JPS6133199A - γ−インタ−フエロン活性を有するポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は天然由来のヒトγ−インターフェロン（ＩＦＮ
−γ）に類似の性質を有する新規なポリペプチドに関す
る。

本発明はまた、該新規ポリペプチドを生産できる新規な
プラスミドならびに該プラスミドを含有する微生物に関
する。

γ−インターフェロンの合成に関係する遺伝情報を担う
ヒト体内の遺伝子は、γ−インターフェロンのアミノ酸
配列をコードするある塩基配列〔エクソン（ａｘｏｎｓ
　）　］と、］γ−インターフェロをコードしない塩基
配列〔イントロン（１ｎｔｒｏｎｓ）］を含む。ヒト細
胞では、γ−インターフェロン遺伝子が、細胞核の中で
ＲＮＡをつくり出す。このＲＮＡはイントロンとエクソ
ンの両方を含んでいる。

γ−インターフェロンの配列をコードしないイントロン
は、メツセン・シャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をつくり出す
ため削除される。イントロン削除後、得られたｍＲＮＡ
は細胞の細胞質中で天然γ−インターフェロンの合成を
指示する。

ヒトγ−インターフェロンのアミノ酸配列が同定され、
γ−インターフェロンをコードスルＤＮＡが、稠魂市ｈ
γ−インターフェロンを生産できる大腸菌に組み込まれ
た（１９８３年４月２７日公告されたヨーロッパ特許出
願公告第００７７６７０号を参照）。

本発明者らは、グレイ（Ｇｒａｙ　）らにより報告され
た天然に存在するヒトγ−インターフェロン〔グレイ（
Ｇｒａｙ　）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ　）　２
９５巻、５０３頁（１９８２年）〕と異なるアミノ酸配
列を有するヒトγ−インターフェロン活性のある新規な
ポリペプチドを得るべく鋭意研究を行なった。

その結果驚くべきことに、エクソン４を欠いているポリ
ヌクレオチドによりコードされないこのポリペプチドは
、ヒトγ−インターフェロン活性を有することが発見さ
れた・ ヒトγ−インターフェロン遺伝子を含有するバクテリオ
ファージス／ヒト染色体遺伝子ライブラリー〔ティー・
マニアティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ教授からの寄贈
）〕からのプラークを同定するため、放射活性グローブ
を用いた。制限酵素分析に基づき、完全なγ−インター
フェロンを含有スることがわかったクローンの１つをＢ
ａｍＨＩで切断し、γ−インターフェロン遺伝子含有断
片をＢａｍＨＩ−切断ｐＢＲ３２７（：ソベロン（５ｏ
ｂｅｒｏｎ　）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ　）第９巻２８７
頁（１９８０年）〕に結合し、ｐＣＧ　５　（１１，７
ｋｂ　）と表示される新しいプラスミドをつくった。こ
の新規なプラスミドを宿主微生物に組み入れ、形質転換
された微生物を調製した。

次にｐＣＧ５をＭａｔｌとＳａｌ　ｌで切断して外来の
ＤＮＡ部を除去し、再結合して新しいプラスミドｐｃＧ
５１（８，７ｋｂ）にした。このプラスミドを蝉更に切
断し、一部をｐＣＧ５から除去した断片と結合し、新規
なプラスミドｐＣＧ５２　（６，４ｋｂ）をっくりた。

ｐＣＧ５２を順に切断し、再結合して別の新規なプラス
ミドｐＣＧ　５３　（５，６ｋｂ）をつくった。このプ
ラスミドからの断片を１次にファージベクター（Ｍ１３
ｍｐ９　）に挿入し大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ　）をトラ
ンスフェクトするのに用いた。γ−インターフェロン遺
伝子を含有する７アージからイントロンｌと２゜ならび
に３を削除する試みがなされた。上記処置の間に、予期
しないことに、γ−インターフェロンをコードする遺伝
物質の一部（エクソン４）が削除された。しかしながら
、削除されたヌクレオチド配列はγ−インターフェロン
活性にとって必要と考えられない。γ−インターフェロ
ン活性を有するポリペプチドを発現できるファージは、
更に遺伝的操作をして得られ、大腸菌に用いてγ−イン
ターフェロン活性を有する物質をつくった。

この活性のａｔの原因となる遺伝子配列をＭ１３ｍｐ９
バクテリオファージ誘導体からとり出し、ｐＢＲ３２７
に挿入して、プラスミドｐＧＬＴ　１０４を調製した。

驚くべきことに、この後者のプラスミドを保持している
大腸菌は、その細胞質の中に、比較のために用いられた
完全なγ−インターフェロン遺伝子を含んでいる微生物
中にある活性の約４〜１０倍の濃度にｒ−インターンエ
ロン活性を有するポリペプチドを含んでいる。ｐＧＬＴ
　１０４のヌクレオチド配列の分析で、このヌクレオチ
ドはエクソン４のｔ初の９個のヌクレオチドと同じ９個
のヌクレオチドからなる配列を含んでいることが示され
た。しかしながら、これらの９個のヌクレオチドはエク
ソン４から来ているのではなく、イントロン３を削除す
るのに用いられるプリーター（ｄｅｌｅｔｅｒ　）　カ
Ｃ）　来テイル。

