CN1546665A - 一种野生稻抗稻瘟病抗性相关基因、蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种野生稻抗稻瘟病相关基因、蛋白及其用途。同时公开了OsBTB基因的开放读码框序列。这些序列具有SEQ ID NO.1～4所示的多核苷酸序列。这些cDNA片段与水稻抗稻瘟病抗性紧密相关。本发明还提供含有编码OsBTB基因的多核苷酸的重组载体和基因工程化宿主细胞，提供克隆OsBTB基因的方法，提供OsBTB基因的染色体定位。OsBTB基因在亲本中以1～2拷贝存在，位于第2号染色体，且在中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46的F8重组自交系群体亲本的一个公共标记RZ324附近。本发明的多核苷酸和/或蛋白或多肽可作为探针分子，用于诊断抗病和/或感病或其他由于OsBTB基因表达异常所引起的抗病性或感病性。利用本发明分离的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因而培育出的水稻新品种可以抵御稻瘟病菌的侵染。

Description

一种野生稻抗稻瘟病抗性相关基因、蛋白及其用途

                               技术领域

本发明为生物技术领域，尤其涉及一种野生稻抗稻瘟病抗性相关基因、蛋白及其用途。

                               背景技术

稻瘟病是水稻三大病害之一，分布广、危害大。目前国内外的研究重点主要集中在抗病相关基因的鉴定和克隆上，迄今已定位的稻瘟病抗性基因(Pi系列)达20多个，现已克隆了Pi-ta(Bryan G T.et al.2000)。与此同时，通过传统的育种手段和现代转基因技术也培育出了一些抗瘟性水稻新品种。由于抗瘟品种的单一化和稻瘟病菌生理小种的复杂性和较快的变异性，一般应用3-5年后就会产生能侵染该品种的优势小种，造成水稻品种抗性的丧失。培育高效广谱的水稻抗瘟新品种是亟待解决的问题，关键之一在于对水稻和病原菌互作机制的深入了解和对抗瘟性基因的功能进一步研究。植物与病原互作过程一般涉及病原菌与宿主的相互识别、信号传导、植物抗性基因激活等一系列的生理生化反应，从水稻基因群体的角度进行研究可以对水稻抗瘟机制的整个过程得以了解。基因芯片技术的出现为从群体水平探索基因表达差异提供了良好的实验平台。通过分析基因表达谱可以检测整个基因组范围的众多基因表达水平的变化，获得基因的差异表达信息，同时还可以用聚类分析算法研究在功能或表达调控上具有相关性的基因，最终为研究基因功能和基因遗传网络提供有力手段。

如何解析特异基因的时空性表达及其基因网络的调控机制，是生物学中的核心问题。在该表达调控过程中，转录因子起非常主要的作用。这些转录因子的蛋白结构是模块式的，通常是根据DNA结合结构域的结构对其进行分类。锌指模块是DNA结合结构域的一种类型(Albagli，O.，P.，et al 1995)。其中C₂H₂锌指是DNA结合结构域最典型的代表之一。人类基因组中编码C₂H₂模块的基因约有600-700个(Bellefroid，E.J.，et al.1991，Venter，J.C.，et al.2001)。锌指转录因子的C₂H₂类中，锌指元件常伴随着各种结构模块。这些结构模块通过控制转录因子与其它细胞组分进行选择性的结合，进而调节亚细胞定位、DNA结合和基因表达。在C₂H₂类锌指转录因子中，这些结构模块包括痘病毒锌指结构域(poxvirus and zinc fingerdomain，(POZ))(Bardwell，V.J.，et al. 1994)，如已知的BTB结构域(Broad-Complex，Tramtrack，and Bric-a-brac)，Kruppel关联盒(Kruppel-associated box(KRAB))(Bellefroid，E.J.，et al.1991)和SCAN结构域(Williams，A.J.，et al.1995)。

BTB/POZ结构域是一个进化保守的蛋白—蛋白相互作用结构域，在许多转录因子的N末端区域。这些结构域表现出能与其它蛋白互作并产生同源或异源二聚体的能力(Bardwell andTreisman，1994；Igarashi et al.，1998)。而且，绝大多数含有BTB/POZ结构域的蛋白通常还包括其它的结构域，如锌指结构域、b-ZIP结构域、kelch重复、MATH结构域或锚蛋白重复序列(ankyrin repeats)(Aravind and Koonin，1999)。这些结构域通过相互协同作用，从而达到行使生物学功能的目的。BTB/POZ结构域的例子从酵母到人类的有机体中得到了证实。

拥有BTB/POZ结构域的蛋白其功能涉及到转录调节、细胞骨架组织、染色质的改变和人类癌症、发育和钾离子通道的四聚化结构域等(Albagli et al.，1995；Aravind and Koonin，1999，Sophie Deltour，et al.2001，Patrick M.et al.2000)。

目前，植物中发现的含有BTB/POZ结构域的已知功能的蛋白数量相当少，如NPR-1基因、RPT2/NPH3基因家族，且都是在拟南芥中发现的。RPT2基因是一个光诱导的、编码蛋白，有593个氨基酸残基，分子量为65.8kD，有四个外显子。该蛋白拥有推测的磷酸化位点，一个核定位信号、一个BTB/POZ结构域和一个卷曲螺旋结构域(coiled-coil domain)，属于一个大基因家族。该家族还包括NPH3基因。RPT2/NPH3拥有一个BTB/POZ结构域和一个卷曲螺旋结构域，都参与了调节拟南芥的向光性反应(Tatsuya S.et al，2000)，但目前尚未弄清RPT2相互作用机制。

在植物中，拟南芥的NPR-1是目前发现的唯一一个拥有BTB/POZ结构域且参与植物抗病的基因，该基因包含一个BTB/POZ结构域和锚蛋白重复序列，是对病原反应的主要调节子(Caoet al.，1997)。另外，NPR-1还能与含有b-ZIP结构域的转录调节子(Zhang et al.，1999)和核蛋白SNI进行蛋白—蛋白互作(Li et al.，1999)，这表明是一个转录调节子诱导了系统获得抗性(SAR)。NPR-1基因定位于核中(Després C，et al.2000，Kinkema M，et al.2000)，NPR-1通过与转录因子的物理相互作用进而调节PR基因的表达。NPR-1含有蛋白—蛋白互作结构域。用酵母双杂交扫描发现，NPR-1结合了TGA转录因子家族(Després C，et al.2000，Zhang YL，et al.1999，Zhou JM，et al.2000)。TGA转录因子在早期的转录研究中就证实能调控SA诱导的基因表达(Jupin I，et al.1996，Lebel E，et al.1998)。一个TGA结合到启动子元件as-1呈现出SA诱导的PR-1基因表达，说明TGAs可能是转录激活子。NPR-1增强了TGA-因子结合到as-1元件上(Després C，et al.2000，Xinnian Dong，2001)。因此，对水稻中含有BTB结构域的基因进行研究，有助于了解水稻的抗病网路以及机制，同时也对作物育种提供了理论和实践指导。

以稻瘟病菌(M.grisea)处理水稻近等基因系抗病品种(H7R)和感病品种(H7S)的叶片抽提的mRNA为探针，与含有1106条独立的cDNA芯片杂交(来自稻瘟病菌诱导的水稻叶cDNA文库、茎cDNA文库和胚乳cDNA文库)，获得一批明显上调的基因，并选出十个功能未知的基因进行生物信息学分析，发现一个基因含有BTB结构域，Northern印迹杂交实验证实该基因的表达受稻瘟病菌的诱导；Southern印迹杂交实验证实该基因来源于野生稻基因组且以单拷贝形式存在。应用M-EST阵列、cDNA末端快速扩增(RACE)和RT-PCR等方法最终获得了OsBTB基因的全长序列并命名，且确定了该基因的完整开放读码框架(ORF)。运用中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46的F8重组自交系群体的亲本为材料，对OsBTB基因进行RFLP进行多态性分析，发现OsBTB基因在亲本中以1～2拷贝存在，位于第2号染色体，且在两个重组自交系群体的一个公共标记RZ324附近。

