CN113788886B - 黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中的应用 - Google Patents

黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，公开了黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII‑OEEP在抗瓜类疫病中的应用。本发明首次发现黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII‑OEEP对瓜类疫病具有抗性：在过量表达黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII‑OEEP的植物子叶上接种瓜类疫霉菌，病斑面积明显减小，而在沉默黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII‑OEEP的植物子叶上接种瓜类疫霉菌，病斑面积明显增大；可见，黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII‑OEEP对植物抗瓜类疫病具有非常重要的作用，可用于抗瓜类疫病、制备抗瓜类疫病的产品、培育抗瓜类疫病转基因植物，具有广泛的应用前景。

Description

黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中 的应用
技术领域
本发明属于植物分子生物学与植物遗传工程领域，具体涉及黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中的应用。
背景技术
瓜类疫病是一种世界性卵菌病害，病原菌为瓜类疫霉(Phytophthora melonis)，引起黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜等瓜类叶、茎、果变褐致死或死苗。该病在我国种植瓜类地区均有发生。在北方以夏秋露地栽培及春季保护地瓜类发生较重，在南方则以春季及夏秋高温多湿的季节发生较重。瓜类整个生长期及各个部位均可受害，幼苗被害生长点及嫩茎基部呈水渍状缢缩，萎蔫死亡。成株期茎被害，基部和节部呈水渍状、黑褐色病斑，逐渐软化缢缩，叶片下垂、植株萎蔫、死亡；叶片多在近叶缘处出现暗绿色、边缘不清晰的大型病斑；瓜果在受害处呈现水渍状、近圆形的凹陷斑，迅速腐烂，表面长出白色或灰白色稀疏霉层。一旦发病，化学药剂控制效果不理想，造成经济损失。控制该病害的最根本途径是培育抗疫病瓜类新品种，要培育高抗疫病瓜类新品种，就需要挖掘瓜类疫病抗性基因并进行应用。以往的研究表明，植物光合系统II析氧增强蛋白具有硫氧还蛋白活性，在非生物逆境胁迫中发挥重要的作用，尚未发现黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中的报道。
发明内容
本发明的第一方面的目的，在于提供黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的应用。
本发明的第二方面的目的，在于提供编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的应用。
本发明的第三方面的目的，在于提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的载体的应用。
本发明的第四方面的目的，在于提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的表达盒的应用。
本发明的第五方面的目的，在于提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的转基因细胞系的应用。
本发明的第六方面的目的，在于提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的重组菌的应用。
本发明的第七方面的目的，在于提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的重组病毒的应用。
本发明的第八方面的目的，在于提供靶向上调黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的表达量或增强黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP活性的试剂的应用。