本発明はこれらの新しい知見に基づき完成されたもので
ある。

即ち、本発明の目的はヒトγ−インターフェロン活性を
有する新規なポリペプチドを提供することにある。

本発明の目的はまた該ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド配列を提供することにある。

更にまた本発明の目的は該ポリヌクレオチドを含む複製
可能な発現ベヒクルを提供することにある。

更にまた本発明の目的は上述のような複製可能な発現ベ
ヒクルで形質転換された生物体を提供することにある。

また本発明の目的は該新規なポリペプチドの製造方法を
提供することにある。

即ち、本質的には本発明によれば、ヒトγ−インターフ
ェロン遺伝子のエクソン４によりコードされるポリペプ
チドの実質的末端部分が削除されているヒトγ−インタ
ーフェロン活性を有するポリペプチドが提供される。

本発明のポリペプチドはヒトγ−インターフェロン遺伝
子のエクソン４の最初の９個のヌクレオチドを除くエク
ソン４のすべてによりコードされるポリペプチドの部分
が削除されているｒ−インターフェロン活性を有するポ
リペプチドである。

かくして、本発明のポリ＜プチドは、エクソン１とエク
ソン２．エクソン３ならびにエクソン４の最初の９個の
ヌクレオチドによりそれぞれコードされるアミノ酸配列
を含む。更に１、本発明のポリペプチドは、イントロン
３のヌクレオチド部分によりコードされるアミノ酸の末
端配列も含む。

かくて、本発明は、更に、エクソン４の実質的末端部分
が削除され、イントロン３から誘導されるヌクレオチド
配列により置換されているヌクレオチドにも関する。該
ポリペプチドをコードする該ポリヌクレオチドは一般式
（エクソン１）−（エクソン２＞−（エクソン３）−（
エクソン４の最初の部分）−（イントロン３の一部分）
、（エクソン１）−（エクソン２）−（エクソン３）−
（エクソン４の最初の部分）−（イントロン３から誘導
される８個のヌクレオチド）、又は（エクソン１）−（
エクソン２）−（エクソン３　）　−（ＧＴＣＡＣ：Ｔ
　ＧＡＣ）　−（ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＧＡＣＡＴＴ　ＡＧ
ＣＡＧＡ　ＡＴＡレオチド１６３９ないし１２４１によ
りコードされるアミノ酸により示される。

また、本発明によれば、該新規なポリペプチドをコード
する新規なポリヌクレオチド配列及びそれに相補的なポ
リヌクレオチド、該新規なヌクレオチド配列を有するプ
ラスミドのような新規な複製可能な発現ベヒクル、該プ
ラスミドを含有する新規な微生物、該微生物の変異体お
よび該微生物の製造に利用される種々の中間生成物が提
供される。たとえば、本発明の一つの態様によれば、本
発明のヌクレオチド配列を有するバクテリオファージの
ようなベクターが提供される。

更にまた、本発明によると、前述のグラスミドならびに
微生物を調製する方法、γ−インターフェロン活性を有
するポリペプチドの調製法、ならびに本発明により生産
されるポリペプチドを含有する医薬組成物をも提供され
る。本発明のインターフェロン活性を有するポリペプチ
ドを生産することのできる′遺伝物質は、大腸菌のよう
な細菌の異なる株に適合する種々のタイプの複製可能な
発現ベヒクル―もしくは酵母や哺乳動物細胞、あるいは
形質転換後、本発明のポリペプチドを生産もしくはコー
ドでき−るその他の細胞に適合するベヒクルに組入れる
ことができる。本発明を以下の記載により詳細に説明す
る。

ヌクレオチドモノマーを用いてのＤＮＡオリゴマーの合
成 各端ニステンレス製フィルターのついたステンレス製の
５００μ）反応容器に、ヌクレオシド（２，０μモル）
をサクシネート結合により結合させたぼりスチレン樹脂
２０■を加えた。ジメトキシトリチ＃　（ＤＭＴ　）保
護基を除去すべく、この樹脂を臭化亜鉛（ＩＭ）のジク
ロロメタン／イングロハ、／−ル（８５／１５　）液で
処理し、ジメチルホーｌｌマー′【や　ｔｊ　ＩＩ　、
ヤ−／　　−ｒ　上Ｌ　−Ｌ　ＩＩ　ｎ＋ブ社籟Ｉ窒素
気流で乾燥した。この乾燥した樹脂に、ＤＭＴ−ヌクレ
オチド（２０μＭ）とメシチレンスルホニルニトロトリ
アゾール（６０μＭ）を２００μｌのピリジンにとかし
た溶液を加え、４５℃で２０分間カップリング反応を行
った。この脱保護とカップリングのサイクルを、樹脂上
に所望のＤＮＡオリゴマーがつくられるまで引き続くヌ
クレオチドについてくり返した。次に、樹脂からＤＮＡ
オリゴマーを除去すべく樹脂を処理し、伊東ら〔ヌクル
、アシッズ　レス、　（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄａ　Ｒｅ
ｓ、）１０巻１７５５頁（１９８２年）〕の方法により
精製した。

離 第１図に示すように、エクソン２の配列に相補的な、５
２　ｐで標識した合成２５マーオリゴヌクレオチド５　
’ＣＣＡＴＴＡＴＣＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＡＡＴＧＡ
Ｃ３’を、シャロン４ＡベクターＣ７’ラツトナー（Ｂ
ｌａｔｔｎｅｒ　）ら、サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　
）誌第１９６巻１６６頁（１９７７年）〕の１ｉｊｅｏ
ＲＩ連結部位に、ｌｉ：ｃｏＲＩ消化ヒトＤＮＡ　［−
ｒ　＝アティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ　）ら、細胞（Ｃｅ
ｌｌ）１５巻６８７頁（１９７８年）〕からの分分析片
を挿入することによって調製したバクテリオファージシ
ャロン４Ａ／ヒト染色体遺伝子ライブラリーの１０１６
プラークをスクリーンするためのノ・イブリダイズプロ
ーブとして用いた。ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ　）らのプ
ラークハイブリダイズ法〔サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ
　）誌°１９６巻１８０頁（１９７７年）〕を用いる。

