JPH1072481A

JPH1072481A - フェノール化合物のルチノース配糖体の製造方法

Info

Publication number: JPH1072481A
Application number: JP23194396A
Authority: JP
Inventors: Hirofumi Shinoyama; 浩文篠山; Takanari Narukawa; 隆也成川; Yoko Takeuchi; 陽子武内; Takaaki Fujii; 貴明藤井; Toshitaka Yasuda; 俊隆安田
Original assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Current assignee: Toyo Suisan Kaisha Ltd
Priority date: 1996-09-02
Filing date: 1996-09-02
Publication date: 1998-03-17
Anticipated expiration: 2016-09-02
Also published as: JP3787002B2

Abstract

(57)【要約】【課題】フェノール化合物から、そのルチノース配糖体
を製造するための新規な方法を提供すること。また、新
規なフェノール化合物配糖体を提供すること。【解決手段】フェノール化合物の存在下において、ルチ
ンに対し、ルチン分解酵素を作用させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＵＶ吸収能、抗酸
化能、美白効果、チロシナーゼ阻害活性といった有用な
機能を有するフェノール化合物の配糖体、より詳しく
は、フェノール化合物のルチノース配糖体を製造する製
造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フェノール化合物の配糖体は、少量では
あるが植物体に広く存在し、また優れた生理活性を有す
るにもかかわらず低毒性であることから、食品素材、食
品添加物、医薬品、化粧品などの開発のターゲットとし
て注目されつつある。

【０００３】例えば、アルブチンは従来周知のフェノー
ル化合物配糖体の一種である。その化学名は、ヒドロキ
ノン β−Ｄ−グルコピラノシドであり、ヒドロキノン
をアグリコンとするグルコース配糖体である。アルブチ
ンは美白効果、メラニン生成抑制および活性酸素抑制と
いった効果を有するため、化粧料として広く用いられて
いる。また、カテコールやレゾルシノール等をアグリコ
ンとする配糖体についても、皮膚色素沈着の予防および
治療に有効であることが知られている。

【０００４】上記のような、優れた薬理効果を有するフ
ェノール化合物の配糖体について更に詳しく検討する
と、各配糖体のアグリコン、即ち、ヒドロキノン、カテ
コール、およびレゾルシノール自体も、夫々の配糖体に
対応した優れた薬理効果を有している。しかし、これら
のアグリコン自体の効果は夫々の配糖体に比較して小さ
い。そのため、高濃度での使用を余儀なくされるのみな
らず、長期に亘って使用すると皮膚に白斑を生じるなど
の副作用を伴う。

【０００５】上記のような事実から、有用な薬理効果を
有するフェノール化合物は、一般的に、これを配糖体に
することによって薬理効果を向上させ、且つ副作用を低
減し得ることが期待される。更に、配糖体はそのアグリ
コン自体に比較して、一般的に水溶性が高いことが知ら
れている。

【０００６】一方、例えば没食子酸の二量体であるエラ
グ酸は、抗酸化作用を始め、メラニン色素抑制作用等の
優れた薬理効果を有しているが、酸化され易く不安定で
あり、また水に対する溶解性が極めて低いため、取り扱
いが不便であるという問題がある。従って、このような
フェノール化合物については、これを配糖体にすること
によって、その生理活性を損なうことなく、副作用およ
び溶解性の問題を改善できることが期待される。

【０００７】しかしながら、フェノール化合物を配糖体
に転化するための、効率的かつ簡便な方法が存在しない
ため、ある種のフェノール化合物では、有用な活性を有
するにもかかわらず十分には利用が図られていないのが
実状である。

【０００８】また、従来のフェノール配糖体における糖
部分は、グルコース、リボース等の数種類に限定されて
おり、アグリコンと糖との組合せは比較的限定されてい
た。従って、同じアグリコンであっても、異なった糖を
結合させることができれば、有用な新規フェノール配糖
体が得られることが期待される。

【０００９】

【発明が解決しょうとしている課題】本発明は上記事情
に鑑みてなされたもので、フェノール化合物から、その
ルチノース配糖体を製造するための新規な方法を提供す
ることを目的とするものである。また、本発明は、上記
の方法で得られた新規なフェノール化合物のルチノース
配糖体を提供する。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、フェノール化
合物の存在下において、ルチンに対し、ルチン分解酵素
を作用させることを特徴とする、フェノール化合物のル
チノース配糖体の製造方法、並びにこの方法によって得
られる新規なフェノール化合物のルチノース配糖体であ
る。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明による方法は、フェノール
化合物の存在下において、ルチンに対してルチン分解酵
素を作用させることにより、ルチンに含まれる糖部分、
即ちルチノースを前記フェノール化合物へ転移させるも
のであり、下記の式で表される。

