CN1323168C - 一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白与应用。其目的是提供一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白与其在培育抗病性提高的植物中的应用。该基因是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。其编码蛋白是序列表中的SEQ ID №：2。本发明的大豆酶学抗病基因将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。

Description

一个大豆酶学抗病基因及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及植物基因及其编码蛋白与应用，特别是涉及一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的抗病基因及其编码蛋白与其在培育抗病性提高的植物中的应用。

背景技术

细菌及真菌是危害农作物的主要病原菌。虽然目前对某些病害已找到有效的防治方法，但对大多数严重危害农作物生长的病害尚无切实有效的防治措施。培育抗病品种是防治植物病害的根本措施。但由于病原菌变异迅速，可供利用的抗原匮乏，常规育种的作用受到很大程度的限制。随着分子生物学、植物病理学及基因工程技术的迅猛发展，运用基因工程手段提高植物的抗病性为抗病育种开辟了一条崭新途径。

Taler等对印度野生、高抗霜霉病甜瓜品种P1进行遗传学研究发现，P45蛋白与抗病性紧密连锁(Plant eR Genes That Encode Photorespiratory Enzymes ConferResistance against Disease，The Plant Cell，Vol.16，172-184，January 2004)。根据P45蛋白部分氨基酸测序结果，设计简并引物，利用RT-PCR的方法克隆得到两个编码P45蛋白的eR基因，分别命名为At1和At2。At1和At2核苷酸序列的同源性为88％，氨基酸序列同源性为93％。研究发现At1和At2不属于任何一类已知的eR基因，其编码蛋白与丝氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ser glyoxylate aminotransferase，SGT)、丙氨酸乙醛酸氨基转移酶(Ala glyoxylate aminotransfe rase，AGT)氨基酸序列同源性均大于80％。酶活分析实验发现，植物抗、感病性与SGT、AGT的酶活有直接相关性，高抗品种中SGT、AGT酶活最高，接近100％，中抗品种中酶活大约70％，感病品种中酶活则低于25％。

Taler等将At1或At2基因转入感病品种，感病品种即获得抗病性，同时，SGT、AGT和乙醇酸氧化酶(glycolate oxidase，GO)的酶活性均显著提高(Plant eRGenesThat Encode Photorespiratory Enzymes Confer Resistance against Disease，ThePlant Cell，Vol.16，172-184，January 2004)。推测SGT和AGT可能具有提高GO活性的功能。经检测，抗病植株中GO的活性是感病植株中GO活性的10-20倍。SGT、AGT和GO是植物光呼吸中的关键酶，它们都在植物的过氧化物体中起作用。在过氧化物体中，GO催化乙醇酸向乙醛酸转化并产生H₂O₂，而SGT、AGT分别以丝氨酸和丙氨酸作为氨基供体，催化乙醛酸向苷氨酸转化。SGT、AGT、GO协同作用导致植物体内H₂O₂的产生和积累。已知H₂O₂在植物抗病过程中起很重要的作用，H₂O₂不仅能够直接杀死病原菌(Peng & Kuc，Phytopathol.82：696-699，1992)，还可通过诱导细胞壁结构蛋白的氧化交联阻止病菌的侵入(Bradley et al.，Cell 70：21-30，1992；Brissonet al.，Plant Cell 6：1703-1712，1994)及通过激活水杨酸合成以诱导防卫基因的表达，使植物产生系统获得性抗性(Leon et al.，Plant Physiol.108：1673-1678，1995；Chen et al.，Science 162：1883-1886，1993)。悬浮细胞试验证明H₂O₂能激活植保素的合成(Apostol et al.，Plant Physiol.90：109-116，1989；Davis et al.，Phytochem.32：607-611，1993；Degousee et al.，Plant Physiol.104：945-952，1994)。在近来的研究中还发现在不亲和的植物-病原互作中氧化激增产生的H₂O₂不仅可作为区域信号导致细胞死亡，而且还可作为扩散信号诱导周围未侵染细胞中防卫基因如谷胱甘肽S转移酶基因的表达(Levine et al.，Cell 79：583-593，1994)。