培養物中のバクテリオファージのすべてがγ−インター
フェロンをつくるのに必要な遺伝物質を含んでいるので
はないので、γ−インターフェロン遺伝子のエクソン２
０部分に相補的な塩基配列を有するプローブを用いる。

所望の遺伝物質を有するプラークは、それらのＤＮＡに
放射活性プローブを結合することによって同定される。

２種のハイブリダイズするプラークをライブラリーから
単離する。単離したプラーク中の各組換えファージから
のＤＮＡを単離し、５種のエンドヌクレアーゼ制限酵素
（ＥｃｏＲｌ　、　ＢａｍＨＩ　、　Ｐｖｕｌ［＋Ｈｉ
ｎｄｌｌ　、　Ｈｉｎｃ　Ｉ［）で消化する。各ファー
ジＤＮＡを、２５マーゾローブを用い、上記酵素での消
化後にグルハイブリダイズにより分析する。これらのハ
イブリダイズパターンの、グレイ（Ｇｒａｙ　）ら〔ネ
イチ−ｙ　−（Ｎａｔｕｒｅ　）誌２９８巻８５９頁（
１９８２年）〕のものの／４’ターンとの比較は、１つ
のファージＤＮＡ　（クローン５−１）がγ−インター
フェロン遺伝子を含んでいるらしいことを示している。

更に研究を進めるため、クローン５−１を選ぶ。

クローン５−１のＤＮＡを得るためにランディ（Ｌａ、
ｎｄｙ　）らの方法〔バイオケミストリー（Ｂｉｏ−ｃ
ｈｅｍｉａｔｒｙ　）誌、第１３巻２１３４頁（１９７
４年）〕を用いる。このＤＮＡをＢ　ａｍＷ　Ｉで消化
し、消化物を１％低融点アガロースダル電気泳動にかけ
る。

８．５ｋｂバンドをティー、マニアティス（Ｔ、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）（モレキュラークローニング、３７７頁、
コールドの断片をＢａｍＨＩで切断したｐＢＲ３２７に
クローＳ蓚ｌする。得られるプラスミドを大腸菌に１２
株ＭＣ１０６１の形質変換に用いる。ホルメス（Ｈｏｌ
ｍｅｓ　）らのミニプレツブ（ｍ１ｎｔ−ｐｒｅｐ　）
法〔アナル、パイオヶム、　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　）　１１４巻１９３頁（１９８１年）〕を用い
て１０種の細菌コロニーラスクリーニングする。この方
法で、所望の染色体遺伝子断片を含むコロニーが得られ
る。このコロニーから調製されるプラスミドＤＮＡをｐ
ＣＧ５と命名する。

プラスミドｐｃｃ　Ｓ中のＤＮＡは時計と反対の方向に
読んでいくことが判かる。ｐｃｃ　５３はｐＣＧ５から
第２図及び第３図に示されるようにして構築される。消
化後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（１４単位）のクレ
ノー（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片を加え、ｄＡＴＰ　。

ｄＧＴＰ　、　ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰで０．５　ｍＭに
調整し、室温で５分間反応させる。この処理により、断
片の一重鎖端を相補的ヌクレオチドで補充し、プラント
二重鎮端を形成する。１％低融点アガロースゲル電気泳
動後、８．７ｋｂの大きさのＤＮＡを溶離する。

この断片２μｇを回収する。この断片（６０ｎｌ　）を
Ｔ　４　ＤＮＡ　＋ｊが−ゼ（１０単位）で処理し、断
片の両端を結合し、環状生成物を形成せしめる。この生
成物を大腸菌ＭＣ１０６１形質転換に用いる。このよう
にして、４１個の形質転換体を得る。予期しないことに
、これらの形質転換体の１つが有するプラスミドＤＮＡ
は、その結合部位にＳａｌ　ｌサイトがある。このクロ
ーンからのプラスミドＤＮＡをｐＣＧ　５１と命名する
。

ｐＣＧ　５１クローンノプラスミ）’ＤＮＡ（１０ｐｆ
ｉ　）（第２図）にＡｃｃｌ制限酵素（１０単位）を加
える。

消化後、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（１４単位）のクレ
ノー（Ｉ’（ｌｅｎｏｗ）断片を加え、ｄＡＴＰ　、　
ｄＧＴＰ　。

ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを用いてこの混合物を０．５ｍＭ
に調整し、室温で３０分反応させる。最終消化物を１チ
低融点アガロースダル電気泳動にかけ、４．５’ｋｂの
大きさのＤＮＡを溶離する。次にプラスミドｐＣＧ５（
５μＩＩ）をＡｖａｌ　（１０単位）で消化する。消化
後、大腸菌ＤＮＡ　＃リメーラーゼ■（１４単位）のク
レノ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片を加え、ｄＡＴＰ　、　ｄ
ＣＴＰ及びｄＴＴＰを用いてこの混合物を０．５ｍＭに
調整する。室温で３０分反応させた後、生成物をＥｃｏ
Ｒｌ　（１０単位）で切断する。１チ低融点アガロース
ゲル電気泳動の後、１．９　ｋｂ　ＤＮＡを溶離する。

