CN102827089A - 采用絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种采用絮凝剂去除发酵液中大分子有机物杂质，利用目标代谢物吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-carboxylic acid，PCA）碱溶酸沉的性质进行该物质初步分离的方法，所述方法包括发酵液初调pH值、高速分散、絮凝、微调pH值、过滤、加酸等电、脱水和干燥等步骤。最后得到黄绿色的PCA粗品，纯度≥65%，回收率≥90%，可用于PCA生物农药的配制，抑制很多种能引起植物根腐、茎腐等病害的真菌病原体对农作物的破坏。

Description

采用絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸的方法

技术领域

本发明属于生物农药提取分离技术领域。具体地说，该发明涉及一种利用吩嗪-1-羧酸（PCA）碱溶酸沉的特性，以及大分子絮凝剂能够与大分子有机物结合的性质，采用絮凝法去除杂质从而提取分离目标物的方法。

背景技术

现代农业的农药残留问题已引起人们越来越多的关注。到目前为止，世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作农药喷洒到田间，而这些化学农药残留在土壤中后通过植物的根系进入植物体内，由于很难降解，农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼虾蛋奶等食品中，造成严重的农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。近年来，很多来源于微生物代谢产物的杀菌剂应运而生，在农业生产的疾病防治中发挥着越来越重要的作用。吩嗪类抗生素是近年来研究的热点。PCA是一种具有广谱抗真菌作用的微生物源抗生素，它从作物根际土壤的自生细菌中分离而成，可以抑制很多种能引起植物根腐、茎腐等病害的真菌病原体对农作物的破坏；田间试验表明，其对小麦根腐病、水稻纹枯病和棉花枯黄萎病具有很强的防治效果。与化学农药相比，PCA具有对动物毒性低、保护生态环境、残留时间短等优点。PCA的广谱抗菌性和安全环保性使得近年来国内外科学家投入大量精力进行研究，目前在吩嗪产品领域的研究报道很多，也成功上市了一些药剂，具有广阔的市场前景和社会前景。

PCA是一种次级代谢产物，由假单胞菌（Pseudomonas）的很多亚种产生。它通过发酵可以产生两种有效成分，一种是藤黄绿脓菌素，一种是吩嗪-1-羧酸（PCA）。由于前者含量较低，在实际生产中没有应用，常用的PCA分子式为C₁₃H₈N₂O₂，分子量为224。一般PCA是黄绿色针状结晶，熔点241~242℃；溶于醇、醚、氯、仿、苯，微溶于水；在偏酸性及中性条件下稳定。其主体结构为吩嗪，侧链连接有一个羧基，因此具有碱溶酸沉的特性。聚合氯化铝絮凝剂在弱碱环境中具有很强的去除有机大分子的能力，通过改变胶体表面电荷，压缩双电层，使胶团变性沉淀而过滤去除发酵液中的杂质，然后在滤液中加酸使PCA沉淀析出，经脱水干燥后，就完成了PCA的提取分离。该工艺过程不涉及有机溶剂，安全环保，其提取成本也要比有机溶剂萃取法低得多。

目前通过基因改良的方法，PCA的在发酵液中的产量可达到6000mg/L以上，然而很难有一种简单有效的方法将其从发酵液中分离出来。发酵液成分复杂，多为菌丝体、蛋白质和多糖等大分子有机物，这些物质相互缠绕形成粘性很大的胶团。因此在提取的过程中除大分子成为分离PCA的关键，目前的提取技术主要限制于实验室，如毛细管电泳法、高效液相分离法等，这些方法耗时费力、成本较高且产量很小，不适用于工业生产。有些公司现用的提取技术是先将发酵液制成干粉，然后用氯仿或乙酸乙酯萃取蒸馏实现PCA的提取分离，其产品纯度可达到80%以上，回收率达到85%，但是由于涉及有机溶剂，工业生产时存在很大的安全隐患，另外，其维护和运行成本都很高，且产品含有一定量的有机溶剂，与安全环保的生物类农药理念相悖。

发明内容

针对上述情况，本发明的目的是提供一种简单高效提取分离吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的方法。

