DE10046318A1 - Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen, bei dem man außerhalb des Zellkerns einer Zelle eine DNA nachweist, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm), und eine den Stamm verbindende einsträngige Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen aufweist, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin Substanzen, die für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren geeignet sind, sowie Kits und Arzneimittel.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen, bei dem man außerhalb des Zellkerns einer Zelle eine DNA nachweist, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm), und einer den Stamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin Substanzen, die für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren geeignet sind, sowie Kits und Arzneimittel.

Tumorzellen unterscheiden sich von normalen Zellen u. a. durch ihr unbegrenztes Potential zur Zellvermehrung (Proliferation), ihre Gewebspenetration und Metastasierungsfähigkeit, sowie durch ihre ausgeprägte genetische Instabilität. Routineverfahren zum Nachweis von Tumorzellen beruhen auf klinischen, histologischen, zytologischen und/oder genetischen Beobachtungen sowie auf veränderten physiologischen Meßwerten.

Tumorzellen akkumulieren eine Vielzahl von genetischen Aberrationen. Beispiele sind Translokationen, Deletionen oder Amplifikationen von Genen, Mutationen innerhalb der Polypeptid-kodierenden Sequenz (z. B. Ha-ras oder p53) oder in transkriptionsregulatorischen Einheiten, Methylierungen oder Demethylierungen von DNA Sequenzen oder Aberrationen der Satelliten-DNA (Loeb, L. A., Cancer cells exhibit a mutator phenotype. Adv. Cancer Res. 72, 25, 1998; Fearson, E. R., und Vogelstein, B., A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell 61, 759-767, 1990). Zu der scheinbar unbegrenzten Vielzahl von möglichen genetischen Aberrationen kommt hinzu, daß nicht eine dieser genetischen Aberrationen allein, sondern die Akkumulation von genetischen Aberrationen indikativ ist für eine Tumorzelle. Zur genetischen Identifizierung von Tumorzellen bedient man sich deswegen des Nachweises von Aberrationen, die bei dem jeweiligen Tumortyp besonders häufig gefunden werden (Cancer Genome Anatomy Project, www.ncbi.nlm.nih.gov/ncicgap/; Mitelman, F., Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer. Wiley-Less, New York, 1991).

Normalerweise findet sich DNA in chromosomaler Form im Zellkern. Es gibt jedoch auch bekannte extrachromosomale DNA-Moleküle: Extrachromosomale zirkuläre DNA (ecc: extrachromosomal closed circular DNA) ist eine doppelsträngige, zirkuläre DNA und wird eingeteilt in "kleine polydisperse zirkuläre" (small polydispersed circular, spc) DNA (0,15-20 kb) und "extrachromosomale große zirkuläre" (extrachromosomal large circular, elc) DNA (150-900 kb). "Spc" DNA persistiert sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma, "elc" DNA ausschließlich im Zellkern. "Ecc" DNA wird sowohl in Tumorzellen als auch normalen Zellen gefunden. Die "ecc" DNA-Sequenzen sind extrem heterogen, die Mehrzahl der "ecc" DNA- Moleküle umfaßtrepetitive DNA-Sequenzen, z. B. Alu-Repeats (Kunisada und Yamagihi, J. Mol. Biol., 198, 557, 1987), Alpha-Satelliten-Sequenzen (Riabovol et al., Nucl. Acids Res. 13, 5563, 1985; Jones und Potter, Nucl. Acids Res. 13, 1027, 1985), Sau3A Repeats (Kiyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4665, 1986; Okumura et al., Nucl. Acids Res. 15, 7477, 1987), SINES, LINES, oder Retrovirus-ähnliche Sequenzen wie z. B. THE-1 (Paulson et al., Nature 316, 359, 1985). Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase haben 50-200 Kopien der "ecc" DNA- Elemente in pro Zelle, während Zellen in der physiologischen Wachstumshemmung eine 10-20fach erhöhte Kopienzahl pro Zelle haben (Smith und Vinograd, J. Mol. Biol. 69, 163-178, 1972; Stanfield and Helinski, Mof. Cell. Biol. 4, 173-180, 1984). Da die "ecc" DNA sowohl in Tumorzellen als auch normalen Zellen vorkommt, ist das Vorhandensein von "ecc" DNA nicht indikativ für Tumorzellen.

Double-minutes (DM) sind lichtmikroskopisch detektierbare, chromosomenähnliche DNA-Chromatin-Komplexe mit einer doppelsträngigen DNA von <10⁶ Basenpaaren (bp). DM persistieren im Zellkern und enthalten häufig amplifizierte Gen-Kopien (Kaufmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5669-5673, 1979), z. B. c-myc in einer akuten myeloischen Leukämie (Mohamed et al., Genes Chromosomes Cancer 8, 185-189, 1993), EGF-Rezeptor in einer Colon-Carcinom-Linie (Dol fet al., Genes Chromosomes Cancer 3, 48-54, 1991), N-myc im Neuroblastom (Van Devanter et al., J. Natl. Cancer Inst. 82, 1815-1821, 1990). DM werden bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich, in Tumorzellen gefunden und sind deswegen nicht indikativ für Tumorzellen.

Kurze, lineare, nicht-kodierende doppelsträngige DNA wird in Tumorzellen gefunden, jedoch nicht in normalen Zellen. Diese DNA ist gekennzeichnet durch ihre immortalisierende Aktivität für menschliche Lymphozyten (Abken et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 468-472, 1988; Abken et al., Proc.: Natl. Acad. Sci. USA 90, 6518-6522, 1993; EP 93 109 016.1; US Patent 5,674,723). Daß es sich bei den von Abken et al. gefundenen DNAs um doppelsträngige handelt, zeigt der Versuch des Abbaus mit den Nukleasen DNAsel und S1: Nuklease S1, die einzelsträngige, jedoch nicht doppelsträngige, DNA abbaut, zeigt keine Wirkung (Fig. 2 in PNAS 90, S. 6520).

EP 0 708 841 B1 (PCT WO 95/02701) offenbart den Nachweis von Tumorzellen bzw. von Zellen mit einer unbegrenzten Proliferationsfähigkeit durch Nachweisen oder Isolieren von DNA-Protein-Komplexen, die sich in der Zytoplasmafraktion befinden, welche in einem Cäsium-Chlorid-Gradienten eine sehr hohe Dichte von 1,82 bis 1,89 g/cm³ aufweist. Die in diesem Dokument gefundene zytoplasmatische, doppelsträngige DNA hat eine Länge von 22-592 bp und ist in einer SDS- und Salz-stabilen Bindung mit Proteinen komplexiert. Die Proteine der DNA-Protein-Komplexe haben ein Molekulargewicht von 52 kD, 62 kD und 64 kD. Der Nachweis wird entweder durch Isolierung des Komplexes mit einem CsCl-Gradienten und anschließender Extraktion mit Phenol und Ethanol, wobei die hohe Dichte der Komplexe ausgenutzt wird, oder durch eine Antikörpererkennungsreaktion erbracht. Ein großer Nachteil dieses Systems besteht darin, daß die in EP 0 708 841 im Zytoplasma gefundenen DNA lediglich durch das Verfahren der Isolierung definiert ist und aus diesem Grund eine extrem hohe Sequenzvielfalt aufweist, ohne daß gemeinsame Sequenzen erkennbar wären. Daher ist ein einfacher und reproduzierbarer Nachweis anhand von spezifisch bindenden Oligonukleotidsequenzen ausgeschlossen.