次にこれらのａつの断片（４，５ｋｂ断片と１．９ｋｂ
断片）をＴ４リガーゼを用いて１５℃で２時間給合させ
る。結合生成物を大腸菌ＭＣ１０６１及び大腸菌″Ｄ　
１２１０の形質転換に用いる。形質転換大腸菌のクロー
ンから単離したプラスミドＤＮＡを制限酵素消化により
試験する。クローンから所望の消化パターンをもつプラ
スミドＤＮＡが得られｐＣＧ　５２と命名する。プラス
ミドｐＣＧ　５２を含む大腸菌の培養物をブダペスト条
約の規定に従って、米国メリーランドロックビル（Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）のアメリカンタ
イプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、寄
託番号ＡＴＣＣ３９６６５が与えられた。プラスミドｐ
ＣＧ　５２　　はアンピシリン耐性をコードした遺伝子
を有する。

このプラスミドを含む大腸菌は、アンピシリンを２０μ
ｇ７ｒｒｔｔ含有するし一プロス中で培養すべきもので
ある。ＡＴＣＣ３９６６５の寄託番号を付与した大腸菌
はｚａｃ−、ｔｅｕ−、ａｒａ−、ａｔｒ”のダラム陰
性の桿菌である。

ｐＣＧ　５２　（５０ｔｄ　）を５ａｅＩ（５０単位）
とｘｂａＩ　（１００単位）を用いて切断し、−重鎖端
を８１ヌクレアーゼ（２，９単位）で一分間３７℃で消
化してプラント末端にする。１％低融点アがロースグル
電気泳動にかけた後、５．６ｋｂの大きさのＤＮＡを溶
離する。ＤＮＡ　６μｇを回収する。このＤＮＡ（１０
０ｎｇ）をＴ４リガーゼ（１０単位）で２時間１５℃で
処理して環状化する。この環状化ＤＮＡを大腸菌ＭＣ１
０６１と大腸菌Ｄ　１２１０の形質転換に用いる。形質
転換大腸菌のクローンから単離したプラスミドＤＮＡに
ついて制限酵素消化により調べる。

クローンから所望の消化・母ターンを有するプラスミド
ＤＮＡが得られｐＣＧ　５３と命名する。所望の遺伝子
を含むｐＣＧ　５３のヌクレオチド部分を以下に示す。

該プラスミドｐＣＧ　５３を含む大腸菌の培養物をブダ
ペスト条約の規定に従ってＡＴＣＣに寄託し、寄託番号
ＡＴＣＣ３９６６６を与えられた。この細菌はＡＴＣＣ
３９６６５と同じようにして培養すべきものである。

ＡＴＣＣ３９６６６として寄託した大腸菌は１ａｃ−ｒ
　１ｅｕ−＋ａｒａ−−＋　５ｔｒｒである０ とＢａｍＨＩ（２０単位）で消化する。１チ低融点アガ
ロースダル電気泳動の後、２．６ｋｂ断片を溶離する。

この断片゛を、Ｍ１３ｍｐ９ファージの複製型由来のＢ
ａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　ｌに挿入する。生成物を大腸菌
ＪＭ１０３にトランスフェクトする（　ＢＲＬユーザー
マニュアル／　Ｍ　１３ｍｐ　７クローニング／′ジデ
オキシ′シーケンシング、１９８０　（ＢＲＬ　Ｕｓｅ
ｒ　Ｍａｎｕａｌ／Ｍ１３ｍｐ７Ｃ１ｏｎｉｎｇ／’　
Ｄｉｄｅｏｘｙ’　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓ　１９８０
　）　）　ｏ核生成物はＭ　１３ｐｍ　９−ＴＧ　２と
表示する。

削除 Ｍ　１３ｍｐ　９−　ＴＧ　２の一重鎖ＤＮＡをＢＲＩ
、−１−デーマニーアル／　Ｍ　１３ｍｐ　７クローニ
ング／′ジデオキシ′シーケンシング、１９８０の方法
により調製する。

Ｅ　１−２　（５’　ＡＣＣＴＧＣＡＴＴＡＡＡＡＴＡ
ＴＴＴＣＴＴＡＡＧＧ　３’　）はイントロン１のプリ
ーターであル、Ｅ　２−３　（５’ＧＴＣＡＣＴＣＴＣ
ＣＴＣＴＴＴＣＣＡＡＴＴ３’　）はイントロン２のプ
リーターであシ、Ｅ　３−４　（５’　ＧＴＣＡＧＴＴ
、ＡＣＣＧＡＡＴＡＡＴＴＡＧＴ３’　）はイントロン
３のプリーターである。

これらのプリーターは、削除されるべきイントロンの前
後の塩基の塩基配列に相補する塩基配列をもっている。

かくして、プリーターは該イントロンの前後の特定の塩
基配列に付くはずであり、猿がはずれるようにイントロ
ンが削除される。プリーターから成る第２の鎖の埋め込
みは、ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ　）らＫよシサイエ
ンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）誌２０９巻１３９６頁（１９８
０年）に記述されているようにして、イントロンを削除
する。

