CN111909225A - 一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控制技术 - Google Patents

一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控制技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高纯度胡椒酚β‑D‑吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控制技术，是以棒柄花的干燥叶为原料提取胡椒酚β‑D‑吡喃葡萄糖苷，包括乙醇回流提取、过滤浓缩、萃取、上柱、洗脱，再浓缩等工艺步骤，最后得到纯度大于98%的高纯度胡椒酚β‑D‑吡喃葡萄糖苷；本发明工艺设计合理，工艺简单，分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，质量可控，适合工业化生产，具有很好的应用前景。

Description

一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控 制技术
技术领域
本发明涉及化合物制备技术领域，具体是一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控制技术。
背景技术
化学对照品又称标准品，是中药质量标准研究、质量检测和质量控制的实物对照，中药化学对照品的研究，是中药标准化、现代化研究的一个非常重要的部分，对产品的质量评价，特别是在药品生产的质量控制中，中药化学对照品起着极其重大的作用，是中药质量控制的基础与核心。
胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷是一种苯丙素类化学成分，是棒柄花等植物的活性成分之一，存在于大戟科、松科、姜科等多种植物中，可作为许多植物、药材和药品标准质量控制的指标性成分。目前无相应的国家药品标准物质，国内外对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷中药化学对照品的系统研究未见报道，参照中药化学对照品（供含量测定用）的技术要求，对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品进行研究，建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。
胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷是从大戟科植物棒柄花中分离得到的活性物质，从公开文献所知，胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的提取分离过程和含量测定方法，如：
1.【题名】棒柄花的化学成分研究（英文）：干燥植物全株（8 .0 kg）用95 %乙醇10 L室温浸提4次，每2天提取一次。合并提取液，真空浓缩。提取物用水混悬，用乙酸乙酯（5 L×3）、正丁醇（5 L×3）依次萃取。正丁醇部位（60.0 g）经硅胶柱色谱（1 kg, 100～200 目）分离，氯仿-甲醇（30:1-0:1）梯度洗脱，得到15个流份，流份1-3经硅胶柱色谱分离，氯仿-丙酮（10:1-0:1）梯度洗脱得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷（56 mg）。（文献来源：李翠红,周红娇,羊晓东,赵静锋,李良.棒柄花的化学成分研究(英文)[J].天然产物研究与开发,2004(06):514-515.）。
2.【题名】Anti-inflammatory Ellagitannins from Cleidion brevipetiolatumfor the Treatment of Rheumatoid Arthritis：棒柄花干燥枝叶（15 kg）用60 L乙醇于70°C提取3次，每次2 h，得到粗提物（940 g）。粗提物混悬于4 L水中，然后依次用等体积的正己烷、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取分比萃取3次。乙酸乙酯萃取物经柱色谱（ODS, 50 μm），甲醇-水系统梯度洗脱（20%→40→60%→80%→100%），得到5个流份（A-E）。流份B （21.4 g）经半制备液相色谱纯化，40%甲醇-水系统洗脱，得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷（9.0 mg，tR32.2min）。（文献来源：Min Zhao, Xue Yuan, Ying-He Pei, et al. Anti-inflammatoryEllagitannins from Cleidion brevipetiolatum forthe Treatment of RheumatoidArthritis.J. Nat. Prod.，2019，doi:10.1021/acs.jnatprod.8b00984.）。
3.【题名】Isolation and structural elucidation of some glycosides fromthe rhizomes of smaller galanga （Alpinia officinarum Hance）：新鲜高良姜根茎（4.0 kg）粉碎均匀，加入甲醇，用热甲醇连续提取3次，每次3 h。回收溶剂，甲醇提取物（260g）经大孔吸附树脂（安伯来特XAD-2）柱（20 × 6.0 cm）分离。色谱柱用3 L蒸馏水冲洗，除去糖、酸及其他水溶性成分。然后用3 L甲醇洗脱。甲醇洗脱液真空浓缩干燥。洗脱物（40 g）溶解混悬于250 mL水中，氯仿萃取3次，每次400 mL。水层冻干得到糖苷结合流份（30g）。该流份经反相硅胶（ODS-A 120-S 150，YMC有限公司，东京，日本））柱色谱（18 × 4.0 cm）分离，甲醇-水梯度洗脱（10, 20, 30, 40, 50, 100%; 每个梯度 900 mL）。流份经薄层色谱（TLC）检识，硅胶G 60 薄层板，0.25 mm 厚度（默克, 达姆施塔特, 德国），氯仿/甲醇/水（65:25:4, v/v）展开，喷以香草醛浓硫酸加热显色。2个主要流份，20%甲醇洗脱物（1.16 g）和30%甲醇洗脱物（2.17 g），经硅胶（BW-820MH, 70-200 目，富士硅化学株式会社，春日井，日本）柱色谱（18 × 3.4 cm）进一步分离，氯仿-甲醇系统梯度洗脱（甲醇浓度逐渐增加）。流份经同样的薄层色谱检识方式合并得到5个流份（I-V）。流份I（320 mg）从20% 甲醇洗脱物经氯仿-甲醇（90:10, v/v）洗脱得到，流份II-V从30% 甲醇洗脱得到: II （90.3 mg）氯仿-甲醇（95:5, v/v）洗脱， III （73.5 mg）氯仿-甲醇（90:10, v/v）洗脱，IV（69 mg）和V（195 mg）氯仿-甲醇（80:20, v/v）洗脱。流份I-V经高效液相色谱（HPLC）进一步纯化，色谱柱（250× 10 mm 水相 C18柱，YMC有限公司，东京，日本），流份I乙腈/水（15:85, v/v）洗脱，流份II-V乙腈/水（21:79, v/v）流份5.0mL/min，检测波长205 nm，得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷（33.0 mg）。