In PCT/EP 98/06384 (WO 99/18235) sind zytoplasmatische cdc37 Protein-Nukleinsäure-Heteromere beschrieben, die zum Nachweis von Tumorzellen verwendet werden können. Auch die in diesem Stand der Technik beschriebene DNA besteht aus zwei komplementären Strängen, die einen Doppelstrang bilden, wobei die Sequenz extrem heterogen ist ohne erkennbare Regel oder gemeinsame Sequenzmotive. Die physiologische Funktion des cdc37 Proteins ist nicht die Bindung an DNA, sondern als Chaperon die Assoziation von zwei Proteinen, cdk4 und Cyclin D, zu vermitteln.

Wegen der erheblichen Vielfalt der physiologischen und histologisch-zytologischen Parameter, die eine Tumorzelle von einer normalen Zelle unterscheiden können, besteht nach wie vor ein Bedarf, Tumorzellen anhand genetischer Marker eindeutig zu identifizieren. Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren bereitzustellen, welches den Nachweis oder die Identifizierung von immortalisierten Zellen oder Tumorzellen in einem Gewebeverband, einer Biopsie oder in Körperflüssigkeiten ermöglicht.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen, bei dem man außerhalb des Zellkerns einer Zelle eine DNA nachweist, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm) und einer den Stamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist. Unter Doppelstrang des DNA-Stranges wird in diesem Zusammenhang die Ausbildung der Sekundärstruktur einer Beta-Helix (B-Helix, B-Konfiguration) verstanden.

Es zeigte sich überraschenderweise, daß Tumorzellen außerhalb des Zellkerns derartige einzelsträngige DNA-Moleküle akkumulieren. In normalen Zellen sind derartige DNA-Moleküle nicht nachzuweisen. Unter normalen Zellen werden in diesem Zusammenhang Zellen verstanden, die in vivo keinen Tumor erzeugen, beispielsweise somatische Zellen mit keiner oder begrenzter Proliferationskapazität, aber auch somatische Stammzellen, wie beispielsweise Satellitenstammzellen des Muskelgewebes. Im chromosomalen Genom von normalen und von Tumorzellen existieren doppelsträngige Kopien dieser DNA-Moleküle, wo jedoch zwei Komplementärstränge den Doppelstrang bilden. Es zeigte sich weiterhin, daß sich der Nachweis einer derartigen DNA in Proben von Zellen, Geweben, Körperflüssigkeiten etc. als Indikator für eine Tumorerkrankung eignet.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbare DNA besteht zwar aus einem Einzelstrang, weist jedoch eine teilweise doppelsträngige Sekundärstruktur auf. Sie ist gekennzeichnet durch Sequenzen der allgemeinen Form A-B-C (Hairpin oder Stamm-Loop):

Die Sequenzen A und C umfassen jeweils mindestens 4 Basen und können durch Basenpaarung einen Doppelstrang A : C ausbilden. Dieser doppelsträngige Bereich (Stamm) liegt in der B-Konfiguration vor. Watson-Crick-Basenpaarung ist bevorzugt, andere Basenpaarungen wie z. B. Adenin : Cytosin oder Thymidin : Guanin sind jedoch ebenfalls möglich. In dem doppelsträngigen Bereich müssen nicht alle Basen gepaart sein, solange die B-Konfiguration über eine Länge von mindestens vier Basen(-paaren) erhalten bleibt.

Vorzugsweise handelt es sich um mindestens 4 Basenpaare, die Watson- Crick-Paarung ausbilden. Der doppelsträngige (Stamm-) Bereich A : C der Stamm-Loop-Struktur umfaßt mindestens vier, vorzugsweise mindestens 6, stärker bevorzugt mindestens 10 Basenpaare. Der Bereich B zwischen A und C (Schleife oder Loop) ist einzelsträngig und umfaßt von 0 bis 15 Basen. Vorzugsweise werden DNAs nachgewiesen, deren Loop höchstens 10, stärker bevorzugt höchstens 5 und noch stärker bevorzugt höchstens 4 Basen aufweist. Der Loop kann auch null einzelsträngige Basen aufweisen, d. h. daß dann zwei benachbarte Basen des Einzelstrangs das eine Ende des doppelsträngigen Stamms bilden. Bevorzugt weist man DNAs nach, die eine Struktur A-B-C mit insgesamt 12-50 Basen, stärker bevorzugt 18-35 Basen enthalten.

Beispiele solcher DNAs, die im erfindungsgemäßen Verfahren nachweisbar sind, sind in Tabelle 1 und im Sequenzprotokoll durch die Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 35 dargestellt. Beispiel 1 (s. u.) beschreibt die Isolierung einer derartigen DNA.

Weiterhin ist die erfindungsgemäß nachzuweisende DNA dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist. Diese DNA bindenden Proteine können an die doppelsträngige Struktur und stärker bevorzugt an den Stamm A : C spezifisch binden. Für den erfindungsgemäßen Nachweis ist die mindestens eine Bindestelle spezifisch für "ubiquitär" exprimierte DNA-bindende Proteine. Dies ermöglicht einen allgemeinen Nachweis, ohne daß eine besondere Auswahl der Nachweisreagenzien für das zu untersuchende Gewebe getroffen werden müßte.

Unter DNA bindenden Proteinen werden in diesem Zusammenhang bevorzugt Proteine verstanden, die ihre physiologische Funktion durch Bindung an DNA, vorzugsweise an chromosomale DNA im Zellkern erfüllen. Unter "ubiquitär" exprimierten Proteinen werden Proteine verstanden, die in mindestens 3 verschiedenen Geweben konstitutiv exprimiert sind. Bei den DNA bindenden Proteinen handelt es sich bevorzugt um Transkriptionsfaktoren, insbesondere um ubiquitär exprimierte Transkriptionsfaktoren. Bekannte DNA bindenden Proteine und die jeweilige DNA-Sequenz, an die diese Proteine spezifisch binden können, sind beispielsweise in der "Transfac" Datenbank zusammengefaßt (Transfac The Transcription Factor Database, Release 4.0; 12. 12. 99; http:/ /transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html). Alternativ kann die Bindung von DNA bindenden Proteinen an diese Struktur experimentell untersucht werden, beispielsweise mit Hilfe des EMSA Tests ("electrophoretic mobility shift assay", Gel-Shift-Analyse) unter Verwendung des doppelsträngigen Bereichs der DNA als Sonde und eines Proteinextrakts aus Tumorzellen als Quelle des DNA bindenden Proteins.

