CN107460226B - 粗糙脉孢菌发酵秸秆高产麦角甾醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种粗糙脉孢菌发酵秸秆高产麦角甾醇的方法。该方法利用小麦秸秆或水稻秸秆作为营养来源，该方法是粗糙脉孢菌以小麦秸秆、水稻秸秆为唯一营养源生产麦角甾醇，该方法包括：粗糙脉孢菌菌种的富集、粗糙脉孢菌的大量培养、麦角甾醇的提取、麦角甾醇的纯化四个步骤。该方法直接利用成本低廉的秸秆作为营养源，快速培养粗糙脉孢菌，获得大量的、高纯度的化合物麦角甾醇。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程领域，具体涉及一种粗糙脉孢菌发酵秸秆高产麦角甾醇的方法。
背景技术
利用丝状真菌获得天然产物具有巨大的潜力，但是在生产过程中受到多种因素的制约，如：所需要的培养条件苛刻，培养成本较高，培养过程中容易被杂菌污染，后期分离提取目标产物程序复杂等。粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)具有易于培养，并且生长周期比较短，所需营养成分简单等特点。
麦角甾醇为白色或无色光亮的小叶晶体或白色结晶粉末，是脂溶性维生素D2的前体，经紫外线照射后可以转化为维生素D2，可用于预防婴幼儿佝偻病，促进孕妇或老年人对钙、磷的吸收，此外，麦角甾醇还具有抗肿瘤、抗氧化和抑菌等活性，是一种重要的医药和化工原料，用于生产可的松、激素黄体酮等甾醇类药物。
我国每年产生的农作物秸秆为几亿吨，资源优势明显。利用成本较低的农作物秸秆作为营养源，可以降低麦角甾醇的生产成本。目前有专家利用酵母发酵玉米秸秆水解液来生产麦角甾醇，但是需要将玉米秸秆蒸汽爆破后处理转化为糖化液才可以被酵母利用，并且在培养酵母过程中需要再额外添加其他营养原料。化学法合成麦角甾醇虽然成本较低，但是在生产过程对环境的污染较大。粗糙脉孢菌生长迅速，菌丝体内的纤维素水解酶活性较高，可以直接利用秸秆进行发酵，从而获得大量的麦角甾醇，并且分离纯化麦角甾醇的工艺简单。
发明内容
本发明为了解决现有技术的缺陷，直接利用成本低廉的秸秆作为营养源，快速培养粗糙脉孢菌，获得大量的、高纯度的化合物麦角甾醇。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种麦角甾醇的制备方法，其特征在于，该方法是粗糙脉孢菌以小麦秸秆或水稻秸秆为唯一营养源生产麦角甾醇，该方法包括：
步骤1)、粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液，种子液浓度为OD600约为0.6；
步骤2)粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆或水稻秸秆等材料别粉碎后灭菌，置于培养容器中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养容器中，置于无菌室进行培养，培养温度为26至28℃，湿度为60％至65％，每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成；
步骤3)麦角甾醇的提取；
步骤4)麦角甾醇的纯化。
进一步的，在上述制备麦角甾醇的方法中，所述的步骤3)麦角甾醇的提取是将小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯，利用闪式提取仪进行提取，于100至150V的条件下闪式提取5min,换新的提取液后重复提取3次，合并回流提取液；于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏。
进一步的，在上述制备麦角甾醇的方法中，所述的步骤3)麦角甾醇的提取是将小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯后浸提8小时后回流。回流条件为：75℃回流3小时，更换新的提取液后重复回流3次；合并回流提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏。
进一步的，在上述制备麦角甾醇的方法中，所述的步骤4)麦角甾醇的纯化是将步骤3)中获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，即为麦角甾醇。
本发明的有益效果：
粗糙脉孢菌在以小麦秸秆或水稻秸秆等为培养基的条件下均能快速大量的积累生物量并大量生产麦角甾醇。以成本低廉的秸秆为原料，以粗糙脉孢菌为工程菌株，采用固体发酵法生产麦角甾醇产量高、纯度大、工艺简单，且生产成本较低，对环境的污染性较小，解决了秸秆的利用问题。
具体实施方式
实施例1
1.粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液。种子液浓度为OD600约为0.6。
备注：Minimal slants固体培养基(1L):20mL 50×Vogel’s Salt(125g/LNa3Citrate.2H2O，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4。7H2O，5g/L CaCl2。2H2O)，30g蔗糖，15g琼脂。
Minimal slants液体培养基不含有琼脂。
2.粗糙脉孢菌的大量培养
收集小麦秸秆粉碎后灭菌，置于培养盘中，将种子液喷洒在粉碎后的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养盘中，置于无菌室进行培养，培养温度为26℃，湿度为65％，每天搅拌一次促进粗糙脉孢菌的生长，共培养7天。