上述研究表明，eR基因对病原菌没有种属专化性，是具有氨基转移酶活性的酶学抗病基因。

烟草黑胫病俗称“黑根”、“黑秆疯”。多发生于成株期，少数苗床期发生。幼苗染病后，茎基部出现污黑色病斑或从底叶发病沿叶柄蔓延至幼茎，引致幼苗猝倒。湿度大时，患病部位长满白色菌丝，幼苗成片死亡。茎秆染病，茎基部初呈水渍状黑斑，后向上、下及髓部扩展，绕茎一周时，植株萎蔫死亡。纵剖病茎，可见髓部黑褐色坏死并干缩呈“笋节”状，“节”间长满白色絮状菌丝。叶片染病，初为水渍状暗绿色小斑，后扩大为中央黄褐色坏死、边缘不清晰隐约有轮纹呈“膏药”状黑斑。潮湿条件表面也生白色绒毛状物。

发明内容

本发明的目的是提供一个来源于大豆的具有氨基转移酶功能的酶学抗病基因及其编码蛋白。

本发明所提供的酶学抗病基因，名称为GmeR(Glycine max enzymaticresistance)，来源于大豆属大豆(Glycine max L.Merril)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：1由1206个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1206位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。

本发明酶学抗病基因所编码的蛋白(GmeR)，具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID №：2；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有提高植物抗病性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2由401个氨基酸残基组成。

含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

扩增GmeR中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。

本发明的另一个目的是提供提供一种提高植物抗病性的方法。

本发明所提供的提高植物抗病性的方法，是将所述大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物。

所述大豆酶学抗病基因可通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞。

用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用GmeR构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

具体来将，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等，优选为pCAMBIA2301。

以pCAMBIA2301为出发载体，构建的植物表达载体为pGmeR121。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物-(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GmeR的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是玉米、小麦等单子叶植物，也可以是烟草、拟南芥、菜豆等双子叶植物。

本发明从大豆品种“科河1号”中克隆得到GmeR，该基因与具有氨基转移酶功能的甜瓜eR基因的核苷酸序列同源性为79.52％，氨基酸序列同源性为96.76％。将该基因转入烟草和棉花，转基因烟草高抗烟草青枯病和烟草黑胫病，转基因棉花高抗棉花枯黄萎病，表明GmeR转基因植物可高抗霜霉、灰霉病等真菌病害。本发明将在植物病害的防治领域及抗病品种的繁育工作中发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为GmeR 5’Race PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为质粒pMeR的限制性内切酶EcoR I和Pst I酶切鉴定结果

图3为GmeR全基因PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为pGmeR的限制性内切酶BamH I酶切鉴定结果

图5为中间载体pCV121的构建流程图

图6为中间载体pUC121的限制性内切酶Sac I和EcoR I酶切鉴定结果

图7为中间载体pMV121的限制性内切酶Hind III和BamH I酶切鉴定结果

图8为中间载体pCV121的限制性内切酶Hind III和EcoR I酶切鉴定结果

图9为GmeR植物表达载体pGmeR121的构建流程图

图10为GmeR植物表达载体pGmeR121的限制性内切酶BamH I酶切鉴定结果

图11为GmeR转基因棉花植株的PCR鉴定结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物均由上海生工合成，测序工作均由三博远志生物技术有限责任公司协助完成。

实施例1、GmeR的克隆

植物材料：

大豆品种“科河”1号，苗龄4周时，整株喷2.0mM水杨酸，诱导48h。

一、GmeR 5’Race的引物设计

根据gene bank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中公布的甜瓜eR基因序列，在网上进行序列比对，发现大豆受2.0mM水杨酸诱导48小时的EST序列中有1个465bp的DNA片段，与甜瓜eR基因3’端序列同源性高达83％，推测该序列可能是大豆中同源基因的3’端基因序列，将大豆中的该同源基因命名为GmeR，据此设计用于GmeR5’Race的3’端PCR引物P1和P2，5’端引物P3和P4由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒(Cat.No.L1502-01)提供，上述引物序列如下：

P1：5’-CTGGTTGCTTTGCCTAAACGACTGTG-3’

P2：5’-AAGAGCAGCTCTCAGACCATACAGC-3’

P3：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’

P4：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’

二、GmeR全基因的克隆

用下述方法进行GmeR全基因的克隆，具体过程包括以下步骤：

1、大豆RNA提取

使用Invitrogen公司的TRIZOL^R Reagent试剂盒(Cat.No.15596-026)并参照试剂盒说明书提取上述经水杨酸诱导的大豆品种“科丰”1号的叶片RNA，具体过程如下：

