CN117264002A - 一种高纯度、高含量芦丁的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度、高含量芦丁的制备方法及其应用，涉及药物化学技术领域。所述制备方法，包括以下步骤：S1、冷分离，将芦丁粗品用高浓度甲醇浸泡第一预设时间，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼；S2、热分离，将第一滤饼置入纯化水中加热回流煮沸第二预设时间，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、将第二滤饼加入高浓度甲醇中加热回流煮沸第三预设时间，过滤并收集滤液浓缩得到浓缩液；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，洗涤后干燥得到成品。利用不同的杂质在不同的温度及溶剂倍数时的溶解性的差异，实现对芦丁充分纯化。解决了现有的芦丁的制备方法繁琐，成本高且含量及纯度较低的问题。

Description

一种高纯度、高含量芦丁的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，特别涉及一种高纯度、高含量芦丁的制备方法及其应用。

背景技术

芦丁是一种来源很广的黄酮类化合物，具有降低毛细血管通透性和脆性的作用，保持及恢复毛细血管的正常弹性；临床上用于防治脑溢血、高血压、糖尿病、视网膜出血、紫癜和急性出血性肾炎等；也可用作食品抗氧化剂和色素；对皮肤具有较好的抗辐射、抗自由基作用，对紫外线和X射线具有极强的吸收作用，作为天然防晒剂，添加10wt%的芦丁，紫外线的吸收率高达98 %；具有很明显的清除细胞活性氧自由基的作用。国内外医药行业以芦丁为原料生产芦丁片、曲克芦丁、芦丁镁铬盐、多维葡萄糖羟丁芦丁和槲皮素等药物，扩大了芦丁的应用范围及市场。

芦丁精制方法有以下几种：（1）利用分子大小分离的方法，将芦丁用甲醇溶解后，加入葡聚糖凝胶柱顶，用甲醇洗脱，收集甲醇液，浓缩，结晶。原理是由于大分子不能进入葡聚糖凝胶内部，因而先被洗脱，小分子后被洗脱，从而将分子大小不同的成分得到分离。（2）利用在室温下用醇溶解芦丁，过滤，滤液放置结晶，母液浓缩后再次结晶得到高含量芦丁。该方法将芦丁的二维平面结构转变为三维立体结构，有利于溶剂分子进入，增加溶解性，可除去加热后溶于醇的一些杂质。（3）采用三氯醋酸法脱蛋白及改良的Sevage法脱蛋白来纯化芦丁，该方法操作简单、节省劳力，但是所用试剂毒性较高，而且纯度仅为90％，难以满足当前对高纯度、高含量芦丁的需求。（4）采用高速逆流色谱法精制高纯度芦丁，其特点是采用含水、多元有机溶剂体系，利用高速逆流色谱无不可逆吸附、回收率高和分离效率高的特点，精制得到高含量芦丁。该方法所制备芦丁含量可达98％以上，但是使用多种有机溶剂，对环境有一定影响，同时其制备只有克量级，成本较高，不利于工业化生产。（5）采用树脂进行柱层析精制芦丁，该方法将所得芦丁用去离子水淋洗，在80-90℃条件下干燥10-14h，因为较高温度下长时间干燥尤其有空气或光照存在的情况下易发生部分芦丁的氧化或分解，因此存在一定的缺陷。

现有制备芦丁的方法操作繁琐，成本高，不适合产业化，同时含量及纯度较低。

发明内容

本发明的目的在于：解决了现有的芦丁的制备方法繁琐，成本高，且含量及纯度较低的问题，本发明旨在提供一种高纯度、高含量芦丁（以无水物计）的制备方法。

本发明为了实现上述目的具体采用以下技术方案：

一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用高浓度甲醇浸泡第一预设时间，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼； S2、热分离，将第一滤饼置入纯化水中加热回流煮沸第二预设时间，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、将第二滤饼加入高浓度甲醇中加热回流煮沸第三预设时间，过滤并收集滤液浓缩得到浓缩液；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤后干燥得到成品。

进一步的，所述S1中浸泡芦丁粗品的甲醇的用量为芦丁粗品质量的2~4倍，第一预设时间为6~24小时，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

进一步的，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇对固态物进行搅拌洗涤5~15分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的0.8~1.5倍，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

进一步的，所述S2中所使用的纯化水的用量为芦丁粗品质量的4.5~7.0倍，第二预设时间为20~50分钟。

进一步的，所述S3中所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的4.8~6.8倍，第三预设时间为60~90分钟，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

进一步的，所述S3还包括，取甲醇添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸第三预设时间，降温后过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液。