3.麦角甾醇的分离纯化与鉴定
收集培养物10Kg，培养物中加入乙酸乙酯，利用闪式提取仪进行提取，于130V的条件下闪式提取5min,更换新的提取液后重复提取3次。合并回流提取液。于65℃条件下减压浓缩，获得浸膏25g，然后加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，利用HPLC对其纯度进行检验后发现，其纯度为98.5％，称量麦角甾醇的重量约为3.62g，占总培养物重量的0.0362％,占总浸膏量的14.48％。
实施例2：
1.粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在Minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液。
备注：Minimal slants固体培养基(1L):20mL 50×Vogel’s Salt(125g/LNa3Citrate.2H2O，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4。7H2O，5g/L CaCl2。2H2O)，30g蔗糖，15g琼脂。
Minimal slants液体培养基不含有琼脂。
2.粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆或水稻秸秆等材料别粉碎为1cm长度后灭菌，置于培养盘中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养盘中，置于无菌室进行培养，培养温度为28℃，湿度为：60％。每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成。
3.麦角甾醇的提取
3.1提取方法的选择：
收集培养物，加入乙酸乙酯分别利用回流法进行提取：
回流法：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯后浸提8小时后回流。回流条件为：75℃回流3小时，更换新的提取液后重复回流3次。合并回流提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.3g。
3.2提取溶剂的选择：
分别取1Kg小麦秸秆培养物采用甲醇浸泡粗糙脉孢菌培养物后采用闪式提取法进行提取。获得的浸膏重量分别为2.3g。
结果表明，利用乙酸乙酯为提取溶剂时获得的浸膏重量最大。
4麦角甾醇的纯化
将上述利用不同溶剂获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，利用NMR、MS等波谱学技术对其结构进行鉴定(
(10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethylhex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，ergosterol)，针状晶体，1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ:5.58(d,J＝12.0Hz),5.39(d,J＝12.0Hz),5.23(dd,J＝16.4,6.8Hz),5.19(dd,J＝16.4,6.8Hz),3.64(m),2.27(d,J＝15.4Hz),2.02(m),1.81(m),1.51(d,J＝3.0Hz),1.41(d,J＝11.0Hz),1.23(m),0.95(s),0.84(dd,J＝12.4,5.3Hz),0.63(s)；13CNMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ：140.73,139.56,135.68,131.87,121.75,117.46,71.09,56.76,55.93,55.03,50.11,49.43,45.82,42.31,40.45,40.15,36.50,36.15,34.21,31.90,29.63,24.21,21.08,19.41,17.61,13.06,11.72.分子量应为396，物质为10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethyl-hex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，分子式为C28H44O。)。纯度检测：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为80％甲醇，紫外检测波长为280nm，进样量为10μl。并称量。
采用不同提取方法或不同溶剂可获得麦角甾醇晶体占总浸膏的量均约为14％。且本研究中麦角甾醇的纯度高达98.6％。
实施例3：
1、粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在Minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液。
备注：Minimal slants固体培养基(1L):20mL 50×Vogel’s Salt(125g/LNa3Citrate.2H2O，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4。7H2O，5g/L CaCl2。2H2O)，30g蔗糖，15g琼脂。
Minimal slants液体培养基不含有琼脂。
