KR101606635B1 - 에포틸론 발현 카세트 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자와 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트, 이를 포함하는 에포틸론 발현용 벡터, 및 이를 이용한 에포틸론의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 에포틸론 발현 카세트 및 발현용 벡터는 생장속도가 빠르고, 유전자 조작이 용이한 이종숙주 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입할 수 있어, 단시간 동안 높은 수율로 에포틸론을 생산할 수 있으며, 본 발명에 따른 에포틸론의 생산방법에 의하여 생산된 에포틸론은 항암물질으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

에포틸론 발현 카세트 및 이의 용도 {EXPRESSION CASSETTES AND THEIR USE}
본 발명은 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자와 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트, 이를 포함하는 에포틸론 발현용 벡터, 및 이를 이용한 에포틸론의 제조방법에 관한 것이다.
식물 및 미생물 등에서 생산되는 폴리케타이드(polyketide) 계열의 화합물은 복잡한 구조의 천연 화합물(natural product)로서, 현재까지 약 10,000 가지 이상의 화합물이 알려져 있다. 그 중 에포틸론은 16환계 폴리케타이드 매크로락톤(16-membered polyketide macrolactone)의 일종으로 항암 화학요법제인 탁솔(Taxol)과 유사하게 튜불린(tubulin)에 결합하여 미세소관(microtubule)의 분해를 억제하는 강력한 항암제이다.
에포틸론 B로부터 반합성 되는 익사베필론(성분명: Ixabepilone, 상품명: Ixampra, Bristol-Myers Squibb)은 2007년 하반기에 유방암의 치료제로 FDA의 승인을 얻었다. 특히 안트라사이클린계(anthracycline)와 탁산계(taxane) 치료에 내성이 생겼거나, 또는 탁산계에 내성이 있고 더 이상의 안트라사이클린계 치료가 금기인 전이성 유방암 또는 국소 진행성 유방암의 치료에 사용이 가능하다. 또한 익사베필론은 탁솔과 다르게 부작용을 유발하는 가용화제(solubilizing agent) 없이 제형화할 수 있으며, 통상적인 화학 치료법(chemotherapy)에 내성이 있는 암세포에 강한 항암 작용을 보이는 장점이 있어 차세대 항암제로 대두되고 있다.
에포틸론의 생산은 믹소박테리움(myxobacterium)인 소란지움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum)에 의해 생산되는 이차대사산물로써 분리되었으나, 16시간에 이르는 긴 생장시간(doubling time)과 유전자 조작의 어려움으로 인하여 그 산업적 생산을 위한 유용성이 떨어지는 문제점이 있다.
한편, 경제적산업적 가치가 매우 높으나 목적하는 이차대사산물의 대량생산에 기술적 어려움이 있는 경우, 현재의 화학합성을 대체할 수 있는 효율적 방안 중 하나로 대량 생산하고자 하는 이차대사산물의 생합성 유전자집단을 자연생산 생물체로부터 확보하고, 이를 최적화된 이종숙주에서 발현하는 이중숙주 생산시스템(heterologous expression system)이 연구되고 있다. 미국 및 독일의 연구팀에서 이중숙주 생산시스템을 이용하여 스트렙토마이시스 실리칼라(Streptomyces coelicolor), 믹소코쿠스 잔서스(Myxococcus xanthus), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 그리고 스트렙토마이시스 베네주엘래에서 에포틸론의 생합성을 시도하여 왔다. 독일 Rolf Mller 연구팀에서는 에포틸론 생합성 유전자를 최적화하여 합성한 후 믹소코쿠스 잔서스에서 발현하는 기술(Oβwald C et al., ACS Synth Biol., 2012. 10)을 보고한 바 있다.
또한, 본 발명자들은 방선균 중 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에서의 에포틸론 생산방법에 대하여 출원한 바 있다(한국 특허등록 제 10-0949313호). 그러나 상기 발명들은 에포틸론 B의 경우 약 0.1㎍/L, 에포틸론 D의 경우 약 0.4㎍/L의 수율을 나타내어, 에포틸론을 산업 수요에 맞추어 생산할 만큼 수율이 높지 않다는 문제가 있었는바, 에포틸론의 생산 효율을 높이기 위한 기술이 여전히 요구되고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 유용한 항암물질인 에포틸론의 수율을 높이는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 에포틸론 생합성 유전자집단을 이종숙주 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 적합하도록 최적화하여 합성하고, 상기 합성된 유전자 사이에 소란지움 셀룰로섬 유래, 또는 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신(pikromycin) 또는 데소사민(desosamin) 생합성 유전자 집단 유래의 유전자간 영역(intergenic region)을 삽입한 발현 카세트를 포함하는 벡터를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입할 경우 에포틸론의 수율을 현저히 향상시킴을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)와, 소란지움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum)에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 소란지움 셀룰로섬에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA, epoP, epoB, 및 epoC와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신(pikromycin) 또는 데소사민(desosamin) 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD, epoE, epoF, orf6, orf3, 및 orf14와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 목적은 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), epoC(서열번호 4), epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 에포틸론 발현 카세트를 포함하는, 에포틸론 발현용 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 에포틸론 발현용 벡터가 하나 이상 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론 A, B, C, 및 D을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 에포틸론의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자와, 하나 이상의 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트를 제공한다.
본 발명에서 용어, "에포틸론"은 메틸티아졸(methylthiazole)기가 올레핀 결합(olefinic bond)에 의하여 결합된 16환계 폴리케타이드 매크로락톤(polyketide macrolactone)의 일종으로, 저성장(low-growing) 믹소박테리움(myxobacterium)인 소란지움 셀룰로섬에 의해 생산되는 이차 대사산물로써 최초 분리되었다. 상기 에포틸론은 하기 화학식 1로 표시되며 R이 H인 에포틸론 A, 하기 화학식 1로 표시되며 R이 CH3인 에포틸론 B, 하기 화학식 2로 표시되며 R이 H인 에포틸론 C, 하기 화학식 2로 표시되며 R이 CH3인 에포틸론 D를 포함할 수 있다. 에포틸론 C와 D는 에포틸론 A와 B의 생합성 초기단계의 중간물질이다.
Figure 112014052317142-pat00001
Figure 112014052317142-pat00002
본 발명의 에포틸론은, 에포틸론의 유사체, 유도체, 익사베필론을 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
상기 에포틸론은 튜불린 중합 에세이에서 항종양 활성을 가지는 것으로 보고되었으며(Bollag, D. et al., Cancer Res., 55:2325, 1995), 탁솔이나 탁소텔 등의 항암제처럼 미세소관(microtubule)을 안정화시키고 세포 분열을 억제함으로써 암 세포의 증식을 막는 것으로 알려져 있는 유용한 의약품의 원료이다.
