas estereoisoméricas . Cada centro quiral puede ser definido, en términos de la estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-. La presente invención está realizada para incluir todos estos isómeros posibles, así como mezclas de los mismos, incluyendo formas racémicas y ópticamente puras. Los isómeros ópticamente activos (R) y (S), (-) y ( + ) , o (D) y (L) se pueden preparar usando sintones quirales o reactivos quirales, o resolverse usando la técnicas convencionales. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen enlaces dobles u otros centros de asimetría geométrica, y a menos que se especifique lo contrario, se pretende que los compuestos incluyan isómeros geométricos tanto E y Z. Del mismo modo, todas las formas tautoméricas también deben ser incluidas. La configuración de cualquier doble enlace carbono-carbono que aparezca en el presente documento se selecciona solo por conveniencia y no se pretende designar una configuración particular, por lo tanto un enlace doble carbono-carbono se representa arbitrariamente aqui como trans puede ser Z, E, o una mezcla de los dos en cualquier proporción.

El término "compuestos de la invención" y las expresiones equivalentes, pretende abarcar los profármacos, las sales farmacéuticamente aceptables, los óxidos, los solvatos, por ejemplo hidratos, y los complejos de inclusión de ese compuesto, cuando el contexto lo permita, asi como cualquier forma estereoisomérica, o una mezcla de cualquiera de tales formas de ese compuesto en cualquier proporción, a menos que se especifique lo contrario. Los complejos de inclusión se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19na Ed. 1: 176-177 (1995), que se incorpora aqui como referencia en su totalidad. Los complejos de inclusión más comúnmente empleados son aquellos con ciclodextrinas , y todos los complejos de ciclodextrina, naturales y sintéticos, están abarcados específicamente en las reivindicaciones. Por lo tanto, de acuerdo con algunas modalidades de la invención, los compuestos como se describe en el presente documento, incluyendo en los contextos de la composiciones farmacéuticas, los métodos de tratamiento, y los compuestos per se, se proporcionan como una forma salina. Del mismo modo, la referencia a los intermedios o intermediarios, ya sea o no que ellos mismos sean reivindicados, deben abarcar sus sales y solvatos, cuando el contexto asi lo permita. Por motivos de claridad, algunas veces se indican casos particulares en texto cuando el contexto asi lo permita, pero estos casos son puramente ilustrativos y no pretenden excluir otros casos cuando el contexto asi lo permita.

También se contempla la "cuaternización" de cualquier grupo que contenga nitrógeno básico, de los compuestos descritos en este documento. El nitrógeno básico puede ser cuaternizado con cualquier agente conocido para aquellos expertos con experiencia ordinaria en la técnica incluyendo, por ejemplo, haluros de alquilo inferior, tales como metilo, etilo, propilo y cloruro, bromuros y yoduros de butilo; sulfatos de dialquilo incluyendo sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo; haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, y haluros de aralquilo incluyendo bromuros de bencilo y fenetilo. Los productos solubles o dispersables en agua o en aceite se pueden obtener por medio de dicha cuaternización.

Un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método para modificar el comportamiento de los nematodos. Este método implica la administración de uno o más compuestos moduladores aislados a los nematodos, en condiciones eficaces para modificar el comportamiento de los nematodos. En este aspecto de la presente invención, el uno o más compuestos moduladores es (i) un compuesto de Fórmula I: donde : R1 es H, -C(R)3r -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R1' está ausente, H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R2 es un grupo de fórmula donde : cada R1 es independientemente H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R5 es H, -OH, -0R6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I; donde : R° y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -0R , -C(0)R , -NHC(0)RB, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo , un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo, y R8 es H , -C(R)3, - [ C (R) 2] níNHC (0) R9, - [ C (R) 2] n<jC ( O ) ( NH ) R9, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; Rs es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R) 3 , -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H , halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, ~ [C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (O) (NH) R9, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo , un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde: cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R) 3 , -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R) 3 , -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n es un número entero de 1 a 30; n1, n2, y n3 son cada uno independientemente un número entero de 0 a 30; y n4 es un número entero de 1 a 30; y la suma de n1, cada n2, y cada n3 es de 1 a 30; R3 y R4 son cada uno independientemente H, -CR6R7R8, -C(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R5 de otra unidad de Fórmula I; donde : R6 y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -OR, -N(R)2/ halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -OR8, -C (0) R8, -NHC (O) R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y R8 es H, -C(R)3, - [C (R) 2] n4NHC (0) R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde: cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -OR, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, - [C (R) 2]n4NHC (O) R9, - [C (R) 2] n4C (O) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina , o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sust ituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sust ituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y cada R5 es independientemente H, -OH, -0R6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, - NHR6, -NR6R7, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo , un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I; donde : R6 y R7 son cada uno independientemente H, -CR3, -OR, -N(R)2 halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, o un cicloalquenilo, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -OR8, -C(0)R8, -NHC(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y R8 es H, -C(R)3, -[C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -OR, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un grupo arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes independientemente seleccionados del grupo que consiste de -C(R) 3, -0R, -C (0) R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; y R8 es H, -C(R)3, - [C(R)2]n4NHC(0)R9, - [C (R) 2] n4C (0) (NH) R9, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; donde : cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; R9 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, donde el alquilo, alquenilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o monosacárido está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de -C(R)3, -0R, -C(0)R, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, y un cicloalquilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo; y n4 es un número entero de 1 a 30; o (ii) un compuesto que comprende: al menos una nucleobase, al menos un ácido graso, al menos un aminoácido, y al menos un azúcar; donde la al menos una nucleobase, el al menos un ácido graso, el al menos un aminoácido, y el al menos un azúcar están unidos por enlaces covalentes; y donde el compuesto tiene un peso molecular menor a aproximadamente 2000 g/mol; con la condición de que el nematodo no sea una especie Caenorhabditis .

Como será entendido por aquellas personas experimentadas en la técnica, la administración de acuerdo con este aspecto de la presente invención pueden incluir, poner directamente en contacto los nematodos con uno o más compuestos moduladores, y/o poner en contacto una ubicación susceptible a los nematodos con el uno o más compuestos moduladores, siempre y cuando el uno o más compuestos moduladores se administran de tal manera que sean capaces de afectar el comportamiento de los nematodos.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, los uno o más compuestos moduladores son compuestos de Fórmula I. Los compuestos moduladores adecuados de acuerdo con esta modalidad incluyen uno o más compuestos moduladores aislados de Fórmula I' o de Fórmula I'': Los compuestos moduladores adecuados de acuerdo con esta modalidad también incluyen uno o más compuestos moduladores aislados de la Fórmula I en los cuales se cumple al menos una de las siguientes condiciones: (I) R1 es independientemente -C(R' )3, -0R, -N(R)2, halógeno, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; en donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo, y cada R' es independientemente halógeno o un alquenilo; y R1' está independientemente ausente, o es independientemente H, -C(R)3, -0, - (R)2r halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; (ii) R2 es en donde: cada es independientemente un enlace sencillo o doble ; q1 q2 Y q3 son cada uno independientemente un número entero de 1 a 26; q4 y q5 son cada uno independientemente un número entero de 0 a 26; la suma de q1, q2, q3, q4, y q5 es menor o iqual a 28; y la suma de q4 y q5 es mayor o igual a 2; (iii) R5 es H, -0R6, -OCR6R7R8, -CR6R7R8, -NH2, -NR6R7, halógeno, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, o un nucleósido; (iv) R5 es un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I, formando un compuesto que contiene al menos dos unidades de Fórmula I; (V) R3 y R4 son cada uno independientemente -CR6R7R8, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, o -(C0)R8, en donde R8 es H, -C(R)3, " [C (R) 2] n HC (O) R9, - [C (R) 2] n C (0) (NH) R9, -0R,-N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, una purina, una pirimidina, o un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, en donde el alquilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, purina, pirimidina, o el monosacárido está sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados independientemente del grupo que consiste de-C(R) 3 , -0R9, -C(0)R9, -NHC(0)R9, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, y un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono; (vi) el compuesto es un compuesto de Fórmula I''; con la condición de que el compuesto no sea En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, el uno o más compuestos moduladores es un compuesto que comprende al menos una nucleobase, al menos un ácido graso, al menos un aminoácido, y al menos un azúcar.

En este y en todos los aspectos de la presente invención, un compuesto modulador individual o una combinación de compuestos moduladores pueden ser administrados.

En este aspecto de la presente invención, el nematodo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste de los nematodos parásitos de plantas y nematodos entomopatogenos.

Los nematodos parásitos de plantas adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen Acontylus, Afenestrata, Aglenchus, Allotrichodorus, Allotylenchus, Amplimerlinius , Anguina, Antarctenchus , Antarctylus, Aorolaimus, Aphasmatylenchus , Aphelenchoides, Apratylenchoides , Atalodera, Atetylenchus , Atylenchus, Axodorylaimellus , Axonchium, Bakernema, Basiria, Basirienchus , Bellodera, Belondira, Belonolaimus , Bitylenchus, Blandicephalonema, Boleodorus, Brachydorus, Bursadera, Bursaphelenchus , Cacopaurus, Cactodera, Caloosia, Campbellenchus , Carphodorus, Cephalenchus , Chitinotylenchus, Coslenchus, Criconema, Criconemella, Criconemoides, Crossonema, Cryphodera, Cucullitylenchus , Cynipanguina, Discocriconemella , Ditylenchus, Dolichodera, Dolichodorus, Dolichorhynchus , Dorylaimellus , Duotylenchus , Ecphyadophora, Ecphyadophoroides , Epicharinema, Eutylenchus, Geocenamus, Globodera, Gracilacus, Gracilancea, Halenchus, Helicotylenchus , Hemicriconemoides , Hemicycliophora, Heterodera, Hirschmanniella, Hoplolaimus, Hoplotylus, Hylonema, Immanigula, Irantylenchus, Laimaphelenchus, Lelenchus, Longidorella, Longidorus, Loofia, Macrotrophurus, Malenchus, Meloidodera, Meloidoderella, Meloidoderita, Meloidogyne, Meloinema, Merlinius, Mesocriconema, Metaxonchium, Miculenchus, Mitranema, Monotrichodorus , orulaimus , Mukazia, Nacobbodera, Nacobbus, Nagelus, Neodolichodorus , Neodolichorhynchus, Neopsilenchus, Neothada, Nimigula, Nothocriconema, Nothocriconemoides, Ogma, Opailaimus, Paralongidorus , Pararotylenchus , Paratrichodorus , Paratrophurus , Paratylenchus , Pateracephalonema, Phallaxonchium, Pleurotylenchus , Polenchus, Pratylenchoides , Pratylenchus , Probelondira, Pseudhalenchus , Psilenchus, Pterotylenchus , Punctodera, Quinisulcius , Radopholus, Rhizonema, Rotylenchulus , Rotylenchus, Sarisodera, Sauertylenchus , Scutellonema , Scutylenchus , Senegalonema, Siddiqia, Sphaeronema, Subanguina, Swangeria, Sychnotylenchus, Syncheilaxonchium, Telotylenchus , Tetylenchus, Thada, Thecavermiculatus , Trichodorus, Trichotylenchus , Triversus, Trophonema, Trophotylenchulus , Trophurus, Tylenchocriconema, Tylenchorhynchus, Tylenchulus, Tylenchus, Tylodorus, Verutus, Xenocriconemella, Xiphinema, y Zygotylenchus .

Los nematodos entomopatógenos adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen Steinernema abbasi, Steinernema aciari, Steinernema affine, Steinernema akhursti, Steinernema anatoliense, Steinernema Apuliae, Steinernema arenarium, Steinernema Ashiuense, Steinernema asiaticum, Steinernema australe, Steinernema backanese, Steinernema bedding, Steinernema biocornutum, Steinernema ceratphorum, Steinernema cholashansense, Steinernema citrae, Steinernema cubanum, Steinernema cumgarense, Steinernema diaprepsi, Steinernema eapokense, Steinernema everestense, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Steinernema guangdongense , Steinernema hebeinse, Steinernema hermaphroditum, Steinernema ichnusae, Steinernema intermedium, Steinernema jollieti, Steinernema karii, Steinernema khoisanae, Steinernema kraussei, Steinernema kushidai, Steinernema leizhouense, Steinernema lici, Steinernema litorale, Steinernema longicaudatum, Steinernema monticolum, Steinernema neocurtillae, Steinernema oregonense, Steinernema pakistanense , Steinernema phyllogphagae, Steinernema puertoricense , Steinernema rarum, Steinernema riobrave, Steinernema ritteri, Steinernema robustispiculum, Steinernema sangi, Steinernema sasonense, Steinernema scapterisci, Steinernema scarabaei, Steinernema schliemanni, Steinernema siamkayai, Steinernema sichuanense, Steinernema silvaticum, Steinernema tami, Steinernema texanum, Steinernema thanhi, Steinernema websteri, Steinernema weiseri, Steinernema yirgalemense, Heterorhabditis amazonensis, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis baujardi, Heterorhabditis downesi, Heterorhabditis floridensis, Heterorhabditis indica, Heterorhabditis marelatus, Heterorhabditis megidis, Heterorhabditis mexicana, Heterorhabditis taysearae, Heterorhabditis zealandica, y Heterorhabditis sonorensis.

El comportamiento de los nematodos de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluye la reproducción, el desarrollo, la formación de larvas dauer, la agregación, la atracción, la repulsión, la dispersión, la disuasión, la alimentación, la búsqueda de anfitriones, y la invasión del anfitrión .

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método para la promoción o la inhibición de la reproducción en una población de nematodos. Este método implica la administración de uno o más compuestos moduladores aislados a la población en condiciones eficaces para promover o inhibir la reproducción en la población de nematodos. En este aspecto de la presente invención, el uno o más compuestos moduladores aislados se selecciona del grupo que consiste de ascr#l; ascrf 3; ascr#7; ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; una combinación de ascr#9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20, y una combinación de ascr#9 y ascr#22.

Los compuestos moduladores aislados adecuados para promover la reproducción de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen ascr#l, ascr#3, ascr#7, ascr#8, y ascr#10. Estos compuestos moduladores pueden usarse para atraer a los nematodos machos y/ hembras, aumentando de este modo la oportunidad para el apareamiento.

Los compuestos moduladores aislados adecuados para inhibir la reproducción de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen ascr#9; ascr#10; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; una combinación de ascr#9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20, y una combinación de ascr#9 y ascr#22. Estos compuestos moduladores se pueden utilizar para repeler a los nematodos machos y/o hembras, reduciendo de este modo la oportunidad para el apareamiento.

Los nematodos adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen Meloidogyne javanica, Meloidogyne floridensis, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne hapla, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica y Heterorhabditis floridensis.

Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a un método para promover o inhibir la agregación de los nematodos en una primera ubicación. Este método implica (i) poner en contacto la primera ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados en condiciones eficaces para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, o (ii) poner en contacto una segunda ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones eficaces para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, donde la primera ubicación y la segunda ubicación están separadas para permitir que dicho contacto en la segunda ubicación tenga un efecto sobre la agregación de nematodos en la primera ubicación. En este aspecto de la presente invención, los uno o más compuestos moduladores aislados se seleccionan del grupo que consiste de ascril; ascr#2; ascr#3; ascr#7; ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascrlll; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; icas#9; oscr#10, una combinación de ascr#9 y ascrtlO; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20; una combinación de ascr#9 y ascr#22; una combinación de ascr#2, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9 y oscr#9, y una combinación de ascr#9, oscr#9 y ascr#ll.

Los compuestos moduladores aislados adecuados para la promoción de la agregación de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen ascril, ascr#3, ascr#7, ascr#8, y ascrtlO . Estos compuestos moduladores pueden usarse para atraer nematodos machos y/o hembras, aumentando de este modo la agregación.

Los compuestos moduladores aislados adecuados para inhibir la agregación de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen ascr#2; ascr#3; ascr#8; ascr#9; ascr#10; ascrtll; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; icas#9; oscr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20; una combinación de ascr#9 y ascr#22; una combinación de ascr#2, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9, ascr#3, ascr#8 e icas#9; una combinación de ascr#9 y oscr#9, y una combinación de ascr#9, oscr#9 y ascr#ll. Estos compuestos moduladores se pueden utilizar para repeler nematodos machos, hembras, y/o larvarios, disminuyendo de ese modo la agregación.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, la primera ubicación puede ponerse en contacto con uno o más compuestos moduladores que atraen a los nematodos deseables a la ubicación.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, la primera ubicación se puede poner en contacto con uno o más compuestos moduladores que repelen a los nematodos indeseables que ya se encuentran en la primera ubicación o que disuaden a los nematodos indeseables de acercarse a la primera ubicación .

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, la segunda ubicación se puede poner en contacto con uno o más compuestos moduladores que atraen a los nematodos indeseables a la segunda ubicación y alejarlos de la primera ubicación. En estas modalidades, la segunda ubicación opcionalmente puede ponerse en contacto opcionalmente con una toxina que es perjudicial para los nematodos. Las toxinas de nematodos adecuadas incluyen, sin limitación, el quitosano, abamectina, torta de nim, extracto de caléndula, hongos nematófagos, Aldicarb, y Dazomet.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, la segunda ubicación puede ser puesta en contacto con uno o más compuestos moduladores que repelen/disuaden a los nematodos deseables de la segunda ubicación a la primera ubicación .

Las modalidades en las cuales, tanto la primera ubicación y la segunda ubicación están en contacto con uno o más compuestos moduladores también se contemplan. Por ejemplo, la primera ubicación puede ponerse en contacto con uno o más compuestos moduladores que atraen a los nematodos deseables a la primera ubicación, mientras que la segunda ubicación se pone en contacto con uno o más compuestos moduladores que repelen/disuaden a los nematodos deseables lejos de la segunda ubicación a la primera ubicación. Alternativamente o adicionalmente , la primera ubicación puede ser puesta en contacto con uno o más compuestos moduladores que repelen/disuaden a los nematodos indeseables de la primera ubicación, mientras que la segunda ubicación se pone en contacto con uno o más compuestos moduladores que atraen a los nematodos indeseables lejos de la primera ubicación.

Como será evidente para los expertos con experiencia ordinaria en la técnica, cuando la segunda ubicación se pone en contacto con uno o más compuestos moduladores, la segunda ubicación se debería estar lo suficientemente cercana a la primera ubicación para que uno o más compuestos moduladores tengan un efecto sobre la agregación en la primera ubicación. Preferiblemente, la segunda ubicación está a una distancia de entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 200 cm de la primera ubicación. Como será evidente para aquellas personas experimentadas en la técnica, las distancias adecuadas dependerán, entre otras cosas, del tamaño de las plantas e incluyen, por ejemplo, entre aproximadamente 1 cm y aproximadamente 50 cm, entre aproximadamente 2 cm y aproximadamente 50 cm, entre aproximadamente 2 cm y 200 cm, entre aproximadamente 50 cm y aproximadamente 200 cm, aproximadamente 1 cm, aproximadamente 2 cm, aproximadamente 50 cm, y aproximadamente 200 cm.

A modo de ejemplo, uno o más de los compuestos moduladores que repelen/disuaden a los nematodos indeseables se pueden colocar en un perímetro alrededor de la primera ubicación (por ejemplo, una ubicación susceptible de albergar a los nematodos), para evitar que los nematodos no deseados fuera del perímetro se muevan hacia la primera ubicación. Alternativamente, uno o más de los compuestos moduladores que repelen/disuaden a los nematodos deseables se pueden colocar en un perímetro alrededor de la primera ubicación, para evitar que los nematodos deseables dentro del perímetro se alejen de, o escapen del interior del perímetro de la primera ubicación. En este último ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden usar en conjunto con la aplicación de los nematodos deseables en si a la primera ubicación.

En una modalidad de este aspecto de la presente invención, la primera ubicación es una planta (incluyendo, por ejemplo, partes de la planta tales como las raíces) . En otra modalidad, la primera ubicación es una población de insectos. Las modalidades en la que la primera ubicación es una población de insectos en una planta también se contemplan. Otras primeras ubicaciones adecuadas incluyen el suelo (por ejemplo, al lado de raíces de las plantas), arena, arcilla, sustratos de cultivo artificiales, turba y musgo.

Cuando la primera ubicación está en una planta, nematodos deseables son aquellos que son beneficiosos para la planta, y los nematodos no deseables son aquellos que son perjudiciales para la planta. Cuando la primera ubicación está en una población de plagas de insectos (por ejemplo, insectos que son perjudiciales para las plantas) , los nematodos deseables son aquellos que son per udiciales para los insectos y los nematodos indeseables son aquellos que son beneficiosos para los insectos. Cuando la primera ubicación está en una población de insectos que son benéficos (por ejemplo, insectos benéficos para las plantas) , los nematodos deseables son aquellos que son beneficiosos para los insectos, y los nematodos no deseables son aquellos que son perjudiciales para los insectos.

Los nematodos dañinos para las plantas de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención incluyen aquellos que infectan a las plantas en si, asi como aquellos que infectan a los insectos que son beneficiosos para las plantas .

Los nematodos dañinos para las plantas de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención incluyen aquellos que infectan las plantas en si, asi como aquellos que infectan a los insectos que son benéficos para las plantas. Los nematodos que infectan a las plantas y/o que infectan a los insectos beneficios para las plantas de acuerdo con la presente invención incluyen Meloidogyne javanica, Meloidogyne floridensis, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne hapla, Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora , Heterorhabditis zealandica , y Heterorhabdit is floridensis.

Los nematodos beneficiosos para las plantas de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención incluyen aquellos que infectan a los insectos parásitos de las plantas y/o los nematodos parásitos de las plantas. Los nematodos que infectan a los insectos parásitos de las plantas y/o los nematodos parásitos de las plantas de acuerdo con la presente invención incluyen Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica, y Heterorhabditis floridensis.

Los nematodos nocivos para los insectos, es decir, los nematodos entomopatogenos, son aquellos que infectan a los insectos. En algunas modalidades, los nematodos entomopatogenos infectan a los insectos parásitos de las plantas. En otras modalidades, los nematodos entomopatogenos infectan a los insectos benéficos para las plantas. Los nematodos entomopatogenos que infectan a los insectos parásitos de las plantas de acuerdo con la presente invención incluyen Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica, y Heterorhabditis floridensis. Los nematodos entomopatogenos que infectan a los insectos benéficos para las plantas de acuerdo con la presente invención incluyen Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica, y Heterorhabditis floridensis.

Las plantas adecuadas de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención que implican plantas incluyen, sin limitación, plantas dicotiledóneas y monocotiledóneas . Más particularmente, las plantas de cultivo útiles pueden incluir, sin limitación, alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, camote, frijol, haba verde, cera de haba, alubia de lima, guisantes, achicoria, lechuga, escarola, col, col de Bruselas, remolacha, remolacha azucarera, chirivia, nabo, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, la cebolla, el ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabaza, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales adecuadas incluyen, sin limitación, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel, y zinnia.

Los insectos parásitos de las plantas adecuados de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención que implican insectos incluyen, sin limitación, el barrenador europeo del maíz, gusano soldado, gusano falso medidor, Helicoverpa zea, gusano cogollero, Plutella xylostella, gusano de la col, gusano de la cebolla, gusano de las semillas del maíz, Diaphania nitidalis (gusano del melón) , gusano de la pimienta, y lombriz intestinal del tomate. El barrenador europeo del maíz es una de las principales plagas del maíz (maíz dentado y dulce) , pero también se alimenta de más de 200 especies de plantas, incluidas las judías verdes, habas de cera, habas, soya, pimientos, papas, tomate, y muchas especies de maleza. Las plagas vivas de larvas de insectos adicionales que dañan una amplia variedad de cultivos vegetales incluyen, sin limitación, gusano soldado, gusano falso medidor, Helicoverpa zea, el gusano cogollero, polilla de la col, gusano de raíz de la col, gusano de la cebolla, gusano de semillas del maíz, Diaphania nitidalis (gusano del melón), gusano de la pimienta y lombriz intestinal del tomate. En conjunto, este grupo de plagas de insectos representa el grupo económicamente más importante de plagas para la producción de hortalizas en todo el mundo.

El contacto de acuerdo con este y todos los aspectos de la presente invención puede llevarse a cabo a través de una variedad de procedimientos que serán evidentes para aquellas personas experimentadas. Los métodos de aplicación adecuados incluyen la pulverización a alta o baja presión, inmersión, atomización, la formación de espuma, nebulización, revestimiento, e incrustación. Otros procedimientos de aplicación adecuados o pueden ser ideados por aquellas personas experimentadas en la técnica.

Los compuestos moduladores de la presente invención se pueden aplicar a la primera y/o la segunda ubicación de conformidad con la presente invención individualmente o en una mezcla con otros materiales. Alternativamente, los compuestos moduladores de la presente invención se pueden aplicar por separado con otros materiales que se aplican en diferentes momentos. Los otros materiales adecuados incluyen cantidades eficaces de otros productos químicos agrícolas u hortícolas, tales como herbicidas (por ejemplo, glifosato) , insecticidas (cuando se utilizan contra los insectos perjudiciales), nematicidas (cuando se utiliza contra los nematodos indeseables) , molusquicidas , bactericidas, acaricidas, fungicidas y/o reguladores del crecimiento de las plantas.

En al menos una modalidad, el contacto incluye la aplicación directa a las plantas. Todo o parte de las plantas, incluyendo, sin limitación, las hojas, tallos, raíces, los propágulos (por ejemplo, esquejes), frutas, etc., puede ponerse en contacto con los uno o más compuestos moduladores. El contacto también se puede llevar a cabo indirectamente, a través de la aplicación, por ejemplo, a sustratos de suelo o de otras plantas. La aplicación de los uno o más compuestos moduladores a las pantas puede llevarse a cabo a una velocidad de aproximadamente 0.1 a 10,000 g/ha del compuesto modulador. Preferiblemente, la aplicación a una las plantas se lleva a cabo a una velocidad de alrededor de 10 a 1, 000 g/ha del compuesto modulador.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de la infección por parásitos de las plantas. Este método implica: (i) poner en contacto las plantas con uno o más compuestos moduladores aislados bajo condiciones efectivas para tratar o prevenir la infección por parásitos de las plantas, o (ii) poner en contacto una segunda ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados en condiciones eficaces para tratar o prevenir la infección por parásitos de las plantas, donde las plantas y la segunda ubicación están separadas para permitir dicho que contacto con la segunda ubicación para tener un efecto sobre la infección por parásitos de las plantas. En este aspecto de la presente invención, el parásito es un nematodo o un insecto y los uno o más compuestos moduladores aislados se seleccionan del grupo que consiste de ascr#l; ascr#2; ascr#3; ascrf 7; ascrf 8 ; ascr#9; ascr#10; ascrtll; ascr#16; ascr#18; ascr#20; ascr#22; icas#9; oscr#10; una combinación de ascr#9 y ascr#10, una combinación de ascr#9 y ascr#16; una combinación de ascr#9 y ascr#18; una combinación de ascr#9 y ascr#20; una combinación de ascr#9 y ascr#22; una combinación de ascr#2, ascr#3, ascr#8, e icas#9; una combinación de ascr#9, ascr#3, ascr#8, e icas#9; una combinación de ascr#9 y oscr#9, y una combinación de ascr#9, oscr#10 y ascr#ll.

El tratamiento y/o la prevención de la infección del parásito de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen la reducción del grado de infección ya presente en las plantas, asi como la prevención de que la infección se produzca en primer lugar. Cuando el parásito es un nematodo, el tratamiento y/o la prevención incluye el uso de uno o más compuestos moduladores que afecten al nematodo parásito en si, y/o el uso de uno más compuestos moduladores que afecten a los nematodos que son perjudiciales para el nematodo parásito. Cuando el parásito es un insecto, el tratamiento y/o la prevención incluyen el uso de uno o más compuestos moduladores que afecten a los nematodos que son perjudiciales para el parásito de insectos.

Como será evidente para el experto en la materia, las diversas modalidades indicadas anteriormente para poner en contacto la primera y/o sequnda ubicación con uno o más compuestos moduladores también son relevantes aqui, la primera ubicación que es la planta objetivo en este aspecto de la presente invención.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, el parásito es un nematodo. Los nematodos parásitos adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen Meloidogyne javanica, Meloidogyne floridensis, Meloidogyne incógnita, y Hapla Meloidogyne. Los nematodos adecuados que son perjudiciales para los parásitos nematodos incluyen Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica y Heterorhabditis floridensis.

En al menos una modalidad de este aspecto de la presente invención, el parásito es un insecto. Los insectos adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen los insectos parásitos de las plantas identificadas anteriormente. Los nematodos entomopatógenos adecuados de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen Steinernema riobrave, Steinernema diaprepesi, Steinernema carpocapse, Steinernema feltiae, Steinernema glaseri, Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica, y Heterorhabditis floridensis.

Las plantas adecuadas de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen las identificadas anteriormente.

La presente invención puede ilustrarse adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos tienen a intención de ilustrar, pero de ningún modo tienen la intención de limitar, el ámbito de la presente invención tal como se expone en las reivindicaciones anexas.

Ejemplo 1 - Instrumentación y Procedimientos Analíticos Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se registraron en un Varían INOVA 600 RMN (600 MHz para XH, 151 MHz para 13C) . Los Espectros de RMN se procesaron utilizando el Varían VNMR y paquetes informáticos MestreLabs MestReC. El procesamiento adicional de los mapas de bitios derivados de los espectros de RMN se realizó usando Adobe Photoshop CS3 como se describe en Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El análisis de cromatografía de líquidos de alta resolución-espectrometría de masas (HPLC- S) se realizó utilizando un sistema Agilent Serie 1100 HPLC equipado con un detector de matriz de diodos y conectado a un espectrómetro Quattro II (Micromass/Waters) . La adquisición y el procesamiento de datos se controlaron por medio del paquete informático MassLynx. La cromatografía ultrarrápida se realizó usando un sistema Teledyne ISCO CombiFlash.

Ejemplo 2 - Cepas de C. elegans y Métodos Generales de - Cultivo Todas las cepas se mantuvieron a 20°C, a menos que se indique lo contrario, en placas de agar NGM, hechas con agar Bacto (BD Biosciences) y se sembraron con bacterias OP50 cultivadas durante toda la noche. La variedad de C. elegans N2 Bristol y los machos de la cepa de him-5(el490) CB1490 se utilizaron para los bioensayos de atracción y los experimentos de seguimiento automatizado. El mutante him-5(el490) segrega progenie macho XO por la no disyunción del cromosoma X durante la meiosis (Hodgkin et al., Genetics 91:67-94 (1979), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La cepa transgénica PS6025 qrls2 [ sra-9 : :mCaspl ] , la cual expresa la caspasa de mamífero en las neuronas ASK bajo la influencia del promotor SRA-9 (regalo de Tokumitsu akabayashi, Iwate University) , se utilizó para la extirpación genética de las neuronas ASK . Otras cepas utilizadas son las siguientes: CB4856, aislado Hawaii de C. elegans (Hodgkin y Doniach, Genetics 146: 149-64 (1997), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad); RC301, aislado Freiburg de C. elegans (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Hodgkin y Doniach, Genetics 146: 149-64 (1997), que se incorporan aquí como referencia en su totalidad); DA609 npr-1 (ad609) ; CX4148 npr-l{kyl3) (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad); C. elegans CX9740 (N2); kyEx2144 [ncs-l::GFP] (Macosko et al., Nature 458: 1171-75 (2009), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad); N2; . Ex (gcy-28 : :dp: :mec-4D) (Shinkai et al., J. Neurosci. 31:3007-15 (2011), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) ; CX10981 kyEx2866 [ "ASK: : GCaMP2.2b"sra-9 : : GCaMP2.2b SL2 GFP, ofm-1::GFP] (ASK imaging line); CX11073 kyEx2916 ["AIA: :GCaMP2.2b" T01A4.1 : :GCaMP2.2b SL2 GFP, ofm-l::GFP] (AIA imaging line) (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), que se incorpora por referencia en su totalidad) ; DR476 daf-22 (ml30) (Golden y Riddle, Mol. Gen. Genet. 198:534-36 (1985), el cual se incorpora como referencia en la presente, en su totalidad), y daf-22 (ok693) (Butcher et al, PNAS 106:1875-79 (2009), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) .

Ejemplo 3 - Nomenclatura de los Metabolitos de C. elegans Todos ascarósidos identificados recientemente se nombran con cuatro letras "SMID"s (SMID: IDentificadores de Moléculas Pequeñas), por ejemplo, "icas#3" o "ascr#10". La base de datos de SMID, la cual incorpora como referencia en su totalidad, es un recurso electrónico mantenido por Frank Schroeder y Lukas Mueller en el Boyce Thompson Institute en colaboración con Paul Sternberg y WormBase. Esta base de datos cataloga las moléculas pequeñas recién identificadas de C. elegans y otros nematodos, asigna un SMID de cuatro letras único (un IDentificador de Moléculas Pequeñas de tipo gen, que puede ser consultado) a las moléculas pequeñas identificadas, e incluye una lista de otros nombres y abreviaturas utilizadas en la literatura para cada compuesto.

Ejemplo 4 - Preparación de los Extractos de Metabolitos Los extractos de metabolitos se prepararon de acuerdo con un método descrito el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, el cual se modificó de la siguiente manera.