如上所述的OsBTB基因经Northern印迹杂交验证在抗性水稻品系中的诱导表达明显强于感病品系中的表达，说明cDNA片段与水稻抗稻瘟病病紧密相关；在水稻基因组中以单拷贝的形式存在。OsBTB基因的获得对研究确定OsBTB基因的作用机理、信号转导、抗病性等方面提供了基础，因此分离该基因具有非常重要的意义。

                               发明内容

本发明的一个目的是提供一种野生稻抗稻瘟病抗性相关基因；

本发明的另一个目的是提供OsBTB基因编码的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因多肽——OsBTB基因多肽以及其生物活性片段、或其活性类似物、或其活性衍生物。

本发明的另一个目的是提供含有编码OsBTB基因的用途。

本发明的另一个目的是提供含有编码OSBTB基因的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供含有编码OSBTB基因的多核苷酸的重组载体。

本发明的另一个目的是提供了一种探针分子。

一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因是运用重组载体和基因工程化宿主细胞，通过应用模块表达序列标签阵列、互补脱氧核糖核酸末端快速扩增、聚合酶链式反应和反转录聚合酶链式反应、分子杂交方法获得的、存在交替剪接现象的、且已于染色体上定位的具有SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。

所说的已于染色体上定位，是野生稻抗稻瘟病抗性相关基因定位于第2号染色体，且定位在中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46的F8重组自交系群体亲本的一个公共标记RZ324附近。

一种分离的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因的多肽具有SEQ ID No.3氨基酸序列的多肽、其保守性变体、或其生物活性片段，或其活性类似物、或其活性衍生物。

一种重组载体含有权利要求1所述的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因，它包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒。

一种基因工程化宿主细胞是用权利要求5所述的重组载体转化的基因工程化宿主细胞，它包括原核细胞、低等真核细胞、高等真核细胞。

一种探针分子，它含有权利要求1或2所述的水稻抗白叶枯抗性相关基因的多核苷酸序列分子中8～100个连续核苷酸的序列。

所说的多核苷酸序列包括SEQ ID No.1～7所示的序列、其互补序列、多核苷酸序列变体、抑制水稻抗白叶枯抗性相关基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。

多核苷酸序列变体是指一种或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。

一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因的用途是用于水稻抵御稻瘟病菌的侵染。

本发明的优点是：1)利用本发明分离的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因而培育出的水稻可以抵御稻瘟病菌的侵染，从而在农业领域加以推广，进而减少过度使用农药而造成对环境的危害。2)利用本发明分离的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因多肽、或其保守性变体、或其生物活性片段、或其衍生物，进行单克隆抗体或多克隆抗体的制备，可以广泛运用于分子生物学领域。例如，运用免疫组织化学对目的基因进行细胞定位，运用western blot对目的基因进行确认，另外，还可以运用所获得的抗体进行蛋白芯片的制备，也可以用获得的抗体作为抗原进行二级免疫，获得二级抗体。3)本发明的多核苷酸和/或多肽可作为探针分子，用于诊断抗病和/或感病或其他由于OsBTB表达异常所引起的抗病性或感病性。

                           附图说明

图1.pCAMBIA-OsBTB正义和反义植物表达载体的构建图谱；

图2.转化农杆菌后pCAMBIA-OsBTB正义和反义质粒的EcoR I酶切鉴定图谱，图中左起第一泳道为标记分子，第二和第四泳道分别为未酶切的正义和反义的pCAMBIA-OsBTB表达载体，第三和第五泳道分别为EcoR I酶切的正义和反义的pCAMBIA-OsBTB表达载体；

图3.转OsBTB基因后所得到的分化的抗性愈伤组织图谱；

图4.转化农杆菌后pCAMBIA-OsBTB正义和反义植株的EcoR I酶切鉴定图谱，图中左起第一泳道为标记分子，第二和第三泳道分别为EcoR I酶切的正义的pCAMBIA-OsBTB表达载体，第四和第五泳道分别为EcoR I酶切的反义的pCAMBIA-OsBTB表达载体；

图5.获得的OsBTB基因蛋白电泳图谱，第一泳道为空载体pET28a的阴性对照；第二泳道为连接有OsBTB的pET28a载体的样品；第三泳道为中等分子量的蛋白标记分子；

图6.获得的转OsBTB基因的植株的抗病性鉴定图谱。图中，左一为高抗植株，左二为中抗植株，右二为低抗植株，右一为对照植株。

                             具体实施方式

本发明涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体：

(a)具有SEQ ID NO.1的1～1974位的序列；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸序列；

(c)与(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少70％同源性的多核苷酸；

(d)与(a)或(b)的多核苷酸序列中8～100个连续核苷酸为探针的序列。

本发明还涉及分离的多肽，该多肽是水稻源的，它包含：具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、或其生物活性片段、或其衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ IDNO.3氨基酸序列的多肽。

本发明另外涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。

蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种或多个核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

“缺失”是指在氨基酸或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或核苷酸的缺失。

“插入”或“添加”是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个氨基酸或核苷酸的增加。“替换”是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或核苷酸。

“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。

“调节”是指OsBTB具有的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及OsBTB编码蛋白的任何其他生物学性质、功能的改变。

“基本上纯”是指基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsBTB基因编码的多肽。基本上纯的OsBTB基因编码的多肽在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。OsBTB基因编码的多肽的纯度可用氨基酸序列分析。

“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。

“相同性百分率”是指在两种或多种核酸序列比较中序列相同或相似的百分率。可用电子方法测定相同性百分率。

“相似性”是指氨基酸序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基的相同或保护性取代的程度。

“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。

“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性。

“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸如从天然状态中同存在的其他物质分开，则为分离纯化的。

“分离的OsBTB基因编码的多肽”是指OsBTB基因编码的多肽基本上不含天然与其相关的其他蛋白、脂类、糖类或其他物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化OsBTB基因编码的多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺上能产生单一的主带。OsBTB基因编码的多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明提供了一种新的多肽——OsBTB基因编码的多肽，基本上是由SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括OsBTB基因编码的多肽的生物活性片段、或其活性类似物、或其活性衍生物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的OsBTB基因编码的多肽相同的生物学功能或活性多肽。本发明多肽的生物活性片段、或其衍生物或其活性类似物可以是：(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸参加(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基的某个基团或其他基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。

本发明提供了分离的核酸(多核苷酸)，基本由编码具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从野生稻的cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为1974个碱基，其开放读码框为1674个碱基，通过Southern杂交证实抗性水稻品系中的诱导表达明显强于感病品系中的表达，推测这些cDNA片段与水稻抗稻瘟病紧密相关，具有抗稻瘟病菌的功能。OsBTB基因的全长DNA序列如SEQ ID NO.4所示，包含6个外显子和5个内含子。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.1所示的编码区序列相同或是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.3的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO.1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.3的成熟多肽的多核苷酸包括：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位病原体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实际上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸(两个序列之间具有至少50％，优选具有70％的相同性)。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC、0.1％SDS、60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(V/V)甲酰胺、0.1％小牛血清/0.1％Ficoll、42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好在97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与以上所述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，“核酸片段”的长度至少含8个核苷酸，较好是至少20～30个核苷酸，更好是至少50～60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码OsBTB基因的多核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的编码OsBTB基因的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术但不局限于：(1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，和(2)表达文库的抗体筛选出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段。

