EP1021564A1 - Verfahren zum nachweis sowie zur gewinnung oder beseitigung von human- oder säugerzellen mit gestörter zellzykluskontrolle oder der fähigkeit zu unbegrenzter proliferation oder zur tumorbildung - Google Patents

Verfahren zum nachweis sowie zur gewinnung oder beseitigung von human- oder säugerzellen mit gestörter zellzykluskontrolle oder der fähigkeit zu unbegrenzter proliferation oder zur tumorbildung

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EP1021564A1
EP1021564A1 EP98954373A EP98954373A EP1021564A1 EP 1021564 A1 EP1021564 A1 EP 1021564A1 EP 98954373 A EP98954373 A EP 98954373A EP 98954373 A EP98954373 A EP 98954373A EP 1021564 A1 EP1021564 A1 EP 1021564A1
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EP
European Patent Office
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cells
seq
nucleic acid
cdc37
cell
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Withdrawn
Application number
EP98954373A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Hinrich Prof.Dr.Med. Abken
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Curacyte AG
Original Assignee
Abken, Hinrich, Prof.Dr.med.
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to cdc37 protein-nucleic acid heteromers, cdc37 protein, nucleic acids and antibodies which are suitable for the detection of cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation, methods for the identification and elimination of human and animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation using such heteromers, proteins, nucleic acids or antibodies.
  • All normal differentiated cells have a limited potential for cell proliferation before they are subject to cell aging (senescence) and cell death after a defined number of cell divisions.
  • the cell biological processes of cell division and cell aging are subject to a complex regulated genetic control, the disruption of which can lead to cell death on the one hand or to unlimited proliferation or tumor formation on the other hand.
  • Cell proliferation requires cell division, which is carried out in a cascade of processes in temporal and spatial order (cell cycle).
  • the control of this process takes place at two points in time, namely that at which the DNA synthesis (S phase of the cell cycle) and that at which the mitosis (M phase) begins, and is carried out by a small group of protein kinases, which by phosphorylation regulate the activity of numerous proteins involved in the process.
  • S phase of the cell cycle DNA synthesis
  • M phase mitosis
  • These cell cycle-controlling protein kinases are heterodimeric proteins with regulatory subunits (cyclins), the content and association of which with other proteins changes in the course of the cell cycle in a characteristic manner.
  • cyclins regulatory subunits
  • cyclin dependent kinases The catalytic subunits of these protein kinases are called cyclin dependent kinases (cdk) because they only become active as kinase after association with a cyclin.
  • the cyclin-dependent kinases were first discovered in yeast and named for the genes coding for them, e.g. B. cdc2 (cell division cycle-2) from Schizosaccharomyces pombe or cdc28 from Saccharomyces cerevisiae. It soon became clear that many proteins involved in the control of the cell cycle are highly conserved and are present as homologous genes with similar or identical functions in eukaryotes.
  • Cdk2, Cdk4 and Cdk5 each associated with the cyclin D 1, D2, D3 subunits, are involved in initiating the G 1 phase of the cell cycle.
  • a cyclin-dependent kinase associated with different cyclins can control different points in the cell cycle.
  • Cdk2 associated with cyclin E is involved in the control of the G 1 -S transition
  • Cdc2 associated with cyclin A and B controls the G2-M transition.
  • the state of knowledge for controlling the cell cycle is still far from a uniform model and further Cdk and cyclin molecules are still being discovered that control defined positions of the cell cycle and thus cell proliferation.
  • tumorigenic transformed cells have one or more defects in one or more of the control mechanisms of the cell cycle.
  • the cyclin-dependent protein kinases can both catalyze and inhibit the transition from one phase of the cell cycle to the next subsequent phase. Damage to the DNA caused by radiation or chemical agents, however, stabilizes the tumor suppressor protein p53, which thereby stimulates the synthesis of a cyclin-dependent kinase inhibitor.
  • This kinase inhibitor in turn binds the G 1 -specific Cdk / cyclin complex, whereupon the cell remains in the G 1 phase until the DNA damage has been repaired and the p53 level has dropped.
  • This complex regulation ensures that only the cells that have completely repaired the DNA damage that has occurred are reproduced. If the repair is unsuccessful, the cell is subject to programmed cell death, which prevents the cell from degenerating into uninhibited proliferation in the event of existing DNA damage. If the gene encoding p53 is mutated, however, the p53-induced delay in the G 1 -S transition does not occur, which leads to replication of damaged DNA and an increase in damaged cells without the cell being subjected to programmed cell death.
  • the phenotype of tumorigenous transformed cells can be extremely diverse and is characterized by an extremely heterogeneous picture of numerous genetic, phenotypic-morphological and physiological changes, which in turn are influenced by numerous other parameters, such as, for. B. degree of differentiation, cell matrix, surrounding cells, local growth factor concentrations or immunological defense, are dependent, without common obligatory properties are molecularly defined can. This problem will be illustrated using the cell proliferation of normal and tumorigenous transformed cells.
  • tumorigenic transformed cells While all normal human and animal cells have a limited potential for cell proliferation, tumorigenic transformed cells often show unlimited cell division. They form constantly growing cell groups, which lead to the formation of a tumor and ultimately, together with the changed expression of other properties (e.g. reduced need for growth factors, proliferation without anchoring and contact inhibition, induction of new blood vessels, etc.) to the tumor disease. According to the current understanding of the development of tumors, cells are most likely to be transformed neoplastic (tumorigenic) if (1) the cells proliferate indefinitely in vivo and / or (2) are arrested in their cell death. The tumorigenic transformation is a multi-stage process, at the end of which the tumor cells express properties (1) and / or (2) along with numerous other properties.
  • An early event in this process is unlimited proliferation (“immortalization”), which is characterized by the fact that the cell has acquired the ability to remain in the cell cycle and to be able to perform continuous cell divisions (Freund et al., Oncogene 7: 1 979 -1 992). With immortalization, however, the cell does not yet acquire the ability to form tumors in a tissue association (Medina and Kttrell, Carcinogenesis 1 4: 25-28, 1 993; Strauss and Griffin, Cancer Cells 2: 360-365, 1 990). This requires a large number of additional "transforming events", which have not yet been characterized in detail.
  • induction of the neoplastic transformed phenotype does not require prior immortalization (O'Brien et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 83: 8659-8663, 1,986).
  • An example of this are cells of chronic lymphoblastic leukemia that are no longer able to divide, but through a transforming event in theirs programmed cell death (apoptosis) are arrested (Buschle et al., J. Exp. Med. 1 77, 21 3-21 8, 1 993). Due to the constant differentiation of progenitor cells, new cells are always formed, which are then inhibited in their cell death. As a result, the number of cells increases, which leads to tumor formation.
  • Tumor cells can be at different stages of neoplastic transformation and have acquired different "tumor-associated" properties or lost properties of differentiated cells. With phenotypic heterogeneity and the various mechanisms leading to neoplastic transformation, it is extremely difficult to identify a cell capable of unlimited proliferation and tumor formation in an environment of normal cells. For diagnostics and therapy and ultimately for the survival of the patient, it is of crucial importance to find those cells which are no longer subject to normal proliferation control and cell cycle regulation and which have acquired the potential for unlimited proliferation and tumor formation.
  • a particular difficulty is always the differentiation of the proliferation of neoplastic transformed cells from the physiological proliferation of normal cells in the context of the regeneration or differentiation of tissues, such as in blood formation in the bone marrow or in wound healing.
  • Physiological proliferation can take place either briefly or permanently in response to physiological stimulation, the extent of physiological regenerative proliferation being able to far exceed that of tumor cells. This is particularly evident in the proliferation and differentiation of blood-forming cells. For this reason, it is not possible to use the degree of cell proliferation (cell divisions per time) or the progression in the cell cycle as well as the degree of activation (phosphorilization) of the cell cycle control proteins to identify tumor cells.
