CN101723952A - 抗癌活性山酮及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类抗癌活性山酮、其制备方法以及含有该类化合物或其可药用盐的药物组合物。本发明还涉及山酮类化合物在诱导肿瘤细胞凋亡、抗新生血管形成以及抗肿瘤转移等方面的用途。

Description

抗癌活性山酮及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及从真菌中分离得到的新的山酮类化合物及药学上可接受的所述化合物的药物组合物。本发明还涉及山酮类化合物用于制备具有诱导肿瘤细胞凋亡、抗新生血管形成以及肿瘤转移的抗肿瘤药物的用途。

背景技术

据世界卫生组织(WHO)的统计资料表明：目前全世界每年约有1000万人发生肿瘤，700万人死于该类疾病，而且全球癌症状况将日益严重。今后20年新患者人数将每年增加到1500万，因癌症而死亡的人数也将增至1000万。所以恶性肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的重大疾病。在中国，恶性肿瘤死亡率均位居全部死亡疾病之首。因此，肿瘤的的药物研发成为目前国际新药研究的热点之一。迄今为止用于肿瘤治疗的药物已经取得了巨大的成就，获得了一大批具有不同作用机制的临床抗肿瘤药物。但目前临床上在防治肿瘤方面仍然面临严峻的考验：一，抗肿瘤药物的毒副作用较大，使病人的长期用药受到限制；二，在肿瘤药物治疗的临床上出现严重的耐药性以及肿瘤的转移等问题成为肿瘤治疗的重要的需要解决的问题。因此，寻找新的高效而毒副作用药物成为抗肿瘤药物的研究目标。

大量的机理研究已经证明，正常的细胞转变为恶性增殖的肿瘤细胞的原因是由于细胞内的各种基本过程调节失控。这些过程包括：细胞周期的调控、信号传递通路的阻断、细胞凋亡、端粒的稳定性、血管生成以及胞外基质的相互作用等。

细胞凋亡(Apoptosis)是在基因调控下发生的细胞自杀行为。而肿瘤细胞的特性就是通过逃避机体的正常的凋亡，而达到永生(Thompson CB，Science，1997：1456～1461)。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式，从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。已有越来越多的证据表明apoptosis与肿瘤的发生、发展、治疗及预后密切相关(Weinberg RA，Scienfic American，1996：32～40)。根据细胞凋亡的分子调控机制，选择性地诱导肿瘤细胞凋亡，克服抗药性，这方面工作已取得了不少进展(Saini KS，Walker NI.Molecular and CellularBiochemistry，1998：9～25)，细胞凋亡成为抗肿瘤药物研究的有效的药物靶点(李鹏飞，中国药理学通报，1996，12(1)：11～14)。多种抗肿瘤药物主要通过诱导细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用，其效能与其诱导apoptosis的能力密切相关。诱导凋亡的化疗药物的种类不断扩大，诱导凋亡在肿瘤化疗中的作用得到越来越多的事实证实。现在用于临床通过凋亡化疗的药物包括放线菌素D，顺铂、博来霉素、长春碱、维甲酸等，这些化疗药物在各种肿瘤细胞中引起癌细胞的凋亡从而抑制癌细胞的恶性增殖。目前，包括国际各大的制药和生物公司在开发凋亡诱导剂类抗癌药物。

细胞凋亡是一个由启动子、各种效应因子和抑制因子参与的复杂的蛋白酶级联反应过程。传统上将细胞凋亡蛋白酶级联过程分成信号引发，调控执行，及结构改变三个阶段。凋亡蛋白酶是一类半胱氨酸蛋白质酶(Caspase)，具有特异性水解底物分子天冬氨酸(Asp)残基C端肽键功能，是近年随着调亡研究的深入而发现的重要凋亡分子(Hannun YA，Blood，1997：1845～1853)。大量事实证明，哺乳动物中最主要的凋亡效应因子是Caspase。Caspase是细胞凋亡过程的主要启动和执行者。迄今已有13个分子得到命名，分别为凋亡蛋白质酶1-13。其中凋亡蛋白质-3是被认为在多种组织、细胞类型中最常涉及的凋亡效应分子。通过激活Caspase诱导肿瘤细胞的凋亡已经成为肿瘤治疗药物研发的一个有效方向。许多化疗药物(如表鬼臼毒素吡喃葡糖苷)都是通过活化半胱氨酸蛋白质酶(Caspase)相关蛋白酶而引发最终的凋亡执行阶段(Fisher DE.Cell，1994：529～542)。