本发明是通过下述技术方案实现的。

采用絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的方法，其中，使用聚合氯化铝作为絮凝剂。

所述的采用絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的方法，具体包括以下步骤：

（1）发酵液初调pH值

配制质量分数3~5%的NaOH溶液，缓慢加入吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发酵液中，60~100rpm搅拌，调节发酵液的pH值至8.0~8.5；

（2）高速分散

将步骤（1）得到的发酵液加热到温度35~45℃，然后用4000~8000rpm的高速分散仪分散60~120s；

（3）絮凝

聚合氯化铝絮凝剂配制成8~10%的水溶液，加入到步骤（2）得到的发酵液中，其中聚合氯化铝添加量为发酵液质量计的1.0~1.5%，缓慢倒入发酵液中，60~100rpm搅拌2~5min，然后搅拌速度调至600rpm，5~10min；加入与聚合氯化铝絮凝剂等质量的硅藻土，搅拌均匀；

（4）微调pH值

絮凝后的发酵液pH值下降，用质量分数3~5%的NaOH溶液微调pH值至7.8~8.2；

（5）过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过板框过滤进行固液分离，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；滤饼用质量分数0.5~0.8%氢氧化钠溶液洗涤，洗涤水量为板框容积量的3~5倍，收集洗涤用碱液；

（6）滤液酸沉

合并步骤（5）得到的滤液和洗涤用碱液，缓慢加1~3mol/L的盐酸，调节pH值至3.0~4.0，使吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸沉淀析出；

（7）脱水

采用板框过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗涤水量为板框容积量的3~5倍；

（8）干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量10%以下，得到吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸产品。

根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发酵液的干物质含量为2.0~2.5%，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸在干物质中所占比例为6.0~6.5%。

所述步骤（2）中高速分散后发酵液体系均一，无分层现象。

所述步骤（3）中絮凝搅拌均匀后的发酵液平均颗粒度为300~500μm。

所述步骤（3）中聚合氯化铝为食品级，Al₂O₃有效含量为30%。

所述步骤（5）中板框过滤介质为300~500目的涤纶滤布，板框进料压力0.4~0.6MPa。

所述步骤（7）中板框过滤介质为400~600目的涤纶滤布，板框进料压力0.4~0.6MPa。

所述步骤（8）中，真空干燥装置的干燥温度为60~80℃，真空度为0.01-0.03MPa，干燥时间2-5h。

根据以上所述的方法，得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸颜色为黄绿色，其中有效成分含量≥65%，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸回收率≥90%。

本发明所述的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发酵液发酵液可以是任意市售产品，或者按照现有技术和方法自制的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发酵液。

（此处一段落删除）

本发明的有益效果：采用絮凝法去除有机大分子杂质，利用目标产物碱溶酸沉的性质进行吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的分离，颠覆了传统方法中有机溶剂萃取精馏的概念。发酵液中胶体物质通过无机高分子絮凝剂架桥、吸附、联接作用形成絮凝体而产生沉淀，再通过固液分离得以去除，绝大部分（96.8%）有机杂质形成滤饼而90%以上的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸溶解在滤液中，收集滤液和洗涤液，加入盐酸使其沉淀析出；采用过滤或离心的方式，将酸沉得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，通过真空干燥装置烘干至水分含量10%以下，便得到所述的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸粗品。产品中吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸含量≥65%，回收率≥90%。提取成本较现有的提取技术有很大幅度的下降，而且简便快捷、安全性高，为后续纯化提供了技术基础。

具体实施方式

下面将结合具体实施方式更详细地描述本发明。

(1)发酵液初调pH值

配制一定浓度的NaOH溶液，缓慢加入到发酵液中，低速搅拌，将pH值调至8.0~8.5；

本发明使用的原料发酵液为自制。荧光假单胞菌购自中国科学院微生物研究所；菌种培养采用LB培养基，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发酵使用PDA培养基，pH自然。发酵完成后干物质在发酵液中所占比例为2.0~2.5%，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸量为干物质量的6.0~6.5%。原料发酵液在低温（4℃）保存，以防变质。