  • the known methods for the detection of tumor cells are based on clinical, morphological-histological, cytological or physiological parameters or on antibodies which recognize antigens which are preferentially expressed by proliferating (normal and tumor) cells, e.g. B. the Ki-67 antigen or PCN antigen, thus on indirect parameters that are not causally related to the neoplastic transformation of the cells.
  • proliferating normal and tumor
  • PCN antigen proliferating cells
  • mutations of membrane-bound or intracellular receptors for intracellular signal transmission e.g., fms, erb-B / A, src, yes
  • mutations of protein kinases e.g. mos, raf, ras
  • nuclear transcription factors e.g. fos, jun, myc
  • cell cycle-associated control proteins e.g p53, rb
  • the object of the invention to detect, eliminate or inhibit the growth of a tissue bandage in situ or in a cell suspension, which have a disturbed cell cycle control or which have acquired the ability to proliferate indefinitely or to form tumors.
  • the tumorigenous transformed cells should be distinguished from normal cells with transient or physiological proliferation.
  • This object is achieved by a method for the detection, identification, extraction or removal of human or animal cells with disturbed cell cycle control or with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation which is characterized in that the presence of an association from the cdc37 protein with Detects extrachromosomal nucleic acid in cells or tissue fluids.
  • the polypeptide portion of the polypeptide-nucleic acid associate represents the human or animal homologous protein to the yeast cdc37 protein and its subunits.
  • the nucleic acid portion consists of extrachromosomal DNA or RNA copies of chromosomal DNA sequences of the respective tumor cell (hereinafter referred to as cdc37 nucleic acid heteromer).
  • This cdc37 nucleic acid heteromer is suitable for the detection of human and animal cells with the ability for unlimited proliferation or tumor formation.
  • the invention therefore furthermore relates to a process for obtaining the cdc37 nucleic acid heteromer by isolation from a soluble fraction from permanently divisible human or animal cells, precipitation in the presence of 1.5 M NaCl and isolation by extraction with phenol and precipitation with ethanol or ammonium acetate.
  • cdc37 nucleic acid heteromer is suitable for the detection of cells with the ability to form tumors or unlimited proliferation, regardless of the degree of differentiation or level of neoplastic transformation the cells have or the tissue from which the cells originate.
  • Molecules that bind to the cdc37 nucleic acid heteromer are useful for eliminating or enriching cells capable of tumor formation or unlimited proliferation, as well as inhibiting the growth or initiation of cell death of these cells.
  • Cells carry an extrachromosomal DNA that is associated with proteins.
  • the DNA-protein complexes described are characterized in that the complexes accumulate in fractions with a density of 1.82-1.86 g / cm 3 upon equilibrium centrifugation in a CsCI density gradient, the DNA is associated with the proteins in an SDS and salt-stable bond and the proteins have molecular weights of 52 kD , 62 kD and 64 kD.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention differ from the above-mentioned DNA-protein complexes in the following properties:
  • the cdc37 protein has a molecular weight of approx. 40 kD. Polypeptides with molecular weights of 52 kD, 62 kD or 64 kD are not detectable in the cdc37 nucleic acid heteromer according to the invention.
  • the binding of the nucleic acid to the cdc37 protein is in the presence of detergents and high temperature, e.g. 0.1% SDS and 90 ° C soluble, but not the binding of the above. DNA-protein complex.
  • the cdc37 protein-associated DNA sequences differ from those of the DNA-protein complexes from PCT WO 95/02701.
  • the cdc37 protein is known and was first isolated from yeast due to the fact that mutations of this protein lead to a disturbed cell cycle (Ferguson et al., 1 986). Isolation from Drosophila was only possible much later, in particular by mutating cdc37 and hsp83 with the signaling pathway through the "sevenless" receptor
  • the cdc37 protein can interact with numerous other proteins, z. B. with the retinoblastoma protein RB and with virally encoded proteins with transforming activity, e.g. B. with SV40 large T, adenovirus E 1 A, Papillon virus E7, pp60v-src or raf (Ozaki and Sakiyama, DNA Cell Biol. 1 5: 975, 1 996; Perdew et al., Biochem.
  • the cdc37 protein also binds hyaluronic acid (Grammatikakis et al., J. Biol. Chem. 270: 1 61 98, 1 995). The variety of interactions of the cdc37 protein with other molecules in the cell is so far unclear.
  • Hsp90 binds the protein kinase cdk4 and stabilizes the cdc37 / cdk4 complex. In this form, cdk4 is activated by cyclin D 1.
  • this complex disintegrates and only builds up again when the cell has reached the G 1 transition point of the cycle again (Stepanova et al., Genes Develop. 1 0 : 1 491, 1 996).
  • the cdc37 / hsp90 complex can be destabilized by an antibiotic, geldanamycin, which leads to the disintegration of the complex. The cell can no longer enter the S phase of the cell cycle (Stepanova et al., Genes Develop. 10: 1491, 1 996).
  • cdc37 might play an important role in the control of cell cycle progression via a sequence-specific DNA binding mechanism.
  • cdc37 protein could bind to chromosomal DNA, A DNA association of the cdc37 protein in vivo has not been demonstrated in the cell. On the contrary, the cdc37 protein in normal cells with physiological proliferation has no detectable DNA.
  • the cdc37 protein is only expressed at the G 1 -S phase transition of the cell cycle, but not constitutively during the entire cell cycle, it was all the more surprising that the cdc37 nucleic acid heteromer in cells was also disturbed Cell cycle control or the ability to unlimited proliferation or tumor formation is constitutively expressed regardless of the cell cycle phase. In contrast, the cdc37 nucleic acid heteromer is not expressed in normal cells regardless of whether the cells proliferate, rest, or senesce.
  • the detection method according to the invention is therefore independent of the cell cycle phase in which the cell with these properties is located.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can also be used to detect cells in different stages of neoplastic transformation, in particular in very early stages, regardless of the mechanisms by which the cell was transformed neoplastic.
  • the cdc37 nucleic acid heteromeric cells according to the invention can be used to detect cells which have a disturbed control function of the cell cycle or have unlimited tumorigenic proliferation capacity, but have not yet formed a tumor.
  • Preferred test material are tissue biopsies or cell mixtures from body fluids or suitable cell or cytoplasmic fractions which are used in specific reactions for the detection of the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention by detecting the nucleic acid, the protein or its special configuration as a heteromer or its reactivity with substrates or antibodies or other binding molecules can be used.
  • Another object of the invention is thus the detection of tumor cells and other cells with unlimited proliferation capacity using a tissue biopsy, a tissue smear, a body fluid or suitable cell disruption, regardless of whether a clinically detectable tumor has already been formed.
  • Preferred uses of the method according to the invention are tumor diagnostics or preventive purposes in health monitoring.
  • any human and animal cells which have a disturbed cell cycle control or which have the ability for permanent proliferation or tumor formation, permanently proliferating cells of different tissues or degrees of differentiation or species, and others, can generally be used as the starting material for obtaining the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention as to what degree of differentiation the cell has (e.g. epithelium, lymphocyte, myelocyte, fibroblast, melanocyte) or from which species (e.g. human, mouse, rat, Drosophila) the cells descend.
  • degree of differentiation the cell has e.g. epithelium, lymphocyte, myelocyte, fibroblast, melanocyte
  • species e.g. human, mouse, rat, Drosophila
  • Cdc37-nucleic acid heteromers from a cytoplasmic fraction are preferably recovered from permanently proliferating human or animal cells, for example using detergents such as NP40 or SDS, or by means of repeated freezing and thawing of the cells, preferably in the presence of Mg + + solutions.