本发明的第九方面的目的，在于提供一种培育抗瓜类疫病转基因植物的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第二个方面，提供编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第三个方面，提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的载体在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第四个方面，提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的表达盒在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第五个方面，提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的转基因细胞系在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述转基因细胞系不包含繁殖材料。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第六个方面，提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的重组菌在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第七个方面，提供包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的重组病毒在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第八个方面，提供靶向上调黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的表达量或增强黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP活性的试剂在(1)～(3)中任一项中的应用；
(1)抗瓜类疫病；
(2)制备抗瓜类疫病的产品；
(3)培育抗瓜类疫病转基因植物。
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的第九个方面，提供一种培育抗瓜类疫病转基因植物的方法，包括如下步骤：向目的植物中导入编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子，得到抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌(Phytophthora melonis)引发的病害。
优选地，所述植物为黄瓜、南瓜、冬瓜、苦瓜、丝瓜和节瓜中的至少一种；进一步为黄瓜和南瓜中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP对瓜类疫病具有抗性：在过量表达黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的植物子叶上接种瓜类疫霉菌，病斑面积明显减小，而在沉默黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的植物子叶上接种瓜类疫霉菌，病斑面积明显增大；可见，黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP对植物抗瓜类疫病具有非常重要的作用，可用于抗瓜类疫病、制备抗瓜类疫病的产品、培育抗瓜类疫病转基因植物，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是pGWB5质粒图谱。
图2是pK7GWIW质粒图谱。
图3是CsPSII-OEEP单克隆抗体制备过程图。
图4不同处理的黄瓜子叶中CsPSII-OEEP蛋白表达量的检测结果图。
图5是不同处理的黄瓜对瓜类疫病的抗性功能结果图：其中，A是不同处理的黄瓜对瓜类疫病的抗性功能的直观图；B是不同处理的黄瓜叶片的病斑面积统计结果图；不同字母代表存在显著性差异(p＜0.05)。
图6是不同处理的南瓜子叶中CsPSII-OEEP蛋白表达量的检测结果图。
图7是不同处理的南瓜对瓜类疫病的抗性功能结果图：其中，A是不同处理的南瓜对瓜类疫病的抗性功能的直观图；B是不同处理的南瓜叶片的病斑面积统计结果图；不同字母代表存在显著性差异(p＜0.05)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。本实验使用黄瓜材料为本单位林毓娥老师于1995年2月从亚蔬中心(泰国曼谷)引进，自交留种，已于专利文献：CN112175988B中公开。南瓜材料为广蜜1号，从广东科农蔬菜种业公司购买所得。瓜类疫霉菌为本实验室2012年从广州白云区黄瓜病株分离所得，已在文献：王瑞,林毓娥,梁肇均,金庆敏,吴廷全.广东地区黄瓜疫病病原菌的分离与鉴定[J].中国农学通报,2016,32(01):76-80.中公开。
实施例1黄瓜CsPSII-OEEP基因过表达载体的构建