【００１２】

【化１】

【００１３】（ここで、ＲＯＨはフェノール化合物であ
る。）本発明におけるフェノール化合物は、上記の酵素反応に
おいてルチノースの受容体として作用するものであれば
特に限定されない。しかし、好ましいフェノール化合物
としては、ヒドロキノン、ピロガロール、ベラトリルア
ルコール、没食子酸、カテコール、エラグ酸、ベンジル
アルコール等が挙げられる。

【００１４】本発明で用いるルチンは、上記式に示され
るように、アグリコンであるクエルセチンに、ルチノー
ス（グルコースとラムノースとからなる二糖）がＯ- グ
リコシド結合した配糖体である。このルチンは、エンジ
ュ（豆科）、蕎麦（タデ科）、ヘンルーダ（ミカン科）
等の天然の植物に広く分布するフラボノール配糖体の一
種であり、動脈硬化、高血圧の予防等に有用な生理活性
物質として知られている。

【００１５】本発明におけるルチン分解酵素としては、
ルチンを分解してルチノースを切り出し、これをフェノ
ール化合物の酸素原子上に転移させ得るものであれば如
何なるものでもよい。その例としては、エンジュ、蕎
麦、ヘンルーダ等の植物に由来する酵素、或いはペニシ
リウム(Penicillium) 属、アスペルギルス(Aspergillu
s) 属の菌などの微生物に由来する酵素を挙げることが
できる。これらの酵素のうち、特に好ましいのはダッタ
ン蕎麦の種実に含まれるルチン分解酵素である。何故な
ら、このルチン分解酵素は活性が高く、またダッタン蕎
麦は現在も広く食用に供されているものであり、安全性
の点で信頼性が高いからである。また、アスペルギルス
・ニガー(Aspergillus niger) から得たルチン分解酵素
は、広範囲のフェノール化合物に対して配糖化能を有す
る点で好ましい。

【００１６】本発明において、上記のルチン分解酵素は
精製品であることが好ましいが、その活性の強さや含量
によっては、必ずしも精製品である必要はない。即ち、
これらの酵素を含有する植物や微生物の抽出液をそのま
ま用いたり、場合によっては植物体や微生物をそのまま
用いてもよい。

【００１７】ダッタン蕎麦の種実に含まれるルチン分解
酵素を例にとると、ダッタン蕎麦の種実、またはこの種
実を挽いて調製した蕎麦粉にバッファーを加えて攪拌抽
出をして抽出液を得、これを更に精製して得られた精製
酵素を用いることが好ましい。しかし、ダッタン蕎麦に
含まれる酵素は活性が高いので、抽出液をそのまま用い
ても十分に機能する。更に、ダッタン蕎麦の種実には、
通常の蕎麦の種実に比較して非常に多量のルチンが含ま
れている。即ち、通常の蕎麦の種実では約１４ｍｇ％で
あるのに対して、ダッタン蕎麦の種実では約１３００ｍ
ｇ％（ｍｇ％は、蕎麦種実１００ｇに含まれるルチンの
ｍｇ量を表す）である。従って、ダッタン蕎麦の種実ま
たはその粉をそのまま用いても、十分に目的とするルチ
ノースの転移反応を行うことができる。

【００１８】また、微生物に由来するルチン分解酵素を
使用する際には、微生物そのものから酵素を抽出して使
用してもよい。しかし、その微生物が菌体外に酵素を分
泌する場合には、微生物を培養した培養液をそのまま粗
酵素液として用いることができる。勿論、この培養液を
更に抽出精製し、精製酵素にして用いることも可能であ
る。

【００１９】植物や微生物からのルチン分解酵素の抽出
は、通常、酵素の抽出に用いられる方法により行うこと
ができる。例えば、酢酸バッファー中で攪拌して抽出す
ればよい。

【００２０】本発明の方法によれば、一段階の反応で、
フェノール化合物をそのルチノース配糖体に変換するこ
とができる。従って、精製したルチン分解酵素は、その
ままルチンに加えて反応させることもできるが、適当な
担体に固定してバイオリアクターを構成すれば、連続的
に目的の配糖体を製造することが可能となり、効率を飛
躍的に向上させることができる。

【００２１】本発明によるルチノース配糖体の製造方法
は、ルチン分解酵素が失活しない限り、如何なる条件下
でも実施することができる。しかし、ｐＨ３〜９、温度
８０℃以下で行うことが好ましく、ｐＨ５、温度４０℃
で行うのが最も好ましい。

