CN109468236A - 一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法,属于生物转化领域。本发明方法包括如下步骤:将保藏编号为CCTCC NO:M 2018804的黑曲霉HX0181接入到察氏液体培养基中,30℃、150r/min培养3天得到黑曲霉HX0181菌液;黑曲霉HX0181菌液、金银花蒸馏残液、察氏液体培养基按体积比2:2:1的比例混合,30℃、200r/min发酵10h。本发明所用的黑曲霉HX0181能极大程度的提高发酵培养物中总黄酮的含量。本发明利用了金银花露生产过程中蒸馏工段排放的高浓度有机废水,减少了污染和资源浪费,提供了产总黄酮的新渠道。

Description

一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法
技术领域
本发明属于生物转化领域,具体涉及一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法。
背景技术
金银花(Lonicerae japonica Thunb)是一种常见中药材,可药食兼用。其有效成分根据含量多少主要为有机酸、黄酮类、挥发油、三萜类等,其中的黄酮类化合物具有抗氧化、防治血管硬化、降血糖等功能。
金银花蒸馏残液为市售金银花露生产过程中的蒸馏工段排放的高浓度有机废水,在工业生产中,金银花蒸馏残液通常直接被废弃,其中含量较高的、具有重要药理作用的有绿原酸、黄酮、皂苷和鞣质等生物活性成分,金银花蒸馏残液的直接排放不但造成了资源的浪费、还产生了废水污染。
目前,对金银花蒸馏剩余物的利用很少,通过微生物转化利用金银花蒸馏残液生产黄酮,具有重大的现实意义,不但可以实现资源的最大化利用,有利于黄酮在化妆品、医疗卫生及保健品等行业的应用与发展;而且微生物转化条件温和,转化率高,环境友好,无副产物生成,能耗极低,可以减少工业废水的排放。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的问题,提供一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法,以及该方法中所使用到的黑曲霉HX0181。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种黑曲霉,其分类命名为Aspergillus niger HX0181黑曲霉HX0181,保藏编号为CCTCC NO:M 2018804,于2018年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国.武汉.武汉大学)。
所述的黑曲霉可用于生产黄酮;优选的,所述的黑曲霉以金银花蒸馏残液为原料生产黄酮,即生产黄酮所用原料包含金银花蒸馏残液。
一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法,包括如下步骤:
(1)将黑曲霉HX0181接入到培养基中进行活化培养,得到黑曲霉HX0181菌液。
(2)将黑曲霉HX0181菌液、金银花蒸馏残液、培养基混合进行发酵培养。
优选的,步骤(1)中所述的活化培养的条件为30℃、150r/min培养3天。
优选的,步骤(2)中黑曲霉HX0181菌液、金银花蒸馏残液的体积比为1:1;进一步优选的,黑曲霉HX0181菌液、金银花蒸馏残液、培养基的体积比为2:2:1。
优选的,步骤(2)中所述的发酵培养的条件为30℃、200r/min发酵10h。
优选的,步骤(1)、(2)中所述的培养基为察氏液体培养基。
优选的,所述的提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法,包括如下步骤:
(1)将黑曲霉HX0181接入到察氏液体培养基中,30℃、150r/min培养3天得到黑曲霉HX0181菌液。
(2)将黑曲霉HX0181菌液、金银花蒸馏残液、察氏液体培养基按体积比2:2:1的比例混合,30℃、200r/min发酵10h。
本发明相对于现有技术具有如下优点和有益效果:本发明的黑曲霉HX0181能极大程度的提高发酵培养物中总黄酮的含量;本发明利用了金银花露生产过程中蒸馏工段排放的高浓度有机废水,减少了污染和资源浪费,提供了产总黄酮的新渠道。