黄瓜CsPSII-OEEP基因属于黄瓜光合系统II成员蛋白基因。将黄瓜CsPSII-OEEP基因CDS全长(SEQ ID NO.2)构建到pGWB5(pGWB5质粒图谱如图1所示)上，具体位置为35S启动子后attR1和attR2之间(通过基因重组交换替代了ccdB基因)，得到过量表达载体(pGWB5-CsPSII-OEEP)；将黄瓜CsPSII-OEEP基因CDS非保守区段239bp长度的片段(CDS 1-239bp，SEQ ID NO.4)及其互补片段构建到pK7GWIW上(pK7GWIW质粒图谱如图2所示)，具体位置为35S启动子后两个attR1和attR2之间(通过基因重组交换替代了ccdB基因)，得到基因沉默载体(pK7GWIW-CsPSII-OEEP)。
黄瓜CsPSII-OEEP蛋白的氨基酸序列为(332aa)：
MAASVQAAAATLMQPSKLASRTTTSHLRSSQSLSKAFGLESSGPRLTCSLHSDLKDVSRKFADAAKIAGFALATSALVVSGAGAEGVPKRLTFDEIQSKTYLEVKGTGTANQCPTIDGGVDSFAFKAGKYQAKKFCLEPTSFTVKAEGVSKNAPPEFQNTKLMTRLTYTLDEIEGPFEVGADGSIKFEEKDGIDYAAVTVQLPGGERVPFLFTIKQLVASGKPESFSGDFLVPSYRGSSFLDPKGRGGSTGYDNAVALPAGGRGDEEELAKENIKNASSSTGKITLSVTKSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKAPKDVKIQGVWYAQLDS(SEQ ID NO.1)。
黄瓜CsPSII-OEEP基因CDS(999bp)序列为：
ATGGCGGCTTCAGTTCAGGCGGCCGCGGCTACCCTTATGCAACCCTCCAAGTTGGCTTCAAGAACTACCACCTCTCACCTCAGATCTTCTCAATCCCTTTCTAAAGCCTTTGGCCTTGAATCTTCCGGACCTAGACTCACCTGCTCTCTTCACTCCGATCTCAAAGACGTTTCTCGCAAGTTTGCCGATGCTGCTAAGATTGCCGGCTTCGCTCTTGCCACTTCCGCTCTTGTCGTTTCGGGAGCTGGTGCTGAAGGAGTACCAAAGAGACTCACCTTTGATGAAATTCAGAGCAAGACATACCTTGAAGTTAAGGGAACTGGAACAGCTAACCAGTGCCCAACCATTGATGGAGGAGTTGATTCATTTGCCTTCAAGGCAGGCAAATATCAAGCCAAGAAATTCTGTCTTGAGCCAACTTCTTTCACTGTGAAGGCTGAAGGAGTGAGCAAGAACGCCCCACCAGAATTCCAAAACACCAAGCTCATGACTCGTCTAACTTACACACTAGACGAGATTGAAGGACCCTTTGAAGTTGGTGCTGATGGTTCGATCAAGTTTGAGGAGAAAGATGGAATTGACTATGCTGCTGTCACTGTCCAGTTGCCGGGAGGTGAGCGTGTCCCGTTCCTCTTCACCATCAAACAATTGGTGGCTTCTGGAAAACCAGAGAGCTTTAGTGGAGACTTTTTAGTCCCATCTTACCGTGGCTCGTCTTTCTTGGACCCAAAGGGAAGAGGAGGTTCAACTGGATATGATAATGCTGTTGCATTGCCTGCTGGAGGGAGAGGTGATGAAGAAGAACTTGCTAAAGAAAACATAAAGAATGCTTCATCTTCAACAGGGAAAATCACTTTGAGTGTGACCAAGAGCAAGCCTGAGACTGGTGAAGTTATTGGTGTGTTTGAGAGTATTCAGCCTTCTGATACCGATTTGGGAGCAAAAGCTCCCAAGGATGTGAAGATCCAGGGTGTTTGGTATGCTCAGCTTGACTCTTAG(SEQ ID NO.2)。
黄瓜CsPSII-OEEP基因(2166bp)全长序列为：
GAATTAAAAAGTATATCCAAGTAGAAAATGAGTTTGTATGCCACGTGGAAGAAAATTGAGGCAAAGAATGATGAGGGAATCATCCAATGAGATTTTTCTTATCCAATTCATTATCTTACTCTAACCAAAACCACATAATTCATTTCCTAAATCCTCTCTACTCTCCGTTATAGTTTCAGTATCATTCCCCGCACAAAATTTCACTTCTCCTCTCTTACACTCAATCCGGATACAACAATGGCGGCTTCAGTTCAGGCGGCCGCGGCTACCCTTATGCAACCCTCCAAGTTGGCTTCAAGAACTACCACCTCTCACCTCAGATCTTCTCAATCCCTTTCTAAAGCCTTTGGCCTTGAATCTTCCGGACCTAGACTCACCTGCTCTCTTCACTCCGATCTCAAAGACGTTTCTCGCAAGTTTGCCGATGCTGCTAAGATTGCCGGCTTCGCTCTTGCCACTTCCGCTCTTGTCGTTTCGGTATGTTCTTATCGTACTTTCCTTCCACGATTACTTTCTTCTTATGATTCTCCACGATGCTTTATATTTGCGTTTGGATGTGAATGTCTGTATTGTTTTAGTTGCTGATATTGAATTGAGTTCTTGGAGAAAATAATTATAGTTCAGACTTAGAATGGGTAATTGATAATCTCCGAATTTGTTTAACTTAGTGGCAATTTCTTGCCAAATAAAGGATCAAACTACTTAGATCCAAGTGGAATAATCCATTTGATTCTCTGTGACTTAATAAAGTACCTGTTGTTCTTAATTTAACTTGTAATTCATTTTTACATTAATGATCCCATAACATTTTCATTATACTATTCAATCAAGGATTATTTGAAAATCAGTCCACCACATAGTCCACTGATGATATATGGTTAGTGTGTTACGGTAAGTCTTAAATGACTTAAATATTAGATACAGACTTTAAAGTTTTAAAGCGTTAAAGAAAATCTCACTTCAAGGACTTAATTAGTCTGAGTACACTTGATATATGAGATCTAAGAATGTCTAGACTGATTAACACTTGATATATACAAAGTGTAATCCTACAACTTGGTGAGCATCTTAATTGTTCGATACTTTTCATGTATTTCCAGGGAGCTGGTGCTGAAGGAGTACCAAAGAGACTCACCTTTGATGAAATTCAGAGCAAGACATACCTTGAAGTTAAGGGAACTGGAACAGCTAACCAGTGCCCAACCATTGATGGAGGAGTTGATTCATTTGCCTTCAAGGCAGGCAAATATCAAGCCAAGAAATTCTGTCTTGAGCCAACTTCTTTCACTGTGAAGGCTGAAGGAGTGAGCAAGAACGCCCCACCAGAATTCCAAAACACCAAGCTCATGACTCGTCTAACTTACACACTAGACGAGATTGAAGGACCCTTTGAAGTTGGTGCTGATGGTTCGATCAAGTTTGAGGAGAAAGATGGAATTGACTATGCTGCTGTCACTGTCCAGTTGCCGGGAGGTGAGCGTGTCCCGTTCCTCTTCACCATCAAACAATTGGTGGCTTCTGGAAAACCAGAGAGCTTTAGTGGAGACTTTTTAGTCCCATCTTACCGTGGCTCGTCTTTCTTGGACCCAAAGGGAAGAGGAGGTTCAACTGGATATGATAATGCTGTTGCATTGCCTGCTGGAGGGAGAGGTGATGAAGAAGAACTTGCTAAAGAAAACATAAAGAATGCTTCATCTTCAACAGGGAAAATCACTTTGAGTGTGACCAAGAGCAAGCCTGAGACTGGTGAAGTTATTGGTGTGTTTGAGAGTATTCAGCCTTCTGATACCGATTTGGGAGCAAAAGCTCCCAAGGATGTGAAGATCCAGGGTGTTTGGTATGCTCAGCTTGACTCTTAGGCCCCCCTTTCTTCTTTTATGATTGTGTAATATTGTTCCTTGTAAGTTAAAAGAGAGAGTTGCTAAACTTTCTTATGGAGAGAGACGCTAGCAGGGGTTCTATTTTTATCCAAGTTTGCATATAAAATCTTGTGCCTTTTCACTCTTTCTCAAACATACATTTGCTTAACTTCATAACTTTAGAGGAAGAGATGGAATCATCAATCTTTGAGATGATTTAGAGGAATGAATAGAATATATAAAACTTTTTAGATGAAATCTAAAGCAATTTATGAGAATTATGTTCAAAAGTAGACAATATCATACA(SEQ ID NO.3)。
黄瓜CsPSII-OEEP基因CDS非保守区段239bp长度的片段如下所示：
ATGGCGGCTTCAGTTCAGGCGGCCGCGGCTACCCTTATGCAACCCTCCAAGTTGGCTTCAAGAACTACCACCTCTCACCTCAGATCTTCTCAATCCCTTTCTAAAGCCTTTGGCCTTGAATCTTCCGGACCTAGACTCACCTGCTCTCTTCACTCCGATCTCAAAGACGTTTCTCGCAAGTTTGCCGATGCTGCTAAGATTGCCGGCTTCGCTCTTGCCACTTCCGCTCTTGTCGTTTC(SEQ ID NO.4)。
实施例2构建瞬时过量表达/基因沉默的黄瓜子叶模型
(1)将实施例1中过量表达载体和沉默载体分别转化农杆菌GV3101，在相应抗性的培养基上倒置培养48h。
(2)挑取单克隆加入到4mL含有相应抗生素及利福平的LB培养基中，28℃，180rpm摇菌24h。