Ｔ４キナーゼ（１０単位）とＡＴＰ　（３ｍＭ　）を用
いてＥｌ−２（１２４ｎｇ、１５ｐｍｏｌｅ）とＥ２−
３（１０４ｎｇ　％　１５　ｐｍｏｌｅ　）及びＢ３−
４（１０４ｎｇ　、　１５ｐｍｏｌｅ）をリン酸化し、
鋳型Ｍ１３ｍｐ９−ＴＧ２　（１，６５μｇ、　０．５
ｐｍｏｌｅ　）に加える。この反応混合物を５分間６５
℃に加熱し、５分間室温に冷却し、最後に氷水で冷却す
る。ｄＡＴＰとｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ　、　ｄＴＴＰ
ならびにＡＴＰ　（０，４ｍＭ　）に、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ■（５単位）のクレノー（Ｋｌｅｎｏｖ）断
片、Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ（１０単位）のＨｉｎ緩衝
液〔ウォーレス（Ｗａｌｌａｃｅ）ら、ヌク、アク、レ
ス、　（Ｎｕｃ、　Ａｃ。

Ｒｅｓ、）第９巻３６４７頁（１９８１年）〕溶液トリ
ス塩酸塩（ＰＨ７，２）　１０　ｍＭ　、　ＭｇＣＬ２
２　ｍＭ及びβ−メルカプトエタノール１ｍＭを加えた
。この反応混合物（最終容量５０μ））を４℃で３０分
間、次に室温で３０分間インキュベートする。オリゴヌ
クレオチドから出発するこの反応からイｑられるＤＮＡ
を、ＢＲＬ　ユーザーマニュアル／　Ｍ　１３ｍｐ　７
クローニング／′ジデオキシ′シーケンシング、１９８
０の方法により、大腸菌ＪＭ１０３のトランスフェクト
に用いる。５０μノの反応容量の内の２μｌから１０．
０００個のプラークが得られる。これらの中から１５０
個のプラークをＹＴ７’レートに採集する〔ジェイ、エ
ッチ、ミラー（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ　）　４３３頁、
エクスペリメンツ　インモレキュラージェネテ！−／ク
ス（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒＧｅｎｅｔｉｃ＋ｓ）ｓコールドスプリングハーバ−
ラぎラトリー（Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）（１９７２年）〕。

得られたコロニーを　　Ｐ　で標識したＢ１−２゜Ｂ２
−３　、　Ｂ３−４と５５℃＋２時間ハイブリダイズさ
せる。この段階には、イントロンを削除した後の対応す
る相補的塩基配列を有するＤＮＡの配列を同定するブζ
めのグローブとして、それらのプリーターを用いる。１
５０個のプラークの内、３種のプリーターもしくはプリ
ーター組合せの各々とハイブリダイズするプラークの数
を下に示す。

Ｅｌ−２６ Ｅ２−３　　　　　　　　　　２２ Ｅ３−４　　　　　　　　　　１４ Ｅｌ−２＋　Ｂ２−３　　　　　　　２Ｅｌ−２十Ｅ３
−４　　　　　　　１ Ｅ２−３　＋　Ｂ３−４　　　　　　　７Ｅｌ−２＋　
Ｂ２−３　十Ｅ３−４　　　０Ｅ１−２とＢ２−３　の
両方とハイブリダイズする２のクローンの内の１つであ
るｍｐ　９−　ＴＧｄｔを、蛙←軽＾イントロン３の削
除に用いる。その後の実験で、ｍｐ　９−　ＴＧｄｔの
ＤＮＡのエクソン４の部分が欠落していることがわかる
。ｍｐ　９−　ＴＧｄｔに至る過程を以下に示す。

６８２８　　　　　　　　　　　　　６８４３　　　　
　　　　　　　　　　＋ＴＴＧ　ＧＣＴ　ＴＴＴ　ＣＡ
Ｇ　ＣＴＣＴＧＣＡＴＣＧＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＴ　ＴＣ
Ｔ　ＣＴＴＬｅｕ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　Ｇｌｎ　Ｌｅ
ｕ　Ｃｙｓ　　Ｉｌ＠Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　　Ｓ
ｅｒ　ＬｅｕＴＣＡＴＴＴＧＴＧＡ　　ＣＡＴＴＧＣＡ
ＡＴＴ　　ＴＡＡＴＧＧＴＴＡＴ　　ＡＴＴＧＧＧＡＡ
ＡＴＴＣＴＡＴＡＴＣＴＣＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴ　　Ｔ
ＴＴＧＧＧＡＡＴＡ　　ＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＧＴＧ
ＡＡＴＡＴＴ　　ＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧ　　ＡＧＴＴＣ
ＡＡＴＧＡ　　ＡＡＣＴＴＧＡＡＡＴシ フ３２６　　　　　　　　　　　　　　　７３４１ＣＣ
ＡＧＴＴＡＣＴＧ　　ＣＣＧＧＴＴＴＧＡＡ　　ＡＡＴ
ＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧＴｔｌ；Ａ
ＣＣＣＴ　　ＧＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＴＡＡＡＧ
Ｔ　　ＧＴＡＡＧＴＴＣＡＣＡＡＣＴＡＣＴＴＡＴＡＡ
ＣＴＡＣＣＴＡＴ　　ＴＡＡＴＧＡＡＴＴＡ　　Ｇ５′
ＡＧＧＧＡＧＧＧＴＣＣＡＴＴＡＡＡＴ　　ＧＴＧＧＴ
ＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴ
　　ＣＴＡＡＧＡＴＡＣＡ　　ＧＡＴＴＴＡＡＴＴＡＴ
ＴＡＡＡＣＴＧＣＴ　　ＴＡＧＣＴＴＧＧＣＡ　　ＣＡ
ＣＡＧＡＧＡＴＴＴＴＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴ
ＣＣＣＴＣＡＴＣＣＡＡＴＧ１ｎＯ− プリーターＥ　３−４　（１０４ｎｉ　、　１５　ｐｒ
ｎｏｌｅ　）はＴ４キナーゼ（１０単位）とＡＴＰ　（
３ｍＭ　）を用いて賦活化した。鋳型ｍｐ９−ＴＧｄＬ
−重鎖ＤＮＡ（１，６μｌｌ　、　０．５　ｐｍｏｌｅ
　）を加え、その混合物を６５℃で５分間加熱し、室温
で５分間冷却し、その後氷水中で冷却する。ｄＡＴＰと
ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ　。