（文献来源：Ly T. N.，Yamauchi R.，Shimoyamada M.，et al. Isolation andstructural elucidation of some glycosides from the rhizomes of smallergalanga （Alpinia officinarum Hance）. J. Agric.Food Chem. 2002, 50（17）：4919-4924.）。
4.【题名】Chavicol β-D-glucoside, aphenylpropanoid heteroside, benzyl-β-D-glucoside and glycosidically bound volatiles from subspecies ofCedronella canariensis：新鲜地上部分（1200 g ssp.anisata/2000 g ssp.canariensis）粉碎，用液氮冻干后（干重：312/518 g），用2 L甲醇室温提取3次，提取液减压浓缩得到提取物（18.4/31.5 g），混悬于100 ml水中。悬浮液于4℃放置10 h，离心（5 min,4000 rpm）除去叶绿素。上清液用汽油萃取6次，直到有机相中非挥发性物质能通过气相（GC）检测。红棕色水相减压浓缩，经中性氧化铝柱（默克 1077, 50 ×2.5 cm）分离，2 L水洗脱。80-400 ml的洗脱物通过紫外和薄层色谱（TLC）检识（检测: UV，显色剂：茴香醛浓硫酸）。蒸干后残渣（5.3/9.7 g）通过中压柱色谱（MPLC）分离（步琪, 弗拉维尔，瑞士；26×2.6cm），色谱柱RP 18 （Europrep 60-30 C18, 60A 20-45μ, Besta Technik），流动相2 L水-1L甲醇，流速5 ml•min-1。葡萄糖苷通过紫外（235 nm, 检测器：LKB Bromma 2151, 可变波长检测）和薄层色谱检测在2200-2420 mL被洗脱出。该流份冻干得到淡黄色粉末（0.8/1.6g）。它的水解产物（见下文）。剩下的流份经硅胶柱色谱（30 × 2 cm）分离，50 ml 水-饱和层的乙酸乙酯、水-饱和层的乙酸乙酯（l、2和3% MeOH，50 ml每次， 2ml•min-1）作为洗脱剂等度梯度洗脱。胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷在110-140 ml被洗脱出，最后经高效制备液相色谱纯化得到。
（文献来源：Coen M.，Engel R.，Nahrstedt A. Chavicol β-D-glucoside,aphenylpropanoid heteroside, benzyl-β-D-glucoside and glycosidically boundvolatiles from subspecies of Cedronella canariensis. Phytochemistry 1995, 40（1）：149-155.）。
5.【题名】The revised structure of furcation, acomponent of leaves ofViburnum furcatum Blume：合轴荚蒾新鲜叶子（480 g），用甲醇提取（4L×2），提取液真空干燥得到提取物（75 g）。提取物溶解于水中，分别用乙醚和乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物（8 g）经硅胶柱色谱分离，甲醇-氯仿（1:9，v/v）洗脱，水饱和乙酸乙酯重结晶得到p-allyphenyl glycoside。100 mg p-allyphenyl glycoside溶解于3 ml水中，加入1 g酸性离子交换树脂（安伯来特IR-120），混合物65 ℃搅拌1 h。过滤后，过滤后蒸干溶剂干燥，残渣（84 mg）经硅胶柱色谱分离，甲醇-氯仿（1:9，v/v）洗脱，在水中重结晶得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷（31 mg）。
（文献来源：Hase T.，Iwagawa T. The revised structure of furcation,acomponent of leaves of Viburnum furcatum Blume. Bull. Chem.Soc. Jpn. 1982,55（1）：3663-3664.）。
6.【题名】Glycosides from Pinus contortaneedles：低极性流份萃取物（5 g），Pinus contorta needles水溶物A、B和C合并，经硅胶（150 g）柱色谱分离，氯仿-甲醇-水（9:1:0.1）洗脱得到Ⅰ油状物（1 g）、Ⅱ 3.3 g、Ⅲ 0.7 g。流份Ⅱ、Ⅲ经凝胶柱色谱分离，水洗脱。流份Ⅱ得到4个子流份（160 mg、260 mg、215 mg、360 mg）。每个子流份经凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，PLC纯化，氯仿-甲醇-水（8:2:0.1）洗脱，得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷（102 mg）
（文献来源：Higuchi R.,Donnelly D. M. X. Glycosides from Pinuscontortaneedles. Phytochemistry，1977, 16（10）：1587-1590.）。
上述方法从不同角度论述了胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的提取分离方法。该方法分离纯度虽较高，但纯度大多数未达到中药化学对照品的要求，即纯度大于98%，且数量少，无法满足高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的需要；胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的测定，及对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的质量控制与评价的研究，未见相关报道。
今后生产的各种产品，无论是在国内或是进入国际市场，都需要靠高水平的质量标准和高水平的分析测试技术来获得发展和提高，否则将失去市场，产品的质量标准和检测方法变得愈来愈重要，“安全、有效和质量可控”的用药标准已成为国际共识，药品生产应围绕着这一中心展开，其核心为质量标准控制水平，而化学对照品则起关键的作用。但目前大部分中药药材及其制剂，因化学成分不明或无化学对照品，无法阐明其作用的化学物质基础，也无法进行质量控制，而不能被现代文明社会所接受，也成为中草药和天然药物难以进入国际药品市场的制约关键，技术壁垒给发展中药产业带来了困难，因此，进行中草药化学成分的研究及质量标准规范化研究是中药现代化发展的必经之路，对阐明中草药作用的物质基础以及中草药制剂的生产加工工艺的制定、伪劣产品的鉴别等等具有重要的意义。毫无疑问，对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷进行质量标准研究，建立规范化的分析测试方法，制定高技术水平的控制胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷质量的检测指标和分析方法，使之科学化、规范化，增强国际竞争力，为中药进入国际市场创造条件，具有重大的实际意义和学术价值。
胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷作为植物、药材及其产品的化学对照品，是质量控制的技术关键，众多企业、科研和检验部门都需要高纯度的对照品，其市场需求很大，由于胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷在药材中的含量低，提取分离技术要求很高、难度很大。本发明进行胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷中药化学标准品制备及其质量控制技术研究，解决高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的问题，对中药现代化的作用是显而易见的，具有重大的实际意义和学术价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法及其质量控制技术，解决高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的问题。本发明通过对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品进行研究，建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。
本发明通过以下技术方案实现：
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1～1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；A～B分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为90:10～85:15；所述A为60～120，B为90～200；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
本发明的工艺流程如图1所示。
具体地，所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的5～15倍，乙醇浓度为50～75%，回流提取次数为3～5次，每次1～3 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8～10cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。见图2。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10 mL/min，检测波长为203～272nm，柱温为25～35 ℃；所述的流动相乙腈-水配比为20: 80～30:70。
具体地，步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5μm；流速0.8～1.1 ml/min；进样量：10～20μl；面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的其中之一：
条件（1）：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为15:85～25:75，检测波长203～272nm；
条件（2）：流动相为甲醇-水溶液，两者体积配比为35:65～40:60，检测波长203～272nm；
条件（3）：流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液，两者体积配比为35:65～40:60，检测波长203～272nm。
优选地，条件（1）为：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为20:80，检测波长220nm；
优选地，条件（2）为：流动相为甲醇-水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长220 nm；
优选地，条件（3）为：流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长272 nm。
本发明的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷是从大戟科植物棒柄花的干燥叶中经提取、分离、精制、纯化而制得。棒柄花，中文学名：长棒柄花，拉丁学名：Cleidion brevipetiolatumpax et Hoffm.，产于广东、海南、广西、贵州西南部、云南东南部和南部。其化学名、分子式、结构式如下：
中文名：胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷；化学名：4-（2-丙烯基）苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷[4-（2-propenyl）phenyl-β-D-glucopyranoside]；英文名：chavicol β-D-glucopyranoside；分子式：C15H20O6；结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
本发明采用上述的方法制备得到的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，可达到纯度大于98%。
本发明对于产品胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的质量控制技术如下：
一、含量与纯度测定：
精密称取于105 ℃干燥至恒重的对照品适量，加甲醇溶液制成每1 ml含1 mg的溶液，在测定条件下，进样10μL（约相当于10μg），注入液相色谱仪，用优选的3个流动相溶剂系统分别记录色谱图至主成分的出峰保留时间的2.5倍以上，用面积归一化法和主成分自身对照发计算含量，结果系统测定对照品含量均在98%以上。杂质检查，分别在不同系统记录的色谱图中，除溶剂峰外，杂质峰面积总和结果均小于2.0%。结果见表1。采用自身对照法测得胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷候选化学对照品色谱纯度为99.70（n=3），杂质总含量均在2.0 %以下。
表1 HPLC（系统①、系统②、系统③）归一化法定量分析结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
二、峰纯度检测：
取对照品适量，按流动相系统，在高效液相色谱仪上，用二极管阵列DAD检测器进行峰纯度检查，胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的HPLC色谱峰>98%，其色谱图为单一峰，三维图谱以及5点光谱图完全重合，表明为单一纯物质峰。结果见图3、图4、图5。
本发明对HPLC色谱分析方法学考察如下：
色谱条件：采用Kromasil 100-5-C18色谱柱，乙腈-水（20:80）为流动相，检测波长220nm，进样量10 μl；流量1 mL/min。
一、线性关系考察
取胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷候选化学对照品，于105 ℃干燥至恒重，取约10mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1009.50 μg/mL的对照品储备液。分别吸取对照品储备液0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.2 ml、1.4 ml置10ml容量瓶中，加甲醇稀释至，摇匀，按上述色谱条件注入液相色谱仪，测定峰面积，并以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得到回归方程为Y=22.9994X+109.6514，R=0.9995。胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷候选化学对照品在进样量为0.40～1.41μg范围内具有较好的线性关系。
二、重现性、稳定性与精密度考察
取同一供试品6份，分别按上述方法及色谱系统测定，记录胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷色谱图及峰面积积分值，计算含量，结果平均含量99.70%，RSD为0.91%，说明该方法重现性良好。
取同一供试品溶液，在室温下放置2、4、6、8、10、12 h，依法进样测定，记录胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷色谱图及峰面积积分值，结果显示RSD=1.24%，表明供试品溶液在12 h内稳定性较好。
取同一供试品溶液，连续进样6次，记录胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷色谱图及峰面积，结果RSD=0.81%，说明仪器精密度良好。
三、方法的耐用性考察
采用了3根不同厂家和品牌的色谱柱，分别进行保留时间、理论板数、分离度和杂质分离效果测定，在上述分析条件下，胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷峰与其他杂质峰达到基线分离，分离度大于1.5，按胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷峰计算理论板数不低于4000时，可满足测定要求，见表2。
表2 保留时间、理论板数及分离度
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本发明的有益效果：
1、本发明生产所获得化合物经光谱分析确认为胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。本发明先将大戟科植物棒柄花的干燥叶粉碎，用乙醇溶液回流提取，合并提取液，浓缩，浸膏用水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇进行系统梯度洗脱，用薄层色谱法（TLC）检测，收集含有胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的洗脱液，合并后减压浓缩，得到胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；再用高效制备液相色谱（PHPLC）法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用高效液相色谱（HPLC）检测，分别得到纯度在90%～98%之间的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分。本发明方法提取分离工艺合理，操作过程明晰，得到产品纯度高。
2、本发明通过对胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品进行研究，建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的批量提取工艺、纯度与含量以及杂质检查的分析测定方法，从而建立胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的技术标准，为其作为中药化学对照品以及药材和制剂的质量标准研究提供科学基础和保证。本发明研究结果可为胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品提供更完整的基础化学依据，掌握其化学信息和分析测试技术，有利于相关产品的进一步开发利用，而且对于开发我国特有产物，开发具有高技术、高附加值的产品，提高市场竞争能力，具有潜在而不可估量的社会效益与经济效益。
3、本发明工艺设计合理，操作简单，利用醇水溶剂提取，经过一次硅胶柱色谱后即可得到纯度较高的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，最后经高效制备液相色谱法制备出纯度达到98%以上的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品，方法简便易行；分离速度快，生产周期短，所得产品纯度高，质量可控，适合工业化生产，具有很好的应用前景。
4、本发明采用薄层色谱和高效液相色谱进行纯度检查，含量测定及质量控制，确保产品的质量。
5、本发明从棒柄花叶中制备出纯度符合化学对照品要求、含量在98%以上的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，解决了胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品的供应问题，为棒柄花及其他含有胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷成分的药品的质量控制提供了提供科学基础和保证。
附图说明
图1是高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备工艺流程图；
图2是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷三种展开系统薄层色谱图；3种展开剂系统分别为：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
图3是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷高效液相色谱图；
图4是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷高效液相色谱3维光谱图；
图5是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷5点光谱图；
图6是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷红外光谱图；
图7是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷紫外吸收光谱图；
图8是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷核磁共振氢谱图；
图9是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷核磁共振碳谱图；
图10是胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷质谱图。