【００２２】

【実施例】

＜実施例１＞（１）粗酵素液の調製ダッタン蕎麦粉５０ｇに２０ｍＭ酢酸バッファー（ｐＨ
５）を１．５リットル加え、１時間攪拌抽出した後、東
洋濾紙製Ｎｏ．１濾紙で濾過することにより、粗酵素液
１．４１リットルを得た。

【００２３】（２）配糖体の製造ルチン４ｇと、ヒドロキノン４００ｍｇと、上記で得た
粗酵素液２０ｍｌとを混合し、４０℃で２４時間攪拌し
て反応させた。次いで、２０ｍｌの水を加えて１０００
０ｒｐｍで遠心分離し、濾過した。続いて、濾液を活性
炭カラムにかけた後、１０％エタノールで洗浄すること
により、ルチノースを除去した。更に、エタノール１０
０％で溶出させ、減圧留去した後、酢酸エチルを加えて
洗浄してヒドロキノンを除去し、その後下記の条件でＨ
ＰＬＣにかけて、２４．７ｍｇの精製物を得た。

【００２４】カラム；ＡｓａｈｉｐａｋＮＨ₂ Ｐ−
５０４．６＊２５０ｍｍ（昭和電工株式会社製）検出器；ＲＩ検出器、ＵＶ検出器溶離液；アセトニトリル：水＝７５：２５流速；１．０ｍｌ／ｍｉｎ上記で得られた精製物をＨＰＬＣ分析した結果を、図１
および図２に示す。図１はＵＶ検出器による結果であ
り、図２はＲＩ検出器による結果である。

【００２５】また、上記で得た精製物のＵＶ吸収スペク
トルを図３に、またヒドロキノンのＵＶ吸収スペクトル
を図４に示す。更に、上記で得た精製物の¹³Ｃ−ＮＭＲ
分析を行ったところ、図５に示す結果が得られた。

【００２６】これらの結果から、上記の反応によって得
られた生成物は、下記の式で表されるヒドロキノンのル
チノース配糖体（ヒドロキノンルチノシド：以下、ＨＱ
Ｒと称する）であることが分かった。

【００２７】

【化２】

【００２８】実施例２ダッタン蕎麦の代わりにエンジュを用い、それ以外は全
て実施例と同様に行った。その結果、６．５ｍｇの精製
ＨＱＲが得られた。

【００２９】実施例３：ＨＱＲの酸分解実施例１、２で得た精製物（ＨＱＲ）１ｍｇを、２Ｎ塩
酸溶液１．２ｍｌ中に溶解し、ブロックヒータで１００
℃に加熱して、２時間分解反応を行った。その後、エタ
ノールを添加しながら減圧留去した。得られた分解物に
ついて、実施例１で行ったのと同様のＨＰＬＣ分析を行
なった。その結果を、図６（ＵＶ検出器）および図７
（ＲＩ検出器）に示す。

【００３０】この結果も、実施例１、２で得た精製物が
ＨＱＲであることを支持している。実施例４上記で得られた精製ＨＱＲのチロシナーゼ阻害活性を調
べるために、下記の試験溶液を調製した。

【００３１】試験溶液対照溶液０．０５％Ｌ−チロシン溶液１．０ｍｌ１．０ｍｌＨＱＲ溶液（５ｍＭ）１．０ｍｌ５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．８）０．９ｍｌ０．９ｍｌチロシナーゼ溶液（５００ｍＵ／ｍｌ）０．１ｍｌ０．１ｍｌなお、チロシナーゼとしては、マッシュルーム起源のチ
ロシナーゼ（和光純薬株式会社製）を用いた。

【００３２】上記の試験液および対照溶液を２５℃でイ
ンキュベートし、３０分毎に４７０ｎｍでの吸光度を測
定した。その結果を図８に示す。図８の結果から、ＨＱ
Ｒはチロシナーゼの活性を阻害し、チロシンの分解を抑
制することが分かった。

【００３３】実施例５ＩＦ０から分譲を受けたアスペルギルス・ニガー(Asper
gillus niger) を、２％ルチンを含む液体培地中で、３
０℃で８日間の培養を行い、その培養液を回収した。

【００３４】この培養液をそのままルチン分解酵素とし
て用い、実施例１に類似した方法で、ルチンとヒドロキ
ノンとの反応を行った。即ち、ルチン、ヒドロキノンお
よび上記の培養濾液を混合し、３０℃で２日間反応させ
た。遠心分離および吸引濾過により、未反応のルチンお
よび生成したケルセチン等を沈殿として除去した。その
ときの上清を回収し、これに酢酸エチルを加え、未反応
のヒドロキノンを上層として除去した。一方、下層を活
性炭クロマトグラフィーに供試、その３０％１−プロパ
ノールによる溶出画分を回収した。