本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)：(1)DNA-RNA或DNA-DNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定OsBTB的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用OsBTB基因的编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

本发明中，编码OsBTB基因的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码OsBTB基因的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列强会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用地二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌地四环素或氨苄青霉素抗性等。

本领域技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。

本发明中，编码OsBTB基因的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS、Bowes黑素瘤细胞等。

通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的OsBTB多肽(Science，1984；224：1431)。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的OsBTB的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明OsBTB基因产生的转录本及其编码的多肽可直接用于研究在生物体内的作用机制、编码蛋白对生物生理生化的影响、寄主与宿主的互作和抗病性的研究等

本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。

编码OsBTB基因的多核苷酸可用于植物的疾病诊断。编码OsBTB基因的多核苷酸可用于OsBTB基因的表达与否。如编码OsBTB基因的DNA序列可用于杂交以判断OsBTB基因的表达情况。杂交技术包括Southern印迹法和Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达和基因克隆。用OsBTB基因特异引物进行RNA-聚合酶链式反应(RT-PCR)体外扩增也可检测OsBTB基因的转录产物。

检测OsBTB基因的突变也可用于研究OsBTB基因异常功能相关的疾病。OsBTB基因突变形式包括与正常野生型OsBTB基因DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其他任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、Northern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外。突变有可能影响蛋白的表达，因此用Southern印迹法和Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条水稻染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与抗稻瘟病病以及植物的生殖发育过程相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。本发明的研究发现运用中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46的F8重组自交系群体的亲本为材料，对OsBTB基因进行RFLP进行多态性分析，OsBTB基因在亲本中以1～2拷贝存在，位于第2号染色体，且在两个重组自交系群体的一个公共标记RZ324附近。

本发明的编码OsBTB基因的多核苷酸序列的染色体定位可以有多种方法，例如体细胞杂合细胞的PCR定位法、原位杂交、RFLP法和荧光原位杂交(FISH)法等。

简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15～35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条水稻染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的水稻基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其他类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA文库。

将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。此技术的综述，参见Verma等，Human Chromosomes：Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。

比较抗病与感病个体间的cDNA和基因组序列的差异，通常涉及首先寻找染色体中结构的变化，如从染色体水平可见的或用基于cDNA序列的PCR可检测的缺失或易位。根据目前的物理图谱和基因定位技术的分辨能力，被精确定位至与抗病有关的染色体区域的cDNA，可以是50至500个潜在抗病基因间之一种(假定1兆碱基作图分辨能力和每20kb对应于一个基因)。

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所介定的本发明范围。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 OsBTB基因的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取水稻总RNA。用Quick mRNA Isolation Kit(Qiagene)从总RNA种分离poly(A+)mRNA。2μg poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(Clontech)将cDNA片段定向插入到pBS SK(+)载体(Clontech)的多克隆位点上，转化DH-5α感受态细胞，形成cDNA文库。用Dye terminate cycle reaction sequencingkit(promega，U.S.A.)和Megabase1000测序仪测定所有克隆的5’和3’末端的序列。将测定的cDNA序列与Genbank数据库比较，结果发现其中一个克隆的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，该克隆所含的全长cDNA为1991bp(SEQ ID NO.1)。经进一步的研究发现，该全长DNA序列为2661bp(SEQ IDNO.3)，包含7个外显子和6个内含子(附图)。

实施例2用RT-PCR方法克隆编码OsBTB多肽的OsBTB基因

用稻瘟病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)处理水稻抗病品种(IR26)和感病品种(金刚30)愈伤组织，分别提取总RNA(严格按照Trizol^试剂盒说明书要求操作)作为逆转录反应的模板，按照下列体系进行逆转录反应合成cDNA：

引物分别为：

Primer1：5’-ATGGCCGGGAGCGAGGCGGCGTTTTTTTTTTTTTTT-3′(3′    (反转录用))；

Primer2：5′-GGCCTCGAGTCAGACAGTGGGTTGCTTTAT-3′(5′    (反转录用))

Primer3：5′-GGCCTCGAGTCAGACAGTGGGTTGCTTTAT-3′(3′    (扩增用))

Primer4：5′-CTAGCTAGCATGGCCGGGAGCGAGGCGGCG-3′(5′    (扩增用))

流程为100ng/μl的3′5′2.5μl，RNA 5μl(约200ng)，5μl DEPC-H2O混合后70℃水浴5min，冰浴5min；加入5×RT缓冲液6μl，0.1 mol/L DTT 3μl，20nmol/LdNTPs 3μl，2μl MMLV(200U/μl)，RNasin 1μl，总体积50μl。42℃温浴2小时。65℃灭活。稀释50倍后取5μl作模板进行PCR扩增。

扩增反应的条件：50μl的反应体系中含有50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，20mmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Tag DNA聚合酶(Clontech)。在HybaidPCR仪上按照下列程序进行反应：94℃，4min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，2min；36cycles。

在RT-PCR时同时设定-actin为阳性对照和模板为阴性对照。扩增产物用试剂盒纯化(Qiagene，Germany)，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrongen，U.S.A.)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO.2所示的1~1674完全相同。

实施例3 Northern印迹法分析OsBTB基因的表达

用一步法提取总RNA(Anal.Biochem.1987，162.156-159)。该法包括酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸取水相，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀，将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为PCR扩增的OsBTB编码区序列。将32P-标记的探针与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(Ph7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。

实施例4 OsBTB多肽的体外表达、分离和纯化

   根据SEQ ID NO.3所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下：

Primer5：  5’-CTA GCT AGC ATG GAT GAG GAA ATT TCC GTA-3’

Primer6：  5’-GGC CTC GAG TCA AGC AAC TGA ATG GTC AAA-3’

此两段引物的5’端分别含有Nhe I和Xho I酶切位点，其后分别为目的基因的5’和3’的编码序列，Nhe I和Xho I酶切位点相应于载体质粒pET-28b(+)(Novagen)上的选择性内切酶位点。以含有全长OsBTB基因的质粒克隆为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为：总体积50μl中含有质粒模板10pg、引物分别为10pmol、Advantage polymerase mix(Clontech)1μl。94℃，4min；94℃，20sec；60℃，30sec；72℃，2min；36cycles。

用Nhe I和Xho I分别对扩增产物和质粒pET-28b(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆菌DH-5α，在含卡那霉素(终浓度100μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(OsBTB基因的质粒克隆)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养中，宿主菌BL21(OSBTB基因的质粒克隆)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind QuickCartridge(Novagen)进行层析，得到了纯化的目的OsBTB多肽。经SDS-PAGE电泳，得到一条单一的条带。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO.3所示的N-端15个氨基酸完全相同(图5)。

实施例5本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用

从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途，如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列，进一步还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。

本实施例的目的是从本发明的多核苷酸SEQ ID NO.1中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针，并用滤膜杂交方法鉴定一些组织中是否含有本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列。滤膜杂交方法包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复印方法等，它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。这些相同的步骤是：固定了样品的滤膜首先用不含探针的杂交缓冲液进行预杂交，以使滤膜上样品的非特异性的结合部位被载体和合成的多聚物所饱和。然后预杂交液被含有标记探针的杂交缓冲液替换，并保温使探针与靶核酸杂交。杂交步骤之后，未杂交上的探针被一系列洗膜步骤除掉。本实施例利用较高强度的洗膜条件(如较低盐浓度和较高的温度)，以使杂交背景降低且只保留特异性强的信号。本实施例选用的探针包括两类：第一类探针是完全与本发明的核苷酸SEQID NO.1相同或互补的寡核苷酸片段；第二类探针是部分与本发明的核苷酸SEQ ID NO.1相同或互补的寡核苷酸片段。本实施例选用斑点印迹法将样品固定在滤膜上，在较高强度的洗膜条件下，第一类探针与样品的杂交特异性较强而得以保留。