(3)按1:100比例加入新鲜含有相应抗生素及利福平的LB培养基中，28℃，180rpm摇菌到OD600值约3.0。
(4)3000rpm离心5分钟收集菌体，用悬浮液(10mM MES,10mM MgCl2)重悬菌体，并调整OD600值到0.4左右，加入200mM乙酰丁香酮。
(5)室温静置3h。
(6)用注射器针头在黄瓜子叶主叶脉两侧各扎一个针孔。
(7)用1mL注射器吸取等量静置过后的菌液，注射器对准背面的针孔，正面用手堵住，注射进菌液。
(8)注射后的黄瓜幼苗黑暗培养12h后22℃光照培养3天。
通过Western Blot检测CsPSII-OEEP蛋白瞬时过量表达、沉默及野生型对照的黄瓜离体子叶中检测CsPSII-OEEP蛋白的表达量。
具体步骤如下：
(1)将收集的黄瓜子叶液氮速冻后研磨加入蛋白提取液(50mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl,0.1％Triton X-100,0.2％乙基苯基聚乙二醇(NP-40),1mM苯甲基磺酰氟(PMSF),1×plant protease inhibitor cocktail)(Sigma，P8340-5ML))混匀置于冰上30分钟。
(2)4℃14000rpm离心10min，收集上清液80uL加入20uL蛋白上样缓冲液均匀混合后沸水浴10分钟。
(3)取20uL样品在SDS-PAGE凝胶上进行电泳分离。
(4)将电泳后的蛋白样品转到PVDF膜上，用5％PBST牛奶孵育封膜。
(5)在封闭液中加入一抗(CsPSII-OEEP单克隆抗体，制备方法如图3所示)孵育2小时，用PBST洗膜，每次5min，洗4次。
(6)随后加入二抗(Invitrogen，Goat anti-Mouse IgG,IgM,IgA(H+L)SecondaryAntibody,HRP，A-10668)，孵育30min，用PBST洗膜，每次5min，洗4次。
(7)对膜进行扫描显色，结果见附图4。
结果表明CsPSII-OEEP基因瞬时过量表达的黄瓜子叶(pGWB5-CsPSII-OEEP)中CsPSII-OEEP蛋白表达量显著高于野生型对照(Control)，而CsPSII-OEEP基因沉默的黄瓜子叶(pK7GWIW-CsPSII-OEEP)中CsPSII-OEEP蛋白表达量明显小于野生型对照(Control)。说明CsPSII-OEEP瞬时过量表达的黄瓜子叶模型以及CsPSII-OEEP基因沉默的黄瓜子叶模型均构建成功。
实施例3黄瓜子叶抗病实验
对实施例2中构建成功的CsPSII-OEEP瞬时过量表达的黄瓜子叶模型、CsPSII-OEEP基因沉默的黄瓜子叶模型以及野生型的黄瓜子叶，将注射后的黄瓜幼苗黑暗培养12h后22℃光照培养3天后将黄瓜子叶离体，并接种瓜类疫霉菌后将黄瓜子叶于28℃培养皿中，黑暗培养24h。
依据不同处理的黄瓜离体子叶病斑大小来判断目的基因对疫病的抗性功能，结果如附图5所示。
结果显示在黄瓜子叶中瞬时过量表达CsPSII-OEEP基因(pGWB5-CsPSII-OEEP)能够使黄瓜子叶对疫病的抗性较对照(Control)明显增强，而在黄瓜子叶中瞬时沉默CsPSII-OEEP基因(pK7GWIW-CsPSII-OEEP)则使黄瓜子叶对疫病的抗性较对照(Control)明显减弱。对每个处理的50个叶片病斑面积统计取均数(利用photoshop的像素数代替面积)，随后，利用过量表达、沉默、对照的叶面积进行显著性分析和比较。结果显示，过量表达CsPSII-OEEP基因叶片的病斑面积较对照显著减小，而沉默CsPSII-OEEP基因叶片的病斑面积显著增大(图5)。
实施例4南瓜子叶抗病实验
采用与实施例2中方法相同的操作步骤，同样构建了CsPSII-OEEP瞬时过量表达的南瓜子叶，并通过Western Blot检测CsPSII-OEEP蛋白瞬时过量表达及野生型对照的南瓜离体子叶中检测CsPSII-OEEP蛋白的表达量，结果如附图6所示：CsPSII-OEEP基因瞬时过量表达的南黄瓜子叶(pGWB5-CsPSII-OEEP)中CsPSII-OEEP蛋白表达量显著高于野生型对照(Control)。
将注射后的南瓜幼苗黑暗培养12h后22℃光照培养3天后将南瓜子叶离体，并接种瓜类疫霉菌后将南瓜子叶于28℃培养皿中，黑暗培养24h。
依据不同处理的南瓜离体子叶病斑大小来判断目的基因对疫病的抗性功能，结果如附图7所示。
结果显示：瞬时过量表达CsPSII-OEEP基因叶片的病斑面积较对照显著减小，抗病性明显增强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蔬菜研究所
<120> 黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在抗瓜类疫病中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 332
<212> PRT
<213> Cucumis sativus Linn.