进一步的，所述S3中降温至55℃以下。

进一步的，所述S3中，将滤液浓缩至体积的0.15~0.30倍。

进一步的，所述S4中洗涤的具体操作为，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明。

本发明还提供一种高纯度、高含量芦丁的制备方法在药物化学上的应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1.本发明所提供的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，在冷分离步骤中常温甲醇对芦丁中的苷元进行充分溶解，由于槲皮素等极性较小的杂质在常温高浓度的甲醇中溶解性较大，因此能够将槲皮素等杂质充分分离，使得成品中芦丁含量提高；而在热分离步骤中采用在纯化水中高温溶解冷却分离，使得在芦丁中的水溶性物质能够充分溶解在滤液中，降低产品的杂质；最后通过高浓度的甲醇（浓度≥95%）加热回流，常温纯化水冷却结晶，进一步除去芦丁中的有机和无机杂质，使得芦丁中的杂质被充分分离，提升了产品的纯度。利用了不同的杂质在不同的温度、溶剂、溶剂倍数及浸泡时间下的溶解性的差异，对芦丁进行充分纯化，得到高纯度、高含量的芦丁产品，得到的芦丁纯度可达到97.0%以上、含量（以无水物计）可达到99.0 %以上。同时制备方法的成本较低。解决了现有的芦丁的制备方法所制备的芦丁产品中芦丁含量较低、制备成本高的问题。

2.发明所提供的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法的应用，芦丁产品的纯度可达到97.0%以上、含量（以无水物计）可达到99.0 %以上，使其所能应用的领域广泛。

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

因此，以下对提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

附图说明

图1为实施例1的检测图谱参考图。

图2为实施例2的检测图谱参考图。

图3为实施例3的检测图谱参考图。

图4为芦丁粗品原料的检测图谱参考图。

图5为常规处理芦丁样品的检测图谱参考图。

具体实施方式

一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用高浓度甲醇浸泡第一预设时间，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼； S2、热分离，将第一滤饼置入纯化水中加热回流煮沸第二预设时间，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、将第二滤饼加入高浓度甲醇中加热回流煮沸第三预设时间，过滤并收集滤液浓缩得到浓缩液；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤后干燥得到成品。

可以理解的是，在冷分离步骤中常温甲醇对芦丁中的苷元进行充分溶解，由于槲皮素等极性较小的杂质在常温高浓度的甲醇中溶解性较大，因此能够将槲皮素等杂质充分分离，使得成品中芦丁含量提高；而在热分离步骤中采用在纯化水中高温溶解冷却分离，使得在芦丁中的水溶性物质能够充分溶解在滤液中，降低产品的杂质；最后通过高浓度的甲醇（浓度≥95%）加热回流，常温纯化水冷却结晶，进一步除去了芦丁中的有机和无机杂质，使得芦丁中的杂质被充分分离，提升了产品的纯度。

利用了不同的杂质在不同的温度、溶剂、溶剂倍数及浸泡时间下的溶解性的差异，对芦丁进行充分纯化，得到高纯度、高含量的芦丁产品，得到的芦丁纯度可达到97.0%以上、含量（以无水物计）可达到99.0 %以上。同时制备方法的成本较低。

具体的，由于芦丁中的苷元需要更长的溶解时间，因此在冷分离中整体的浸泡时间更长，能够使得芦丁中的苷元，如槲皮素等有机杂质被充分溶解，而在热分离步骤中，主要溶解芦丁中的水溶性物质，因此在热分离步骤中浸泡时间更短。利用了不同的杂质在不同的溶剂、不同的浸泡时间下的溶解性的差异，对芦丁进行充分纯化，实现了提供一种高纯度、高含量芦丁产品。

可见，本发明在冷分离和热分离步骤中，控制了三个要素旨在提高产品的含量，一是在不同溶剂温度下杂质的溶解性的不同，二是在不同溶剂倍数下杂质的溶解性的差异，三是在不同浸泡时间杂质的溶解性的不同，从多维度进行调控，能够更全面的将产品的纯度提升，实现多维度联动的纯度提升，进而提高产品含量。

在本发明的某些实施例中，所述S1中浸泡芦丁粗品的甲醇的用量为芦丁粗品质量的2~4倍，第一预设时间为6~24小时，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

在本发明的某些实施例中，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇对固态物进行搅拌洗涤5~15分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的0.8~1.5倍，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

在本发明的某些实施例中，所述S2中所使用的纯化水的用量为芦丁粗品质量的4.5~7.0倍，第二预设时间为20~50分钟。

在本发明的某些实施例中，所述S3中所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的4.8~6.8倍，第三预设时间为60~90分钟，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

在本发明的某些实施例中，所述S3还包括，取甲醇添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸第三预设时间，降温后过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液。

在本发明的某些实施例中，所述S3中所使用的抗氧剂为柠檬酸、2，6-三级丁基-4-甲基苯酚、双硫醚、四季戊四醇酯、维生素C、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠中的任一种；所使用的络合剂为酒石酸、庚糖酸盐、葡萄糖酸钠、海藻酸钠、乙二胺四乙酸中的任一种或是多种的混合物。