Die erfindungsgemäß nachweisbare DNA befindet sich außerhalb des Zellkerns von Tumorzellen, wobei auch "extrachromosomal" im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung als außerhalb des Zellkerns zu verstehen ist. Hierunter fallen unter anderem das Zytoplasma, die äußere Zellmembran und auch der extrazelluläre Bereich. Es zeigte sich nämlich weiterhin, dass die erfindungsgemäß nachweisbare DNA auch außerhalb der Tumorzellen, bevorzugt in Körperflüssigkeiten, nachweisbar ist.

Eine Probe, in der man das erfindungsgemäße Verfahren durchführen kann, kann somit beispielsweise Zellen, Zellfraktionen und Körperflüssigkeiten umfassen. Unter Zellen werden in diesem Zusammenhang verstanden beispielsweise einzelne Zellen, Zeilpopulationen, Zellverbände wie etwa Gewebeproben und histologische Schnitte fallen. Als Zellfraktionen werden die verschiedenen Kompartimente einer Zelle bezeichnet, wie etwa Zytoplasma, Zellkern, Zellorganellen oder die Zellmembran. Unter Körperflüssigkeiten werden beispielsweise Urin, Blut, Serum, Plasma, Aszites, Liquor oder Sekrete von exokrinen Geweben verstanden.

Für den Nachweis stehen dem Fachmann eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Es können die DNA oder ein Komplex aus der DNA und DNA- bindenden Proteinen nachgewiesen werden.

Eine erste Alternative besteht darin, die extrachromosomale DNA nachzuweisen. Dies kann durch Hybridisierung mit spezifischen Substanzen, insbesondere Oligonukleotidsonden erfolgen, entweder mit oder ohne anschließender Amplifikation, z. B. mit Hilfe der Polymerase-Ketten-Reaktion (Mullis und Fallona, Meth. Enzymol. 155: 335-350, 1987; Saiki et al., Science 239: 487-491, 1988), und Detektion der hybridisierten Sonden. Unter spezifischer Hybridisierung wird in diesem Zusammenhang eine Hybridisierung verstanden, die mindestens 85% der Basen der Sonde in einer Watson-Crick Basenpaarung mit den Basen der nachzuweisenden DNA aufweist. Beispiele sind Hybridisierungsverfahren oder PCR mit markierten oder nicht markierten Nukleinsäure-Sonden mit anschließendem Detektionsverfahren der markierten Sonden (J. Gu. Editor, Polymerase Chain Reaction und Related Technology, Eaton Publishing, 1995, ISBN 1-881-299- 02-3). Die Hybridisierungssonde zum Nachweis der extrachromosomalen DNA kann eine Oligonukleotid-Sequenz aus DNA, RNA und/oder PNA (peptidische Nukleinsäure: Hanvey et al., Science 258: 1481-1485, 1992) sein, bevorzugt in markierter Form. Die Basen der Oligonukleotidsonde können natürliche Basen sein (A, T, C, G, U), aber auch künstliche (z. B. Deaza-G).

Für den Nachweis müssen die nachzuweisenden DNAs in ihre einzelsträngige Form aufgeschmolzen werden. Vorzugsweise hybridisiert die Sonde mit dem Teil der extrachromosomalen DNA, der die doppelsträngige Struktur A-B-C ausbilden kann. Bevorzugt sind Sonden, die aus 10 bis 100 Basen bestehen, mehr bevorzugt aus 12-50 Basen, noch stärker bevorzugt aus 18-25 Basen.

Als Markierungen der Sonden können beispielsweise Biotin, Digoxigenin, Farbstoffe, Fluorochrome, Enzyme, radioaktive Nuklide (Radionuklide) verwendet werden (Sambrook, J., E. F. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). Die Sonden können auch in unmarkierter Form verwendet werden, z. B. als Oligonukleotid-Primer. Bevorzugt ist dann eine zweite Reaktion, z. B. eine DNA-Polymerase Reaktion um eine Markierung in das amplifizierte Hybridisierungsprodukt einzufügen (J. Gu, Editor, Polymerase Chain Reaction and Related Technology, Eaton Publishing, 1995, ISBN 1-881-299-02-3).

Die erfindungsgemäß nachzuweisende DNA kann direkt oder indirekt an eine Festphase verankert werden. Die Detektion der Sonden kann mit Hilfe der verwendeten Markierungen oder durch die spezifische Bindung von Antikörpern, die ihrerseits markiert sein können, durchgeführt werden, beispielsweise mit Hilfe von Immun-Nachweisverfahren wie ELISA oder RIA.

Weiterhin können Array-Verfahren (z. B. DNA- oder RNA-Chips) angewendet werden (Eisen, M. B. und Brown, P. O., DNA arrays for analysis of gene expression. Methods Enzymol. 303, 179-205, 1999; Microarray Biochip Technology, Hrsg.: M. Shena, BioTechnique Books ISBN 1-881299-37-6, 298, 2000), wobei die Substanzen mit Spezifität für die erfindungsgemäß nachweisbaren extrachromosomalen DNA-Sequenzen auf einem Chip angeordnet sind oder in einem Detektionsverfahren verwendet werden. Die nachweisbare DNA, beispielsweise aus einer Biopsie, einem Zellaufschluß oder aus Körperflüssigkeiten, hybridisiert mit der Nukleinsäure auf dem Array und zeigt die Anwesenheit von Tumorzellen an. In einer weiteren Ausführungsform können die DNA bindenden Proteine mit Spezifität für die erfindungsgemäße DNA in dem Verfahren eines Protein oder Peptid-Arrays (Emili, A. Q. und G. Cagney, Nature Biotech. 18, 393-397, 2000) auf einem Array angeordnet sein. In Abwandlung der bekannten Verfahren zeigt die Bindung der nachweisbaren DNA an diese Proteine die Anwesenheit von Tumorzellen an.

Verfahren, die die Tumorzelle in einem Gewebeverband in situ detektieren, sind beispielsweise die in-situ-Hybridisierung (Luke und Shepelsky, Cell Vis 5 : 49-53, 1998) (Beispiel 2) oder die in-situ-PCR (Yap, E. P. und McGee, J. O., Slide PCR: DNA amplification from cell samples on microscopic glass slides. Nucl. Acids Res. 19, 4294, 1991; Tsongalis, G. J. et al., Localized in situ amplification (LISA): a novel approach to in situ PCR. Clin, Chem. 40, 381-384, 1994) unter Verwendung von markierten DNA-, RNA- oder PNA- Sonden, die spezifisch mit der extrachromosomalen DNA hybridisieren. Die Detektion der hybridisierten Sonden erfolgt beispielsweise durch Antikörper gegen die Markierungsdomäne der Sonden, durch Enzymreaktionen, Farbreaktionen, Fluoreszenz, Lumineszenz oder radioaktiven Nachweis (Sambrook et al.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989; Gentechnische Methoden, Hrsg. H. G. Gassen, G. Schimpf, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlin S. 432 ff, 1999; Harlow, E.: Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

Desweiteren kann der Nachweis der DNA mit Hilfe eines spezifisch an diese DNA bindenden Proteins oder Peptids erfolgen. Vorzugsweise verwendet man Proteine oder Peptide, die an den Stammbereich A-C der erfindungsgemäß nachweisbaren DNA binden. Es können als Proteine natürlich vorkommende Proteine verwendet werden, wie etwa Transkriptionsfaktoren (siehe unten für eine entsprechende Datenbank). Es können aber auch synthetische Peptide verwendet werden. Auch Antikörper sind geeignet als spezifisch bindende Proteine. Die Proteine bzw. Peptide können ebenfalls wie beschrieben in Array-Verfahren eingesetzt werden.