1)取50-100mg大豆叶片在液氮中磨成粉末，转入1.5mL离心管中。

2)加入1mL TRIZOL Reagent充分混匀，室温放置5min。

3)加200μl氯仿，振荡15s，室温放置2-3min，4℃、12000g离心10min。

4)取上清，加入500μl异丙醇，室温放置10min，4℃、12000g离心5min，在离心管底部可见白色片状的RNA沉淀。

5)弃上清，小心加入1mL 70％乙醇，不要破坏RNA片状沉淀，5s后用加样器将液体全部吸出。

6)室温放置5-10min，使乙醇挥发(不要让其完全干，否则影响溶解性)，加入20μl DEPC水溶解沉淀，得到经水杨酸诱导后的大豆叶片RNA。

2、RNA去磷酸化

本实验中所用10XCIP缓冲液、RNaseOUT^TM、CIP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，3M醋酸钠(pH5.2)均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。

对步骤1提取的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行去磷酸化处理，具体方法如下：

1)取提取的RNA 2μl(5-10μg)置于1.5mL离心管中，放置冰上，再顺次加入10XCIP缓冲液1μl、RNaseOUT^TM 1μl、CIP 1μl和DEPC水5μl至总体积为10μl。

2)轻柔混匀，4℃稍加离心，收集液体，50℃温浴1h。

3)4℃稍加离心，置于冰上，加90μl DEPC水和100μl氯仿/苯酚，振荡30秒，室温离心5min。

4)取上层液相，置于1个新的1.5mL离心管中，加入2μl 10mg/mL贝糖原(musselglycogen)，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀后，加入220μl 95％乙醇，稍加混合。

5)-70℃冰箱中放置10min，4℃、离心20min，用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。

6)加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀几次，4℃、12000g离心2min。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇吸出。

7)室温下风干1-2min，立即加入7μl DEPC水将RNA沉淀溶解，得到经去磷酸化处理的大豆RNA。

3、去掉RNA 5’端帽状结构

本实验中所用TAP缓冲液、RNaseOUT^TM、TAP、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，3M醋酸钠(pH5.2)均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。

对步骤2经去磷酸化处理的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书进行5’端脱帽处理，具体方法如下：

1)取步骤2经去磷酸化的RNA 7μl置冰上，再依次加入1μl TAP缓冲液、1μlRNaseOUTTM和1μl TAP，至总体积为10μl，轻柔混匀，4℃短暂离心收集液体。

2)37℃温浴1小时，4℃短暂离心收集液体，置冰上。

3)加入90μl DEPC水和100μl氯仿/苯酚，振荡混匀30秒。

4)室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1.5mL离心管中。

5)加入2μl 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀，加入220μl 95％乙醇，稍加混合。

6)-70℃冰箱中放置10min，4℃离心20min。用移液器小心吸去上清，不要碰到RNA沉淀。

7)加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀几次，4℃离心2min。用移液器小心吸去上清，稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温下风干1-2min，立即加入7μlDEPC水将RNA沉淀溶解。

4、将RNA Oligo与经5’端脱帽处理的大豆RNA连接

本实验中所用装有0.25μg GeneRacer^TMRNAOligo冻干粉的离心管、10X连接缓冲液、10mM ATP、RnaseOutTM、T4RNA连接酶、DEPC水、氯仿/苯酚、10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，3M醋酸钠(pH5.2)均由Invitrogen公司GeneRacer试剂盒提供。

对上述经去磷酸化、脱帽处理的大豆叶片RNA用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其与RNA Oligo进行连接，具体方法如下：

1)取7μl上述经去磷酸、脱帽处理的大豆RNA，加入装有0.25μg GeneRacer^TM RNAOligo冻干粉的离心管中，用移液器混匀，短暂离心。

2)65℃温浴5min，去掉RNA二级结构(由于挥发作用，体积会减小到6μl)。冰上放置2min，短暂离心。

3)加入1μl 10x连接缓冲液、1μl 10mM ATP、1μl RnaseOut^TM，1μl T₄ RNA连接酶，用移液器混匀，37℃温浴1h，短暂离心，置于冰上。