可以理解的是，添加抗氧剂和络合剂络合重金属杂质、钙镁离子等杂质，进一步降低产品中的杂质，提升了产品的纯度。使用氧化剂、络合剂配合冷分离和热分离，能够更为充分的提升产品纯度，进而提高产品含量。

在本发明的某些实施例中，所述S3中降温至55℃以下。

在本发明的某些实施例中，所述S3中，将滤液浓缩至体积的0.15~0.30倍。

在本发明的某些实施例中，所述S4中洗涤的具体操作为，使用纯化水对结晶固态物进行洗 涤至洗涤水无色透明。

具体的，所述S4的具体操作为，将浓缩液加入结晶釜中，搅拌下加热至50~60℃，继续保温搅拌1小时，将物料降温至40℃以下，过滤，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明；用烘箱在100~112℃之间干燥结晶固态物得到成品。

本发明还提供一种高纯度、高含量芦丁的制备方法在药物化学上的应用，芦丁产品的纯度高、含量高，芦丁纯度可达到97.0%以上、含量（以无水物计）可达到99.0 %以上，使其所能应用的领域广泛。

实施例1

在本实施例中制备高纯度、高含量芦丁1，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用芦丁粗品质量的3倍的甲醇浸泡10小时，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%）对固态物进行搅拌洗涤10分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的1倍； S2、热分离，将第一滤饼置入芦丁粗品质量的6倍的纯化水中加热回流煮沸30分钟，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、取芦丁粗品质量的6倍的甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%。）添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸80分钟，降温至55℃以下后经过三级过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液，将滤液浓缩至体积的0.2倍；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明，用烘箱在100~112℃之间干燥结晶固态物得到成品芦丁1。

实施例2

在本实施例中制备高纯度、高含量芦丁2，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用芦丁粗品质量的3.5倍的甲醇浸泡12小时，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%）对固态物进行搅拌洗涤8分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的1.2倍； S2、热分离，将第一滤饼置入芦丁粗品质量的4.5倍的纯化水中加热回流煮沸25分钟，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、取芦丁粗品质量的5倍的甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%。）添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸65分钟，降温至55℃以下后经过三级过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液，将滤液浓缩至体积的0.25倍；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明，用烘箱在100~112℃之间干燥结晶固态物得到成品芦丁2。

实施例3

在本实施例中制备高纯度、高含量芦丁3，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用芦丁粗品质量的4倍的甲醇浸泡24小时，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%）对固态物进行搅拌洗涤15分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的1.5倍； S2、热分离，将第一滤饼置入芦丁粗品质量的7倍的纯化水中加热回流煮沸50分钟，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、取芦丁粗品质量的6.8倍的甲醇（所述甲醇的体积浓度大于等于95%。）添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸90分钟，降温至55℃以下后经过三级过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液，将滤液浓缩至体积的0.15倍；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明，用烘箱在100~112℃之间干燥结晶固态物得到成品芦丁3。

试验1 测定芦丁含量

1.试验操作

选取实施例1、实施例2、实施例3的芦丁成品及芦丁粗品原料作为样品，在实验室中，分别对各组的样品进行图谱分析。

分别得到实施例1、实施例2、实施例3、芦丁粗品原料的检测图谱，图谱见图1、图2、图3及图4。

并分别计算其芦丁纯度及芦丁含量（以无水物计）。

2.试验结果

芦丁纯度采用峰面积归一化法计算，含量采用HPLC方法计算，检测方法：

色谱条件：采用C8色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相A：四氢呋喃-磷酸二氢钠溶液（15.6g/L）=5：95，用磷酸调节pH=3.0，流动相B：四氢呋喃-磷酸二氢钠溶液（15.6g/L）=40：60，用磷酸调节pH=3.0；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积10μL。

供试品溶液制备：取本品0.05g，置50ml量瓶中，加甲醇10ml超声使其完全溶解，用流动相B稀释至刻度。

对照品溶液制备：取工作对照品0.05g，置50ml量瓶中，加甲醇10ml超声使其完全溶解，用流动相B稀释至刻度。

测定方法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

含量计算公式：

C供试品%=

A供试品——为供试品的峰面积；

C对照品——对工作对照品的标定含量%；

M对照品——为工作对照品取样量（mg）；

A对照品——为工作对照品的平均峰面积；

M供试品——为供试品取样量（mg）.