具体实施方式
为了使本发明的技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应该理解的是，本发明的实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。除非另有说明，本发明中的甲醇量的百分数是体积百分数，v/v 表示溶液的体积比。
实施例1
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶5kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.2倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～60分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；60～160分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为90:10；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，得到纯度95%之间以及大于99.6%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的5倍，乙醇浓度为70%，回流提取次数为3次，每次1.0 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8 cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为8 mL/min，检测波长为220 nm，柱温为25℃。所述的流动相乙腈-水配比为20: 80。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速1ml/min；进样量：10μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为20:80，检测波长220 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例2
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶3kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.3倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～90分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；90～200分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为85:15；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，得到纯度96%之间以及大于98.5%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的10倍，乙醇浓度为60%，回流提取次数为4次，每次2 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：10cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为7 mL/min，检测波长为203 nm，柱温为30 ℃。所述的流动相乙腈-水配比为22: 78。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速1ml/min；进样量：10μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为15:85，检测波长220 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例3
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶5kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～80分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；80～180分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为88:12；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，最终得到纯度97%之间以及大于99.8%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的15倍，乙醇浓度为50%，回流提取次数为5次，每次3 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8 cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为5mL/min，检测波长为272 nm，柱温为25 ℃。所述的流动相乙腈-水配比为25:75。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5μm；流速0.8 ml/min；进样量：10μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为25:75，检测波长203 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例4
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶6kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.3倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～80分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；80～180分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为86:14；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，得到纯度94%之间以及大于98.2%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的12倍，乙醇浓度为55%，回流提取次数为4次，每次2.5h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8 cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为10 mL/min，检测波长为222 nm，柱温为30 ℃。所述的流动相乙腈-水配比为20: 80。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5μm；流速0.9 ml/min；进样量：20μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为甲醇-水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长220 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例5