Los gusanos (N2 o daf-22) de tres placas NGM de 10 cm se lavaron usando medio M9 en un precultivo de 100 mL de medio S, donde estos se cultivaron durante 5 días a 22°C en un agitador rotatorio. OP50 de E. coli concentrado, derivado de 1 L de cultivo bacteriano (cultivado durante 16 horas en medio LB) se añadió como alimento en los días 1 y 3. Posteriormente, el pre-cultivo se dividió en partes iguales en cuatro matraces Erlenmeyer de 1 L conteniendo 400 mL de medio S para un volumen combinado de 425 mL de medio S, que después se cultivó durante un periodo adicional de 10 días a 22 °C en un agitador rotatorio .

OP50 concentrado derivado de 1 L de cultivo bacteriano se añadió como alimento todos los días desde el día 1 a 9. Posteriormente, los cultivos se centrifugaron y los medios sobrenadantes y el sedimento de gusanos se liofilizaron por separado. Los materiales liofilizados se extrajeron con etanol al 95% (250 mL, 2 veces) a temperatura ambiente durante 12 horas. Las suspensiones amarillas resultantes se filtraron. Después, el filtrado se evaporó al vacio a temperatura ambiente, produciéndose los extractos de metabolitos del medio y de la pelotilla de gusanos.

Ejemplo 5 - Fraccionamiento Cromatográfico El extracto de metabolitos del medio de dos culturas se adsorbió sobre 6g de gel de sílice y funcionalizado con octadecilo en un cartucho de carga de muestras RediSep Rf de 25 g secado al vacío. El material adsorbido se fraccionó entonces a través de una columna HPLC18 de 30 g, RediSep de fase invertida. El solvente inicio con agua al 100% durante 4 minutos, seguid por un incremento lineal del contenido de metanol hasta al 100% de metanol a los 42 minutos, lo cual se continuó hasta los 55 minutos. Las ocho fracciones generadas de este fraccionamiento se evaporaron al vacío. El residuo se analizó mediante HPLC-MS y espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional (2D-NMR) Ejemplo 6-Análisis por Espectrometría de Masas Los extractos de medios de gusanos o las fracciones de metabolitos derivados del fraccionamiento Cromatográfico se volvieron a suspender en 1.5 mi de metanol, y se sometieron a centrifugación a 2,000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se sometió a análisis por HPLC-MS. La HPLC se llevó a cabo con una columna Eclipse XDB-C18 de Agilent (9.4 X250 mm, diámetro de particular de 5 µp?) . Se usó un gradiente de solvente de ácido acético-acetonitrilo al 0.1%, comenzando con un contenido de acetonitrilo de 5% durante 5 minutos, el cual se incrementó al 100% durante un periodo de 40 minutos. La espectrometría de masas se llevó a cabo usando ionización por electroaspersion ya sea en el modo de iones negativos o positivos.

Ejemplo 7- Cultivos Axénicos de C. elegans y Estudios Biosintéticos Los cultivos in vitro de C. elegans (N2, Bristol) se establecieron como se describe por Nass y Hamza, Curr. Protoc. Toxicology. 31: 1.9.1-1.9.18 (2007), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad, usando el Medio de Mantenimiento de C. elegans (CeMM, Lu y Goetsch, Nematologica 39:303-11 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) con colesterol (5 mg/1) en lugar de sitosterol y nucleosido-5-fosfatos . Después de 21 días, los cultivos de sometieron a centrifugación. El medio sobrenadante resultante y la pelotilla de gusanos se sometieron a liofilización por separado. Las pelotillas de gusanos liofilizadas (1.2-2.0 mg) se extrajeron con 2 mi de metanol, se filtraron, y después se concentraron al vacio. Los medios de gusanos liofilizados se extrajeron con acetato de etilo-metanol (95:5, 100 mL, dos veces), se filtraron, y después se concentraron al vacio. Los residuos se recuperaron en 150 µ? de metanol y se investigaron por medio de cromatografía líquida de alta resolución- tándems de ionización por electroaspersión -espectrometría de masas (HPLC-ESI-MS) . Para el experimento de aplicación, 50 mi de medio CeMM se complementaron con 9.2 mg de L- [2 , 4 , 5, 6 , 7-D5] -triptófano de Cambridge Isotope Laboratories.

Ejemplo 8. Ensayos de Atracción al Punto Los ensayos de atracción al punto se llevaron a cabo de acuerdo con un método reportado previamente (Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), que se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Tanto para los machos y los hermafroditas de C. elegans, 50-60 gusanos se recolectaron diariamente en la cuarta etapa larval (L4) y se almacenaron de forma segregada por sexo a 20°C durante toda la noche, para ser usados con adultos jóvenes el siguiente día. Para los experimentos competitivos, se usaron dos condiciones: ascr#3 tubo 120 de reforzamiento nM e icas#3 10 nM (Condición 1) , o ascr#3 12 µ? e icas#3 1 µ (Condición 2) en agua, conteniendo 10% de etanol. Las alícuotas se almacenaron a -20°C en tubos de 20 L . Se usó 10% de etanol en agua como control.

Ejemplo 9- Ensayo de quimiotaxis de Cuadrantes La quimiotaxis tanto de los no indol e indol ascarósidos se evaluó en placas de Petri de cuatro cuadrantes, de 10 cm (Wicks, et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Cada cuadrante se separó de los cuadrantes adyacentes por medio de separadores de plástico (Figura IB) . Los pares de cuadrantes opuestos se llenaron con el medio de crecimiento de nematodos (NG ) agar que contenía ya sea los indol ascarósidos o los no indol ascarósidos a diferentes concentraciones. Los animales se lavaron suavemente en amortiguador basal S, se colocaron en el centro de una placa de cuatro cuadrantes con los ascarósidos en cuadrantes alternados, y se calificaron después de 15 minutos y 30 minutos. El índice de quimiotaxis se calculó como: (número de animales sobre los cuadrantes con ascarósido menos el número de animales sobre los cuadrantes con amortiguador) / (número total de animales) .

Ejemplo 10- Medición de los Parámetros Locomotores La frecuencia y la velocidad de los cambios de rumbo se midieron usando un sistema automatizado de rastreo de los gusanos (Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), que se incorpora por la presente referencia en su totalidad) .

Ejemplo 11 - Ensayos de agregación El comportamiento de agregación de los gusanos se midió utilizándolos ensayos reportados en de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Los ensayos de agregación se realizaron en placas de NGM estándar. Las placas que contenían indol ascarósidos se prepararon mediante la adición de la base de solución indol ascarósido a los medios NGM antes de que estos se vertieran sobre las placas. Estas placas se secaron a temperatura ambiente durante 2 a 3 dias. Las placas de control se trataron de manera similar, excepto que se añadieron a las placas soluciones de etanol en lugar de las soluciones de icas, correspondientes a la cantidad de etanol introducida a través de las soluciones de icas. Las concentraciones finales de etanol de las placas fueron inferiores al 0.1% para todas las condiciones. Después del secado, tanto las placas de control y las placas que contenían los indol ascarósidos se sembraron con 150 µ? de un cultivo durante toda la noche de E. coli OP50 usando una micropipeta, y se les permitió secarse durante 2 días a la temperatura ambiente.

Para los experimentos de "baja densidad de gusanos", 20 gusanos se colocaron sobre el césped y se dejaron a 20°C durante 3 horas. Para los experimentos con "alta densidad de gusanos", aproximadamente tubo 120 de reforzamiento gusanos se colocaron sobre el césped bacteriano y se dejaron a 20°C durante 3 horas. El comportamiento se agregación se cuantificó como el número de animales que entraron en contacto con dos o más animales con más del 50% de su longitud corporal.

Ejemplo 12- Análisis de Formación de Imágenes por Calcio Las lineas transgénicas que expresan el detector de Ca2+ codificado genéticamente en ASK (kyEx2866) y AIA (kyEx2916) (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), que se incorpora como referencia en su totalidad) se utilizaron para la proyección de imagen de calcio. Los adultos jóvenes o los gusanos adultos se insertaron en un dispositivo microfluidico "circuito integrado olfativo" (Chronis et al., Nat. Methods 4:727-31 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Las diluciones de icas#3 se realizaron con amortiguador S-basal (sin colesterol) . Ya que las soluciones madre de icas#3 contenían pequeñas cantidades de etanol, se añadieron cantidades equivalentes de etanol para el flujo de control S-basal.

El análisis por imágenes se llevó a cabo usando un microscopio invertido Zeiss equipado con una cámara Andor. El tiempo de exposición para la adquisición de las imágenes fue de 300 milisegundos . Antes de obtener las imágenes de las neuronas ASK, los gusanos se exponen a luz azul durante 3 minutos ya que las neuronas ASK responden a la luz azul en si. Este paso es necesario para que las neuronas se adapten a la luz azul que se utiliza para las mediciones de Ca . Las películas se analizaron mediante programación de Matlab a medida. El primer pico de fluorescencia inmediatamente después de la exposición al amortiguador o al icas#3 fue elegido para el cálculo de la variación media de la fluorescencia tras la exposición al amortiguador o al icas#3. El valor de este máximo, se resta entonces de la media de la fluorescencia durante los 5 segundos antes de la administración del icas#3/buffer (correspondiente a la región entre 5 a 10 segundos en la Figura 2D) .

Ejemplo 13- Análisis Estadístico Se usaron pruebas t de Student apareadas con corrección c elch: (i) para comprar la atracción de los hermafroditas y los machos a los indol ascarósidos (+:p<0.01, **:p<0.001, p<0.0001) (Figuras 1C-1D, 3A, 3D, 4A, 5A, y 6C) ; (ii) para comparar los cambios de rumbo entre las líneas no extirpadas y extirpadas para ASK (*:p<0.01, **: p<0.001 ) ( Figuras 7A-B) ; (iii) para comparar la atracción de los gusanos de tipo natico con las líneas extirpadas genéticamente para ASK y AIA así como las extirpaciones de las neuromas ASI y RMG ( *** : p<0.0001 ) (Figura 2B) ; y (iv) para comparar los cambios de fluorescencia por G-CaMP para el amortiguador y el icas#3 (**:p<0.001) (Figura 2E) . Se usó ANOVA de un factor seguido por la post-prueba de Dunnett: (i) para comparar los índices de quimiotaxis por cuadrante de las varía cepas (*:p<0.05, **:p<0.01) (Figuras 1E y 3B-C) ; (ii) para comparar la agregación de los gusanos sociales, solitarios y de Cel-daf-22 sobre las placas que contenían los indol ascarósidos (*:p<0.05; **:p <0.01) (Figuras 5C. 6A-B, y 8A-C); (iii) para comparar la duración de la permanencia de los gusanos sobre las placas con los indol ascarósidos (*:p<0.05, **:p<0.01) (Figura 8D) ; y (iv) para comparar las velocidad y las frecuencias de cambio de rumbo sobre las placas con los indol ascarósidos (*:p<0.05; **p<0.01) (Figuras 6D-E) . Todas las barras de error indican el error estándar de la media (S.E.M) .

Ejemplo 14- Cálculo del Número de Moléculas de icas#3 en UN Volumen de gusanos L4 a 100 fM El número de moléculas (n) de icas#3 en un volumen de gusanos L4 a 100 fM (femtomolar) se calculó usando la ecuación (1) : N=VYA*c*NA (1) donde Vy¾=volumen de los adultos jóvenes de C. elegans (Knight et al., Evol. Dev. 4: 16-27 (2002), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) c = concentración (100 fM) NA = número de Avogadro En este caso, VYA = 3*106 µp?3 = 3*109 L y c = 10 fM = 10"14 M. Resolviendo para n, n=VYA*cNA=3*10"9L*10"1mol*L"1*6.022*1023 mol"1= 18 moléculas. Por lo tanto, hay 18 moléculas de icas#3 contenidas en un volumen gusano de gusanos del agar a una concentración de icas#3 de 10 fM.

Ejemplo 15 - Síntesis Químicas Las muestras de los indol ascarósidos icas#l, icas#7, icas#3, e icas#9 para uso en ensayos biológicos y como estándares para HPLC-MS se prepararon a través de síntesis química. Los procedimientos sintéticos detallados y los datos espectroscópicos de RMN se exponen en los Ejemplos 16-21.

Ejemplo 16 - Síntesis del Ascarósido ascr#9 Para preparar el ascr#9, (R) -Hex-5-en-2-ol 2 (32 mg, 0.32 mmol) (preparado como se describe en Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, usando las condiciones descritas para la síntesis de ascr#6) se acopló a la tricloroacetimida 1 (150 mg, 0.3 mmol, Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . El glicósido resultante 3 (92 mg, 0.21 mmol) se disolvió en acetona (2 mi) y se trató con 2 mi de una solución 1 M de permanganato de potasio. Después de 30 minutos, la mezcla de reacción se vertió en una mezcla de solución acuosa, saturada, enfriada con hielo, de cloruro de sodio (5 mi), ácido acético (0.1 mi), y diclorometano (DCM) (5 mi) . La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con dos porciones de 5 mi de DCM. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre sulfato de sodio, se evaporaron hasta sequedad, y se volvieron a disolver en una mezcla de hidróxido de litio acuoso 0.5 M (2 mi) y dioxano (6 mi) . La mezcla se agitó durante 3 horas a 70 °C, después se enfrió a 23°C y se acidificó con ácido clorhídrico acuoso 0.2 M. La mezcla se evaporó a sequedad y se purificó por medio de cromatografía en columna Combiflash usando un gradiente de disolvente de metanol-DCM, obteniéndose 15.6 mg (0.063 mmol) de ascr#9 puro como un aceite viscoso.

Los datos espectroscópicos de la RMN 1H (600 MHz) y 13C (126 MHz) del ascr#9 fueron adquiridos en metanol-d6. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Las constantes de acoplamiento se dan en hercios [Hz] . 1H RMN (600 MHz, CD30D) : d 4.65 (s, 1H) , 3.84 (m, 1H) , 3.72 (m, 1H) , 3.61 (dq, 1H, J = 9.4 Hz, J = 6.1 Hz), 3.51 (ddd, 1H, J = 11.2 Hz, J = 9.5 Hz, J = 4.5 Hz) , 2.43 (m, 2H), 1.95 (dt, 1H, J = 13.1 Hz, J = 3.5 Hz), 1.71-1.87 (m, 3H) , 1.22 (d, 3H, J = 6.1 Hz), 1.15 (d, 3H, J = 6.1 Hz) ppm; 13C RMN (126 MHz, CD30D) : d 174.5, 97.3; 71.5, 71.4, 69.9, 68.4, 36.0, 33.5, 31.3, 19.1, 18.1 ppm; ESI-MS (m/z) : [M-H] 247.2.

Ejemplo 17 - Síntesis del Ascarósldo ascrflO Para preparar el ascr#10, una solución agitada de ascr#3 (3.2 mg, 10.6 µ???, Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en 10 mi de etanol se sometió a hidrogenación utilizando paladio sobre carbón activado (10% de Pd, 1 atmosfera de presión de H2) a 23 °C durante 18 horas. Después de la terminación, la reacción se evaporó a sequedad. El residuo se filtró sobre un lecho corto de sílice usando una mezcla 1:8 (v/v) metanol y DCM, obteniéndose 3.0 mg (9.9 µ????) de ascr#10 puro.

Los datos espectroscópicos de RMN de 1H (600 MHz) y 13C (126 MHz) del ascr#10 se adquirieron en metanol-d4. Los desplazamientos químicos se refieren al (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Las constantes de acoplamiento se dan en hercios [Hz] . XH RMN (600 MHz, CD3OD) : d 4.64 (s, 1H) , 3.78 (m, 1H) , 3.71 (m, 1H) , 3.63 (dq, 1H, J = 9.3 Hz, J = 6.2 Hz), 3.51 (ddd, 1H, J = 11.2 Hz, J = 9.3 Hz, J = 4.6 Hz), 2.27 (t, 2H, J = 7.4 Hz), 1.94 (dt, 1H, J = 13.0 Hz, J = 3.7 Hz) , 1.77 (ddd, 1H, J = 13.3 Hz, J = 11.5 Hz, J = 3.0 Hz), 1.61 (m, 2H) , 1.56 (m, 1H) , 1.46 (m, 1H) , 1.32-1,38 (m, 6H) , 1.21 (d, 3H, J = 6.2 Hz), 1.12 (d, 3H, J = 6.1 Hz) ppm; 1JC RMN (126 MHz, CD3OD) : d 177.7, 97.3, 72.3, 71.0, 69.8, 68.1, 38.1, 38.2, 35.7, 34.9, 30.0, 26.5, 26.0, 19.0, 18.0 ppm; ESI-MS (m/z) : [M-H] 303.2.

Ejemplo 18 - Síntesis del Indol Carboxl Ascarósldo lcas#l Para preparar el icas#l, el ascrtl se convierte en primer lugar en el éster metílico correspondiente. El ascr#l (10 mg, 0.036 mmol), preparado como se informa en Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, se disolvió en una mezcla de tolueno (1 mL) y metanol (1 mL) . A esta mezcla, se agregó una solución de trimetilsilildiazometano (TMS-diazometano) (solución 2M en hexano, 50 µ?, 0.1 mmol) . Después de agitar durante 20 minutos a 23 °C, el exceso de TMS-diazometano se destruyó por adición de ácido acético (40 iL) y los disolventes se retiraron al vacío, produciendo el metil éster de ascr#l (10.3 mg, 0.035 mmol) como un aceite viscoso.

A continuación, se preparó una solución de cloruro de indol-3-carbonilo . Una suspensión bien agitada de ácido indol-3-carboxílico (67.7 mg, 0.42 mmol) en DCM seco (2 mi) que contenía una pequeña cantidad de dimet ilformamida (DMF) (20 se trató con cloruro de oxalilo (0.84 mmol, 107 mg, 72 \iL) O °C. Después de la adición del cloruro de oxalilo, la mezcla se agitó durante 20 minutos a 23 °C, produciéndose una solución clara, ligeramente amarilla. Esta solución se evaporó a sequedad al vacio a 0.1 Torr para asegurar la eliminación del exceso de cloruro de oxalilo, y se volvió a disolver posteriormente en 2 mi de DCM seco.

La muestra de metil éster de ascr#l (10.3 mg, 0.035 mmol) se disolvió en 1 mi de DCM seco, al que se añadió diisopropilet ilamina (129 mg, 1 mmol) . La solución resultante fue equipada con una barra de agitación eficaz y se enfrió a -20 °C. Posteriormente, la solución de cloruro de ácido indol-3-carboxí lico Se añadió gota a gota durante un periodo de 10 minutos con agitación vigorosa. La reacción bien agitada se calentó gradualmente a -7 °C, a la que se añadió solución enfriada con hielo, saturada, acuosa de bicarbonato de sodio (2 mi) . La mezcla bifásica se dejó calentar a 20 °C, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos de acetato de etilo combinados se evaporaron al vacio y se sometieron a cromatografía en columna sobre gel de sílice usando metanol al 0-10% en DCM.

Las fracciones que contenían el derivado de bis-2,4-0-(-indol-3-carbonil ) del metil éster de ascr#l se combinaron, se evaporaron a sequedad, y se trataron con una mezcla de 3 mi de solución acuosa de hidróxido de litio 0.5 M y 7 mi de dioxano a 67 °C durante 3 horas. Posteriormente, la mezcla de reacción se enfrió a 23 °C, se neutralizó por adición de ácido clorhídrico acuoso 0.2 M, y se evaporó al vacio. El residuo se purificó mediante HPLC con una columna Eclipse XDB C-18 de Agilent (25 cm x 9.4 mía, diámetro de partícula de 5 µp?) . Se usó acetonitrilo y ácido acético acuoso al 0.1% como disolventes, aumentando el porcentaje de acetonitrilo de 15% a los 0 minutos a 85% a los 30 minutos. Las fracciones que contenían el icas#l se evaporaron, obteniéndose 5.8 mg (0.014 mmol) del compuesto objetivo como un sólido blanco parecido a la cera.

Los dato espectroscópicos de RMN de 1H (600 MHz), 13C (126 MHz), y HMBC para el icas#l se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 1 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a ( C D2HOD ) = 3.31 ppm y ( CD2HOD ) = 49.05 ppm. Las constantes de acoplamiento se dan en hercios [Hz] ; *: intercambiables.

Tabla 1. Datos espectroscóplcos de RMN del icas#l Ejemplo 19 - Síntesis del Indol Carboxi Ascaros do icas#3 Para preparar el icas#3, el ascr#3 se convirtió primero en el éster metílico correspondiente. El ascr#3 (5.2 mg, 0.017 mmoles) , preparado como se informa en Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, se disolvió en una mezcla de tolueno (1 mi) y metanol (1 mi) . A esta mezcla, se agregó una solución de TMZ-diazometano ( solución 2M en hexano, 25 ]iL, 0.05 mmoles) . Después de agitar durante 20 minutos a 23 °C, el exceso de TMS-diazometano se destruyó por adición de ácido acético (30 µ??) y los disolventes se retiraron al vacío, produciéndose el metil éster de ascr#3 (5.3 mg, 0.017 mmol) como un aceite viscoso .

La muestra de metil éster de ascr#3 (10.3 mg, 0.035 mmol) se hizo reaccionar con cloruro de indol carbonilo como se describe en el Ejemplo 18 para la preparación del icas#l, usando cantidades proporcionalmente más pequeñas de todos los reactivos. La purificación de los productos de reacción en bruto a través de HPLC utilizando las condiciones descritas en el Ejemplo 18 produjo el icas#3 (2.3 mg, 5.2 µp???) como un aceite incoloro.

Los datos espectroscópícos de RMN de 1H (600 MHz), 13C (126 MHz) , y HMBC para el icas#3 se obtuvieron usando metanol- d4 y se muestran en la Tabla 2 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y ( C D2HOD ) = 49.05 ppm. Las constantes de acoplamiento se dan en hercios [Hz] .

Tabla 2. Datos espectroscópícos de RMN del icas#3 Ejemplo 20 - Síntesis del Indol Carboxi Ascarósido icas#7 Una muestra estándar del icas#7 (120 yg) se obtuvo del ascr#7 (0.5 mg, Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) como se describe en el Ejemplo 18 para la preparación del icas#l a partir del ascr#l.

Los datos espectroscopicos de RMN de 1H (600 MHz) para el icas#7 se obtuvieron utilizando metanol- d4 y se muestran en la Tabla 3 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2H0D) = 3.31 ppm. Las constantes de acoplamiento se dan en hercios [Hz] .

Tabla 3. Datos espectroscopicos de RMN del icas#7 Ejemplo 21 - Síntesis de Indol Carboxi Ascarósido icas#9 El icas#9 se obtuvo del ascr#9 como se describe en el Ejemplo 18 para la preparación del icas#l a partir del ascrtl. Los datos de espectroscópicos de RMN están de acuerdo con los datos publicados (Butcher et al., Org. Lett. 11:3100-03 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Ejemplo 22 - Identificación del Indol Ascarósido icas#3 a través de la Metabolomica comparativa Todas las feromonas de moléculas pequeñas conocidas actualmente en el C. elegans se derivan de la ß-oxidación peroxisomal de los ácidos grasos de cadena larga a través de DAF-22, una proteina con fuerte homología a la proteína portadora de esterol humana SCPx (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Butcher et al., PNAS 106:. 1875-1879 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Se ha sospechado que las feromonas de agregación putativas pueden ser derivadas a partir de la misma vía, lo que sugiere que los mutantes de daf-22 no las producirían. En ese caso, una comparación espectroscópica del metaboloma de tipo nativo con aquel contenido de los gusanos mutantes daf-22 revelaría los compuestos candidatos para las señales de atracción o agregación.

En un estudio previo, la técnica basada en espectroscopia de RMN llamada Análisis Diferencial de espectros de RMN ("DANS") se usó para comparar el metaboloma de tipo nativo con el de los gusanos mutantes daf-22 (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Esta comparación ha conducido a la identificación de los ascr#6-8, de los cuales ascr#8 es un componente importante de la señal de atracción de los machos (Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Sobre la base de los espectros de RMN con una mejor relación señal a ruido, se llevó a cabo una comparación más detallada de los metabolomas de tipo nativo y de los mutantes daf-22, revelando varios compuestos que contienen indol en el metaboloma de tipo nativo que no fueron producidos por los gusanos daf-22 gusanos (Figuras 9B-C) . El papel establecido de DAF-22 en la biosíntesis de las feromonas (Pungaliya et al, PNAS 106:7708-13 (2009); Butcher et al, PNAS 106: 1875-1879 (2009); Golden y Riddle, Mol. Gen. Genet. 198:534-36 (1985), que se incorporan aquí como referencia en su totalidad) sugiere que estos derivados de indol pueden representar una familia no reconocida previamente de las moléculas de señalización.

Para aclarar las estructuras y las funciones biológicas de los derivados de indol dependientes de daf-22, la identificación completa de estos derivados de indol se estudió a través de fraccionamiento guiado por espectroscopia de R N del metaboloma de tipo nativo. La cromatografía en fase invertida produjo ocho fracciones de metabolitos , los cuales fueron analizados por espectroscopia de RMN bidimensional . Los espectros de RMN revelaron la presencia de derivados de indol dependientes de daf-22 en dos fracciones, que fueron seleccionadas para estudios adicionales de espectroscopia de RMN y de espectrometría de masas. Estos análisis indican que el derivado de indol dependiente de daf-22 más abundante consta de una unidad de indol-carboxi enlazada a la ascarilosa que lleva una cadena lateral insaturada de 9 átomos de carbono idéntica a la encontrada en el ascr#3 conocido (Srinivasan et al., Nature 454:. 1115-1118 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) (ver datos de RMN y MS en los Ejemplos 18-19, Figuras 10-13) . Sobre la base de su relación estructural con el ascr#3 conocido, este metabolito identificado recientemente fue nombrado _indol carboxi ascarósido "icas#3" (Figura 9E) .

Ejemplo 23 - El icas#3 es parte de una familia más grande de Moléculas Pequeñas Derivadas de Triptófano Algunos otros compuestos de indol dependientes de daf-22 detectados por DANS fueron investigados para determinar si también representan indol ascarósidos. Una técnica de espectrometría de masas (MS) se empleó para esta investigación, ya que el análisis de los espectros de masas del icas#3 ha revelado un patrón característico de fragmentación MS (pérdida de la porción indol-3-carboxi , Figura 12) que permite la detección de los compuestos relacionados .

La detección por MS de los compuestos con perfiles de fragmentación similares indica que el icas#3 es un miembro de una serie más amplia de indol ascarósidos que presentan cadenas laterales de cinco a nueve átomos de carbono (Figuras 9D-E) . Los componentes más abundantes de esta familia de indol ascarósidos son icas#3, icas#9 e icas#10, que están acompañados de cantidades menores de icas#l e icas#7 (Figura 9E) . Todos estos compuestos representan nuevos metabolitos, excepto por el icas#9, el cual, como ha sido reportado poseen actividad de inducción de larvas Dauer y es única entre las feromonas dauer conocidos por producir una curva de respuesta en forma de campana (Butcher et al, Org. Lett . 11:3100-03 (2009) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

También se detectaron dos nuevos no indol ascarósidos: ascr#9, que presenta con una cadena lateral saturada de 5 carbonos, y ascr#10, que presenta una cadena lateral de 9 carbonos saturada, lo que representa el análogo saturado del ascr#3 conocido (Figura 9F) .

El análisis de MS reveló además que la distribución cuantitativa de los indol ascarósidos 'es claramente diferente de la de los correspondientes ascarósidos no-indol, lo que sugiere que la incorporación de la unidad de indol está fuertemente regulada. El indol ascarósido más abundante, icas#3, está acompañado de cantidades 10 - a 40 veces mayores del no indol ascarósido correspondiente, ascr#3, mientras que el icas#9 es más abundante que el correspondiente ascr#9 (Figura 9G) .

Para determinar el origen biosintético de los indol ascarósidos y para excluir la posibilidad de que estos sean producidos por la mediante la fuente de alimento de E. coli, los cultivos axénicos (sin bacterias) in vitro de C. elegans (N2) se estabilizaron utilizando el medio CeMM definido químicamente (Lu y Goetsch, Nematologica 39:303-11 (1993); Nass y Hamza, Curr. Protoc. Toxicology. 31: 1.9.1-1.9.18 (2007), que se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . El análisis por HPLC-MS de los cultivos axénicos reveló la presencia de icas#l, icas#3, icas#9, e icas#10, lo que indica que los indol ascarósidos son producidos por el C. elegans sin la participación de bacterias dietéticas. El uso de una mezcla 1:1 de L- [2 , 4 , 5 , 6 , 7-D5] -triptófano y L- triptófano en el medio axénico resultó en la producción de [D5]-icas#l, [D5]-icas#3, [D5]-icas#9, y [D5] -icas#10, junto con cantidades equivalentes de los compuestos no marcados (Figura 13) . En conclusión, estos estudios bioquímicos establecieron el origen relacionad con el triptófano de la porción de indol-3-carboxi en los indol ascarósidos e indican que estos compuestos son productos de una ruta biosintética fuertemente regulada.

Ejemplo 24 - Los Indol Ascarósidos Atraen Fuertemente a los Hermafroditas La adición de una porción de indol-3-carboxi a los ascarósidos representa un cambio estructural significativo. Esta diferencia química puede indicar funciones de señalización para estos compuestos, distintas a las de sus cognados no-indol.

Tres indol ascarósidos sintéticos de diferentes longitudes de la cadena lateral, icas#l, icas#3 e icas#9, se evaluaron en el ensayo de atracción al punto para demostrar las funciones sociales de las moléculas pequeñas (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) (Figura 1A) . Los tres indol ascarósidos evaluados, icas#l, icas#3 e icas#9, atraen tanto a los machos como a los hermafroditas a altas concentraciones (Figura 1C) . La evaluación del indol ascarósido más abundante, icas#3, a través de un rango más amplio de concentraciones reveló que, a bajas concentraciones, el icas#3 fue muy atractivo para los hermafroditas , mientras que los machos ya no se sintieron atraídos (Figura ID) . Del mismo modo, los hermafroditas, pero no los machos, fueron fuertemente atraídos a bajas concentraciones de icas#9 (Figura 5A) .

La atracción hermafrodita al icas#3 se investigó adicionalmente usando un bioensayo de quimiotaxis por cuadrantes como se informa en Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009); Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000), que se incorporan aquí como referencia en su totalidad (Figura IB) . En contraste con el ensayo de atracción al punto, el cual mide la atracción a una fuente puntual de compuestos, el ensayo de quimiotaxis por cuadrantes mide la agregación de los hermafroditas sobre secciones de las placas con la concentración del compuesto bien definida (Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009); Wicks et al., Dev. Biol. 221:295-307 (2000), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad). Se encontró que concentraciones tan bajas como 13:1 pM de icas#3 resultan en una fuerte atracción de los hermafroditas (Figura 1E) , tanto en la presencia y ausencia de alimento (Figura 5B) .

La función biológica del icas#3 difiere marcadamente de la del no-indol ascarósido correspondiente ascr#3, que atrae fuertemente a los machos pero repele a los hermafroditas (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), que se incorporan aqui como referencia en su totalidad) . Los resultados en el presente documento muestran que con sólo enlazar un grupo indol-3-carboxi a la posición 4 de la ascarilosa, el ascr#3 que atrae fuertemente a los machos se convierte en una señal que atrae principalmente a los hermafroditas . La diferencia en las cantidades a las cuales el ascr#3 y el icas#3 son producidos por los gusanos corresponde a su potencia relativa: el ascr#3 que atrae a los machos, el cual tiene una potencia muy inferior al icas#3, se produce a concentraciones mucho más altas que el icas#3 atrayente de forma muy potente para los hermafroditas (Figura 9G) .

Ejemplo 25 - Los Hermafroditas de Tipo Nativo, Solitarios y sociales Son Atraídos por el icas#3 , pero no por los No-Indol Ascarósidos Los resultados denlos ensayos de atracción al punto y de quimiotaxis de cuadrantes indican que los hermafroditas son atraídos fuertemente por los indol ascarósidos, lo que sugiere que estos compuestos regulan el comportamiento de agregación del C. elegans. El C. elegans exhibe una variación natural en su comportamiento de forrajeo, con algunas cepas (por ejemplo, la cepa común de laboratorio N2) que se dispersa de forma individual sobre el césped bacteriano, en tanto que la mayoría de las cepas de tipo nativo (por ejemplo, RC301 y CB4856 (Hawaii) ) se acumulan y se agregan donde las bacterias son las más abundantes (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Hodgkin y Doniach, Genetics 146: 149-64 (1997), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Estas variantes se conocen como "solitaria" y "social", respectivamente (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-1185 (2003), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Estas diferencias en el comportamiento de alimentación y de agregación se asocian con dos alelos diferentes del receptor de similar al neuropéptido Y, NPR-1 (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-1185 (2003), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) , los cuales difieren en la posición de un solo aminoácido: las cepas solitarias tales como N2 expresan una variante de alta actividad del NPR-1 (215-valina) , mientras que las cepas de agregación, tales como CB4856 expresan una variante de baja actividad de NPR-1 (215-fenilalanina) (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Rogers et al., Nat. Neurosci. 6:1178-1185 (2003), los cuales se incorporan aqui como referencia en su totalidad) . Los mutantes de pérdida de función fuerte npr-1 (ad609) y npr-l(kyl3), los se generan en el contexto N2, también muestran una alta tendencia a la agregación (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Hodgkin y Doniach, Genetics 146: 149-64 (1997), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) .