<400> 1
Met Ala Ala Ser Val Gln Ala Ala Ala Ala Thr Leu Met Gln Pro Ser
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ser Arg Thr Thr Thr Ser His Leu Arg Ser Ser Gln Ser
20 25 30
Leu Ser Lys Ala Phe Gly Leu Glu Ser Ser Gly Pro Arg Leu Thr Cys
35 40 45
Ser Leu His Ser Asp Leu Lys Asp Val Ser Arg Lys Phe Ala Asp Ala
50 55 60
Ala Lys Ile Ala Gly Phe Ala Leu Ala Thr Ser Ala Leu Val Val Ser
65 70 75 80
Gly Ala Gly Ala Glu Gly Val Pro Lys Arg Leu Thr Phe Asp Glu Ile
85 90 95
Gln Ser Lys Thr Tyr Leu Glu Val Lys Gly Thr Gly Thr Ala Asn Gln
100 105 110
Cys Pro Thr Ile Asp Gly Gly Val Asp Ser Phe Ala Phe Lys Ala Gly
115 120 125
Lys Tyr Gln Ala Lys Lys Phe Cys Leu Glu Pro Thr Ser Phe Thr Val
130 135 140
Lys Ala Glu Gly Val Ser Lys Asn Ala Pro Pro Glu Phe Gln Asn Thr
145 150 155 160
Lys Leu Met Thr Arg Leu Thr Tyr Thr Leu Asp Glu Ile Glu Gly Pro
165 170 175
Phe Glu Val Gly Ala Asp Gly Ser Ile Lys Phe Glu Glu Lys Asp Gly
180 185 190
Ile Asp Tyr Ala Ala Val Thr Val Gln Leu Pro Gly Gly Glu Arg Val
195 200 205
Pro Phe Leu Phe Thr Ile Lys Gln Leu Val Ala Ser Gly Lys Pro Glu
210 215 220
Ser Phe Ser Gly Asp Phe Leu Val Pro Ser Tyr Arg Gly Ser Ser Phe
225 230 235 240
Leu Asp Pro Lys Gly Arg Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Asp Asn Ala Val
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Gly Gly Arg Gly Asp Glu Glu Glu Leu Ala Lys Glu
260 265 270
Asn Ile Lys Asn Ala Ser Ser Ser Thr Gly Lys Ile Thr Leu Ser Val
275 280 285
Thr Lys Ser Lys Pro Glu Thr Gly Glu Val Ile Gly Val Phe Glu Ser
290 295 300
Ile Gln Pro Ser Asp Thr Asp Leu Gly Ala Lys Ala Pro Lys Asp Val
305 310 315 320
Lys Ile Gln Gly Val Trp Tyr Ala Gln Leu Asp Ser
325 330
<210> 2
<211> 999
<212> DNA
<213> Cucumis sativus Linn.
<400> 2
atggcggctt cagttcaggc ggccgcggct acccttatgc aaccctccaa gttggcttca 60
agaactacca cctctcacct cagatcttct caatcccttt ctaaagcctt tggccttgaa 120
tcttccggac ctagactcac ctgctctctt cactccgatc tcaaagacgt ttctcgcaag 180
tttgccgatg ctgctaagat tgccggcttc gctcttgcca cttccgctct tgtcgtttcg 240
ggagctggtg ctgaaggagt accaaagaga ctcacctttg atgaaattca gagcaagaca 300
taccttgaag ttaagggaac tggaacagct aaccagtgcc caaccattga tggaggagtt 360
gattcatttg ccttcaaggc aggcaaatat caagccaaga aattctgtct tgagccaact 420
tctttcactg tgaaggctga aggagtgagc aagaacgccc caccagaatt ccaaaacacc 480
aagctcatga ctcgtctaac ttacacacta gacgagattg aaggaccctt tgaagttggt 540
gctgatggtt cgatcaagtt tgaggagaaa gatggaattg actatgctgc tgtcactgtc 600
cagttgccgg gaggtgagcg tgtcccgttc ctcttcacca tcaaacaatt ggtggcttct 660
ggaaaaccag agagctttag tggagacttt ttagtcccat cttaccgtgg ctcgtctttc 720
ttggacccaa agggaagagg aggttcaact ggatatgata atgctgttgc attgcctgct 780
ggagggagag gtgatgaaga agaacttgct aaagaaaaca taaagaatgc ttcatcttca 840
acagggaaaa tcactttgag tgtgaccaag agcaagcctg agactggtga agttattggt 900
gtgtttgaga gtattcagcc ttctgatacc gatttgggag caaaagctcc caaggatgtg 960
aagatccagg gtgtttggta tgctcagctt gactcttag 999
<210> 3
<211> 2166
<212> DNA
<213> Cucumis sativus Linn.