본 발명에서 용어, "발현 카세트"란, 에포틸론 생합성 유전자를 포함하고 있어서 에포틸론을 발현시킬 수 있는 단위 카세트를 의미한다. 또한, 본 발명에서 발현 카세트는 발현구조체와 혼용될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 카세트는 본 발명의 목적 상, 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입되어 에포틸론을 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어, "코돈 최적화(codon optimization)"는 코돈의 숙주에서의 에포틸론 생합성 유전자의 발현을 보다 효율적으로 하기 위하여 유전자의 코돈을 상기 숙주 유전자에서 높은 빈도로 사용되는 코돈으로 치환하는 것을 의미한다.
상기 숙주는 본 발명의 벡터가 도입되어 에포틸론을 제조할 수 있는 세포는 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 방선균, 스트렙토마이시스 속이며, 더욱 바람직하게는 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae) 또는 스트렙토마이시스 실리칼라(Streptomyces coelicolor)이다. 스트렙토마이시스 베네주엘래와 스트렙토마이시스 실리칼라는 방선균의 일종으로, 스트렙토마이시스 속에 속하는 토양 미생물이며 그람 양성균이다.
상기 에포틸론 생합성 유전자는 바람직하게는 소란지움 셀룰로섬에서 유래한 유전자일 수 있다.
소란지움 셀룰로섬은 기존에 에포틸론을 생산하는 점액 세균으로 이용되어 왔다. 그러나 소란지움 셀룰로섬은 에포틸론의 수율이 낮을 뿐만 아니라 생장시간(더블링 타임)이 길며 유전자 조작의 곤란으로 인하여 유용성이 떨어진다는 단점이 있었다. 또한 에포틸론의 유기합성방법이 보고된바 있지만, 합성방법이 복잡하다는 단점이 있다. 최근, 에포틸론 생합성 유전자 클러스터의 규명으로 인하여 대장균(E. coli)에서의 에포틸론의 이종생산이 연구되고 있으나, 생산되는 에포틸론의 양이 채 1㎍/L도 되지 않으며, 낮은 온도에서(15℃) 장기간 배양(6일)이 요구되는 단점이 있었다.
이에 본 발명자들은 에포틸론의 생산수율을 향상시키기 위하여 이종숙주로 스트렙토마이시스 베네주엘래를 사용하고 이종숙주에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하는 벡터를 완성하였다.
본 발명의 에포틸론 생합성 유전자는 에포틸론의 생합성에 필요한 epoA , epoP , epoB , epoC , epoD, epoE, epoF, orf6 , orf3 , 및 orf14으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 본 발명의 목적 상, 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 서열로서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 epoA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 epoP, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoB , 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 epoC , 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 갖는 epoD, 서열번호 6로 표시되는 염기서열을 갖는 epoE, 서열번호 7으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoF, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 갖는 orf6 , 서열번호 9으로 표시되는 염기서열을 갖는 orf3 , 및 서열번호 10로 표시되는 염기서열을 갖는 orf14이다.
본 발명에서 용어, "유전자간 영역(intergenic region)"은 유전자와 유전자 사이에 위치하는 DNA서열로, 비해독성(noncoding) 부분을 의미한다(Tropp, Burton E. (2008). Molecular Biology: Genes to Proteins). 이는 인트라제닉 영역(intragenic region)인 인트론(intron)과는 차이가 있다. 유전자간 영역은 기능이 없는 것으로 알려져 있을 뿐, 발현 유전자의 특이적인 발현 증대를 위한 유전자간 영역이 어느 부분인지는 전혀 보고된 바 없다.
본 발명자들은 상기 유전자간 영역으로 소란지움 셀룰로섬의 유전자간 영역, 또는 이종숙주로 사용되는 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 유전자 집단의 유전자간 영역을 사용하여 벡터를 제조한 결과, 에포틸론 유전자의 발현이 매우 향상되어 에포틸론의 수율이 향상됨을 확인하였다.
하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트는 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)와, 소란지움 셀룰로섬에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자간 영역은 epoA 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 11), epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 12), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 13)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 모든 영역을 포함할 수 있다.
상기 유전자간 영역을 포함하는 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가 pDHS702 벡터에 합성된 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를 도 1a에 도시하였으며, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가 pSBAC벡터에 합성된 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를 도 3a에 도시하였다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트는 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 소란지움 셀룰로섬에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자간 영역은 epoD 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 14), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 15), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 16), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 17), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치는 영역(서열번호 18), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 19), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 20)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 7개의 모든 영역을 포함할 수 있다.
상기 유전자간 영역을 포함하는 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가, pDHS618 벡터에 합성된 벡터 pDHS618-optSoC_DEF_Sv의 개열지도는 도 1b에 도시하였으며, pSBAC 벡터에 합성된 벡터 pSBAC-optSoC_DEF_Sv의 개열지도는 도 3b에 도시하였고, pSET152 벡터에 합성된 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv의 개열지도는 도 4a에 도시하였다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트는 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 것일 수 있다. 스트렙토마이시스 베네주엘래는 PKS 유전자 클러스터로부터 항생제로 사용되는 피크로마이신을 생산하며 PKS는 6개의 모듈로 구성되어 있다. 본 발명자들은 유전자간 영역을 이종숙주인 스트렙토마이시스 베네주엘래가 본래 보유하고 있는 것으로서, 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 벡터에 도입한 결과, 에포틸론의 생합성 수율이 향상됨을 확인하였다. 바람직하게 상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 2개의 모든 영역을 포함할 수 있다.
상기 유전자간 영역을 포함하는 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가, pDHS702 벡터에 합성된 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv의 개열지도는 도 2a에 도시하였다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트는 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자간 영역은 epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 6개의 모든 영역을 포함할 수 있다.
상기 유전자간 영역을 포함하는 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가, pDHS618 벡터에 합성된 벡터 pDHS618-optPD_DEF_Sv의 개열지도는 도 2b에 도시하였고, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가, pSET152 벡터에 합성된 벡터 pSET152-optPD_DEF_Sv의 개열지도는 도 4b에 도시하였다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론 발현 카세트는 스트렙토마이시스 베네주엘래에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), epoC(서열번호 4), epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신 또는 데소사민 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역을 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28)을 포함할 수 있다.
상기 유전자간 영역을 포함하는 본 발명의 에포틸론 발현 카세트가, pSBAC 벡터에 합성된 벡터 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv의 개열지도는 도 3c에 도시하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 에포틸론 발현 카세트를 포함하는, 에포틸론 발현용 벡터를 제공한다.
본 발명에서 용어, "벡터"는 숙주세포에 DNA를 도입하여 에포틸론을 미생물에서 효율적으로 발현시키기 위한 수단으로서, 상기 벡터의 제작 시에는 에포틸론 생합성 유전자뿐만 아니라, 에포틸론을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
상기 에포틸론 발현 카세트가 벡터에 포함되는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
상기 벡터는 pDHS702, pDHS618, pSBAC, 및 pSET152로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 벡터에 합성된 것일 수 있다.