Un estudio anterior mostró que la pérdida de la función de npr-1 afecta a la respuesta de los hermafroditas a los no indol ascarósidos (Macosko et al., Nature 458: 1171-75 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Mientras que los gusanos de nativo (N2) que expresan la variante de alta actividad de NPR-1 son rechazados por los no indol ascarósidos, los mutantes npr-1 (ad609) mostraron atracción a una mezcla casi fisiológica de no indo, ascarósidos más abundantes, ascr#2, ascr#3 y ascr # 5 (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Tanto los ensayos de quimiotaxis por cuadrantes y de atracción al punto confirmaron la atracción de los hermafroditas npr-1 (ad609) por mezclas de ascr#2/3/5, sin embargo, los hermafroditas sociales de las dos cepas de tipo nativo analizadas (RC301 y CB4856) mostraron ninguna atracción en ninguno de los ensayos (Figuras 3A-B) . Por el contrario, ambas cepas sociales de tipo nativo (RC301 y CB4856), asi como los hermafroditas npr-1 (ad609) fueron fuertemente atraídos por el icas#3, tanto en los ensayos de quimiotaxis de cuadrantes y de atracción al punto (Figuras 3B-D y 5B-C) . Estos resultados indican que el icas#3 funciona como un atrayente de hermafroditas tanto la cepa solitaria y social de C. elegans.

Ejemplo 26 - Las Concentraciones Femtomolares de los indol Ascarósidos Promueven la Agregación del C . elegans Se evaluó como una concentración de fondo constante de los indol ascarósidos afecta el comportamiento hermaf odita . La agregación de los gusanos solitarios N2 y de varias cepas sociales (incluida la cepa CB4856 de tipo nativo, social, y los dos mutantes de pérdida de función de npr-1) se midieron en respuesta al icas#3 usando dos condiciones diferentes: "alta densidad de gusanos", con 120 lombrices por placa de 5 cm; y "baja densidad de gusanos", con 20 gusanos por placa de 5 cm.

A baja densidad de los gusanos, se observó un fuerte aumento en la agregación a concentraciones tan bajas como 10 fM (femtomolar) de icas#3 tanto para los hermafroditas solitarios y sociales (Figuras 8A y 14E) . La agregación de los hermafroditas N2 aumentó tanto como 4 veces a 1 pM de icas#3, con mayores concentraciones de icas#3 que producen menos agregación. Del mismo modo, la cepa social de origen natural, CB4856 muestra una curva de respuesta en forma de campana con la agregación máxima a 1 pM de icas#3 y la agregación inferior no significativamente diferente del control a 1 nM de icas#3 (Figura 8A) . En contraste, el icas#3 aumentó la agregación de los hermafroditas npr-1 (ad609) durante todo el rango de concentración evaluado, sin una caída a concentraciones más altas (Figura 8A) . A una densidad alta de los gusanos se observó un aumento hasta de 3 veces en la agregación de los hermafroditas N2, en las placas con icas#3 (Figuras 8B y 14F) , mientras que los hermafroditas de las tres cepas sociales evaluadas mostraron agregación casi completa, incluso en ausencia del icas#3, lo que impedia la detección de cualquier efecto de promoción de la agregación adicional del icas#3 (Figura 8B) . Estos resultados muestran que el icas#3 aumenta la agregación de los hermaf oditas incluso en ausencia de un gradiente de concentración de este compuesto, y que las cepas solitarias y sociales se ven afectadas de manera similar. Del mismo modo, el segundo indol ascarósido más abundante, icas#9, aumenta la agregación tanto de los hermafroditas solitarios y sociales (Figura 6A) .

El efecto del icas#3 sobre la agregación de los machos, los cuales en general tienden a agregarse en la ausencia de los hermafroditas (Gems y Riddle, Genetics 154: 1597-610 (2000), el cual se incorpora como referencia en su totalidad), también se investigó. Se encontró que la agregación de los machos him-5 sobre las placas con icas#3 aumentó significativamente (Figura 6B) .

Estos resultados muestran que los indol ascarósidos promueven el comportamiento de agregación, incluso en ausencia de un gradiente de concentración, lo que sugiere que la detección del icas#3 e icas#9 afecta la respuesta a otras señales o condiciones (químicas u otras) que promueven la agregación. Por ejemplo, la secreción de indol ascarósidos adicionales por los gusanos en las placas que contienen el icas#3 exógeno podría contribuir al incremento observado en la agregación. Para investigar esta posibilidad, los hermafroditas se evaluaron los hermafroditas daf-22 en el ensayo de agregación. Los hermafroditas daf-22 no produjeron los indol ascarósidos pero respondieron al icas#3 tanto en el ensayo de atracción al punto y de quimiotaxis de cuadrantes, tan fuertemente como los gusanos N2 (Figuras 3B y 5C) . Se encontró que los hermafroditas daf-22 muestran menos agregación que los gusanos N2 a 1 pM del icas#3, pero no a 10 pM de icas#3 (Figura 8C) . Estos resultados sugieren que la secreción de los indol ascarósidos adicionales u otros compuestos dependientes de daf-22 por los gusanos puede contribuir a la agregación sobre las placas con icas#3, sin embargo, otros factores, tales como bajos niveles de oxígeno o el contacto con otros gusanos (Rogers et al, Curr. Biol. 16:649-59 (2006); Chang et al, Publ . Lib. Sci. Biol. 4(9) : e274 (2006); Chang y Bargmann, PNAS 105:7321-26 (2008), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) , pueden ser más importantes. Además, los cambios en el comportamiento locomotor sobre las placas con icas#3 podrían afectar el nivel de agregación (Rogers y otros, Curr. Biol. 16:649-59 (2006), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . El uso de un sistema de visión artificial automatizado para rastrear el movimiento de los gusanos (Cronin et al., BMC Genet 6:05 (2005), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) , se descubrió que las concentraciones de icas#3 que inducen la agregación aumentan fuertemente la duración de permanencia promedio y afectan otros parámetros locomotores (Figuras 6D-E y 8D) . Estos cambios en la locomoción de los gusanos, en conjunción con otros factores que median la agregación, pueden contribuir al aumento observado en la agregación sobre las placas con icas.

Ejemplo 27 - La Respuesta a icas#3 Requiere de las Interneuronas sensorial ASK y AIA Las neuronas sensoriales tipo K monociliadas , de los anfidios (ASK) juegan un papel importante en la mediación del comportamiento del C. elegans. Los trabajos anteriores han demostrado que se requieren las neuronas para las respuestas conductuales de los machos y los hermafroditas a los no indol ascarósidos (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), los cuales se incorporan como referencia en su totalidad) . Las neuronas sensoriales ASK se conectan a través de uniones comunicantes anatómicas con las interneuronas RMG, las cuales, como ha sido demostrado, actúan como el concentrador que regula la agregación y los comportamientos relacionados, con base en los impulsos de las neuronas ASK y de otras neuronas sensoriales (Macosko et al., Nature 458: 1171-75 (2009), White et al., Philos. Trans. R. Soc. Londres [Biol] 314:1-340 (1986), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) (Figura 2A) .

Para investigar los circuitos neuronales necesarios para la atracción y la agregación de los hermafroditas mediadas por el icas#3, se realizaron pruebas para determinar si las neuronas ASK se requieren para estos comportamientos. Los gusanos que carecen de las neuronas ASK debido a la expresión especifica de las células de la caspasa de mamífero en las neuronas en desarrollo (Tokumitsu Wakabayashi, Universidad Iwate de Japón) se usaron para estas pruebas. La extirpación de las neuronas sensoriales ASK resulta en una pérdida casi completa de la atracción al icas#3 (Figura 2B) . En contraste, la extirpación de las neuronas ASI, las cuales, como las neuronas ASK participan en la detección de las feromonas de dauer, no teniendo efecto significativo sobre la atracción mediada por icas#3 en los hermafroditas (Figura 2B) . Además, la extirpación tanto de las neuronas ASI y ASK no resultó en una pérdida más significativa de la atracción, en comparación con la extirpación de las neuronas ASK únicamente, lo que sugiere que las neuronas sensoriales ASK se requieren para detectar el icas#3 (Figura 2B) .

También se realizaron pruebas para determinar si las neuronas ASK se requieren para la agregación mediada por icas#3. Los resultados muestran que los hermafroditas que carecen de las neuronas ASK no se agregan en respuesta al icas#3 a ninguna de las concentraciones evaluadas (Figura 2C) . El análisis locomotor de los hermafroditas con neuronas ASK extirpadas sobre las placas con icas#3 no mostraron ni una frecuencia de cambio de rumbo aumentada ni velocidad reducida, cuando se observa para los gusanos de tipo nativo (Figuras 7A-B) .

Se realizaron entonces pruebas para determinar si las interneuronas RMG se requieren para los comportamientos mediados por el icas#3. Se identificó La posición celular de las interneuronas RMG en los gusanos de tipo nativo y en la cepa transgénica que expresa ncs-l::gfp (un reglado del laboratorio Bargnann) , usando microscopía por contraste de interferencia diferencial (DIC) (Sulston et al., Des. Biol. 100:64-119 (1983), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Este transgen expresa GFP en las interneuronas RMG y unas pocas de otras neuronas sensoriales (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Se encontró que la extirpación de las interneuronas RMG en los gusanos tanto de tipo nativo y ncs-l::gfp no afectó la respuesta al icas#3 en el ensayo de atracción al punto (Figura 2B) . Estos resultados indican que las interneuronas RMG no se requieren para la transducción de las señales de atracción derivadas del icas#3 desde las neuronas sensoriales ASK, al contrario de los efectos conductuales de los no indol ascarósidos, los cuales requieren tanto de las neuronas sensoriales ASK y de las interneuronas RMG (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Dada esta observación, también se llevaron a cabo pruebas para determinar cuáles interneuronas corriente abajo de las neuronas ASK se requieren para la respuesta al icas#3. De acuerdo con el diagrama de cableado del C. elegans, la salida sináptica primario de las neuronas ASK son las interneuronas AIA ( hite et al., Philos. Trans . R. Soc. Londres [Biol] 314: 1-340 (1986), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Una linea transgénica que expresa una forma hiperactiva de MEC-4 en las interneuronas AIA (un regalo del Ishihara lab, Japón) (Shinkai et al., J. Neurosci. 31 : 3007-15 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) se utilizó para comprobar si se requieren la interneuronas de AIA para detectar el icas#3. La expresión del MEC-4, un canal de sodio de DEG/ENaC, provoca toxicidad neuronal en los C. elegans, resultando por ello en la pérdida de las neuronas AIA (Harbinder et al., PNAS 94: 13128-33 (1997), que se incorpora por la presente referencia en su totalidad) . Los gusanos con deficiencia de AIA no muestran ninguna atracción al icas#3, lo que sugiere que las interneuronas AIA se requieren para la respuesta al icas#3. Por lo tanto, la circuiteria neuronal requerida para la atracción al icas#3 es diferente de aquello de los no indol ascarósidos .

Puesto que los ensayos conductuales demostraron que las neuronas ASK y AIA participan en la detección del icas#3, se llevaron a cabo pruebas para determinar si el icas#3 provoca el flujo del calcio en estas neuronas. Para medir el flujo del Ca2+, las lineas transgénicas que expresan los detectores de calcio codificados genéticamente (GCaMP) en estas neuronas (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) se utilizaron. El "circuito integrado olfativo" se usó para restringir los gusanos y aplicar las etapas de ACTIVACIÓN y DESACTIVACIÓN del icas#3 mientras que se forman imágenes de estas neuronas (Chronis et al., Nat . Method 4:727-31 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . No hubo detección de transiciones de Ca2+ en las neuronas ASK aun cuando se aplicó un amplio rango de concentraciones, que variaron desde 1 pM a 1 µ?. Las respuestas del calcio en las interneuronas AIA, las cuales son el objetivo sináptico primario de las neuronas ASK ( hite et al., Philos. Trans . R. Soc. Londres [Biol] 314: 1-340 (1986), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , se monitorearon entonces. Los resultados demostraron que el icas#3 provocó una fluorescencia por G-CaMP aumentada significativamente en las neuronas AIA (Figuras 2D-E) , al igual que los resultados reportados para la estimulación de las interneuronas AIA con una mezcla de tres no indol ascarósidos (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Estos resultados muestran que las neuronas sensoriales ASK se requieren para la respuesta a los icas y que esta respuesta se transduce a través de las interneuronas AIA.

Ejemplo 28 - Icas#3 y ascr#3 son Señales Competitivas Los estudios previos han demostrado que las concentraciones altas de ascr#3 que indicen las larvas dauer disuaden fuertemente a los hermafroditas tanto sociales y solitarios (Srinivasan et al., Nature 454:1115-1118 (2008); Macosko et al., Nature 458 : 1171-1175 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Para investigar si la adición del ascr#3 afectarla la atracción de los hermafroditas mediada por icas#3, mezclas que contenían estos dos compuestos en una relación caso fisiológica de 12:1 ( ascr#3 : icas#3 ) se evaluaron en un ensayo modificado de atracción al punto, en el cual, la atracción de los hermafroditas N2 se calificó para tres zonas de concentración A-C (Figura 1?) . Los resultados demuestran que a la menor de las concentraciones evaluadas (120 fmol de ascr#3 y 10 fmol de icas#3), la presencia del ascr#3 no interfirió con la atracción mediada por icas#3, en tanto que las concentraciones más altas de ascr#3 resultaron en una fuerte repulsión, aun en presencia de concentraciones de icas#3 aumentadas proporcionalmente (12 pmol de ascr#3 y 1 pmol de icas#3, Figura 4A) . Enseguida de la retirada desde el borde externo de la zona A, muchos gusanos permanecieron "atrapados" en la zona circular B que rodea la zona central, repelidos por la alta concentración de la mezcla de icas#3/ascr#3 dentro de la zona A, pero atraídos por las concentraciones más bajas de la mezcla de icas#3/ascr#3 que se difunde hacia la zona B. Estos resultados demuestran que el efecto repulsivo del ascr#3 prevalece a concentraciones altas de las mezclas icas#3/ascr#3 , en tanto que la atracción por el icas#3 domina a las concentraciones más bajas.

Discusión de los Ejemplos 1-28 Los indol ascarósidos son las primeras feromonas de C. elegans que atraen fuertemente a los hermafroditas de tipo nativo y que promueven la agregación. Los indol ascarósidos se ajustan a la definición más amplia de las feromonas de agregación en que estos atraen y/o detienen a los gusanos conespecí fieos a la región de liberación independientemente del sexo (EDWARD O. WILSON, SOCIOBIOLOGY : THE NEW SYNTHESIS (The Belknap Press of Harvard University, Cambridge, Mass., Edición de 25 aniversario, 2000) ; Shorey, Annu. Rev. Entomol. 18:349-80 (1973) ; Wertheim et al., Annu. Rev. Entomol. 50:321- 46 (2005) , los cuales se incorporan aqui como referencia en su totalidad) . Para la promoción de estos comportamientos, los indol ascarósidos son activos a concentraciones tan bajas ( femtomolares ) que la respuesta conductual del gusano debe resultar de la detección de sólo unas pocas moléculas. Por ejemplo, a una concentración de icas#3 de 10 fM, sólo hay alrededor de 20 moléculas de icas#3 contenidas en un cilindro correspondiente a la longitud y el diámetro de un hermafrodita adulto. Dada su alta actividad especifica, es razonable que los indol ascarósidos tengan una abundancia mucho menor que los no indol ascarósidos.

Las propiedades fuertemente atractivas de los indol ascarósidos sugieren que estos compuestos sirven para atraer a sus congéneres a entornos deseables, tales como las fuentes de alimentos. Sin embargo, los resultados de los experimentos competitivos indican que la atracción de los hermafroditas por el icas#3 puede ser contrarrestada por las concentraciones altas de ascr#3, que son repulsivas para los hermafroditas (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), que se incorpora por referencia en su totalidad) . Los experimentos competitivos demuestran además, que a bajas concentraciones de una mezcla fisiológica de icas#3 y ascr#3, las propiedades atractivas de icas#3 dominan, mientras que a altas concentraciones de la misma mezcla, la repulsión por el ascr#3 llega a ser dominante (Figura 4A) . Estos hallazgos sugieren que bajo condiciones que inducen las larvas dauer con alta densidad de población, las altas concentraciones de ascr#3 asociadas facilitan la dispersión (Srinivasan et al., Nature 454:1115-1118 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad), mientras que la baja densidad de población y las concentraciones correspondientemente más bajas de ascr#3 resultan en la atracción mediada por el icas#3. Por lo tanto, los icas y los ascr pueden representar los estímulos opuestos que regulan la densidad de población y el nivel de agregación. A su vez, la densidad de población, la disponibilidad de alimentos y otros factores ambientales pueden afectar las tasas relativas de las biosíntesis de los ascr de los icas como parte de un circuito de regulación.

Los indol ascarósidos afectan el comportamiento de agregación, incluso en ausencia de un gradiente de concentración: las concentraciones de fondo muy bajas (fM-pM) del icas#3 y del icas#9 aumentan fuertemente la disposición de los hermafroditas (y de los machos) a agregarse. Este hallazgo sugiere que la detección del icas#3 y del icas#9 aumenta la susceptibilidad por las señales o las condiciones (químicas u otros) que promueven la agregación, tales como cantidades adicionales de icas secretadas por los gusanos sobre las placas .

Se sabe que la agregación en los C. elegans depende de un conjunto diverso de factores genéticos y las condiciones ambientales, incluyendo la disponibilidad de alimentos y la concentración de oxigeno, lo que sugiere la existencia de circuitos neuronales que integran los estímulos de diferentes fuentes (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Cheung et al., Curr. Biol . 15:905-17 (2005); Coates y de Bono, Nature 419:925-29 (2002); de Bono et al., Nature 419:899-903 (2002); Gray et al., Nature 430:317-22 (2004), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Se ha demostrado recientemente que las señales de agregación y de atracción procedentes de varias neuronas sensoriales diferentes, incluyendo las neuronas URX las neuronas ASK que detectan los ascr, convergen en las interneuronas RMG, que se propone actúan como el eje central la coordinación de estas conductas (Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Las interneuronas RMG son el sitio central de la acción del receptor homólogo del neuropéptido Y NPR-1, que distingue las cepas solitarias (alta actividad de NPR-1) de las cepas sociales (baja actividad de NPR-1) (de Bono y Bargmann, Cell 94:679-89 (1998); Rogers et al., Nat . Neurosci. 6: 1178-1185 (2003) , los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . En los hermafroditas mutantes npr-l(lf) sociales, las neuronas URX que detectan el oxígeno promueven la agregación en los bordes del césped bacteriano, mientras que los hermafroditas N2 solitarios no responden a los gradientes de oxígeno. Del mismo modo, la repulsión por ascr depende de NPR-1, ya que los hermafroditas solitarios son repelidos por los ascr, mientras que los hermafroditas sociales npr-l(lf) muestran ya sea repulsión muy disminuida o débil atracción (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Por el contrario, se demostró que el icas#3 promueve la atracción y la agregación de los hermafroditas tanto de las cepas sociales y solitarias. El icas#3 atrajo a los hermafroditas N2 solitarios así como a los hermafroditas nprl-(lf) sociales y aumento la agregación de los hermafroditas en la cepa N2 solitaria, las cepas de tipo nativo sociales RC3'1 y CB4856 (Hawaii) que contienen una variante de baja actividad de NPR-1, y los dos alelos nulos npr-1 evaluados. El descubrimiento de que la atracción y la agregación mediadas por icas#3 no fueron reducidas por la actividad de NPR-1 sugiere que estas conductas mediadas por el icas#3 se basan en rutas de señalización distintas de aquellas que controlan las respuestas de agregación a otros tipos de estímulos, tales como los niveles bajos de oxígeno. Esto se encuentra sustentado por la observación de que los hermafroditas que carecen de las interneuronas RMG, las cuales coordinan las repuestas de agregación a través del NPR-1, fueron atraída inclusive por el icas#3. Además, la agregación mediada por el icas#3 difiere del comportamiento de agregación dependiente de NPR-1 en que la agregación de los gusanos en las placas con icas#3 fue más dinámica y no se restringe al borde del césped bacteriano donde el oxigeno es limitado. La velocidad de los gusanos no se redujo significativamente a concentraciones de icas#3 que inducen la agregación máxima (1-10 pM; Figura 6D) , y la agregación mediada por el icas#3 se asoció con menos aglomeraciones (tamaño promedio de las aglomeraciones de 3-5 gusanos) que aquellas encontradas para los gusanos mutantes NPR-1 que se aglomeran (tamaño promedio de las aglomeraciones de 6-16 gusanos) (Rogers et al., Curr. Biol. 16:649-59 (2006), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) . Estas observaciones muestran que la agregación mediada por icas#3 es fenotipicamente distinta de los comportamientos de agregación controlados por NPR-1 y las interneuronas RMG.

Se demostró que la atracción y la agregación mediadas por icas#3 agregación dependen de la Neuronas ASK, de forma similar a la repulsión de hermafroditas y la atracción de machos por los ascr (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), que se incorpora por la presente referencia en su totalidad) , lo que confirma el papel central de este par de neuronas sensoriales para la percepción de diferentes tipos de feromonas en C. elegans (Figuras 2A-E) . Además, se demostró que las respuestas al icas#3, dependen de las interneuronas de AFP y no requirieren las interneuronas RMG. Por lo tanto, parece que las neuronas sensoriales ASK participan en la percepción de dos tipos diferentes de feromonas, ascr e icas, y que estas señales se transducen a través de dos vías neurofisiológicas diferentes como parte de una circuitería neuronal y genética compleja que integra un arreglo estructuralmente diverso de señales por feromonas.

Las transiciones de calcio se han registrado desde las neuronas sensoriales de anfidios en respuesta a los no indol ascarósidos, sin embargo, los cambios reportados en la fluorescencia G-CaMP son relativamente pequeñas (del orden de un 20%) (Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009); Kim et al., Science 326:994-98 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Se ha informado recientemente de que el no indol ascarósido ascr#5 no provoca las transiciones de calcio en las neuronas sensoriales ASI, aunque las neuronas ASI funcionan como sensores de ascr#5 y expresan los receptores de ascr#5 srg-36 y srg-37 (McGrath et al., Nature 477:321-25 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Del mismo modo, no hubo detección de transiciones significativas de Ca2+ en las neuronas ASK en respuesta a un amplio rango de concentraciones de icas#3. Tal vez algunas señales de Ca2+ provocadas por el icas#3 en estas neuronas son aún más débiles que las de los no indol ascarósidos, ya que el icas#3 está activo a concentraciones extremadamente bajas ( femtomolares a picomolar baja) . Además, puede haber implicación de las neuronas adicionales en la señalización del icas#3, dado que las neuronas ASK son postsinápticas para un número de otras neuronas sensoriales (White et al., Philos. Trans. R. Soc. Londres [Biol] 314:1-340 (1986), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En particular, como se muestra en el presente documento, el icas#3 provocó cambios significativos en la fluorescencia de G-cAMP en las interneuronas AIA, las cuales son los objetivos postsinápticos primarios de las Neuronas sensoriales ASK (Figuras 2D-E) .

La identificación de los indol ascarósidos como señales de agregación revela una inesperada complejidad de la señalización social en C. elegans. Los resultados en el presente documento indican que las moléculas pequeñas derivadas de ascarilosa (icas y ascr) sirven al menos para tres funciones distintas en las larvas dauer de C. elegans: inducción de las larvas dauer, atracción de los machos y señalización social de los hermafroditas (Figura 4B) . Los estudios previos han demostrado que los ascr a menudo tienen más de una función. Por ejemplo, el ascr#3 desempeña un papel importante, tanto para la señalización de las larvas dauer y la atracción de los machos (Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Los resultados en este documento demuestran que las variantes estructurales especificas de las moléculas pequeñas derivadas de ascarilosa se asocian con funciones especificas (Figura 4C) . La adición de un grupo indol carboxi a los ascr cambia las propiedades de señalización de tal manera que los compuestos modificados por indol pueden tener efectos de señalización muy diferentes a los de los compuestos no modificados: el icas#3 atrae fuertemente a los hermafroditas y promueve la agregación, mientras que el ascr#3 rechaza a los hermafroditas y atrae a los machos. También se ha demostrado en este documento que, además de la variación estructural, las funciones de señalización distintas están asociados con diferentes ventanas de concentración: mientras que se requieren concentraciones nanomolares altas de ascr para la formación de las larvas dauer, concentraciones nanomolares bajas a las concentraciones picomolares altas de los ascr promueven la atracción de los machos, y las concentraciones picomolares a concentraciones femtomolares de los icas promueven la atracción y la agregación de los hermafroditas (Figura 4B) .

La señalización social en los en C. elegans por lo tanto parece estar basada en un lenguaje modular de moléculas pequeñas, derivado de ensamblaje combinatorio de varios bloques de construcción estructuralmente distintos (Figura 4C) . Las diferentes combinaciones de estos bloques de construcción sirven para diferentes funciones de señalización que se traslapan ocasionalmente. Los resultados de la abundancia relativa de los ascr y de los icas con cadenas laterales idénticas (Figura 9G) indican que la integración de los diferentes bloques de construcción se controla cuidadosamente. Bioquímicamente, los bloques de construcción se derivan de tres vías metabólicas básicas: metabolismo de los carbohidratos, la ß-oxidación de los ácidos grasos peroxisomales , y el metabolismo délos aminoácidos. Estas observaciones estructurales plantean la posibilidad de que la señalización social, a través de moléculas pequeñas transduce los impulsos desde el estado metabólico global del organismo. La disponibilidad de alimentos y el contenido de nutrientes en combinación con otros factores ambientales pueden controlar las vías de la biosíntesis de los ascr y los icas para generar mezclas de feromonas específicas que regulan diferencialmente la agregación, la atracción de pareja, y el calendario de desarrollo. El vocabulario expansivo de un lenguaje químico modular haría posible que diferentes nematodos se reconozcan conespecí ficamente así como interespecíficamente, pero no se sabía si las especies de nematodos distintos al C. elegans se basan en moléculas pequeñas basadas en ascarilosa para la comunicación química. Los glucósidos derivados de lípidos de ascarilosa han sido identificados a partir de varias otras especies de nematodos (Bartley et al., J. Nat. Prod. 59:921-26 (1996), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , lo cual puede indicar que los nematodos pueden tener la capacidad de producir compuestos similares a los ascr o los icas.

La identificación de los indol ascarósidos como señales de atracción y de agregación ha demostrado que el comportamiento de agregación del C. elegans depende de las señales químicas específicas producidas por sus congéneres y con preferencia no sólo compartida por las condiciones ambientales específicas. Por lo tanto, la señalización social del C. elegans parece ser mucho más evolucionada de lo que se sospechaba .

Ejemplo 29 - Instrumentación Analítica Los espectros de RMN se registraron en un espectrómetro Varían INOVA 600 (600 MHz para 1ti, 151 MHz para 13C) , INOVA 500 (500 MHz para 1H, 125 MHz para 13C) , o INOVA 400 (400 MHz para 1H, 100 MHz para 13C) . Los espectros de RMN fueron procesados utilizando los paquetes informáticos Varían VNMR, MestreLabs MestReC y Mnova .

HPLC-MS y HPLC-MS/MS de baja resolución se realizaron utilizando un sistema HPLC Serie 1100 de Agilent equipado con un detector de matriz de diodos y conectado a un espectrómetro de masas Quattro II (Micromass/Waters) . La MS/MS de alta resolución se realizó usando un espectrómetro de masas de Transformada de Fourier (FT) Híbrida de Velos Orbitrap LTQ (Thermo Scientific, Cornell University Life Sciences Core Laboratories Center) . Los análisis de HPLC-MS de alta resolución se realizaron usando el sistema nanoACQUITY UPLC de Waters equipado con una columna Acquity UPLC HSS C-18 de Waters (2.1 x 100 iran, diámetro de particular de 1.8 pm de partícula) conectado Espectrómetro de Masas Xevo G2 Q . El software MassLynx se utilizó para la adquisición y el procesamiento de los datos de MS .

La cromatografía en columna instantánea se llevó a cabo usando un sistema Teledybe ISCO CombiFlash. El fraccionamiento por HPLC se llevó a cabo usando el sistema HPLC serie 1100 de Agilent equipado con la columna Agilent Eclipse XDB-C18 (9.4 X 250 mm, diámetro de partícula de 5 m) acoplado a un colector de fracciones Teledyne ESCO Foxy 200.

Ejemplo 30 - Métodos Generales de Cultivo de las Cepas de C . elegans El c elegans de la variedad Bristol, la cepa N2 /tipo nativo), acox-1 (ok2257), dhs-28(hj8), maoc-1 (h 13 ) , maoc-l(ok2645), daf-22 (ml30) , daf-22 (ok693 ) , F58 F9.7 ( tm4033 ) , C48B4 (ok2619) , F59F4.1 (ok2119) , y F08A8. (tm5192 ) , se mantuvieron a 20°C sobre placas de agar NGM, preparadas con agar Bacto (BD Biosciences) y sembradas con OP50 de E. coli, cultivado durante toda la noche.

Ejemplo 31- Preparación de los Extractos de Metabolitos Los gusanos de tipo nativo (N2, Bristol) o los gusanos mutantes acox-1 (ok2257 ) , maoc-1 (hj 13 ) , dhs-28(hj8), y daf- 22(ok693) de cuatro placas NGM de 10 cm se lavaron usando medio M9 en un precultivo de 100 mL de medio S donde estos se cultivaron por cuatro días a 22°C en un agitador rotatorio a 220 revoluciones por minuto (rpm) . OP50 de E. coli concentrado derivado de 1 L de cultivo bacteriano se agregó como alimento en los días 1 y 3. Posteriormente, cada precultivo se dividió de forma equitativa en cuatro matraces Erlenmeyer de 500 mL contendiendo 100 mL de medio S en el dia 4. Dos de estos cultivos, etiquetados como no privados de alimento (NS) , se cultivaron durante 5 días a 22°C en un agitador rotatorio, y se alimentaron con el OP50 concentrado derivado de 500 mL de cultivo bacteriano cada dia desde el 1 a 4. Los dos cultivos restantes de cada conjunto, etiquetados como privados de alimento (S) se alimentaron una vez con OP50 concentrad derivado de 500 MI de cultivo bacteriano, el dia 1, y se cultivaron durante 9 días adicionales a 22°C en un agitador rotatorio, sin alimento. Posteriormente, los cultivos se recolectaron el día 5 para NS y el dia 10 para S, y se sometieron a centrifugación. Los medios sobrenadantes y las pelotillas de gusanos se congelaron sobre barro de hielo seco-acetona y se sometieron a liofilización por separado. Los materiales separados de los sobrenadantes se extrajeron con 150 mL de etanol al 95% a la temperatura ambiente durante 16 horas. Las pelotillas de gusanos se trituraron con ~2g de NaCl granular usando un mortero y pistilo, y se extrajeron con 100 mL de etanol al 100% a la temperatura ambiente durante 16 horas, las suspensiones resultantes se filtraron. El filtrado se evaporó al vacio a la temperatura ambiente, produciéndose los extractos de metabolitos de los medios (el "excretoma" de gusanos) y los extractos de metabolitos de las pelotillas de gusanos .

Ejemplo 32-Experimento de Alimentación de Ascarósido con daf-22 (ml30) Los experimentos de alimentación de ascarósido se llevaron a cabo con el mutante daf-2 (ml30 ) , el cual es menos sensible a los defectos del desarrollo debido a los ascarósidos agregados que el mutante daf-22 (ok693) . El análisis de HPLC-MS de daf-22 (mi 30) mostró perfiles de ascarósidos similares al daf-22 (ok693 ) , principalmente una carencia total de ascarósidos de cadena corta con una longitud de la cadena inferior a 12 átomos de carbono. Los cultivos no privados de alimento de daf-22 (ml30) se cultivaron como se describe en el Ejemplo 31, pero con la adición de 5 µ? por cultivo, ya sea de ascr#3 o de una mezcla 1:1 de ascr#10 y oscr#10, agregados en el día después de la división de los pre-cultivos .

Ejemplo 33- Preparación de las Muestras Los extractos de metabolitos de los medios o de las pelotillas de gusanos se volvieron a suspender en ~150 mL de metanol y se sometieron a centrifugación. Los sobrenadantes se recolectaron entonces, se concentraron al vacío a la temperatura ambiente, se volvieron a suspender en 1 mL de metanol, y se sometieron a centrifugación. 30 del extracto resultante se inyectaron directamente para el análisis de LC-MS/M.