Zusätzlich zum Nachweis der DNA kann ein Nachweis eines an die DNA gebundenen Proteins erfolgen. Dazu wird zunächst der Komplex der DNA mit dem Protein isoliert und anschließend eine Substanz zum Nachweis der Proteine eingesetzt, wie etwa spezifische Antikörper.

Es ist auch möglich, die DNA mit Hilfe von Antikörpern nachzuweisen, die in der Lage sind, die Struktur A-B-C der DNA spezifisch zu erkennen. Vorzugsweise sind die Antikörper spezifisch für eine extrachromosomale DNA, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur (Stamm-Loop) aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm), und einer den Stamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist, oder für einen Komplex aus der DNA und einem oder mehreren an die mindestens eine Bindestelle gebundenen DNA bindenden Proteinen.

Eine weitere Alternative zu dem beschriebenen Verfahren, bei dem man die extrachromosomale DNA nachweist, besteht darin, daß man Assoziate (Komplexe) aus DNA bindenden Proteinen und der extrachromosomalen DNA nachweist. Dabei kann die DNA wie beschrieben nachgewiesen werden. Der Nachweis der DNA kann durch Hybridisierung mit der erfindungsgemäßen DNA erfolgen, der Nachweis des an die DNA gebundenen Proteins mit Hilfe eines Antikörpers.

Alternativ kann ein Antikörper verwendet werden, der spezifisch den Komplex aus DNA und Protein detektiert, so daß die Bestandteile des Komplexes nicht mehr gesondert nachgewiesen werden müssen. Dem Fachmann stehen für derartige Anwendungen eine Vielzahl von Verfahren zur Verfügung. Beispielhaft sei genannt die Analyse der Zellen in situ oder des Zytoplasma-Lysats bei kombinierter Verwendung von Antikörpern mit Spezifität für die DNA bindenden Proteine und Hybridisierungs- oder PCR-Verfahren zur Detektion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen. Die Antikörper und/oder die Nukleinsäure spezifischen Sonden können in markierter Form verwendet werden oder indirekt über markierte Detektionsantikörper nachgewiesen werden. Beispielhaft seien Markierungen mit Biotin, Digoxigenin, Enzymen, Farbstoffen oder radioaktiven Substanzen genannt.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann vielfältig zur Identifikation von Tumorzellen angewendet werden, beispielhaft an isolierten Zellen, an Gewebeschnitten, Biopsien, Blut- oder Knochenmarksproben, Gewebeabstrichen (z. B. Cervix-Abstriche), Körperflüssigkeiten, histologischen Präparaten, oder Zellsedimenten (z. B. aus einer Urinprobe).

Die beschriebenen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich zum Nachweis einer Tumorerkrankung oder deren Vorstufen sowie zur Identifikation von Tumorzellen in vitro sowie in vivo. Eine bevorzugte Anwendung ist daher die Feststellung und Verlaufskontrolle einer Tumorerkrankung dadurch, daß man die extrachromosomale DNA in Körperflüssigkeiten oder Zellaufschlüssen nachweist. Die extrachromosomale DNA ist beispielsweise im Serum und Plasma von Tumorpatienten nachzuweisen, nicht jedoch im Serum oder Plasma von gesunden Probanden. Bei einem Tumorrezidiv ist eine derartige Nukleinsäure im Serum frühzeitig nachweisbar. Der Nachweis der extrachromosomalen DNA kann auch in Zellaufschlüssen erfolgen, bevorzugt in Zellaufschlüssen von Blut- oder Knochenmarkszellen oder anderen Zellen einer Biopsie.

Es dabei nicht nur möglich, Tumorzellen allgemein zu identifizieren, sondern die Tumorzellen können auch einem bestimmten Gewebe zugeordnet werden, indem man sowohl uliquitär exprimierte DNA-bindende Proteine als auch solche Proteine nachweist, die gewebespezifisch exprimiert werden. Die Sequenz A-B-C der erfindungsgemäß nachzuweisenden DNA kann in dem A : C DNA-Doppelstrang zusätzlich zu der spezifischen Bindestelle eines ubiquitären DNA bindenden Proteins die Bindestelle für ein DNA-bindendes Protein haben, das nur gewebespezifisch exprimiert ist. Es zeigte sich überraschenderweise, daß die Tumorzelle stets dem Gewebe entstammt, in dem das gewebespezifische DNA-bindende Protein exprimiert ist (Beispiel 3). Eine besondere Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, Tumorzellen dem Gewebe zuzuordnen, aus dem sie entstanden sind. Diese Zuordnung erhält man dadurch, daß man in der Doppelstrang-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA die DNA-Sequenz für die spezifische Bindung eines gewebespezifisch exprimierten, DNA bindenden Proteins aufweist. Die Tumorzelle entstammt dem Gewebe, in dem dieses gewebespezifisch exprimierte Protein exprimiert ist. Als Beispiel sei genannt die DNA-Sequenz A02.1 (SEQ ID NO. 1, Tabelle 1), die den Transkriptionsfaktor MZF-1 in dem A- oder C-Teil der erfindungsgemäßen DNA A-B-C binden kann. Diese DNA eignet sich zum Nachweis von Tumorzellen myeloischen Ursprungs z. B. Zellen der akuten myeloischen Leukämie Typ 2 oder Typ 4 (Beispiel 3). Diese Gewebszuordnung ist spezifisch, da beispielsweise Carcinomzellen im Zytoplasma keine derartige DNA tragen, die MZF-1 binden kann. Das Verfahren eignet sich somit zur Diagnostik und Verlaufskontrolle von Tumorerkrankungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind DNA-Moleküle, die für den Nachweis von Tumorzellen geeignet sind. Eine solche DNA kann durch Inkontaktbringen einer extrazellulären Probe mit DNA bindenden Proteinen erhalten werden und ist dadurch gekennzeichnet, daß sie:

• a) aus einem Strang besteht,
• b) eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren und einer den Doppelstrang verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält,
• c) in der doppelsträngigen Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist.

Solche Nukleinsäuren finden sich außerhalb des Zellkerns von Tumorzellen. Normalerweise befindet sich die Sequenz einer solchen Nukleinsäure in doppelsträngiger Form also mit Komplementärstrang, im chromosomalen Genom der Zelle.

