CN114891645B - 棘孢木霉hb40619及其应用 - Google Patents

棘孢木霉hb40619及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619，该菌株于2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40143；本发明提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在防治番茄叶片枯萎病中、制备防治尖孢镰刀菌所致病害的生防制剂中、制备防治番茄叶片枯萎病的制剂中的均有应用；本发明提供的棘孢木霉HB40619，可以有效抑制尖孢镰刀菌；经过棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄幼苗表现出对尖孢镰刀菌较显著地抗病效果；同时，在测量叶片中叶绿素荧光相关参数以及激素含量后发现，棘孢木霉HB40619菌株能够保护番茄幼苗中光合系统II并可以诱导植株激素含量变化，以提高抗病性；并且可以调节植株体内抗性激素变化，诱导番茄幼苗防御反应，提高抗病性。

Description

棘孢木霉HB40619及其应用
技术领域
本发明涉及微生物和生物废了技术领域，具体涉及棘孢木霉HB40619及其应用。
背景技术
木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科。木霉菌能够诱导植物系统抗性、对病原菌有竞争作用、抗性作用和重寄生作用，是一类具有巨大生防潜力的真菌。
目前对于木霉菌的研究主要集中在哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)、绿色木霉(Trichoderma virens)、里氏木霉(Trichodermareesei)和长枝木霉(Trichoderma longbrachiatum)这几种木霉菌中，鲜见对于棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌种的研究以及将其应用于生物防治番茄叶片枯萎病的研究中。
发明内容
发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619及其应用，本发明的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)具有对尖孢镰刀菌的抑制作用，并且不仅可以保护番茄幼苗中光合系统II，而且可以调节植株激素含量变化，激活植株诱导系统抗性(ISR)，以提高植物的抗病性。
技术方案：本发明所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619，该菌株于2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.40143。
本发明提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在防治番茄叶片枯萎病中的应用。
本发明提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在制备防治尖孢镰刀菌所致病害的生防制剂的应用。
本发明提供棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在制备防治番茄叶片枯萎病的制剂的应用。
本发明提供一种生防菌剂，包含有所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619。
本发明提供一种生防菌剂，所述菌剂的类型为分生孢子洗脱液和/或分生孢子悬浮液。
本发明提供一种制备生防菌剂的方法，所述分生孢子洗脱液的制备方法如下，
步骤1、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为25℃～28℃，光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤2、在所述单菌落的边缘取出菌丝块接种到PDA平板培养7d，培养条件为：25℃、光照，得到分生孢子；
步骤3、添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，过滤菌丝，得到所述分生孢子洗脱液。
本发明提供一种制备生防菌剂的方法，所述分生孢子悬浮液的制备方法如下，
步骤A、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为23℃～27℃光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤B、选取单菌落边缘的菌丝块接种至PDB液体培养基中，200rpm/min摇培3～5d，得到培养物；
步骤C、将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得到所述分生孢子悬浮液。
本发明提供一种防治番茄叶片枯萎病的方法，将所述的分生孢子洗脱液于番茄幼苗移栽前进行蘸根，或/和将分生孢子悬浮液于番茄幼苗移栽后进行灌根。