4)加入90μl DEPC水和100μl氯仿/苯酚，振荡混匀30秒。

5)12000g室温离心5min，取上层液相，放入1个新的1.5mL离心管中。

加入2μl 10mg/mL贝糖原(mussel glycogen)，10μl 3M醋酸钠(pH5.2)，混匀，加入220μl 95％乙醇，稍加混合，-70℃冰箱中放置10min。

6)4℃、12000g离心20min，用移液器小心吸去上清。

7)加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀，4℃、12000g离心2min。用移液器小心吸去上清。稍加离心，将乙醇尽可能吸出。室温风干1-2min。立即加入10μl DEPC水溶解RNA沉淀。

5、反转录合成cDNA

本实验中所用Gene Racer Oligo dT Primer，dNTP Mix，无菌蒸馏水、5x第一链缓冲液，0.1M DTT，RNaseOut^TM，SuperScript^TM III RT缓冲液和RnaseH均由Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒提供。

以步骤5获得的大豆叶片RNA为模板，用Invitrogen公司的GeneRacer试剂盒并参照试剂盒说明书将其反转录合成cDNA，具体方法如下：

1)取步骤5经处理的大豆叶片RNA 10μl，加入1μl Gene Racer Oligo dT Primer，1μl dNTP Mix，1μl无菌蒸馏水。

2)65℃温浴5min，去掉RNA二级结构，冰浴5min，短暂离心。

3)依次加入4μl 5x第一链缓冲液，1μl 0.1M DTT，1μl RNaseOut^TM，1μlSuperScript^TM III RT缓冲液，至总体积20μl，用移液器混匀。

4)短暂离心后，50℃温浴50min。

5)70℃温浴15min，使反应停止，冰上放置2min，最大转速短暂离心。

6)加入1μl RnaseH，37℃温浴20min。

7)短暂离心，反转录获得的cDNA可立即用于PCR扩增或置-20℃保存。

6、目的基因的PCR扩增

以上述获得的cDNA为模板，首先在引物P1和P3的引导下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：先95℃5min；再94℃ 30s，67℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃ 10min。再取1(1上述PCR产物，并以之为模板，在引物P2和P4的引导下，进行第二次PCR扩增，PCR反应条件为：先95℃ 5min；再94℃ 30s，64℃ 1min，72℃ 2min，共30个循环；最后72℃ 10min。PCR反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+HindIII，泳道2为PCR产物，泳道3为CK(以无菌水为模板扩增产物))，在960bp处有一明显的扩增条带。

7、冻融法回收PCR产物

1)将上述扩增的长度约960bp的目的基因片段从琼脂糖凝胶上切下，置于一新的离心管中。

2)加入TE缓冲液200μl，在振荡器上振荡5min，再放入液氮中冷冻5min。

3)取出，在65℃下水浴5min。

4)按步骤2)-3)所述方法重复冷冻、融化两次。

5)依次用苯酚、苯酚/氯仿、氯仿抽提，用无水乙醇沉淀DNA，然后加入4ul无菌水溶解沉淀，沉淀即为回收的目的片段。

8、PCR产物的克隆

使用载体pMD18-T(TaKaRa，Cat.No.D504A)试剂盒进行PCR产物的克隆。具体方法为：取步骤7获得PCR回收产物4ul，依次加入1ul载体pMD18-T、5ul Ligase SolutionI，然后16℃连接4h。将连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pMeR，用限制性内切酶EcoR I和Pst I进行酶切鉴定，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为酶切产物)，表明960bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T中，对pMeR做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列。

9、GmeR全基因的克隆

根据pMeR的测序结果，设计引物P5和P6 PCR扩增GmeR全基因序列，引物序列如下：

P5：5’-CTGCAGATGGATTATTTCAATGCACCAGGAAG-3’

P6：5’-CTGCAGGTCGACGAATGACTTGTGACTCAAATCCTGG-3’

以大豆cDNA为模板，在引物P5和P6的引导下，进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃ 1分钟，52℃ 1分钟，72℃ 1.5分钟，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为PCR产物)，回收约1.2bp的PCR产物，将其与载体pMD18-T Simple(TaKaRa，Cat.no.D506A)进行连接，将连接产物用CaCl₂法转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性重组克隆，将阳性克隆质粒命名为pGmeR，对其用限制性内切酶BamH I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为酶切产物)，表明约1.2bp的目的片段已正确连接入载体pMD18-T Simple中，对pMeR做进一步的测序鉴定，测序结果表明插入片段具有序列表中SEQ ID №：1的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：1由1206个碱基组成，其编码序列为自5’端第146位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的蛋白质。进行核苷酸及氨基酸序列比对，比对结果表明该基因与甜瓜eR基因DNA序列的同源性为79.52％；其编码的氨基酸序列与甜瓜eR基因所编码的氨基酸序列同源性为88.03％。