2、粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆或水稻秸秆等材料别粉碎为1cm长度后灭菌，置于培养盘中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养盘中，置于无菌室进行培养，培养温度为28℃，湿度为：60％。每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成。
3.麦角甾醇的提取
3.1提取方法的选择：
收集培养物，加入乙酸乙酯分别利用回流法进行提取：
回流法：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯后浸提8小时后回流。回流条件为：75℃回流3小时，更换新的提取液后重复回流3次。合并回流提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.3g。
3.2提取溶剂的选择：
分别取1Kg小麦秸秆培养物采用乙酸乙酯溶剂浸泡粗糙脉孢菌培养物后采用回流提取法进行提取。获得的浸膏重量分别为2.3g。
4麦角甾醇的纯化
将上述利用不同溶剂获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，利用NMR、MS等波谱学技术对其结构进行鉴定(
(10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethylhex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，ergosterol)，针状晶体，1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ:5.58(d,J＝12.0Hz),5.39(d,J＝12.0Hz),5.23(dd,J＝16.4,6.8Hz),5.19(dd,J＝16.4,6.8Hz),3.64(m),2.27(d,J＝15.4Hz),2.02(m),1.81(m),1.51(d,J＝3.0Hz),1.41(d,J＝11.0Hz),1.23(m),0.95(s),0.84(dd,J＝12.4,5.3Hz),0.63(s)；13CNMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ：140.73,139.56,135.68,131.87,121.75,117.46,71.09,56.76,55.93,55.03,50.11,49.43,45.82,42.31,40.45,40.15,36.50,36.15,34.21,31.90,29.63,24.21,21.08,19.41,17.61,13.06,11.72.分子量应为396，物质为10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethyl-hex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，分子式为C28H44O。)。纯度检测：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为80％甲醇，紫外检测波长为280nm，进样量为10μl。并称量。
采用不同提取方法或不同溶剂可获得麦角甾醇晶体占总浸膏的量均约为14％。且本研究中麦角甾醇的纯度高达98.6％。
实施例4：
1、粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在Minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液。
备注：Minimal slants固体培养基(1L):20mL 50×Vogel’s Salt(125g/LNa3Citrate.2H2O，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4。7H2O，5g/L CaCl2。2H2O)，30g蔗糖，15g琼脂。
Minimal slants液体培养基不含有琼脂。
2、粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆、玉米秸秆或水稻秸秆等材料别粉碎为1cm长度后灭菌，置于培养盘中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养盘中，置于无菌室进行培养，培养温度为28℃，湿度为：60％。每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成。
3.麦角甾醇的提取
3.1提取方法的选择：
收集培养物，加入乙酸乙酯分别利用闪式提取法进行提取：
闪式提取法：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯，利用闪式提取仪进行提取，于100至150V的条件下闪式提取5min,换新的提取液后重复提取3次。合并回流提取液。于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.5g。
3.2提取溶剂的选择：
分别取1Kg小麦秸秆培养物采用乙酸乙酯浸泡粗糙脉孢菌培养物后采用闪式提取法进行提取。获得的浸膏重量分别为2.5g。
4麦角甾醇的纯化
将上述利用不同溶剂获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，利用NMR、MS等波谱学技术对其结构进行鉴定(