Tabelle 1 und das Sequenzprotokoll fassen beispielhaft bevorzugte DNA-Sequenzen zusammen, deren Nachweis in Zellen außerhalb des Zellkerns oder in Körperflüssigkeiten indikativ ist für Tumorzellen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Nukleinsäure-Sonden zum Nachweis einer derartigen extrachromosomalen DNA, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie in der Lage sind, mit einer solchen DNA in einzelsträngiger Form spezifisch zu hybridisieren. Eine erfindungsgemäße Sonde hat eine Länge von 10 bis 100 Basen (Einheiten), vorzugsweise 15 bis 50, stärker bevorzugt 15 bis 35. Besonders bevorzugt sind Oligonukleotide, die mit den in SEQ ID NO: 1 bis 45 dargestellten Sequenzen spezifisch hybridisieren. Die Sonde kann aus DNA, RNA und/oder peptidischen Nukleinsäuren (PNA) bestehen. Sie ist bevorzugt markiert. Die Markierung kann ein Radionuklid sein oder eine Markierungsgruppe, wie etwa Biotin, Digoxigenin, Enzyme, Farbstoffen u. dgl. Solche Markierungsgruppen für Oligonukleotidsonden sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Protein, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es in der Lage ist, spezifisch an eine erfindungsgemäße Nukleinsäuren, insbesondere an eine der in SEQ ID NO: 1 bis 45 dargestellten Sequenzen zu binden. Das Protein kann natürlich oder auch synthetisch sein. Protein umfaßt in dieser Zusammensetzung auch Peptide.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Komplex aus einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und einem DNA bindenden Protein, daß spezifisch mit der DNA assoziiert ist, indem es an die mindestens eine Bindestelle auf der DNA gebunden ist.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ist für eine extrachromosomale DNA, die einen einzigen Strang darstellt, der in der Lage ist, in einem Abschnitt eine doppelsträngige Struktur zu bilden, und eine oder mehrere Sequenzen aufweist, an die DNA-bindende Proteine spezifisch binden können. Der Antikörper kann ein polyklonaler, monoklonaler oder auch rekombinanter Antikörper sein. Der Antikörper kann an ein Enzym, Radionuklid, Farbstoff, oder andere Substanzen als Detektoren gekoppelt sein.

Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Arzneimittel, welches als Wirkstoff eine erfindungsgemäße DNA, eine erfindungsgemäße Sonde und/oder einen erfindungsgemäßen Antikörper aufweist.

Figurenbeschreibung

Abb. 1 zeigt die Ergebnisse aus In-situ-Hybridisierungen mit den Sonden A, B und C (Beispiel 2) und jeweils AML-Zellen und peripheren Blutlymphozyten gesunder Spender (a bis f).

Das Sequenzprotokoll zeigt die in Tabelle 1 dargestellten Sequenzen A-B-C in der Reihenfolge, in der sie dort aufgelistet sind (SEQ ID NO 1-45), sowie die in den Beispielen beschriebenen Sonden A bis L (SEQ ID NO 46-57).

Beispiele Beispiel 1

Isolierung der extrachromosomalen DNA, die für den Nachweis von Tumorzellen verwendet werden kann.

Beschrieben ist hier die Isolierung der DNA aus Zellen einer akuten myeloischen Leukämie. Mit gleichem Verfahren kann die DNA jedoch aus jeder beliebigen Tumorzelle isoliert werden.

Mononukleäre Zellen einer akuten myeloischen Leukämie (AML) wurden mit Hilfe der Dichtegradienten-Zentrifugation (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, Suppl. 97, 51-76, 1968) aus dem peripheren Blut eines Patienten mit AML isoliert. Ca. 25% der mononukleären Zellen waren AML- Blasten, ca. 75% der Zellen normale mononukleäre Zellen.

Die Zellen (ca. 10⁸ Zellen) wurden in PBS gewaschen und in 5 ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM EDTA, 1,5 mM MgCl₂ resuspendiert. Die Zellen wurden durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen lysiert und die Zellkerne anschließend durch 30minütige Zentrifugation bei 6.000 × g sedimentiert. Die Mitochondrien wurden aus dem Überstand mit Hilfe eines Sucrosegradienten (J. Biol. Chem. 249: 76991-76995, 1974) abgetrennt. Die Mitochondrien-freie Fraktion wurde mit RNase A (20 µg/ml) und RNase T1 (1000 U/ml) 30 min bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz 12 Stunden bei 60°C mit Proteinase K (500 µg/ml) inkubiert. Der Ansatz wurde bei 10.000 × g zentrifugiert, der Überstand in Phenol und die wässrige Phase anschließend in Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1 v/v) extrahiert. Die DNA in der wäßrigen Phase wurde durch Zugabe von 0,2 M NaAcetat und 2 vol Ethanol gefällt und in 50 µl 1 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,1 mM EDTA resuspendiert (= isolierte extrachromosomale DNA aus dem Zytoplasma von AML Zellen). Die DNA wurde in die Smal-geschnittene pUC19-DNA mit Hilfe der T4 DNA Ligase (10 U) bei 4°C 12 Std. ligiert und anschließend in E.coli DH5α Bakterien transformiert. Die Sequenzen der DNA-Inserts in pUC DNA wurde bestimmt.

Zur Identifizierung der DNA-Sequenzen, die sich zum Nachweis von Tumorzellen eignen, wurden folgende Verfahren sukzessiv angewendet:

• 1. Es wurden ausschließlich die DNA-Sequenzen weiter bearbeitet, die in den Tumorzellen als extrachromosomaler Einzelstrang, nicht jedoch als Doppelstrang vorliegen. DNA-Sequenzen, die in der Zelle als doppelsträngige extrachromosomale DNA-Moleküle vorliegen, wurden verworfen.
• 2. Die DNA-Sequenz des Einzelstranges wurde daraufhin analysiert, ob dieses DNA-Molekül mindestens eine doppelsträngige DNA-Struktur ausbilden kann, die aus mindestens vier Basenpaaren und einer den Doppelstrang verbindenden Schleife aus höchsten 15 Basen besteht.
• 3. Die in 2. gefundene doppelsträngige Struktur wurde daraufhin untersucht, ob sie eine potentielle Bindestelle für mindestens ein DNA-bindendes Protein aufweist.

Erfüllt die klonierte DNA-Sequenz die Parameter 1 bis 3, so ist die doppelsträngige DNA Struktur dieses Moleküls zusammen mit der verbindenden Schleife für den Nachweis von Tumorzellen geeignet. Tabelle 1 zeigt Beispiele derartiger DNA-Sequenzen.