Ejemplo 34- Análisis de Espectrometría de Masas El perfilado por HPLC-MS/MS de baja resolución se llevó a cabo usando el sistema HPLC Serie 1100 de Agilent, equipado con una columna Agilent Eclipse XDB-C18 (9.4 X 250 mm, diámetro de articula de 5 µ??) conectada al espectrómetro de masas Quattro II usando una división de 10:1. Se usó un gradiente de solvente de ácido aceito-acetonitrilo al 0.1% a una velocidad de flujo de 3.6 ml/min, iniciando con un contenido de acetonitrilo de 5% durante 5 minutos, el cual se aumentó al 100% durante un periodo de 40 minutos. Los extractos de metabolitos se analizaron por medio de HPLC-ESI-MS en los modos de iones negativos y positivos, usando un voltaje de capilaridad de 3.5 kV y un voltaje de cono de -40 V y +20 V, respectivamente. La identificación de HPLC-MS/MS para los iones precursores de m/z=73.0 (modo negativo) y la pérdida neutral de 130.0 (modo positivo) se llevó a cabo usando argón como el gas de colisión a 2.1 mtorr y 3 eV. La fragmentación de los ascarósidos se analizó adicionalmente por medio de MS/MS de alta resolución usando el LTQ Orbitrap. Para confirmar la composición elemental de los nuevos compuestos, las muestras y las fracciones del metaboloma mutante, se analizaron adicionalmente por medio de HPLC-MS de alta resolución usando el Xevo G2 QTof.

Ejemplo 35- Síntesis del Ascarósido oscr#9 El ascarósido oscr#9 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 2 siguiente.

Esquema de Reacción 2 Para preparar 3, una solución de 2 , 4-di-0-benzoil-l-ascarilosa-1- (2, 2, 2-tricloroacetimida) (1, 132 mg, 263 µp???, Butcher et al., Nat . Chem. Biol. 3:420-22 (2007) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y 5-hidroxipentanoato de metilo (2, 125 mg, 950 µp???, Huckstep et al., Synthesis 10:881-82 (1982), en cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DC seco ( 3 mi ) a 0 °C se trató con trimet ilsililoxi triflato (5 µ?) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03 (0.5 mi), se secó sobre Na2S04, y se concentró al vacio. Cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 20-40% de acetato de etilo en hexanos dio el 5 -3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2'-iloxi) pentanoato de metilo (3) (66.8 mg, 142 µp???, 47%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, acetona-de) : d (ppm) 1.28 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.67-1.80 (m, 4H) , 2.23 (m, 1H) , 2.40 (t, J = 6.9 Hz, 2H) , 2.48 (m, 1H) , 3.58 (m, 1H) , 3.64 (s, 3H) , 3.83 (m, 1H) , 4.13 (q, J = 9.8 Hz, J = 6.0 Hz, 1H ), 4.87 (s.br, 1H) , 5.15 (ddd, J = 11.0 Hz, J = 10.4 Hz, J = 4.5 Hz, 1H), 5.18 (s.br, 1H) , 7.50-7.60 (m, 4H) , 7.62-7.72 (m, 2H) , 8.05 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 8.11 (d, J = 7.5 Hz, 2H) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 18.3, 22.5, 29.6, 30.4, 34.0, 51.5, 67.5, 67.9, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.3, 130.4, 131.0, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9, 166.0, 174.0. Ver las Figuras 15A-B.

Para preparar el oscr#9, una solución de 3 (66.8 mg, 142 mol) en THF seco (0.5 mi) se añadió a una mezcla de LiOH (28 mg, 1.4 mmoles) y agua (0.6 mi) en 1,4-dioxano (4 mi) . Después de agitar a 66 °C durante 2 horas, la solución se acidificó con ácido acético glacial y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-30% de metanol en DCM conteniendo ácido acético al 1% proporcionó el ácido 5- ( 3 ' R, 5 ' R-Dihidroxi-6 ' S-metil- ( 2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi ) pentanoico ( oscr#9) (26 mg, 105 µp???, 74%) como un aceite incoloro. 1ti RMN (400 MHz, metanol-d4) : d (ppm) 1.22 (d, J = 6.0 Hz, 3H) , 1.58-1.72 (m, 4H) , 1.77 (ddd, J = 13.1 Hz, J = 11.1 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 1.95 (ddt, J = 13.1 Hz, J = 3.7 Hz, J = 0.9 Hz, 1H) , 2.33 (t, J = 7.2 Hz, 2H) , 3.43 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.0 Hz, 1H) 3.47-3.59 (m, 2H) , 3.71 (dt, J = 9.8 Hz, J = 6.2 Hz, 1H) , 3.77 (m, 1H) , 4.50 (s, 1H) ; 13C RMN (100 MHz, metanol-d ) : d (ppm) 18.1, 23.0, 30.1, 34.7, 36.0, 67.9, 68.3, 69.4, 70.9, 100.4, 177.5. Ver las Figuras 16A-B.

Ejemplo 36 - Síntesis del Ascarósido oscr#10 El ascarósido oscrllO se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 3 a continuación.

Esquema de Reacción 3 Para preparar 5, una solución de 2 , 4 -di-O-benzoil-ascarilosa-1- ( 2 , 2 , 2-tricloroacetimida ) (1, 132 mg, 263 µ????, Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y 9-hidroxinonanoato de metilo (4, 112.8 mg, 600 µ?t???, Kai et al., Tetrahedron 64:6760-69 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (3 mi) a 0 °C se trató con triflato de trimetilsililoxi (5 µ?) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHCC>3 (0.5 mi), se secó sobre Na2S04, y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 20-40% acetato de etilo en hexanos dio 9- ( 3 ' R, 5 ' R-dibenczoiloxi- 6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-21 -iloxi-iloxi ) nonanoato de metilo (5) (99.3 mg, 190 pmol, 72%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 1,28 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.30-1.40 (m, 6H) , 1.40-1.49 (m, 2H) , 1.56-1, 72 (m, 2H) , 2.22 (ddd, J = 13.6 Hz, J = 11.5 Hz, J = 3.2 Hz, 1H), 2.30 (t, J = 7.5 Hz, 2H) , 2.46 (m, 1H) , 3.55 (dt, J = 9.8 Hz, J = 6,5 Hz, 1H) , 3.60 (s, 3H) , 3.81 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.6 Hz, 1H) , 4.13 (q, J = 9.7 Hz, J = 6.2 Hz, 1H) , 4.86 (s.br, 1H) , 5.15 (ddd, J = 11.4 Hz, J = 9.8 Hz, J = 4.6 Hz, 1H), 5.18 (m, 1H) , 7.50-7.60 (m, 4H) , 7.63-7.71 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 18.3, 25.6, 26.8, 29.7, 29.9, 30.0, 30.2, 30.4, 34.4, 51.4, 67.4, 68.2, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.2, 130.3, 130.9, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9, 165.9, 174.3. Ver las Figuras 17A-B.

Para preparar el ascr#10, una solución de 5 (99.3 mg, 190 µp???) en THF (500 µ?) se añadió a una mezcla de LiOH (38 mg, 1.9 mmol) y agua (800 µ?) en 5 mi de 1,4-dioxano (5 mi) . Después de agitar a 66 °C durante 3 horas, la solución se acidificó con ácido acético y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-30% de metanol en DCM contendiendo ácido acético glacial al 1% proporcionó ácido 9-(3'R,5'R-dihidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) nonanoico (oscr#10) (49 mg, 161 µ????, 85%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 Hz, metanol-d4): d (ppm) 1.22 (d, J = 6.1 Hz, 3H) , 1.32-1.43 (m, 8H) , 1.56-1.63 (m, 4H) , 1.77 (ddd, J = 13.1 Hz, J = 11.1 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 1.96 (ddt, J = 13.1 Hz, J = 3.7 Hz, J = 0.9 Hz, 1H) , 2.28 (t, J = 7.4 Hz, 2H) , 3.41 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.2 Hz, 1H) 3.49-3.59 (m, 2H) , 3.68 (dt, J = 9.8 Hz, J = 5.5 Hz, 1H) , 3.76 (m, 1H ), 4.49 (s, 1H) ; 13C RMN (100 MHz, metanol-d4) : d (ppm) 17.3, 25.2, 26.4, 28.0, 29.3, 29.5, 29.6, 30.5, 34.1, 61.1, 67.4 , 68.5, 69.9, 99.4, 176.8. Ver las Figuras 18A-B.

Ejemplo 37 - Síntesis del Ascarósido bhas#10 El ascarósido bhas# 10 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 4 a continuación.

Esquema de Reacción 4 Para preparar 9, una solución de 6 (366 mg, 1.91 mmol, Guan y Greenberg, J. Am. Chera. Soc. 131: 15225-31 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y 7 (104 mg, 380 µp???, Evans y Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (10 mi) se trató con 1,4-benzoquinona (4 mg, 38 ymmol) en DCM (0.5 mi) y se agitó durante 10 minutos. Se añadió una solución de catalizador de Grubbs de 2da generación (16 mg, 19 µp???) en DCM (0.5 mi) . La mezcla resultante se agitó a 40 °C. Después de 20 horas, la mezcla se filtró sobre una pequeña capa de sílice y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 0-20% acetato de etilo en hexano proporcionó una mezcla del producto deseado 8 y el homodímero de 6. La mezcla no se purificó adicionalmente; en su lugar, la mezcla en bruto (160 mg) se disolvió en etanol (2 mi), se trató con Pd/C (15 mg, 10%, p/p) , y se sometió a hidrogenación durante 40 horas. La mezcla resultante se filtró, se concentró al vacio, y se purificó por cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 10-30% acetato de etilo en hexano para dar el ( 8R) -Hidroxi- ( 3R? ) -ter-butildimetilsililoxinonanoato de etilo (9) (48 mg, 144 µp???, 38%) en dos etapas) como un aceite incoloro. XH RMN (500 MHz, cloroformo-di) : d (ppm) 0.03 (s, 3H) , 0.06 (s, 3H) , 0.86 (s, 9H), 1.19 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.26 (t, J= 7.2 Hz, 3H), 1.29-1.47 (m, 6H) , 1.47-1.53 (m, 2H) , 2.40 (dd, J= 14.6 Hz, J= 5.7 Hz, 1H) , 2.44 (dd, J= 14.6 Hz, J = 7.0 Hz, 1H) , 3.75-3.83 (m, 1H) , 4.09-4.15 (m, 3H) . Ver la Figura 19.

Para preparar 10, una solución de 2 , 4-di-O-benzoil-ascarilosa-1- ( 2 , 2 , 2-tricloroacetimida ) (1, 62 mg, 120 µp???, Butcher et al., Nat . Chem. Biol. 3:420-22 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (2 mi) a -10 °C se trató con 9 (47 mg, 141 µ????) y triflato de trimetilsililoxi (10 µ?) . Después de 3.5 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03 (0.5 mi), se secó sobre a2S04, y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 10 - 40% acetato de etilo en hexano dio el ( 8R) - ( 31 R, 5 ' R-dibenzoiloxi-6 ' 5-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi ) - ( 3R) -hidroxinonanoato de etilo (10) (4.0 mg, 7,2 µ?t???, 6%) como un aceite incoloro. 1ti RMN (400 MHz, cloroformo-di ) : d (ppm) 1.19 (d, J = 6.1 Hz, 3H), 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 1.28 (d, J = 6.4 Hz, 3H) , 1.33-1, 72 (m, 8H) , 2.20 (ddd, J = 14.3 Hz, J = 11.6 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 2.42 (dd, J = 16.5 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 2.38-2.45 (m, 1H) , 2.52 (dd, J = 16.5 Hz, J = 3.0 Hz, 1H) , 3.00 (d, J = 3.9 Hz, 1H) , 3.80-3.89 (m, 1H) , 3.98- 4.07 (m, 1H) , 4.11 (q, J = 9.7 Hz, J = 6.1 Hz, 1H) , 4.17 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 4.95 (s.br, 1H) , 5.12-5.22 (m , 2H) , 7.43-7.50 (m, 4H) , 7.55-7.62 (m, 2H) , 8.05 (d, J = 7.5 Hz, 2H) , 8.11 (d, J = 7.5 Hz, 2H) . Ver la Figura 20.

Para preparar el bhas#10, una solución de 10 (4 mg, 7.2 mol) en THF (150 µ?) se trató con LiOH (7 mg, 290 µ?) en agua (100 µ?) y 1,4-dioxano (250 mi) a 67 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se acidificó con ácido acético (100 µ?) , se concentró al vacio, se trató con metanol (2 mi) , y se concentró al vacio. La cromatografía en columna ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de 5-25% de metanol en DCM con 0.5% de ácido acético glacial proporcionó ácido (8R)- (3' R, 5' R-dihidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - ( 3R) -hidroxinonanoico (bhas# 10) (1.5 mg, 4.7 µ mol; 65%) como un aceite incoloro. 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), y los datos espectroscópicos de R N de HMBC del bhas# 10 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 4 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2H0D) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 21A-D.

Tabla 4. Datos espectroscópicos de RM del bhas#10 Ejemplo 38 - Síntesis del Ascarósido bhas# 22 El ascarósido bhas# 22 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 5 a continuación.

Esquema de Reacción 5 Para preparar 12, una solución de 2 , 4 -di-O-benzoil-ascarilosa-1- (2 , 2 , 2-tricloroacetimida) (1, 132 mg, 263 µp???, Butcher et al., Nat . Chem. Biol. 3:420-22 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (3 mi) a 0 °C se trató con ( 8R) -hidroxinon-l-eno (11, 85.2 mg, 600 µ????, Ferrie et al., Synlett 18:2891-93 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y trimetilsililoxi triflato (5 µ?) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHCC>3 (0.5 mi), se secó sobre a2SÜ4, y se concentró al vacío. La cromatografía el columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 10-30% de acetato de etilo en hexanos proporcionó el ( 8R) - ( 3 ' R, 5 ' R-dibenzoiloxi-ß' S-metil- ( 2H) -tetrahidropiran-21 -iloxi ) no-l-eno (12) (71.0 mg, 148 µ????, 56%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 1.20 (d, J = 6.1 Hz, 3H) , 1.27 (d, J = 6.3 Hz, 3H) , 1.33-1.72 (m, 8H) , 2.09 (m, 2H) , 2.23 (ddd, J = 13.5 Hz, J = 11.4 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 2.47 (m, 1H) , 3.91 (m, 1H) , 4.20 (q, J = 9.6 Hz, J = 6.1 Hz, 1H) , 4.93 (ddt, J = 10.2 Hz, J = 2.2 Hz, J = 1.3 Hz, 1H), 5.01 (s.br, 1H) , 5.02 (ddt, J = 17.1, Hz, J = 2.2 Hz, J = 1.6 Hz, 1H) , 5.13 (m, 1H) , 5.16 (ddd, J = 11.3 Hz, J = 9.8 Hz, J = 4.6 Hz, 1H) , 5.84 (ddt, J = 17.1 Hz, J = 10.3 Hz, J = 6.8 Hz, 1H) , 7.50-7.60 (m, 4H) , 7.63-7.71 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.12 (m, 2H) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 18.3, 19.5, 26.3, 29.7, 29.7, 30.4, 34.4, 37.8, 67.7, 71.5, 72.1, 72.9, 94.4, 114.8, 129.4, 129.5, 130.2 , 130.4, 131.0, 131.0, 134.1, 134.2, 139.8, 165.9, 166.0. Ver las Figuras 22A-B.

Para preparar 13, una solución de 12 (38 mg, 80 µp???) y 7 (65 mg, 240 umol, Evans y Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (2 mi) se trató con 1, 4-benzoquinona (1 mg, 8 umol) en DCM (0.5 i) y se agitó durante 10 minutos. Se añadió una solución del catalizador de Grubbs de 2da generación (3 mg, 4 ymol) en DCM (0.5 mi). La mezcla resultante se agitó a 40 °C. Después de 20 horas, la mezcla se filtró sobre una pequeña capa de sílice y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre sílice utilizando un mezcla 5:1 de hexanos y acetato de etilo, proporciona (12R) - (3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2' -iloxi) - (3R) -ter-butildimetilsililoxitridec-5-enoato de etilo (13) (17.0 mg, 23 umol, 29%) como un aceite incoloro. XH RM (400 MHz, cloroformo-di) : d (ppm) 0.03 (s, 3H), 0.06 (s, 3H), 0,86 (s, 9H) , 1.19 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.28 (d, J = 6.3 Hz, 3H) , 1.32-1.44 (m, 4H) , 1.44-1.52 (m, 2H), 1.61-1.68 (m, 2H) , 1.99-2.06 (m, 2H) , 2.17 a 2.22 (m, 3H) , 2.38-2.43 (m, 3H) , 3.84 (m, 1H) , 4.6-4.18 (m, 4H) , 4.95 (s, 1H) , 5.14 (s.br, 1H), 5.18 (dt, J = 4.2 Hz, J = 10.6 Hz, 1H) , 5.39 (dt, J = 15.2 Hz , J = 6.8 Hz, 1H), 5.47 (dt, J = 15.2 Hz, J = 6.3 Hz, 1H) , 7.43-7.49 (m, 4H), 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 8.11 (d, J = 7,2 Hz, 2H) . Ver la Figura 23.

Para preparar 14, una solución de 13 (14.2 mg, 18.9 umol) en metanol (1.5 mi) se trató con Pd/C y se sometió a hidrogenación durante 24 horas. La mezcla se filtró y se concentró al vacío para dar (12R)-(3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -ter-butildimetilsililoxitridecanoato de etilo (14) (12.8 mg, 17.0 umol, 90%) como un aceite incoloro. ¾ RMN (600 MHz, cloroformo-di) : d (ppm) 0.03 (s, 3H), 0.05 (s, 3H), 0.86 (s, 9H) , 1.19 (d, J = 6.1 Hz, 3H) , 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 3H), 1.28 (d, J = 6.3 Hz, 3H) , 1.29-1.40 (m, 10H) , 1.42-1.53 (m, 4H), 1.58-1.68 (m, 2H) , 2.21 (ddd, J = 14.0 Hz, J = 11.7 Hz, J = 2.8 Hz, 1H), 2.37-2.45 (m, 3H) , 3.84 (m, 1H) , 4.8-4.15 (m, 4H) , 4.95 ( s, 1H), 5.14 (s.br, 1H) , 5.18 (dt, J = 4.2 Hz, J = 10.6 Hz, 1H) , 7.43-7.49 (m, 4H), 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (d, J = 7.4 Hz, 2H) , 8.11 (d, J = 7.2 Hz, 2H) . Ver la Figura 24.

Para preparar 15, una solución de 14 (19.5 mg, 26.8 umol) en acetonitrilo (1 mi) se trató con ácido fluorhídrico acuoso al 40% (10 µ?) en acetonitrilo (100 µ?) . Después de agitar durante 1 hora, la solución se trató con NaHC(¾ (100 mg) durante 15 minutos, se secó sobre Na2SC>4 , y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5 - 80% de acetato de etilo en hexanos proporcionó el (12R) - (3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2'-iloxi) - (3R) -hidroxitridecanoato de etilo (15) (12,0 mg, 19.6 umol; 73%) como un aceite incoloro. XH RM (501 MHz, cloroformo-di) : d (ppm) 1.19 (d, J = 6.1 Hz, 3H) , 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 1.28 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 1.30-1.55 (m, 14H) , 1.60-1,68 (m. 2H) , 2.21 (ddd, J = 13.5 Hz, J = 11.6 Hz, J = 3.1 Hz, 1H) , 2.38 (dd, J = 16.4 Hz, J = 9.2 Hz, 1H), 2.41 (m, 1H) , 2.49 (dd, J = 16.3 Hz, J = 3.1 Hz, 1H) , 3.84 (m, 1H), 3.99 (m, 1H) , 4.12 (dq, J = 9.8 Hz, J = 6.2 Hz, 1H) , 4.17 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 4.95 (s, 1H) , 5.15 (s.br, 1H) , 5.18 (ddd, J = 11.2 Hz, J = 9.9 Hz, J = 4.5 Hz, 1H) , 7.43-7.49 (m, 4H) , 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) . Ver la Figura 25.

Para preparar el bhas#22, una solución de 15 (12 mg, 19.6 umol) en THF (1 mi) se trató con LiOH (15 mg) en agua (200 µ?) y 1,4-dioxano (2 mi) a 67 °C durante 3 horas. La mezcla de reacción se acidificó con ácido acético (100 µ?) , se concentró al vacío, se trató con metanol (2 mi) , y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-30% de metanol en DCM con 0.2% de ácido acético proporcionó el ácido (12R) - (3 'R, 5'R-dihidroxi-6' S- metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxitridecanoico (bhas#22) (7.3 mg, 19.4 umol; 99%) como un aceite incoloro.

Los datos espectroscopicos de RMN de ¾ (600 MHz) , 13C (151 MHz), HMBC del bhas# 22 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 5 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren al (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2H0D) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 26A-D.

Tabla 5. Da'bos especbroscóplcos de RMN del bhas#22 Ejemplo 39 - Síntesis del Ascarósido bhos#26 El ascarósido bhos#26 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 6 a continuación.

Esquema de Reacción 6 Para preparar 17, una solución de 2, 4-di-0-benzoil-ascarilosa-1- (2 , 2 , 2- tricloroacetimida) (1, 132 mg, 263 µp???, Butcher et al., Nat . Chem. Biol. 3:420-22 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (3 mi) a 0 °C se trató con 11-hidroxiundec-l-eno (16, 102 mg, 600 µp???) y trimetilsililoxi triflato (5 µ?) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHCC>3 (0.5 mi), se secó sobre Na2S04, y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre sílice, usando un gradiente de 10-30% (v/v) de acetato de etilo en hexanos proporcionó el 11- ( 3 ' R, 5 ' R-dibenzoiloxi- 6' S-metil- ( 2H ) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) undec-l-eno (17) (92.3 mg, 182 µp???, 69%) como un aceite incoloro. 1H RMN (400 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 1.28 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.30-1.49 (m, 11H) , 1.63-1.72 (m, 2H) , 2.03 (m, 2H) , 2.22 (ddd, J = 13.5 Hz, J = 11.3 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 2.46 (m, 1H) , 3.55 (dt, J = 9.7 Hz, J = 6.5 Hz, 1H) , 3.80 (dt, J = 9.8 Hz, J = 6.7 Hz, 1H) , 4.13 (q, J = 9.8 Hz, J = 6.3 Hz, 1H) , 4.86 (s.br, 1H) , 4,90 (ddt, J = 10.2 Hz, J = 2.2 Hz, J = 1.3 Hz, 1H) , 5.98 (ddt, J = 17.1, Hz, J = 2.2 Hz, J = 1.6 Hz, 1H) , 5.15 (ddd, J = 11.3 Hz, J = 9.8 Hz, J = 4.6 Hz, 1H), 5.18 (m, 1H) , 5.80 (ddt, J = 17.1 Hz, J = 10.3 Hz, J = 6.8 Hz, 1H), 7.49-7.59 (m, 4H) , 7.62-7.71 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d (ppm) 18.28, 26.88, 29.67, 29.83, 30.10, 30.16, 30.28, 34.46, 67.43, 68.25, 71.43, 71.53, 97.00, 114.66, 129.42, 129.48, 130.23, 130.35, 130.95, 130.96, 134.08, 134.19, 139.78, 165.89, 165.91. Ver las Figuras 27?-?.

Para preparar 18, una solución de 17 (30.8 mg, 60 µp???) y 7 (50 mg, 180 µp???, Evans y Andrews, Angew. Chem. Int. Ed. 47:5426-29 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (2 mi) se trató con 1,4-benzoquinona (1 mg, 8 µ?a??) en DCM (0.5 mi) y se agitó durante 10 minutos. Se agregó una solución de catalizador de Grubbs de 2da generación (3 mg, µp???) en DCM (0.5 mi) . La mezcla resultante se agitó a 40 °C. Después de 20 horas, la mezcla se filtró sobre una pequeña capa de sílice y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre sílice utilizando una Mezcla 5:1 de hexanos y acetato de etilo, proporcionó 15- ( 3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -ter-butildimetilsililoxipentadec-5-enoato de etilo (18) (14.2 mg, 18,9 µp???, 31%) como un aceite incoloro. ?? RMN (400 MHz, cloroformo-di) : d (ppm) 0.03 (s, 3H) , 0.06 (s, 3H) , 0.86 (s, 9H) , 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 1.30 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.27-1.43 (m, 12H) , 1.61-1.68 (m, 2H) , 1.95-2.02 (m, 2H) , 2.16 a 2.25 (m, 2H), 2.35- 2.46 (m, 3H) , 3.50 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.5 Hz, 1H), 3.76 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.8 Hz, 1H) , 4.4-4.18 (m, 4H) , 4.82 (s, 1H) , 5.18 (ddd, J = 11.2 Hz, J = 9.9 Hz, J = 4.7 Hz, 1H), 5.21 (s.br, 1H) , 5.37 (dt, J = 15.2 Hz, J = 7.0 Hz, 1H) , 5.45 (dt, J = 15.3 Hz, J = 6.9 Hz, 1H) , 7.43-7.50 (m, 4H) , 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) . Ver la Figura 28.

Para preparar 19, una solución de 18 (14.2 mg, 18.9 µp???) en metanol (1.5 mi) se trató con Pd/C (10 mg, 10%, p/p) y se sometió a hidrogenación durante 24 horas. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-80% de acetato de etilo en hexanos dio 15- (3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -ter- butildimetilsililoxipentadecanoato de etilo (19) (12.8 mg, 17.0 µ?t???, 90%) como un aceite incoloro. 1ñ RMN (400 MHz , cloroformo-d; ) : d (ppm) 0.03 (s, 3H) , 0.06 (s, 3H) , 0.86 (s, 9H) , 1.25 (t, J = 7.2 Hz, 3H) , 1.30 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.25-1.36 (m, 14H) , 1.36-1.42 (m, 2H) , 1.45-1.51 (m, 2H) , 1.61-1.68 (m, 2H) , 2.21 (ddd, J = 14.3 Hz, J = 11.4 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 2.35-2.46 (m, 3H) , 3.50 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.5 Hz, 1H) , 3.76 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.8 Hz, 1H) , 4.4-4.18 (m, 4H) , 4.82 (s, 1H) , 5.18 (ddd, J = 11.2 Hz, J = 9.9 Hz, J = 4.7 Hz, 1H) , 5.20 (s.br, 1H.), 7.43-7.50 (m, 4H) , 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) . Ver la Figura 29.

Para preparar 20, una solución de 19 (9.2 mg, 12.2 µp???) en acetonitrilo (2 mi) se trató con ácido fluorhídrico al 40% (20 µ?) . Después de agitar durante 1 hora, la solución se trató con NaHCC>3 (100 mg) durante 15 minutos, se secó sobre Na2SC>4 , y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-80% acetato de etilo en hexanos dio el 15- ( 3' R, 5' R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxipentadecanoato de etilo (20) (4.4 mg, 6,9 µp???; 57%) . 1ti RMN (400 MHz, cloroformo-di ) : d (ppm) 1.27 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.30 (d, J = 6.2 Hz, 3H) , 1.25-1.36 (m, 16H), 1.36-1.42 (m, 2H) , 1.45-1.51 (m, 2H) , 1.61-1.68 (m, 2H) , 2.21 (ddd, J = 14.3 Hz, J = 11.4 Hz, J = 3.2 Hz, 1H) , 2.39 (dd, J = 16.4 Hz, J = 9.0 Hz, 1H), 2.41 (m, 1H) , 2.50 (dd, J = 16.4 Hz, J = 3.0 Hz, 1H) , 3.50 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.5 Hz, 1H) , 3.76 (dt, J = 9.6 Hz, J = 6.8 Hz, 1H) , 3.99 (m, 1H) , 4.07 (dq, J = 10.0 Hz, J = 6.2 Hz, 1H), 4.17 (q, J = 7.1 Hz, 2H) , 4.82 (s, 1H) , 5.18 (ddd, J = 11.2 Hz, J = 9,9 Hz, J = 4.7 Hz, 1H) , 5.20 (s. br , 1H) , 7.43 -7.50 (m, 4H) , 7.56-7.61 (m, 2H) , 8.04 (m, 2H) , 8.11 (m, 2H) . Ver la Figura 30.

Para preparar el bhos#26, una solución de 20 (4.4 mg, 6.9 pmol) en THF (1 mi) se trató con una solución de LiOH (5 mg) en agua (200 µ?) y 1,4-dioxano (2 mi) y se agitó a 67 ° C. Después de 3 horas, la solución se acidificó con ácido acético glacial (50 µ? y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-50% de metanol en DCM con 0.2% de ácido acético proporcionó el ácido 15- (3'R, 5' R-dihidroxi-6 ' S-metil- (2H) - ( tetrahidropiran-2 ' -iloxi) - (3R) -hidroxipentadecanoico (bhos#26) (2.3 mg, 5.7 µ????; 83%).

Los datos espectroscópicos de RMN de 1H (600 MHz) , 13C (151 MHz), y HMBC para el bhos#26 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 6 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 31A-D.

Tabla 6. Datos espectroscópicos de RMN del bhos#26 Ejemplo 40 - Síntesis del Ascarósido icos#10 El ascarósido icos#10 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 7 a continuación.

Esquema de Reacción 7 Para preparar el icos#10, una solución de oscr#10 (12 mg, 39.5 µ????) en una mezcla de metanol (1 mi) y tolueno (1 mi) se trató con TMS-diazometano 2.0M en éter dietilico (23 µ?, 46 µ????) . Después de agitar durante 30 minutos, el exceso de reactivo se desactivó mediante la adición de ácido acético (20 µ?) y la solución se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-10% de metanol en DCM proporcionó el éster metílico (11.3 mg, 35.5 µp\?1, 90%) como un sólido incoloro.

Una solución del éster metílico en DCM (1 mi) a -20 °C se trató con DIPEA (175 µ?, 1 mmol) y cloruro de ácido indolcarboxílico . El cloruro de ácido indolcarboxílico estaba recién preparado por el tratamiento del ácido indol-3-carboxílico (68 mg, 420 µp???) en DCM (2 mi) a 0 °C con DMF (10 µ?) y SOCI2 (72 µ?, 840 µp???) . Después de agitar la mezcla de reacción durante 20 minutos a temperatura ambiente, la solución se concentró al vacío y se agregó gota a gota DCM (2 mi) . La solución se dejó llegar a -7 °C y después se inactivo con una solución acuosa saturada de NaHCC>3 (2 mi) . La fase acuosa se extrajo con DCM (2 mi, tres veces) . Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S04 y se concentraron al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-10% de metanol en DCM proporcionó una mezcla isomérica de indol carboxilato ésteres (8.4 mg, 18.2 µp???, 51%) . La mezcla isomérica resultante de indol carboxilato ésteres se disolvió en THF (1 mi) y se trató con una solución de LiOH (2.8 mg, 116 µ????) en agua (0.5 mi) y 1,4-dioxano (2 mi) a 67 °C. Después de agitar durante 2 horas, la solución se acidificó con ácido acético (30 µ?) y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-20% de metanol en DCM conteniendo 0.2% de ácido acético proporcionó una mezcla isomérica de los isómeros de icos#10. La HPLC proporcionó muestras puras de ácido 9- ( 5' R- ( ( 1H) -indol-3-carboniloxi) -3' R- hidroxi-6' S-metil-tetrahidro- (2H) -piran-21 -iloxi) nonanoico (icos#10) (0.6 mg, 1,3 µp???, 7%) y su isómero (0.3 mg, 0.67 µp??? , 3.7%) .

Los datos espectroscópicos de RMN de 1H (600 MHz), 13C (151 MHz) , y HMBC para el icos#10 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 7 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a ( C D2HOD ) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 32A-D.

Tabla 7. Datos espectroscópicos de RMN del icos#10 Ejemplo 41 - Síntesis del Ascarósido hbas#3 El ascarósido hbas#3 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 8 a continuación.

Esquema de Reacción 8 Para preparar 22, una solución de ácido 4-hidroxibenzoico (21, 1.52 g, 10 mmol) en DMF (7 mi) se trató con DI PEA (5.2 mi, 30 mmol) y cloruro de ter-butildimet ilsililo (3.7 g, 24.5 mmol) . Después de 12 horas, la mezcla se llevó a un pH de 4 mediante la adición de H3PO4 1M. La mezcla se extrajo dos veces con hexanos (15 mi) . La fase orgánica se lavó dos veces con agua (15 mi), se secó sobre Na2SC>4 y se concentró al vacio. El residuo (3.7 g) se disolvió en THF (10 mi), y se trató con agua (7 mi) y ácido acético glacial (21 mi) . Después de agitar durante 90 minutos, la mezcla se añadió a agua helada y se extrajo dos veces con una mezcla 1:1 (v/v) de éter dietilico y hexanos (30 mi) . La fase orgánica se lavó con agua (30 mi), se secó sobre Na2SC> y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-20% de metanol en DCM conteniendo 0.2% de ácido acético proporcionó el ácido 4-ter-butildimetilsililoxibenzoico (22, 1.42 g, 5.3 moles, 53%) como un sólido blanco. :H RMN (400 MHz, cloroformo-di) d (ppm) 0.24 (s, 6H) , 0.99 (s, 9H) , 6.89 (d, J = 8.8 Hz, 2H) , 8.02 (d, J = 8.8 Hz, 2H) ; 13C RMN (100 MHz , cloroformo-di) : d (ppm)- 4.22, 18.40, 25.73, 120.08, 122.39, 132.46, 132.46, 161.01, 172.23. Vea las figuras 33 AB.