实验表明吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸具有碱溶酸沉的性质，常温、pH值7.75时其溶解度为90mg/ml，温度升高后溶解度更大，同时考虑絮凝过滤后发酵液的杂质去除率和吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的回收率，最佳pH值为8.0~8.5。如果所述原料的pH值小于8.0时，则会造成絮凝后pH值下降严重导致吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸酸沉析出，降低回收率；如果所述料液的pH值大于8.5，则会造成蛋白等大分子在碱性环境中水解，导致不能充分絮凝去除杂质，降低产品的纯度。

(2)高速分散

将步骤（1）得到的发酵液加热到温度35~45℃，然后用4000~8000rpm的高速分散仪分散60~120s；

高速分散器可用于动物、植物组织匀浆粉碎，细胞分散。高速分散机的工作原理是利用锯齿状圆形分散盘在容器内高速分散完成固液分散、湿润、解聚、稳定的过程，是对多种混合液体、固体进行搅拌分散、调和、溶解的高效设备。首先，它使浆液呈滚动环状流，产生强漩涡，浆液表面粒子呈螺旋状下降到涡流底部，然后在分散盘湍流处形成湍流区，浆料及粒子受到强烈剪切和冲击，区域外形成上下两个束流，浆料得到充分循环及翻动。

加热会使吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸在碱溶液中的溶解度提高，增加吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的回收率。

在发酵过程中，菌丝体成簇生长，其代谢产物蛋白质、多糖等大分子物质围绕其间，形成了具有很高粘性的胶团，这样，粘性胶团与水溶液构成了非均相体系。分散的作用是使胶团组织破碎，一方面，束状菌丝体被打乱，溶胀性增加，发酵液的粘性下降，便于与絮凝剂反应；另一方面，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸在分散作用下充分溶出，增加了目标物的回收率。

(3)絮凝

在步骤（2）得到的发酵液中加入以发酵液质量计1.0~1.5%的聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成8~10%左右的水溶液，缓慢倒入发酵液中，60~100rpm搅拌2~5min，然后搅拌速度调至600rpm，5~10min；加入与絮凝剂等量的硅藻土，搅拌均匀；

本实验所用聚合氯化铝絮凝剂由无锡博耐丹化工科技有限公司提供，食品级，Al₂O₃含量为30%。絮凝指使水或液体中悬浮微粒积聚变大，或形成絮团，从而加快离子的聚沉，达到固液分离的目的。

一方面，有机物成分极其复杂，且多为大分子物质，形成胶体颗粒；另一方面，胶体物质表面带有负电荷，由于双电层的存在，微粒呈扩散型分布，稳定地分散在体系中。由于絮凝剂所带电荷的电负性与胶体物质相反，胶体表面的正电荷被中和，物理吸附力超过排斥力，从而引发胶体物质的凝聚。对于不易从水中分离的细小颗粒，可通过絮凝使它们变为易于分离的絮体，从而从水中分离出来。

(4)微调pH值

絮凝后的发酵液pH值会下降，用配制的NaOH溶液微调pH值至7.8~8.2，氢氧化钠溶液浓度不宜过高，2~5%为宜；

聚合氯化铝絮凝剂表面带正电荷，其溶液本身pH值为3.5，加入到发酵液中后pH值会下降至7.0左右，在此情况下，部分吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸会沉淀析出，包裹在絮体中，若此时过滤会影响吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的回收率。

微调絮凝体混合液的pH值时，所配NaOH溶液的浓度不能过高，一般2~5%为宜。胶体的稳定性与胶体表面电荷有密切关系，根据DLVO理论，正的合能会造成颗粒间相互排斥，而负的合能则造成颗粒相互吸引，导致体系不稳定。原料发酵液中加入絮凝剂正是克服了能垒而使胶体颗粒与絮凝剂架桥吸引，形成絮体而去除；如果此时加入浓度过大的NaOH溶液会使絮体局部碱度过高，造成絮凝剂与胶体颗粒已形成的架桥结构不稳定而断开，降低产品的纯度。