一、探针的选用

从本发明的多核苷酸SEQ ID NO.1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针，应遵循以下原则和需要考虑的几个方面：1.探针大小优选范围为18-50个核苷酸；2.GC含量为30-70％，超过则非特异性杂交增加；3.探针内部应无互补区域；4.符合以上条件的可作为初选探针，然后进一步作计算机序列分析，包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即SEQ ID NO.1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源性比较，若与非靶分子区域的同源性大于85％或者超过15个连续碱基完全相同，则该初选探针一般就不应该使用；5.初选探针是否最终选定为有实际应用价值的探针还应进一步由实验确定。完成以上各方面的分析后挑选并合成两种探针：探针1，与SEQ ID NO.1的基因片段完全同源或互补；探针2，与SEQ ID NO.1的基因片段或其互补片段的替换突变序列。

与以下具体实验步骤有关的其他未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献：DNA PROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1989年第二版)[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社。

植物基因组DNA的提取：在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液I，60℃水浴预热。水稻幼苗或叶子5~10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30~60min(时间长，DNA产量高)，不时摇动。加20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温静置5~10min，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。室温5000rpm离心5min。仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻棒捞出DNA絮团，干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。若DNA未形成絮状沉淀，则可用5000rpm离心5min，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶于TE，可在60℃水浴置15min以上，以助溶。将DNA溶液3000rpm离心5min，将上清倒入干净的5ml离心管。加5μl RNaseA(10μg/μl)，37℃10min，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤)。加入1/10体积的3mol/L NaAc及2×体积的冰乙醇，混匀，-20℃置20min左右，DNA形成絮状沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，吸水纸吸干。将DNA重溶于1ml TE，-20贮存。取2μl DNA样品在0.7％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取15μl稀释20倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。分装后存放于-20℃。

样膜的制备1)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号，每一探针需两张NC膜，以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和低强度条件洗膜。2)吸取样品及对照各15μl，点于样膜上，在室温中晾干。3)置于浸润有0.1mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl的滤纸上5min(2次)，晾干置于浸润0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/L NaCl的滤纸上5min(2次)，晾干。4)夹于干净滤纸中，以铝箔包好，60-80℃真空干燥2小时。探针的标记1)3μl Probe(0.1OD/10μl)，加入2μl Kinase缓冲液，8-10μCi-32P-dATP+2UKinase，以补加至终体积20μl。2)37℃保温2小时。3)加1/5体积的溴酚蓝指示剂(BPB)。4)过Sephadex G-50柱。5)至少32P-Probe洗出前开始收集第一峰(可用Monitor检测)。6)5滴/管，收集10-15管。7)用液体闪烁仪监测同位素量。8)合并第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。

预杂交将样膜置于塑料袋中，加入3-10mg预杂交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/ml CTDNA(小牛胸腺DNA))，封好袋口后，68℃水浴摇2小时。

杂交将塑料袋剪去一角，加入制备好的探针，封好袋口后，42℃水浴摇过夜。洗膜：

一、高强度洗膜：1)取出已杂交好的样膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30min(2次)，室温晾干。

二、低强度洗膜：1)取出已杂交好的样膜。2)2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。3)0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15min(2次)。4)0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15min(2次)，室温晾干。

实验结果：采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，以上两个探针杂交斑放射性强弱没有明显区别；而采用高强度洗膜条件所进行的杂交实验，探针1的杂交斑放射性强度明显强于另一个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针1定量和定性地分析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。

实施例6 DNA Microarray

基因芯片或基因微阵列(DNA Microarray)是目前许多国家实验室和大制药公司都在着手研制和开发的新技术，它是指将大量的靶基因片段有序地、高密度地排列在玻片、硅片、硝酸纤维素膜等载体上，然后用荧光或同位素检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的、本发明的多核苷酸可作为靶DNA用于基因芯片技术用于高通量研究新基因功能；寻找和筛选组织特异性新基因特别是疾病相关基因；疾病的诊断，如遗传性疾病、其具体方法步骤在文献中已有多种报道，如可参阅文献Derisi，J.L.，Lyer，V.and Brown，P.O.(1997)Science 278，680-686.及文献Helle，R.A.，Schema，M.，Chai，A.，Shalom，D.，(1997)PNAS 94：2150-2155.

(一)点样：各种不同的全长cDNA共计4000条多核苷酸序列作为靶DNA，其中包括本发明的多核苷酸、将它们分别通过PCR进行扩增，纯化所得扩增产物后将其浓度调到500ng/μl左右，用GAC Solution点样仪(购自美国)点于尼龙膜上。将点样后的玻片进行水合、干燥、置于紫外交联仪中交联，洗脱后干燥使DNA固定在尼龙膜上制备成芯片。其具体方法步骤在文献中已有多种报道，本实施例的点样后处理步骤是：1)潮湿环境中水合4分钟；2)0.2％SDS洗涤1分钟；3)ddH2O洗涤两次，每次1分钟；4)NaBH4封闭5分钟；5)95℃水中2分钟；6)0.2％SDS洗涤1分钟；7)ddH2O洗涤两次；8)晾干，25℃储存于暗处备用。

(二)探针标记：用一步法分别从水稻特定的愈伤组织(用稻瘟病菌处理水稻抗病品种(IR26)和感病品种(金刚30))中抽提总mRNA，并用Oligotex mRNA Midi Kit(购自QiaGen公司)纯化mRNA，运用随机引物通过反转录分别将同位素α-33p-CTP(购自Amersham PhamaciaBiotech公司)标记水稻抗病品种(IR26)mRNA和感病品种(金刚30)mRNA，经纯化后制备出探针。具体步骤参照及方法见：Schena，M.，Shalon，D.，Heller，R.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.Vol.93：10614-10619.Schena，M.，Shalon，D.，Davis，R.W.(1995)Science.270.(20)：467-480.

(三)杂交：分别将来自以上两种组织的探针与芯片一起在UniHybTM HybridizationSolution(购自TeleChem公司)杂交液中进行杂交16小时，室温用洗涤液(1×SSC，0.2％SDS)洗涤后用Scanarray3000扫描仪(购自美国General Scanning公司)进行扫描，扫描的图象用Imagene软件(美国Biodiscovery公司)进行数据分析处理，算出每个点的Ratio比值。

实施例7.OsBTB基因的染色体定位

为了进一步了解OsBTB基因在染色体上位置及其在水稻基因组中存在的拷贝数，我们筛选了该基因在三个重组自交系群体亲本间的RFLP多态性，并对该基因在筛选到的重组自交系群体中进行了定位。

材料和方法：选用由中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46；协青早B/密阳46和中156/谷梅2号的F8重组自交系群体的亲本为材料，用于OsBTB基因的RFLP多态性鉴定。由247个株系组成的珍汕97B/密阳46重组自交系群体和210个株系组成的协青早B/密阳46重组自交系群体分别应用于基因定位研究。

RFLP定位：

一、DNA提取、酶解、southern转膜：参照《分子克隆实验方法》(萨姆布鲁克J，1989)方法。以BamH I、Dra I、EcoR I、EcoR V和Hind III五种限制性内切酶分别对三个重组自交系珍汕97B/密阳46、协青早B/密阳46和中156/谷梅2号的5个亲本进行酶解。