上世纪70年代初期，美国哈佛大学医学院JudahFolkman教授提出了著名提出了著名的肿瘤生长的新生血管假说，该假说提出肿瘤细胞的生存和生长只有在生长早期从新生血管中获得供生长的氧气和养分才能得到维持(Folkman J，N.Engl.J.Med.，1971，285(21)：1182-1186)。通过阻断肿瘤新生血管生成切断肿瘤营养供给，达到抑制和治疗肿瘤的目的。随着近年来发现的具有阻断肿瘤新生血管功能的抗癌物质不断体现出低毒性和不产生耐药性等诸多优点，该理论于2003年被美国《科学》杂志列入年度十大科技突破。该理论经过30多年的发展得到充分的证实和发展，并进一步提出肿瘤的发生、发展以及肿瘤的转移都依赖于新生血管的生成(Gasparini G，Oncol，Rep.，1994，1(1)：7-12).因此，抑制新生血管的形成成为抗肿瘤的一个有效手段之一，抗新生血管药物的研发成为热点。

截至目前，国外新药研发单位已筛选出大量的血管生成抑制化合物，有的已经研发成新药并成功上市，如美国阿斯利康公司(Astra Zeneca)2003年5月初次上市吉非替尼(Gefitinib，易瑞沙，Iressa)，用于治疗非小细胞肺癌，目前已在36个国家获准上市，2004年全球销售收入2.95亿美元。2004年11月8日，FDA批准了埃罗替尼Erlotinib(Tarceva它赛瓦)上市，用于治疗局部晚期或转移性非小细胞肺癌。目前还有有40多种化合物处于I、II、III期临床试验阶段，如BritishBiotech公司的Marimastat(III期临床)，治疗胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌；Agouron公司的AG3340(III期临床)治疗非小细胞肺癌、前列腺癌；Bay12-9566(III期临床)治疗肺癌、胰管癌；Aeterna公司的Neovastat(III期临床)治疗非小细胞肺癌；瑞士诺瓦提斯公司的PTK787(III期临床)治疗直肠癌；Sugen公司的SU-5416/(III期临床)治疗肉瘤等。所以抗新生血管生成药物收到国际各大制药公司的重视。

发明内容

经过大量研究，发明人发现下图所示化合物对肿瘤细胞增殖表现出很好的抑制活性，因此完成本发明。

具体地，本发明涉及：

1)上图中化合物II或V及其可药用盐或溶剂化物。

2)一种制备项1)化合物I-V中任一化合物的方法，包括：培养产生所述化合物的微生物，之后对发酵液进行分离和纯化。

3)根据项2)所述的方法，其中的微生物为曲霉(Aspergillus sp.)CGMCCNo.2037。

4)一种药物组合物，含有项1任一化合物作为活性成份和可药用载体。

5)项1)中任一化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

6)项1)中任一化合物在制备诱导肿瘤细胞凋亡、抗新生血管形成或抗肿瘤转移的抗肿瘤药物中的用途。

本发明涉及的具有上述用途的化合物不仅是化合物本身，适当时也可以是其药学上可接受的盐(酸或碱加成盐)或其溶剂化物(例如水合物、醇合物等)，下文中为简便起见，都简称为本发明的化合物。

上述化合物和盐可以形成溶剂化物，例如水合物、醇合物等。还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。

本发明还提供了制备上述化合物的方法，该方法包括：

1.提供能够通过发酵产生项1)化合物的微生物，优选真菌，特别优选曲霉(Aspergillus sp.)F02Z-1593。该菌种F02Z-1593已于2007年5月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.2037。

菌株来源：产生菌株F02Z-1593是从我国厦门戴云山自然保护区土壤样品中分离得到。

菌种鉴定：在PDA平板上，26℃，10-14天：菌落直径45-55mm，质地丝绒状至絮状，疏松或致密。菌落中央隆起，颜色呈浅棕色，较疏松，分生孢子结构大量。其他部分，较平坦，呈白色至灰绿色，较致密。边缘菌丝呈灰绿色，疏松。中央有渗出液，无色或浅棕色。菌落反面中央呈棕色，边缘也呈棕色、呈环形，其余部分呈浅灰绿色。