상기 pDHS702 벡터에 합성되는 벡터는 pDHS702-optSoC_APBC_Sv 또는 pDHS702-optPD_APBC_Sv일 수 있다. 또 다른 구체예로서, 상기 pDHS618 벡터에 합성되는 벡터는 pDHS618-optSoC_DEF_Sv 또는 pDHS618-optPD_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSBAC에 합성되는 벡터는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv, pSBAC-optSoC_DEF_Sv, 또는 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv일 수 있다. 상기 pSET152 벡터에 합성되는 벡터는 pSET152-optSoC_DEF_Sv 또는 pSET152-optPD_DEF_Sv 일 수 있다.
하나의 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pDHS702-optSoC_APBC_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pDHS702 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 epoA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 epoP, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoB, 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 epoC를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoA 유전자의 업스트림, 즉 프로모터와 epoA 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 11), epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 12), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 13) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를 도 1a에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pDHS618-optSoC_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pDHS618-optSoC_DEF_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pDHS618 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoD 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 14), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 15), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 16), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 17), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치는 영역(서열번호 18), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 19), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 20) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 7개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pDHS618-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를 도 1b에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pDHS702-optPD_APBC_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pDHS702 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 epoA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 epoP, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoB , 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 epoC를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv의 개열지도를 도 2a에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pDHS618-optPD_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pDHS618-optPD_DEF_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pDHS618 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pDHS618-optPD_DEF_Sv의 개열지도를 도 2b에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pDHS618-optPD_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pSBAC 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 epoA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 epoP, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoB , 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 epoC를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoA 유전자의 업스트림, 즉 프로모터와 epoA 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 11), epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 12), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 13) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를 도 3a에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pSBAC-optSoC_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optSoC_DEF_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pSBAC 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoD 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 14), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 15), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 16), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 17), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치는 영역(서열번호 18), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 19), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 20) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를 도 3b에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pSBAC-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv는 pikA Ⅰ 프로모터를 사용하는 pSBAC 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 epoA, 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 epoP, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 epoB, 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 갖는 epoC , epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv의 개열지도를 도 3c에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pSET152-optSoC_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv는 ermE* 프로모터를 사용하는 pSET152 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoD 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 14), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 15), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 16), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 17), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치는 영역(서열번호 18), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 19), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 20) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를 도 4a에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 벡터는 pSET152-optPD_DEF_Sv일 수 있다. 상기 벡터 pSET152-optPD_DEF_Sv는 ermE* 프로모터를 사용하는 pSET152 벡터에 합성할 수 있다. 상기 벡터는 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자를 포함하며, 상기 유전자는 바람직하게는 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함한다. 상기 벡터는 유전자간 영역을 하나 이상 포함하며, 상기 유전자간 영역은 epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28) 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 3개의 영역을 모두 포함할 수 있다. 상기 벡터 pSET152-optPD_DEF_Sv의 개열지도를 도 4b에 도시하였다. 본 발명자들은 상기 벡터 pSET152-optPD_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 발현이 향상됨을 확인하였다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 에포틸론 발현용 벡터가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론의 제조방법을 제공한다.
상기 에포틸론은 에포틸론 A, B, C, 및 D을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 벡터가 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입되고, 배양하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 스트렙토마이시스 베네주엘래에 대하여 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
하나의 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법은 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)를 포함하는 제1 발현 카세트, 및 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함하는 제2 발현 카세트를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 1개의 벡터에 합성되어 1개의 벡터로 합성될 수 있다. 상기 발현 카세트를 이용하여 벡터를 합성하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 합성된 벡터는 바람직하게는 상기 제1 발현 카세트의 다운스트림에 제2 발현 카세트가 합성된 것일 수 있다.
상기 제1 발현 카세트 및 제2 발현 카세트는 각각 별개의 벡터에 합성될 수 있다. 별개의 벡터에 합성될 경우에는, 제1 발현 카세트를 포함하는 제1 벡터, 및 제2 발현 카세트를 포함하는 제2 벡터가 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입될 수 있다. 도입되는 방법은 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 스트렙토마이시스 베네주엘래에 대하여 통상적으로 사용되는 방법이라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법에 사용되는 발현 카세트는 pDHS702, pDHS618, pSBAC, 및 pSET152로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 벡터에 합성된 것일 수 있다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법에 사용되는 벡터는 상기한 pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS618-optSoC_DEF_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, pDHS618-optPD_DEF_Sv, pSBAC-optSoC_APBC_Sv, pSBAC-optSoC_DEF_Sv, pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv, pSET152-optSoC_DEF_Sv, 또는 pSET152-optPD_DEF_Sv일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 각 벡터에 대한 설명은 상기한 것과 같으므로 생략한다. 상기 발현 카세트는 먼저 제작한 후 벡터로 합성하여 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입할 수도 있고, 한 번에 벡터를 합성하여 도입할 수도 있다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법은 상기 2개의 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv 및 pDHS618-optSoC_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하여 에포틸론 A, B, C, D를 합성할 수 있다. 본 발명자들은 pDHS702-optSoC_APBC_Sv 및 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A의 수율은 약 10㎍/L, 에포틸론 B의 수율은 약 5 ㎍/l으로 나타났으며, 에포틸론 C와 D는 각각 에포틸론 A와 B의 수율의 1/10 정도의 수율로 나타나, 에포틸론 생산 수율이 현저히 증가함을 확인하였다(도 6).
또 다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법은 상기 2개의 벡터 pDHS618-optPD_APBC_Sv 및 pDHS702-optPD_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하여 에포틸론 A, B, C, D를 합성할 수 있다. 본 발명자들은 pDHS618-optPD_APBC_Sv 및 pDHS702-optPD_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 생산 수율이 현저히 증가함을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법은 상기 2개의 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 및 pSBAC-optSoC_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하여 에포틸론 A, B, C, D를 합성할 수 있다. 본 발명자들은 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 및 pSBAC-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 생산 수율이 현저히 증가함을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 본 발명의 에포틸론의 제조방법은 1개의 벡터 pSBAC-optSoC_APBCDEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하여 에포틸론 A, B, C, D를 합성할 수 있다. 본 발명자들은 pSBAC-optSoC_APBCDEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입하여 배양한 결과, 에포틸론 A, B, C, D의 생산 수율이 현저히 증가함을 확인하였다.
또 다른 구체예로서, 상기 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 및 pSBAC-optSoC_APBC_Sv를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 제1 발현 벡터, 및 pDHS618-optSoC_DEF_Sv, pDHS618-optPD_DEF_Sv, pSBAC-optSoC_DEF_Sv, pSET152-optSoC_DEF_Sv, 및 pSET152-optPD_DEF_Sv를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나의 제2 발현 벡터가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하여 높은 수율로 에포틸론 A, B, C, D를 합성할 수 있다.