(5)过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过板框压滤机进行固液分离，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；过滤结束后，用0.5~0.8%的NaOH溶液洗涤滤饼，洗水量为板框容积量的3~5倍。

板框压滤是利用输送泵的机械动力在管道和过滤机的腔室内形成高压，滤布将固体物质阻拦而液体可通过的方式达到固液分离的目的。絮体混合液在滤布表面形成滤饼层，滤液穿过滤布并沿滤板沟槽流至板框边角通道，集中排出。本发明中板框过滤滤布材质要求为涤纶，300~500目，板框进料压力0.6MPa。

过滤完成后，还有10%左右的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸残留在滤饼中，此时须用0.5~0.8%的NaOH溶液洗涤，洗水量为板框容积量的3~5倍。

(6)滤液酸沉

收集步骤（5）得到的碱液，缓慢加入1~3mol/L的盐酸，调节pH值至3.0~4.0，使吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸沉淀析出；

吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸具有碱溶酸沉的性质，pH值3.5时其溶解度只有50μg/ml，而pH值2.5时其溶解度为48μg/ml；当溶液过酸(H⁺浓度＞4mol/L)时吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸能够重新溶解，证明这种物质能溶于强酸。本发明使用2mol/L的盐酸溶液，调酸时搅拌，避免局部过酸吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸发生化学反应。

(7)脱水

采用过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为板框容积量的3~5倍；

所述的板框压滤脱水是一种采用板框压滤机脱水的方法，本发明使用的板框压滤机是目前市场上销售的各种板框压滤机，例如杭州贝特过滤机有限公司商品名XAM1500-UBK型板框式压滤机。由于悬浊液具有酸性且颗粒度较小，所用滤布为涤纶材质，600目。

(8)真空干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量10%以下，得到所述的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸产品。

真空干燥，又名解析干燥，是一种将物料置于负压条件下，并适当通过加热达到负压状态下的沸点或,者通过降温使得物料凝固后通过溶点来干燥物料的干燥方式。

物料内水分在负压状态下溶点沸点都随着真空度的提高而降低，同时辅以真空泵间隙抽湿降低水汽含量，使得物料内的水获得足够的动能脱离物料表面。真空干燥由于处于低温下使得在干燥过程容易高温变质的物料更好的保持原有的特性。发明所述的真空干燥箱设定干燥温度为60~80℃，真空度为0.02MPa。

在本发明中，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸提取率的计算方法如下：

吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸提取率（%）=分离提取得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸/原料中纯吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸×100%

采用本发明的方法，吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸提取率可以达到90%以上，纯度可以达到65%~70%，现有技术可以达到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸提取纯度是80%，虽然本发明的产品纯度比现有技术稍低，但是本发明的提取成本比有机溶剂萃取法低的多（约为萃取法的1/4），而且该方法直接用发酵液进行分离，省去了制成干粉的繁琐步骤；另外，本方法简便快捷、不涉及有机溶剂、安全性大大提高。

根据本发明方法分离得到的吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸可用于0.1%和1%吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸悬浊液的制备，广泛用于小麦根腐病、水稻纹枯病和棉花枯黄萎病等的防治。

实施例1

本发明的絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸吩嗪-1-羧酸的方法，该方法的步骤如下：

(1)发酵液初调pH值

先按发酵液量的1%称量食品级氢氧化钠，并将其配制成质量分数5%的溶液存储于碱罐中。吩嗪-1-羧酸发酵罐有效容积为10m³，发酵完成后，开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察发酵罐中的pH值，升至8.5时关闭进碱阀门，第一次添加完毕，计时搅拌5min，分别从罐上部和下部取样阀同时取样并分别测pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀。然后根据上下料液平均pH值实际情况适当添加碱液，终点pH值8.47。