Punkt 1 wurde wie folgt untersucht.
Isolierte extrachromosomale DNA aus dem Cytoplasma von AML-Zellen (ca. 100 ng DNA) wurde mit S1-Nuklease (100 U/µl) (Ansatz A), mit DNasel (50 µg/µl) (Ansatz B), und ohne Zusätze (Ansatz C) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Ansätze wurden anschließend 10 min bei 95°C inkubiert und mit Hilfe der Minifold® Apparatur (Schleicher & Schuell, Mainz) auf Hybond N Nylon-Membran (Amersham Buchler, Braunschweig) aufgetragen. Die Membran wurde mit einer Digoxigenin-1 l-dUTP markierten klonierten DNA- Sonde bei 42°C in 55% (v/v) Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS, 10% (w/v) Dextransulfat (MW 500.000), 100 µg/ml Hering Sperma DNA für 12 Stunden hybridisiert. Die hybridisierte DNA wurde mit Hilfe eines Peroxidase markierten anti-Digoxigenin Antikörpers und der Peroxidase Reaktion nachgewiesen. Liegt die DNA als Einzelstrang vor, so ist die DNA durch S1 Nuklease abbaubar und in Ansatz A nicht nachweisbar. Liegt die DNA jedoch als Doppelstrang vor, so ist sie in Ansatz A nachweisbar. Unabhängig davon und als Kontrollen sollte die DNA in Ansatz B nicht nachweisbar sein, da sie durch DNasel abgebaut wurde, in Ansatz C jedoch stets nachweisbar sein.

Alternativ wurde folgendes Verfahren eingesetzt.
Der Oberstrang der klonierten DNA wurde in Gegenwart von Digoxigenin- 11-dUTP (Roche Diagnostics, Mannheim) synthetisiert (Sonde A). In einem getrennten Ansatz wurde der Unterstrang in Gegenwart von Digoxigenin-11- dUTP synthetisiert (Sonde B). Sonde A und Sonde B werden in getrennten Ansätzen als Sonden in der in situ Hybridisierung von AML-Zellen verwendet. Die Hybridisierung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Hybridisierte die Sonde A, jedoch nicht die Sonde B, mit dem Zytoplasma der AML Zelle, so wurde die zur Sonde A komplementäre DNA- Sequenz der Analyse nach Punkt 2 und 3 unterzogen. Hybridisierte die Sonde B, jedoch nicht die Sonde A, mit dem Zytoplasma der AML Zelle, so wurde die zur Sonde 8 komplementäre DNA-Sequenz der Analyse nach Punkt 2 und 3 unterzogen. Hybridisierten beide DNA Sonden A und B, so wurde die DNA-Sequenz verworfen.

Punkt 3 wurde wie folgt untersucht.
Die doppelsträngige Struktur (aus Punkt 2) wurde mit Hilfe der Transfac Datenbank (Transfac The Transcription Factor Database, Release 4.0, 12. 12. 99; http:/ /transfac.gbf.de/TRANSFAC/index.html) untersucht, ob sie die Binderegion eines bekannten DNA bindenden Proteins umfaßt. War dieses der Fall, so ist auch dieser Parameter für die Sequenz erfüllt.

Alternativ wurde Punkt 3 experimentell wie folgt untersucht. Unter Verwendung des doppelsträngigen Bereichs der DNA als Sonde und unter Verwendung eines Proteinextrakts aus Tumorzellen als Quelle des DNA- bindenden Proteins wurde mit Hilfe des EMSA Tests ("electrophoretic mobility shift assay", Gel-Shift Analyse) die Bindung von DNA bindenden Proteinen an diese Struktur untersucht. Ist eine spezifische Proteinbindung an die DNA-Sonde nachgewiesen, so erfüllt die DNA-Sequenz Punkt 3 der Analyse.

Beispiel 2 Identifizierung von Tumorzellen im peripheren Blut eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie

Mononukleäre Zellen aus 10 ml Blut eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und als Kontrolle aus 10 ml Blut eines gesunden Spenders wurden mit Hilfe der Dichtegradienten-Zentrifugation (Boyum, A., Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21, suppl. 97, 51-76, 1968) isoliert. Ca. 30% der mononukleären Zellen des Patienten mit AML waren Leukämie-Zellen, 70% normale mononukleäre Zellen des peripheren Bluts. Die Identifizierung der Tumorzeilen in diesen Blutproben erfolgte durch Nachweis der extrachromosomalen A02.1 DNA mit Hilfe der in situ Hybridisierungstechnik.

Die mononukleären Zellen des peripheren Bluts wurden in PBS resuspendiert, 5 × 10⁵ Zellen in 10 µl PBS auf Objektträger aufgetragen, getrocknet und mit Paraformaldehyd (4% v/v) 20 min bei 4°C fixiert. Die Objektträger wurden dreimal mit PBS gewaschen, 30 sec. in Ethanol (70% v/v) gegeben und schließlich an der Luft getrocknet. Der Objektträger wurde 5 Min. in 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2 mM CaCl₂, bei 37°C äquilibriert, 3 µl Proteinase K (20 mg/ml) für 10 min hinzugegeben und anschließend zweimal 5 Min in 20 mM Tris-HCl, pH 7,2, 2 mM CaCl₂, 50 mM MgCl₂ bei Raumtemperatur gewaschen. Die Zellen wurden mit Paraformaldehyd (4% v/v) 15 Min bei 4°C fixiert und anschließend in PBS, 1% (v/v) Tween 20 für 10 Min bei Raumtemperatur gewaschen.

Es folgte eine Prähydisierung der Zellen eines Objektträgers in 50 µl Hybridisierungslösung (25% v/v deionisiertes Formamid, 4× standard saline citrate (SSC) (1 × SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Na-zitrat, pH 7,0), 5× Denhardt's Lösung (0,1% [v/v] Polyvinylchlorid, 0,1% Pyrrolidon, 0,2% [w/v] bovines Serum Albumin BSA), 50 mM NaH₂PO₄Na₂HPO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA, 250 µg/ml tRNA, 500 µg/ml Hering Sperma DNA für 3 Std. bei 42°C. Anschließend wurde der Objektträger für 5 Min bei 95°C inkubiert.

Die Oligonukleotidsonde zur Detektion der A02.1 DNA sowie die Kontrollsonde wurde synthetisiert und 5'-terminal mit Digoxigenin-11-dUTP markiert. Vor der Hybridisierung wurden die Oligonukleotidsonden durch Inkubation bei 95°C für 5 Min denaturiert.

Folgende Olignonukleotid-Sonden wurden verwendet:

• A) 5' Dig-UTTTTCTACTAAATAAAATAAAA-Dig-U 3' (komplementär zur A02.2 DNA)
• B) 5' Dig-UTTTTATTTTATTTAGTAGAAAA-Dig-U 3' (A02.2 DNA)
• C) 5' Dig-UTTTTTTTTTTTTGGAAAAAAAA-Dig-U 3' (dieselbe Anzahl Nukleotide wie Sonde A, jedoch in willkürlicher Sequenz)
• D) 5' Dig-UGGGAATATCTTCATATCAAATC-Dig-U 3' (komplementär zur A12 DNA)
• E) 5' Dig-UGATTTGATATGAAGATATTCCC-Dig-U 3' (A12 Sequenz)
• F) 5' Dig-UTTTTTTTTGGGGCCCAAAAAAA-Dig-U 3' (dieselbe Anzahl Nukleotide wie Sonde (D), jedoch in willkürlicher Sequenz).