二、探针标记与分子杂交及信号检测：用ECL检测系统(Amersham pharmacia Biotech)，参照庄杰云(浙江大学博士论文2001)优化方法。(一)预杂交：将滤膜放入预热到41℃的含有0.5mol/L NaCl和5％封闭试剂的杂交液中，预杂交1h。所有杂交液的用量为每一张10cm×20cm滤膜一般用量为10-15ml。(二)探针标记：用双蒸水稀释探针为10ng/μl，沸水中变性5min，冰浴5min；加入与探针等体积的标记试剂(辣根过氧化物酶)，缓慢混匀；再加入等体积的化学胶联试剂戊二醛溶液，缓慢混匀；37℃保温15min，置于冰上，马上进行杂交。(三)杂交：标记好的探针加入预杂交液中混匀，在41℃下缓慢震荡，杂交过夜。(四)洗膜：将滤膜从杂交液中取出，DNA面朝上，逐张放入洗涤液I(5M尿素、0.5×SSC、0.4％SDS)，于41℃下洗涤2×15min，再用洗涤液II(2×SSC)在室温下洗涤2×5min。(五)信号检测：在一个空盒中混合等体积的检测试剂I和检测试剂II，马上将滤膜放入，DNA面朝上，使检测试剂盖住滤膜；取出滤膜，略微滴干后置于吸水纸上，DNA面朝上；移到保鲜膜上，DNA面朝下包好；放入装有增感屏的X光片夹中，DNA面朝上。在暗红灯下压上X光片；暴光0.5-2h，常规冲片。

三、数据分析及连锁图构建：应用MAPMAKER/EXP3.0(Lancoln et al，1992a)构建连锁图，以LOD＝3.0将各标记归入连锁群，以LOD＝2.0确定连锁群内标记的顺序，部分区间含有多个紧密连锁的标记，标记间顺序无法达到LOD＝2.0的置信度，暂以计算结果提供的最佳顺序排列。采用Kosambi函数(1944)将重组值转换成遗传图距，根据前人发表的图谱确定各连锁群的染色体号(Causse et al，1994)

OSBTB基因的图谱定位：选用珍汕97B/密阳46重组自交系群体的247个株系DNA，经EcoR I进行酶解转膜，以OsBTB克隆为探针，进行杂交；经MAPMAKER/EXP3.0连锁分析，在97B/密阳46重组自交系群体中将其定位于水稻第2染色体上RG108和RM210B之间，距离分别为6.5cM和3.5cM；以我们所定位的OsBTB基因紧密连锁G104标记与NCBI公布的水稻基因组第8号染色体图谱(www.ncbi.nlm.nih.gov/cig-bin/Entrez/maps.cgi？org＝rice8chr＝8)比较，发现该基因位于水稻第8号染色体着丝粒附近(表1)。

表1 OsBTB基因在珍汕97B/密阳      实施例8.OsBTB基因的功能研究

46重组自交系群体的染色体定位    通过构建OsBTB基因cDNA全长序列正义表达与反义表

Markers       Distance          达的植物转化载体，用农杆菌侵染法对水稻进行转化，

RG555         3.7cM             希望从该基因在水稻中超表达与阻断表达后水稻表型

RZ915         1.4cM             对比，进一步了解该基因的生理功能。

RZ957         4.6cM             供试水稻品种：籼稻品种(O.sativa L.sub.indica)H7S

RG634         1.5cM             实验方法

RZ512         0.9cM             一、正义与反义表达的植物转化载体构建，以下载体构

RM71          4.2cM             建方法参照《重组DNA的原理与方法》(李德葆等，

OSB           0.4cM             1994)。1)pGEM-T-OsBTB质粒的EcoR I酶切；2)酶切

RZ324         1.8cM             片段OsBTB/E的回收(严格按Concert TM Rapid Gel

RZ288         7.5cM             Extraction Systerm要求操作)；3)pBluescript SK(pBS)

RG171         2.4cM             载体的EcoR I酶切及抽提；4)回收片段OsBTB/E与pBS

RG120         0.7cM             载体的连接；5)连接产物的转化感受态细胞及兰白斑筛

RZ717         3.9cM             选；6)碱法小量制备重组质粒DNA；7)pBS-OsBTB质粒

RZ668         2.6cM             EcoR I酶切鉴定；8)pBS-OsBTB质粒的BamH I酶切及

RG252         0cM               OsBTB/B片段回收；9)pCAMBIA 1301质粒BamH I酶切

RG905         1cM               及抽提；10)pCAMBIA1301与OsBTB/B片段的连接；

RZ401         3.3cM             11)pCAMBIA1301-OsBTB(pCAM-OsBTB)转化感受态细胞

RZ318         5.6cM             及碱法小量制备重组质粒DNA；12)BamH I酶切鉴定

RZ123         7cM               pCAMBIA1301与OsBTB/B片段连接情况；13)pCAM-OsBTB

                                质粒的EcoR I酶切鉴定片段连接方向；14)转化载体的PCR验证。运用下列引物对对所得质粒进行PCR扩增，扩增条件94℃30sec、60℃45sec、72℃80sec、40循环。

Primer7：5’-GGATCCACCAAGTGACAATATGGATGAGGAA-3’

Primer8：5’-TATAAGAATCCATTGTTCAGGCC-3’

二、水稻转化：用于本研究的细菌培养基及水稻组织培养培养基见表2、3

表2细菌培养基

培 养 组分                                           参考文献

基

      16g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L NaCl，  Sambrook J，2001

2YT

      pH7.0

YEB   5g/L蛋白胨，1g/L酵母提取物，5g/L牛肉浸膏，Vervliet等，

      5g/L蔗糖，2mmol/LMgSO4，pH7.0                1975

      3g/LK2HPO4，1g/L NaH2PO4，1g/LNH4Cl，300mg/L Chilton等，1974

AB    MgSO4，150mg/L KCl，10mg/L CaCl，2.5mg/L

      FeSO4.7H2O，5g/L葡萄糖，pH7.0

表3水稻组织培养培养基

培养基      组份

愈伤组织诱导及培养用培养基

            N6(Chu 1978)盐份和维生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，

N6D2

            4-D，2.5g/L phytegal，pH5.8

悬浮细胞培养用培养基

            AA(Toriyama等1985)盐份和氨基酸，MS(Murashige等，1962)维生素，

AA

            0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L 2，4-D，0.2mg/L KT，pH5.8

共培养培养基

            AA盐份和氨基酸，MS维生素，0.5g/L水解酪蛋白，36g/L葡萄糖，68.5g/L

AAM

            蔗糖，100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2

N6D2C       N6D2，10g/L葡萄糖，100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.2

            N6盐份和维生素，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2.5g/L phytagel，

N6C

            100μmol/L乙酰丁香酮，pH5.8

筛选培养基

            N6D2，0.25g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/L

N6D2S1      玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，25mg/L潮霉素，250mg/L