【００３５】こうして得られた生成物の¹³Ｃ−ＮＭＲス
ペクトルは、図５に示したものと同じであった。このＮ
ＭＲデータから、生成物は実施例１と同じくＨＱＲであ
ることが分かった。また、¹ Ｈ−ＮＭＲスペクトル（デ
ータは省略）から、そのアノマー構造はβであることが
分かった。

【００３６】また、ヒドロキノンの代わりに、ピロガロ
ール、ベラトリルアルコール、没食子酸を用い、上記と
同様の反応および精製を行った。その結果、ヒドロキノ
ン以外のこれらフェノール化合物についても、同様にル
チノース配糖体の生成が認められた。

【００３７】実施例６：ＨＱＲの抗酸化能上記の実施例で得たヒドロキノンルチノシド（ＨＱＲ）
の抗酸化性を調べるために、高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）／電気化学検出器（ＥＣＤ）による還元
性の測定を行った。電気化学検出器は、電極間に一定の
電位を印加して、そこを通る試料による電流の変化を測
定するものである。電極間に印加する電位を正の電位と
すれば、この条件で検出される物質は、還元力、即ち抗
酸化能を有しているということができる。

【００３８】５ｍＭのＨＱＲを高速液体クロマトグラフ
ィー（カラム：ＹＭＣ社製のＹＭＣ−ＰａｃｋＮＨ₂
２５０×４．６ｍｍＩ．Ｄ．、溶離液：４０ｍＭ酢
酸アンモニウム、１７．５ｍＭ酢酸／８０％メタノー
ル、流速：１ｍｌ／ｍｉｎ）に２０μｌ注入し、溶出し
てくる試料を電気化学検出器（資生堂社製アンペロメト
リック式電気化学検出器、印加電圧＋８００ｍＶ）によ
り検出した。

【００３９】比較のために、抗酸化活性を有するとされ
ているアルブチンおよびコウジ酸の同濃度溶液を同様の
方法で測定した。この方法によって測定した各物質の電
流変化値（ピーク高さから算出）は、以下の通りであっ
た。

【００４０】試料電流変化値実施例５ｍＭＨＱＲ１０４０ｎＡ比較例１５ｍＭアルブチン１１５０ｎＡ比較例２５ｍＭコウジ酸３００ｎＡ上記の結果から、ＨＱＲはアルブチンと略同等、コウジ
酸よりも３〜４倍強い還元力を有することが分かり、Ｈ
ＱＲが抗酸化能を有していることが示された。

【００４１】

【発明の効果】以上詳述したように、本発明によれば、
フェノール化合物から、簡便かつ効率的に、そのルチノ
ース配糖体を製造することができる。また、本発明によ
り得られるフェノール化合物のルチノース配糖体は、糖
部分が二糖のルチノースであるため、新規化合物であ
る。また、本発明の方法により得られる配糖体は、チロ
シナーゼ阻害活性、美白効果、メラニン生成抑制、活性
酸素抑制といった有用な薬理作用を有し、かつ副作用や
難溶性といった欠点も少ないものが多い。従って、本発
明は斯かる有用な化合物を提供するものとして、社会に
裨益するところ大なるものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）のＨＰＬ
Ｃ分析（ＵＶ検出器）の結果を示す図である。

【図２】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）のＨＰＬ
Ｃ分析（ＲＩ検出器）の結果を示す図である。

【図３】実施例１で得た精製物（ＨＱＲ）のＵＶ吸収ス
ペクトルを示す図である。

【図４】ヒドロキノンのＵＶ吸収スペクトルを示す図で
ある。

【図５】実施例１で得られた精製物（ＨＱＲ）の¹³ＣＮ
ＭＲスペクトルを示す図である。

【図６】実施例３で得たＨＱＲの分解生成物のＨＰＬＣ
分析（ＵＶ検出器）の結果を示す図である。

【図７】実施例３で得たＨＱＲの分解生成物のＨＰＬＣ
分析（ＲＩ検出器）の結果を示す図である。

【図８】ＨＱＲのチロシナーゼ阻害活性を示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者藤井貴明千葉県松戸市松戸159−１松戸第三住宅１−709 (72)発明者安田俊隆東京都港区港南２丁目13番40号東洋水産株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フェノール化合物の存在下において、ル
チンに対し、ルチン分解酵素を作用させることを特徴と
するフェノール化合物のルチノース配糖体の製造方法。
【請求項２】請求項１の方法で得られたフェノール化
合物のルチノース配糖体。