Zu den Hybridisierungen mit den Sonden D, E und F sind keine Abbildungen bereitgestellt.

Als weitere Kontrolle diente eine "Scheinhybridisierung" (C) ohne DNA- Sonde.

Die Oligonukleotid-Sonden (1 ng Oligonukleotid/µl Hybridisierungslösung) wurden hinzugegeben und die Objektträger 12 Std. bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Objektträger wurden viermal 20 Min. bei Raumtemperatur in 2 × SSC gewaschen, anschließend 30 Sek. in PBS, 1% (w/v) bovines Serum Albumin (BSA) inkubiert und 15 Min in PBS, 33% (v/v) fötales Kälberserum bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Objektträger 2 Stunden in PBS, 1% (w/v) BSA, 1 : 300 (v/v) Schaf-anti-Digoxigenin Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase (Roche Diagnostics, Cat. Nr. 1 093 274) bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurde der Objektträger viermal 10 Min in PBS gewaschen, einmal 30 Sek. in PBS, 20 mM Levamisol, gewaschen und anschließend in 0,16 mg/ml 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat (BCIP) und 0,33 mg/ml Nitro-Blau Tetrazoliumsalz (NBT) in 200 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 9,2 (BCIP/NBT) entwickelt. Der Objektträger wurde viermal in PBS gewaschen und die Zellkerne mit Methylgrün (1 g Methylgrün, 100 ml H₂O, 25 ml EtOH) 5 Min bei Raumtemperatur gefärbt. Die Zellen wurden je 30 Sek. in 70% Ethanol und in abs. Ethanol und zweimal 10 Min in Xylol entwässert. Die Zellen wurden in Eukitt (Fa. Kindler, Freiburg) eingedeckt und mikroskopisch ausgewertet.

Ergebnis

Die Bilder in Abb. 1 a) bis f) zeigen die Hybridisierung der Sonden A (komplementär zur Sequenz AO2.2), B (Sequenz AO2.2 [komplementär zu Sonde A]) und C (willkürliche Sequenz) jeweils mit AML-Zellen und peripheren Blutlymphozyten (PBL) gesunder Spender. Lediglich in a) (Sonde A und AML-Zellen) ist ein positives Hybridisierungssignal in Form einer dunkelblauen Färbung sichtbar.

• 1. Bei Verwendung der Sonde A und der Sonde D zeigen die Leukämie- Zellen in der Blutprobe des Patienten mit AML ein blaues Hybridisierungssignal im Zytoplasma. Der Zellkern (leicht grün gefärbt) zeigt kein Hybridisierungssignal. Normale Lymphozyten in der Blutprobe des Patienten mit AML sowie in der Blutprobe des gesunden Spenders zeigen kein Hybridisierungssignal.
• 2. Bei der Verwendung der Sonden B und C sowie E und F sowie bei der Scheinhybridisierung wurden keine Hybridisierungssignale erhalten, weder bei den Leukämiezellen noch bei den normalen Zellen. Dieses demonstriert, daß das Hybridisierungssignal bei Verwendung der Sonden A und D auf einer spezifischen Hybridisierung mit einer komplementären DNA beruht.

Diskussion

Zellen der akuten Leukämie wurden mit Hilfe der Sonde A unter Verwendung der in situ Hybridisierungstechnik in einem Gemisch mit normalen Blutzellen des Patienten identifiziert. Normale Zellen gesunder Spender werden nicht durch diese Sonde gezeigt.

Beispiel 3 Tumorzellen werden dem Gewebe-Ursprung zugeordnet

Mononukleäre Zellen werden aus (1) einer Blutprobe eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) und (2) eines gesunden Spenders wie in Beispiel 2 beschrieben isoliert. Ca. 30% der mononukleären Zellen des Patienten mit AML waren Leukämie-Zellen, 70% normale mononukleäre Zellen des peripheren Bluts. Einer weiteren Blutprobe (3) des gesunden Spenders werden Zellen eines Mammakarzinoms (MCF-7, ATCC) zugesetzt, so daß 30% der Zellen dieser Blutprobe Karzinomzellen sind.

Die Zellen werden auf Objektträger aufgebracht und einer in situ Hybridisierung wie in Beispiel 2 beschrieben, unterzogen.

Folgende Digoxigenin (Dig-)-UTP markierte Oligonukleotid-Sonden wurden verwendet:

• A) 5' Dig-UCAGGGTCTGCGGCAGCCCCTCA-Dig-U 3' (detektiert die AO2.1 DNA mit der Bindestelle für MZF-1, ein Transkriptionsfaktor, der in myeloischen Zellen spezifisch exprimiert ist)
• B) 5' Dig-UCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGT-Dig-U 3' (detektiert die M29 DNA mit der Bindestelle für CHOP, ein Transkriptionsfaktor, der in Mamma- und Colon- Karzinom spezifisch exprimiert ist)
• C) 5' Dig-UTTTTCTACTAAATAAAATAAAA-Dig-U 3' (detektiert die AO2.2 DNA mit den Bindestellen für C/EBP-B und NFAT, ubiquitäre Faktoren)

Kontrollen

• A) 5 ' Dig-UTGAGGGGCTGCCGCAGACCCTG-Dig-U 3' (komplementär zur Sonde G und identisch zur AO2.1 Sequenz)
• B) 5' Dig-UACCTGCAGGCATGCAAGCTTGG-Dig-U 3' (komplementär zur Sonde H und identisch zur M29 Sequenz)
• C) 5' Dig-UTTTTATTTTATTTAGTAGAAAA-Dig-U 3' (komplementär zur Sonde 1 und identisch zur A02.2 Sequenz)
• D) "Scheinhybridisierung" ohne DNA-Sonde

Ergebnis

• 1. Unter Verwendung der Sonde G wurden Hybridisierungen mit dem Zytoplasma der AML-Leukämie-Zellen, jedoch nicht mit MCF-7 Mamma- Carcinomzellen erhalten.
• 2. Unter Verwendung der Sonde H wurden Hybridisierungen mit dem Cytoplasma der MCF-7 Zellen, jedoch nicht mit den AML-Leukämiezellen erhalten.
• 3. Unter Verwendung der Sonde 1 wurden Hybridisierungen im Cytoplasma sowohl der AML- als auch der MCF-7-Zellen erhalten.
• 4. Unter Verwendung der Sonde K und L sowie bei der "Scheinhybridisierung" wurden keine Hybridisierungssignale erhalten, weder mit den MCF-7- noch den AML-Zellen.
• 5. Es wurden keine Hybridisierungen mit Blutlymphozyten gesunder Spender erhalten.

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch Auswahl der Sonden zwischen Karzinom- (MCF-7 Mammakarzinom) und Leukämie-Zellen (AML) unterschieden werden kann.