ｄＴＴＰならびにＡＴＰの０．４ｍＭ溶液に大腸菌ＤＮ
Ａポリメ７−ゼＩ（５単位）のクレノー（Ｋｌｅｎｏｗ
　）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼ（１０単位）のＨｉｎ
緩衝液溶液を加え、上記と同様にして処理する。得られ
るファージ−をプレートに置き、１５０のプラークをＹ
Ｔグレートに採集する。クローンを５５℃で２時間、３
２ｐで標識しｆｃＥ　３−４と／％イブリダイズさせる
。この陽性クローン、　ｍｐ９−ＴＧΔ１２３−１とｍ
Ｐ９−ＴＧΔ１２３−２が得られる。クローンｍｐ９−
ＴＧΔ１２３−１の塩基配列を調べると、イントロンＩ
Ｊ／′ｉ完全に削除されることが判るが、このクローン
は末端の１９のヌクレオチドがエクソン４の末端の８個
のヌクレオチドとそれに続く１１個のヌクレオチドに相
補的である２３マ一プライマー／突然変異誘発遺伝子（
５’ＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＣＡＴＴＡＣＴＧＧＧＡＴＧ
３’　）とハイブリダイズしない。この結果は、エクソ
ン４０部分が欠落していることを示唆している。ｍｐ９
−ＴＧｄｔをしらべると、これは２３マ一ゾライマー突
然変異誘発遺伝子にも相補しないことを示している。明
らかにエクソン４０部分はＥ３−４による第２の処理の
前に失なわれている。ブダペスト条約の規定に従い、フ
ァージｍｐ９−ＴＧΔ１２３−１をＡＴＣＣＫ寄託し、
寄託番号ＡＴＣＣ４０１１７が付与されたａ　ｍｐ９−
ＴＧΔ１２３−１の関連部分のヌクレオチド配列を以下
に示す。このファージはＭ１３ｍｐ９ファージを培養す
るのに通常用いられる条件下で生育できる。ＡＴＣＣ４
０１１７は溶解物上液液中のファージの寄託物である。

発現用ｍｐ９−ＴＧｄ−Δ１２３−１の構築プロモータ
ー末端のＡＴＧ開始コドンとγ−インターフェロン配列
の第２のシスティンコドンとの間の配列を、Ｄ−４プリ
ーター（５’　ＧＧＴＣＣＴＧＧＣＡＧＴＡＡＣＡＣＡ
ＴＡＧＣＴＧＴＴＴＣＣ３’）　ｅ用いて、ｍｐ９−Ｔ
Ｇ、（１２３−１″１得るのと類似の方法で削除する。

配列の解析から、ムｃ７’ロモータのＡＴＧ　Ｈ始コｐ
ンと第２のシスティンコドンの間の所望の部分の削除が
達成でれたことが確認される。

ｐＧＬＴ１０４の構築 ｍｐ９−ＴＧΔ１２３−１の複数型ｆ：ＡｖａＩとＢ　
ａｍＨＩで消化する。５８２６の位置の、シングルＢ　
ａｍＨＩの３′サイトに寸で伸びているＡｖａＩから、
インターフェロン遺伝子配列までの断片を単離し、Ｂａ
ｍＨＩ／Ａｖａ　Ｉで切断したｐＢＲ３２７にクローン
せしめて、プラスミドｐＧＬＴ１０４　？生成する。該
プラスミドｐＧＬＴ１０４を大腸菌株ＭＣ１０６１とＤ
１２１０に組み込む。グラスミドｐＧＬＴ１０４を含む
大腸菌Ｄ１２１０の培養菌を、ブダペスト条約の規定に
従いＡＴＣＣに寄託し、ＡＴＣＣ３９６６７の寄託番号
を与えられた。

プラスミドｐＧＬＴ１０４はアンピシリン耐性をコード
している遺伝子をもっている。このプラスミド含有大腸
菌の培養物は、２０μＷのアンピシリンを含有するＬ−
ブロス中で培養しなげれはならない。ＡＴＣＣ３９６６
７と同定されるｐＧＬＴ１０４を含有する大腸ＷＭｈ　
１ｔＬｃ−＃　Ｌｅｕ″″＋　ａｒｌＬ−＊　５ｔｒｒ
のグラム陰性桿菌である。ｐＧＬＴ　１０４のヌクレオ
チド配列を以下に説明する。本発明の号？リペプチドの
アミノ酸配列は以下に示す。