Para preparar el hbas#3, una solución del ascarósido#3 metil éster (23, 5.7 mg, 18 µ????, Srinivasan et al., pub. Lib. Sci. Biol. 10: el001237 (2012), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (500 µ? se trató con 22 (11.0 mg, 41 µp???), clorhidrato de l-etil-3-(3-dimet ilaminopropil ) carbodiimida (EDC, 9.0 mg, 47 µp???), y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 6.2 mg, 51 µ?a??) . Después de agitar durante 48 horas, la solución se concentró al vacio y se trató con ¾0 (500 µ?) . Los productos resultantes se extrajeron con DCM (1 mi, tres veces), se secaron sobre Na2SC>4 , y se concentraron al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 0-30% de metanol en DCM proporcionó una mezcla isomérica de los 4-ter-butildimetilsililoxibenzoil-ascarósido#3 metil ésteres (7.3 mg, 12.9 µp???; 72%) .

Para la desprotección del grupo ter-but ildimetilsililoxi aromático (Jiang y Wang, Tetrahedron Lett. 44:3859-61 (2003), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , una mezcla de los ( 4-ter-butildimetilsililoxibenzoil ) -ascarósido#3 metil ésteres (6.0 mg, 10.7 µ????) en DMF (360 µ?) se trató con Cs2C03 (1.9 mg, 5.4 µ????) en H20 (36 µ?) y se agitó durante 3.5 horas. Los productos resultantes se extrajeron con DCM (1 mi, dos veces), se secaron sobre Na2SC , y se concentraron al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 0-30% de metanol en DCM proporcionó una mezcla isomérica de 4-hidroxibenzoil-ascarósido#3 metil ésteres (4.5 mg, 10.0 µp???; 93%) . Para la escisión del grupo metil éster, una mezcla de los 4-hidroxibenzoil-ascarósido#3 metil ésteres (4.5 mg, 10.0 µ???) en THF (100 µ?) se trató con LiOH (2.3 mg) en H20 (30 µ?) y 1,4-dioxano (500 µ?) en 67 °C. Después de 2 horas, la reacción se inactivo mediante la adición de ácido acético glacial (50 µL) . La solución se concentró al vacío. La cromatografía en columna ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de 5-20% de metanol en DCM con 0.2% de ácido acético produjo una mezcla de isómeros de los isómeros de hbas#3 (1.2 mg, 2.8 µp???, 28%) . La HPLC proporcionó muestras puras de ácido ( 8R) - ( 3' R-hidroxi-5' R- ( 4 -hidroxibenzoiloxi ) -6' S-metil- (2H)- tetrahidropiran-21 -iloxi) -non- (2E) -enoico (HBA # 3) (0.6 mg, 1.4 µp???; 14%) y su isómero (0.6 mg, 1.4 µp???; 14%) .

Los datos espectroscópicos de XH (600 MHz), 13C (151 MHz), y HMBC del HBA # 3 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 8 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2H0D) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 34A-C.

Tabla 8. Datos espectroscopicos de R N del hbas#3 Ejemplo 42 - Síntesis del Ascarósido mbas#3 El ascarósido mbas#3 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 9 a continuación.

Esquema de Reacción 9 Para preparar el mbas#3, una solución del ascarósido#3 metil éster (23, 10 mg, 31.4 µ????, Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10:el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en DCM seco (1 mi) a 0 °C se trató con DIPEA (110 µ?, 630 µp???) . Se agregó gota a gota cloruro de ácido (E) -2-metilbut-2-enoico (35 µ?, 316 µ????) en DCM (0.5 mi) . Después de agitar a 0 °C durante 1 hora, la solución se dejó volver a la temperatura ambiente y se trató con una solución acuosa saturada de NaHCC>3 (0.5 mi). El producto se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre Na2S0 , y se concentró al vacio. La cromatografía ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de 5-25% de acetato de etilo en hexanos proporcionó el di-tiglato éster (5.2 mg, 10,8 µp???, 34%) como un sólido amarillento.

El producto (4.5 mg, 9.4 µ????) se disolvió en THF (1 mi) y se trató con LiOH (0.5 mg, 22 µ????) en agua (100 µ?) y 1,4-dioxano (2 mi) . Después de agitar a 67 °C durante 3 horas, la reacción se inactivo mediante la adición de ácido acético glacial (100 µL).La solución se concentró al vacío. El residuo se disolvió en metanol y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 0-20% de metanol en DCM conteniendo 0.2% de ácido acético dio una mezcla de isómeros de mbas#3 (2.1 mg, 5,45 µ?t???) . La HPLC proporcionó una muestra pura de ácido (8R) - (3' R-hidroxi-5' R- (E) - (2-metilbut-2-enoiloxi) -6' S-metil- ( 2H) -tetrahidropiran-2 ' -iloxi ) non- ( 2E ) -enoico (mbas#3 ) (1.2 mg, 3.1 µ?a??; 33% de rendimiento) idéntico al producto natural del C. elegans.

Los datos espectroscópicos de 1H (600 MHz), 13C (151 MHz), y HMBC para el mbas#3 se obtuvieron usando metanol-cU y se muestran en la Tabla 9 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 35A-B.

Tabla 9. Da-tos espectroscópicos de RMN del mbas#3 Ejemplo 43 - Síntesis del Ascarósido glas#10 El ascarósido glas#10 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 10 a continuación.

Esquema de Reacción 10 Para preparar el glas#10, una solución de ascr#10 (3 mg, 9.9 pmol) en DMF seca (2 mi) se trató con 2 , 3 , 4 , 6-tetra-O- bencil-D-glucosa (11 mg, 20 µp???), DMAP (12.2 mg, 100 µp???) y EDC (19.2 mg, 100 µp???) . Después de agitar a temperatura ambiente durante 18 horas, la solución se concentró al vacio. El residuo se trató con ácido acético acuoso (200 µL) , se concentró, y se purificó por cromatografía en columna ultrarrápida sobre sílice usando un gradiente de 5-50% de metanol en DCM.

El producto se disolvió en etanol (1 mi), se trató con Pd/C (10 mg, 10% de Pd (p/p) ) , y se sometió a hidrogenación durante 24 horas. La mezcla se filtró y se concentró al vacío. La HPLC proporcionó muestras puras de ß-D-glucosil-ascarósido #10 (1.5 mg, 3.22 µ????, 33%)) y a-D-glucosil-ascarósido#10 (1.2 mg, 2.58 µp >1, 26%) .

Los datos espectroscópicos de RMN de XH (600 MHz), 13C (151 MHz), y HMBC del glas#10 se obtuvieron usando metanol-d4 y se muestran en la Tabla 10 a continuación. Los desplazamientos químicos se refieren a (CD2HOD) = 3.31 ppm y (CD2HOD) = 49.05 ppm. Ver las Figuras 36A-D.

Tabla 10. Datos espectroscóplcos de RMN del glas#10 Ejemplo 44 - Identificación y Cuantificación de los Ascarósidos Para la identificación de ascarósidos detectados en el los gusanos de tipo nativo y mutantes (ascr, oscr, bhas, bhos, icas, icos, ibha, ib o y glas), los tiempos de retención de HPLC se graficaron frente al m/z (o la longitud de la cadena) . (Para los datos de HPLC-EMI-MS, ver la Figura 37? (ascarósidos (?-l ) -oxigenados (ascr)). La Figura 37B (ascarósidos (?)- oxigenados (oscr), la Figura 37C ( ß-hidroxiascarósidos (?-1)- oxigenados (bhas), la Figura 37D ( ß-hidroxiascarósidos (?)- oxigenados (bhos)), la Figura 37E (indol ascarósidos (?-1)- oxigenados (icos)), la Figura 37F (indol ascarósidos (?)- oxigenados (icos) ) , la Figura 37G, indol ß-hidroxiascarósidos (?-l ) -oxigenados (iba)), la Figura 37H (indol ß-hidroxi ascarósidos (?) -oxigenados (ibho)), la Figura 371 (glucosil ascarósido ésteres (glas)), la Figura 37J (ascr#8 y 4- (4- hidroxibenzoil ) - y 4- (2- (E) -metil-2-butenoil ) -ascarósidos (hbas y mbas)), y la Figura 37K (ascr#2 y ascr#6.1)) . Los componentes que pertenecen a la serie de homólogos exhibieron un perfil de elución casi lineal (Figura 38), lo que indica que los componentes dentro de la serie comparten la misma estereoquímica relativa. La estructura y la estereoquímica de las varias series se identificaron entonces con base en (1) el aislamiento de los ejemplos representativos y el análisis de RMN (por ejemplo, véanse las Figuras 39A-B, 40A-B, 41A-B, 42 y 43A-B) , (2) la comparación de los ejemplos representativos con los estándares sintéticos, (3) la fórmula molecular como se establece a partir de MS de alta resolución, (4) la fragmentación característica por MS/MS (véanse las Figuras 44A-P) , y (5) los tiempos de retención de HPLC que igualan los valores de tiempo de retención extrapolados a partir de aquellos de las muestras sintéticas. La configuración (E) de los ascarósidos a, ß-insaturados se estableció por comparación con el ascr#3, el ascr#3 y el ascr#7 con configuración (Z), y también fue sugerida por la estereoselectividad de la actividad de acil-CoA-oxidasa (ACOX) . La estereoquímica (3R) de los ß-hidroxiascarósidos (la serie de bhas y bhos) se dedujo a partir de la comparación con los estándares sintéticos de bhas#10, bhas#22, y bhos#26 como ejemplos representativos, y también fue sugerida a partir de la homología de la secuencia de MAOC-1 y DHS-28 con MFE-2 con selectividad para (R) (Figura 45) .

La cuantificación de los ascarósidos se llevó a cabo mediante la integración de las señales de LC-MS a partir de las trazas de iones correspondientes. Las concentraciones de los ascarósidos se calcularon usando los factores de respuesta determinados para los estándares sintéticos de ascr#l, ascr#3, ascr#5, ascr#7, ascr#9, ascr#10, oscr#9, oscr#9, bhas# 22, bhos#26, icas#3, icas#9, icos#10 y glas # 10. Para la mayoría de los compuestos, la respuesta espectrómetro de masas fue más o menos lineal (error de menos de 10%) para cantidades de 1 pmol a 2 nmol por inyección. Los factores de respuesta para loa ascarósidos que no fueron sintetizados se extrapolaron sobre la base de los datos observados para los estándares disponibles. En general, se observaron grandes diferencias entre los factores de respuesta de los miembros de cadena corta de cada serie (cadenas laterales inferiores a C7), mientras que las diferencias entre los factores de respuesta de los homólogos de cadena más larga fueron pequeñas. Dado que no se sintetizaron todos los miembros de cadena corta de todas las series, los errores sistemáticos de las cantidades absolutas reportadas para algunas ascarósidos de cadena corta pueden ser más grandes que para los compuestos de cadena más larga .

Con el fin de tomar en cuenta más o menos la duración del cultivo y la biomasa de los gusanos, el contenido de ascarósidos del excretoma y de muestras de pelotillas de gusanos se registraron en fmol de los ascarósidos producidos por tiempo de cultivo por mg de peso seco de las pelotillas de gusanos. Todos los datos cuantitativos reportados en las Figuras 37-62 se obtuvieron a partir de al menos dos repeticiones biológicos independientes.

Ejemplo 45 - Ensayos de Atracción al Punto Se llevaron a cabo los ensayos de atracciones con hbas#3 como se reporta anteriormente (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Pungaliya et al., Proc. Nati. Acad. Science. EUA. 106:7708-13 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Para los ensayos de atracción, 50-60 gusanos hermafroditas se recogieron a diario en la cuarta etapa larvaria temprana (L4) y se almacenaron a 20 °C durante toda la noche para ser utilizados como adultos jóvenes el dia siguiente. El hbas#3 se disolvió en agua conteniendo etanol al 10%. Las alícuotas se almacenaron a -20 °C en tubos de 20 µ??. Como control se usó etanol al 10% en agua.

Ejemplo 46 - Ensayos de cuadrantes para Medir la Quimiotaxis La quimiotaxis al hbas#3 se evaluó en placas de Petri de 10 cm de cuatro cuadrantes (Wicks, et al., Dev. Biol. 221 :295-307 (2000), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Cada cuadrante se separó de las adyacentes por medio de separadores de plástico. Los pares de cuadrantes opuestos se llenaron con agar de medio de crecimiento de nematodos (NGM) que contenia diferentes concent aciones de hbas#3. Los Animales se lavaron suavemente en amortiguador S-basal, y se colocan en el centro de una placa de cuatro cuadrantes con los ascarósidos en cuadrantes alternados, y se calificaron después de 15 minutos y 30 minutos. El índice de quimiotaxis se calculó como: (el número de animales en los cuadrantes con ascarósido menos el número de animales en los cuadrantes con amortiguador) / (número total de animales).

Ejemplo 47 - Análisis estadísticos

[0298] se utilizaron pruebas t de Student con la corrección de Welch para comparar los perfiles de ascarósidos entre los metabolomas de los gusanos de tipo nativo y mutantes y para comparar la atracción de los hermafroditas al hbas#3 (*:p<0.05, **p <0.001, *** : p<0.0001 ) . ANOVA de un factor seguido por post-prueba de Dunnett (*: p <0.05, **: p<0.01) se utilizó para comparar los índices de quimiotaxis de las diferentes concentraciones de hbas#3.

Ejemplo 48 - El Análisis de LC-MS/MS Revela Nuevos ascarósidos en el C. elegans de Tipo Nativo Era deseable desarrollar un método de análisis que (1) facilitaría la detección sensible y la cuantificación de los ascarósidos conocidos en los metabolomas de diferentes cepas de C. elegans y mutantes y (2) ayudaría al descubrimiento de nuevos derivados de ascarósidos.

Debido a la gran complejidad del metaboloma del C. elegans, el análisis por HPLC-MS de los extractos de metabolitos resulta en cromatogramas extremadamente abarrotados que son difíciles de interpretar (Figura 46 A) . Sin embargo, parece probable que los ascarósidos relacionados estructuralmente mostrarían patrones característicos de fragmentación de MS/MS, que proporcionan un medio mucho más selectivo y sensible para su detección. Por lo tanto, se investigó la fragmentación ESI-MS/MS de una serie de ascarósidos sintéticos.

Se descubrió que la ionización por elect roaspersion de iones negativos (EST) , los ascarósidos dieron lugar a iones de producto intensos y altamente a m/z 73.02939 [C3H5O2] , que se originaron a partir de la unidad de ascarilosa (Figuras 44A-P y 46B) . Este método de detección resultó adecuado para todos los ascarósidos conocidos, a excepción de ascr#2 y ascr#4, que no se ionizan bien en condiciones de ESI". Para la detección de los ascarósidos que se ionizan sólo bajo las condiciones de ESI+, se monitoreó la pérdida neutra de 130.0663 amu [C6Hi0O3] debido a la escisión de la unidad ascarilosa. Sin embargo, se encontró que la detección por ESI+ MS/MS de los ascarósidos fue en general menos sensible que la detección por ESI" MS/MS, como los fragmentos de ascarósidos menos predecibles bajo las condiciones de ESI+. A continuación se llevaron a cabo pruebas para determinar si una identificación de los iones precursores de m/z 73 podría ser utilizada para detectar los ascarósidos conocidos, así como los ascarósidos aún no identificado en el metaboloma de C. elegans de tipo nativo. Se utilizaron los extractos de metabolitos en cultivo líquido, los cuales contienen los metabolitos excretados, acumulados, de un gran número de gusanos (el "excretoma" de los gusanos) . Los cromatogramas HPTC-MS/MS resultantes mostraron un gran número de picos bien definidos, la mayoría de los cuales se encontró que representaban ascarósidos, incluyendo varias familias de compuestos previamente no detectados.

Las identidades de los ascarósidos conocidos fueron confirmadas utilizando los estándares sintéticos. Además, se encontró que los ascarósidos saturados conocidos ascrtl, ascr#9, y ascr#10 están acompañados de cantidades sustanciales de homólogos con cadenas laterales de seis a quince átomos de carbono (Figuras 46C y 47 A) . La identificación de esta serie homologa se basa en MS/MS de alta resolución, los tiempos de retención de LC, y la síntesis de los miembros representativos (véase el Ejemplo 44 y la Figura 38]) . La identificación por LC-MS/MS reveló además que los ascarósidos con cadenas laterales de 5 a 11 carbonos están acompañadas por pequeñas cantidades de isómeros ligeramente menos polares. Estos isómeros de ascarósidos fueron producidos en abundancia por los gusanos mutantes acox-1.

Varios picos adicionales en los cromatogramas de MS/MS de los gusanos de tipo nativo no podían ser asignados a ninguna de las clases ascarósido conocidos. Para dos de estos compuestos, los iones producidos por MS/MS a m/z 301.1651 [C15H25O6] sugieren que estos representan derivados de ascr#3.

Los derivados de ascr#3 putativos se aislaron por HPLC preparativa y se analizaron usando espectroscopia de R N 2D (dqfCOSY, véanse las Figuras 39A-B, 40A-B y 41A-B) , que confirmaron que estos compuestos estaban basados en ascr#3 e indicaron además la presencia de una porción 4-hidroxibenzoilo o (E) -2-metil-2-butenoilo (tigloilo) unida en la posición 4 de la ascarilosa (Figura 47C) . Estas asignaciones estructurales fueron corroborados mediante síntesis total de muestras auténticas (véanse los ejemplos 41 a 42) . En analogía con el derivado de indol-3-carboxi de ascr#3 ("icas#3") reportado recientemente (Srinivasan et al., Publ . Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) , los derivados de 4-hidroxibenzoil y (E) -2-metil-2-butenoilo de ascr#3 fueron los nombrados con los SMIDs, "hbas#3 y "mbas#3" respectivamente. Hbas#3 y mbas#3 fueron los primeros ascarósidos que incorporaban las porciones 4 -hidroxibenzoil y (E) -2-metil-2-butenoilo, que, en analogía a la porción indol-3-carboxi en icas#3 (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10 (1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , se podría derivar a partir de precursores de aminoácidos. Debido a su similitud estructural con los indol ascarosidos que inducen la agregación (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1): el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , el hbas#3 se evaluó en cuanto a su efecto sobre el comportamiento de los gusanos. Se encontró que los hbas#3 atraían fuertemente a los gusanos C. elegans a concentraciones tan bajas como 10 femtomolar (véanse las figuras 48A-B) , la cual es superior a la potencia de cualquier previamente señal de moléculas pequeñas de C. elegans conocida previamente (Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008); Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1): el001237 (2012), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . La actividad femtomolar baja es inusual para las señales de moléculas pequeñas en animales, pero coincide con el de algunas clases de hormonas peptídicas (Rittschof y Cohén, Péptidos 25:1503-1516 (2004); Gozes et al., CS Drogas Rev. 11:353-68 (2005), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) .

Ejemplo 49 - ß-Oxidación Peroxisomal en la síntesis de los Ascarosidos El análisis de LC-MS/MS comparativo se utilizó para investigar la biogénesis de los ascarosidos. Los estudios han indicado que las cadenas laterales de los ascarosidos se derivan de la ß-oxidación peroxisomal de los precursores de cadena más larga y que la acil-CoA oxidasa ACOX-1 participa en la primera etapa de la ß-oxidación de la cadena lateral de los ascarósidos, introduciendo la a, ß-insaturación (Figuras 49A-B) (Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En los vertebrados, asi como en las moscas Drosophila, los dos pasos siguientes en la ß-oxidación peroxisomal-oxidación-hidratación del doble enlace y la deshidrogenación posterior en la ß-cetoacil-CoA éster son catalizadas por una proteina, por ejemplo, la enzima multifuncional tipo 2 (MFE-2) . Estas dos funciones enzimáticas parecen estar separadas en los gusanos C. elegans de modo tal que la deshidratasa y deshidrogenasa son proteínas distintas (Figura 45) (Haataja et al., Biochem. J. 435: 771-81 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Los estudios han demostrado que la DHS-28 de C. elegans, una proteína con homología al dominio de la ß-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa con selectividad (R) de la MFE-2 humana, probablemente participa en la conversión de los derivados de ß-hidroxiacil-CoA en los intermediarios de ß-cetoacil-CoA, que posteriormente son escindidos por la ß-cetoacil-CoA tiolasa DAF-22 (Butcher et al., PNAS 106:1875-79 (2009); Joo et al., Biochem. J. 422:61-71 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Sin embargo, no había quedado claro que la enzima actúa como enoil-CoA hidratasa que cataliza el segundo paso esencial de la cascada de la ß-oxidación.

Usando el método de identificación de los ascarósidos basado en MS/MS descrito en este documento, se volvieron a investigar los perfiles de ascarósidos de los gusanos mutantes acox-1 (ok2257) , dhs-28(hj8) y daf-22 ( ok693 ) . Además, otro estudio indicó que maoc-1 codifica una 2-enoil-CoA hidratasa peroxisomal, (Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) la cual, como se ha hipotetizado participa en la etapa de hidratación de la ß-oxidación de los ascarósidos. Por lo tanto, se analizaron los excretomas de varios otros mutantes peroxisomales, incluyendo los gusanos maoc-1 (h 13 ) .

Ejemplo 50 - La Funcionalización de la Cadena lateral Precede la ß-Oxidación El análisis por LC- S/MS del excretoma de los gusanos mutantes acox-1 (ok2257 ) reveló que la abundancia del ascr#3 , ß-insaturado , el componente dominante de los medios de tipo nativo, fue reducida en gran medida reducidas (Figuras 50A-E) . Esta disminución en el ascr#3 y otros ascarósidos a, ß-insaturados no parecía ser el resultado de la sub regulación general de la producción del ascarósido, pero en su lugar se vio acompañada por la acumulación de una serie de ascarósidos saturados. Por ejemplo, ascr#10, el derivado de dihidro el precursor directo del ascr#3, fue 13.6 veces más abundante en acox-1 (ok2257 ) que en el excretoma de tipo nativo. Los homólogos correspondientes a las cadenas laterales de 11 y 13- carbonos, ascr#18 y ascr#22, fueron 29 veces y 66 veces más abundantes en acox-1 que en los excretomas de tipo nativo, respectivamente. La acumulación de los ascarósidos saturados de cadena más larga en el excretoma de acox-1 { ok2257 ) confirmó la importancia de la ACOX-1 en la a, ß-deshidrogenación de la cadena lateral de los ascarósidos (Figura 49A) . Debido a que la biosintesis de los ascarósido no es abolida en los gusanos acox-1 (ok2257 ) , parece probable que otros enzimas ACOX todavía no identificados contribuyen a la ß-oxidación peroxisomal de los precursores de ascarósido de cadena larga. Sin embargo, el análisis LC-MS/MS del excretoma de varios otros mutantes acox peroxisomales (ver Ejemplos 29-34 y 44-47 y la Figura 51]), reveló en gran medida los perfiles de ascarósidos de tipo nativo.

Un análisis más detallado del excretoma de los gusanos acox-1 (ok225 ) reveló la ausencia total de ascr#5, uno de los principales ascarósidos que inducen las larvas dauer producidos abundantemente en los gusanos de tipo nativo (Figura 52]) . El ascr#5 se diferencia de todos los demás ascarósidos previamente identificados en que su cadena lateral está unida al azúcar ascarilosa a través del carbono terminal ("enlace ?"), y no el penúltimo carbono ("enlace ?-l") (Figura 47B) . En lugar del ascr#5, se detectaron grandes cantidades de una nueva serie homologa de ascarósidos saturados en acox-1 (ok2257), cantidades más pequeñas de los cuales también estaban presentes en el excretoma de tipo nativo (Figura 52]) . El componente más abundante de esta serie de isómeros se aisló mediante HPLC preparativa, y se identificó por espectroscopia de R N como un ascarósido co-enlazado con una cadena lateral de C5 (Figuras 42 y 47B) . Esto sugiere que la serie adicional de compuestos observados en acox-1 representa una serie de ascarósidos saturados ?-enlazados (Figura 37B) , lo cual fue confirmado por la síntesis de los ascarósidos ?-enlazados de C5 y C9 (véanse los Ejemplos 35-36) . Para diferenciar los ascarósidos ?-enlazados de sus isómeros (?-l) -enlazados descritos anteriormente los compuestos (co) -enlazados recién encontrados fueron nombrados con el SMID "oscr" SMID, por ejemplo, los isómeros (?) -enlazados sintetizado de ascr#9 y ascrttlO fueron nombrados oscr#9 y oscr#9 (Figura 47]) .

Por lo tanto, la producción del ascr#5 (?) -enlazado fue abolida en los gusanos acox-1 (ok2257 ) , mientras que la producción de los homólogos de cadena más larga con cadenas laterales de 5-13 átomos de carbono, por ejemplo, oscr#9, fue sobre regulada enormemente (Figura 52) . Estos resultados indican que la ß-oxidación en los gusanos acox-1 (pk2257 ) es fuertemente dependiente de si la cadena lateral esta funcionalizado en la posición (?-1) o (?) . El acortamiento de la cadena de los sustratos (?-l ) -oxigenados parece detenerse a una longitud de cadena de 9 átomos de carbono como en ascr#10, mientras que los sustratos de (?) -oxigenados se procesaron por dos rondas adicionales de ß-oxidación para producir grandes cantidades de oscr#9 (?) -oxigenado que presenta una cadena lateral de 5 carbonos. Esto sugiere que la oxigenación de la cadena lateral precede a la ß-oxidación peroxisomal. Por el contrario, el punto de tiempo del enlazamiento de la ascarilosa parece menos seguro. La ausencia de todo ácido graso (?-1)- o (?) -hidroxilado en las muestras de metaboloma de los gusanos C. elegans mutantes investigadas sugiere un modelo de biosintesis en el que los ascarósidos de cadena muy larga sirven como sustratos para la ß-oxidación peroxisomal. Sin embargo, puede ser posible que la ß-oxidación se produzca antes del enlazamiento a la ascarilosa.

Ejemplo 51 - MAOC-1 y DHS-28 son Homólogos Funcionales de la MFE-2 Humana A diferencia de los gusanos de tipo nativo y acox-l(ok2257), no se detectaron ascarósidos de cadena corta (<Cg) en los gusanos maoc-1 (h 13) y dhs-28 (hj8), los cuales más bien acumulan varias series de ascarósidos de cadena mediana y larga (=Cg) , (?-l) y (?) -oxigenados . El perfil de ascarósidos del excretoma de los gusanos maoc-l(hjl3) estuvo dominado por ascarósidos , ß-insaturados como el ascr#21 (C13) y el ascr#25 (C15) (Figuras 50A-E) , lo que sustenta la hipótesis de que la MAOC-1 funciona como una enoil-CoA hidratasa en la ruta biosintética de los ascarósidos (Figura 49A) . Además, el excretoma maoc-l(hjl3) contenia cantidades más pequeñas de los correspondientes ascarósidos saturados, junto con una tercera serie homologa de compuestos, cuyas fragmentaciones por espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) y MS/MS sugieren que estos representan una serie de ascarósidos de cadena larga ß-hidroxilados (Figuras 37C-D, 44A-P, y 50A-E) . Estas asignaciones estructurales se confirmaron a través de la síntesis de los miembros representativos de esta serie (véanse los Ejemplos 37-39), el los (?-l ) -ascarósidos ß-hidroxilados de C9 y C13 bhas#10 y bhas#22, así como el w-ascarósido ß-hidroxilado de Ci5 bhos#26 (S IDs para los ascarósidos ß-hidroxilados (?-l)- y (?) -oxigenados : "bhas" y "bhos") . Ya que los ascarósidos ß-hidroxilados son productos putativos de las enoil-CoA hidratasas, como la MAOC-1, su presencia en los excretomas de ambas cepas mutantes maoc-1 estudiadas maoc-l(hjl3), las cuales contienen una mutación puntual en el sitio activo (D186N), y el mutante de eliminación de 2110 pares de bases maoc-1 (ok2645) (Figura 49B) sugiere que las enoil-CoA hidratasas adicionales pueden participar en la biosíntesis de los ascarósidos.

De manera similar a los resultados para el maoc-1 (hj 13 ) , se encontró que el perfil de ascarósidos de dhs-28(hj8) está dominada por compuestos con cadenas laterales que varían desde C9-C21 (Figuras 5A-E. Sin embargo, en contraste con maoc-l(hjl3), los ascarósidos saturados, y , ß-insaturados constituían una porción relativamente más pequeña de los ascarósidos totales dhs-28(hj8) . Además, se encontró que los ß-hidroxi ascarósidos (co-l)- y (?) -oxigenados (bhas y bhos) con cadenas laterales numeradas como impares desde C13-C21 son los componentes principales (Figuras 50A-E y 53A-E) , lo cual es consistente con la función biosintética propuesta de DHS-28 como una ß-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (Butcher et al., PNAS 106: 1875-1879 (2009); Joo et al., Biochem. J. 422:61-71 (2009) , los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . El análisis del excretoma de los gusanos la daf-22(ok693) reveló la ausencia de todos los ascarósidos con cadenas laterales más cortas que 12 átomos de carbono, como se informó anteriormente (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Butcher et al., PNAS 106: 1875-79 (2009); Joo et al., Biochem. J. 422:61-71 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) (Figuras 50A-E y 53A-E) . El excretoma de los gusanos daf-22 (ok693) contenía pequeñas cantidades de series homologas de ascarósidos de cadena larga (?-l)- y (Ü) -oxigenados que presentan cadenas laterales saturadas (ascr y oscr) y ß-hidroxiladas (bhas y hbos) . Además, el excretoma de los gusanos daf-22 (ok693) contenía ascarósidos de cadena muy larga (VLCA, > C22) con longitudes de cadena lateral de hasta 33 átomos de carbono, como se informó anteriormente (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Zagoriy et al., Chem. Biodivers. 7:2016-22 (2010), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) .

Ejemplo 52 - Identificación de Nuevos Indol Ascarósidos Los ascarósidos indol-3-carboniladas fueron mucho menos abundantes que los correspondientes ascarósidos no funcional i zados y se han demostrado que funcionan como señales de agregación altamente potentes (Srinivasan et al., publ. Lib. Sci. Biol. 10 (1) :el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La identificación por LC-MS/MS reveló varios nuevos tipos de indol ascarósidos (Figura 37E-H y 47C) . Los resultados de las muestras sintéticas de icas#3, icas#9 e icas#l (Srinivasan et al., publ. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) muestran que los indol ascarósidos exhiben un patrón de fragmentación característico que incluye pérdida neutra de 143 amu [C9H5NO] debido a la escisión de la unidad de indol-3-carbonilo, así como los iones de diagnóstico producidos de los ascarósidos a m/z 73 (véanse las Figuras 44A-P) . La identificación por LC-MS/MS para los componentes con este patrón de fragmentación reveló que los isómeros (?-l ) -oxigenados conocidos icas#l, icas#9 e icas#10 en los gusanos acox-1 (ok2257 ) están acompañados de una serie de indol ascarósidos (?) -oxigenados (SMID: icos#l, icos#9, e icos#10), lo cual fue confirmado por la síntesis química del icos#10 como un ejemplo representativo (véase el ejemplo 40) . Los mutantes de ß-oxidación peroxisomal que no producen ascarósidos de cadena corta (cadenas laterales <9 átomos de carbono), por ejemplo los gusanos maoc-1 y dhs-28, tampoco produjeron ninguno de los indol ascarósidos correspondientes. Más bien, los excretomas de maoc-1 y dhs-28 contenían cantidades significativas de indol ascarósidos de cadena larga (?-l)- y (?) -oxigenados (S IDs icas e icos) e indol ß-hidroxi ascarósidos (SMIDs ibha e ibho) con cadenas laterales de 9-17 átomos de carbono (ver Figuras 37E-H) .

Ejemplo 53 - Biogénesis de los Indol Ascarósidos Los experimentos con triptófano etiquetado con deuterio y los cultivos axénicos in vitro han demostrado que la porción indol-3-carbonilo de los indol ascarósidos se origina a partir de L-triptófano (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Un origen de L-tirosina u origen de L-fenilalanina similar parece probable para la porción 4-hidroxibenzoilo del hbas#3, en tanto que el grupo tigloilo de mbas#3 podría ser derivado de L-isoleucina (Attygalle et al., J. Chem. Ecol. 33:963-70 (2007), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Sin embargo, no ha quedado claro en qué etapa de la biosíntesis de los ascarósidos se enlaza la porción indol-3-carbonilo .

La comparación de los perfiles de ascarósidos y de indol ascarósidos reveló que la biosíntesis de los indol ascarósidos está estrictamente controlada. Por ejemplo, se encontró que en los mutantes acox-1, el (?) -ascarósido oscr#9 era más de 100 veces más abundante que el (?) -ascarósido ascr#9, en tanto que (?-1) -indol ascarósido icas#9 era mucho más prominente que el (?) -indol ascarósido icos#9 (Figura 54A) . Del mismo modo, icas#3 e icas#9, los indol ascarósidos dominantes en el excretoma de tipo nativo, de produjeron en cantidades aproximadamente iguales, mientras que el ascr#3 fue aproximadamente 20 veces más abundante que el ascr#9 (Figura 55) . Esta fuerte dependencia de la biosintesis del indol ascarósido sobre la longitud de la cadena lateral y la (?)-1 vs la (?) -oxigenación sugiere que estos compuestos se originan de unión especifica de una unidad de indol-3-carbonilo al no indol ascarósido correspondiente.