附图说明
图1是芦丁标准曲线图。
图2是发酵时间对总黄酮产量影响的结果图。
图3是接种量对总黄酮产量影响的结果图。
图4是发酵温度对总黄酮产量影响的结果图。
图5是转速对总黄酮产量影响的结果图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明,但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1黑曲霉HX0181的筛选
取1g堆积20天以上的金银花蒸馏残渣(湖北楚天舒药业有限公司)加入到盛有9mL无菌水的试管内,于恒温培养摇床上30℃、200r/min振荡培养20min,静置,过滤,即得10-1残渣稀释液。在超净工作台内,用移液枪取出1mL的10-1残渣稀释液移入装有9mL无菌水的试管中,摇匀即可得到10-2的稀释液,以同样的方法制取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀释液,配制察氏固体培养基(蔗糖30,NaNO3 3,K2HPO4 1,MgSO4·7H2O 0.5,KCl0.5,FeSO40.01,琼脂20,单位g/L),在察氏固体培养基平板分别涂上浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀释液后,于37℃培养72h,待其长出菌落,挑选单菌落在新的察氏固体培养基平板上划线,直至得到纯化单菌落。
按照上述过程经过多次筛选,得到一株高产黄酮的黑曲霉,命名为黑曲霉HX0181。
黑曲霉HX0181菌落在查察氏固体培养基上生长时,菌丝初为白色,后变黑,常出现黄色区带,厚绒状,反面无色或略带黄褐色。孢子成熟后菌落呈白色绒毛状,外观干燥,不透明菌落与培养基的连接紧密,不易挑取;在液体培养基中,振荡培养,形成白色小球;显微镜下观察到分枝繁茂且具横隔的菌丝体,菌丝透明,形成多分枝轮廓,分生孢子梗,直立无色,小枝对生,分生孢子褐色球形,若干分生孢子在分生孢子梗上聚集成孢子头。
黑曲霉HX0181于2018年11月19日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国.武汉.武汉大学),分类命名为Aspergillus niger HX0181黑曲霉HX0181,保藏编号为CCTCCNO:M 2018804。
实施例2总黄酮产量的测定
(1)芦丁标准曲线的绘制
准确称取芦丁标准品10.66mg,用体积分数60%乙醇溶液配制成母液,分别取母液0.00mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL于25mL容量瓶中,加入体积分数60%乙醇溶液5.50mL,加入5%亚硝酸钠1mL后摇匀放置6min,加入10%硝酸铝溶液1mL之后摇匀放置6min,最后加入4%氢氧化钠溶液10mL,并用体积分数60%乙醇溶液定容至刻度线位置,放置15min后,以未加入标准品溶液的试剂为空白,在波长509nm处检测其吸光度值,以芦丁质量浓度(C)为横坐标、吸光度值(A)为纵坐标绘制标准曲线(图1),得到芦丁标准曲线回归方程为:A=12.197C+0.0042,R2=0.9996,表明芦丁质量浓度在8.6~59.7μg/mL范围内与吸光度值线性关系良好。
(2)样品中总黄酮产量的测定
根据芦丁标准曲线方程计算样品溶液中黄酮的含量,通过公式(1)计算总黄酮产量:
E=C样液×N-C母液×N(1)
式中:E为总黄酮产量,g/L;C样液为三个平行实验发酵液样品中黄酮的质量浓度,g/L;N为发酵液的稀释倍数;C母液三个平行样品所对应的未经菌液发酵的混合液中黄酮的质量浓度,g/L。
实施例3单因素实验
取金银花蒸馏残液(湖北楚天舒药业有限公司)在高压灭菌锅中121℃条件下高温灭菌20min,用于后续实验。
将黑曲霉接种到察氏液体培养基中于转速为150r/min、温度为30℃的摇床培养3天得到活化的黑曲霉菌液。
根据溶氧量设定液体发酵液容器为500mL锥形瓶,总发酵体系设定为150mL,包含黑曲霉菌液、金银花蒸馏残液和察氏液体培养基,其中察氏液体培养基30mL。按一定接种比(菌液:金银花蒸馏残液,V:V)将发酵体系放入摇床培养,培养结束后取出发酵液,离心取上清测得吸光度,根据芦丁标准曲线回归方程得出总黄酮浓度,通过总黄酮产量计算公式得出总黄酮的产量。通过单因素试验分别考察黑曲霉菌种、发酵时间(h)、接种量(V:V)、温度(℃)和转速(r/min)等因素下各个水平对总黄酮产量的影响。