바람직하게는 pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 또는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 중 어느 하나의 벡터와 벡터 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 도입하는 방법, pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 또는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 중 어느 하나의 벡터와 벡터 pDHS618-optPD_DEF_Sv를 도입하는 방법, pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 또는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 중 어느 하나의 벡터와 벡터 pSBAC-optSoC_DEF_Sv를 도입하는 방법, pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 또는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 중 어느 하나의 벡터와 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv를 도입하는 방법, 및 pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, 또는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 중 어느 하나의 벡터와 벡터 pSET152-optPD_DEF_Sv를 도입하는 방법으로 에포틸론을 생산할 수 있다.
본 발명에 따른 에포틸론 발현 카세트 및 발현용 벡터는 생장속도가 빠르고, 유전자 조작이 용이한 이종숙주 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입할 수 있어, 단시간 동안 높은 수율로 에포틸론을 생산할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 에포틸론의 제조방법에 의하여 생산된 에포틸론은 항암물질으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a는 본 발명에 따른 에포틸론 발현용 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를, 도 1b는 pDHS618-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를 도시한 것이다.
도 2a는 본 발명에 따른 에포틸론 발현용 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv의 개열지도를, 도 2b는 pDHS618-optPD_DEF_Sv의 개열지도를 도시한 것이다.
도 3a는 본 발명에 따른 에포틸론 발현용 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv의 개열지도를, 도 3b는 pSBAC-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를, 도 3c는 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv의 개열지도를 도시한 것이다.
도 4a는 본 발명에 따른 에포틸론 발현용 벡터 pSET152-optSoC_DEF_Sv의 개열지도를, 도 4b는 pSET152-optPD_DEF_Sv의 개열지도를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 벡터에 포함되는 에포틸론 생합성 유전자 및 그의 제한효소를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv와 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 도입한 스트렙토마이시스 베네주엘래 균주에서의 LC-ESI-MS/MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
균주, 플라스미드, 배양조건
본 발명에서 서브-클로닝 (subcloning)을 위하여 대장균(E.coli) DH5(Invitrogen), 플라스미드 pLitmus28 (New England Biolabs)을 사용하였다. 본 발명에 사용된 대장균 DH5는 서브클로닝에 널리 이용되는 가장 잘 알려진 균주 중에 하나이다. 이 균주는 redAI 과 endA1 유전자의 변이로 인하여 클로닝된 내부 유전자(insert)의 안정성과 플라스미드의 획득 수율을 높여주는 장점이 있다. 한편, 플라스미드 pLitmus28은 3kb 이하의 크기를 가지며, 암피실린(ampicillin)에 저항성을 가지고 다양한 개열지도(cleavage map)를 가지고 있어서 서브클로닝에 널리 이용되는 플라스미드이다.
에포틸론을 스트렙토마이세스 베네주엘래에에서 발현시키기 위한 대장균-스트렙토마이시스 셔틀(shuttle) 벡터로 pDHS702, pDHS618 또는 pSBAC를 사용하였다. 상기 벡터들은 pikA Ⅰ 프로모터와 각각 티오스트렙톤 (thiostrepton) 및 아프라마이신(apramycin) 내성 유전자를 포함하고 있다. 상기 셔틀벡터 pDHS702와 pDHS618은 미국 미시간 대학교 미생물학과 데이비드 셔먼 (David H. Sherman) 교수로부터 확보하였다.
조작된 돌연변이 균주인 스트렙토마이시스 베네주엘래 DHS2001은 한국 등록특허 제10-0949313호에 언급된 균주를 사용하였다.
대장균은 플라스미드의 선별을 위하여 암피실린 (ampicillin, 50 ㎍/mL) 또는 아프라마이신 (apramycin, 25 ㎍/mL)이 첨가된 LB배지에서 배양하였다.
실시예 1: 에포틸론 생합성 유전자 합성 및 발현벡터 제조
에포틸론 생합성 유전자는 소란지움 셀룰로섬의 유전자 정보를 바탕으로 이종숙주 스트렙토마이시스 베네주엘래의 코돈 선호도에 맞추어 바이오니아에서 ~2kb의 사이즈로 합성하였다. 합성된 에포틸론 생합성 유전자는 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), epoC(서열번호 4), epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)이다.
상기 합성된 유전자 단편들은 각각의 제한효소를 이용하여 서브클로닝 단계를 거쳐 결합시켜 pDHS702, pDHS618 및 pSBAC에 도입하였다. 서브클로닝 및 도입 방법은 한국 등록특허 제10-0949313호에 기재된 방법을 일부 변형하여 사용하였다.
이를 통하여 하기 표 1과 같이 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv, pDHS618-optSoC_DEF_Sv, pDHS702-optPD_APBC_Sv, pDHS618-optPD_DEF_Sv, pSBAC-optSoC_APBC_Sv, pSBAC-optSoC_DEF_Sv, pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv, pSET152-optSoC_DEF_Sv, pSET152-optPD_DEF_Sv를 완성하였다. 각 벡터의 개열지도는 도 1a 내지 도 4b에 도시하였다. 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자 단편과 각각의 제한효소를 도 5에 나타내었다.
실시예 1에 따른 벡터의 특징
벡터 프로모터 벡터 에포틸론 생합성 유전자 및
유전자간 영역(IGR)
pDHS702-optSoC_APBC_Sv pikA Ⅰ pDHS702 IGR-epoA - epoP -IGR-epoB - epoC -IGR
pDHS618-optSoC_DEF_Sv pikA Ⅰ pDHS618 IGR-epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
pDHS702-optPD_APBC_Sv pikA Ⅰ pDHS702 epoA - epoP -IGR-epoB - epoC -IGR
pDHS618-optPD_DEF_Sv pikA Ⅰ pDHS618 epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
pSBAC-optSoC_APBC_Sv pikA Ⅰ pSBAC IGR-epoA - epoP -IGR-epoB - epoC -IGR
pSBAC-optSoC_DEF_Sv pikA Ⅰ pSBAC IGR-epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
pSBAC-optSoC_APBCDEF_Sv pikA Ⅰ pSBAC epoA - epoP -IGR-epoB - epoC -IGR-epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
pSET152-optSoC_DEF_Sv ermE * pSET152 IGR-epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
pSET152-optPD_DEF_Sv ermE * pSET152 epoD-IGR-epoE-IGR-epoF-IGR-orf6-IGR-orf3 -IGR-orf14 -IGR
실시예 2: 이종숙주에서 에포틸론의 발현
(1) 스트렙토마이시스 베네주엘래에의 형질전환
실시예 1에서 제조한 pDHS702-optSoC_APBC_Sv와 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 스트렙토마이시스 베네주엘래 DHS2001로 도입하고, 상기 균주를 아프라마이신 (25㎍/mL), 티오스트렙톤 (50㎍/mL) 및 카나마이신 (50㎍/mL)를 함유한 R2YE 배지를 이용하여 30℃에서 4일간 배양하였다. R2YE 조성은 103g 수크로오스 (sigma), 0.25g K2SO4 (sigma), 10.12g MgCl26H2O (sigma), 10g 글루코스 (sigma), 0.1g 카사미노 애시드(casamino acids, Difco), 5g 이스트 추출물(yeast extract, Difco), 5.73g TES 버퍼 (sigma), 2ml 미량원소용액(trace element solution), 22g agar (1L 기준)이며, 고온 멸균(autoclave) 후에 10ml 0.5% KH2PO4 (sigma), 4ml 5M CaCl22H2O (sigma), 15ml L-프롤린(L-proline, sigma), 7mL 1N NaOH(sigma) (1L 기준)을 첨가하여 제조하였다.