            头孢霉素，pH5.8

            N6D2，0.25g/L水解酪蛋白，30g/L蔗糖，2mg/L6-BA，0.2mg/L NAA，0.2mg/L

N6D2S2      玉米素(zeatin)，0.5mg/LKT，2.0g/L phytagel，50mg/L潮霉素，250mg/L

            头孢霉素，pH5.8

分化培养基

            MS盐份，MS维生素、30g/L蔗糖、2mg/L 6-BA、0.5mg/L KT、0.2mg/L玉

MSBK

            米素(zeatin)、0.2mg/L NAA、50mg/L潮霉素、2.0/L phytagel，pH5.8

生根培养基

            1/2MS盐份，MS维生素，30g/l蔗糖，0.2mg/L NAA，50 mg/L潮霉素，1-2mg/L

1/2MSOEMH

            多效唑(刘明华等1995)，2.0g/L phytagel，pH5.8

三、双元载体导入农杆菌及酶切鉴定：参考Hofgen等(1998)的冻融法直接将双元载体pCAMBIA 1301导入根癌农杆菌菌株EHA105，具体步骤如下：1)根癌农杆菌生长于YEB(无抗生素)固体平板上，任挑一单菌落接入5mL YEB液体培养基中28℃、200rpm培养过夜；2)按1％接种量将上述菌液接种于50mL新鲜的YEB液体培养基中，28℃、200rpm培养至对数生长期；3)4000g、4℃、8min离心收集农杆菌菌体，用5mL预冷的TE(pH7.5)(10mmol/L Tris-Cl，pH7.5，1mmol/L EDTA)洗涤一次，加入5mL新鲜YEB培养基重新悬浮；4)取200μl菌液分装于1.5mL eppendorf管中，液氮速冻后于-70℃保存备用；5)直接取步骤3中200μl菌液(或取一管冻存细胞冰上化冻)加入1μg质粒DNA混匀，然后依次于冰上、液氮上、和37℃水浴中放置5min；6)用新鲜的YEB液体培养基稀释至1mL，于28℃振荡培养2-4小时；7)取200μl涂布于含Km 50mg/L的YEB平板上，28℃培养2-3天；8)生长的菌落在含Km 50mg/L的YEB平板上划分单菌，重复3次；9)随机挑选2个单菌落，用碱法小量制备质粒DNA；10)用氯化钙法将质粒DNA转化入E.coli DH5α感受态细胞中；11)再随机挑选2个单菌落，用碱法小量制备质粒DNA，进行酶切鉴定(图2)。

四、转化农杆菌后质粒鉴定：导入农杆菌后质粒的酶切鉴定操作参照《重组DNA原理和方法》(李德葆等，1994)的方法。用碱法小量制备质粒DNA，用EcoR I酶切。质粒DNA经氯化钙法转化E.coli DH-5α。

五、水稻幼胚愈伤组织的诱导：授粉后12-15天的水稻未成熟种子经70％乙醇浸泡1分钟后于2％的NaClO溶液中(加入2-3滴土温20)消毒60分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，用解剖刀和镊子挑出幼胚并培养于N6D2培养基上诱导愈伤组织(图3)。

六、根癌农杆菌的培养及水稻的转化

(一)根癌农杆菌培养：农杆菌菌种自YEB平板上接种到3mL含Km 50mg/L的YEB液体培养基中于28℃、200rpm培养过夜，第二天按1％接种量接入含Km 50mg/L的AB液体培养基中，28℃、200rpm继续培养至分光光度计上600nm读数0.8左右，将新鲜的培养液于5000g、4℃离心5min，收集并重新悬浮于1/3体积的AAM液体培养基中，用于水稻幼胚愈伤组织的转化。(二)水稻幼胚愈伤组织与根癌农杆菌的共培养转化：转化前制备N6D2C固体培养基时，在制备好的培养基上铺一层无菌滤纸，并用少量新鲜的AAM液体培养基润湿。在6mL培养皿中将预培养后的愈伤组织浸泡于新鲜的AAM农杆菌菌液并不时摇动，20min后将水稻材料取出，在无菌滤纸上吸去多余的农杆菌菌液，随即转移到上述N6D2C培养基上于28℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基AAM、N6D2C中添加100μmol/L的乙酰丁香酮(AS)作为农杆菌Vir基因的活化诱导物。共培养三天后，从培养基上取出转化水稻材料，用无菌水洗一次并于无菌滤纸上吸干菌液和水份。(三)转化后愈伤组织的筛选、分化及生根：(1)愈伤组织的处理、筛选及分化：将愈伤组织从N6D2C固体培养基中取出，无菌条件下用镊子和解剖刀将芽切除。去除芽的愈伤组织接种于N6D2S1培养基，12-14天后转接于N6D2S2培养基继续筛选。两周后，将抗性愈伤组织接种于MSBK分化培养基诱导分化。转接时挑选分化状态良好的愈伤组织，并注意同一愈伤组织所增殖的新愈伤在转接时不要分开接种，以便准确统计抗性愈伤转化效率。(2)转化植株的再生：将分化的小苗栽入1/2MSOEMH生根培养基。生根后，将再生植株从生根管取出，自来水将根部培养基冲洗干净后，经练苗移栽温室。(四)植株再生与转化频率的计算：转化效率为：抗性愈伤分化后产生的总株系(含白化苗)数与转入第一轮选择的愈伤组织数的比值，即转化效率＝分化的总苗株(系)数/进入第一轮选择的愈伤组织数×(100％)。其中一个株系指由一个抗性愈伤分化而来的一棵或几棵苗。计算愈伤组织转化频率的公式为(刘巧泉等，1998)：稳定转化率＝能够产生HYGr水稻植株的幼胚数/与农杆菌共培养的幼胚总数×(100％)

七、转基因株的鉴定：(一)转基因水稻植株总DNA提取，参照《重组DNA的原理与方法》(李德葆等，1994)的方法。(二)转基因植株的PCR分析：用以下引物对正义转基因株DNA及反义转基因株DNA进行PCR鉴定。Primer35S1：5′-GCTCCTACAAATGCCATCA-3′；Primer35S2：5′-GATAGTGGGATTGTGCGTCA-3’；PrimerNos1：5′-GAATCCTGTTGCCGGTCTTG-3′；PrimerNos2：5′-TTATCCTAGTTTGCGCGCTA-3′；Primer BBRG3：5′-ACATCCACCGCTGCTTGAGGCAG-3′；PrimerBBRG6：5′-TGCCTGAGATCCCTCGATTCT-3′。引物组合为35S1×35S2；35S1×BBRG3；35S1×BBRG6；Nos1×Nos2。反应体系为模板DNA 100ng；10×缓冲液5μl；20mM dNTP 0.5μl；100ng/μl引物各0.5μl；Taq酶2U；加水至体积50μl。反应条件：35S与Nos检测用94℃30sec、54℃45sec、40循环；35S1×BBRG或BBRG6用94℃30sec、56℃45sec、72℃80sec、40循环。转基因株的PCR鉴定结果(图4)