  • the mitochondria are then separated from this cytoplasmic fraction, preferably with the aid of a sucrose gradient according to methods known to those skilled in the art.
  • the cytoplasmic fraction with cdc37 nucleic acid heteromers can alternatively also be obtained by obtaining a protein-containing cell fraction which is free of nuclear DNA.
  • Such a fraction is preferably obtained by lysing the cells in the presence of NaCl and SDS and subsequent centrifugation ("Hirt extraction", J. Mol. Biol. 26: 3655-369, 1,967).
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can be obtained from the supernatant of the “shepherd extraction” or from mitochondrial-free cell lysates by selective precipitation or electrophoretic or chromatographic methods, preferably by precipitation with 1.5 M NaCl and precipitation of the supernatant with ethanol or ammonium sulfate.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers have surprisingly poor dissolution behavior in both organic and aqueous solvents. According to a further isolation process for the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention from a cytoplasmic lysate, the lysate is therefore subjected to an extraction in organic solvents, preferably subjected to phenol and chloroform.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention collect in the organic aqueous interphase of the extraction and can be separated from other molecules of the lysate, preferably by precipitation with ethanol.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention also have a surprisingly high stability towards proteinases and nucleases, while cytoplasmic organelles and membranes or mitochondrial or viral DNA or RNA are rapidly degraded by nucleases.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can also, according to a further object of the invention, by incubation in the presence of proteolytic enzymes, preferably proteinase K (100 / vg / ml) for 1 h at 60 ° C., and subsequent precipitation in the presence of Ethanol or ammonium sulfate or chromatographic purification, preferably using HPLC, can be obtained.
  • the nucleic acid sequences of the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention differ in cells of different degrees of differentiation and species.
  • the sequence of the associated DNA of the cdc37 nucleic acid heteromers from melanoma cells according to the invention differs from that from mamma carcinoma or from colon carcinoma cells.
  • Most cdc37-associated DNA molecules have a length of approx. 30 bp - 1,000 bp, but there are also molecules of longer length, e.g. B. up to 3,000 bp in cells of acute myeloid leukemia.
  • the nucleic acid (RNA / DNA) sequences can be isolated from the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention by methods known to the person skilled in the art, preferably using proteolytic enzymes, detergents, high temperature, enzymatic multiplication or molecular cloning.
  • the nucleic acid sequences of the cdc37 nucleic acid heteromers are increased enzymatically, preferably using the reverse transcriptase or Klenow polymerase or using the PCR method using thermostable DNA polymerases.
  • the DNA sequences can be obtained by hybridizing a genomic library or a cDNA library with the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • Another preferred method is to obtain the nucleic acid by affinity binding to the cdc37 protein, preferably using extra-chromosomal DNA or cDNA and then enriching the cdc37 nucleic acid heteromer formed, preferably by sedimentation or using antigen-antibody reactions.
  • the DNA sequences obtained can then be used for the detection of human or animal cells with unlimited proliferation or the ability to form tumors.
  • Preferred methods of DNA or RNA hybridization, enzymatic amplification using sequence-specific oligonucleotides, in situ hybridization to cells or tissue biopsies, or binding of the nucleic acids to the cdc37 protein or the protein are preferred to those skilled in the art to the nucleic acids in a lysate.
  • Another object of the invention is the use of the cdc37 protein from the cdc37 nucleic acid heteromer for the detection of human and animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation. It was shown that these cells express the cdc37 protein and its mRNA in an increased number of molecules compared to normal cells with physiological proliferation.
  • the comparison of the expression of the cdc37 protein molecules is preferably carried out by an antigen-antibody recognition reaction, preferably with the aid of Western blot detection, immunofluorescence or FACS analysis ("fluorescence activated cell sorter") using a cdc37 protein-specific antibody (for example Dai et al., J. Biol. Chem.
  • mRNA expression is preferably compared using Northern blot hybridization using a suitable hybridization sample, for example the human cdc37 cDNA sequence (for example dbEST data base, GenBank TM ID clone R87892).
  • a suitable hybridization sample for example the human cdc37 cDNA sequence (for example dbEST data base, GenBank TM ID clone R87892).
  • nucleic acids When using the South-Western method or other methods of binding nucleic acids to the cdc37 protein, DNA or RNA or single- or double-stranded deoxy- or oxy-oligonucleotides or labeled (eg with digoxigenin or biotin) or modified nucleic acids, eg PNA "peptide nucleic acid" used.
  • the binding of the nucleic acids to cdc37 protein in vitro requires the presence of Zn 2 + ions (preferably 8 mM) and monovalent ions, for example Na + (preferably 8 mM), as well as ATP or GTP (preferably 2 mM).
  • the nucleic acid-cdc37 interaction includes the N-terminal part of the cdc37 polypeptide sequence.
  • the cdc37 protein is obtainable from the cdc37 nucleic acid heteromer according to the invention by treatment with DNase I, preferably matrix-bound DNasel, or by proteolytic cleavage or treatment with detergent or in the presence of high temperature, preferably 90 ° C., and chromatographic or electrophoretic isolation of the released cdc37 Protein or its fragments.
  • the invention furthermore relates to antibodies and antisera with specificity or recombinant molecules with antibody-like binding specificity for the cdc37 protein nucleic acid heteromers according to the invention. These are suitable for the detection of human and animal cells with the ability for unlimited proliferation or for tumor formation.
  • antibodies or antisera can be obtained in polyclonal form by methods known per se by immunizing immunocompetent animals, such as mice, rabbits or sheep, with the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention or the cdc37 protein or the nucleic acid of the heteromer.
  • Hybridoma clones producing monoclonal antibodies can also be obtained by methods known per se by fusing antibody-forming lymphocytes with suitable myeloma cells, for example Ag8.653 cells.
  • suitable myeloma cells for example Ag8.653 cells.
  • immunoglobulin chains from immunocompetent donor lymphocytes can be isolated individually or in combination, binding hybrid molecules with antibody-like specificity, preferably recombinant "single-chain" antibodies which are able to bind the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • Isolation of recombinant antibodies from a "phage display library” is also preferred, in that the suitable recombinant phages are enriched by specific binding ("panning") to the cdc37 nucleic acid heteromers.
  • the antibody-like fusion proteins on the surface of the phage or in soluble form can then be used like an antibody in suitable detection methods.
  • the antibodies obtained after immunization with the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention bind so specifically to cells with unlimited proliferation, disturbed cell cycle control or the ability to form tumors that they can also be used for labeling cells in a tissue association in situ.
  • the cells sought are preferably labeled in the cytoplasm, while normal cells with physiological permanent or transient proliferation are not labeled. This is all the more surprising since proliferating normal cells express the cdc37 protein during the transition from the G 1 to the S phase of the cell cycle.
  • the antibodies according to the invention are able to distinguish between the cdc37 nucleic acid heteromer in tumor cells and the cdc37 protein normal cells.
  • the invention therefore furthermore relates to antibodies and antisera which are able to bind heteromeres to cdc37 nucleic acid.
  • Preferred use is the use of the antibodies or antisera or recombinant antibody-like molecules to remove or inhibit growth for detection reactions in a biopsy in situ or in a tissue section or in reactions with cell suspensions or body fluids or with cdc37 nucleic acid heteromers of these cells in a lysate or in body fluids or for the elimination or inhibition of growth of these cells in the tissue or in a cell mixture.
  • the antibodies or their fragments or recombinant binding molecules can be coupled with carriers or labeling molecules such as proteins, sugars, Sepharose, enzymes, dyes, haptens or radioactive ions and used for suitable detection methods.
  • carriers or labeling molecules such as proteins, sugars, Sepharose, enzymes, dyes, haptens or radioactive ions and used for suitable detection methods.
  • a large number of known antigen stands for the detection reaction.