또한 pDHS702-optPD_APBC_Sv 및 pDHS618-optPD_DEF_Sv의 두 벡터를 스트렙토마이시스 베네주엘래 DHS2001 균주로 도입하고, pSBAC-optSoC_APBC_Sv 및 pSBAC-optSoC_DEF_Sv의 두 벡터를 스트렙토마이시스 베네주엘래 DHS2001 균주로 도입하고, pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv 벡터를 스트렙토마이시스 베네주엘래 DHS2001 균주로 도입하여 형질전환하고, 상기와 동일한 방법으로 배양하였다.
(2) 에포틸론의 생산여부 확인
상기 배양 용액을 동량의 에틸아세테이트 (ethyl acetate)와 혼합하고, 분별깔때기로 층 분리를 2회 반복하고, 유기층을 진공회전농축기(rotary evaporator)로 농축하였다. 얻어진 용출물을 100㎕의 메탄올(methanol)로 다시 녹이고 상기 용액을 Phenomenex Synergi Polar-RP 컬럼(1504.6mm, 4㎛)을 장착한 LC-ESI-MS/MS (액체크로마토그래피/전자스프레이 이온화-질량분석기; Waters/Micromass Quattromicro/MS)로 분석하였다.
분석조건으로는 250㎕/min의 유속으로 용출시켰고, 0.1%(v/v) 포름산 (formic acid) 이 첨가된 증류수 용액(A)과 0.1%(v/v)의 포름산이 첨가된 80%(v/v) 아세토니트릴 (acetonitrile) 용액(B)를 이용하여 수행하였다. 상기 용액 B를 30%에서 50%로 5분간, 50%에서 90%로 3분간 적용하고, 90%에서 4분간 유지시킨 후 30%로 15분간의 구배로 컬럼의 재평형을 위하여 용출시켰다.
분석 결과, 먼저, pDHS702-optSoC_APBC_Sv와 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 도입한 스트렙토마이시스 베네주엘래 균주에서 도 6 좌측에 도시된 것과 같이 에포틸론 A, B, C, D를 모두 생산하는 것을 확인하였다. 다른 스트렙토마이시스 베네주엘래 균주에서도 에포틸론 A, B, C, D를 모두 생산하는 것을 확인하였다.
(3) 에포틸론 생산량 정량분석
다중 반응 모니터링 모드(mutiple reactions monitoring mode)로 ESI-MS/MS(전자스프레이 이온화-질량분석기/질량분석기)로 정량분석하였다. 이는 양성자화된 분자 이온(parents)이 에포틸론 A, B, C, D에 특이적인 단편으로 전이되는 것을 탐지하기 위해 셋팅된 2개의 질량 이온(mass ion)을 선별하는 방식으로 수행되었다. 에포틸론 표준물질 A, B는 시그마 (Sigma)에서 구입하였고, 에포틸론 C, D는 소란지움 셀룰로섬에서 분리하였다. 에포틸론의 생산량은 배양액 세 군데에서 채취하여 추출한 추출물의 평균으로 계산하였다.
도 6 우측 그래프는 pDHS702-optSoC_APBC_Sv와 pDHS618-optSoC_DEF_Sv를 도입한 스트렙토마이시스 베네주엘래 균주를 ESI-MS/MS로 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도시된 것과 같이 27.12분의 용출물은 전형적인 단편 부분인 m/z 306.2, 406.2 및 494.1을 보여 에포틸론 A임을 확인하였으며, 27.95분의 용출물은 320.2, 420.3 및 508.5를 보여 에포틸론 B임을 확인하였다. 또한, 35.10분의 용출물은 290.3, 289.9 및 477.5를 보여 에포틸론 C임을 확인하였고, 36.77분의 용출물은 304.8, 404.5 및 491.1을 보여 에포틸론 D임을 확인하였다. 에포틸론 표준물질로 동일하게 실험한 결과 용출시간 및 분획 형태가 동일하였다.
에포틸론 A의 수율은 약 10㎍/L, 에포틸론 B의 수율은 약 5 ㎍/l으로 나타났으며, 에포틸론 C와 D는 각각 에포틸론 A와 B의 수율의 1/10 정도, 즉 약 1㎍/l의 수율로 생산하였다. 이는 본 발명에 따른 발현 카세트 및 이를 포함하는 에포틸론 발현용 벡터에 의하여 에포틸론 생산 수율이 현저히 증가함을 확인한 것이다.