八、OsBTB基因抗病性鉴定

对获得的OsBTB基因抗病植株进行抗病性检测。用稻瘟病菌喷洒水稻3～4叶期的幼苗，三个星期后观察叶片发病情况。其结果如图6所示。

                           序    列    表

(1)SEQ ID No.1的信息：

(a)序列特征：

      长度：1974个碱基

      类型：核酸

      链型：单链

      拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)最初来源：水稻

(d)序列描述：SEQ ID No.1：

SEQ ID No.1：

cgcccttgtcgtccaaccctcctctcctcccctcctcgtcgcggggctagggttacgccccctcctcctcctcctcct

cctcgtcgtgtgggggcatggccgggagcgaggcggcggcggcgcaggaggcggagatggacccggacttctcgggcg

ggggcggtgggggccccagcttcgagttcgccttcaactcggtcaacttctccgaccgggtgctccggatcgaggtcg

tcgcgggggacgacgacgacgacgacgaccacgcgcccggctccagccgggacggcggggccggctcgctttcggatt

gggcgcgccaccgcaagcgccgccgtgaggagctcctcaaggagaaagagtctgaagcagtcatgccagaccagataa

attgcaaagtagaaccagaagaatgtgatgcatatgaagaaaatcaagaagaacctgtagcaatgatggacgactctc

cacccagtgttggccctgatggtgatgatggaccaagtatggactcaccttggagtggtggggtgagcacaccagttc

taagagtaaagaacatttatatcagttcagcgattcttgcagcaaaaagtcctttctttttcaagcttttctcaaatg

gcatgaaagaatctgatgagaggcaggcaacccttagaattactgattcagaggaaaatgcccttatggagcttttaa

gctttatgtacagtggaaagttgacatcaactgaccctactcttctactggatattctgatggctgctgacaagtttg

aggttgtttcgtgcatgaggtactgcagtcagttgctcacaagcttgactatgactacagaatctgcactactctacc

tagatcttccatgctccatttcgatggctgctgcagttcaacctctgacagatgcagccaaggaatatctttccaaca

aatacaaggatttgactaagttccaagatgaagtgatgaacatccctcttgctggaatcgaagccatcttgtcaagta

atgacctccaggtggcatctgaagatgctatctacgatttcttgatcaggtgggctcgcgcacaataccctaaatcag

aggaaaggcgtgagatcttgagttctcgtttgcttccgctcgtgcgattcagtcacatgacctgtaggaagctgcgga

aggtcctaatatgcaccgatctggaccatgagcaagcaaccaagtgtgtcactgaggcacttctatataaagctgatg

ctccacacaggcaacgtgctctcgcagcagacgtaacaacctgtcggaaatttgcagagcgggcttacaagtacagac

ctttgaaagttgttgagtttgaccgaccctacccacagtgtatagcatacttggatctaaagcgcgaagagtgctccc

ggctcttcccgtcaggtcggatgtactctcaagccttccatcttgcagggcagggcttcttcctctcagcacactgta

acatggaacagcagagtacgttctactgcttcggtctcttcttagggatgcaagagaagggctcaatgagcgtgacag

tagattatgagtttgctgcaaggacaagaccgtcaggagagtttgtgagcaagtacaagggtaactacacgttcaccg

gtgggaaggcggttggttacaggaatctctttgcgataccatggtcgacgttcatggctgacgacagcctcttcttcc

ttgacggcgtgttgcatctgagagctgaattgacgataaagcaacccactgtctaatgtactgctgccaaactcaagt

tggctttgcgctcgagtgggtgatagtgcgaaacatcacatgctgcagatatcgtattgttttttttccccttcttct

atgcttaaacccttttgttgatagaaactttgcaaatgacaagtggaaaaaaaaagaactaaaaccggtctcttttac

tggcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

(2)SEQ ID NO.2的信息：

(a)序列特征：

      长度：1674个碱基

      类型：核酸

      链型：单链

      拓扑结构：线性

(b)分子类型：cDNA

(c)最初来源：水稻

(d)序列描述：SEQ ID NO.2：

SEQ ID NO.2

atggccgggagcgaggcggcggcggcgcaggaggcggagatggacccggacttctcgggcgggggcggtgggggccccag

cttcgagttcgccttcaactcggtcaacttctccgaccgggtgctccggatcgaggtcgtcgcgggggacgacgacgacg

acgacgaccacgcgcccggctccagccgggacggcggggccggctcgctttcggattgggcgcgccaccgcaagcgccgc

cgtgaggagctcctcaaggagaaagagtctgaagcagtcatgccagaccagataaattgcaaagtagaaccagaagaatg

tgatgcatatgaagaaaatcaagaagaacctgtagcaatgatggacgactctccacccagtgttggccctgatggtgatg

atggaccaagtatggactcaccttggagtggtggggtgagcacaccagttctaagagta aagaacatttatatcagttc

agcgattcttgcagcaaaaagtcctttctttttcaagcttttctcaaatggcatgaaagaatctgatgagaggcaggca

acccttagaattactgattcagaggaaaatgcccttatggagcttttaagctttatgtacagtggaaagttgacatcaa

ctgaccctactcttctactggatattctgatggctgctgacaagtttgaggttgtttcgtgcatgaggtactgcagtcag

ttgctcacaagcttgactatgactacagaatctgcactactctacctagatcttccatgctccatttcgatggctgctgc

agttcaacctctgacagatgcagccaaggaatatctttccaacaaatacaaggatttgactaagttccaagatgaagtga

tgaacatccctcttgctggaatcgaagccatcttgtcaagtaatgacctccaggtggcatctgaagatgctatctacgat

ttcttgatcaggtgggctcgcgcacaataccctaaatcagaggaaaggcgtgagatcttgagttctcgtttgcttccgct

cgtgcgattcagtcacatgacctgtaggaagctgcggaaggtcctaatatgcaccgatctggaccatgagcaagcaacca

agtgtgtcactgaggcacttctatataaagctgatgctccacacaggcaacgtgctctcgcagcagacgtaacaacctgt

cggaaatttgcagagcgggcttacaagtacagacctttgaaagttgttgagtttgaccgaccctacccacagtgtatagc

atacttggatctaaagcgcgaagagtgctcccggctcttcccgtcaggtcggatgtactctcaagccttccatcttgcag

ggcagggcttcttcctctcagcacactgtaacatggaacagcagagtacgttctactgcttcggtctcttcttagggatg

caagagaagggctcaatgagcgtgacagtagattatgagtttgctgcaaggacaagaccgtcaggagagtttgtgagcaa

gtacaagggtaactacacgttcaccggtgggaaggcggttggttacaggaatctctttgcgataccatggtcgacgttca

tggctgacgacagcctcttcttccttgacggcgtgttgcatctgagagctgaattgacgataaagcaacccactgtc

(3)SEQ ID No.3的信息：

(a)序列特征：

      长度：558个氨基酸

      类型：氨基酸

      拓扑结构：线性

(b)分子类型：多肽

(c)序列描述：SEQ ID No.3：

SEQ ID NO.3

M A G S E A A A A Q E A E M D P D F S G G G G G G P S F E F A F N S V N F S D R V L R I E V V A G D

D D D D D D H A P G S S R D G G A G S L S D W A R H R K R R R E E L L K E K E S E A V M P D Q I N

C K V E P E E C D A Y E E N Q E E P V A M M D D S P P S V G P D G D D G P S M D S P W S G G V S T P

V L R V K N I Y I S S A I L A A K S P F F F K L F S N G M K E S D E R Q A T L R I T D S E E N A L M E L

L S F M Y S G K L T S T D P T L L L D I L M A A D K F E V V S C M R Y C S Q L L T S L T M T T E S A L

L Y L D L P C S I S M A A A V Q P L T D A A K E Y L S N K Y K D L T K F Q D E V M N I P L A G I E A I

L S S N D L Q V A S E D A I Y D F L I R W A R A Q Y P K S E E R R E I L S S R L L P L V R F S H M T C

R K L R K V L I C T D L D H E Q A T K C V T E A L L Y K A D A P H R Q R A L A A D V T T C R K F A E

R A Y K Y R P L K V V E F D R P Y P Q C I A Y L D L K R E E C S R L F P S G R M Y S Q A F H L A G Q

G F F L S A H C N M E Q Q S T F Y C F G L F L G M Q E K G S M S V T V D Y E F A A R T R P S G E F V

S K Y K G N Y T F T G G K A V G Y R N L F A I P W S T F M A D D S L F F L D G V L H L R A E L T I K

Q P T V

(4)SEQ ID No.4的信息：

(a)序列特征：

      长度：8308个碱基

      类型：核酸

      链型：单链

      拓扑结构：线性

(b)分子类型：DNA

(c)最初来源：水稻

(d)序列描述：SEQ ID No.4：

SEQ ID No.4：

agatccggcatgaagcggcgcggcagcccggcatgcctctcgctcacgatgcgggaaggcggaagtacgctaccgtcaagcagagcggagc

cccgtgccatggcgccagaggaagagatgattgagagcgagcgtgtgtggcgagggtaaggcgcagcagagaaagagttagggctcaagca

gcgaaggcaaggggaataatggcgaaaggaagggagcaaatcctttcctcggtgtttttatacctttgccatcgctgtgcccggctcctcg

tttctcgcgcccactatcccgctccctcgtttctcactatctcgctccctcgattctcgtgcccacgcttccactaatcccattcgcccgc