  • Antibody recognition reactions are available, such as ELISA, RIA, fluorescence immunoassay or fluorescence activated cell sorting (FACS).
  • One embodiment of the invention consists in measuring the content of the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention, the cdc37 protein portion or the nucleic acid of the heteromer in a mitochondrial-free cytoplasmic fraction of the cell to be examined, preferably from a biopsy, a tissue section or cell suspensions or from a soluble fraction of body fluids.
  • a mitochondrial-free cytoplasmic fraction of the cell to be examined preferably from a biopsy, a tissue section or cell suspensions or from a soluble fraction of body fluids.
  • Normal cells with physiological proliferation capacity and regulated Zeil cycle do not contain such heteromers in this fraction, while cells with disturbed cell cycle control carry these heteromers in high copy numbers regardless of the cell cycle phase.
  • Antigen-antibody reactions or nucleic acid hybridizations are preferred for measuring the content of the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • detection methods are available to those skilled in the art, e.g. ELISA, RIA, fluorescence immuno
  • the detection of the heteromer can also be carried out by enzymatic reaction of the heteromer with a substrate, preferably by cleaving an energy-rich phosphate bond, or by binding to hyaluronic acid.
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromer of the invention has kinase activity and / or is (auto) kinased and this is the basis for this detection method.
  • a further embodiment of the invention therefore consists in the detection of cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors by using reagents which are able to identify or bind the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention on the surface of the cell .
  • Labeled antibodies, antisera or recombinant polypeptides with binding specificity are preferably used for the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • Detection of the cells in situ or in a cell mixture using a cdc37 nucleic acid heteromer-binding antibody according to the invention or its derivatives which is coupled to a dye or enzyme is particularly preferred in a known method of immunostaining biopsies or histological preparations, or enrichment of cells by fluorescence or magnet-activated cell sorting.
  • the antibodies, antisera or recombinant antibody-like molecules according to the invention against the cdc37 nucleic acid heteromers on the surface of the cell membrane can also be used for the detection of cells with the ability for unlimited proliferation or tumor formation in vivo. Preference is given to using the antibodies according to the invention or recombinant antibody-like molecules or their derivatives after suitable labeling, for example with 99mTc or 121 J, in immunoscintigraphy or other imaging methods.
  • the antibodies accumulate in tissues where cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors are present. Tissue with normal resting or proliferating cells (e.g. brain or bone marrow) and cells in physiological regeneration, e.g. B.
  • the antibodies, nucleic acids or their derivatives according to the invention can be coupled with other detectable or reactive molecules or atoms, for example proteins, sugars, enzymes, biologically active mediators, metal complexes, radioactive isotopes or toxins, and for the detection or / and destruction of cells impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors.
  • Preferred is the use of fusion proteins from a cdc37 protein nucleic acid heteromer-specific antibody with a cellular toxin, for example pseudomonas exotoxin, whereby a so-called immune toxin is generated which specifically binds to cells with unlimited proliferation or tumor formation and kills the cells .
  • an immunologically active protein for example a cytokine or a chemokine
  • the known immune toxins or immune cytokines are directed via their antibody portion against antigens which are almost exclusively expressed on tumor cells of a certain tissue or degree of differentiation.
  • the fusion molecules according to the invention with specificity for cdc37 protein nucleic acid heteromers are directed against a large number of different tumor cells, irrespective of the tissue from which the cells originate or the degree of differentiation of the tumor cell.
  • most tumor cells lose a large number of antigens on their surface, as a result of which the known immune conjugates lose their binding to these highly malignant cells and cells in metatases.
  • the fusion molecules according to the invention with specificity for cdc37 protein nucleic acid heteromers also bind to these highly malignant cells and cells of metastases, since the fusion molecules bind to a molecule which is required by the cell for each further cell division. This leads to an efficacy which is superior to that of the known immune conjugates. It was furthermore surprisingly found that Fc-carrying antibodies according to the invention or their derivatives with binding ability of the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention are able to trigger cell lysis in cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors. The cell lysis is carried out with the help of complement activation by the Fc portion of the antibody molecule.
  • the invention therefore also relates to the use of molecules with the ability to bind the cdc37 nucleic acid heteromers for the use of the lysis of cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors, with the binding molecules themselves or fusion products of these molecules other pharmacologically active substances are used.
  • nucleic acids of the cdc37 protein nucleic acid heteromers or derived oligonucleotides of these nucleic acids can be used for the inhibition of the proliferation of cells with unlimited proliferation capacity.
  • partial sequences (oligonucleotides) of these nucleic acids which are homologous to the binding region of the nucleic acid with the cdc37 protein are preferred. These oligonucleotides interfere with the nucleic acid-cdc37 protein binding and thereby destabilize the heteromer. Surprisingly, it was found that the tumor cell stops its unlimited proliferation, leaves the cell cycle and is subject to cell death.
  • a particular embodiment of the invention is thus the use of oligonucleotides and nucleic acid derivatives which bind and destabilize heteromers to the binding region of the nucleic acid with the cdc37 protein of the cdc37 protein nucleic acid to inhibit growth and / or initiate cell death of the tumor cell.
  • Other substances that change the stability of the cdc37 protein nucleic acid heteromer can also be used for this purpose. Surprisingly, such substances induce growth inhibition and / or cell death of cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation and tumor formation. For this purpose, preference is given to substances which interfere with heteromer formation by binding the nucleic acid or the cdc37 protein.
  • peptide sequences are more preferably used which are derived from the nucleic acid binding region of the cdc37 protein, in particular from the cdc37 protein sequence amino acid 62 to 1 20.
  • the peptides of the sequence are particularly preferred
  • substances are preferred which block the function of the cdc37 protein nucleic acid heteromer in the control of the G 1 / S transition of the cell cycle, such as e.g. Antibiotics, fungicides, or other physiological or synthetic substances.
  • cdc37 protein nucleic acid blocking or destabilizing substances are therefore used to inhibit the proliferation of cells with unlimited proliferation and tumor formation and to initiate cell death of these cells.
  • cells with unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors from a cell mixture can also be enriched or depleted with the aid of reagents which are able to bind the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention.
  • the antibodies, antisera or recombinant antibody-like molecules against the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can be used.
  • methods by fluorescence-activated sorting (FACS) or magnet-activated sorting (MACS) are preferred.
  • the antibodies or their derivatives with reactivity to the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can also be used for the removal of cells with unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors from a cell suspension or a tissue, preferably for "purging" grafts, for example of autologous bone marrow transplants.
  • Antibodies or their derivatives with a binding domain for the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention are preferably bound to a matrix, the cell mixture is incubated with this matrix and the unbound cells are eluted chromatographically.
  • the cdc37 nucleic acid according to the invention is secreted by cells with unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers can therefore, for example, in the culture supernatant from Tumor cells or also in the blood, bone marrow, serum, plasma, liquor, urine or other body fluids are detected. Therefore, human and animal cells with impaired cell cycle control, unlimited proliferation capacity or the ability to form tumors can be detected by detecting the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention in body fluids or in cell-free supernatants or filtrates.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers are preferably detected with the aid of antibodies which bind the heteromers, the cdc37 nucleic acid heteromers isolated according to the invention being able to be carried as standard.
  • combinations of the methods are also possible, preferably an enrichment with the aid of an antibody
  • Nucleic acid heteromer is able to bind, or with the help of an enzymatic reaction that of the cdc37 nucleic acid according to the invention
  • Heteromer itself runs out, e.g. B. the cleavage of an energy-rich phosphate bond of a substrate.