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶5kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.2倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～90分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；90～200分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为87:13；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，最终得到纯度95%之间以及大于98.2%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的10倍，乙醇浓度为50%，回流提取次数为3次，每次3 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8 cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为5mL/min，检测波长为272nm，柱温为35 ℃。所述的流动相乙腈-水配比为30:70。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5 μm；流速1ml/min；进样量：10 μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长272 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
实施例6
一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶2kg，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1.3倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～70分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；70～170分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为85:15；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，最终得到纯度96%之间以及大于99.1%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的8倍，乙醇浓度为65%，回流提取次数为3次，每次2 h。
步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：9cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为5mL/min，检测波长为222 nm，柱温为30℃。所述的流动相乙腈-水配比为22: 78。
步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5μm；流速1.1ml/min；进样量：15μl；面积归一化法定量；系统条件：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为16:84，检测波长203 nm；面积归一化法定量，主成分（胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷）峰不得少于 98.0%，如有杂质峰，除溶剂峰外，各杂质峰面积总和不得超过2.0%。
对实施例1-6制备得到的产品进行结构确证如下：
理化常数：胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷为白色粉末，熔点260~262 ℃，易溶于甲醇、氯仿。
波谱数据鉴定：
1、红外吸收光谱（IR）
仪器：Bruker TENSOR 27FTIR，仪器校正和检定，聚苯乙烯薄膜的IR谱，符合中国药典2015年版的规定；
样品制备方法：取样品适量，溴化钾压片；
红外光谱数据如下表3所示，测得的红外吸收光谱图见图6。
表3 胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷红外光谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE008
解析：
3385 cm-1：（-OH）；2894cm-1：（-CH2-）；1639、1612、1511 cm-1：（苯环）；1238、1073 cm-1：（C-O）；913cm-1：（C=C-H）；827（苯环对位取代）。
2、紫外吸收光谱（UV）
仪器：日本岛津UV-2550型紫外光谱仪；
仪器校正和检定，符合中国药典2015年版的规定。
溶剂：分析纯甲醇；
供试液：取样品适量，加甲醇配制成每1 mL含50 μg的溶液；
紫外光谱数据如下表4所示，本品的紫外吸收光谱图见图7。
表4 胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷UV数据
溶剂 最大吸收峰（nm）
甲醇 272、222
解析：
紫外光谱在272、222 nm处有三个最大吸收峰，为双键与苯环共轭的π→π*跃迁所产生的峰。从紫外光谱图得知，结构中含有不饱和共轭体系。
3、核磁共振谱
（1）1H-NMR 核磁共振谱
仪器：德国BRUKER Dre-500；
溶剂：CD3OD，内标TMS；
核磁共振谱数据如下表5所示，测得的1H-NMR 核磁共振波谱图见图8。
表5 1H-NMR 核磁共振谱数据表
Figure DEST_PATH_IMAGE010
（2）13C-NMR 核磁共振谱
仪器：德国 BRUKER 125 MHz；
溶剂：CD3OD，内标TMS；
核磁共振谱数据如下表6所示，测得的13C-NMR核磁共振波谱图见图9。
表6 13C-NMR 核磁共振谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE012
4、质谱（MS）
仪器：Thermo QE FOCUS 液质联用色谱仪；
测试条件：流动相乙腈-0.1%甲酸水溶液，10:90；电离方式HESI源；正离子模式；电离能量（N）CE 60 eV；Full-MS分辨率70000，dd-MS2分辨率17500。本品的质谱图见图10。
质谱数据如下表7所示，测得的质谱图见图10。
表7 ESI/MS质谱数据
Figure DEST_PATH_IMAGE014
测定结果：测定样品准分子离子峰m/z 319.11395[M+Na]+，615.23901[2M+Na]+，测得其MS质量数为296，与胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的化合物分子式为C15H20O6相符。