实施例2、GmeR植物表达载体pGmeR121的构建

一、中间载体pCV121的构建

本实施例所构建的基因GmeR表达盒中包括以下基因表达调控元件：5’端的35S启动子、基因GmeR和3’端的NOS终止子。首先构建不含基因GmeR中间载体pCV121，其构建流程如图5所示，具体过程包括以下步骤：

1、中间载体pUC121的构建

对质粒载体pBI 121(北京拜尔迪生物技术有限公司)用限制性内切酶Sac I和EcoRI进行双酶切，回收260 bp的T-NOS终止子片段，将其与经相同酶双酶切的载体pUC19连接，获得一中间载体，命名为pUC121，对其用限制性内切酶Sac I和EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图6所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2和3为酶切产物)，酶切产物片段大小为260bp，与预期结果相符。

2、中间载体pMV121的构建

对质粒载体pBI 121用限制性内切酶Hind III和BamH I进行双酶切，回收800bp的P35S启动子片段，将其与经相同酶双酶切的步骤1构建的载体pUC121连接，获得一中间载体，命名为pMV121，对其用限制性内切酶Hind III和BamH I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图7所示(泳道1为酶切产物，泳道2为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III)，酶切产物片段大小为800bp，与预期结果相符。

3、中间载体pCV121的构建

对质粒载体pCAMBIA 2301(北京拜尔迪生物技术有限公司)用限制性内切酶HindIII和EcoR I进行双酶切，回收1.0kb的目的片段，将其与经相同酶双酶切的步骤2构建的载体pMV121连接，获得一中间载体，命名为pCV121，对其用限制性内切酶Hind III和EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图8所示(泳道1为酶切产物，泳道2为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III)，酶切产物片段大小为1.0kb，与预期结果相符。

二、GmeR植物表达载体pGmeR121的获得

GmeR植物表达载体pGmeR121的构建流程如图9所示，具体方法为：对质粒载体pGmeR用限制性内切酶BamH I进行酶切，回收1206bp的GmeR目的片段，将其与经相同酶酶切的步骤一构建的中间载体pCV121进行连接，得到GmeR植物表达载体，命名为pGmeR121。对其用限制性内切酶BamH I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图10所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为酶切产物)，酶切产物片段大小为1206bp，与预期结果相符。

实施例3、GmeR转基因烟草的抗病性鉴定

将实施例2构建的植物表达载体pGmeR121用冻融法转化根癌农杆菌LBA4404。再用叶盘法将整合有pGmeR121的根癌农杆菌LBA4404转化子转化烟草NC89，获得GmeR转基因烟草20株。采用离体叶片接种法，以非转基因烟草为对照，进行转基因烟草进行烟草黑胫病(Black shank)、青枯病的抗病性鉴定，具体方法如下：

1、GmeR转基因烟草的烟草黑胫病(Black shank)抗病性鉴定

黑胫病菌谷制作方法：将谷子煮至约一半谷粒开花捞出，装入三角瓶，高压灭菌1h。将已培养好的黑胫病菌种，接种到灭菌后冷却的谷子上，然后置于28-30℃下培养10-14天，收集孢子，调整孢子浓度至5×10⁴个/mL。

采用离体叶片接种法，以非转基因烟草为对照，重复3次。取长势良好专一的GmeR转基因烟草15个单株用于抗病性检测，取供试烟草的顶部第3片叶，叶背面朝上置于无菌的湿纱布上，用石英砂制造微伤，在伤口处接种10μl孢子悬浮液，100％相对湿度保湿24h，接种后连续7d观察发病情况，结果对照组叶片接种2-3d后，接种部位形成水渍状病斑，7d时，病斑变黑甚至腐烂，有白色菌丝赘生，病灶扩大，周围出现退绿，表明黑胫病孢子萌发后，已成功的侵染到叶片组织中。在供试的15株转基因烟草中，有7株抗病性显著提高，接种3d后，接种部位无明显变化，7d时，形成轻微的坏死，表现出明显的过敏性坏死反应。