(1)不同黑曲霉菌种对总黄酮产量的影响
分别取黑曲霉(市售,CCTCC AF 91006)菌液、黑曲霉HX0181菌液,按菌液:金银花蒸馏残液为1:1(V:V)的接种量,将30mL察氏液体培养基、60mL菌液、60mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中,放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床培养6h。6h之后取出发酵混合液,离心取上清并测吸光度,通过计算得出总黄酮产量,平行做3组实验,考察同一条件下两种黑曲霉菌种对总黄酮产量的影响。结果如表1所示,经黑曲霉HX0181发酵后总黄酮产量远高于黑曲霉(市售)。
表1两种黑曲霉发酵的总黄酮产量
(2)发酵时间对总黄酮产量的影响
按黑曲霉HX0181菌液:金银花蒸馏残液为1:1(V:V)的接种量,将30mL察氏液体培养基、60mL黑曲霉HX0181菌液、60mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中,放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床中分别培养4h、6h、8h、10h、24h。之后取出发酵混合液,离心取上清并测吸光度,通过计算得出总黄酮产量,平行做3组实验,考察发酵时间对总黄酮产量的影响。结果如表2和图2所示。
表2不同发酵时间下的吸光度及总黄酮产量
由结果可知,随着发酵时间增加到10h,总黄酮产量达到峰值,继续延长发酵时间,总黄酮产量下降趋势明显。
(3)接种量对总黄酮产量的影响
按黑曲霉HX0181菌液:金银花蒸馏残液分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4(V:V)的接种量,将30mL察氏液体培养基、120mL黑曲霉HX0181菌液与金银花蒸馏残液的混合液加入到500mL锥形瓶中,放入转速为150r/min、温度为30℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液,离心取上清并测吸光度,通过计算得出总黄酮产量,平行做3组实验,考察接种量对总黄酮产量的影响。结果如表3和图3所示。
表3不同接种量下的吸光度及总黄酮产量
由结果可知,随着接种量的逐渐增加,即同等体系下菌液占比的逐渐减少而金银花蒸馏残液占比的逐渐增多,总黄酮产量也在逐渐升高。总黄酮产量在接种量为1:2(V:V)条件下达到峰值,为0.4373g/L。继续增加接种量,总黄酮产量则随着接种量的增加而下降。这很有可能是因为尽管随着金银花蒸馏残液占比的增加总黄酮产量会随之增加,但实验组发酵液和对照组发酵液黄酮的增量互相抵消。反而因为黑曲霉HX0181菌液占比的减少金银花蒸馏残液占比的增多带来的抑菌的影响而使得总黄酮产量下降。因此,接种量应以1:2(V:V)为宜。
(4)发酵温度对总黄酮产量的影响
按黑曲霉HX0181菌液:金银花蒸馏残液为1:1(V:V)的接种量,将30mL察氏也培养基、60mL黑曲霉HX0181菌液、60mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中,放入转速为150r/min,温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液,离心取上清并测吸光度,通过计算得出总黄酮产量,平行做3组实验,考察发酵温度对总黄酮产量的影响。结果如表4和图4所示。
表4不同发酵温度下的吸光度及总黄酮产量
由结果可知,发酵的温度小于30℃时,随着温度的升高,总黄酮产量逐渐升高,总黄酮产量在30℃的恒温条件下达到峰值,为0.4988g/L。继续升高发酵温度到40℃,总黄酮产量随着发酵温度的升高而显著下降。这可能是因为30℃是黑曲霉生长最适宜的温度,随着温度继续增加,高温分解了产物或者不适于黑曲霉的生长,使得微生物转化的能力下降。因此,发酵温度以30℃为宜。