(10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethylhex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，ergosterol)，针状晶体，1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ:5.58(d,J＝12.0Hz),5.39(d,J＝12.0Hz),5.23(dd,J＝16.4,6.8Hz),5.19(dd,J＝16.4,6.8Hz),3.64(m),2.27(d,J＝15.4Hz),2.02(m),1.81(m),1.51(d,J＝3.0Hz),1.41(d,J＝11.0Hz),1.23(m),0.95(s),0.84(dd,J＝12.4,5.3Hz),0.63(s)；13CNMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ：140.73,139.56,135.68,131.87,121.75,117.46,71.09,56.76,55.93,55.03,50.11,49.43,45.82,42.31,40.45,40.15,36.50,36.15,34.21,31.90,29.63,24.21,21.08,19.41,17.61,13.06,11.72.分子量应为396，物质为10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethyl-hex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，分子式为C28H44O。)。纯度检测：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为80％甲醇，紫外检测波长为280nm，进样量为10μl。并称量。
采用不同提取方法或不同溶剂可获得麦角甾醇晶体占总浸膏的量均约为14％。且本研究中麦角甾醇的纯度高达99％。
实施例5：
1、粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在Minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液。
备注：Minimal slants固体培养基(1L):20mL 50×Vogel’s Salt(125g/LNa3Citrate.2H2O，250g/L KH2PO4，100g/L NH4NO3，10g/L MgSO4。7H2O，5g/L CaCl2。2H2O)，30g蔗糖，15g琼脂。
Minimal slants液体培养基不含有琼脂。
2、粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆、玉米秸秆或水稻秸秆等材料别粉碎为1cm长度后灭菌，置于培养盘中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养盘中，置于无菌室进行培养，培养温度为28℃，湿度为：60％。每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成。
3.麦角甾醇的提取
3.1提取方法的选择：
收集培养物，加入乙酸乙酯分别利用超声波提取法进行提取：
回流法：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯后浸提8小时后回流。回流条件为：75℃回流3小时，更换新的提取液后重复回流3次。合并回流提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.3g。
闪式提取法、：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯，利用闪式提取仪进行提取，于100至150V的条件下闪式提取5min,换新的提取液后重复提取3次。合并回流提取液。于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.5g。
超声波提取法：1Kg小麦秸秆培养物中加入乙酸乙酯利用超声波在功率为200W至300W范围内提取30min，收集提取液，更换新鲜的提取液后重复超声提取3次。合并超声提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏约2.0g。
可见，三种提取方法均可获得大量的提取浸膏，但是采用闪式提取法获得的浸膏的重量高于回流提取方法和超声波提取法。
3.2提取溶剂的选择：
分别取1Kg小麦秸秆培养物采用乙酸乙酯、甲醇、石油醚、丙酮等不同溶剂浸泡粗糙脉孢菌培养物后采用闪式提取法进行提取。获得的浸膏重量分别为2.5g、2.3g、2.4g和1.8g。
结果表明，利用乙酸乙酯为提取溶剂时获得的浸膏重量最大。
4麦角甾醇的纯化
将上述利用不同溶剂获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，利用NMR、MS等波谱学技术对其结构进行鉴定(