(2)高速分散

吩嗪-1-羧酸发酵液用4000rpm的高速搅拌器搅拌8min。分别从罐上部和下部取样阀取样并测定粘度，当罐中上下粘度数值相当时停止搅拌，表示发酵液已分散均匀。

(3)絮凝

将步骤（2）得到的发酵液加热到温度40℃，然后加入以发酵液质量计1.5%（即150kg）聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成8%左右的水溶液并存储于絮凝液罐中。搅拌桨速度60rpm，开启进液阀门，缓慢将絮凝剂浆液加入发酵液中，浆液添加速度以刚好呈线型为最佳。添加完成后，将搅拌速度调至600rpm，10min；在搅拌桨的剪切力下絮体被破碎分散。加入与絮凝剂干物质等量的硅藻土，搅拌5min；

(4)微调pH值

絮凝后的发酵液pH值会下降，用配制的NaOH溶液微调pH值至8.5；开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察发酵罐中的pH值，升至8.5时关闭进碱阀门，计时搅拌5min，分别从罐上部和下部取样阀同时取样并分别测pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀，若差值查过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH之差在0.1内，最终pH值为8.38。

(5)过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过滤布进行固液分离，絮体浆液经过板框过滤，由于开始过滤时未形成滤饼层，滤布空隙大，一些颗粒絮体不可避免的穿过滤布随滤液流出，因此初滤液需返回调浆罐继续过滤避免损失，待滤液澄清后方能关闭回流阀，开启出水阀，将滤液收集至酸沉罐中。滤饼用0.5%的碱水洗涤，洗涤水量约为500kg，滤饼用压缩空气吹干。

(6)滤液酸沉

收集步骤（5）得到的碱液，加盐酸调节pH值。将食品级浓盐酸配制成3mol/L的溶液存储于酸罐中，开启进酸阀门进行酸液添加，酸液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察调浆罐中的pH值，降至3.8时关闭进酸阀门，第一次添加完毕，计时搅拌5min，分别从调浆罐上部和下部取样阀同时取样分别测pH值，当上下pH值误差不超过0.1时表示搅拌均匀，若误差超过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH值误差在0.1内。最终罐中悬浊液的pH值为3.52.

(7)脱水

采用过滤的方式，将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为500kg，选用600目涤纶滤布，过滤压差0.6MPa；

(8)真空干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量3%以下，物料内水分在负压状态下溶点沸点都随着真空度的提高而降低，同时辅以真空泵间隙抽湿降低水汽含量，使得物料内的水获得足够的动能脱离物料表面。真空干燥由于处于低温下使得在干燥过程容易高温变质的物料更好的保持原有的特性。发明所述的真空干燥箱设定干燥温度为75℃，真空度为0.02MPa，干燥时间3h。最终产品水分含量6.7%，干物质量24.5kg，吩嗪-1-羧酸纯度70.3%，回收率91.5%。

实施例2

本发明的絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸的方法，该方法的步骤如下：

(1)发酵液初调pH值

称取足量的食品级氢氧化钠并将其配制成5%的溶液存储于碱罐中。吩嗪-1-羧酸发酵罐有效容积为10m³，发酵完成后，开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。添加完毕，60rpm计时搅拌5min，分别从罐上部和下部取样阀同时取样并分别测pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀。然后根据上下料液平均pH值实际情况适当添加碱液，最终测得pH值为8.35。

(2)高速分散

调节至pH值8.5的吩嗪-1-羧酸发酵液用6000rpm的高速搅拌器搅拌5min。分别从罐上部和下部取样阀取样并测定粘度，当罐中上下粘度数值相当时停止搅拌，表示发酵液已分散均匀。

(3)絮凝

将步骤（2）得到的发酵液加热到温度40℃，然后加入140kg聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成8%的水溶液并存储于絮凝液罐中。搅拌桨速度80rpm，开启进液阀门，缓慢将絮凝剂浆液加入发酵液中，浆液添加速度以刚好呈线型为最佳。添加完成后，将搅拌速度调至400rpm，10min；在搅拌桨的剪切力下絮体被破碎分散。加入与絮凝剂干物质等量的硅藻土，搅拌5min；

(4)微调pH值

絮凝后的发酵液pH值会下降，用配制的NaOH溶液微调pH值至8.4；开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察发酵罐中的pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀，若差值查过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH之差在0.1内。