进一步地，分生孢子洗脱液的活菌浓度为1x107个/ml；所述分生孢子悬浮液的活菌浓度为1x107个/ml。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明提供了一种具有生防作用的棘孢木霉HB40619菌株；(2)本发明提供的棘孢木霉HB40619，可以有效抑制尖孢镰刀菌；经过棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌混合孢子液处理的番茄幼苗表现出对尖孢镰刀菌较显著地抗病效果；(3)同时，在测量叶片中叶绿素荧光相关参数以及激素含量后发现，棘孢木霉HB40619菌株能够保护番茄幼苗中光合系统II并可以诱导植株激素含量变化，以提高抗病性；(4)本发明提供的棘孢木霉HB40619可以调节植株体内抗性激素变化，诱导番茄幼苗防御反应，提高抗病性。
附图说明
图1为棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌在PDA培养基上共同培养7天对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用；
图2为棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株表型，图中Control表示清水处理，F.oxy表示尖孢镰刀菌处理，HB40619&F.oxy表示HB40619菌株和尖孢镰刀菌混合处理；
图3为棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株病情指数；
图4为棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，植株发病率；
图5为棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，番茄叶片中叶绿素荧光相关参数发生变化，使番茄抗逆性增强；
图6为棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液对番茄幼苗浸根后，番茄植株内水杨酸和茉莉酸含量变化。
具体实施方式
下面通过附图对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。
实施例1棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619的分离、纯化、鉴定和保藏
1、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619的分离、纯化
从田间取回含有木霉的土壤，把采集的土样自然晾干后辗碎，过筛。称取10g土样置于盛有90mL无菌水的烧瓶中，用涡旋仪充分振荡.吸取10mL悬浮液于90mL无菌水中稀释，再从稀释的悬浮液中吸取10mL于90mL无菌水中稀释，如此类推，稀释至体积分数为10-3、10-4、10-5。用微量移液枪从各含量的土壤悬浮液中吸取0.1mL悬浮液分散滴于马丁氏——孟加拉红平板上，再用灭菌的三角玻璃棒涂匀，静置20min后于25℃的恒温培养箱中倒置培养，菌落形成后立即纯化。
将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上培养，得到单菌落，所述培养的温度优选为25℃，时间优选为3d。本发明对所述PDA平板的组成并没有特殊限定，优选利用本领域的常规平板培养基即可。
实施例中所用的PDA平板的配方包括：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉10g，补充蒸馏水至1000ml。在制备所述PDA平板时，本实施例将洗净后去皮的马铃薯切片，加水煮沸约半小时，用纱布滤去马铃薯，然后加入葡萄糖，将琼脂粉加水搅拌均匀，加入上述溶液中，再加水定容，搅拌溶解后分装灭菌。
短期保存的菌种于PDA斜面试管中，保存于4℃冰箱中；长期保存的菌种放置于-80℃的冰箱中。
2、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619的鉴定
将木霉菌在PDA平板上培养3d，用直径为0.5cm的打孔器打取菌饼，置于PDA平板上，于25℃、光照条件下培养5d，观察菌落形状和颜色等。
在显微镜下观察木霉菌分生孢子梗的分枝情况和分生孢子的形态，木霉菌落长出白色绒状气生菌丝，呈圆形快速向四周扩展，菌落中央产生墨绿色孢子附着在菌丝上，并随着菌丝向四周扩展，最后整个菌落全部变成墨绿色。该木霉菌丝约宽度为1.4～3.1微米不等，主枝次枝分明较粗壮、成对分布于主枝两侧。菌落产生的圆形墨绿色分生孢子梗垂直对称分歧，单生或簇生，并且在24℃-30℃条件下放置的分生孢子易于萌发。结合培养性状并参考Rifai和Bissett的木霉菌种群分类系统进行种类鉴定。
3、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619的保藏
棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619，该菌株于2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40143。
实施例2棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619分生孢子洗脱液的制备