ttgcggcgcatgaggtggatatgcggttgtggcagtcgagacagatcgtatcgtgcgcgcgttaattacgctcgccgatcgaagcgacgtt

gccatatctccaggcgaagcaaaatcgactcgcccagattcgtgcgctgcacaagtgatgtggcagtcttgaagagaccgcccattatttg

acagctaagattaccataaccgatgtgcatggtttgagaccgttgggtctctacccaaccatggagaccggtcccacctgtcaccaggctt

taggagtggcgtcacgcccgaccgcttcccttgagaagggcgatcgccctggcataacgccgggggctactgtcggtgatatgggaccggg

agtaccgtgaccagaggcttgaggcagacacaatcgcccacgtggcctggcaccttcggggacgtcgggcccgagggtgaggtgtccgccc

tcctcctgatttccccgagggggggtcgggtgactcctgccccggccccggggaccgaggcggcccgaccccttgtgaagttagcgctaca

tgaatgggttaggtgagcacggtaaacctcaccgaaccacatttaatgcggtctggtcgaacgtgtcacactgcatgcagcgtagtgcagc

gcgttcctttatccggtctgtgaccagtcacagaccggtcagatcacgggttaggtggcgactggcggtctgacgcacgccttgccccatc

ccgtcaagacgaaagcctttagggcactcgtctcaagctggagctagtgtgttatctcttagagatggcacgttagccctggttagatttt

taccaggcttcatcccaaccgttacaggcaagatgctacatgaagaagggcaaacatgcacgctgctaagctgacgcgtggtggacaagga

tgactggtctgtgaccggtctgacacgggttgcgtcatccacagacagccataatcccacgtcgcacctgtttccggtggaagtgggggta

ggtatgggctgtcccgtcagaagggcactcggacagcaaccgtaccgatctccgtccatttatgaagagaagaacagtccagtttggaaag

ggagaggtgcatgtggtatccccttgagatataaaaggaggaccttgcccacttagagaaggatcttggacttttggactggaggcctttt

ccagaaccgatcccagagcgattgggggctggttcatactttgtaacttgtccatacacagatccaccaaaaacacaggagtagggtatta

cgcttcccagcggcccgaacctgtatacgtctcctgcgtctcgcgtttcttcttggttcgcgatctttccacataccgagagagcttggga

tttcaccctaagcctccggccgaaccggcaaaggggggcctgtgcggtctcccggtgaggagccacgagctccgtcacaaccaagtatata

tcgattagcatcatgtcatcacaacacagttaatgcacaaattaggcaaccatgcaaattaggttcgaatttgagggagccagcctgctag

gcttttttgttgggcttcttttgatcgttgttttctttatttctctgcatacatacgaagtatataccttatatatgtattctttttgtaa

aaatcttaggtattttcatttgaatacccttgaattgagttggcccacccctgcccatgaccacgacaaatagagtaaggccctgtttagt

tcaggggtgaaaagtatttgtgtgttataacggatttacggacacatatttgaagtattaaacgtagactaataacaaaacaaattacaga

ttctgcctgtaaactgcgagaagattttattaagcctaattaatccgtcattcgtaaatgtttactgtagcaccacattatcaaatcatga

cgcaatcaggcttaaaagatttgtctcgcaatttacacgtaatctgtgtaattagtttttttttgtctatatttaatactccatacatatg

tccaaatattcaatgtgattggggaagctggagtaggtaaaacagtactcatcataaaattaattaacaatattgctaaagctcactgggc

cgggtgaaaattttttatttaggaactaaatagggcctaattaagctgtgtatagtaagcacaatttccacgccgacgcactgcaattttc

acgcaactttcaccgcctatttccttcttttacccccacaaccacgaccacgacgacgaccagagtaaacaagtcttattataaccacccc

ttaattttcgaattgtggacgatcgttttacgaaaatttcggtgccttcgatcatatattaggtggtcaatgaaaagcgaccagggtaacg

gagaatggatgaaaggggattttatttttctccttccaatttttagatgctctcgtgtacttgtaatagataccttttcagaatttgatat

tttgttctaggccgttggataattggttatgcaagggatacaattgtgcaacctagaaattttggaagaacctgtaatcttgtactaattg

attatacctgtaggatgatatgggtaagaataattcatttcatgcattgtatggataggcatggtttatgcatggatccatgtagcatact

cgcctcgggttgaggggacaatgtggtcaattgtttgagataaagtgaggttatctagagaattggttgttgcatagtatataaacgaggg

ataacgcctttgtagttcatacttctggttgggtgcacgcactagaagtatggaactgattttgttgaaaatttgatcatgaatgttggaa

attgtatcatgcaatgtggctattgtgggcatattattgaacaacccttggttatcttggttatatgtttgtagcttataatatagtgatt

agttttatttgattttcttagattgtgttccaatgttcccccattttgtgtatacctgtacttttaatgagtaccttatgtaataatgtgt

gcatattcagttggttatcatgcttcttctggtgaccaaatcagttctcactgactgaaattttttggctagtttatgtgtcaaacaaatg

ggtcaacactctgtagaaagagctaaagtgactgacaacaagccaaatcctcttgatacctagagttctctctttatttttttgtaggttt

ctatgatgttttttatgaaattcggagacctgcataagtcctactgcacttatgcatcttgtgtgagggcattttgtgctacacagtccac

aatgtatacaagatactttgcatgaaaaatgggtttaagggctatatactgctttgcaaattgattgttagttttctgtttctccttatgg

ttatatttgaaaggggtatggtgggggttggggggtaaataatacatttttataatgaagggacgcgtgaaaatatgctttgcaaaatacc

gttagtttttgtgtttaatcttcagacttcagttgcttgttagctgtgccgatcatgatctcaatgcttgttttgtgcttcttaggtcatg

ctcaaaggtagagcccggtatgggctcttatgcaaacatgtcatttagaaactgcccccttacaagagttgaggcaacaaaggctctaacc

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Claims (10)

1.一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因，其特征在于：运用重组载体和基因工程化宿主细胞，通过应用模块表达序列标签阵列、互补脱氧核糖核酸末端快速扩增和反转录聚合酶链式反应方法获得的、且已于染色体上定位的具有SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因，其特征在于：所说的已于染色体上定位，是指野生稻抗稻瘟病抗性相关基因定位于第2号染色体，且定位在中国水稻研究所国家水稻改良中心构建的珍汕97B/密阳46的F8重组自交系群体亲本的一个公共标记RZ324附近。

3.根据权利要求2所述的一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因，其特征在于：具有SEQ ID No.2所示的开放读码框序列，并且具有SEQ ID No.3所示的开放读码框多核苷酸序列。

4.一种分离的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因多肽，其特征在于，它具有SEQ ID No.3氨基酸序列的多肽、其保守性变体、或其生物活性片段，或其活性类似物、或其活性衍生物。

5.一种重组载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因，它包括细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒。

6.一种基因工程化宿主细胞，其特征在于，它是用权利要求5所述的重组载体转化的基因工程化宿主细胞，它包括原核细胞、低等真核细胞、高等真核细胞。

7.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1或2所述的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因的多核苷酸序列分子中8～100个连续核苷酸的序列。

8.根据权利要求7所述的一种探针分子，其特征在于：所说的多核苷酸序列包括SEQ IDNo.1～2所示的序列、其互补序列、多核苷酸序列变体、抑制水稻抗白叶枯抗性相关基因信使核糖核酸的寡核苷酸以及核酶。

9.根据权利要求8所述的一种探针分子，其特征在于：所说的多核苷酸序列变体是指一种或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。

10.一种分离出的野生稻抗稻瘟病抗性相关基因的用途，其特征在于：它用于水稻抵御稻瘟病菌的侵染。

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