(5)过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过滤布进行固液分离，絮体浆液经过板框过滤，由于开始过滤时未形成滤饼层，滤布空隙大，一些颗粒絮体不可避免的穿过滤布随滤液流出，因此初滤液需返回调浆罐继续过滤避免损失，待滤液澄清后方能关闭回流阀，开启出水阀，将滤液收集至酸沉罐中。滤饼用0.8%的碱水洗涤，洗涤水量为400kg，滤饼用压缩空气吹干。

(6)滤液酸沉

收集步骤（5）得到的碱液，加盐酸调节pH值。将食品级浓盐酸配制成3mol/L的溶液存储于酸罐中，开启进酸阀门进行酸液添加，酸液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察调浆罐中的pH值，降至3.9时关闭进酸阀门，第一次添加完毕，计时搅拌5min，分别从调浆罐上部和下部取样阀同时取样分别测pH值，当上下pH值误差不超过0.1时表示搅拌均匀，若误差超过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH值误差在0.1内。最终罐中悬浊液的pH值为3.68.

(7)脱水

采用过滤方式将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为500kg；

(8)真空干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量10%以下，物料内水分在负压状态下溶点沸点都随着真空度的提高而降低，同时辅以真空泵间隙抽湿降低水汽含量，使得物料内的水获得足够的动能脱离物料表面。真空干燥由于处于低温下使得在干燥过程容易高温变质的物料更好的保持原有的特性。发明所述的真空干燥箱设定干燥温度为65℃，真空度为0.02MPa，干燥时间5h。最终产品水分含量7.8%，干物质量25.3kg，吩嗪-1-羧酸纯度65.3%，回收率92.4%。

实施例3

本发明的絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸的方法，该方法的步骤如下：

(1)发酵液初调pH值

称取足够质量的食品级氢氧化钠，并将其配制成质量分数5%的溶液存储于碱罐中。吩嗪-1-羧酸发酵罐有效容积为10m³，发酵完成后，开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察发酵罐中的pH值，升至8.0时关闭进碱阀门，第一次添加完毕，计时搅拌5min，分别从罐上部和下部取样阀同时取样并分别测pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀。然后根据上下料液平均pH值实际情况适当添加碱液。最终pH值8.33.

(2)高速分散

调节至pH值8.0的吩嗪-1-羧酸发酵液用4000rpm的高速搅拌器搅拌10min。分别从罐上部和下部取样阀取样并测定粘度，当罐中上下粘度数值相当时停止搅拌，表示发酵液已分散均匀。

(3)絮凝

将步骤（2）得到的发酵液加热到温度40℃，然后加入140kg聚合氯化铝，絮凝剂预先配制成8%的水溶液并存储于絮凝液罐中。搅拌桨速度60rpm，开启进液阀门，缓慢将絮凝剂浆液加入发酵液中，浆液添加速度以刚好呈线型为最佳。添加完成后，将搅拌速度调至300rpm，5min；在搅拌桨的剪切力下絮体被破碎分散。加入与絮凝剂干物质等量的硅藻土，搅拌2min；

(4)微调pH值

絮凝后的发酵液pH值会下降，用配制的NaOH溶液微调pH值至8.5；开启进碱阀门进行碱液添加，碱液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察发酵罐中的pH值，升至8.0时关闭进碱阀门，计时搅拌5min，分别从罐上部和下部取样阀同时取样并分别测pH值，当上下pH值之差不超过0.1时表示搅拌均匀，若差值查过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH之差在0.1内。最终pH值为8.16.

(5)过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过滤布进行固液分离，絮体浆液经过板框过滤，由于开始过滤时未形成滤饼层，滤布空隙大，一些颗粒絮体不可避免的穿过滤布随滤液流出，因此初滤液需返回调浆罐继续过滤避免损失，待滤液澄清后方能关闭回流阀，开启出水阀，将滤液收集至酸沉罐中。滤饼用0.5%的碱水洗涤，洗涤水量为500kg，滤饼用压缩空气吹干。

(6)滤液酸沉

收集步骤（5）得到的碱液，加盐酸调节pH值。将食品级浓盐酸配制成3mol/L的溶液存储于酸罐中，开启进酸阀门进行酸液添加，酸液添加速度以刚好呈线型为最佳。观察调浆罐中的pH值，降至3.7时关闭进酸阀门，第一次添加完毕，计时搅拌5min，分别从调浆罐上部和下部取样阀同时取样分别测pH值，当上下pH值误差不超过0.1时表示搅拌均匀，若误差超过此范围则需要继续搅拌1min左右，直到上下料液pH值误差在0.1内。最终罐中悬浊液的pH值为3.20.

