CN102187870B - 一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用 - Google Patents
一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及杀虫剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用。所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用，海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物如式(I)所示；本发明通过分离于海洋红藻异管藻的真菌米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2发酵经提取、分离获得的二萜生物碱类天然化合物，经杀虫活性实验得出此二萜生物碱类化合物在100微克/毫升时对卤虫的致死率为74.2％。
Description
技术领域
本发明涉及杀虫剂领域，具体地说是一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用。
背景技术
随着化学合成农药使用时间的推移，其产生的不良影响已越来越突出。化学农药大规模地生产和无限制地大量使用，使70％～80％的农药直接渗透到环境中，残留非常严重，对土壤、地表水、地下水造成污染，并进一步进入生物链，对生物和人类健康都造成直接和潜在的危害。我国加入世界贸易组织后，因化学农药残留而导致的“绿色壁垒”严重制约着我国农产品的出口，传统农业产业面临着更大的风险和挑战。农业部已从2001年起在全国范围内实施“无公害食品行动计划”，而使用无公害农药又是实施这一目标的关键措施，于是人们把目光投向对环境更友好的生物农药。与传统的化学合成农药相比，生物农药具有对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性等优点。生物农药的开发应用对人类健康，环境保护和农业的可持续发展都具有极其重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种天然的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物的应用，所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用，海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物如式(I)所示。
所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物可作为杀虫剂。所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物按如下步骤制备：
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵20-25天，过滤，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，收集的菌丝体用有机溶剂提取，而后再经乙酸乙酯萃取浓缩，发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并，即为粗提物；
所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2010045，株号为cf-2；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比10-15∶1梯度的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化，纯化收集Rf值为0.6-0.7组分，即得海藻内生真菌二萜生物碱类化合物。
步骤1)中的有机溶剂提取液为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种。步骤2)中的有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮。步骤3)所述凝胶柱层析洗脱液为体积比1-2∶1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇；硅胶柱层析洗脱液为体积比5-15∶1比石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮；薄层层析展开剂为体积比为5∶1的石油醚-乙酸乙酯。步骤3)所述凝胶柱层析时收集经TLC检测为深红色斑点的组分；硅胶柱层析时收集以洗脱液体积比10-15∶1梯度的洗脱液。
本发明具有以下优点：
本发明通过分离于海洋红藻异管藻的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2发酵经提取、分离获得的二萜生物碱类天然化合物，经杀虫活性实验得出二萜生物碱类化合物在100微克/毫升时对卤虫的致死率为74.2％。
具体实施方式：
下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。
实施例1
如式(I)所示的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物具有杀虫作用，可作为杀虫剂。
杀虫活性实验：
卤虫(Brine Shrimp)也称盐水丰年虫，分类上属于节肢动物门，甲壳纲，无甲目，盐水丰年虫科，卤虫属，卤虫作为一种重要的和良好的实验动物材料，一直受到人们的广泛重视。采用控制条件下实验室培育的该昆虫，借其来评价化合物杀虫活性的强弱.
卤虫卵的孵化：取卤虫卵100毫克置于500毫升烧杯中，加入人工海水400毫升，用一小充气泵缓缓充气，室温孵化24小时，除去卵壳及未孵化的卵，卤虫幼虫继续培养24小时，备用。
卤虫生物致死法：依照Solis的改良法，取96孔细胞培养板，每孔加190微升含10个左右卤虫幼虫的人工海水液，制成测试培养板。空白对照组和每个浓度的样品组各设三个平行孔，空白对照组加10微升溶剂二甲基亚砜(DMSO)，样品组加10微升、浓度为2.0毫克/毫升式(I)所示的二萜生物碱类化合物的DMSO溶液，其中式(I)所示的二萜生物碱类化合物的DMSO溶液是以DMSO为溶剂，式(I)所示化合物为溶质。室温培养24小时后，在双目解剖镜下检测计数卤虫死亡个体数目。
卤虫生物致死活性以校正死亡率表示，计算公式如下：
校正死亡率＝(对照组存活率-处理组存活率)/对照组存活率×100％
实验结果：式(I)所示的二萜生物碱类化合物在100微克/毫升时对卤虫的致死率为74.2％。
实施例2
式(I)所示的二萜生物碱类化合物的制备方法：
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M2010045，株号为cf-2；切成小块接种于PDB液体培养基中，每1L三角瓶中放300mL培养基，共30瓶，室温静止发酵23天，加入发酵液二分之一体积乙酸乙酯杀灭真菌，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。所述PDB液体培养基组成为每升含土豆汁200毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏3克，陈海水500毫升，蒸馏水300毫升。