  • the sensitivity of the method can be increased further by detecting the associated nucleic acid of the cdc37 nucleic acid heteromers by hybridization with suitable nucleic acid probes or enzymatically, preferably by polymerase chain reaction (Mullis and Fallona, Meth. Enzymol. 1 55: 335-350, 1 987; Saiki et al., Science 239: 487-491, 1 988) using sequence-specific or rapom sequence oligonucleotides as primers.
  • suitable nucleic acid probes or enzymatically preferably by polymerase chain reaction (Mullis and Fallona, Meth. Enzymol. 1 55: 335-350, 1 987; Saiki et al., Science 239: 487-491, 1 988) using sequence-specific or rapom sequence oligonucleotides as primers.
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromers are therefore obtained from a lysate of a biopsy or from body fluids or cell supernatants using a specific antibody and then the associated nucleic acid is increased enzymatically.
  • the described embodiments of the method of the invention are suitable for the detection of malignant and benign tumors or their precursors or of cells with impaired cell cycle control, the cells being a biopsy, a tissue section or cells or their lysates or secreted complexes of body fluids from humans or animals Sample material can be used.
  • the described methods are also suitable for finding and localizing such cells in vitro and in vivo. Furthermore, these methods can be used in a correspondingly modified form for isolating the cells from a cell mixture or for their enrichment or depletion and elimination from a cell mixture.
  • antibodies or recombinant molecules with binding specificity for the cdc37 nucleic acid heteromers according to the invention can be used for the elimination of the cells in vivo and in vitro, the antibodies or recombinant molecules being used alone or as fusion products with other bioactive molecules.
  • MCF-7 breast carcinoma cells (ATTC HTB22) were lysed in the presence of 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM EDTA, 1.5 mM MgCl 2 by repeated freezing and thawing and then the cell nuclei by 30 minutes Centrifugation at 6000 xg sedimented.
  • the mitochondria were separated from the supernatant using a sucrose gradient (J. Biol. Chem. 249: 76991-1 995, 1 974).
  • the mitochondrial-free fraction was treated with RNase A (20 / yg / ml) and RNase T1 (1000 U / ml) for 30 min at 37 ° C, then incubated for 20 min at 60 ° C with Proteinase K (100 ⁇ g / ml). SDS (ad 0.4% SDS w / v) and NaCl (ad 4 M NaCl) were added to this mixture, cooled on ice for 60 min and then centrifuged at 6000 xg for 20 min. The supernatant was extracted into phenol (neutralized with Tris-HCl, pH 7.2) and then into chloroform / isoamy alcohol (24: 1 v / v).
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromers are concentrated in the organic-aqueous interphase. This interphase was removed, the cdc37 nucleic acid heteromers precipitated by adding 2 vol ethanol and resuspended in 0.1 mM EDTA, 1 mM Tris-HCl, pH 7.2.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers were separated in a native agarose (0.7%) or polyacrylamide (4%) gel, the heteromers from MCF-7 cells showing the migration rate of a protein-free DNA of the size 100-500 bp . In a denaturing SDS polyacrylamide gel, these cdc37 nucleic acid heteromers migrate at approximately 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD.
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromers (from Example 1) were incubated in the presence of Proteinase K (500 // g / ml) and 0.1% SDS for 10 hours at 60 ° C. This approach was subjected to another extraction in phenol and then in chloroform / isoamyl alcohol. The DNA released from the cdc37 protein nucleic acid heteromer collected in the aqueous phase of the extraction. The DNA was precipitated with ethanol and dissolved in 10 mM Tris-HCl, pH 7.2, 1 mM EDTA.
  • the DNA (approx. 20 ng) of the cdc37 protein nucleic acid heteromers was subjected to a "replenishment reaction" by Klenow polymerase (1 0 U) in the presence of 1 0 mM Tris-HCl, pH 7, 6, 6 mM ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM NaCI, 1 0 mM MgCl 2 and each 0, 1 mM TTP, dATP, dCTP, dGTP subjected.
  • Klenow polymerase 1 0 U
  • 50 mM NaCI 1 0 mM MgCl 2
  • each 0, 1 mM TTP, dATP, dCTP, dGTP subjected was followed by cloning into the DNA of the Smal-cut pUC 19 vector in the presence of 10 U T4 DNA ligase.
  • the recombinant plasmid obtained was transformed into E. coli K1 2 bacteria.
  • plasmid clones Four independent plasmid clones were obtained (pMCF-7). These plasmid clones contain inserted DNA sequences which represent the nucleic acid portion of the cdc37 protein nucleic acid heteromers and are suitable for the detection of neoplastic transformed cells. Analogously to this procedure, the nucleic acid sequences of the cdc37 protein nucleic acid heteromers were obtained from colon carcinoma, Hodgkin lymphoma, melanoma cells and cells from acute myeioic leukemia. The DNA sequences are shown in SEQ ID NO 1.
  • Mouse Ehrlich-Ascites tumor cells (ATCC CCL77) and human MCF-7 (ATCC HTB22) mammary carcinoma cells carry cdoplasmic cdc37 nucleic acid heteromeres in their cytoplasm, whereas in normal embryonic mouse fibroblasts these heteromers could not be detected.
  • the cdc37 nucleic acid heteromers are obtained from mouse Ehrlich-Ascites tumor cells (ATCC CCL 77) according to the method described in Example 1.
  • Cdc37 nucleic acid heteromers with a share of approx. 100 ng associated DNA are placed in a Balb / c mouse s.c. injected.
  • Second injections with the same amount of antigen (“booster injections") without adjuvant were made on day 32 and on day 54 after the first injection.
  • boost injections Second injections with the same amount of antigen
  • antigen antigen
  • approx. 500 ⁇ ⁇ But were removed for the production of antiserum (“anti-cdc37 nucleic acid heteromer antiserum”) for further analyzes.
  • the spleen of the immunized mouse was obtained, the spleen lymphocytes isolated and fused with cells of the myeloma line X3-Ag8.653 with the aid of polyethylene glycol to produce hybridomas (Köhler G. and Milstein C. Nature 256: 495-497, 1 975; Köhler, G. (ed.) Hybridoma techniques. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1 980).
  • the hybridoma cells formed were selected in the presence of HAT selection medium (1 0 "4 M hypoxanthine, 4x 1 0 " 7 M aminopterin, 1, 6 x 1 0 "5 M thymidine in RPMI 1 640 medium).
  • Ehrlich mouse ascites cells, mouse embryonic fibroblasts (as a negative control) and human MCF-7 breast carcinoma cells (approx. 100 cells per well of a "Terasaki" microtiter plate) are each covered with the supernatant Hybridoma culture (approx. 10 ⁇ ⁇ per well, supernatant 1: 100 diluted in PBS) incubated for 1 hour at 37 ° C., then washed twice with PBS and then for 1 hour with a peroxidase-coupled antibody against mouse immunoglobu - line (anti-mouse Ig antibody) incubated at 37 ° C.
  • hybridoma cells of these cultures were subcloned by "limiting dilution” and finally by single cell seeding. A total of approximately 300 cultures were created, the supernatants of which were again checked on day 24 using the method described above for reactive antibodies. Hybridoma cells with reactive supernatants were subcloned again. A stable hybridoma clone (“3D6") was obtained which shows monclonal antibodies with specificity against mouse and human cdc37 nucleic acid heteromers from tumor cells, but does not react with normal cells.
  • cdc37 protein nucleic acid heteromer-specific antibody 3D6 for the detection of tumor cells in a cell lysate.
  • Tumor cells should be detected in a mixture with normal cells. Since tissue preservation is often insufficient for histological analysis It is appropriate to demonstrate in this example how to detect tumor cells in a cell lysate.