2、GmeR转基因烟草的青枯病抗病性鉴定

测定烟草品种抗青枯病的程度，一般在病区的连作田块自然发病，也可以经过人工接种观察对青枯病的抗性。青枯病菌接种体的制备：将20℃下保存于无菌水中的青枯菌，在肉汁培养基(杭州维特洁生化技术有限公司)平板上划线，培养于28-30℃下，24h后挑取典型单菌落移置于肉汁斜面，28℃培养24h后，再移至肉汁斜面，在28℃下再培养24h后用无菌水稀释，稀释成所需要的接菌浓度(3×10⁸个细菌/mL)。将苗龄40天的转基因烟苗，移栽至瓦盆，待烟苗成活后，用根灌菌液的方法，每株灌20mL的细菌悬浮液，接种后置于28-30℃恒温室中，并将瓦盆放在盛水的瓷盘中保湿，观察发病情况，并于接种后第7、10、15、21、30天进行调查，计算发病率和病情指数，病情指数的计算方法为：

根据病情指数可将烟草的青枯抗性划分4级：病情指数25以下为高抗，25.1-50为中抗，50.1-75为中感，75以上为高感。对步骤1获得的7株抗黑胫病的烟草用上述方法进行青枯病的抗性鉴定，结果有5株青枯病抗性指数分别为20，23、27、27、35，对青枯病具有显著抗性。

实施例4、GmeR转基因棉花的抗病性鉴定

1、将植物表达载体pGmeR121转化棉花

用植物花粉管通道法将植物表达载体pGmeR121转化棉花，在本实施例中，子房注射外源基因的时间是在棉花开花授粉后约10-24小时之间。如在珠心孔道封闭之前，用微量注射器将外源基因溶液注射到子房内，外源基因即可通过珠孔和珠心孔道，逐渐扩散到或在珠心孔道封闭的过程中被挤压到刚受精后的胚囊内。在受精卵分裂的过程中，外源基因被整合到受精卵细胞的基因组中，从而完成外源基因导入和整合的过程。

棉花是常异花授粉作物，为保持品种(系)的相对纯度，在开花的前一天下午，将要在第二天开花的蕾用线扣紧，使花辨不能张开，以使其自花授粉。开花后约10小时左右，即当天开花的晚6点钟左右花粉管进入胚囊后，即可进行外源基因的注射。注射前将花辨连同雄蕊剥去露出幼铃，抹去幼铃顶端的花柱，将吸取外源基因溶液的微量注射器，沿中轴垂直插入幼铃大小的2/3处，再将微量注射器向上提到1/3的地方，留下约幼铃1/3的注入空间，缓慢将注射装置内的外源溶液注射到注入空间内。此后，外源DNA溶液将沿着珠孔和珠心孔道向受精胚囊内扩散，或由于珠心孔道在逐渐封闭而被挤压进受精胚囊中实现基因的整合。注射的外源基因溶液为10μl，DNA总量约为0.25-0.5μg。外源基因注射后，为了防止和减少幼铃的脱落，提高成铃率，在幼铃柄基部用毛笔涂沫40ppm的赤霉素或用浸有40ppm赤霉素的棉球夹在幼铃柄基部和茎(枝)之间，同时将注射外源基因的幼铃所在的枝条项端摘掉，以保持幼铃的充分营养，有利于成铃和铃内种子的发育。对收获种子的后代进行抗病及分子检测，获得抗病棉植株。

2、转基因抗病棉的分子生物学检测及抗病性测试

对用上述方法获得的转基因棉花植株分别进行PCR检测及抗病性鉴定。提取转基因棉花叶片的基因组DNA，在引物5和引物6的引导下进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示(泳道1为Marker：λDNA/EcoR I+Hind III，泳道2为PCR扩增产物)，转基因植株可扩增出约1.2kb的特异性条带，表明GmeR已导入到棉花基因组中并获得表达。在转基因棉的抗黄、枯萎病温室和田间病圃鉴定中，转基因棉花播种出苗后，用枯萎7号小种(中科院微生物研究所)按3％(w/w)的比例混入营养钵土壤进行接种，以野生型棉花为对照。四周后再用黄萎北京菌系(中科院微生物研究所)接种，具体方法为：用1.2×10⁷cfu/mL的黄萎病菌液，每个营养钵加10mL，进行大菌量枯、黄萎病混合鉴定，经检测受体植株体内SGT、AGT、GO活性明显提高，表明GmeR转基因棉花抗黄、枯萎病能力明显高于对照棉花。