Para evaluar si los no indol ascarósidos sirven como precursores para los indol ascarósidos, los gusanos daf-22 (ml30) (que están desprovistos de todos los indol y no indol ascarósidos de cadena corta) se incubaron con una mezcla 1:1 de ascr#10 y oscr#9 durante 5 días. El análisis posterior por LC-MS muestra la conversión parcial en icas#10 e icos#10 (Figura 54B) , lo que indica que los no indol ascarósidos sirven como precursores específicos de sus correspondientes derivados de indol. Por otra parte, la conversión del (?-1) ascarósido ascr#10 se prefirió sobre la conversión del (?)-ascarósido oscr#10, los que refleja las proporciones de estos compuestos en el los gusanos de tipo silvestre y los mutantes acox-1 mutantes. Del mismo modo, se descubrió que los gusanos daf-22 (ml30 ) convierten el ascr#3 en icas#3. Además, no se observó una mayor conversión de los indol o los no de indol ascarosidos en los derivados de cadena más corta (por ejemplo, ascr#l o icas#l) . Estos resultados indican que la unión de una unidad de la unidad de indol-3-carbonilo derivada de L-triptófano representa el paso final en la biosintesis de los indol ascarosidos.

Ejemplo 54 - La Excreción de los Ascarosidos es Selectiva A pesar de las investigaciones detalladas de la función de los ascarósido, poco se sabe acerca de cómo los ascarosidos son liberados y transportados desde su lugar de biosintesis. Los perfiles de ascarósido de los excretomas de tipo nativo (extractos de sobrenadante de cultivo líquidos) y metabolomas de cuerpos de gusanos (extractos de pelotillas de gusanos) se compararon para identificar los posibles derivados de ascarósido no excretados y para determinar las diferencias cuantitativas. Los perfiles de ascarosidos de los extractos de pelotillas de gusanos difieren significativamente de los excretados en los medios, lo que indica que los ascarosidos se liberan diferencialmente por los gusanos C. elegans (Figura 56A) . En las pelotillas de gusanos, los ascarosidos más abundantes, tales como el ascr#3 y el ascr#10 de tipo nativo en los gusanos acox-1 gusanos, estaban acompañados por derivados significativamente más polares, los cuales estuvieron ausentes en los extractos de medios (Figura 57) . El análisis de MS/MS sugirió que estos componentes representan ascarósido O-glucósido ésteres. El aislamiento del glucósido de ascr#10 putativo de extractos de pelotillas de gusanos acox-1 (ok2257 ) y el análisis espectroscópico de R N posterior (figuras 43 AB) indican esterificación del ascr#10 con el grupo hidroxilo anomérico de ß-glucosa, lo que fue confirmado posteriormente a través de la síntesis (SMID para ?-ß-D-glucosil ascr#10: glas#10, Figura 56A) . El hecho de que grandes cantidades de glas#10 altamente polar y de otros glucósidos de ascarósido (ver Figura 371) fueron retenidos en los cuerpos de gusanos pero no excretados sugiere que estos representan las formas de transporte o de almacenamiento de las moléculas de señalización excretadas en última instancia.

Además, los ascarosidos saturados fueron retenidos en los cuerpos de los gusanos a un grado mucho mayor que sus derivados a, ß-insaturados (Figura 56A) . La liberación diferencial también se observó para componentes (?) -oxigenados (Figura 58) . Por lo tanto, parece que los gusanos C. elegans exhiben un control notable sobre la liberación de las señales de ascarósido.

Ejemplo 55 - £1 Estado Nutricional Afecta la biosintesis de los Ascarosidos Se ha reportado que la biosintesis de los ascarosidos depende de diversos factores ambientales, incluyendo la disponibilidad de alimentos (Butcher et al., PNAS 106: 1875- 1879 (2009), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad), la etapa de desarrollo (Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE6:el7804 (2011), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad), y la temperatura (Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) .

Se utilizó LC-MS se utilizó para investigar el efecto del estado nutricional sobre la biosintesis de los ascarósidos comparando los excretomas de cultivos bien alimentados y desnutridos de gusanos de tipo nativo y mutantes. Los resultados indican que la proporción de los ascarósidos (?-1) - a (o) -enlazados depende fuertemente del estado nutricional. La producción de los ascarósidos (?-l ) -oxigenados de cadena larga en los cultivos privados de alimento dhs-28 fue aproximadamente 5 veces más alta que la de los cultivos bien alimentados (Figura 56B y 59A-C) . Del mismo modo, los gusanos de tipo nativo privados de alimento excretaron cantidades significativamente más grandes del ascr#3 (?-l) -enlazados que los gusanos bien alimentados, con relación a las cantidades de ascr#5 (?) -enlazado (Figura 60) . Tanto el ascr#5 y el ascr#3 son los principales componentes de la feromona dauer; sin embargo, estos afectan el comportamiento de los gusanos de manera diferente (Jeong et al., Nature 433:541-45 (2005); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Butcher et al., PNAS 105: 14288-92 (2008); Macosko et al., Nature 458:1171-75 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) .

Por lo tanto, parece que la señalización por los ascarósidos se regula de forma activa en respuesta a los cambios en la disponibilidad de nutrientes a través de la modulación de la funcionalización (?-l) y (?) - de los ácidos grasos de cadena muy larga corriente arriba de ß-oxidación peroxisomal. Junto con el reciente hallazgo de que los ascarósidos (?) y (?-l)- funcionalizados son detectados son detectados por diferentes familias de receptores acoplados a proteina G (Kim et al., Science 326:994-98 (2009); McGrath et al., Nature 477:321-25 (2011), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) , estos resultados sugieren que los ascarósidos (?) y (?-l ) -funcionalizados se dirigen a las vias de señalización corriente abajo separadas.

Discusión de los Ejemplos 29-55 Los ascarósidos juegan un papel importante para varios aspectos diferentes de la biología de los gusanos C. elegans. Esta diversidad funcional es paralela a la correspondiente diversidad estructural y una ruta biosintética compleja. El estudio basado en S/MS descrito en los Ejemplos 34 a 43 y las Figuras 37A-37K reveló 146 ascarósidos, incluyendo 124 análogos previamente no reportados, que muestran varios rasgos inesperados incluyendo la (?) -oxigenación de las cadenas laterales derivadas de ácidos grasos, la 4- hidroxibenzoilación o la (E) -2-metil-2-butenoilación de la unidad de ascarilosa, y de los glucosil ésteres. La mayoría de los ascarósidos se producen como miembros de series homologas de compuestos con (cadenas laterales (?-l)- o (Ü) -enlazadas, a, ß-saturadas o ß-hidroxiladas que varían de 3 a 21 (a veces más) carbonos. Es importante señalar que sólo unos pocos miembros de cada serie se producen abundantemente en los nematodos de tipo nativo, y la incorporación de las características estructurales específicas, tales como la modificación en la posición 4 de la ascarilosa (por ejemplo, como en los indol ascarósidos) o la incorporación de la a, ß-insaturación parece estar estrechamente controlada.

En vista de su ensamblaje a partir de carbohidratos, lípidos y bloques de construcción derivados de aminoácidos, los ascarósidos aparecen como una biblioteca modular de señales de moléculas pequeñas que integran los estímulos de tres vías metabólicas básicas (Figura 61 A) . Los ascarósidos transducen entonces los estímulos de estas vías a través de sus diversas funciones de señalización en el comportamiento y el desarrollo de los gusanos C. elegans, incluyendo la formación de larvas dauer, la atracción de pareja, la repulsión de los hermafroditas , y la agregación (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol . 10(1): el001237 (2012); Edison, A.S., Curr. Opin. Neurobiol. 19:378-88 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Sus biosíntesis especificas sugieren que muchos de los ascarósidos recientemente identificados también contribuyen a funciones conocidas o aún por determinar en los gusanos C. elegans. Como un ejemplo, se demostró que el hbas#3 actúa como una señal de atracción cuya potencia supera a la de todas las moléculas pequeñas conocidas anteriormente en este organismo modelo .

Se propone un modelo de trabajo para la biogénesis de los ascarósidos en la Figura 61B. El descubrimiento de que los ascarósidos son miembros de varias series homologas con cadenas laterales de hasta 21 (y más) carbonos sugiere su origen a partir de la ß-oxidación peroxisomal de los precursores de cadena muy larga. Los estudios previos estudios reportaron la presencia de ascarósidos de cadena muy larga (VLCA) con C29 y C31 en las cadenas laterales de los gusanos de tipo nativo y imitantes daf-22, los cuales podrían representar los precursores o intermediarios en la biosíntesis de los ascarósidos (Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Zagoriy et al., Chem. Biodivers. 7:2016-22 (2010), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Alternativamente, los ácidos grasos de cadena muy larga (VLCFAs) podrían experimentar la ß-oxidación peroxisomal antes de la funcional! zación en las posiciones (?-1) o (?) y la unión posterior de la ascarilosa. La observación de que la mutación acox-1 afectó a los ascarósidos (?-l)- y (?) - oxigenados de forma diferente sugiere que la funcionalización (?-l) y (?) de los precursores VLCFA se producen corriente arriba de su descomposición por la ß-oxidación peroxisomal. Dada la amplia gama de longitudes de la cadena lateral, parece probable que los (?-l)- y (?) -hidroxi VLCFAs están enlazados a la ascarilosa antes de entrar en la vía de ß-oxidación, aunque la presencia de un ascarosil transferasa promiscua también puede ser posible (Figura 61B) .

El acortamiento de la cadena de los VLCA puede entonces progresar a través de ciclos repetitivos de la ß-oxidación peroxisomal. Los resultados de la identificación por LC-MS/MS permite la propuesta de las funciones precisas para las enzimas que participan en cada uno de los ciclos de ß-oxidación de cuatro pasos: la acil-CoA oxidasa ACOX-1, enoil-CoA hidratasa MAOC-1, ß-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa DHS-28, y ß-cetoacil-CoA tiolasa DAF-22. Se ha demostrado que las mutaciones en acox-1, maoc-1, y dhs-28 dan lugar a cambios específicos de los perfiles de ascarósidos correspondientes, de acuerdo con sus funciones propuestas.

La acil-CoA oxidasa ACOX-1 ha sido objeto de un estudio previo que indica que las mutaciones en los gusanos acox-1 principalmente afectan la biosíntesis de ascr#2 y ascr#3, pero no de ascr#l (Joo et al., J. Biol. Chem. 285:29319-25 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Sin embargo, los resultados descritos en el Ejemplo 50 indican que los mutantes acox-1 (ok2257 ) tienen una capacidad reducida para procesar los ascarósidos de C9 (?-l) -funcionalizados, lo que resulta en la producción disminuida de todos los ascarósidos saturados con cadena más corta y la acumulación de los ascarósidos saturados con cadena de Cg y más largas. Se ha demostrado que mutaciones de los gusanos maoc-1 (asi como de los gusanos dhs-28 y daf-22) resulta en la expansión de las gotas de lipidos intestinales y provoca un aumento en los triglicéridos de resistencia al ayuno y a la lipolisis (Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) . Los resultados descritos en el Ejemplo 51 muestran que la MAOC-1 participa en la biosintesis de los ascarósidos, actuando como la enoil-CoA hidratase previamente no identificada. Estos descubrimientos demuestran además que la hidratación de la enoil-CoAs y la deshidrogenación de la ß-hidroxiacil-CoA en los gusanos C. elegans son catalizadas por dos enzimas distintas, MAOC-1 y DHS-28, como ha sido indicado por su homología para separar los dominios funcionales de MFE-2 humano (Zhang et al., PNAS 10:4640-45 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) .

Los resultados descritos en los Ejemplos 52-53 muestran además que la unión de la unidad de indol-3-carbonilo derivada de triptófano en los indol ascarósidos probablemente representa el último paso en su biosintesis, y que este paso es altamente específico. Ya que la unión de un grupo indol-3-carbonilo a los ascarósidos puede alterar dramáticamente su función biológica, tal regulación estricta tiene sentido. Por ejemplo, la adición del indol-3-carbonilo a la señal ascr#3 que induce las larvas dauer y fuertemente repulsiva resulta en el potente atrayente de hermafroditas icas #3 (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci . Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La biosíntesis de la ascarilosa en los gusanos C. elegans no se ha investigado. Sin embargo, la detección de los ascarósidos en los cultivos axénicos de C. elegans demuestra que los gusanos C. elegans producen la ascarilosa endógenamente (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . La biosíntesis de la ascarilosa en las bacterias se entiende bien y el genoma de los gusanos C. elegans incluye varios homólogos de genes bacterianos en esta vía, por ejemplo ascE de Yersinia pseudotuberculosis (Figura 62) (Thorson et al., J. Bacteriol. 176:5483-93 (1994), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , que proporcionan los posibles puntos de entrada para el estudio de la biosíntesis de ascarilosa y su regulación en los nematodos. Además, las oxidasas que catalizan la (?-l)- o la (?)- funcionalización de los precursores de VLCFA quedan aún por identificar. El descubrimiento de que la relación de ascarósidos (?-1)/(?)- oxigenados en los gusanos de tipo nativo y los mutantes de ß-oxidación peroxisomal fue afectada fuertemente por el la privación de alimento indica que este paso puede codificar la información sobre el estado nutricional. Además, la excreción de los ascarósidos ha demostrado ser sorprendentemente especifica. Dada la alta sensibilidad y selectividad de LC-MS/MS, el perfilado de los ascarósidos usando el método descrito en los Ejemplos 29-55 pueden ayudar en la identificación de los genes y los factores ambientales adicionales que participan en la biosintesis y la. homeostasis de los ascarósidos.

Ejemplo 56 - Producción de Larvas Dauer Los gusanos C. elegans fueron cultivados bajo condiciones de cultivo liquido que inducen las larvas dauer (Kaplan et al., Publ. Lib. Sci. ONE 6:el7804 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) en medio S completo con 20,000 gusanos/ml y 0.5% (peso húmedo) de E . coli (HB101) . Los nematodos se incubaron a 22 °C en un agitador (250 rpm) durante 112 horas después de la alimentación de las larvas de nematodos Ll . Después, los nematodos se trataron con 1% de dodecil sulfato de sodio (SDS) durante 15 minutos. A los nematodos supervivientes se les permitió separarse de los nematodos muertos en una placa de agar antes de la recolección. Después del retiro de los nematodos muertos por vacio, los animales dauer se recolectaron utilizando el amortiguador M9 y se colocaron a 4°C.

Ejemplo 57 - Cria de S. feltiae Los gusanos S. feltiae se ordenaron a Arbico Organics (Tucson, AZ ) . Las larvas de G. mellonella (gusanos de cera, Grubco, Hamilton, OH) se infectaron con 50 juveniles dauer de S. feltiae por larva. Después de dos días, las larvas infectadas se colocaron en nuevas placas de Petri de 6 cm de diámetro y el método de la trampa blanca se usó para recolectar los juveniles infectivos (IJs) (LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997), el cual se incorpora como referencia en su totalidad) .

Los IJ de S. feltiae fueron verificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos de la especie de la región ITS rDNA como se describe en Campos-Herrera et al., Ann. Appl. Biol. 158:55-68 (2011), el cual se incorpora como referencia en su totalidad. Las amplificaciones por PCR se realizaron en un termociclador MJ Research PTC 200 de Peltier. Las amplificaciones se llevaron a cabo como se describe en Campos-Herrera et al., Ann. Appl. Biol. 158:55-68 (2011), el cual se incorpora como referencia en su totalidad, en un volumen final de 25 L que contiene 1 µL de plantilla de ADN, utilizando agua desionizada estéril y ADN preparado a partir de Steinernema riobrave como controles negativos. Los parámetros de ciclación fueron de 94 °C durante 15 minutos seguido por 35 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, apareamiento a 59 °C durante 20 segundos, y extensión a 72 °C durante 20 segundos, con una extensión final de 72 °C durante 10 minutos. El Tamaño de los amplicones se verificó mediante electroforesis en un tris-acetato-EDTA (TAE) 2% en gel de agarosa y se visualizó en el Sistema UVP BIODOC-ITTM.

El cebador de S. feltiae produjo amplificación especifica de todas las muestras que contenían los JIs de poblaciones de laboratorio en la PCR convencional. Los cebadores no mostraron amplificación para la especie S. riobrave y los controles de agua desionizada.

Ejemplo 58 - Producción de los nematodos de los nudos de la raiz Plantas de tomate infectadas fueron recogidas de los sitios de campo en Florida. Las raíces se inspeccionaron en cuanto a la infección de los nudos de la raíz, y los huevos de nematodos de los nudos de la raíz se recolectaron como describe en Hussey y Barker, Plant Dis. Rep. 57: 1025-1028 (1973), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, con modificaciones. Las raíces infectadas se trataron con 1% de lejía durante 2 minutos. Los huevos liberados de las matrices de masa de huevos fueron recogidos con un sistema de filtros anidados (85 µp?) para recoger los restos vegetales y con filtros de nylon de 25 µp? (Nytex) para recoger los huevos. Los huevos se lavaron a fondo con agua MILLI-Q y se colocaron a temperatura ambiente durante 3 días en un filtro 20 µ??, en una placa de Petri de 8 cm de diámetro con una pequeña cantidad de agua para provocar la eclosión.

Se identificaron los nematodos extraídos de los nudos de las raíces de tomate infestadas, con base en la morfología y fenotipado de isoenzimas para la esterasa (EST) y la malato deshidrogenasa (MDH) . Las identificaciones morfológicas se realizaron utilizando los patrones perineales de las hembras maduras que se describen en JOSEPH NEAL SASSER Y CATHY CAMERON CARTER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE (1985), el cual se incorpora como referencia en su totalidad. Brevemente, la fenotipificación de isoenzimas se llevó a cabo utilizando 25 jóvenes hembras ponedoras de huevos. Los extractos de las hembras extirpadas directamente desde el sistema de raíces se procesaron en dos electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) (Brito et al., Nematology 10:757-66 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Un gel se tiñó tanto con MDH y EST (KENNETH REECE BARRER, CATHY CAMERON CARTER Y JOSEPH NEAL SASSER: AN ADVANCED TREATISE ON MELOIDOGYNE (1985), el cual se incorpora como referencia en su totalidad), mientras que un segundo se tiñó sólo para EST.

Ejemplo 59 - Identificación de la Mezcla de Dispersión de C . elegans Los cultivos líquidos que indujeron 60% de larvas Dauer (2 experimentos) y 40% de larvas Dauer después de 67 horas de Lis de alimentación se analizaron mediante LC-MS. Cuatro ascarósidos fueron comunes a los tres medios líquidos. Las concentraciones de cada uno se midieron a partir de los cultivos líquidos que produjeron 60% de dauers.

Ejemplo 60 - Ensayo de Dispersión JIs de S. feltiae se lavaron con aqua MILLI-Q tres veces y se incubaron en placas de Petri de 6 cm durante 36 horas con una pequeña cantidad (4-5 mi) de agua MILLI-Q. Los nematodos se colocaron al día siguiente en 10.7 g/L de agar con una resistencia del gel de 1010 g/cm2 ( PhytoTechnology Lab. Shawnee Mission, KS) . El comportamiento de los nematodos se ensayó en múltiples placas con replicas internas en las placas para descartar la posibilidad de que el comportamiento se vea afectado por la composición de la placa. Aproximadamente 300 IJs en 10 µ? de agua se colocaron en un medio de agar y los compuestos o los extractos de prueba (1-2 µ?) se colocaron en la suspensión de nematodos. Después de la absorción (~15 minutos) del líquido, los nematodos moviéndose libremente se grabaron en video durante 5-10 minutos. El comportamiento de dispersión es dependiente de la temperatura y la temporada. Durante el invierno, el ensayo es eficaz a temperatura ambiente (22 ± 1 °C) . Durante el verano, el ensayo requiere un ambiente de temperatura controlada debido a los efectos sobre el comportamiento de nematodos por encima de los 23 °C.

Los juveniles dauer de C. elegans se lavaron con agua MILLI-Q 3 veces, se colocaron en placas de Petri de 6 cm con una pequeña cantidad de agua, y se dejaron en reposo durante toda la noche. Aproximadamente 200-300 nematodos en 10 µ? de agua se colocaron en una placa de agar, a la que se añadieron 2 µ? de tratamiento. El cultivo liquido que produjo 60% animales dauer se sometió a centrifugación, se filtró con un filtro de 0.45 µt , y se utilizó como un control positivo para la dispersión. Después, los medios se liofilizaron y se resuspendieron en agua MILLI-Q 5 veces. Se utilizaron 2 µ? a 10 µ? de suspensión de nematodos para el ensayo. Como el control negativo, 0.5% de E. coli (HB101) se preparó en medio S completo, se liofilizó, y se ajustó hasta el volumen final de 0,25% de E. coli en el ensayo. El comportamiento de dispersión se observó durante 12-15 minutos.

Para analizar la dispersión de los nematodos de los nudos de la raiz, los nematodos de los nudos de la raiz que eclosionaron el plazo de 1-3 días se recogieron y se lavaron con agua MILLI-Q 3 veces con] filtros de nylon de 10 µp? (Nytex) . Después, estos se colocaron en un tubo Eppendorf de 1.5 mi. Los nematodos, en 10 µ? de agua se colocaron en una placa de agar. Los nematodos encontrados en lugares alejados de donde fueron colocados originalmente se contaron después de 1 hora y 2 horas. Cada tratamiento se normalizó usando el número total de nematodos que se desplegaron. Para cada tratamiento, se llevaron a cabo 20 experimentos en tres dias diferentes. La densidad de nematodos fue de ~30 por placa en 14 experimentos y 100 por placa en 6 experimentos. Los experimentos se llevaron a cabo en la mañana.

Ejemplo 61 - C antificación de la Dispersión de C . elegans Los nematodos se cuantificaron utilizando el software Image J (Image Processing and Analysis in Java, los Institutos Nacionales de Salud) . El número de nematodos visualizados y contabilizados usando Image J se ilustra en la Figura 63B. Los nematodos dentro del circulo se restaron manualmente del número total de gusanos contabilizados debido a la ubicación de su colocación. Cada tratamiento se repitió 9-11 veces. El gráfico se normalizó con el control positivo, el medio de acondicionado Dauer.

Ejemplo 62 - Purificación de la Mezcla de Dispersión de S. feltiae El fraccionamiento guiado por la actividad se llevó a cabo como se reporta en Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, con modificaciones. Un total de 33 cadáveres de insectos anfitriones (larvas de G. mellonella) se colocaron en EtOH al 70% y se almacenaron a -20 °C hasta la extracción. Los cadáveres de insectos se homogeneizaron utilizando 1 g de perlas de cerámica de circonio (1.25 mm) (ZIRMIL) en tubos de 2 mi durante 37 segundos, utilizando un homogeneizador Precellys24. Las muestras se centrifugaron durante 15 minutos a una fuerza centrifuga relativa (rfc) de 18400, y el sobrenadante se liofilizó y se resuspendieron en agua MILLI-Q. La actividad de dispersión de los nematodos se analizó usando el ensayo de dispersión descrito en el Ejemplo 60 y una concentración fisiológicamente relevante de extracto de cadáver de insecto huésped o extracto fraccionado. Para facilitar los cálculos de la concentración fisiológicamente relevante de los ascarósidos, el volumen de gusano de cera se estimó en ~200 µ?; el peso promedio de los gusanos de cera fue de 232 + 57 mg (n = 19) .

La primera extracción en fase sólida de fase inversa se realizó utilizando cartuchos Sep-Pak Plus C18 ( aters Corporation, Milford, MA) . El flujo recogido inicialmente se denominó Fracción A. Después, la columna se lavó con agua, se recogió, y se guardó. Posteriormente, la columna se eluyó con MeOH al 50% (Fracción B) y al 90% (Fracción C) . Las fracciones se analizaron en cuanto a la actividad de dispersión tanto individualmente como en combinación. Además, las fracciones individuales se analizaron por LC-MS . la fracción A contenia ascr#9, que se recogió por CL-MS y se evaluó por su actividad con la Fracción B + C.

Ejemplo 63 - Estudio de Curso Temporal de la Producción de Ascarósidos por S . fel iae Se usó el método de ensayo de uno a uno (LA RENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997), el cual se incorpora como referencia en su totalidad) . Un gusano de cera se colocó en un pozo de una placa de 24 pozos. Para la infección, 50 IJ de S. feltiae IJ se colocaron en 25 µ? de agua en cada pozo. Después de 24 horas, se examinaron las placas para las larvas de insecto infectadas. Aquellas que fueron infectadas se colocaron en una trampa blanca LAWRENCE LACEY: MANUAL OF TECHNIQUES IN INSECT PATHOLOGY (1997), el cual se incorpora como referencia en su totalidad) y aquellas que se infectaron después de 48 horas se colocaron en una trampa blanca separada. El muestreo inicial se realizó después de 48 horas. Posteriormente, las muestras se tomaron todos los dias durante 9 días y una vez al día 14. Para cada experimento, las muestras comprendían seis cadáveres huésped de insecto. Los cadáveres de insectos se colocaron en un tubo Eppendorf de 2 mi con 1 mi de agua. Los cadáveres se perforaron con una aguja para permitir la disipación de los contenidos internos y luego se sometieron a un vórtice. Las muestras se centrifugaron a 3380 rcf durante 10 minutos, y se recuperaron 0.5-1 mi del sobrenadante. El sobrenadante se congeló a -20 °C y después se liofilizó. Después, este se resuspendió en 200 µ? de MeOH al 50% y se diluyó 1:1 con ácido fórmico al 0.1%. El pH de la muestra fue de 4.3. En este punto, 20 µ? de cada muestra se sometieron a LC-MS para el análisis del ascr#9.

Ejemplo 64 - Asrc#9 en Cadáveres de Insectos Anfitriones de Steinernema spp y Heterorhabditis spp.

Los insectos anfitriones (G. mellonella) se infectaron con H. bacteriophora , H. zealandica, H. floridensis, S. carpocapsae, S. riobrave o S. diaprepesi. Cuando los nematodos empezaron a surgir de los cadáveres de insectos, estos se colocaron en 1.5 mi de EtOH al 70% y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Después, los cadáveres de insectos se homogeneizaron utilizando 1 g de perlas de cerámica de circonio (1.25 mm) (ZIRMIL) en tubos de 2 mi durante 39 segundos, utilizando un homogenei zador Precellys24. Los cadáveres homogeneizados se centrifugaron a 3380 rcf durante 10 minutos. El sobrenadante se diluyó con 1 mi de agua para HPLC, colocada a -20 °C y, a continuación, se colocaron en un SpeedVac® (Speed Vac Plus SC210A, Savant) durante toda la noche. Cada extracto de cadáver se resuspendió en 1 mi de MeOH al 50% y se centrifugó a 18400 rcf durante 15-20 minutos. Después, las muestras se diluyeron en una relación de 1:1 con ácido fórmico al 0,1%, dando un pH de la muestra de 4.2. La presencia o ausencia de arc#9 se determinó por LC-MS.

Ejemplo 65 - Análisis de LC-MS El análisis de los ascarósidos se llevó a cabo utilizando el método reportado en Kaplan et al., Publ. Lib . Sci. ONE 6: el7804 (2011), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad.

Ejemplo 66 - Ensayo de Dispersión Para los nematodos entomopatógenos (NEP) , se sabe que los cadáveres de insectos promueven un comportamiento de dispersión de la fase IJ ( Shapiro-Ilan et al., J. Invertebr. Pathol. 83:270-72 (2003), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Por lo tanto, se desarrolló un ensayo para identificar los compuestos en los cadáveres de insectos consumidos que promueven la dispersión. Aproximadamente 300 JIs de S.feltiae en 10 µ? de agua se colocaron en una placa de agar (Figura 64B) . Entonces, 2 µ? de agua (Figura 64C) o bien un extracto acuoso de cadáveres de larvas de Gallería mellonella infectados con S. feltiae (Figura 64D) se colocaron en la suspensión de nematodos. Después de la absorción del agua en los medios, los nematodos fueron capaces de moverse libremente. Los nematodos tratados con agua se mantuvieron cerca del sitio de despliegue sin ningún comportamiento de dispersión. Por el contrario, los nematodos tratados con el extracto de cadáveres fueron muy activos y se alejaron del punto de liberación. Este fue el mismo comportamiento de dispersión distintivo observado para los nematodos que salen de un cadáver. Los de CL-MS del extracto de cadáveres revelaron la presencia de un ascarósido (ascr#9) (Srinivasan et al., Publ . Lib. Sci. Biol . 10(1): el001237 (2012) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad), lo que sustenta la hipótesis de que la S. feltiae podría utilizar los ascarosidos como señales de dispersión .

Ejemplo 67 - La Dispersión de los Gusanos C. elegans Está Regulada por una Mezcla de Ascarosidos El bioensayo de dispersión en el Ejemplo 66 se investigó después para determinar si también podría ser utilizado para probar para la dispersión de las larvas dauer de C. elegans. Para este ensayo, se utilizó un medio de crecimiento de un cultivo líquido de C. elegans que habían producido 60% de larvas dauer. Enseguida de la extracción de todos los nematodos, este medio acondicionado por las larvas daeur indujo fuertemente el comportamiento de dispersión en las larvas dauer de C. elegans. Usando LC-MS, se encontró que el medio de la formación de dauer contiene cuatro ascarosidos conocidos (ascr#2, ascr#3, ascr#8 e icas#9) (Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007); Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009); Srinivasan et al., Publ . Lib. Sci. Biol. 10(1): el001237 (2012), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) (Figura 63A y 65), los cuales, como se demostró previamente que promueven individualmente la entrada en la etapa dauer de los gusanos C. elegans (Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007); Butcher et al., Org. Lett. 11 :3100-03 (2009); Pungaliya et al., PNAS 106:7708-13 (2009) , los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Las concentraciones de los ascarosidos en el medio de cultivo que forma las larvas dauer se estimaron como ascr#2 (3.68 pmol/µ?), ascr#3 (0.165 pmol/µ?) , ascr#8 (0.25 pmol/µ?), e icas#9 (0.005 pmol/µ?) .

Una mezcla sintética de estos ascarósidos se evaluó entonces en cuanto a la actividad de dispersión, utilizando el medio de acondicionado por las larvas dauer, como un control positivo. Se estimó que los medios contenían aproximadamente la mitad de la fuente de alimento original de 0.5% de E. coli (HB101) . Por lo tanto se agregó 0.25% de E. coli a las muestras de prueba sintéticas, así como a un control de agua para evitar el comportamiento de búsqueda de alimentos inducido por la ausencia de alimentos. El número de nematodos dispersados se normalizó al porcentaje de respuesta del control positivo. En la presencia sólo de la comida (control negativo) , aproximadamente el 35% de las larvas Dauer dejó el punto de liberación. Sin embargo, con la adición de la mezcla sintética de ascarósidos, casi el doble de los nematodos (62%) se alejaron del punto de liberación (Figuras 63B y 66A-B) . Probados individualmente a concentración fisiológica, el ascr#8 (50%) y el ascr#2 (40%) provocaron la respuesta más fuerte, pero los cuatro fueron menos activos que la mezcla (Figura 63 C) . Esto sugiere que las larvas dauer de C. elegans eran capaces de percibir y responder a los componentes individuales de la mezcla de dispersión, pero la mezcla de cuatro componentes completa fue necesaria para restaurar la actividad .

Ejemplo 68 - Los EPN y los Nema-todos Parásitos de las plantas detectan la Mezcla de Dispersión de los gusanos C . elegans Se planteó la hipótesis de que muchas especies de nematodos podría ser capaces de detectar y responder a las señales liberadas por otras especies de nematodos. Por lo tanto, los ascarósidos liberado por los gusanos C. elegans podrían funcionar como señales de evasión válidas. En el ensayo de dispersión, los JIs de S.feltiae no exhibieron ningún movimiento perceptible cuando se expusieron al agua, pero fueron muy activos y se alejaron del punto de liberación cuando se expusieron a la mezcla de dispersión de C. elegans (Figuras 63D y 66C) . La forma J2 móvil de los nematodos de los nudos de la raíz silvestres (una mezcla de Meloidogyne spp; M. javanica, M. floridensis, y M. incógnita) aisladas a partir de raíces de tomate también se evaluaron en cuanto a la respuesta a la mezcla de dispersión de C. elegans (Figura 66D) . Otra vez, más nematodos (10-12%) salieron del área en la que se introdujo la mezcla de C. elegans en comparación con el control. Esto sugiere que al menos algunas especies de nematodos pueden responder a mezclas de dispersión de las especies de nematodos relacionadas de forma distante.

Ejemplo 69 - Los componentes Principales de las Mezclas de S . feltiae y C . elegans son Análogos Estructurales Para la caracterización de la feromona de dispersión de S. feltiae, cadáveres de insectos anfitriones se extrajeron con EtOH al 70%, se fraccionaron mediante cromatografía en fase invertida (C18), y se analizaron (Figuras 67A-D) . El bioensayo reveló que una combinación de las tres fracciones (A, B, y C) fue necesaria para la actividad (Figura 67A) . El análisis de las fracciones por LC-MS (Figuras 68A-C) reveló 2 ascarósidos en la fracción A, que se identificaron como ascr#9 y ascr#ll con la ayuda de un estándar sintético (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci . Biol. 10(1) : el001237 (2012); von Reuss y et al., J. Am... Chem. Soc. 134 (3) : 1817-1824 (2012), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Los bioensayos mostraron que el ascr#9 y el ascr#ll no tienen actividad por sí mismos a concentraciones fisiológicamente relevantes (Figura 67B) . Esto se debe a que la fracción A natural fue inactiva cuando se evaluó individualmente (Figura 67A) . Sin embargo, la combinación del ascr#9 sintético a la concentración biológicamente relevante (40 pmol/µ?) con las fracciones naturales B y C restaura la actividad de dispersión inicial (Figura 67C) , lo que confirma al ascr#9 como un componente activo de la mezcla de dispersión de S. feltiae. El segundo ascarósido encontrado en la fracción A, ascr#ll, también restauró la actividad completa cuando se combina con las fracciones B y C (Figura 67D) , lo que indica que ya sea el ascr#9 o el ascr#ll fueron en sí suficientes para reconstituir la actividad de dispersión completa en combinación con las fracciones B y C.