이와 같이, 본 발명에 따른 에포틸론 발현용 벡터는 생장속도가 빠르고, 유전자 조작이 용이한 이종숙주 스트렙토마이시스 베네주엘래에 도입할 수 있어, 단시간 동안 높은 수율로 에포틸론 A, B, C, D를 모두 생산할 수 있으며, 본 발명에 따른 에포틸론의 생산방법에 의하여 생산된 에포틸론은 항암물질으로 유용하게 사용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> EWHA UNIVERSITY - INDUSTRY COLLABORATION FOUNDATION <120> EXPRESSION CASSETTES AND THEIR USE <130> KPA140462-KR <160> 28 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized DNA of Sorangium cellulosum for Expression in Streptomyces venezuelae <400> 1 atggccgacc gcccgatcga gcgcgccgcc gaggacccga tcgccatcgt cggagcctcc 60 tgccgcctcc cgggcggcgt catcgacctc tccggcttct ggaccctcct cgaaggttcc 120 cgcgacaccg tcggccgcgt cccggccgaa cgctgggacg ccgctgcctg gttcgacccg 180 gaccccgacg ccccgggcaa gaccccggtc acccgcgcct ctttcctcag tgacgtcgcc 240 tgcttcgacg catccttctt cggtatctcc ccgcgcgagg cgctccgcat ggacccggcc 300 caccgtctcc tcctcgaggt ctgctgggag gccctcgaga acgccgccat cgccccgtcc 360 gccctcgtcg gcacggagac cggcgtcttc atcggaatcg gcccgagcga gtacgaggcc 420 gccctcccgc aggccaccgc ctccgccgag atcgacgccc acggcggtct cggcaccatg 480 ccctccgtcg gcgccggccg catcagctac gccctcggcc tccgcggccc gtgcgtcgcc 540 gtcgataccg cctactcctc ctccctcgtc gccgtgcacc tcgcctgcca gtccctccgt 600 tccggcgagt gctccaccgc cctcgccggc ggcgtctccc tcatgctctc cccgtccacc 660 ctcgtctggc tctccaagac ccgcgccctc gcccgcgacg gccgctgcaa ggccttctcc 720 gccgaagccg acggcttcgg tcgcggtgag ggctgcgccg tcgtcgtcct gaagcgcctc 780 tccggcgccc gggccgacgg cgaccgcatc ctcgccgtca tccgcggctc cgccatcaac 840 cacgacggag ccagctccgg gctcaccgtc ccgaacggct cctcccagga gatcgtcctc 900 aagcgcgccc tcgccgacgc cggctgcgcc gcctcctcgg tcggctacgt cgaggcgcac 960 ggcaccggga cgaccctcgg cgacccgatc gagatccagg ccctcaacgc cgtctacggc 1020 ctcggtcgcg acgtcgccac cccgctcctc atcggctccg tcaagaccaa cctcggccac 1080 ccggaatacg cctccggcat caccggcctc ctcaaggtcg tactctccct ccagcacggc 1140 cagatcccgg cccacctcca cgcccaggcc ctcaaccccc gcatctcctg gggcgacctc 1200 cgcctcaccg tcacccgcgc ccgcaccccg tggccggact ggaacacgcc gcgccgcgcc 1260 ggtgtctcct ccttcggcat gtccggaacg aacgcccacg tcgtcctcga ggaggccccg 1320 gccgccacct gcaccccgcc ggcccctgag cgtccggccg agctcctcgt cctctccgcg 1380 cggaccgcct ccgccctcga tgcccaggcc gcccgcctcc gcgaccacct cgagacctac 1440 ccgtcccagt gcctcggcga cgtcgctttc tccctcgcca ctacgcgctc cgccatggag 1500 caccgcctcg ccgtcgccgc cacatcccgt gagggcctcc gcgctgccct cgacgctgcc 1560 gcccagggtc agacctcccc gggcgccgtc aggtccatcg ccgactcctc caggggcaag 1620 cttgccttcc tcttcaccgg ccagggtgcc cagacgctcg gcatgggccg cggcctctac 1680 gacgtctggt ccgccttccg cgaggccttc gacctctgcg tccgcctctt caaccaggag 1740 ctcgaccgcc cgctccgcga ggtcatgtgg gccgagccgg cctccgtcga cgccgccctc 1800 ctcgaccaga ccgccttcac ccagccggcc ctgttcacct tcgagtacgc gctcgcggcc 1860 ctctggcgct cctggggggt cgagccggag ctcgtcgccg ggcactccat cggcgagctc 1920 gtcgccgcct gcgtcgccgg cgtcttctcc ctcgaggacg ccgtcttcct cgtcgccgcc 1980 cgcggtcgtc tcatgcaggc cctcccggcc ggcggcgcga tggtctccat cgaggccccg 2040 gaggccgacg tcgccgccgc cgtcgcgccg cacgccgcgt ccgtctccat cgccgccgtc 2100 aacgccccgg accaggtcgt catcgccggc gccggccagc cggtccacgc aatcgccgcc 2160 gccatggccg cccgcggggc ccgcaccaag gccctccacg tcagccacgc cttccactcc 2220 ccgctcatgg ccccgatgct cgaggccttc ggccgcgtcg ccgagtccgt ctcctaccgc 2280 cgcccgagca tcgtcctcgt ctccaacctc tccgggaagg cctgtaccga cgaggtctcc 2340 tccccgggat actgggtccg ccacgcccgc gaggtcgtac gcttcgccga tggagtcaag 2400 gccctccacg ccgcaggcgc cggcaccttc gtcgaggtcg gcccgaagtc caccctcctc 2460 ggtctcgtcc cggcctgcat gcccgacgcc cgtccggccc tcctcgcctc ctcccgcgcc 2520 ggccgcgacg aaccggccac cgtcctcgag gcccttggcg gcctctgggc cgtcggcggc 2580 ctcgtctcct gggccggtct cttcccgtcc ggcggccgcc gcgtcccgct cccgacctac 2640 ccgtggcagc gcgagcgcta ctggatcgac accaaggcgg acgacgccgc ccgcggcgac 2700 cgccgcgccc cgggcgccgg ccacgacgag gtcgaggagg gcggcgccgt ccgtggcggc 2760 gaccgccgct ccgcccgcct cgaccacccg ccgccggaat ccggccgccg cgagaaggtc 2820 gaggccgccg gcgacaggcc gttccgactc gagatcgacg agccgggcgt cctcgaccac 2880 ctcgtcctcc gcgtcaccga acgccgcgcc ccgggcctcg gcgaggttga gatcgccgtc 2940 gacgccgcgg gcctctcctt caacgacgtg cagctcgccc tcggcatggt cccggacgac 3000 ctcccgggca agccgaaccc gccgctcctc ctcggcgggg agtgcgccgg ccgcatcgtc 3060 gccgtcggcg agggcgtcaa cggcctcgtc gtcggccagc cggtcatcgc actctccgcc 3120 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atcgaggtcg acgtcggcat cctccgcaag 300 gaggcgcgcc cgggcgccct ctccgccctc ggcgccatcg cccccccgct cgccgcgggc 360 gcagcgttct cggccctcgt cctcgaccgc cccctcccgt ccggcctctt cctcgggatc 420 gtactctccg tcaccgccgt ctccgtcatc gccaaggtcc tcatcgagcg cgagtccatg 480 cgccgctcct acgcccaggt gaccctcgcc gcgggcgtcg tctccgaggt cgccgcctgg 540 gtcctcgtcg ccatgacctc cagctcctac ggggcctccc cggccctcgc cgtcgcccgc 600 tccgccctcc tcgcctccgg cttcctcctc ttcatggtcc tcgtcggtcg ccgcctcacg 660 cacctggcca tgcgctgggt cgccgacgcc acccgcgtct ccaagggcca ggtctccctc 720 gtcctcgtcc tcacgttcct cgccgccgcc ctcacccagc gcctcggtct ccacccgctg 780 ctcggggcct tcgccctcgg ggtcctcctc aactccgcac cgcgcaccaa ccgcccgctc 840 ctcgacggcg tccagaccct cgtggccggt ctcttcgccc ccgtcttctt cgtgctcgcc 900 ggaatgaggg tcgacgtcag ccagctccgc acgccggccg cctggggcac cgtcgccctc 960 ctcctcgcca ccgccaccgc cgccaaggtc gtcccggccg ccctcggcgc ccgtctcggc 1020 ggcctccgcg gctcggaggc cgccctcgtg gccgtcggtc tcaacatgaa gggcggcacc 1080 gacctcatcg tcgcgatcgt cggagtcgag ctcggcctcc tctccaacga ggcctacacc 1140 atgtacgccg tcgtcgccct cgtcaccgtc accgcctccc ccgcccttct catctggctc 1200 gagaagcgcg ccccgcccac ccaggaagag tccgcccgcc tcgagcgcga ggaggccgcc 1260 cggcgcgctt acatcccggg cgtcgagcgc atcctcgtcc ccatcgtcgc ccacgccctc 1320 ccggggttcg ccacggacat