                         序列表

<160>3

<210>1

<211>1206

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>1

atggattatt tcaatgcacc aggaagaaac catctctttg ttccagggcc ggttaacatt     60

ccggaccaga tcatccgggc catgaacaga aacaatgagg actaccgttc cccagcaatt    120

ccagctatga caaaaacttt gcttgaggat gtcaagaaga ttttcaagac cactactgga    180

accccatttc tcatccctac aactggtact ggtgcttggg agagtgctct cacaaacaca    240

ctgtctcctg gggatcgaat tgtatcgttc ctgattggcc aattcagctt gctttggatt    300

gatcagcagc aacgcctgaa gttcaatgtt gatgttgttg agagtgaatg gggccatggt    360

gctaagcttg atgttctgga atcaaagatt gcttcagata cttcacacac tataaaggca    420

atttgcattg ttcacaatga gactgcaact ggggtcacca atgacttggc caaagtgaga    480

caaattcttg attcctacca gcatccagcc ctccttattg ttgacggagt gtcttccatt    540

tgtgctcttg atttccgcat ggatgaatgg ggagttgatg tggcaataac tggctcccag    600

aaggcccttt cccttcccac tgggataggt attgtggttg caggccctag agctattgag    660

gcctcaaaac atgctaaatc acttcgagtt ttctttgact ggaaagacta cctgaaattc    720

taccagctag gaacgtattg gccatacact ccttccatac atttgctgta tggtctgaga    780

gctgctctta atctgatttt tgaggaagga cttgaaaatg tgattgcaag acacagtcgt    840

ttaggcaaag caaccagact tgctgtagag gcatggggtt tgaagaattg cacccaaaag    900

gaagagtggt acagtgacac tgtgactgct gttcttgttc ctgcttacat tgatagtact    960

gaaatagtta gaagggcatg gaagagatac aatttgagct taggtcttgg actgaacaaa   1020

gttgctggga aggttttcag aattggacat cttggcaact tgaatgagtt gcaactgttg   1080

ggatgtctag ctggtgtgga gatgatactg aaagatgtgg gctatcctgt aaagcttgga   1140

agtggagttg ctgctgccag tgcatactta caggacacta ttcctatgat cccttccagg   1200

atttga                                                              1206

<210>2

<211>401

<212>PRT

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>2

Met Asp Tyr Phe Asn Ala Pro Gly Arg Asn His Leu Phe Val Pro Gly

1               5                   10                  15

Pro Val Asn Ile Pro Asp Gln Ile Ile Arg Ala Met Asn Arg Asn Asn

            20                  25                  30

Glu Asp Tyr Arg Ser Pro Ala Ile Pro Ala Met Thr Lys Thr Leu Leu

        35                  40                  45

Glu Asp Val Lys Lys Ile Phe Lys Thr Thr Thr Gly Thr Pro Phe Leu

    50                  55                  60

Ile Pro Thr Thr Gly Thr Gly Ala Trp Glu Ser Ala Leu Thr Asn Thr

65                  70                  75                  80

Leu Ser Pro Gly Asp Arg Ile Val Ser Phe Leu Ile Gly Gln Phe Ser

                85                  90                  95

Leu Leu Trp Ile Asp Gln Gln Gln Arg Leu Lys Phe Asn Val Asp Val

            100                 105                 110

Val Glu Ser Glu Trp Gly His Gly Ala Lys Leu Asp Val Leu Glu Ser

        115                 120                 125

Lys Ile Ala Ser Asp Thr Ser His Thr Ile Lys Ala Ile Cys Ile Val

    130                 135                 140

His Asn Glu Thr Ala Thr Gly Val Thr Asn Asp Leu Ala Lys Val Arg

145                 150                 155                 160

Gln Ile Leu Asp Ser Tyr Gln His Pro Ala Leu Leu Ile Val Asp Gly

                165                 170                 175

Val Ser Ser Ile Cys Ala Leu Asp Phe Arg Met Asp Glu Trp Gly Val

            180                 185                 190

Asp Val Ala Ile Thr Gly Ser Gln Lys Ala Leu Ser Leu Pro Thr Gly

        195                 200                 205

Ile Gly Ile Val Val Ala Gly Pro Arg Ala Ile Glu Ala Ser Lys His