分生孢子梗生自基质或气生菌丝，带浅棕色，壁较厚，光滑；分生孢子头球形，全部表面可育；产孢结构双层；分生孢子稍大，球形，壁较粗糙。

根据以上培养特征可以确定该菌种F02Z-1593为曲霉Aspergillus sp.。

2.选择性地在种子培养基上培养微生物。

3.提供一种发酵培养基，该培养基为本领域常用培养基，优选含有下列成份：葡萄糖，酵母粉，NaCl，CaCO₃。

4.将微生物在发酵培养基中进行发酵。

5.选择性地对所得发酵液进行分离和纯化。

本发明的一个实施方案中，优选在pH约为7的条件下发酵。本发明另一实施方案中，分离包括离心发酵液，收集菌体，用溶剂提取菌体再除去溶剂，纯化包括硅胶柱层析和选择性的HPLC单组分制备。

本发明方法不受上述顺序的限制，并且所述培养基成分可以在本领域技术人员可预见的范围内改变。

需要指出的是，本发明的化合物可以但不限于从微生物发酵产物中提取、分离得到。

本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物可以单独给药，与其他本发明化合物联合给药，和/或以与其他已知治疗剂联合的形式给药。

本发明的活性化合物可以本身形式给药的，或者以药物组合物形式给药，其中活性化合物是与一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合的。按照本发明使用的药物组合物通常是按常规方式配制的，使用一种或多种生理学上可接受的载体，包含赋形剂和助剂，它们有利于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的给药途径，可以按照本领域熟知的常识进行制造。

本发明的化合物将按照有效提供所需治疗效果的量给药。提供所需治疗效果所必要的浓度将尤其根据疾病的明确性质、患者的年龄、体重和疾病的严重性而异。

给药剂量优选地将对患者是无毒的，不过在某些情况下所治疗疾病的严重性可能迫使给以导致一些毒性迹象的量的化合物。

本发明的化合物或组合物还可以选择性地与已知的抗肿瘤药物联合给药。当它与已知药物联合给药时，可以同时、分别或顺序给药。

附图说明

图1为产生菌F02Z-1593的菌落形态照片；

图2为产生菌F02Z-1593的显微照片；

图3为化合物II的ESI-MS图；

图4为化合物II的¹H NMR图谱；

图5为化合物II的¹³C NMR图谱；

图6为化合物II的HMBC图谱；

图7为化合物V的¹H NMR图谱；

图8为化合物V的¹³C NMR图谱；

图9为化合物V的ESI-MS图；

图10为化合物V的HMBC图谱；

图11化合物II对结肠癌细胞的凋亡诱导引起的细胞形态变化

图12化合物II对结肠癌细胞引起的凋亡核固缩效果

图13化合物II对血管内皮细胞ECV304引起的凋亡核固缩效果

图14化合物II对结肠癌细胞周期和凋亡的影响

图15化合物II对结肠癌细胞的caspase 3、7的诱导浓度依赖作用

图16化合物II对结肠癌细胞的caspase 3、7的诱导时间依赖作用

具体实施方式

下面实施例进一步详细说明本发明，但它们并非理解成对本发明范围的任何限制。

仪器与试剂为本领域技术人员常用的仪器与试剂。除非特别说明，本发明中所说的％均为重量百分比。

材料：RPMI-1640，培养基、胰蛋白酶、胎牛血清(购于华美生物工程公司)；肿瘤细胞株HT29、MCF、MDA-MB-231、Hela，人胚肝细胞L02以及人脐静脉内皮细胞ECV304均购自于美国ATCC；Caspase-3/7四肽荧光底物Ac-DEVD-AMC和Hochest3328购自于sigma公司；色谱试剂购自Merck公司；

紫外光谱仪：Pharmacia公司Ultrospec 2100Pro型

核磁共振仪：Varian公司inova 500

质谱仪：Waters公司Micromass

细胞板读板仪：Perkin Elmer公司Victor² 1420 Multilabel Counter

中压层析系统：德国BUCHI公司

制备型HPLC：Waters公司(pump：600，Detector：2487，Injector：7725i)

流式细胞仪：BECKMAN COULTER II，USA

实施例1菌种的培养

斜面培养基：PDA斜面培养基。

种子培养基：淀粉2％，葡萄糖1％，热榨黄豆饼粉0.2％，麦牙粉0.6％，酵母粉0.3％，NaCl 0.2％，MgSO4.7H2O 0.1％，CaCO3 0.2％pH 7.0。