(5)转速对总黄酮产量的影响
按黑曲霉HX0181菌液:金银花蒸馏残液为1:1(V:V)的接种量,将30mL察氏液体培养基、60mL黑曲霉HX0181菌液、60mL金银花蒸馏残液加入到500mL锥形瓶中,放入转速分别为0r/min、50r/min、100r/min、150r/min、200r/min,温度为30℃的摇床中培养6h。6h之后取出发酵混合液,离心取上清并测吸光度,通过计算得出总黄酮产量,平行做3组实验,考察转速对总黄酮产量的影响。结果如表5和图5所示。
表5不同转速下的吸光度及总黄酮产量
由结果可知,随着转速的增加总黄酮产量逐步上升。当转速增加至150r/min时总黄酮产量达到最大,为0.3263g/L。继续增加转速,提取率略有下降。主要是因为剪切力太大导致菌丝体断裂从而不利于黑曲霉的生长,最终不利于黑曲霉生物转化生成黄酮提高总黄酮产量。因此,转速以150r/min为宜。
实施例5正交实验
在单因素试验结果的基础上,以黑曲霉HX0181作为发酵菌种,选取对发酵得到总黄酮产量影响都较显著的发酵时间(h)、接种量(V:V)、温度(℃)和转速(r/min)这四个因素进行正交试验设计,正交试验因素与水平如表6所示。
表5总黄酮发酵工艺优化正交试验因素与水平
设计L9(43)正交优化试验,试验设计及结果见表7,方差分析结果见表8。
表7总黄酮发酵工艺优化正交试验设计及结果与极差分析
表8正交试验结果方差分析
注:“-”表示对结果不显著(P>0.05)。
由表7的极差分析结果可知,各因素对总黄酮产量的影响次序为:B>A>C>D,即接种量>发酵时间>发酵温度>转速。表8方差分析也表明各个因素对总黄酮产量的影响次序是B>A>C>D。但各因素的影响均不显著,获得最佳发酵工艺条件为A2B1C2D3,即发酵时间10h,接种量1:1(V:V),温度30℃,转速200r/min。
使用最佳发酵工艺条件平行试验3次,总黄酮产量为(2.5371±0.4800)g/L,高于表7中最大总黄酮产量2.5109g/L,表明正交设计所确定的黑曲霉HX0181发酵条件为最优。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种黑曲霉,其特征在于:分类命名为Aspergillus niger HX0181黑曲霉HX0181,保藏编号为CCTCC NO:M 2018804。
2.权利要求1所述的黑曲霉在生产黄酮中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:生产黄酮所用原料包含金银花蒸馏残液。
4.一种提高金银花蒸馏残液中总黄酮含量的方法,包括如下步骤:
(1)将权利要求1所述的黑曲霉接入到培养基中进行活化培养,得到黑曲霉菌液;
(2)将黑曲霉菌液、金银花蒸馏残液、培养基混合进行发酵培养。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)中所述的活化培养的条件为30℃、150r/min培养3天。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)中黑曲霉菌液、金银花蒸馏残液的体积比为1:1。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)中黑曲霉菌液、金银花蒸馏残液、培养基的体积比为2:2:1。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的发酵培养的条件为30℃、200r/min发酵10h。
9.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:步骤(1)、(2)中所述的培养基为察氏液体培养基。
10.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:包括如下步骤:
(1)将权利要求1所述的黑曲霉接入到培养基中,30℃、150r/min培养3天得到黑曲霉菌液;
(2)将黑曲霉菌液、金银花蒸馏残液、察氏液体培养基按体积比2:2:1的比例混合,30℃、200r/min发酵10h。
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