  • the human breast carcinoma line MCF-7 (ATCC HTB22) and human normal skin fibroblasts are lysed in the presence of 50 mM Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM EDTA, 3 mM MgCl 2 , 0.2% NP40. Cell debris, cell nuclei and other organelles are separated by centrifugation at 8,000 xg for 2 min. The supernatant (corresponding to approximately 1 0 4 cells) and isolated cdc37 protein nucleic acid heteromers (as a positive control) are denatured in the presence of SDS, electrophoretically separated in a 1, 2.5% SDS polyacrylamide gel and transferred electrophoretically to a nitrocellulose membrane.
  • the membrane is incubated in TBS (20 mM Tris, 1 37 mM NaCl, pH 7.6) 3% Tween 20, 5% (w / v) dry milk powder for 1 hour, then the anti-cdc37 protein nucleic acid heteromer-specific antibody 3D6 (1: 1 00 hybridoma supernatant) was added and incubated again for 1 hour at room temperature.
  • the membrane is washed in TBS, 3% Tween 20 and incubated for 1 hour with the anti-mouse Ig antibody coupled to the peroxidase.
  • the membrane is then washed again in TBS, 3% Tween 20, incubated with the detection reagent ECL (Amersham) and autoradiography is carried out.
  • the monoclonal antibody 3D6 specifically recognizes the bands of the cdc37 nucleic acid heteromers (approx. 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD in human tumor cells) in the cell lysate of the MCF-7 breast carcinoma cells and the isolated cdc37 in the Western blot -Nucleic acid heteromers (positive control), but does not react with the cytoplasmic protein lysate from normal human fibroblasts.
  • the task is to show tumor cells of a malignant meianoma in a tissue section of a biopsy.
  • cryostat sections of a tissue biopsy were made and fixed with acetone / methanol.
  • the endogenous peroxidases were blocked by incubation with 1% H 2 0 2 (v / v) in 40% methanol / 60% PBS for 1 5 min, the sections were then washed and 1 0 min with 0.2% Triton X- Incubated 1 00 in PBS. After washing again, the sections were incubated with bovine serum albumin (3% w / v in PBS) for 1 hour and washed again.
  • the incubation was then carried out with the anti-cdc37 nucleic acid heteromer-specific antibody 3D6 (1: 10 diluted hybridoma supernatant in PBS) for 2 hours at room temperature.
  • "Sham incubations” with buffer without antibody and incubation with an anti-TAG72 antibody (B72-3) with specificity for the TAG72 antigen, which expresses on cells of the gastrointestinal tract, but not on melanocytes or on cells of the epidermis, served as controls is.
  • the sections were then washed four times with PBS and incubated with a peroxidase-coupled goat anti-mouse IgG (H + L) antibody (Dianova, Hamburg) (1:50 in PBS) for 1 hour at room temperature. After washing four times, the peroxidase was reacted with the substrate AEC for 20 min. The cell nuclei were stained with hemalum.
  • the cells of the malignant meianoma reacted in their cytoplasm with the cdc37 nucleic acid heteromer-specific antibody 3D6, while the nucleus of the melanoma cells did not react with the 3D6 antibody.
  • the normal cells surrounding the melanoma and the cells of the normal epidermis show no staining with the 3D6 antibody.
  • Infiltrating Tumor cells in the normal tissue are identified by staining with the 3D6 antibody.
  • Control markings without 3D6 antibodies show no specific staining, nor do reactions with the anti-TAG72 antibody.
  • the task is to detect cdc37 protein nucleic acid heteromers on living cells on the cell surface.
  • the intact cell membrane of the living cells prevents the antibodies from entering the cell, while dead cells allow the antibody to enter.
  • Dead cells are identified by staining with propidium iodide and excluded in the subsequent measurement procedure.
  • Human MCF-7 breast carcinoma cells (A) and normal human fibroblasts (B) are washed in PBS, each divided into 4 batches and incubated with the following reagents for 30 min at room temperature: (1) anti-cdc37 nucleic acid heteromer specific antibody 3D6 (hybridoma supernatant 1: 1 00 in PBS)
  • anti-TAG72 specific antibody B72-3 hybrida supernatant 1: 1 00 in PBS
  • the cells were washed in PBS and the batches (1), (2) and (3) were then incubated with a FITC-coupled anti-mouse IgG antibody (Dianova, Hamburg) (1: 500) for 30 min at room temperature .
  • the cells were washed again in PBS and analyzed using the fluorescence-activated cell sorting (FACS) (FACscan, from Becton-Dickinson, Mountain View, Cal.). It was through the configuration suitable measuring window ("gates”) dead cells excluded from the analysis, so that the signals obtained come exclusively from living cells with an intact surface membrane.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • MCF-7 breast carcinoma cells of approach (1) showed a FITC fluorescence signal.
  • Cells from batches (2) and (3) showed a background fluorescence which was weaker by a factor of 5-1 0, which has the same strength as the control batch (4) without secondary antibodies and indicates the "inherent fluorescence" of the cells.
  • the labeling in approach (1) showed that MCF-7 cells were specifically labeled by the 3D6 antibody, but not by a control antibody (B72-3) that reacts with an antigen that is not expressed on MCF-7 cells .
  • B72-3 control antibody
  • normal human fibroblasts only showed background fluorescence in batch (1), as did batches (2), (3) and (4). It can be concluded that 3D6 antibody reactive cdc37 nucleic acid heteromers are expressed on the surface of MCF-7 breast carcinoma cells, but not on the surface of normal fibroblasts.
  • Blood serum was obtained from two patients with breast cancer and with melanoma as well as from two healthy donors and 2 ⁇ ⁇ of the serum each with DNasel (1 0 U, 1 hour, 37 ° C) or with Proteinase K (1 0 ⁇ g, 1 Hrs, 60 ° C). Untreated and DNasel- or proteinase-treated serum was incubated in the presence of SDS (0.1% w / v) for 2 min at 90 ° C., separated electrophoretically in an SDS-polyacrylamide gel and then electrophoretically in the presence of 50 mM Tris, 380 mM glycine, 0.1% (w / v) SDS, 20% methanol on a nitrocellulose Transfer cellulose membrane.
  • the non-specific binding of the membrane was determined by incubation with 5% (w / v) dry milk powder in TBS (20 mM Tris, 1 37 mM NaCl, pH 7.6) 3% (v / v) Tween 20 for 1 hour at room temperature blocked.
  • the membrane was then incubated with the cdc37 protein nucleic acid heteromer-specific antibody 3D6 (1: 1 00 hybridoma supernatant in blocking buffer) for 1 hour at room temperature, washed three times and with a perxidase-coupled sheep anti-mouse Ig (Amersham) (1: 200 ) incubated for 1 hour. After washing four times, the bound antibody was detected by reaction of the peroxidase with the ECL Detection Reagent (Amersham) and subsequent autoradiography on an X-ray film.
  • the 3D6 antibody detects bands with the relative Mr approx. 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD, but shows no reaction with sera from the healthy volunteers.
  • the Mr detected corresponds to the relative migration rate of the isolated cdc37 protein nucleic acid heteromers.
  • the 3D6 antibody-reactive bands in the serum of the tumor patients can be degraded by preincubation of the serum with both DNasel and Proteinase K. This shows that the detected bands contain material consisting of both protein and DNA.
  • Example 8 Enrichment of tumor cells from a mixture of normal cells with the aid of the 3D 6 antibody with specificity for cdc37 protein-nucleic acid heteromers.
  • SK-Mel5 cells of a malignant meianoma become
  • Sk-Mel5 PBL 1: 1 0, 1: 1 00, 1: 1,000, 1: 1, 0,000, 1: 1, 00,000.
  • HMW-MAA high molecular weight melanoma associated antigen
  • the cell mixture (approx. 10 6 cells in 1 ml PBS) was incubated with the antibody 3D6 (200 ⁇ g purified antibody) for 1 hour at room temperature, washed four times with PBS and then with an anti-mouse Ig antibody
  • the number of HMW-MAA + tumor cells in the respective fractions is determined using the anti-HMW-MAA antibody 763.74.