步骤1、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为25℃～28℃，光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤2、在所述单菌落的边缘取出菌丝块接种到PDA平板培养7d，培养条件为：25℃、得到分生孢子；
步骤3、添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，过滤菌丝，得到所述分生孢子洗脱液。
实施例3棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619分生孢子悬浮液的制备
步骤A、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为23℃～27℃，光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤B、选取单菌落边缘的菌丝块接种至PDB液体培养基中，200rpm/min摇培3～5d，得到培养物；
步骤C、将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得到所述分生孢子悬浮液。
实施例4棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619的平板对峙实验
将保存的HB40619菌株和尖孢镰刀菌分别在PDA平板上活化，在超净工作台里用打孔器在PDA培养基平板上打孔，得到5×5mm的菌饼，将两种菌转接到新的PDA平板，室温培养7天。
结果如图1所示，棘孢木霉HB40619菌株相同时间内能占取平板更多生长空间和营养、在木霉与病原菌之间产生了明显的抑菌圈，表明该木霉并能够产生抗性物质显著抑制尖孢镰刀菌菌丝生长。
实施例5棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619防治番茄叶片枯萎病
1、实验材料
制备尖孢镰刀菌孢子洗脱液：将尖孢镰刀菌接种在PDA培养基上25℃下培养3d，得到尖孢镰刀菌菌落；将尖孢镰刀菌边缘菌丝接种到PDA培养皿上培养7d；向培养皿中加入无菌水，刮洗菌落表面的分生孢子，混匀，即得到尖孢镰刀菌分生孢子洗脱液，调整其浓度为1x107个/ml。
实施例2和实施例3中得到的棘孢木霉HB40619分生孢子洗脱液和棘孢木霉HB40619分生孢子悬浮液，利用血球计数板在显微镜下计数，调整分生孢子洗脱液和分生孢子悬浮液浓度为1x107个/ml。
2、实验方法
将生长3周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，分别浸泡在清水、棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液(1x107个/ml)、尖孢镰刀菌孢子洗脱液(1x107个/ml)、棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌孢子混合洗脱液(1x107个/ml)中，时间为15～20min，定植于穴盘中，每一组处理24株。处理后，番茄在苗期出现表型差异，如图2所示。
由图2可知，混合孢子液处理组和单独棘孢木霉HB40619处理组的番茄幼苗生长健壮，显著增强植株抗病性。
根据番茄植株发病状态划分为4级：
0级：植株生长健壮，叶片自然舒展、绿色明亮，茎部粗壮；
1级：植株挺立，叶片黄化萎蔫面积小于叶总面积50％，茎基部褐化；
2级：植株叶片黄化萎蔫面积大于总叶面积50％，顶部叶片发黄且皱缩，茎部枯黄
皱缩；
3级：植株矮小枯萎，叶片枯黄卷曲皱缩，仅生长点存活，茎部萎蔫；
4级：植株枯萎至死。
根据发病等级计算病情指数：病情指数(％)＝∑(各级病株数×相应病级)/(总株数×最高病级)×100％。以病情指数作为棘孢木霉HB40619菌株分生孢子洗脱液对尖孢镰刀菌孢子洗脱液的抑制效果。如图3和表1所示。
表1不同处理组对对番茄枯萎病病情指数的影响
Figure BDA0003649372850000061
计算发病率(处于2～4级即判定为枯萎病番茄植株)：发病率(％)＝该处理发病植株数/该处理发病植株总数×100％。以发病率作为棘孢木霉HB40619菌株分生孢子洗脱液对尖孢镰刀菌导致番茄枯萎病的防治效果。如图4和表2所示。
表2不同处理组对番茄枯萎病发病率的影响
Figure BDA0003649372850000071
由图3和表1可知，尖孢镰刀菌侵染番茄幼苗后，F.oxy处理组的植株出现严重的发病情况，病情指数高达70％以上，显著影响番茄的生长状况。与之相比，619&F.oxy处理组的病情指数显著降低，植株的患病表型较轻；同时，由图4和表2可知，F.oxy处理组的植株发病率极高，均在83％以上，而619&F.oxy处理组的植株发病率显著降低在20％左右，表明棘孢木霉HB40619能够有效防治番茄苗期枯萎病，显著降低枯萎病的发病率和病情指数。
实施例6
将生长3周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，分别浸泡在清水、棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液(1x107个/ml)、尖孢镰刀菌孢子洗脱液(1x107个/ml)、棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌孢子混合洗脱液(1x107个/ml)中，时间为15～20min，定植于穴盘中，每一组处理24株。