<400> 3
gaattaaaaa gtatatccaa gtagaaaatg agtttgtatg ccacgtggaa gaaaattgag 60
gcaaagaatg atgagggaat catccaatga gatttttctt atccaattca ttatcttact 120
ctaaccaaaa ccacataatt catttcctaa atcctctcta ctctccgtta tagtttcagt 180
atcattcccc gcacaaaatt tcacttctcc tctcttacac tcaatccgga tacaacaatg 240
gcggcttcag ttcaggcggc cgcggctacc cttatgcaac cctccaagtt ggcttcaaga 300
actaccacct ctcacctcag atcttctcaa tccctttcta aagcctttgg ccttgaatct 360
tccggaccta gactcacctg ctctcttcac tccgatctca aagacgtttc tcgcaagttt 420
gccgatgctg ctaagattgc cggcttcgct cttgccactt ccgctcttgt cgtttcggta 480
tgttcttatc gtactttcct tccacgatta ctttcttctt atgattctcc acgatgcttt 540
atatttgcgt ttggatgtga atgtctgtat tgttttagtt gctgatattg aattgagttc 600
ttggagaaaa taattatagt tcagacttag aatgggtaat tgataatctc cgaatttgtt 660
taacttagtg gcaatttctt gccaaataaa ggatcaaact acttagatcc aagtggaata 720
atccatttga ttctctgtga cttaataaag tacctgttgt tcttaattta acttgtaatt 780
catttttaca ttaatgatcc cataacattt tcattatact attcaatcaa ggattatttg 840
aaaatcagtc caccacatag tccactgatg atatatggtt agtgtgttac ggtaagtctt 900
aaatgactta aatattagat acagacttta aagttttaaa gcgttaaaga aaatctcact 960
tcaaggactt aattagtctg agtacacttg atatatgaga tctaagaatg tctagactga 1020
ttaacacttg atatatacaa agtgtaatcc tacaacttgg tgagcatctt aattgttcga 1080
tacttttcat gtatttccag ggagctggtg ctgaaggagt accaaagaga ctcacctttg 1140
atgaaattca gagcaagaca taccttgaag ttaagggaac tggaacagct aaccagtgcc 1200
caaccattga tggaggagtt gattcatttg ccttcaaggc aggcaaatat caagccaaga 1260
aattctgtct tgagccaact tctttcactg tgaaggctga aggagtgagc aagaacgccc 1320
caccagaatt ccaaaacacc aagctcatga ctcgtctaac ttacacacta gacgagattg 1380
aaggaccctt tgaagttggt gctgatggtt cgatcaagtt tgaggagaaa gatggaattg 1440
actatgctgc tgtcactgtc cagttgccgg gaggtgagcg tgtcccgttc ctcttcacca 1500
tcaaacaatt ggtggcttct ggaaaaccag agagctttag tggagacttt ttagtcccat 1560
cttaccgtgg ctcgtctttc ttggacccaa agggaagagg aggttcaact ggatatgata 1620
atgctgttgc attgcctgct ggagggagag gtgatgaaga agaacttgct aaagaaaaca 1680
taaagaatgc ttcatcttca acagggaaaa tcactttgag tgtgaccaag agcaagcctg 1740
agactggtga agttattggt gtgtttgaga gtattcagcc ttctgatacc gatttgggag 1800
caaaagctcc caaggatgtg aagatccagg gtgtttggta tgctcagctt gactcttagg 1860
cccccctttc ttcttttatg attgtgtaat attgttcctt gtaagttaaa agagagagtt 1920
gctaaacttt cttatggaga gagacgctag caggggttct atttttatcc aagtttgcat 1980
ataaaatctt gtgccttttc actctttctc aaacatacat ttgcttaact tcataacttt 2040
agaggaagag atggaatcat caatctttga gatgatttag aggaatgaat agaatatata 2100
aaacttttta gatgaaatct aaagcaattt atgagaatta tgttcaaaag tagacaatat 2160
cataca 2166
<210> 4
<211> 239
<212> DNA
<213> Cucumis sativus Linn.
<400> 4
atggcggctt cagttcaggc ggccgcggct acccttatgc aaccctccaa gttggcttca 60
agaactacca cctctcacct cagatcttct caatcccttt ctaaagcctt tggccttgaa 120
tcttccggac ctagactcac ctgctctctt cactccgatc tcaaagacgt ttctcgcaag 180
tttgccgatg ctgctaagat tgccggcttc gctcttgcca cttccgctct tgtcgtttc 239

Claims (9)

1.黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
2.编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
3.包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的载体在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
4.包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的表达盒在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
5.包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的转基因细胞系在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
6.包含编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子的重组菌或重组病毒在（1）～（3）中任一项中的应用；
（1）抗瓜类疫病；
（2）制备抗瓜类疫病的产品；
（3）培育抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
7.根据权利要求2～6中任一项所述的应用，其特征在于：
所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
8.一种培育抗瓜类疫病转基因植物的方法，包括如下步骤：向目的植物中导入编码黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的核酸分子，得到抗瓜类疫病转基因植物；
所述黄瓜光合系统II析氧增强蛋白CsPSII-OEEP的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述所述瓜类疫病为瓜类疫霉菌（Phytophthora melonis）引发的病害。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述核酸分子的序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
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