    210                 215                 220

Ala Lys Ser Leu Arg Val Phe Phe Asp Trp Lys Asp Tyr Leu Lys Phe

225                 230                 235                 240

Tyr Gln Leu Gly Thr Tyr Trp Pro Tyr Thr Pro Ser Ile His Leu Leu

                245                 250                 255

Tyr Gly Leu Arg Ala Ala Leu Asn Leu Ile Phe Glu Glu Gly Leu Glu

            260                 265                 270

Asn Val Ile Ala Arg His Ser Arg Leu Gly Lys Ala Thr Arg Leu Ala

        275                 280                 285

Val Glu Ala Trp Gly Leu Lys Asn Cys Thr Gln Lys Glu Glu Trp Tyr

    290                 295                 300

Ser Asp Thr Val Thr Ala Val Leu Val Pro Ala Tyr Ile Asp Ser Thr

305                 310                 315                 320

Glu Ile Val Arg Arg Ala Trp Lys Arg Tyr Asn Leu Ser Leu Gly Leu

                325                 330                 335

Gly Leu Asn Lys Val Ala Gly Lys Val Phe Arg lle Gly His Leu Gly

            340                 345                 350

Asn Leu Asn Glu Leu Gln Leu Leu Gly Cys Leu Ala Gly Val Glu Met

        355                 360                 365

Ile Leu Lys Asp Val Gly Tyr Pro Val Lys Leu Gly Ser Gly Val Ala

    370                 375                 380

Ala Ala Ser Ala Tyr Leu Gln Asp Thr Ile Pro Met Ile Pro Ser Arg

385                 390                 395                 400

Ile

<210>3

<211>938

<212>DNA

<213>大豆属大豆(Glycine max L.Merril)

<400>3

gattggacac tgacatggac tgaaggagta gaaaagctct tactttcttc cgccatattc     60

cacaagaact ctccaaggat cctccttccc acgagattct ttggtgggaa aaatccaaga    120

ggtttgaaat ttgaaggcag ggaagatgga ttatttcaat gcaccaggaa gaaaccatct    180

ctttgttcca gggccggtta acattccgga ccagatcatc cgggccatga acagaaacaa    240

tgaggactac cgttccccag caattccagc tatgacaaaa actttgcttg aggatgtcaa    300

gaagattttc aagaccacta ctggaacccc atttctcatc cctacaactg gtactggtgc    360

ttgggagagt gctctcacaa acacactgtc tcctggggat cgaattgtat cgttcctgat    420

tggccaattc agcttgcttt ggattgatca gcagcaacgc ctgaagttca atgttgatgt    480

tgttgagagt gaatggggcc atggtgctaa gcttgatgtt ctggaatcaa agattgcttc    540

agatacttca cacactataa aggcaatttg cattgttcac aatgagactg caactggggt    600

caccaatgac ttggccaaag tgagacaaat tcttgattcc taccagcatc cagccctcct    660

tattgttgac ggagtgtctt ccatttgtgc tcttgatttc cgcatggatg aatggggagt    720

tgatgtggca ataactggct cccagaaggc cctttccctt cccactggga taggtattgt    780

ggttgcaggc cctagagcta ttgaggcctc aaaacatgct aaatcacttc gagttttctt    840

tgactggaaa gactacctga aattctacca gctaggaacg tattggccat acactccttc    900

catacatttg ctgtatggtc tgagagctgc tcttaatc                            938

Claims (8)

1、大豆酶学抗病基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

2、根据权利要求1所述的大豆酶学抗病基因，其特征在于：所述基因具有序列表中SEQ ID №：1的DNA序列。

3、权利要求1所述的大豆酶学抗病基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID №：2所示。

4、含有权利要求1或2所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。

5、一种提高双子叶植物抗非病毒类侵染性病害的方法，是将权利要求1或2所述的大豆酶学抗病基因导入植物组织或细胞，得到抗病性提高的植物。

6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述大豆酶学抗病基因通过含有所述大豆酶学抗病基因的植物表达载体导入植物组织或细胞；用于构建所述植物表达载体的出发载体为pBI121。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述植物表达载体为如图9所示的载体pGmeR121。

8、根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述植物宿主为大豆、烟草、棉花、黄瓜或香瓜。

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