主要裂解途径：分子离子m/z 319.11395[M+Na]+，碎片离子有m/z 157.08313为[M+Na-162]+，为失去1分子葡萄糖基C6H10O5 -的碎片离子，即C9H10O1，与胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷结构相符。
综合各MS数据分析，分子量为296，分子式C15H20O6，计算不饱和度为：Ω=（2×15+2-20）/2=6，符合胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷结构。
结论：本发明分离、纯化的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品，经质谱测得HR-ESI/MS准分子离子峰为319.11395[M+Na]+，测得分子量为296，结构单元中含有C=C、OH、CH2-、C-O、苯环。IR、UV、NMR、MS均证明此点，质谱特征碎片离子也证明其化学结构。
综合上各光谱数据，各理化常数和光谱数据与胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化合物结构相符，并与文献值基本一致，鉴定为胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
结果：本发明分离、纯化的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷化学对照品，经红外光谱、紫外光谱、核磁共振、质谱以及理化检测确认化学结构。经3个展开系统5个不同浓度的TLC检测；3个流动相系统和3个不同波长的HPLC检测，结果符合中药含量测定用化学对照品的要求，含量大于98%。

Claims (9)

1.一种高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）取棒柄花的干燥叶，粉碎，用乙醇回流提取，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；
2）浸膏用1～1.5倍体积的蒸馏水混悬后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，静置，合并正丁醇层，浓缩得正丁醇萃取物；
3）正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集含胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的流分；所述的氯仿-甲醇系统梯度洗脱条件为：0～A分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为95:5；A～B分钟，洗脱系统为氯仿-甲醇，比例为90:10～85:15；所述A为60～120，B为90～200；
4）流分用薄层色谱法检测后合并，浓缩，即得纯度为重量含量80～90％的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶；
5）将胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷粗结晶用高效制备液相色谱法分离纯化，收集胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷组分；
6）对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90%-98%之间和纯度大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷，减压浓缩，得到纯度90%-98%之间以及大于98%的胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中乙醇的加入量为药材重量的5～15倍，乙醇浓度为50～75%，回流提取次数为3～5次，每次1～3 h。
3.根据权利要求1所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：步骤4）所述的薄层色谱法参数如下：
薄层板：硅胶G；
3种展开剂系统：系统（1）：醋酸乙酯-甲醇体积比为16:1，系统（2）：氯仿-甲醇体积比为5:1，系统（3）：氯仿-丙酮体积比为1：2；
点样：用甲醇制成1 mg/mL的溶液，在同一硅胶G板上，按不同的点样量梯度点样，点样量分别为20 μg、40 μg、60 μg、80 μg、100 μg；置展开缸分别展开，展距：8～10cm；
定位：喷以10%乙醇磷钼酸溶液，晾干，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视；结果在薄层色谱中，可见蓝灰色的单一斑点，3种展开剂系统，5个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点。
4.根据权利要求1所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：步骤5）所述的高效制备液相色谱的色谱柱为C-18柱，乙腈-水为流动相洗脱，流速为5～10mL/min，检测波长为203～272 nm，柱温为25～35 ℃。
5.根据权利要求4所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述的流动相乙腈-水配比为20: 80～30:70。
6.根据权利要求1所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：步骤6）所述的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C-18，4.6×250 mm，5μm；流速0.8～1.1 ml/min；进样量：10～20μl；面积归一化法定量；系统条件为以下三个条件的其中之一：
条件（1）：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为15:85～25:75，检测波长203～272nm；
条件（2）：流动相为甲醇-水溶液，两者体积配比为35:65～40:60，检测波长203～272nm；
条件（3）：流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液，两者体积配比为35:65～40:60，检测波长203～272nm。
7.根据权利要求6所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述条件（1）为：流动相为乙腈-水溶液，两者体积配比为20:80，检测波长220 nm。
8.根据权利要求6所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述条件（2）为：流动相为甲醇-水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长220 nm。
9.根据权利要求6所述的高纯度胡椒酚β-D-吡喃葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：所述条件（3）为：流动相为甲醇-0.1%醋酸水溶液，两者体积配比为37:63，检测波长272 nm。
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