ｐＧＬＴ１０４ ＣＡＡＴＣＣＡＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＣＴＡ　　ＧＡＧ
ＣＴＴＡＣＡＣｌｌｏｏ　　　　　　　　１１１０　　
　　　　　１１２０ＧＴＡＣＡＧＴＣＡＣＡＧＴＴＧＴ
ＣＡＡＣＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＣＧＣＧＧＣＣＴＴＴ　
　ＴＴＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＴＧ　　ＣＴ
ＧＧＣＣＴＴＴＴＧＣＡＧＣＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＧＣ
ＧＡＧ　　ＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧ　　ＡＧＣＧＣＣＡＧ
ＧＧＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴ　　ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧ
ＣＣＴＧＧＣＣＣＴ　　ＧＡＧＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＣ
ＧＣＧＴＴＧ ＢＲ３２７ ＧＣＴＣＡＣＡＴＧＴ　　ＴＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧＴＴ
ＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧ　　ＣＣＧＣＡＧ
ＣＣＧＡ　　ＡＣＧＡＣＣＧＡＧＣＴＧＧＴＴＴＴＴＣ
Ｔ　　ＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡＣＡ
ＧＣＡＡＧＣＧＧ　　ＴＣＣＡＣＧＣＴＧＧ　　ＴＴＴ
ＧＣＣＣＣＡＧイン１ナート→〈− 上記において示されるポリヌクレオチド配列はＤＮＡの
相補的ストランドの配列である。ＤＮＡのコードストラ
ンドのヌクレオチド配列は、相補的ヌクレオチドを定量
することにより容易に決められる。かくて、ＤＮＡのコ
ードストランドはヌクレオチド１２７３から１２４１ま
でＧＴＣＡＣＴ　ＧＡＣＣＡＴ　ＣＡＴＧＡＣＡＴＴ　
ＡＧＯＡＧＡ　ＡＴＡ　ＴＣＣめヌクレオチド配列を有
しており、他方対応する相補ストランド（３′から５′
の方向に読む）はＣＡＧ　ＴＧＡ　ＣＴＧ　ＧＴＡ　Ｇ
ＴＡＣＴＧ　ＴＡＡ　ＴＣＧ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＡＧＧ
の配列をもつ。上述の配列に示すように、塩基対１２７
３で始まるヌクレオチド塩基配列”　ＣＡＧ　ＴＧＡ　
ＣＴＧ　”は、エクソン４の相補ストランドの最初の９
個のヌクレオチドと同じ配列を有する。上記で言及した
ように、これらのヌクレオチドはＥ３−４デリータから
由来している。

−ドされたアミノ酸力！欠落しているが、代シにイント
ロン３由来の２４のヌクレオチドによりコードされた８
個のアミノ酸配列を含んでいる。

このクローンはＢａｍＨＩサイトを有するが、ＡｖａＩ
サイトはもはや形跡がない。ｐＧＬＴ　１０４を含む大
腸菌は通常の培地で培養される。γ−インターフェロン
活性についての生成物のバイオアッセイは、１に当りの
単位（ｕ／ｌ　）で測定したとき、ｔａｃプロモーター
のコントロール下Ｋ　５Ｅ、　全１１−インターフェロ
ン遺伝子を含有するプラスミド（ｐＧＬＹ１０２）を用
いて得られたのよシも４ないし１０倍も高い活性を示し
ている。なお、パイ、ｔ７ツセイはルピンスタイン（Ｒ
ｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　）　ラの方法〔シェイ、パイロロ
ジー（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　）　３７巻７５５頁（１
９８１年）〕により、ヒト羊膜細胞系（ＷＩＳＨ）を用
いて行なわれる。

実験１　　　実験２ ｐＧＬＹ１０２　（撮画ＭＣ１０６１）　１．２刈０　
’ｕ／Ｌ　　５．０刈０３ｕ／ＬｐＧＬＹ１０２　（鵡
ＩＤ１２１０）　　１．０Ｘ１０’ｕ／１７．６刈０’
ｕ／ＬｐＧＬＴ１０４　（大腸菌ＭＣ１０６１）１．０
Ｘ１０’ｕ／ｌ　　　　−ＰＧＬＴ１０４　（大腸菌Ｄ
１２１０）　　　　　　　　　　２．０Ｘ１０’ｕ／ｌ
ポリ−！ｉ′ノチドの生産 本発明のポリ被ノチドをコードできるグラスミド（例え
ばｐａｒ、Ｔ１ｏ４）を含む大腸菌を、抗生物質、糖源
及び必須ビタミンを含有するＬ−プロスのような通常の
栄養培地に植えつける。大腸菌により十分ガ愈のインタ
ーフェロンが生産されるまで培養を続ける。遠心分離に
より大腸菌全採取し、リン酸緩衝生理食塩水中に懸濁す
る。超音波処理により細胞を破壊し、得られる溶液を遠
心分離にかけて清澄する。ポリペプチドのインターフェ
ロン活性を通常の方法で検定し、ポリペプチドを通常の
方法で精製する。

医薬組成物 精製したポリペプチドを、医薬用に認められている担体
もしくは賦形剤又は希釈剤に、公知の方法により、患者
に投与したときγ−インターフェロン活性を示すに十分
な量溶かす。医薬組成物の調製に適した担体や処方につ
いては、イー、ダブリュー、マーチン（Ｅ、　Ｗ、　Ｍ
ａｒｔｉｎ　）によるレミントンの製薬科学（Ｒｅｍ１
ｎｔｏｎ’８ＰｈａｒｍａｅｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎ
ｃｅ　）に記述されており、参考までにここに書き加え
る。医薬組成物は、志眉への適切な投与のため、適量の
担体と組み合せて有効団の本発明ポリ（プチドを含む。