(10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethylhex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，ergosterol)，针状晶体，1H NMR(400MHz,CDCl3,ppm)δ:5.58(d,J＝12.0Hz),5.39(d,J＝12.0Hz),5.23(dd,J＝16.4,6.8Hz),5.19(dd,J＝16.4,6.8Hz),3.64(m),2.27(d,J＝15.4Hz),2.02(m),1.81(m),1.51(d,J＝3.0Hz),1.41(d,J＝11.0Hz),1.23(m),0.95(s),0.84(dd,J＝12.4,5.3Hz),0.63(s)；13CNMR(100MHz,CDCl3,ppm)δ：140.73,139.56,135.68,131.87,121.75,117.46,71.09,56.76,55.93,55.03,50.11,49.43,45.82,42.31,40.45,40.15,36.50,36.15,34.21,31.90,29.63,24.21,21.08,19.41,17.61,13.06,11.72.分子量应为396，物质为10,13-dimethyl-17-(1,4,5-trimethyl-hex-2-enyl)-2,3,4,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol，分子式为C28H44O。)。纯度检测：采用高效液相色谱法进行测定，色谱条件为：C18柱(4.6mm×250mm,5μm)，流动相为80％甲醇，紫外检测波长为280nm，进样量为10μl。并称量。
采用不同提取方法或不同溶剂可获得麦角甾醇晶体占总浸膏的量均约为14％。且本研究中麦角甾醇的纯度高达98.5％以上。
Claims (4)
1.一种麦角甾醇的制备方法，其特征在于，该方法是粗糙脉孢菌以小麦秸秆或水稻秸秆为唯一营养源生产麦角甾醇，该方法包括：
步骤1）、粗糙脉孢菌菌种的富集
将粗糙脉孢菌接种在minimal slants固体培养基中，30℃培养5天，待形成大量分生孢子后，用灭菌后的minimal slants液体培养基将分生孢子洗涤下来，作为种子液，种子液浓度为OD600为0.6，所述的minimal slants固体培养基每1L由下述成份组成:20 mL 50×Vogel’s Salt，30 g 蔗糖，15 g 琼脂；
所述的Minimal slants 液体培养基不含有琼脂；
所述的Vogel’s Salt 由125 g/L Na3Citrate·2H2O，250 g/L KH2PO4 ，100 g/LNH4NO3，10 g/L MgSO4·7H2O，5 g/L CaCl2·2H2O组成；
步骤2）粗糙脉孢菌的大量培养
将小麦秸秆或水稻秸秆材料粉碎后灭菌，置于培养容器中，待培养物冷却后将种子液喷洒在粉碎的秸秆上，搅拌均匀后平铺于培养容器中，置于无菌室进行培养，培养温度为26℃至28℃，湿度为60%至65%，每天搅拌一次以促进粗糙脉孢菌的生长，培养7天时有大量菌丝体和分生孢子形成；
步骤3）麦角甾醇的提取；
步骤4）麦角甾醇的纯化。
2.根据权利要求1所述的麦角甾醇的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）麦角甾醇的提取是将秸秆培养物中加入乙酸乙酯，利用闪式提取仪进行提取，于100至150V的条件下闪式提取5~10min,换新的提取液后重复提取3次，合并回流提取液；于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏。
3.根据权利要求1所述的麦角甾醇的制备方法，其特征在于，所述的步骤3）麦角甾醇的提取是将秸秆培养物中加入乙酸乙酯后浸提8小时后回流；回流条件为：75℃回流3小时，更换新的提取液后重复回流3次；合并回流提取液，于65℃条件下减压浓缩，获得提取浸膏。
4.根据权利要求1所述的麦角甾醇的制备方法，其特征在于，所述的步骤4）麦角甾醇的纯化是将步骤3）中获得浸膏中加入甲醇进行溶解后，将溶液置于4℃条件下过夜，容器底部有晶体析出，利用滤纸过滤获得晶体，然后使用石油醚对晶体进行脱色，在甲醇中重结晶后，收集晶体，即为麦角甾醇。
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Citations (3)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104694401A (zh) * | 2015-04-09 | 2015-06-10 | 临沂大学 | 纯绿青霉菌株及用其生产麦角甾醇过氧化物的方法 |
| CN105884850A (zh) * | 2016-04-29 | 2016-08-24 | 周礼红 | 一种麦角甾醇的制备方法和用途 |
| CN106841472A (zh) * | 2017-03-31 | 2017-06-13 | 江苏省农业科学院 | 一种米根霉固态发酵谷物生产麦角甾醇及其检测的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 粗糙脉孢菌固态发酵产纤维素酶工艺优化;周正东等;《化学与生物工程》;20161231;第33卷(第12期);第38页摘要和第1段，第39页左栏第2段至右栏第5段 * |
| 绿色木霉固态发酵产纤维素酶的研究;姜绪林;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》;20060915;正文第4页第1.1.4节至第5页第1.2.1节，正文第8页第2.2.2节 * |
| 闪式提取香菇柄中麦角甾醇工艺研究;史德芳等;《工艺技术》;20140930(第9期);第208页摘要和第209页1.2.2-1.2.3节 * |
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