  • the measuring limit of the method is approx. 10 cells with 5000 counts per measurement.
  • Sk-Mel5 cells of a malignant meianoma are added to 1 0 6 normal human lymphocytes from peripheral blood (PBL) in the following mixing ratios: Sk-Mel5: PBL 1: 1 0, 1: 1 00 , 1: 1,000, 1: 1,0,000, 1: 100,000.
  • the Sk-Mel5 melanoma cells express the HMW-MAA ("high molecular weight melanoma associated antigen") on the surface and can be detected with an anti-HMW-MAA antibody. Normal human lymphocytes do not express this antigen.
  • the antibody 3D6 (2 mg of purified protein) was bound to CNBr-activated Sepharose (0.5 ml) (Pharmacia) and the Sepharose was then washed in PBS, 0.2% (w / v) dry milk powder.
  • the cell mixture (approx. 10 6 cells in 1 ml PBS) was placed on a column with 3D6 antibody-coupled Sepharose (0.5 ml) and incubated for 1 hour at room temperature. The column was then washed four times with 10 times the volume of PBS in order to remove the unbound cells (flow-through fraction).
  • the bound cells were eluted in the presence of 2 M MgCl 2 , 10 mM NaP0 4 , pH 7.2.
  • the number of HMW-MAA + tumor cells in the respective fractions was determined using the anti-HMW-MAA antibody 763.74 and the efficiency of the purification (depletion factor) was determined.
  • Table 2 The results of the FACS analysis are summarized in Table 2.
  • the detection limit of the method is about 10 cells at 5000 counter ⁇ eignissen per measurement.
  • Human breast carcinoma line MCF7 (ATCC HTB22) (A) cells and primary skin fibroblasts (passage 12) (B) were cultured on slides. More than 90% of the cells of both cultures proliferate, the
  • MCF-7 cells have unlimited proliferation potential, primary human skin fibroblasts stop their proliferation in vitro after approx. 1 5 -20 passages, age and die. Furthermore, a solid tumor was generated by subcutaneous injection of MCF-7 cells in Balb / c mice, a frozen section of this tumor was made and transferred to a slide (C).
  • the slides were briefly washed twice with PBS, overlaid with 200 ⁇ ⁇ paraformaldehyde solution (5% v / v) for 5 minutes for fixation and then washed twice in 70% ethanol.
  • the DNA sequence shown in SEQ ID NO 1 was used to detect the cells with unlimited proliferation potential.
  • This DNA sequence is the nucleic acid portion of the cdc37 protein nucleic acid heteromers from MCF-7 cells and was obtained by molecular cloning as described in Example 1a.
  • the DNA sequence is cloned into the S al interface of the vector pUC 19.
  • the 221 bp MCF-7 / sml DNA fragment was released from the vector by restriction cleavage of the DNA with Smal.
  • the fragment was electrophoretically separated from the pUC1 9 vector DNA (2.7 kb) in an agarose gel, eluted and precipitated with ethanol.
  • the MCF-7 / sm 1 DNA (1 _J / g DNA) was denatured and with the aid of Klenow polymerase (1 U) in the presence of 10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 6 mM ⁇ -mercaptoethanol, 50 mM NaCI, 1 0 mM MgCI 2 and 0.2 mM digoxigenin-1 1 - dUTP (Dig-dUTP) (Boehringer Mannheim), each 0.1 mM dATP, dCTP, dGTP and hexanucleotides of a random sequence as primer (Boehringer Mannheim) by incubation Marked at 37 ° C for 2 hours. Unincorporated nucleotides were separated by filtration through a Sepharose G50 column (Pharmacia).
  • the slides with the fixed cells or tissue sections were treated with 200 ⁇ l hybridization solution (50% deionized formamide, 4 x SSC, 10% dextran sulfate, 1 x Denhardts solution, 0.25 mg / ml denatured tRNA, 0.5 mg / ml denatured herring sperm DNA).
  • the solution was placed on the slide with coverslips covered and incubated for 1 hour at 42 ° C in a humid chamber.
  • the solution was then removed, the cells were covered with Dig-dUTP-labeled MCF-7 / sm1 DNA (200 ng DNA in 40 ⁇ l hybridization solution) and incubated at 42 ° C. overnight.
  • the cytoplasmic cdc37 protein nucleic acid heteromers can thus be specifically detected in tumor cells by hybridizing suitable DNA samples with the nucleic acid associated with the heteromers.
  • Example 1 1 Detection of cdc37Preotein-Nucleic Acid Heteromers Using the Antibody and the Polymerase Chain Reaction of the Associated Nucleic Acid.
  • the cells of acute myeloid leukemia contain cytoplasmic cdc37 protein nucleic acid heteromers, which can be enriched with the help of the cdc37 protein nucleic acid heteromer-specific antibody from a cell lysate and their nucleic acid with the help of the polymerase chain reaction and sequence-specific oligonucleotides can be amplified.
  • 1 0 4 cells each of an AML (A) and normal peripheral blood lymphocytes (B) or a mixture of 1 00 AML cells in 1 0 4 blood lymphocytes (C) or 1 00 normal human fibroblasts in 1 0 4 blood lymphocytes (D) was produced. While normal human peripheral blood lymphocytes show no proliferation without antigen stimulation, normal fibroblasts proliferate physiologically until they undergo cell aging after about 50-60 passages. The cells of acute myeloid leukemia, on the other hand, show unlimited proliferation and inhibition of entry into physiological cell death. Although the cells only survive in vitro to a limited extent, they induce a malignant tumor in vivo and show unlimited proliferation.
  • the cells of batches AD were sedimented, resuspended in 100 ⁇ l 10 mM Tris-HCl, pH 7.2, 1.5 mM MgCl 2 , immediately frozen at -20 ° C. and thawed again.
  • the samples were sedimented by centrifugation at 2,000 xg for 10 min and the supernatant was placed in a hole in a microtiter plate, the surface of which was coated with the cdc37 protein nucleic acid heteromer specific antibody 3D6 is coated. After incubation for 1 h at room temperature, the sample was washed four times with PBS, 2% (w / v) bovine serum albumin.
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromers from the cells were now enriched on the microtiter plate. This enrichment ensured that in the subsequent step of DNA amplification only the DNA of the cdc37 protein nucleic acid heteromers can serve as a template for the DNA polymerase, but not the nuclear DNA or any other contaminating DNA.
  • the cdc37 protein nucleic acid heteromers are detected by a specific amplification of the associated DNA.
  • a particular advantage is that this process can also be carried out on the microtiter plate after the enrichment.
  • the hole with the enriched cdc37 protein nucleic acid heteromers was incubated with proteinase K (100 ⁇ g / ml) for 1 hour at 55 ° C. and then heated at 95 ° C. for 10 minutes.
  • the polymerase chain reaction (PCR) was then carried out by a known method (Mullis and Fallona, Methods Enzymol. 1 55: 335-350, 1 987; Saiki et al, Science 239: 487-491, 1 988). The following approach was chosen.
  • Primer oligonucleotide A
  • the amplified DNA is separated electrophoretically in a 1% agarose gel and, after incubation with ethidium bromide, made visible in UV light.
  • A When analyzing the cells of acute leukemia (A), a DNA of approximately 221 bp in length was amplified, but not when using normal human lymphocytes (B). Amplification of the DNA was also obtained when using a mixture of AML cells with normal lymphocytes (C), but not when the normal lymphocytes were mixed with normal fibroblasts (D).