Un perfil de desarrollo se ha establecido previamente (Kaplan et al., Publ . Lib. Sci. ONE 6: el7804 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) para el principal componente de la feromona de dispersión de C. elegans, ascr#2. El ascarósido primario de la fracción A en la mezcla de dispersión de S.feltiae, ascr#9, tiene una estructura análoga al ascr#2 (Figura 67C) . La acumulación de ascr#9 en los cadáveres de insectos infectados por S.feltiae se analizaron por lo tanto en un experimento de curso temporal (Figura 69) . Los resultados muestran que el ascr#9 tuvo un perfil de acumulación muy similar al establecido anteriormente para el ascr#2 en C. elegans. Además, la acumulación del ascr#9 fue más alta directamente antes de la dispersión de los IJ y se mantuvo constante durante al menos 6 dias en el los cadáveres con pocos IJ. Esto es muy similar a la observación del ascr#2 y la formación de larvas dauer para el C. elegans (Kaplan et al., publ. Lib. Sci. ONE 6: el7804 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Por el contrario, el perfil de ascr#ll (Figura 69) difiere del de ascr#9. Inicialmente este hizo detectable pero no cuantificable en el día 8 (dia de dispersión) , y no podría ser cuantificado en el cadáver de insecto anfitrión hasta el día 14, a 6 días después de la dispersión.

El ascr#9 también se evaluó y se encontró que era capaz de ser sustituido por su análogo estructural ascr#2 en el la mezcla de dispersión de C. elegans (Figura 70) . Por lo tanto, la percepción de especies cruzadas, tal como se encuentra con S.feltiae, también puede ser cierta para los gusanos C. elegans .

Ejemplo 70 - El ascr#9 Podría ser un Componente Común en las Mezclas de Dispersión de EPNs Relacionados Fi1ogenéticamente En los escarabajos y las moscas, las especies relacionadas filogenét icamente comparten componentes en sus mezclas de feromonas de agregación (Symonds y Elgar, Proc. Biol. Sci. 271:839-46 (2004) ; Symonds y Wertheim, J. Evol. Biol. 18: 1253-1263 (2005), los cuales se incorporan aqui como referencia en su totalidad) . Para mayor prueba de hasta qué punto los componentes de la mezcla de dispersión fueron compartidos por especies de nematodos filogenéticamente relacionadas, los cadáveres de insectos anfitriones, infectados con Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. se analizaron en cuanto a la presencia de ascr#9, ascr#2 y ascrtll (Figuras 71A-B) .

Se encontró que los cadáveres de insectos anfitriones para ambas especies contienen ascr#9 (Figuras 71A-B) , lo que sugiere que el ascr#9 puede ser utilizado por una amplia gama de especies EPN como parte de sus mezclas de dispersión. El ascr#ll se encontró en todas los Steinernema spp., evaluados pero no en los Heterorhabditis spp., lo que sugiere que el ascr#ll puede ser especifico para el Steinernema spp.

Discusión de los Ejemplos 56-70 Para los gusanos C. elegans, las composiciones compartidas y únicas de los ascarósidos regulan distintos comportamientos. Por ejemplo, las mezclas de apareamiento y dispersión comparten el ascr#2, ascr#3 y ascr#8 (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Pungaliya et al., PN7AS 106:7708-13 (2009); Kaplan et al., Publ . Lib. Sci . ONE 6: el7804 (2011), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . La mezcla de apareamiento de los gusanos C. elegans se caracteriza por un componente único, el ascr#4 (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , y la mezcla de dispersión tiene un componente único, icas#9 (Srinivasan et al., Publ. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Por lo tanto, se piensa que esto puede ser común para muchas especies de nematodos.

No quedó aun claro si Meloidogyne spp., también utiliza mezclas de dispersión, pero se ha demostrado en este documento que estas especies de nematodos pueden detectar y responder a las señales liberadas por otras especies de nematodos que son indicativas de la descomposición y el decaimiento del material vegetal. La mezcla de dispersión de C. elegans muestra una actividad similar en las etapas de desarrollo análogos de especies filogenéticamente relacionadas, lo que sugiere que puede ser utilizada para identificar dianas genéticas, asi como para formular mezclas de dispersión para el control de las especies para parásitas de las plantas, los human y el ganado. Los ejemplos 56-70 no sólo demuestran que varias especies de nematodos utilizan señales de moléculas pequeñas especificas de la especie para regular el comportamiento de dispersión, sino también que el comportamiento de la dispersión de los nematodos puede ser ampliamente inducidos por la comunicación entre especies.

Ejemplo 71 - Ensayo de Retención OP50 de E. coli se cultivó en una placa de agar de 5 cm de estándar (producida con medio de Crecimiento de Nematodos estándar) El césped bacteriano fue de 16 mm de diámetro y se cultivó durante la noche a 20 °C antes de ser utilizado en los ensayos. Dos puntos de 4 mm (0.6 L) se colocaron en lados opuestos del césped bacteriano (utilizando una plantilla transparente para guiar la colocación de los puntos), y varios minutos transcurrido para que el líquido se asentara antes de colocar los nematodos en el ensayo. El registro comenzó inmediatamente después de la colocación de los gusano. 0.6 µL del control se colocaron en un lado del césped, y el 0.6 µ? de la señal experimental se colocaron en el otro lado del césped, cambiando la ubicación de la señal a través los ensayos entre la izquierda/derecha y arriba/abajo para evitar sesgos .

Los nematodos se aislaron por género en la etapa L4 el día antes de ser utilizados en los ensayos como adultos desarrollados. Los gusanos se dividieron y se colocan en dos puntos equidistantes de los focos de la región de calificación de manera uniforme. Los ensayos se registraron durante 20 minutos, y se recolectaron imágenes para su análisis en 1 fotograma por segundo. Los resultados se promediaron a partir de al menos tres ensayos diferentes. Para cada especie de nematodos en este estudio, un número total diferente de gusanos (usando agua en ambas regiones de puntuación) se ensayó para determinar el número mínimo de gusanos necesarios para obtener resultados no sesgados durante un ensayo de 20 minutos. El número total de gusanos utilizados en los ensayos de múltiples especies dependía de los parámetros óptimos de la especie. 10 gusanos se usaron como los machos y hembras de P. redivivus, se usaron 20 gusanos de C. elegans machos y O. dolichuridae machos y 14 gusanos se usaron 14 gusanos machos de S glaseri. Se utilizó un programa automatizado para comparar la ocupación gusano en cada región de calificación con el tiempo, y el índice de Quimiotaxis (Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) se adaptó para calificar la preferencia o la evasión de cada ascarósido.

Ejemplo 72 - Ensayo de Atracción Se prepararon placas de quimiotaxis estándar de 10 cm (Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y se almacenaron a 4 °C hasta el día antes de su uso. Tubos de cobre estándar de 1 cm de diámetro se seccionaron en segmentos de 1 cm de altura, que se utilizaron para las cámaras de retención. Las hembras/ hermafroditas fueron aislados durante toda la noche, se lavaron 3 veces en el amortiguador M9, y luego se les permitió a vagar en una placa preacondicionada con 50 uL de lOOOx estreptomicina durante 2 horas para matar cualquier bacteria que pudiera producir un atrayente falso positivo. Los nematodos se lavaron 3 veces, y el sobrenadante del último lavado se colocó en una cámara de cobre, como el control, 1 cm desde el borde de la placa de 10 cm. Los nematodos se suspendieron en M9 dentro de la cámara de cobre, 1 cm desde el borde y frente a la cámara de control. Después de 6 horas, se retiraron posteriormente y se reemplazaron con 3 µ?,, de azida de sodio 1M. 100 machos adultos de C. elegans se aislaron durante toda la noche, se lavaron varias veces en ddH20, y se colocaron en el centro de la placa de agar. Después de varias horas, los machos paralizados dentro de 2 cm de cada región fueron anotados. El índice Quimiotaxis índice (Bargmann et al., Cell 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) se utilizó luego para calificar la quimiotaxis de los machos a cualquiera de las fuentes puntuales .

Ejemplo 73 - Ensayo de Apareamiento Se adaptó el ensayo de apareamiento descrito en Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. En resumen, hermafroditas/hembras adultas jóvenes se colocaron en un césped bacteriano de 8 mm. Los machos L4 de C. elegans se aislaron durante toda la noche. 5 machos se colocaron en la placa de hermafroditas/hembras . Se contó el número de machos que respondieron a los hermafroditas en un plazo de 3 minutos (un macho individual solo se cuenta una vez) . La respuesta se definió cuando un macho se detuvo en el hermafrodita y fija su cola ventral sobre la posible pareja durante más de 10 segundos consecutivos. Estos se calificaron por su eficiencia de respuesta, también adaptada de Peden et al., Curr. Biol. 15:394-404 (2005), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad, que se calculó usando la fórmula: Eficiencia de Respuesta = [# machos que respondieron/5 machos ] l00% .

Ejemplo 74 - Programa Automatizado (para los Ensayos de Retención) Una cámara de video adjunta al microscopio produce un flujo de video digital, que a continuación fue analizado. Se calculó la relación entre el tiempo promedio que los gusanos pasan en cada región de interés para cada prueba. Para facilitar la implementación, se asumió gue todos los gusanos en un solo experimento tenían más o menos el mismo tamaño. Por lo tanto se contaron los pixeles de los gusanos en lugar de los gusanos completos, lo que permite que las fracciones de los gusanos en la región de interés se tomaran en cuenta. Esto también elimina la necesidad de un algoritmo de identificación de los gusanos basado en la forma, y permite que cada cuadro sea analizado independientemente. Un filtro de paso de banda se aplica a cada cuadro para eliminar el efecto de la iluminación desigual y también acentuar los gusanos contra el fondo. A continuación, los gusanos se identificaron después de la umbralización de las imágenes filtradas. A través de cada experimento, se conocen las ubicaciones y tamaños de las regiones de interés. A través de la filtración descrita anteriormente, se sabe cuáles pixeles están ocupados por gusanos y cuáles no lo están. Por lo tanto, la relación de gusano-píxeles de todos los pixeles dentro de la región de interés se puede calcular para producir la relación de ocupación por los gusanos. Este cálculo se realizó para cada cuadro, dando un gráfico de la proporción de ocupación por los gusanos vs tiempo para cada región.

Ejemplo 75 - Análisis por HPLC .

Se usó un Thermo Finnigan LCQ Deca XP Max con ionización por electroaspersion en modo de iones positivos en el rango de 50 a 1000 AMU. El sistema de HPLC de espectros Thermo Separation consistía en una bomba cuaternaria P4000, un muestreador automático AS 3000, y un detector de matriz de diodos UV 6000. Los disolventes fueron agua con (a) 0.1% de ácido fórmico y (b) 90% de acetonitrilo-10% de agua con formiato de amonio lOMm. La temperatura de la columna se mantuvo a 60 °C y un flujo de disolvente de 1.0 ml/min. La columna de fase invertida (columna en fase invertida polimérica PPLRP-S, 250X4.6mmid, Varían Inc.) se eluyó con una composición de disolvente comenzando con 90:10 (a, b) durante 2 minutos, seguido de un gradiente a 5:95 durante 20 minutos y 5 minutos adicionales a 5:95. La absorción de ultravioleta se monitorizó a 190 y 400 nm. La división del flujo de disolvente entre el detector ultravioleta y espectroscopia de masas fue de 9:1 con una válvula divisora P450 de micro aguja, de bajo volumen (Upchurch Scientific, Oak Harbor, A) , por lo que es posible la obtención de los espectros de los compuestos eluidos y al mismo tiempo recoger el 90% del material inyectado para el bioensayo. El pico purificado con un tiempo de retención de 9,7 minutos fue activo con los machos en el bioensayo. La LC-MS con ionización química (modo positivo) muestra que el pico principal tenía un m/z de 294 (M+NH4) . Se confirmó que este fue el ascr#l usando análisis de RMN .

Ejemplo 76 - Construcción del Árbol Filogenético: Las secuencias de ADN ribosómico de subunidad pequeña (ADNr SSU) para este análisis se obtuvieron de GenBank. Las secuencias se alinearon primero utilizando MUSCLE y posteriormente se cortaron para facilitar la comparación de secuencias con diferentes longitudes. La alineación recortada resultó en 690 caracteres representados de todos los taxa. El análisis Vecino-Unión (NJ) se realizó utilizando los programas de "Dnadist" y "Neighbor" del paquete informático PHYLIP 3.68 y, usando "Consense" para producir un árbol de consenso mayoritario en reglas.

Ejemplo 77 - Cultivo de Nema odos y recolección de Excreciones y Secreciones de los Gusanos C. elegans, R abditis sp., O. tipulae, C. sp.7, P. pacificus, P. redivivo, Koernia sp. Y P. Strongyloides se mantuvieron en placas de agar estándar de 6 cm de agar con E. coli OP50. Para producir grandes cantidades, estos se hicieron crecer en medio liquido de cultivo-medio S completo con E. coli HB101 a 20 °C a 250 rpm en un agitador de incubación. Los gusanos se expusieron a varias etapas de lavado y filtración, utilizando S Basal para eliminar las bacterias. Los gusanos se recolectaron entre los lavados por centrifugación a 3000 rpm durante 5 minutos. Los gusanos se incubaron a 1 gusano/yL en S Basal durante 6 horas. Los gusanos se filtraron entonces y el sobrenadante restante se pasó a través de un filtro de 0.22 µ?? antes de ser almacenados a -20 °C.

S. carpocapsae, S. glaseri, S. riobrave, y H. bacteriophora se mantuvieron como se informa en Hallem, et al., Curr. Biol. 21 (5): 377-83 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Brevemente, varias larvas de Gallería mellonella de último estadio larvario se colocaron en un plato de Petri de 6 cm con 1 papel de filtro Whatman 55 mm. Aproximadamente 500-1000 IJs se colocaron en este papel filtro. Después de 7 días, los cadáveres de insectos se colocaron en una placa de Petri de 6 cm invertida que llevaban un papel de filtro Whatman 1 y se sumergieron en un pequeño volumen de ddH20 en un plato de Petri de 10 cm. Los IJs emergentes se recogieron y se lavaron varias veces como se describe anteriormente, antes de ser incubados en ddH20 en 1 gusano/yL durante 6 horas. Los adultos se extirparon de cadáveres de insectos 3 días después de la infección, y se lavaron/incubaron como se describe anteriormente.

N. brasiliensis , A. suum, P. penetrans y Romanomermis spp. fueron proporcionados por los colaboradores identificados en la Tabla 11 a continuación. Todas las cepas utilizadas en este ejemplo se enumeran. Las especies sin una identificación de la cepa están etiquetadas como "sin designación".

Tabla 11. Fuente de las cepas de nema odos Los gusanos N. brasiliensis se incubaron en solución salina al 0.85% a 1 gusano/5 µ]_, (dado su gran tamaño) a 30 °C. Los gusanos A. suum se lavaron en solución salina estéril antes de ser incubados en DMEM durante 3, 6, y 13 horas a 37 °C. Los sobrenadantes se analizaron individualmente y posteriormente se agruparon para el análisis combinado. Los gusanos P. penetrans y Romanomermis spp. se incubaron en ddH20 a 20 °C a 250 rpm durante la noche.

Ejemplo 78 - Preparación de las Muestras de Gusanos Las muestras de gusanos en agua se liofilizaron, se extrajeron con 1-10 mi de metanol, dos veces, y se filtraron a través de lana de algodón. Los extractos se concentraron al vacio. Los Residuos resultantes se resuspendieron en 150 µL de metanol y después se filtraron.

Ejemplo 79 - Análisis de MS La HPLC-MS se realizó usando un sistema HPLC Agilent Serie 1100 equipado con una columna Agilent Eclipse XDB-C18 (9.4 x 250 mm, 5 um de diámetro de partícula) conectado a un espectrómetro Quattro II (Micromass/Waters) usando una división de 10:1. Un gradiente de disolvente de 0.1% de ácido acético -acetonitrilo se utilizó a una velocidad de flujo de 3.6 ml/min, empezando con un contenido de acetonitrilo de 5% durante 5 minutos y luego se aumentó a 100% durante un periodo de 40 minutos. Los extractos de metabolitos se analizaron por HPLC-ESI-MS en el modo de iones negativos y positivos utilizando un voltaje capilar de 3.5 kV y un voltaje de cono de -40 V y 20 V, respectivamente. Los ascarósidos se identificaron por comparación de las señales cuasi moleculares de los iones (Figuras 72A-D) y los tiempos de retención de HPLC (Figura 73) con las de una biblioteca de 150 componentes identificados a partir de los gusanos de tipo nativo y mutantes de beta-oxidación peroxisomal de C. elegans. Para confirmar la asignación de las estructuras de los ascarósidos, se utilizó identificación por MS/MS para los iones precursores de m/z = 73.0 (Figuras 7 A-B) , porque el trabajo previo indicó que todos los ascarósidos proporcionan un ion C3H5O2 producto intensivo en MS/MS (argón como gas de colisión a 2.1 mtorr y 30 eV) . La cuantificación de los ascarósidos se realizó por integración de las señales LC-MS partir de las correspondientes trazas de iones. Las concentraciones relativas de los ascarósidos se calcularon finalmente utilizando los factores de respuesta determinados para los estándares sintéticos de ascr#l, ascr#2, ascr#3, ascr#5, ascr#7, ascr#9, ascr#10, oscr#9, oscr#9, e icas#9. Los factores de respuesta para los ascarósidos que no han sido sintetizados sin embargo, se extrapolaron con base en los datos observados para los estándares disponibles .

Ejemplo 80 - Síntesis del Ascarósido oscr# 9 El ascarósido oscr#9 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 11 a continuación.

Esquema de Reacción Para preparar 2, d-valerolactona (1) (856 mg) recién destilada, en metanol (17 mi) se trató con H2SO4 concentrado (100 µ?) y se calentó a reflujo durante 12 horas. La solución se enfrió a -20 °C, se trató con NaHC03 (80 mg) , y se agitó durante 10 minutos. La mezcla de reacción se filtró y el disolvente se eliminó al vacio. El residuo se recogió en DC (10 mi), se secó sobre Na2S04, se filtró, y se concentró al vacio para dar 5-hidroxipentanoato de metilo (2) (Huckstep et al., Synthesis 10:881-82 (1982), que se incorpora como referencia en su totalidad) (1.071 mg, 94%) como un aceite incoloro, el cual se usó directamente sin purificación adicional. ?? RM (400 Hz, acetona-de) : d 1.55 (2H, m), 1.68 (2H, m) , 2.35 (2H, t, J = 7.4 Hz) , 3.57 (2H, m) , 3.64 (3H, s); 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d 22.2, 32.9, 34.1, 51.5, 61.9, 174.2. Ver las Figuras 75A-B.

Para preparar 4, una solución de monometil éster de ácido nonanodioico (3) (923 mg, 4.6 mmol) en THF seco (3 mi) a -20 °C se trató con BH3 1M en THF (4.6 mi, 4.6 mmol) durante 10 minutos. Después de agitar a temperatura ambiente durante 4 horas, la reacción se inactivo con una solución acuosa 0.77 M de K2C03 (10 mi) a 0 °C. El producto se extrajo con éter dietilico (3 x 20 mi) , se lavó con solución acuosa saturada de NaCl, se secó sobre Na2S04 y se concentró al vacio para proporcionar 9-hidroxinonanoato de metilo (4) (Kai K. et al., Tetrahedron 64 : 6760-69 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) (850 mg, rendimiento 99%) como un aceite incoloro, que se usó directamente sin purificación adicional. ¾ RMN (400 MHz, cloroformo-di) : d 1.27-1.37 (8H, m) , 1.50-1.66 (4H, m) , 2.29 (2H, t, J = 7.5 Hz), 3.62 (2H, t, J = 6.5 Hz) , 3.66 (3H, s) . Ver la Figura 75C.

Para preparar 6, una solución de 2, 4-di-O-benzoil-L-ascarilosa-(2,2,2-tricloroacetimida) (5) (11116) (132 mg, 263 umol) y 2 (125 mg, 950 umol) en DCM seco (3 mi) a 0 °C se trató con triflato de trimetilsililoxi (5 µ?) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03 (0.5 mi) , se secó sobre Na2SC> , y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 20-40% (v/v) de acetato de etilo en n-hexano, dio metil éster de ácido 5- (3' R, 5'R-dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2-iloxi) -pentanoico (6) (66.8 mg, 142 umol, 47%) como un aceite incoloro. ? RM (400 MHz, acetona-d6) : d 1.28 (3H, d, J = 6.2 Hz), 1.67-1.80 (4H, m) , 2.23 (IH, m) , 2.40 (2H, t, J = 6.9 Hz) , 2.48 (IH, m), 3.58 (IH, m) , 3.64 (3H, s) , 3.83 (IH, m) , 4.13 (IH, dq, J = 9.8 Hz, J = 6.0 Hz), 4.87 (IH, s.br) , 5.15 (IH, ddd, J = 1 1.0 Hz, J = 10.4 Hz, J = 4.5 Hz), 5.18 (IH, s.br), 7.50-7,60 (4H, m) , 7.62 -7.72 (2H, m) , 8.05 (2H, d, J = 7.5 Hz), 8.11 (2H, d, J = 7.5 Hz) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d 18.3, 22.5, 29.6, 34.0, 51.5, 67.5, 67.9, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.03, 130.4, 131.0 (2X) , 134.1, 134.2, 165.9, 166.0, 17 4.0. Ver las Figuras 75D-E.

Para preparar oscr#9 (7), una solución de 6 (66.8 mg, 142 umol) en THF seco (0.5 mi) se añadió a una mezcla de LiOH (28 mg, 1.4 mmol) y agua (0.6 ral) en 1,4-dioxano (4 mi). Después de agitar a 66 °C durante 2 horas, la solución se acidificó con ácido acético glacial y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-30% (v/v) de metanol en DCM conteniendo ácido acético glacial al 1% proporcionó el ácido 5- (3' R, 5' R-dihidroxi-6' S-metil-(2H)- tetrahidropiran-2-iloxi) -pentanoico (oscr#9) (7) (26 mg, 105 umol, 74%) como un aceite incoloro. ¾ RMN (400 MHz, metanol-dj) : d 1.22 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.58-1,72 (4H, m) , 1.77 (IH, ddd, J = 13.1 Hz, J = 11.1 Hz, J = 3.2 Hz), 1.95 (IH, ddt, J = 13.1 Hz, J = 3.7 Hz, J = 0.9 Hz), 2.33 (2H, t, J = 7.2 Hz) , 3.43 (IH, dt, J = 9.6 Hz, J = 6.0 Hz) 3.47-3.59 (2H, m) , 3.71 (IH, dt, J = 9.8 Hz, J = 6.2 Hz) , 3.77 (IH, m) , 4.50 (IH, s); 13C RMN (100 MHz, metanol-d,) : d 18.1, 23.0, 30.1, 34.7, 36.0, 67.9, 68.3, 69.4, 70.9, 100.4, 177.5; ESI-MS (modo negativo) m/z = 247.1 [M-H] . Ver las Figuras 75F-G.

Ejenplo 81 - Síntesis del Ascarósido oscr#10 El ascarósido oscr#10 se preparó como se muestra en el Esquema de Reacción 12 a continuación.

Esquema de Reacción 12 Para preparar 8, una solución de 2 , 4-di-0-benzoil-ascarilosa-1- ( 2 , 2 , 2-tricloroacetimida ) (5) (132 mg, 263 µp???, Hallem, et al., Curr. Biol. 21 (5) : 377-83 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) y 4 (112,8 mg, 600 ymol) en DCM seco (3 mi) a 0 °C se trató con trimetilsililoxi triflato de (5 \ih) . Después de 3 horas, la solución se lavó con solución acuosa saturada de NaHC03 (0.5 mi), se secó sobre Na2SÜ4, y se concentró al vacio. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice utilizando un gradiente de 20-40% (v/v) de acetato de etilo en n-hexano proporcionó 99,3 mg de éster metílico del ácido 9-(3' R, 5' R) -dibenzoiloxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-iloxi) -nonanoico (8) (190 µp???, 72% de rendimiento) como un aceite incoloro. XH RMN (400 MHz, acetona-d6) : d 1.28 (3H, d, 6.2 Hz), 1.30-1.40 (6H, m) , 1.40-1.49 (2H, m) , 1.56-1.72 (2H, m) , 2.22 (1H, ddd, J = 13.6 Hz, J = 11.5 Hz, J = 3.2 Hz), 2.30 (2H, t, J = 7.5 Hz), 2.46 (1H, m) , 3.55 (1H, dt, J = 9.8 Hz, J = 6.5 Hz), 3.60 (3H, s), 3.81 (1H, dt, J = 9.6 Hz, J = 6.6 Hz), 4.13 (1H, dq, J = 9.7 Hz, J = 6.2 Hz) , 4.86 (1H, s.br), 5.15 (1H, ddd, J = 11.4 Hz, J = 9.8 Hz, J = 4.6 Hz), 5.18 (1H, m) , 7.50-7.60 (4H, m) , 7.63-7.71 (2H, m) , 8.04 (2H, m) , 8.11 (2H, m) ; 13C RMN (100 MHz, acetona-d6) : d 18.3, 25.6, 26.8, 29.7, 29.9, 30.0, 30.2, 30.4, 34.4, 51.4, 67.4, 68.2, 71.4, 71.5, 97.0, 129.4, 129.5, 130.2, 130.3, 130.9, 131.0, 134.1, 134.2, 165.9 (2C), 174.3. Ver las Figuras 75H-I.

Para preparar el oscr#10, una solución de 8 (99.3 mg, 190 µp???) en THF (500 µ?) se añadió a una mezcla de LiOH (38 mg, 1.9 mmol) y agua (800 µ?) en 5 mi de 1,4-dioxano (5 mi) . Después de agitar a 66 °C durante 3 horas, la solución se acidificó con ácido acético y se concentró al vacío. La cromatografía en columna instantánea sobre gel de sílice usando un gradiente de 5-30% (v/v) de metanol en DCM conteniendo ácido acético glacial al 1% proporcionó el ácido 9 - (3' R, 5' R-dihidroxi-6' S-metil- (2H) -tetrahidropiran-2-iloxi ) -nonanoico (oscr#10) (9) (49 mg, 161 µp???, 85%) como un aceite incoloro. XH RMN (400 MHz, metanol-d4) : d 1.22 (3H, d, J = 6,1 Hz), 1.32-1.43 (8H, m) , 1.56-1.63 (4H, m) , 1.77 (1H, ddd, J = 13.1 Hz, J = 11.1 Hz, J = 3.2 Hz), 1.96 (1H, ddt, J = 13.1 Hz, J = 3.7 Hz, J = 0.9 Hz), 2.28 (2H, t, J = 7.4 Hz) , 3.41 (1H, dt, J = 9.6 Hz, J = 6.2 Hz) 3.49-3.59 (2H, m) , 3.68 (1H, dt, J = 9.8 Hz, J = 5.5 Hz), 3.76 (1H, m) , 4.49 (1H, s); 13C RMN (100 Hz, metanol-d4) : d 17.3, 25.2, 26.4, 28.0, 29.3, 29.5, 29.6, 30.5, 34.1, 61.1, 67.4, 68.5, 69.9, 99.4, 176.8; ESI-MS (modo de iones negativos) m/z = 303.2 [M-H] . Ver las Figuras 75J-K.

Ejemplo 82 - Muchas Especies de Nematodos Producen Ascarósidos Una identificación basada en la espectrometría de masas se inició para los ascarósidos (Figuras 76A-D) en una variada selección de especies de nematodos, incluyendo tanto los nematodos no parasitarios y parásitos (plantas, insectos y mamíferos) . Estudios anteriores han demostrado que la producción de ascarósidos de los gusanos C. elegans es específica de la etapa de desarrollo (Kaplan et al., Pub. Lib. Sci. ONE 6 (3) : el7804 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Para obtener muestras completas, exudados de un cultivo de desarrollo mixto se pusieron a prueba, conteniendo así una acumulación de ascarósidos liberados por todas las fases de larvas y adultos. Cuando es factible los juveniles infecciosos, parásitos viables y adultos se ensayaron por separado, con el fin de identificar de forma univoca los ascarósidos asociados con la búsqueda de alojamiento o la búsqueda de pareja, respectivamente. Las secreciones de nematodos se analizaron a través de HPLC-MS usando un protocolo optimizado para la detección délos ascarósidos en muestras complejas del metaboloma (Ejemplo 79) . Estos análisis revelaron la presencia de los ascarósidos en la mayoría de las muestras de nematodos. Las muestras se compararon con los datos de espectroscopia de masas de una biblioteca de 150 ascarósidos previamente identificados a partir tanto de las cepas de gusanos C. elegans de tipo nativo y mutantes. Estos análisis revelaron la presencia de ascarósidos en la mayoría de las muestras analizadas de nematodos.

Los ascarósidos se produjeron generalmente en forma de mezclas, que incluían compuestos con cadenas laterales saturadas e insaturadas. Las longitudes de la cadena lateral fueron muy variables y variaron entre las cadenas más cortas también encontradas en C. elegans a compuestos con cadenas laterales considerablemente más largas en Pelodera strongyloides y Heterorhabditis bacteriophora. Al igual que en los gusanos C. elegans, la mayoría de los ascarósidos identificados contienen el azúcar ascarilosa en el penúltimo carbono de la cadena lateral ( "funcionalización (?-l)"), a excepción de los gusanos Caenorhabditis sp. 7 y Rhabditi ssp., los producen ascarósidos en los cuales, la ascarilosa está unida al carbono terminal de la cadena lateral ( "funcionalización (?)", por ejemplo oscr#9 y oscr#9 en la Figura 76D) . Los indol ascarósidos, por ejemplo icas#9 (Figura 76?) , los cuales, como se han demostrado recientemente actúan como señales de agregación en los gusanos, elegans (Srinivasan et al., pub. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) , se encontraron sólo en los gusanos Caenorhabit is spp. Sin embargo, en los gusanos C. elegans, las concentraciones de los indol ascarósidos fueron mucho más bajas que las de los ascarósidos simples ("ascr" y "oscr" en la Figura 76A) . ya que los tamaños de las muestras de metabolitos disponibles para la mayoría de las especies estudiadas en el presente documento fueron mucho menores que las que están disponibles para los gusanos Caenorhabditis spp. , as posible que los indol ascarósidos no se pudieran detectar en algunos nematodos porque las cantidades eran demasiado pequeñas para la detección por HPLC-MS.

Los perfiles de ascarósidos general variaron en general entre las especies (Figura 77) . Sin embargo, las especies de muy diferentes ecologías en algunos casos producen los mismos ascarósidos. Por ejemplo, el ascr#9 es producido por la especie Panagrellus redivivus que habita en el abono vegetal, Rhabditis sp., y Caenorhabditis spp.; que habitan en el suelo Oschieus tipulae; Pristionchus pacificus asociados con los insectos, y Heterorhabditis bacteriophora , Steinernema carpocapsae, Steinernema riobrave, y Steinernema glaseri infecciosos para los insectos.

No se detectaron ascarósidos conocidos en 3 de las 17 especies de nematodos analizadas, a saber, en las especies Pratylenchus penetrans, Ascaris suum, y Romanomermis . Es posible que estas especies produzcan sólo cantidades muy pequeñas de los ascarósidos, o que se produzcan ascarósidos con características estructurales inesperadas que no podrían ser detectadas con el método utilizado, dado que los ascarósidos similares a las identificadas a partir de cepas de tipo nativo y mutante de C. elegans se identificaron. Los estudios previos han reportado la presencia de ascarósidos de cadena larga similares a lípidos en Ascaris sum; sin embargo, estos se limitaron a los ovocitos y los huevos (Bartley et al., J. Nat. Prod. 59 ( 10 ) : 921-26 (1996); Tarr, Comp. Biochem. Physiol. 46B: 167-76 (1973), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Teniendo en cuenta su carácter altamente lipofílico, estos compuestos son poco solubles en medios acuosos, lo que explica su ausencia en los análisis anteriores de este documento, y por lo tanto es poco probable que sirvan como feromonas. Las especies de nematodos, como Romanomermis spp., tienen la capacidad única de almacenar un suministro de por vida de alimentos compuestos de lípidos (Platzer, J. Am. Mosquito Contr. Association Bulletin 7:58-64 (2007); Ittycheriah et al., Nematologica 23: 165-71 (1977), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . Es posible que estos tengan un mecanismo diferente del metabolismo de ácidos grasos o tal vez la síntesis de Ascarósidos aún no ha evolucionado, dado que la especie Romanomermis spp. fue la especia más ancestral evaluada.