固体培养基：成分为大米，豆粉2.5％

由真菌CGMCC No.2037斜面，接种于种子培养基，26℃，220r/min，72hr培养后，接种于装量为150g的750mL三角瓶中，含水量25％，八层纱布，静止培养14d。

实施例2化合物I-V的分离及结构鉴定

F02Z-1593固体发酵150gX20瓶，6L乙酯浸泡2h，滤去培养基，乙酯相减压浓干得浸膏6.0g。浸膏6.0g进行硅胶柱(3.5x50cm)层析，依次以氯仿、氯仿-甲醇(100∶1)、氯仿-甲醇(50∶1)、氯仿-甲醇(20∶1)洗脱各两个柱体积，自动收集，50ml/管，薄层层析检测合并成6份。其中第三份经SephadexLH-20(2.6x50cm)凝胶柱层析，甲醇洗脱，薄层层析检测合并成三部分，第二部分进行HPLC制备[流动相为70％乙腈-30％水(含0.1％磷酸)，流速16ml/min，色谱柱：YMC C18，20x250mm，10um]，得化合物III 9.7mg，保留时间18.0min；第三部分进行HPLC制备[流动相为60％乙腈-40％水(含0.1％磷酸)，流速16ml/min，色谱柱：YMC C18，20x250mm，10um]，得化合物IV 50.4mg，保留时间6.5min；化合物V 7.1mg，保留时间11.2min。硅胶柱分离所得的第五份经HPLC制备[流动相为50％乙腈-50％水(含0.1％磷酸)，流速16ml/min，色谱柱：YMC C18，20x250mm，10um]，得化合物I 36.5mg，保留时间13.6min。硅胶柱分离所得的第六份放置过程中有结晶析出，该结晶用甲醇洗涤三次，抽干，得化合物II 27.3mg。

化合物I：分子式C₂₂H₂₀O₈；分子量412.12，浅黄色粉末，可溶于甲醇、丙酮，易溶于氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。UVλmax(nm)：225，254，326(MeCN)。¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δ：6.58(1H，s，4-H)，7.49(1H，d，J＝8.5Hz，6-H)，6.67(1H，d，J＝8.5Hz，7-H)，5.65(1H，d，J＝2.5Hz，2’-H)，6.82(1H，d，J＝2.5Hz，3’-H)，6.43(1H，s，5’-H)，2.71(2H，m，1”-H)，1.62(2H，m，2”-H)，1.20(6H，s，4”-H)，1.20(6H，s，5”-H)，12.16(1H，s，1-OH)，11.50(1H，s，8-OH)，6.46(1H，s，1’-OH)；¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δ：157.2(C-1)，111.8(C-2)，166.3(C-3)，90.2(C-4)，157.8(C-4a)，120.6(C-5)，137.4(C-6)，110.3(C-7)，158.1(C-8)，106.6(C-8a)，184.5(C-9)，102.8(C-9a)，152.7(C-10a)，88.4(C-1’)，106.7(C-2’)，148.3(C-3’)，117.3(C-5’)，23.5(C-1”)，43.6(C-2”)，68.8(C-3”)，29.2(C-4”)，29.2(C-5”)

化合物I结构如下：

化合物II：分子量(ESI-MS)：428.2；分子式：C₂₂H₂₀O₉；浅黄色粉末，可溶于甲醇、丙酮，易溶于氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。UVλmax(nm)：225，254，326(MeCN)。¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δ：6.65(1H，s，4-H)，7.83(1H，d，J＝8.5Hz，6-H)，6.85(1H，d，J＝8.5Hz，7-H)，5.62(1H，d，J＝3.0Hz，2’-H)，6.78(1H，d，J＝3.0Hz，3’-H)，6.42(1H，s，5’-H)，5.37(1H，br，1”-H)，1.71(2H，br，2”-H)，1.30(3H，s，4”-H)，1.19(3H，s，5”-H)，12.20(1H，s，1-OH)，11.63(1H，s，8-OH)，5.38(1H，br，1”-OH)，4.67(1H，br，3”-OH)。¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δ：157.2(C-1)，112.0(C-2)，166.3(C-3)，90.4(C-4)，157.7(C-4a)，124.8(C-5)，134.6(C-6)，110.5(C-7)，158.8(C-8)，106.3(C-8a)，184.5(C-9)，103.0(C-9a)，150.9(C-10a)，88.4(C-1’)，106.6(C-2’)，148.3(C-3’)，117.3(C-5’)，63.7(C-1”)，50.5(C-2”)，69.8(C-3”)，29.2(C-4”)，30.4(C-5”)