收集发酵液约9L，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体粉碎后用体积比1∶1的氯仿-甲醇提取三次，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩；浓缩物经薄层层析检测其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物8g。将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯以100∶0，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，1∶1到0∶100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(薄层层析检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得22个组分(1-22)。将组分15即以石油醚-乙酸乙酯体积比为10∶1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时洗脱液为体积比1∶1的氯仿-甲醇，洗脱下的组分经TLC检测采用石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集深红色斑点的组分，硅胶柱层析时用梯度在10∶1到5∶1的石油醚-乙酸乙酯进行洗脱，收集10∶1的石油醚-乙酸乙酯洗脱下的组分，经薄层层析分离用5∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.6-0.7的组分，得式(I)所示的二萜生物碱类化合物(109.7毫克)，经TLC检测，呈单个、均匀深红色斑点，确定为纯化合物。经波谱分析，其结构鉴定为JBIR-03，结构式如(I)所示。
该化合物具有以下理化和波谱特性：
无色晶体，核磁共振氢谱(1H NMR，CDCl3，500MHz)δ0.91(s)，1.03(s)，1.10(s)，1.69(s)，1.73(s)，3.24(dd，J＝12.4，3.2Hz)，4.83(m)，5.34(d，J＝9.0Hz)，7.06(t，J＝8.0Hz)，7.07(t，J＝8.0Hz)，7.29(d，J＝8.0Hz)，7.42(d，J＝8.0Hz)；核磁共振碳谱(13C NMR，CDCl3，125MHz)δ14.7(q)，15.1(q)，18.1(q)，20.8(q)，22.8(t)，25.4(t)，25.4(t)，26.0(q)，27.7(t)，34.3(t)，40.5(s)，45.2(s)，46.5(d)，48.7(t)，48.9(d)，52.9(s)，73.7(d)，86.1(d)，111.6(d)，118.0(s)，118.4(d)，119.5(d)，120.4(d)，125.2(s)，127.0(d)，135.0(s)，140.1(s)，150.8(s)。
上述化合物与JBIR-03(参考文献Ogata，M.；Ueda，J.Y.；Hoshi，M.；Hashimoto，J.；Nakashima，T.；Anzai，K.；Takagi，M.；Shin-ya，K.Anovel indole-diterpenoid，JBIR-03 with anti-MRSA activity fromDichotomomyces cejpii var.cejpii NBRC 103559.J.Antibiot.2007，60(10)，645-648.)具有相同的理化和波谱特性。
实施例3
与实施例2不同之处在于
取平板上生长良好的真菌米曲霉(Asp.oryzae)cf-2菌种，切成小块接种于PDB液体培养基中，每1L三角瓶中放300mL培养基，共30瓶，室温静止发酵23天，加入二分之一体积乙酸乙酯杀灭真菌，过滤，分别收集菌丝体和发酵液。所述PDB液体培养基组成为每升含土豆汁200毫升，葡萄糖20克，蛋白胨5克，酵母膏3克，陈海水500毫升，蒸馏水300毫升。
收集发酵液约9L，用乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩；菌丝体粉碎后用丙酮提取三次，再用乙酸乙酯萃取，减压浓缩；浓缩物经薄层层析检测其结果相似，合并发酵液和菌丝体两部分的浓缩物为粗提物8g。将粗提物进行200-300目的硅胶柱层析，用石油醚-丙酮以100∶0，50∶1，20∶1，15∶1，10∶1，5∶1，1∶1到0∶100的梯度进行洗脱，分别收集洗脱液，再用薄层层析(TLC)检测(薄层层析检测时用茴香醛-硫酸作为显色剂)，根据Rf值来判断、合并相同或类似部分，获得22个组分(1-22)。将组分15即以石油醚-丙酮体积比为15∶1梯度洗脱下的组分再进行凝胶柱、硅胶柱和薄层层析分离，凝胶柱层析时洗脱液为体积比2∶1的氯仿-乙醇，洗脱下的组分经TLC检测采用石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集深红色斑点的组分，硅胶柱层析时用梯度在15∶1到10∶1的石油醚-丙酮进行洗脱，收集15∶1的石油醚-丙酮洗脱下的组分，经薄层层析分离用5∶1的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，收集Rf值为0.6-0.7的组分，得式(I)所示的二萜生物碱类化合物。
Claims (6)
1.一种海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物如式(I)所示
2.按权利要求1所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：所述海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物按如下步骤制备：
1)将米曲霉(Aspergillus oryzae)cf-2接种于真菌液体培养基中静止发酵20-25天，过滤，发酵液经乙酸乙酯萃取浓缩，收集的菌丝体用有机溶剂提取，而后再经乙酸乙酯萃取浓缩，发酵液所得浓缩物和菌丝体所得浓缩物合并，即为粗提物；
所述米曲霉(Asp.oryzae)cf-2，其于2010年3月1日保存于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCC M 2010045，株号为cf-2；
2)取步骤1)中的粗提物进行硅胶柱层析，用有机溶剂进行梯度洗脱，收集洗脱液，洗脱液经薄层层析检测；
3)收集步骤2)中以洗脱液体积比10-15∶1梯度的洗脱组分，将收集的洗脱组分进行凝胶柱层析、硅胶柱层析和薄层层析分离纯化，纯化收集Rf值为0.6-0.7组分，即得海藻内生真菌二萜生物碱类化合物。
3.按权利要求2所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：步骤1)中的有机溶剂提取液为氯仿、丙酮、乙酸乙酯、乙醇或甲醇中一种或几种。
4.按权利要求2所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：步骤2)中的有机溶剂为石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮。
5.按权利要求2所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：步骤3)所述凝胶柱层析洗脱液为体积比1-2∶1的氯仿-甲醇或氯仿-乙醇；硅胶柱层析洗脱液为体积比5-15∶1的石油醚-乙酸乙酯或石油醚-丙酮；薄层层析展开剂为体积比为5∶1的石油醚-乙酸乙酯。
6.按权利要求2所述的海藻内生真菌次生代谢产物二萜生物碱类化合物作为杀虫剂的应用，其特征在于：步骤3)所述凝胶柱层析时收集经TLC检测为深红色斑点的组分；硅胶柱层析时收集以洗脱液体积比10-15∶1梯度的洗脱液。
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