3.结果分析

参见图1的图谱，计算得知，实施例1的芦丁成品的纯度为97.15%，含量（以无水物计）为99.25%。

参见图2的图谱，计算得知，实施例2的芦丁成品的纯度为97.98%，含量（以无水物计）为99.39%。

参见图3的图谱，计算得知，实施例3的芦丁成品的纯度为97.98%，含量（以无水物计）为99.43%。

参见图4的芦丁粗品原料的图谱，计算得知，芦丁粗品原料的纯度92.64%，含量（以无水物计）为94.35%。

可见，将本案的实施例1-3与芦丁粗品原料对比，可以看出，实施例1-3的纯度和含量均有明显的提升，各实施例所得成品的纯度均高于97%，含量均高于99.0%，可见本发明的制备方法实现了提供高纯度、高含量的芦丁，具有较强的优越性。

试验2 对比实验

1.试验操作

按常规方法选取与实施例1相同的原料进行处理，得到常规处理组：常规处理的芦丁样品，作为对比例，并对对比例的芦丁样品进行如试验1相同的图谱分析，分析方法在此不赘述。

2.试验结果

得到常规处理芦丁样品的检测图谱，见图5。并计算其芦丁纯度及芦丁含量（以无水物计）。

参见图5，常规处理芦丁样品的图谱，计算得知，常规处理芦丁样品的纯度为95.90%，含量（以无水物计）为97.16%。

3.结果分析

请对比参阅图1和图5，并对比实施例1和常规处理组的数据，可见，使用本发明的制备方的实施例1的芦丁纯度为97.15%，含量（以无水物计）为99.25%。而对比例常规处理芦丁的纯度为95.90%，含量（以无水物计）为97.16%。可见，实施例1的芦丁纯度更高，更为重要的是，实施例1的芦丁含量远远大于对比例的常规处理的芦丁。

综上所述，本发明的实施例1-3相比于芦丁原料，在使用本发明的制备方法后，使得芦丁含量和纯度均大幅提升，特别是对于含量的提升尤为明显。与常规处理方法相比，实施例的芦丁也在含量和纯度上表现出来更好的数据。本发明的制备方法利用了不同的杂质在不同的温度及溶剂倍数时的溶解性的差异，同时配合抗氧剂和络合剂对芦丁进行充分纯化，能够得到高纯度、高含量的芦丁产品。

本发明在冷分离步骤中常温甲醇对芦丁中的苷元进行充分溶解，由于槲皮素等极性较小的杂质在常温高浓度的甲醇中溶解性较大，因此能够将槲皮素等杂质充分分离，使得成品中芦丁含量提高；而在热分离步骤中采用在纯化水中高温溶解冷却分离，使得在芦丁中的水溶性物质能够充分溶解在滤液中，降低产品的杂质；最后通过高浓度的甲醇（浓度≥95%）加热回流，常温纯化水冷却结晶，进一步除去了芦丁中的有机和无机杂质，使得芦丁中的杂质被充分分离，提升了产品的纯度。利用了不同的杂质在不同的温度、溶剂、溶剂倍数及浸泡时间下的溶解性的差异，对芦丁进行充分纯化，得到高纯度、高含量的芦丁产品，得到的芦丁纯度可达到97.0%以上、含量（以无水物计）可达到99.0 %以上。

以上实施例仅为本发明其中的一种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： S1、冷分离，将芦丁粗品用高浓度甲醇浸泡第一预设时间，过滤、收集固态物并对其进行洗涤得到第一滤饼；S2、热分离，将第一滤饼置入纯化水中加热回流煮沸第二预设时间，冷却静置后过滤，收集固态物并对其进行洗涤得到第二滤饼；S3、将第二滤饼加入高浓度甲醇中加热回流煮沸第三预设时间，过滤并收集滤液浓缩得到浓缩液；S4、将浓缩液结晶得到结晶固态物，对其洗涤后干燥得到成品。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S1中浸泡芦丁粗品的甲醇的用量为芦丁粗品质量的2~4倍，第一预设时间为6~24小时，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

3.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S1中的洗涤具体为：使用甲醇对固态物进行搅拌洗涤5~15分钟，所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的0.8~1.5倍，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

4.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S2中所使用的纯化水的用量为芦丁粗品质量的4.5~7.0倍，第二预设时间为20~50分钟。

5.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S3中所使用的甲醇的用量为芦丁粗品质量的4.8~6.8倍，第三预设时间为60~90分钟，所述甲醇的体积浓度大于等于95%。

6.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S3还包括，取甲醇添加抗氧剂和络合剂得到混合溶液，将第二滤饼加入混合溶液，加热回流煮沸第三预设时间，降温后过滤并收集滤液，将滤液浓缩得到浓缩液。

7.根据权利要求6所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S3中降温至55℃以下。

8.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S3中，将滤液浓缩至体积的0.15~0.30倍。

9.根据权利要求1所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法，其特征在于，所述S4中洗涤的具体操作为，使用纯化水对结晶固态物进行洗涤至洗涤水无色透明。

10.如权利要求1至9中任一项所述的一种高纯度、高含量芦丁的制备方法在药物化学上的应用。