cgtcgagtcc atcgtcgcct ccaagcggaa gctcggggag 1380 accgtcgaca tcaccgagct ctccgtcgag cagcaggccc cgggcccgtc ccgcgccgcc 1440 ggcgaggcct cccgcggcct cgccaggctc ggcgcccggc tccgcgtcgg catctggcgc 1500 cagcgccgcg agctccgtgg ctccatccag gccatcctcc gtgcgtcccg cgaccacgac 1560 ctcctcgtca tcggcgcccg ctccccggcc cgcgcccgtg gcatgtcctt cggccgcctg 1620 caggacgcca tcgtccagcg cgccgaaagc aacgtcctcg tcgtcgtcgg cgacccgccg 1680 gccgccgagc gcgcgtccgc ccgccgcatc ctcgtcccga tcatcggcct cgagtacagc 1740 ttcgccgccg ccgacctcgc cgcccacgtc gccctcgcct gggacgcgga gctcgtcctc 1800 ctctcctccg cccagacgga cccgggcgcc gtcgtctggc gcgaccggga gccgtcgcgc 1860 gtccgcgccg tggcgcgttc cgtcgtcgac gaggccgtct tccgcggtcg ccgcctcggc 1920 gtccgcgtct ccagccgagt ccacgtcggc gcccacccgt ccgacgagat cacccgcgag 1980 ctcgcccgcg cgccctacga cttgctcgtc ctcggctgct acgaccacgg ccccctcggc 2040 cgcctctacc tcggatccac cgtcgaatcc gtagtcgtcc gctcccgcgt cccggtggcc 2100 ctcctcgtgg cccacggtgg cacccgcgag caggtccgct ga 2142 <210> 10 <211> 918 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Codon Optimized DNA of Sorangium cellulosum for Expression in Streptomyces venezuelae <400> 10 atggagaagg agtcgcgcat cgccatctac ggcgccatcg ccgccaacgt cgccatcgcc 60 gccgtcaagt tcatcgccgc ggccgtcacg ggctcgtcgg cgatgctcag cgagggcgtc 120 cactccctcg tggacaccgc cgacggcctc ctcctcctcc tcggcaagca ccgcagcgcg 180 cgcccgccgg acgccgagca ccccttcggc cacggcaagg agctctactt ctggaccctc 240 atcgtggcca tcatgatctt cgcggccggc ggcggcgtct ccatctacga gggcatcctc 300 cacctcctcc acccccggca gatcgaggac ccgacctgga actacgtcgt cctcggggcc 360 gcagcggtgt tcgaaggcac ctccctgatc atctccatcc acgagttcaa gaagaaggac 420 gggcagggct acctcgcggc catgcgctcc agcaaggacc ccaccacctt cacgatcgtc 480 ctcgaggaca gcgccgcgct ggccggcctc acgatcgcgt tcctcggcgt ctggctcgga 540 caccgcctcg gcaacccgta cctggacggc gccgcgtcca tcggcatcgg gctcgtcctc 600 gccgcggtgg ccgtcttcct cgcctcccag tcccgcggcc tgctcgtcgg cgagtccgcc 660 gaccgggagc tcctcgccgc catccgcgcc ctggcctccg cggacccggg cgtgtccgcc 720 gtggggcgcc cgctcaccat gcacttcggc ccgcacgagg tcctcgtcgt gctccggatc 780 gagttcgacg cggcgctcac cgcctccggc gtggccgagg ccatcgagcg tatcgagacc 840 cgcatccggt ccgagcgccc cgacgtcaag cacatctacg tcgaggcgcg ctccctccac 900 cagcgcgccc gcgcgtga 918 <210> 11 <211> 207 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 11 actttcaatt tttccgaggg gggcttggtc tctggttcct caggaagcct gatcgggacg 60 agctaattcc catccatttt tttgaggctc tgctcaaagg gattagatcg agtgagacag 120 ttcttttgca gtgcgcgaag aacctgggcc tcgaccggag gacgatcgac gtccgcgagc 180 gggtcagccg ctgaggatgt gcccgtc 207 <210> 12 <211> 146 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 12 gagcgccgaa caaaaccagg ccgagcgggc cgatgagccg caagcccgcc tgcgtcaccc 60 tgggactcat ctgatctgat cgcgggtacg cgtcgcgggt gtgcgcgttg agccgtgttg 120 ttcgaacgct gaggaacggt gagctc 146 <210> 13 <211> 4 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 13 ttgc 4 <210> 14 <211> 183 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 14 cggtggcagc gctgagtgcg catctggctt ctcatgtcgt ctctacgggg gatggggaat 60 ccgcgcgccc gccggataca gggagcgtgg ctccaacgac ccacgaagtc gcttcgctcg 120 acgaagacgg gttgttcgcg ttgattgatg agtcactcgc gcgcgcggga aagaggtgat 180 tgc 183 <210> 15 <211> 83 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 15 cctgcccgac accaccggca ccaccggcac caccagcccc cctcacacac ggaacacgga 60 acggacaggc gagaacggga gcc 83 <210> 16 <211> 102 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 16 cccgaccgcg gtcctgcccc acgcgccgca ccccgcgcat cccgcgcacc acccgccccc 60 acacgcccac aaccccatcc acgagcggaa gaccacaccc ag 102 <210> 17 <211> 68 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 17 gcgccggccg tcgccgaggc cgtcctctcc tggctcgacg ccatcgaggg catcgagggg 60 gcgggcaa 68 <210> 18 <211> 147 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 18 gacaccgggg ccccggtccg cccggccccc cttcggacgg accggacggc tcggaccacg 60 gggacggctc agaccgtccc gtgtgtcccc gtccggctcc cgtccgcccc atcccgcccc 120 tccaccggca aggaaggaca cgacgcc 147 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 19 gcaccgccca agaccccccg gggcgggacg tcccgggtgc accaagcaaa gagagagaaa 60 cgaacc 66 <210> 20 <211> 75 <212> DNA <213> Sorangium cellulosum <400> 20 aagcggcggt gcccgccacc cgggagggtg gcgggcaccg ctttttcggc ctgctgggtc 60 taccggacca cctga 75 <210> 21 <211> 104 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 21 tccctgccgc acggtcgcct cccgccccgg accccgtccc gggcacctcg actcgaatca 60 cttcatgcgc gcctcgggcg cctccaggaa ctcaagggga cagc 104 <210> 22 <211> 108 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 22 cgtgacgccg tgaaagcggc ggtgcccgcc acccgggagg gtggcgggca ccgctttttc 60 ggcctgctgg gtctaccgga ccacctgacc tgcaggaaac ttaagaaa 108 <210> 23 <211> 83 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 23 cctgcccgac accaccggca ccaccggcac caccagcccc cctcacacac ggaacacgga 60 acggacaggc gagaacggga gcc 83 <210> 24 <211> 102 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 24 cccgaccgcg gtcctgcccc acgcgccgca ccccgcgcat cccgcgcacc acccgccccc 60 acacgcccac aaccccatcc acgagcggaa gaccacaccc ag 102 <210> 25 <211> 68 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 25 gcgccggccg tcgccgaggc cgtcctctcc tggctcgacg ccatcgaggg catcgagggg 60 gcgggcaa 68 <210> 26 <211> 147 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 26 gacaccgggg ccccggtccg cccggccccc cttcggacgg accggacggc tcggaccacg 60 gggacggctc agaccgtccc gtgtgtcccc gtccggctcc cgtccgcccc atcccgcccc 120 tccaccggca aggaaggaca cgacgcc 147 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 27 gcaccgccca agaccccccg gggcgggacg tcccgggtgc accaagcaaa gagagagaaa 60 cgaacc 66 <210> 28 <211> 101 <212> DNA <213> Streptomyces venezuelae <400> 28 cgccgtgaaa gcggcggtgc ccgccacccg ggagggtggc gggcaccgct ttttcggcct 60 gctgggtcta ccggaccacc tgagctagca aatctagaaa a 101