四种处理出现表型差异后取样，摘取番茄同一部位叶片，暗处理15min，利用荧光仪PAM系列测量样品中叶绿素荧光相关参数Fv/Fm、ETR＝[(Fm’-F)Fm’]×PFD、qP＝(Fm’-Fs)/Fv’和NPQ＝(Fm-Fm’)/Fm’＝Fm/Fm’-1。
Fv/Fm反映了植物的潜在最大光合能力(即光合效率)；
ETR是表观光合电子传递速率；
qP是由光合作用引起的荧光淬灭，反映了光合活性的高低；
NPQ反映了植物耗散过剩光能为热的能力，即光保护能力。
结果如图5和表3所示，木霉抑制尖孢镰刀菌的活性，防止番茄幼苗感病，保护了植株光合系统II免遭破坏，提高叶片光合效率。
表3不同处理组对番茄叶片叶绿素荧光的影响
Figure BDA0003649372850000081
实施例7
将生长3周的番茄幼苗从穴盘里取出来，清水冲洗干净根部，分别浸泡在清水、棘孢木霉HB40619菌株孢子洗脱液(1x107个/ml)、尖孢镰刀菌孢子洗脱液(1x107个/ml)、棘孢木霉HB40619菌株与尖孢镰刀菌孢子混合洗脱液(1x107个/ml)中，时间为15～20min，定植于穴盘中，每一组处理24株。
四种处理出现表型差异后取样，摘取番茄同一部位叶片测定其茉莉酸和水杨酸含量。
结果如图6和表4、表5所示，棘孢木霉HB40619调节植株体内抗性激素变化，诱导番茄幼苗防御反应，提高抗病性。
表4不同处理组对番茄体内茉莉酸含量的影响
CK F.oxy 619&F.oxy 619
14.94 14.96 30.73 33.62
19.44 12.34 32.69 37.54
14.03 12.49 34.57 34.09
16.28 11.62 32.61 32.89
表5不同处理组对番茄体内水杨酸含量的影响
CK F.oxy 619&F.oxy 619
142.81 282.13 78.63 150.63
162.5 267.38 71.39 145.26
122.6 306.18 80.65 137.81
149.54 302.44 72.9 130.51
由图6和表4、表5可知，F.oxy处理组中茉莉酸(JA)的含量有所下调，同时水杨酸(SA)的含量显著上调，表明尖孢镰刀菌浸染番茄植株后，会激发植株内源激素SA含量的上升，番茄幼苗通过启动SA参与的系统获得性抗性(SAR)抵御病原菌的入侵，但该广谱性抗性对抵抗尖孢镰刀菌的效果不佳；而619&F.oxy处理组的番茄幼苗植株中的JA含量上升幅度远大于SA含量的上升幅度，表明棘孢木霉HB40619可以通过提高番茄植株中JA的含量，促进JA参与植株产生的诱导系统抗性(ISR)，更高效地提高番茄幼苗抗病性。
如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (10)

1.棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619，该菌株的保藏编号为CGMCCNo.40143。
2.如权利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在防治番茄叶片枯萎病中的应用。
3.如权利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在制备防治尖孢镰刀菌所致病害的生防制剂的应用。
4.如权利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)HB40619在制备防治番茄叶片枯萎病的制剂的应用。
5.一种生防菌剂，其特征在于：包含有权利要求1所述的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)HB40619。
6.根据权利要求5所述的生防菌剂，其特征在于：所述菌剂的类型为分生孢子洗脱液和/或分生孢子悬浮液。
7.一种制备权利要求6所述的生防菌剂的方法，其特征在于：所述分生孢子洗脱液的制备方法如下，
步骤1、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为25℃～28℃，光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤2、在所述单菌落的边缘取出菌丝块接种到PDA平板培养7d，培养条件为：25℃、光照，得到分生孢子；
步骤3、添加无菌水后刮洗菌落表面的分生孢子，过滤菌丝，得到所述分生孢子洗脱液。
8.一种制备权利要求6所述的生防菌剂的方法，其特征在于：所述分生孢子悬浮液的制备方法如下，
步骤A、将棘孢木霉HB40619菌株接种在PDA平板上，培养条件：温度为25℃～28℃，光照条件下培养3d，得到单菌落；
步骤B、选取单菌落边缘的菌丝块接种至PDB液体培养基中，200rpm/min摇培3～5d，得到培养物；
步骤C、将所述培养物离心，对离心上清液进行过滤，收集滤液得到所述分生孢子悬浮液。
9.一种防治番茄叶片枯萎病的方法，其特征在于：将如权利要求6所述的分生孢子洗脱液于番茄幼苗移栽前进行蘸根，或/和将分生孢子悬浮液于番茄幼苗移栽后进行灌根。
10.根据权利要求9所述的一种防治番茄叶片枯萎病的方法，其特征在于：所述分生孢子洗脱液的活菌浓度为1x107个/ml；所述分生孢子悬浮液的活菌浓度为1x107个/ml。
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