化合物II结构如下：

化合物III：浅黄色粉末，可溶于甲醇、丙酮，易溶于氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。UVλmax(nm)：225，254，326(MeCN)。¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)δ：6.46(1H，s，4-H)，7.44(1H，d，J＝9.0Hz，6-H)，6.73(1H，d，J＝9.0Hz，7-H)，5.70(1H，d，J＝2.5Hz，2’-H)，6.58(1H，d，J＝2.5Hz，3’-H)，6.44(1H，s，5’-H)，3.45(2H，m，1’-H)，5.26(1H，t，J＝7.0Hz，2”-H)，1.78(3H，s，4”-H)，1.74(3H，s，5”-H)，12.40(1H，s，1-OH)，11.66(1H，s，8-OH).¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)δ：157.7(C-1)，110.6(C-2)，166.6(C-3)，90.8(C-4)，158.8(C-4a)，119.6(C-5)，137.4(C-6)，110.7(C-7)，159.2(C-8)，107.2(C-8a)，185.2(C-9)，103.5(C-9a)，153.2(C-10a)，89.7(C-1’)，106.1(C-2’)，148.9(C-3’)，117.4(C-5’)，27.5(C-1”)，121.4(C-2”)，133.5(C-3”)，17.7(C-4”)，25.5(C-5”)

化合物III结构如下：

化合物IV：分子式：C₁₇H₁₀O₇，分子量：326.3，浅黄色粉末，可溶于甲醇、丙酮，易溶于氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。UVλmax(nm)：225，254，326(MeCN)。¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δ：6.58(1H，s，4-H)，6.99(1H，d，J＝8.5Hz，5-H)，7.69(1H，t，J＝8.5Hz，6-H)，6.80(1H，d，J＝8.5Hz，7-H)，5.65(1H，d，J＝2.5Hz，2’-H)，6.79(1H，d，J＝2.5Hz，3’-H)，6.42(1H，s，5’-H)；¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δ：157.4(C-1)，112.0(C-2)，166.6(C-3)，90.6(C-4)，158.1(C-4a)，107.4(C-5)，137.8(C-6)，111.1(C-7)，160.4(C-8)，106.8(C-8a)，184.5(C-9)，103.3(C-9a)，155.7(C-10a)，88.6(C-1’)，107.0(C-2’)，148.5(C-3’)，117.5(C-5’)。

化合物IV结构如下：

化合物V：分子式：C₁₇H₉ClO₇，分子量：360.7，浅黄色粉末，可溶于甲醇、丙酮，易溶于氯仿、二甲亚砜等有机溶剂。UVλmax(nm)：225，254，326(MeCN)。¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)δ：6.47(1H，s，4-H)，6.89(1H，d，J＝8.9Hz，5-H)，7.66(1H，d，J＝8.9Hz，6-H)，5.70(1H，d，J＝2.7Hz，2’-H)，6.58(1H，d，J＝2.7Hz，3’-H)，6.45(1H，s，5’-H)，11.50(1H，s，8-OH).¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)δ：157.7(C-1)，111.1(C-2)，167.1(C-3)，91.0(C-4)，158.8(C-4a)，107.8(C-5)，137.0(C-6)，115.1(C-7)，156.2(C-8)，107.9(C-8a)，184.5(C-9)，103.4(C-9a)，154.4(C-10a)，89.6(C-1’)，106.0(C-2’)，149.1(C-3’)，117.5(C-5’)

化合物V结构如下：

实施例3化合物I-V对肿瘤细胞、血管内皮细胞以及正常肝细胞的增殖抑制的活性

将培养瓶中培养好的肿瘤细胞株胰酶消化、计数，以每孔约为1-2×104细胞数铺板，并加入不同稀释浓度的测试样品，5％CO2、37℃条件下孵育72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg/L)，继续孵育6h。出吸取培养基，每孔加入DMSO100μL，振荡5min，在570nm波长条件下测量吸光度值，按以下公式计算细胞增殖抑制率：