(7)脱水

采用过滤的方式，将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗水量为300kg；

(8)真空干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量3%以下，物料内水分在负压状态下溶点沸点都随着真空度的提高而降低，同时辅以真空泵间隙抽湿降低水汽含量，使得物料内的水获得足够的动能脱离物料表面。真空干燥由于处于低温下使得在干燥过程容易高温变质的物料更好的保持原有的特性。发明所述的真空干燥箱设定干燥温度为50℃，真空度为0.02MPa，干燥时间6h。最终产品水分含量5.9%，干物质量25.3kg，吩嗪-1-羧酸纯度66.4%，回收率90.3%。

Claims (10)

1.一种采用絮凝法提取分离发酵液中吩嗪-1-羧酸的方法，其特征在于，使用聚合氯化铝作为絮凝剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1） 发酵液初调pH值

配制质量分数3~5%的NaOH溶液，缓慢加入吩嗪-1-羧酸发酵液中，60~100rpm搅拌，调节发酵液的pH值至8.0~8.5；

（2） 高速分散

将步骤（1）得到的发酵液加热到温度35~45℃，然后用4000~8000rpm（优选5000-7000rpm）的高速分散仪分散60~120s；

（3） 絮凝

聚合氯化铝絮凝剂配制成8~10%的水溶液，加入到步骤（2）得到的发酵液中，其中聚合氯化铝添加量为发酵液质量计的1.0~1.5%，缓慢倒入发酵液中，60~100rpm搅拌2~5min，然后搅拌速度调至600rpm，5~10min；加入与聚合氯化铝絮凝剂等质量的硅藻土，搅拌均匀；

（4） 微调pH值

絮凝后的发酵液pH值下降，用质量分数3~5%的NaOH溶液微调pH值至7.8~8.2；

（5） 过滤洗涤

把步骤（4）得到的混合液通过板框过滤进行固液分离，初滤液进行二次过滤，待滤饼形成，滤液澄清时，收集滤液；滤饼用质量分数0.5~0.8%氢氧化钠溶液洗涤，洗涤水量为板框容积量的3~5倍，收集洗涤用碱液；

（6） 滤液酸沉

合并步骤（5）得到的滤液和洗涤用碱液，缓慢加入1~3mol/L的盐酸，调节pH值至3.0~4.0，使吩嗪-1-羧酸沉淀析出；

（7） 脱水

采用板框过滤或离心的方式，将步骤（6）得到的吩嗪-1-羧酸悬浊液脱水，液相弃用，固相保留并用自来水清洗，洗涤水量为板框容积量的3~5倍；

（8） 干燥

步骤（7）得到的物料再通过真空干燥装置烘干至水分含量10%以下，得到吩嗪-1-羧酸粗品。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中吩嗪-1-羧酸发酵液的干物质含量为2.0~2.5%，吩嗪-1-羧酸在干物质中所占比例为6.0~6.5%。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中高速分散后发酵液体系均一，无分层现象。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中絮凝搅拌均匀后的发酵液平均颗粒度为300~500μm。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中聚合氯化铝为食品级，Al₂O₃有效含量为30%。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）中板框过滤介质为300~500目的涤纶滤布，板框进料压力0.4~0.6MPa。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中板框过滤介质为400~600目的涤纶滤布，板框进料压力0.4~0.6MPa。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（8）中，真空干燥装置的干燥温度为60~80℃，真空度为0.01～0.03MPa，干燥时间2~5h。

10.根据权利要求1~9之任一项所述方法，其特征在于，得到的吩嗪-1-羧酸颜色为黄绿色，其中杂质含量≤35%，吩嗪-1-羧酸回收率≥90%。