Claims (20)

  1. 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)와, 소란지움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum)에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트로서, 상기 유전자간 영역은 epoA 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 11), epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 12), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 13)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나 이상인, 에포틸론 발현 카세트.
  2. 삭제
  3. 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 소란지움 셀룰로섬(Sorangium cellulosum)에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트로서, 상기 유전자간 영역은 epoD 유전자의 업스트림에 위치하는 영역(서열번호 14), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 15), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 16), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 17), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치는 영역(서열번호 18), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 19), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 20)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나 이상인, 에포틸론 발현 카세트.
  4. 삭제
  5. 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신(pikromycin) 또는 데소사민(desosamin) 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트로서, 상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), 및 epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나 이상인, 에포틸론 발현 카세트.
  6. 삭제
  7. 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신(pikromycin) 또는 데소사민(desosamin) 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트로서, 상기 유전자간 영역은 epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나 이상인, 에포틸론 발현 카세트.
  8. 삭제
  9. 스트렙토마이시스 베네주엘래(Streptomyces venezuelae)에 코돈 최적화된 에포틸론 생합성 유전자인 epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), epoC(서열번호 4), epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)와, 스트렙토마이시스 베네주엘래의 피크로마이신(pikromycin) 또는 데소사민(desosamin) 생합성 유전자 집단에서 유래한 유전자간 영역(intergenic region)을 포함하는 에포틸론 발현 카세트로서, 상기 유전자간 영역은 epoP와 epoB 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 21), epoC 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 22), epoD와 epoE 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 23), epoE와 epoF 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 24), epoF와 orf6 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 25), orf6과 orf3 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 26), orf3과 orf14 유전자 사이에 위치하는 영역(서열번호 27), 및 orf14 유전자의 다운스트림에 위치하는 영역(서열번호 28)을 포함하는 군에서 이루어진 어느 하나 이상인, 에포틸론 발현 카세트.
  10. 삭제
  11. 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는, 에포틸론 발현용 벡터.
  12. pDHS702, pDHS618, pSBAC, 및 pSET152로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 벡터에 제1항, 제3항, 제5항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는, 에포틸론 발현용 벡터.
  13. 제11항에 따른 에포틸론 발현용 벡터가 하나 이상 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론 A, B, C, 및 D을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 에포틸론의 제조방법.
  14. epoA(서열번호 1), epoP(서열번호 2), epoB(서열번호 3), 및 epoC(서열번호 4)를 포함하는 제1항, 및 제5항 중 어느 한 항에 따른 제1 발현 카세트, 및 epoD(서열번호 5), epoE(서열번호 6), epoF(서열번호 7), orf6(서열번호 8), orf3(서열번호 9), 및 orf14(서열번호 10)를 포함하는 제3항, 제7항, 및 제9항 중 어느 한 항에 따른 제2 발현 카세트를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 발현 카세트를 포함하는 에포틸론 발현용 벡터가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론 A, B, C, 및 D을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 에포틸론의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 발현 카세트는 pDHS702, pDHS618, pSBAC, 및 pSET152로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 벡터에 합성된 것인, 에포틸론의 제조방법.
  16. (a) pDHS702 벡터에 제1항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pDHS702-optSoC_APBC_Sv;
    (b) pDHS618 벡터에 제3항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pDHS618-optSoC_DEF_Sv;
    (c) pDHS702 벡터에 제5항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pDHS702-optPD_APBC_Sv;
    (d) pDHS618 벡터에 제7항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pDHS618-optPD_DEF_Sv;
    (e) pSBAC 벡터에 제1항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pSBAC-optSoC_APBC_Sv;
    (f) pSBAC 벡터에 제3항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pSBAC-optSoC_DEF_Sv;
    (g) pSBAC 벡터에 제5항 및 제7항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pSBAC-optPD_APBCDEF_Sv;
    (h) pSET152 벡터에 제3항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pSET152-optSoC_DEF_Sv; 및
    (i) pSET152 벡터에 제7항에 따른 에포틸론 발현 카세트를 포함하는 pSET152-optPD_DEF_Sv를 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 벡터가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론 A, B, C, 및 D을 포함하는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 에포틸론의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 벡터 pDHS702-optSoC_APBC_Sv 및 pDHS618-optSoC_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론의 제조방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 벡터 pDHS702-optPD_APBC_Sv 및 pDHS618-optPD_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론의 제조방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 벡터 pSBAC-optSoC_APBC_Sv 및 pSBAC-optSoC_DEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론의 제조방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 벡터 pSBAC-optSoC_APBCDEF_Sv가 도입된 스트렙토마이시스 베네주엘래를 배양하는 단계를 포함하는, 에포틸론의 제조방법.
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