细胞增殖抑制率＝(1-实验组吸光度平均值/对照组吸光度平均值)×100％

结果显示本发明中的五个化合物对乳腺癌MCF，MDA-MB-231、结肠癌HT29、宫颈癌细胞株HeLa的肿瘤细胞表现出很好的增殖抑制活性，其增殖抑制的IC₅₀在0.007-6.0μg/ml，对血管内皮细胞ECV304也具有较好的抑制作用，IC₅₀在0.24-6.3μg/ml，说明对肿瘤的新生血管的形成具有潜在的抑制作用。但五个化合物对正常肝细胞L02表现出较低的细胞毒作用，其IC₅₀均大于100μg/ml，见表2。

表2化合物对不同肿瘤细胞株的抑制IC50(μg/ml)

实施例4化合物II对肿瘤细胞的凋亡诱导的细胞形态变化效应

利用0.01-10μg/ml浓度的样品处理HT29结肠癌细胞1天后，在电镜下观察细胞形态变化并拍照。研究结果证明经化合物II处理的细胞出现贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落，细胞体积变小、变形。这些都是是典型的细胞凋亡特征性的变化。而且该化合物这种诱导效应具有浓度依赖关系见图11。

实施例5化合物II对肿瘤细胞的核形态影响

利用0.01-10μg/ml浓度的样品处理HT29结肠癌细胞0-3天后，利用4％甲醛固定，并用1μg/ml的Hochest 33258荧光染色剂进行细胞核染色15分种。荧光显微镜下观察并拍照记录。研究结果证明经化合物处理的细胞核出现明显的固缩，凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，部分细胞出现染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态，见图12。

实施例6化合物II对血管内皮细胞的核形态的影响

实验方法同实施例5。结果证明，经过化合物II处理后的HT29结肠癌细胞核呈现明显的固缩等凋亡现象，见图13。说明该化合物对血管细胞具有诱导凋亡作用，从可能起到抑制新生血管形成的作用。

实施例7流式细胞术检测化合物II对癌细胞周期和凋亡的影响

凋亡的测定方法：不同药物浓度分别作用于HT29结肠癌细胞，在同一时间或不同的处理时间后收集细胞(1～5)×10⁶个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。3ml PBS洗一次。离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。用1ml(含5mg/ml PI，0.1％RNaseA)PI染液，4℃避光30min。上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡的检测。结果如图14所示，经化合物II处理的细胞G2/M期细胞明显减少，G1期细胞由明显增加，说明F02Z-1593J使细胞周期停滞在G1/G0期。同时结果证明经过化合物II处理后细胞在流式细胞仪上出现了明显的亚G1期凋亡峰，而且随着浓度凋亡峰所占的比例从5.1％增加到22.7％。

实施例8化合物II对细胞中Caspase 3/7活性

对照与样品处理组培养3天后的HT29结肠癌细胞用PBS洗涤一次，加入细胞裂解液，保温15min后加Ac-DEVD-AMC(caspase-3四肽荧光底物)，37℃反应2h。分析荧光强度(激发光波长355nm，发射光波长为460nm)以及利用荧光显微镜进行细胞中荧光检测。根据释放的AMC荧光强度的大小，测定caspase-3的活性。结果证明经化合物1处理的细胞中caspase3/7的活性随着样品处理的浓度和时间活性成明显的增长，其EC₅₀为0.07μg/ml，见图15和图16。说明该化合物对癌细胞中的caspase3/7的活性有明显的诱导作用。

上述生物活性实验表明，本发明化合物在诱导肿瘤细胞凋亡、抗新生血管形成以及抗肿瘤转移等方面具有显著的效果。

Claims (6)

1.下图中化合物II或V及其可药用盐或溶剂化物。

2.一种制备权利要求1化合物I-V中任一化合物的方法，包括：培养产生所述化合物的微生物，之后对发酵液进行分离和纯化。

3.根据权利要求2所述的方法，其中的微生物为曲霉(Aspergillus sp.)CGMCCNo.2037。

4.一种药物组合物，含有权利要求1任一化合物作为活性成份和可药用载体。

5.权利要求1中任一化合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

6.权利要求1中任一化合物在制备诱导肿瘤细胞凋亡、抗新生血管形成或抗肿瘤转移的抗肿瘤药物中的用途。

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