本発明のポリペプチドは、抗腫瘍、抗ウィルスおるいは
免疫抑制活性を示すに十分な方法かつ十分な分量を患者
もしくは宿主に投与する。投与量や投与方法は当該技術
で従来用いられているのと同様である。本発明のポリ被
グチドは抗腫瘍や抗ウイルス治療を必要とする患者や免
疫抑制状態を示す患者らに投与することが出来る。投与
量や投与ホは個々の場合により一定でないが、ヒトイン
ターフェロンを用いてのヒトについての臨床試験で従来
用いられている投与量〔例えば１日当シ約（１−１０）
ＸＩＯ’″″′黒′、１％以上の純度を有するものの場
合には、例えば１日当り５０Ｘ１０６２まで〕に従うと
よい。遺伝子工学技術ｄよシ生産したポリペプチドには
実質的に汚染蛋白質が存在しないため、ポリペプチドの
投与量を、効果を上げるべくかなり高めることができる
であろう。

以上述べたように、本発明は裡々の方法で変えることか
できる。そのような変化は本発明の精神と範囲から逸脱
するものと見なすべきではなく、当業者にとって明らか
であるそのようなすべての変化は、本願の特許請求の範
囲に含まれるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐ　ＣＧ５の構築を示すフローチャートである
。第２図及び第３図はｐＣＧ５３の構築を説明する概要
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒトγ−インターフェロン遺伝子のエクソン４によ
   りコードされるポリペプチドの実質的末端部分が削除さ
   れているヒトγ−インターフェロン活性を有するポリペ
   プチド。 ２、エクソン４によりコードされる該ポリペプチドの該
   削除末端部分がイントロン３由来のヌクレオチドにより
   コードされているアミノ酸配列によって置換されている
   特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。 ３、該ポリペプチドが次式のポリヌクレオチド（エクソ
   ン１）−（エクソン２）−（エクソン３）−（エクソン
   ４の最初の部分）−（イントロン３の１部分） によりコードされている特許請求の範囲第１項に記載の
   ポリペプチド。 ４、該ポリペプチドが次式のポリヌクレオチド（エクソ
   ン１）−（エクソン２）−（エクソン３）−（ＧＴＣ　
   ＡＣＴ　ＧＡＣ）−（ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＧＡＣ　ＡＴＴ
   ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＴＣＣ） によりコードされている特許請求の範囲第３項に記載の
   ポリペプチド。 ５、該ポリペプチドが次式のポリヌクレオチド（エクソ
   ン１）−（エクソン２）−（エクソン３）−（ＣＡＧ　
   ＴＧＡ　ＣＴＧ）−（ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＴＡＡ
   ＴＣＧ　ＴＣＴ　ＴＡＴ　ＡＧＧ） にコードされている特許請求の範囲第１項に記載のポリ
   ペプチド。 ６、少くともエクソン４の最初の９個のポリヌクレオチ
   ドを除くすべてが削除されているポリヌクレオチドによ
   りコードされる特許請求の範囲第１項に記載のポリペプ
   チド。 ７、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコー
   ドすることのできる遺伝情報を含んでいるポリヌクレオ
   チド配列。 ８、特許請求の範囲第３項に記載のポリペプチドをコー
   ドすることのできる遺伝情報を含んでいるポリヌクレオ
   チド配列。 ９、特許請求の範囲第４項に記載のポリペプチドをコー
   ドすることのできる遺伝情報を含んでいるポリヌクレオ
   チド配列。 １０、特許請求の範囲第６項に記載のポリペプチドをコ
   ードすることのできる遺伝情報を含んでいるポリヌクレ
   オチド配列。 １１、特許請求の範囲第７項に記載のＤＮＡを含んでお
   り細胞間で転移することのできるベクター。 １２、バクテリオファージである特許請求の範囲第１１
   項に記載のベクター。 １３、ＡＴＣＣ４０１１７及びその突然変異体として同
   定される特許請求の範囲第１２項に記載のベクター。 １４、プラスミドである特許請求の範囲第１１項に記載
   のベクター。 １５、ＡＴＣＣ３９６６５及びその突然変異体として同
   定される特許請求の範囲第１４項に記載のベクター。 １６、ＡＴＣＣ３９６６６及びその突然変異体として同
   定される特許請求の範囲第１４項に記載のベクター。 １７、特許請求の範囲第１項に記載のポリペプチドをコ
   ードできる複製可能な発現ベヒクル。 １８、特許請求の範囲第４項に記載のポリペプチドをコ
   ードできる複製可能な発現ベヒクル。 １９、プラスミドである特許請求の範囲第１７項に記載
   の複製可能な発現ベヒクル。 ２０、特許請求の範囲第１７項に記載の複製可能な発現
   ベヒクルを含有する形質転換された生物体。 ２１、細菌、酵母もしくは哺乳動物細胞培養物である特
   許請求の範囲第２０項に記載の形質転換された生物体。 ２２、プラスミドｐＧＬＴ１０４を含有する特許請求の
   範囲第２０項に記載の形質転換された生物体。 ２３、大腸菌である特許請求の範囲第２０項に記載の形
   質転換された生物体。 ２４、ＡＴＣＣ３９６６７およびその突然変異体として
   同定される特許請求の範囲第２０項に記載の形質転換さ
   れた生物体。 ２５、有効な量の特許請求の範囲第１項に記載のポリペ
   プチドと医薬用に認められている担体もしくは希釈剤と
   から成る医薬組成物。 ２６、培地中で、特許請求の範 囲第１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレ
   オチド配列を有する複製可能な発現ベヒクルを含んでい
   る微生物もしくは細胞培養物を、回収可能な量の該ポリ
   ペプチドを生産せしめるのに十分な条件下で培養し、か
   くして生産されたポリペプチドを集めることから成るポ
   リペプチドの製造方法。 ２７、該ポリペプチドが該複製可能な発現ベヒクルで形
   質転換した大腸菌の細胞質中に存在する特許請求の範囲
   第２６項に記載の方法。