Ejemplo 83 - Los Ascarósidos Median Distintos Comportamientos de los Nematodos Las respuestas conductuales de los nematodos a una serie de ascarósidos sintetizados se evaluaron usando diversos ensayos de comportamiento diferentes. Se utilizó un ensayo de retención (Figura 78) utilizando el programa automatizado para detectar preferencia o la evasión de regiones acondicionadas con ascarósidos individuales (Figura 79) . Las especies de nematodos en el estudio de HPLC/MS se seleccionaron por su compatibilidad con este bioensayo, lo que requiere un adecuado movimiento a través de un césped bacteriano. Los nematodos parásitos fueron excluidos en gran parte debido a su exigencia de sustratos similares a su entorno anfitrión. Esta investigación se limitó aún más a los machos, porque en la mayoría de las especies, los machos son mucho más móviles que las hembras o hermafroditas , con la excepción de las hembras de P. redivivus, que se mueven bien y por lo tanto, se incluyeron. Los gusanos Oscheius tipulae se excluyeron debido al hecho de que los machos sólo ocasionalmente están presentes en esta especie hermafrodita, en su lugar, la especie con machos-hembras estrechamente relacionados, Oscheius dolichuroides , se incluyó. En un estudio previo, muestras de ~1 pmol (de concentración 1 p?µ) de ascr#2 y ascr#3 resultaron ser la concentración más activa para la atracción en los gusanos C. elegans (Srinivasan et al Nature 454:1115-18 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Por lo tanto, los ascarósidos sintéticos disponibles se ensayaron a la concentración de InM, ?µ? y lmM.

Varias de las especies de nematodos evaluadas prefieren las áreas acondicionadas por muchos de los mismos ascarósidos, en particular loa ascarósidos ascr#l, ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9 y ascr#10 (Figura 78) . Sin embargo, los umbrales de actividad variaron entre las especies. Por ejemplo, los gusanos C. elegans machos prefieren las regiones acondicionadas con ascr#10 ?µ?, mientras que los gusanos S. glaseri y P. redivivus machos solamente prefieren las regiones acondicionadas con ascr#10 lmm. Además, varias especies de nematodos respondieron a ascarósidos que no fueron producidos por su propia especie, lo que sugiere la posible comunicación entre especies. Una de las especies ensayadas, O. dolichuroides 0 no responde a ninguna de los ascarósidos ensayados. Es posible que esta especie responda a otros ascarósidos o que se requieren condiciones ambientales especificas para provocar su respuesta a los ascarósidos.

Además, se observó que los gusanos P. redivivus machos y hembras responden a diferentes conjuntos de ascarósidos, un fenómeno descrito anteriormente en los C. elegans (Srinivasan et al., Nature 454:1115-18 (2008), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Estas respuestas especificas del género demuestran que ascarósidos pueden desempeñar diferentes funciones tanto entre y dentro de las especies. Por ejemplo, el icas#9 actuó como un estimulante de la agregación en C. elegans (Srinivasan et al., Pub. Lib. Sci. Biol. 10(1) : el001237 (2012), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad), sin embargo, este repele a las hembras de P. redivivus y no provocó ninguna respuesta de los machos de P. redivivus. Puesto que el icas#9 fue producido por el P. redivivus, podría servir como una señal interespecies .

La capacidad de los hermafroditas de C. elegans para atraer a los machos de C. elegans a distancia también fue evaluada. Los estudios previos han informado que los hermafroditas de C. elegans no lograron atraer a los machos en una placa de 5 cm que contenía una fuente puntual condicionada con un solo hermafrodita o en una portaobjetos montado en agar que contiene sobrenadante incubado por hermafroditas (Bargmann et al., Cell. 74:515-27 (1993), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . En los experimentos descritos en el presente documento, tanto el diámetro del área de ensayo y el número de hermafroditas se ampliaron, utilizando una placa de 10 cm y 1-300 hermafroditas de prueba (Figura 80A) . Los resultados demuestran que los gusanos C. elegans hermafroditas de hecho atrajeron a los machos desde una distancia (Figura 80B) . La capacidad de los C. elegans machos para realizar la quimiotaxis hacia 50 C. elegans hermafroditas se comparó con la de números iguales de hembras o hermafroditas de otras especies. Debido a que se encontró que los C. elegans machos fueron atraídos a 7 ascarósidos diferentes (Figura 78), se predijo que las especies productoras de estos ascarósidos atraerían a los C. elegans machos, mientras que los que producen pocos o ninguno de estas ascarósidos no serían capaces de atraer a los C. elegans machos. Los resultados en el presente documento muestran que los C. elegans machos muestran una atracción parcial a las P. redivivus hembras (Figuras 80A-C), cuyas especies produjeron 3 de los 7 conocida atrayentes de los C. elegans machos (Figura 77) (Srinivasan et al., Nature 454.: 1115-1118 (2008); Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . También se encontró que los C. elegans machos no mostraron atracción de largo alcance a las hembras o hermafroditas de la especie S. carpocapsae, P. pacificus, o P. Strongyloides , los cuales produjeron dos, uno, y ninguno de los atrayentes conocidos de los C. elegans machos, respectivamente. Estos resultados proporcionan una prueba más de la posibilidad de interacciones mediadas por ascarósidos entre las diferentes especies de nematodos. Las funciones individuales de las tres feromonas de búsqueda de pareja de C. elegans, descritas previamente (ascr#2, ascr#3 y ascrf 8) (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) también se ensayaron para provocar atracción de los machos desde una distancia. Los resultados muestran que ascr#2 y ascr#3 provocan la tracción de los C. elegans machos, con cantidades tan bajas como 500 attomol y 5 femtomol, respectivamente, mientras que ascr#8 no fue activo en este ensayo. Estos resultados sugieren que ascr#2 y ascr#3 sirven para atraer a los machos de C. elegans desde la distancia, mientras que ascr#8 sirve para mantener los machos dentro de un radio de llegada a un punto de origen.

El apareamiento entre los C. elegans machos y los hermafroditas conespecificos asi como las hembras/ hermafroditas de diferentes especies de nematodos también fueron investigados. Se adoptó el ensayo de apareamiento describe en Peden y Barr, Curr. Biol. 15:394-404 (2005), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad, el cual califica el porcentaje de machos que intentan copular con hermafroditas/hembras , (Figura 81). La investigación fue evaluar si los gusanos C. elegans se apareaban con las especies de nematodos relacionadas de forma distante. Los resultados muestran que estos no intentaron copular con los gusanos P. redivivus, S. carpocapsae, P. pacificus, o P. stronglyoides durante 10 segundos (Figura 81). Además, la adición de una mezcla de ascarósidos no indujo el apareamiento con cualquiera de estas especies de nematodos. Los estudios previos indicaron que el comportamiento de apareamiento de los gusanos C. elegans machos fue guiado principalmente por el reconocimiento de los hermafroditas a través de señales mecanosensoriales o químicos locales (Liu et al., Neuron 14:79-89 (1995), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Los resultados de este documento sugieren que las feromonas sexuales de ascarósido sirven para ayudar a los gusanos C. elegans a localizar compañeros, pero no afectan el apareamiento físico.

Discusión de los Ejemplos 71-83 Los resultados de los Ejemplos 71-83 indican que los ascarósidos comprenden un amplio léxico de nematodos, dada su amplia producción y reconocimiento por parte de las diferentes especies de nematodos. Estos hallazgos son sugestivos de la detección del quorum bacteriano, donde las acil homoserinalactonas acilo (AHL) son producidas y percibidas por muchas especies de bacterias Gram-negativas (Miller et al., Annu. Rev. Microbiol. 55: 165-99 (2001), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) (Figura 82) . Diferentes AHL son estructuralmente muy similares, pero tienen variaciones específicas de la especie en la cadena de N-acilo (Miller et al., Annu. Rev. Microbiol. 55: 165-99 (2001), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Los ascarósidos se organizan de una manera muy similar: estos se componen del mismo anillo de azúcar ascarilosa pero tienen variaciones en la cadena lateral de ácido graso unida (Dickschat, Nat. Prod. Rep. 27:343-69 (2010), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) (Figura 82) . Los resultados en el presente documento indican que los nematodos secretan combinaciones del mismo repertorio de ascarósidos para presentar una firma química específica a su ambiente circundante.

La organización estructural compartida y la naturaleza de amplio alcance tanto de los ascarósidos y los AHLs proporcionan una nueva comprensión de la sintaxis de las redes de comunicaciones bioquímicas. Muchos de los comportamientos bacterianos están mediados por la percepción del quorum, tales como bioluminiscencia, la formación de biopelículas , la expresión de factores de virulencia, la producción de antibióticos, y la motilidad (Boyer y Wisnieski-Dye, FEMS Microbiol. Ecol. 1: 1-19 (2009) , el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Del mismo modo, muchas conductas de los gusanos C. elegans están mediados por los ascarósidos, como la búsqueda de pareja, la repulsión, la agregación, la plasticidad olfativa, y la entrada en una etapa de la vida diapausal (Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Jeong et al., Nature 433:541-45 (2005); Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007); Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009); Niblack et al., Annu. Rev. Phytopathol. 44:283-303 (2006); Macosko et al., Nature 458: 1171-1175 (2009); Yamada et al., Science 329: 1647-1650 (2010); Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 3:420-22 (2007); Golden y Riddle, Science 218:578-80 (1982), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) .

Por otra parte, el perfil de ascarósidos de C. elegans cambia en respuesta al crecimiento y las perturbaciones ambientales (Kaplan et al., Pub. Lib. Science. ONE 6 (3) : el7804 (2011), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Teniendo en cuenta la amplia diversidad de los nematodos y los comportamientos de los nematodos, la naturaleza modular de los ascarósidos parece una estrategia adecuada para el uso de un único mecanismo para transmitir las necesidades cambiantes de un individuo o población. Las moléculas que son estructuralmente similares a los AHLs bacterianos pueden ser sintetizados para desarrollar una nueva clase de fármacos antimicrobianos que interfieren con la comunicación bacteriana (Schauder et al., Genes Dev. 15: 1468-1480 (2001), el cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Los estudios similares en los nematodos pueden permitir el diseño de mezclas sintéticas de ascarósido para interferir con la reproducción y la supervivencia de los nematodos en modelos parásito-anfitrión.

Debido a que los nematodos son actualmente responsables de alrededor de $100 millones de dólares anuales en pérdidas a la agricultura mundial (JOSEPH A. VEECH: REVIEWS ON NE ATOLOGY (Society of Nematologists , Inc. Hyatsville, MD, 1987), que se incorpora aqui como referencia en su totalidad) e infectan a 3 mil millones de humanos en todo el mundo (Blumenthal y Davis, Nat. Genet. 36: 1246-1247 (2004), el cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad) , existe una necesidad significativa para el control de los parásitos. El concepto de la utilización de feromonas especificas de cada especie para el manejo de las plagas de insectos ha llevado más de 50 años de investigación en feromonas de insectos con > 100 feromonas utilizadas en el manejo de las plagas (Witzgall et al., J. Chem. Ecol. 36:80-100 (2010), que se incorpora aqui por Referente en su totalidad) . Sin embargo, la interrupción mediada por feromonas sólo se ha aplicado en la práctica a una sola feromona de nematodo, el ácido vanílico, hacia el control del nematodo parásito de la soya Heterodera glycines (Meyer et al., J. Nematol 29:282-88 (1997), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad) . Es más probable atribuir esto a la falta de identificación de las feromonas de nematodo, aparte de las descubiertas en H. glycines y C. elegans (Jaffe et al., J. Chem. Ecol. 15:2031-43 (1989); Srinivasan et al., Nature 454: 1115-1118 (2008); Jeong, et al., Nature 433:541-45 (2005); Butcher et al., Nat. Chem. Biol. 7:420-22 (2007); Pungaliya et al., PNAS 19:7708-13 (2009), los cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad) . El descubrimiento de esta biblioteca modular, de amplio alcance, biblioteca de las feromonas de nematodos, puede sin duda resultar útil a este esfuerzo necesario, mientras que la interpretación de la sintaxis puede proporcionar nueva información sobre la evolución de las firmas bioquímicas.

Ejemplo 84 - Producción de Ascarosidos en Los Nematodos de los Nudos de la Raíz Los ascarosidos ascr#10, ascr#16, ascr#18, ascr#20 y ascr#22 se detectaron en ciertas especies de nematodos parásitos de plantas Meloidogyne (Figura 83) y se identificaron utilizando la espectrometría de masas de alta resolución (Figuras 84 - 88) . Se prevé que estos ascarosidos y/o los derivados estructurales de la misma (individualmente, conjuntamente, y/o conjuntamente con el ascr#9 u otros ascarosidos) actúan como dispersantes y repelentes en la especie Meloidogyne. (También se predijo que ascr#18 y ascr#22 y/o los derivados estructurales de los mismos (individualmente, conjuntamente, y/o conjuntamente con ascr#9 u otros ascarosidos) actúan como dispersantes y repelentes en Heterorhabditis . ) Ejemplo 85 - Funciones de los Ascarosidos Varios ascarosidos y mezclas de ascarosidos se administraron a varios nematodos descritos a continuación (Tabla 12) . Como se resume a continuación, los ascarosidos y las mezclas de ascarósidos resultaron en varios comportamientos de los nematodos, tales como la atracción de los nematodos machos, o la promoción de la formación de larvas dauer. Un resultado muy intenso al afectar el comportamiento de los nematodos se designa en la tabla como "fuerte".

Tabla 12 : función de los Ascarósidos/Mezclas de Ascarósidos Función de los ascarósidos Nematodos Nematodos Modelo: Caenorhabditis elegans, Pristionchus pacificus, Panagrellus redivivus Parásitos de las plantas: Nematodos de los Nudos de la raíz (RKN), Meloidogyne spp. (Segunda etapa de juveniles) Entomopatógenos (parasitarios de insecto):. Heterorhabditis spp, Steinernema spp, Steinernema feltiae (juveniles Ejemplo 86 - Ascarósidos producidos Los ejemplos de los diversos ascarósidos que son producidos por las especies de nematodos como se indica a continuación (Tabla 13) . Los Ejemplos de fuentes de los ascarósidos se proporcionan por especie de nematodo asi como el tipo del nematodo Tabla 13 : Ascarósidos producidos por especie de nematodo Aunque las reivindicaciones preferidas se han representado y descrito en detalle en el presente documento, será evidente para aquellas personas experimentadas en la técnica relevante que se pueden hacer varias modificaciones, adiciones, sustituciones, y los similares sin apartarse del espíritu de la invención y estos por lo tanto, se consideran dentro del alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones.

Claims (50)

REIVINDICACIONES

1. Un método para modificar el comportamiento de los nematodos, caracterizado porque, comprende: proporcionar una composición que comprende un compuesto de la fórmula: (Fórmula I), o los equivalentes, derivados, análogo y/o sales farmacéuticas del mismo; y administrar una dosis eficaz de la composición a los nematodos ; caracterizado porque, los nematodos están en contacto con plantas .

2. El método de la rei indicación 1, caracterizado porque, R1 es H, -C(R)3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, R1' está ausente, es H, -C(R) 3, -0R, -N(R)2, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, o un haloalquenilo; en donde cada R es independientemente H, halógeno, un grupo alquilo, o un alquenilo.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, R2 es un grupo de la fórmula: (Fórmula II), los equivalentes, derivados, análogos y/o sales farmacéuticas del mismo.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, R3 es H, -CR6R7R8, -C(0)R8, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R5 de otra unidad de Fórmula I .

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, R4 es H, -CR6R R8, Q -C(0)R , un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R5 de otra unidad de Fórmula I .

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, R5 es H, -OH, -0R6, -OCR6R7R8, -CR5R7R8, -NH2, -NHR6, -NR6R7, halógeno, un grupo alquilo, un haloalquilo, un alquenilo, un haloalquenilo, un arilo, un heteroarilo, un arilalquilo, un heterociclilo, un cicloalquilo, un cicloalquenilo, un grupo acilo, un aminoácido, un nucleósido, un monosacárido que tiene 5 o 6 átomos de carbono, o un enlace que conecta a R3 o R4 de otra unidad de Fórmula I.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el nematodo no es la especie Caenorhabditis .

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el nematodo se selecciona del grupo que consiste de Acuarioidea, Aelurostrongylus , Aelurostrongylus abstrusus, Amidostomatidae , Amidostomum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum (anquilostoma canino) , Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Ancylostoma tubaeforme, Ancylostomatidae, Ancylostomatinae, Angiostrongylidae, Angiostrongylus , Aproctoidea, Ascaridia galli, Ascaris lumbricoidies, Ascaris suum, Brevistriatinae, Brugia malayi, Brugia timori, Bunostominae, Camallanoidea, Carolinensis minutus, Chabertia, Chabertia ovina, Chabertiidae, Cloacina, Cloacinidae, Cooperia, Cooperia pectinata, Cooperia punctata, Cooperiidae, Cosmocercoidea, Crenosoma, Crenosomatidae, Cyathostoma, Cyathostominae, Cyclodontostomum, Cylicocyclus nassatus, Cystocaulus, Cystocaulus ocreatus, Deletrocephalidae, Deletrocephalus, Diaphanocephalidae, Diaphanocephaloidea, Dictyocaulidae, Dictyocaulinae, Dictyocaulus arnfeldi, Dictyocaulus filaría, Dictyocaulus osleri, Dictyocaulus viviparus, Dictyocausus viviparous, Didelphostrongylus, Dioctophyma renale, Dioctophymatoidea, Diplotriaenoidea, Dirofilaria iramitis, Dracunculoidea, Dromaeostrongylidae, Elaeophora scheideri, Elaphostrongylinae, Filarinema, Filarioidea, Filaroides, Filaroididae, Gape orm, Ghathostomatoidea, Globocephaloidinae, Gongylonema pulchrum, Gyalocephalinae, Habronema, Habronematoidea, Haemonchidae, Haemonchinae, Haemonchus contortus, Haemonchus placei, Halocercus, Heligmonellidae, Heligmonellinae, Heligmonoides speciosus, Heligmosomatidae, Heligmosomidae, Heligmosomoidea, Heligmosomoides, Herpetostrongylidae, Herpetostrongylinae, Heterakoidea, Hovorkonema, Hypodontus, Kalicephalus, Labiomultiplex, Labiosimplex, Labiostrongylus, Libyostrongylinae, Loa loa, Longistriata, Mackerrastrongylidae, Macroponema, Macropostrongylus, Mansonella ozzardi, Mansonella perstans, Mansonella streptocerca, Marshallagia, Metastrongylidae, Metastrongyloidea (gusanos pulmonares), Metastrongyloidea sp. RJ-2010, Metastrongylus, Metastrongylus apri, Metastrongylus asymmetricus, Metastrongylus confusus, Metastrongylus elongates, Metastrongylus pudendotectus, Metastrongylus salmi, Molineidae, Molineoidea, Monilonema, Muellerinae, Muellerius capillaris, Muspiceoidea, Nematodirinae, Nematodirus battus, Neoheligmonella granjoni, Nicollina, Nicollinidae, Nippostrongylinae, Nippostrongylus brasiliensis, Oesophagostomum, Oesophagostomum columbianum, Oesophagostomum radiatum, Ohbayashinema, Oncocerca volvulus, Orientostrongylus ezoensis, Oslerus, Oslerus osleri, Ostertagia ostertagi, Ostertagia venulosum, Otostrongylus, Oxyurodiea, Papillostrongylus, Paraelaphostronyglus tenuis, Parafilaroides, Parazoniolaimus, Physalopteroidea, Potorostrongylus, Protostrongylidae, Protostrongylinae, Pseudaliidae, Pseudalius, Rictularioidea, Rugopharynx, Setaria cewi, Seuratoidea, Skrjabingylus, Spiruroidea, Stenurus, StephanoJilaria stilesi, Stephanuridae, Stephanurus, Strongylida, Strongylida sp. AM-2008, Strongylidae, Strongylinae, Strongyloidea, Strongyloides papillosus, Subuluroidea, Syngamidae, Syngamus, Teladorsagia circumcincta, Ternidens, Tetrabothriostrongylus, Thelazioidea, Torynurus, Toxocana canis, Toxocara cati, Toxocara vitulorum, Trichinella spiralis, Trichinelloidea, Trichostronglyus axei, Trichostronglyus colubriformis, Trichostronglyus vitrinus, Trichostrongylidae, Trichostrongylinae, Trichostrongyloidea, Trichuris suis, Troglostrongylus, Umingmakstrongylus pallikuukensis, Metastrongyloidea no clasificada, Protostrongylidae no clasificada, Strongylida no clasificada, Trichostrongylidae no clasificada, y Varestrongylinae Zoniolaimus.

10. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el compuesto incluye al menos una nucleobase.

11. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el compuesto incluye al menos un ácido graso.

12. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el compuesto incluye al menos un aminoácido.

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el compuesto incluye al menos un azúcar.

14. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, el comportamiento de los nematodos se selecciona del grupo que consiste de la reproducción, el desarrollo, la formación de larvas dauer, la agregación, la atracción, la repulsión, la dispersión, la disuasión, la alimentación, la búsqueda de anfitriones, y la invasión de anfitriones.

15. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, las plantas se seleccionan del grupo que consiste de dicotiledóneas, monocotiledóneas, plantas de cultivo, alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, camote, frijol, haba verde, cera de haba, alubia de lima, guisantes, achicoria, lechuga, escarola, col, col de Bruselas, remolacha, remolacha azucarera, chirivia, nabo, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, la cebolla, el ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabaza, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales adecuadas incluyen, sin limitación, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel, y zinnia.

16. Un método para monitorear o inhibir la reproducción en los nematodos en contacto con las plantas, caracterizado porque comprende: proporcionar una composición que comprende un compuesto de la fórmula: (Fórmula I), o un equivalente, derivado, análogo y/o sal farmacéutica del mismo; y administrar una dosis eficaz de la composición a los nematodos en contacto con las plantas.

17. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, la composición comprende uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de ascr#l, ascr#2 ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9, ascr#10, ascrtll, ascr#12 ascr#14, ascr#16, ascr#18, ascr#20, ascr#22, ascr#24, ascr#26, icas#9, hbas#3, y oscr#9.

18. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#l, ascr#2, ascr#3, ascr#4, ascr#5, ascr#7, ascr#8, ascr#10, icas#9, hbas#3, y combinaciones de los mismos.

19. El método de la reivindicación 18, caracterizado porque, el nematodo es Caenorhabditis elegans.

20. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#2, ascr#3, ascr#4, y combinaciones de los mismos .

21. El método de la reivindicación 20, caracterizado porque, el nematodo es Caenorhabditis brenneri, Caenorhabditis remanei, Caenorhabditis briggsae, o Caenorhabditis japónica.

22. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#l, ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9, ascr#10, oscr#9, oscr#10, icas#9, y combinaciones de los mismos.

23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque, el nematodo es Panagrellus redivivus.

24. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#2, ascr#3, ascr#8, icas#9, ascr#9, ascr#10, ascr#16, ascr#18, ascr#20, ascr#22, y combinaciones de los mismos.

25. El método de la reivindicación 24, caracterizado porque, el nematodo es Meloidogyne javanica, Meloidogyne floridensis, Meloidogyne incógnita, o Meloidogyne hapla.

26. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#9, ascr#ll, y combinaciones de los mismos.

27. El método de la reivindicación 26, caracterizado porque, el nematodo es Steinernema riobrave, Steinernema diaprepsi, o Steinernema carpocapse.

28. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#2, ascr#3, ascr#8, ascr#9, oscr#10, ascr#ll, y combinaciones de los mismos.

29. El método de la reivindicación 28, caracterizado porque, el nematodo es Steinernema feltiae.

30. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#l, ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#10, y combinaciones de los mismos.

31. El método de la rei indicación 30, caracterizado porque, el nematodo es Steinernema glaseri.

32. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#9, ascr#18, ascr#22 y combinaciones de los mismos.

33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque, el nematodo es Heterorhabditis bacteriophora, Heterorhabditis zealandica, o Heterorhabditis floridensis.

34. El método de la reivindicación 16, caracterizado porque, la composición comprende ascr#l, ascr#3, ascr#7, ascr#10, ascr#18, ascr#20, ascr#22, ascr#26, y combinaciones de los mismos.

35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque, el nematodo es Nippostrongylus brasiliensis o Pelodera strongyloides .

36. Un método para promover o inhibir la agregación de los nematodos en una primera ubicación, en las plantas, dicho método, caracterizado porque, comprende: (i) poner en contacto dicha primera ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados, bajo condiciones efectivas para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, o (ii) poner en contacto una segunda ubicación con uno o más compuestos moduladores aislados, bajo condiciones efectivas para promover o inhibir la agregación de los nematodos en la primera ubicación, en donde la primera ubicación y la segunda ubicación están separadas para que permitir dicho contacto en la segunda ubicación tenga un efecto sobre la agregación de los nematodos en la primera ubicación; en donde, el compuesto comprende la fórmula: (Fórmula I) o los equivalentes, derivados, análogos y/o sales farmacéuticas del mismo.

37. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, el uno o más compuestos moduladores aislados se selecciona del grupo que consiste de ascr#l, ascr#2 ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9, ascr#10, ascr#ll, ascr#12 ascr#14, ascr#16, ascr#18, ascr#20, ascr#22, ascr#24, ascr#26, icas#9, hbas#3, y oscr#9.

38. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, la segunda ubicación está en las plantas.

39. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, las plantas se seleccionan del grupo que consiste de dicotiledóneas, monocot iledóneas , plantas de cultivo, alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, camote, frijol, haba verde, cera de haba, alubia de lima, guisantes, achicoria, lechuga, escarola, col, col de Bruselas, remolacha, remolacha azucarera, chirivia, nabo, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, la cebolla, el ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabaza, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales adecuadas incluyen, sin limitación, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel, y zinnia.

40. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, las puesta en contacto comprende rociado a alta presión, rociado a baja presión, inmersión, atomización, formación de espuma, nebulización, revestimiento, o incrustación.

41. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, comprende además, poner el contacto la segunda ubicación con una toxina que es dañina para los nematodos.

42. El método de la reivindicación 36, caracterizado porque, la primera ubicación es una población de insectos.

43. El método de la reivindicación 42, caracterizado porque los insectos se seleccionan del grupo que consiste del barrenador europeo del maiz, gusano soldado, gusano falso medidor, Helicoverpa zea, gusano cogollero, Plutella xylostella, gusano de la col, gusano de la cebolla, gusano de las semillas del maiz, Diaphania nitidalis, gusano de la pimienta, y lombriz intestinal del tomate.

44. El método para reducir la probabilidad o evitar infecciones por parásitos en plantas, dicho método caracterizado en que comprende: proporcionar una composición que comprende un compuesto de la fórmula: ( Fórmula I) o los equivalentes, derivados, análogos y/o sales farmacéuticas del mismo; y administrar una cantidad de la composición a las plantas, suficiente para reducir la probabilidad o evitar la infección por parásitos de las plantas.

45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque, el parásito es un nematodo o un insecto.

46. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque, la composición comprende uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste de ascrll, ascr#2 ascr#3, ascr#7, ascr#8, ascr#9, ascr#10, ascr#ll, ascr#12 ascr#14, ascr#16, ascr#18, ascr#20, ascr#22, ascr#24, ascr#26, icas#9, hbas#3, y oscr#9.

47. El método de la reivindicación 4, caracterizado porque, las plantas se seleccionan del grupo que consiste de dicotiledóneas, monocotiledóneas , plantas de cultivo, alfalfa, arroz, trigo, cebada, centeno, algodón, girasol, cacahuate, maíz, papa, camote, frijol, haba verde, cera de haba, alubia de lima, guisantes, achicoria, lechuga, escarola, col, col de Bruselas, remolacha, remolacha azucarera, chirivia, nabo, coliflor, brócoli, nabo, rábano, espinaca, la cebolla, el ajo, berenjena, pimiento, apio, zanahoria, calabaza, calabaza, calabacín, pepino, manzana, pera, melón, cítricos, fresa, uva, frambuesa, piña, soja, tabaco, tomate, sorgo y caña de azúcar. Los ejemplos de plantas ornamentales adecuadas incluyen, sin limitación, Arabidopsis thaliana, Saintpaulia, petunia, pelargonio, flor de pascua, crisantemo, clavel, y zinnia.

48. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque, el parásito es un insecto.

49. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque, los insectos se seleccionan del grupo que cosiste de: el barrenador europeo del maíz, gusano soldado, gusano falso medidor, Helicoverpa zea, gusano cogollero, Plutella xylostella, gusano de la col, gusano de la cebolla, gusano de las semillas del maíz, Diaphania nitidalis, gusano de la pimienta, y lombriz intestinal del tomate.

50. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque, el parásito se selecciona del grupo que consiste de Acuarioidea, Aelurostrongylus , Aelurostrongylus abstrusus, Amidostomatidae, Amidostomum, Ancylostoma braziliense, Ancylostoma caninum ( anquilostoma canino) , Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Ancylostoma tubaeforme, Ancylostomatidae, Ancylostomatinae, Angiostrongylidae, Angiostrongylus, Aproctoidea, Ascaridia galli, Ascaris lumbricoidies , Ascaris suum, Brevistriatinae, Brugia malayi, Brugia timori, Bunostominae, Camallanoidea, Carolinensis minutus, Chabertia, Chabertia ovina, Chabertiidae, Cloacina, Cloacinidae, Cooperia, Cooperia pectinata, Cooperia punctata, Cooperiidae, Cosmocercoidea, Crenosoma, Crenosomatidae, Cyathostoma, Cyathostominae , Cyclodontostomum, Cylicocyclus nassatus, Cystocaulus, Cystocaulus ocreatus, Deletrocephalidae, Deletrocephalus , Diaphanocephalidae, Diaphanocephaloidea, Dictyocaulidae, Dictyocaulinae , Dictyocaulus arnfeldi, Dictyocaulusfilaria, Dictyocaulus osleri, Dictyocaulus viviparus, Dictyocausus viviparous, Didelphostrongylus , Dioctophyma renale, Dioctophymatoidea , Diplotriaenoidea, Dirofilaria immitis, Dracunculoidea, Dromaeostrongylidae, Elaeophora scheideri, Elaphostrongylinae, Filarinema, Filarioidea, Filaroides, Filaroididae, Gapeworm, Ghathostomatoidea, Globocephaloidinae, Gongylonema pulchrum, Gyalocephalinae, Habronema, Habronematoidea, Haemonchidae, Haemonchinae , Haemonchus contortus, Haemonchus placei, Halocercus, Heligmonellidae, Heligmonellinae, Heligmonoides speciosus, Heligmosomatidae, Heligmosomidae, Heligmosomoidea , Heligmosomoides, Herpetostrongylidae, Herpetostrongylinae, Heterakoidea, Hovorkonema, Hypodontus, Kalicephalus , Labiomultiplex, Labiosimplex, Labiost rongylus , Libyostrongylinae , Loa loa, Longistriata , Mackerrastrongylidae, Macroponema, Macropost rongylus , ansonella ozzardi, Mansonella perstans, Mansonella streptocerca, Marshallagia, etastrongylidae, etastrongyloidea (gusanos pulmonares), Metastrongyloidea sp. RJ-2010, Metastrongylus, Metastrongylus apri, Metastrongylus asymmetricus , Metastrongylus confusus, Metastrongylus elongates, Metastrongylus pudendotectus, Metastrongylus salmi, Molineidae, Molineoidea, Monilonema, Muellerinae, Muellerius capillaris, Muspiceoidea , Nematodirinae, Nematodirus battus, Neoheligmonella granjoni, Nicollina, Nicollinidae, Nippostrongylinae, Nippostrongylus brasiliensis, Oesophagostomum, Oesophagostomum columbianum, Oesophagostomum radiatum, Ohbayashinema , Oncocerca volvulus, Orientostrongylus ezoensis, Oslerus, Oslerus osleri, Ostertagia ostertagi, Ostertagia venulosum, Otostrongylus , Oxyurodiea, Papillostrongylus , Paraelaphostronyglus teniiis, ParaJilaroides , Parazoniolaimus , Physalopteroidea, Potorostrongylus, Protostrongylidae, Protostrongylinae, Pseudaliidae, Pseudalius, Rictularioidea, Rugopharynx, Setaria cewi, Seuratoidea, Skrj abingylus , Spiruroidea, Stenurus, StephanoJilaria stilesi, Stephanuridae , Stephanurus, Strongylida, Strongylida sp. AM-2008, Strongylidae, Strongylinae, Strongyloidea, Strongyloides papillosus, Subuluroidea, Syngamidae, Syngamus, Teladorsagia circumcincta, Ternidens, Tetrabothriostrongylus, Thelazioidea, Torynurus, Toxocana canis, Toxocara cati, Toxocara vitulorum, Trichinella spiralis, Trichinelloidea, Trichostronglyus axei, Trichostronglyus colubriformis , Trichostronglyus vitrinus, Trichostrongylidae, Trichostrongylinae, Trichostrongyloidea, Trichuris suis, Troglostrongylus , Umingmakstrongylus pallikuukensis, Metastrongyloidea no clasificado, Protostrongylidae no clasificado, Strongylida no clasificado, Trichostrongylidae no clasificado, Varestrongylinae, Wucheria bancrofti, y Zoniolaimus .