Die Sonde G detektiert eine cytoplasmatische DNA mit einer Bindestelle für den myeloid zellspezifischen Transkriptionsfaktor MZF-1. Der MZF-1 Transkriptionsfaktor ist spezifisch in myeloischen Zellen exprimiert, jedoch nicht in epithelialen Zellen. Die Sonde G ist geeignet für den spezifischen Nachweis von Tumorzellen myeloischen Ursprungs. Andererseits weist die Detektion einer extrachromosomalen DNA mit Bindestelle für den Transkriptionsfaktor MZF-1 (detektiert mit DNA-Sonde H) diese Tumorzellen dem myeloischen Gewebeursprung zu.

Die Sonde H detektiert eine cytoplasmatische DNA mit einer Bindestelle für den Mamma- und Colon-Karzinom-spezifischen Transkriptionsfaktor CHOP (C/EB-zeta, gadd 153). Dieser Transkriptionsfaktor ist bevorzugt in Mamma- und Colon-Karzinomzellen erhöht exprimiert, jedoch nicht in Blutzellen exprimiert. Diese Sonde ist geeignet für den Nachweis von Karzinomzellen, insbesondere Mamma- und Colon-Karzinom-Zellen und weist diese Tumorzellen dem epithelialen Gewebeursprung zu.

Sonde I, die zytoplasmatische DNA mit Bindungsstellen für ubiquitäre Transkriptionsfaktoren (C/EBPB und NFAT) detektiert, eignet sich für den Nachweis von Tumorzellen unabhängig vom Gewebeursprung oder von der Differenzierung.

Tabelle 1

Beispiele für DNA-Moleküle, deren Vorkommen außerhalb des Zellkerns zum Nachweis und zur Identifizierung von Tumorzellen genutzt werden kann.

Dargestellt ist die Sequenz des DNA-Stranges, dessen Faltung zu einem Doppelstrangbereich A : C, der sie verbindenden Schleife B, sowie die 5' und 3' flankierenden Basen. Weiterhin sind aufgeführt die DNA- bindenden Proteine, die an den Doppelstrang binden können, sowie die DNA-Sequenz, an die das DNA- bindenden Protein spezifisch bindet (Binderegion). Innerhalb dieser DNA-Binderegion ist die Kernsequenz (core) unterstrichen. Sonden oder Antikörper, die spezifisch den DNA-Doppelstrange (A : C) und dessen Schleife (B) detektieren, eignen sich für den Nachweis und die Identifizierung von Tumorzellen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (30)

1. Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man außerhalb des Zellkerns einer Zelle eine DNA nachweist, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur (Stamm- Loop) aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm), und einer den Stamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA- bindende Proteine aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA nachweist, deren doppelsträngige Struktur einen Loop aus höchstens 10 und vorzugsweise höchstens fünf Basen aufweist.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA mit einer doppelsträngigen Struktur aus 12 bis 50 Basen nachweist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA mit einer doppelsträngigen Struktur aus 18 bis 35 Basen nachweist.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine DNA nachweist, die eine der in SEQ ID NO: 1 bis 45 dargestellten Sequenzen enthält.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich ein DNA-bindendes Protein nachweist, das spezifisch an die doppelsträngige Struktur der DNA gebunden ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Komplex aus der DNA und dem DNA-bildenden Protein nachweist.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis der DNA eine Oligonukleotidsonde verwendet, die in der Lage ist, mit dem Sequenzbereich der DNA zu hybridisieren, welcher die doppelsträngige Struktur bildet, wobei man vor der Hybridisierung die DNA in einzelsträngige Form aufschmilzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis eine Oligonukleotidsonde verwendet, die mit einer der in SEQ ID NO: 1 bis 45 dargestellten Sequenzen spezifisch hybridisiert.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis eine Oligonukleotidsonde aus DNA, RNA, und/oder PNA verwendet.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis eine markierte Oligonukleotidsonde verwendet.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis der DNA mindestens ein DNA- bindendes Protein oder Peptid verwendet, welches in der Lage ist, spezifisch an eine DNA gemäß Anspruch 1 zu binden.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis sowohl ein ubiquitär exprimiertes als auch ein gewebsspezifisches DNA-bindendes Protein verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis einen Transkriptionsfaktor als DNA- bindendes Protein verwendet.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis zusätzlich einen Antikörper verwendet, welcher spezifisch ist für ein DNA-bindendes Protein, das mit der DNA assoziiert ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Nachweis einen Antikörper verwendet, welcher spezifisch ist für die DNA oder für eine Oligonukleotidsonde, die mit der DNA spezifisch hybridisiert, oder für einen Komplex aus der DNA und dem DNA bindenden Protein.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis in einer Gewebebiopsie, Blut- oder Knochenmarksproben, einem Gewebeabstrich, einer Körperflüssigkeit, einem Zellsediment, histologischen Präparat oder einem Zellaufschluß durchführt.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die für den Nachweis verwendeten Substanzen in einem Array anordnet.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Nukleinsäuresonden als DNA- oder RNA- oder PNA-Chip zum Nachweis einsetzt.

20. Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, daß sie

• a) aus einem Strang besteht,
• b) eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm) und einer den Stamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält,
• c) in der doppelsträngigen Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist.

21. Nukleinsäure nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine der in SEQ ID NO: 1 bis 45 dargestellten Sequenzen enthält.

22. Nuleinsäure-Sonde, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Länge von 10 bis 100 Basen aufweist und in der Lage ist, mit einer Nukleinsäure nach Anspruch 18 oder 19, nach deren Aufschmelzen in einzelsträngige Form spezifisch zu hybridisieren.

23. Sonde nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus DNA, RNA und/oder PNA besteht.

24. Sonde nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß sie markiert ist.

25. Protein, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Lage ist, spezifisch an eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 20 oder 21 zu binden.

26. Komplex aus einer Nukleinsäure nach Anspruch 20 oder 21 und einem DNA bindenden Protein, das spezifisch an die mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine gebunden ist.

27. Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er spezifisch ist für eine extrachromosomale DNA, die aus einem Strang besteht und eine doppelsträngige Struktur aus mindestens vier Basenpaaren, die einen Doppelstrang bilden (Stamm), und einer den Doppelstamm verbindenden einsträngigen Schleife (Loop) aus höchstens 15 Basen enthält, wobei die doppelsträngige Struktur mindestens eine Bindestelle für DNA-bindende Proteine aufweist, oder für einen Komplex aus der DNA und einem oder mehreren an die mindestens eine Bindestelle gebundenen DNA bindenden Proteinen.

28. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eine Sonde nach einem der Ansprüche 22 bis 24 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 27 aufweist.

29. Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Diagnostizierung von Tumorzellen, dadurch gekennzeichnet, daß man als Wirkstoff eine Sonde nach einem der Ansprüche 22 bis 24 und/oder einen Antikörper nach Anspruch 27 verwendet.

30. Anwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 19 zur Diagnostik und Verlaufskontrolle von Tumorerkrankungen.