  • C normal lymphocytes
  • D normal fibroblasts
  • Example A Cells from the human lymphoma line L540 (sample A) and normal human lymphocytes from peripheral blood (sample B) were each in a concentration of 1 0 4 cells per 1 00 ⁇ l RPMI 1 640 culture medium, 1 0% (v / v) fetal calf serum, seeded in 4 holes of a 96-well microtiter plate.
  • the normal lymphocytes were also mitogenically stimulated in the presence of 10 ⁇ g / ⁇ l pokeweed mitogen (PWM) (sample C).
  • PWM pokeweed mitogen
  • the samples were incubated at 37 ° C for 1 2 hours.
  • Peptides 1, 2 and 3 were mixed with 2 ⁇ l DOTAP "transfection reagent" (Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat. No. 1 81 1 1 77) and in each case in hole 1-3 of the samples AC in the concentration of 40 ⁇ M peptide added, in the hole 4 was added buffer / PBS) plus
  • Peptide 1 and peptide 2 are derived from an N-terminal sequence of the cdc37 protein and contain the nucleic acid binding region of the protein.
  • Peptide 3 is a random peptide sequence of the same length. The peptides are cyclized via their N- and C-terminal Cys residues.
  • Peptide 3 CysGluAlaGInValLeuAspAlaLeuValGluGluLysArgGInValSerGluGluLysArg GlnLysGluAlaCys
  • the cultures were incubated for 3 days at 37 ° C. and then the cell vitality was determined using the XTT test (Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat No. 1 46501 5).
  • the tetrazolium salt XTT is added to the cells that cleave XTT to formazan using the succinate tetrazolium reductase system of the mitochondrial respiratory chain.
  • the metabolite can then be determined photometrically.
  • the amount of the metabolite is proportional to the number of living cells and is used to estimate the vitality and proliferation of a cell population.
  • L540 lymphoma cells in the presence of peptide 1 (hole 1) and peptide 2 (hole 2) show only 1 5-20% of the XTT metabolism compared to cultures in the presence of control peptide 3 (hole 3) and in the "blank” without peptide (hole 4).
  • Normal human lymphocytes from peripheral blood show the same XTT metabolism in the presence of the peptides (hole 1 -3) and in the "blank sample", as do the cultures (hole 1 -4) with lymphocytes after mitogenic stimulation (sample C ).
  • L540 lymphoma cells stop growing in the presence of peptide 1 and peptide 2, while a control peptide (peptide 3) is unable to trigger this growth inhibition.
  • a control peptide peptide 3
  • the proliferation of normal lymphocytes after mitogenic stimulation is not affected by these peptides.
  • TTTCATGATA TTGATTCTTC CTATCCATGA GGATGGAATG TTTTTCCATT TGTTTGTGTC 120
  • SEQ ID NO: 10 AACTGTAAAC GGCTTATTGC TATAATTATC CTAGTTTATT ATTGTTAATT TCTTACTGTA 60 CCTAATTTAT AAATTAAACT TTATCAGAGG TATGTATGTA TTAGAAAAAA TATAACATAT 120 ATAGGATACA GTACTATCCA TGGTTTCAGG AATCTACTGG GCATACTAGA AAGATCCCC 179 (2) INFORMATION ON SEQ ID NO: 11:
  • GATAGTTAAA AATAAATACC ACCTAAATAT GAACCTAAAG AAAGCGAGAT AAAAAGTAAA 120
  • CAACATTTCT CTTCTCACCT CAGTACACCT TTCCAAGAAG ATTGCAAAGC
  • CTCTCAAGTC ACAAAGTCAA GATTTTTTAA CCGTGATTTT AGTTATCTCC ATGACTCCCA 60
  • AAGATTGTGA TTTTTTTGGA AATAAATATT TTACGGGAGG CATGAATGAT GATTTAGAGT 420
  • CAGCAACAAC CAGATTAACA GTCCAAACCT GCTCTCTAGA TTCCAGATAA AACAGCTTAT 60
  • GATCAATTGC AATGTAAACT CACTCTTTGT GTGAAAGGAA AAAAAATGCT TAATATCTTT 60 TTGCTGGTGG AGGGCCTTGC CTCAGTGTGG ATGGCTGCTG ACTGATC 107
  • AAATTGTGAA ACAGAGGGGG CTGGGGCAGT AAGGAAGTTA TGAAGAAAGT AATTCACATT 240

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Abstract

Zum Nachweis, zur Identifizierung, zur Gewinnung oder Beseitigung von menschlichen oder tierischen Zellen mit gestörter Zellzykluskontrolle oder mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung weist man das Vorliegen eines Assoziats aus dem cdc37Protein mit extrachromosomaler Nukleinsäure in Zellen oder Gewebsflüssigkeiten nach. Dies kann z.B. mit einer mit dem Assoziat spezifisch bindefähigen nachweisbaren Substanz, mit einer mit der Nukleinsäure des Assoziats hybridisierenden Nukleinsäure oder Oligonukleotid oder mit bindefähigen Substanzen, welche an einen festen Träger gebunden vorliegen, erfolgen, wobei mit letzterer Methode sich derartige Zellen auch gewinnen oder beseitigen lassen.

Description

Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung, zur Gewinnung oder Beseitigung von menschlichen oder tierischen Zellen mit gestörter Zellzykluskontrolle oder mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbil- düng
Beschreibung
Die Erfindung betrifft cdc37 Protein-Nukleinsäure-Heteromere, cdc37 Protein, Nukleinsäuren und Antikörper, welche zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet sind, Verfahren zur Identifizierung und Eliminierung von menschlichen und tierischen Zellen mit Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung unter Verwendung von solchen Heteromeren, Proteinen, Nukleinsäuren oder Antikörpern.
Alle normalen differenzierten Zellen haben ein begrenztes Potential zur Zellvermehrung (Proliferation), ehe sie nach einer definierten Anzahl von Zellteilungen der Zellalterung (Seneszenz) und dem Zelltod unterliegen. Die zellbiologischen Vorgänge der Zellteilung sowie der Zellalterung unterliegen einer komplex regulierten genetischen Kontrolle, deren Störung einerseits zum Zelltod oder andererseits zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung führen können.
Die Zellvermehrung erfordert eine Zellteilung, die in einer Kaskade von Vorgängen in zeitlicher und räumlicher Ordnung (Zellzyklus) vollzogen wird. Die Kontrolle dieses Vorgangs geschieht an zwei Zeitpunkten, nämlich dem an dem die DNA- Synthese (S-Phase des Zellzyklus) und dem an dem die Mitose (M-Phase) einsetzt, und wird durch eine kleine Gruppe von Proteinkinasen vollzogen, die durch Phosphorylierung die Aktivität von zahlreichen, an dem Vorgang beteiligten Proteine regulieren. Diese Zellzyklus-kontrollierenden Proteinkinasen sind heterodimere Proteine mit regulatorischen Untereinheiten (Cycline) , deren Gehalt und Assoziation mit anderen Proteinen sich im Verlauf des Zellzyklus auf charakteristische Weise ändert. Die katalytischen Untereinheiten dieser Proteinkinasen werden Cyclin-abhängige Kinasen (cyclin dependent kinases, cdk) genannt, da sie erst nach Assoziation mit einem Cyclin als Kinase aktiv werden. Die Cyclin- abhängigen Kinasen wurden zuerst bei Hefe entdeckt und nach den für sie kodierenden Genen benannt, z. B. cdc2 (cell devision cycle-2) aus Schizosaccharomyces pombe oder cdc28 aus Saccharomyces cerevisiae. Sehr bald wurde klar, daß viele an der Steuerung des Zellzyklus beteiligten Proteine stark konserviert sind und als homologe Gene mit ähnlichen oder identischen Funktionen bei Eukaryoten vorliegen.
Der Ablauf des Zellzyklus in Säugetierzellen wird durch zahlreiche Cyclin- abhängige Kinasen in Kombination mit verschiedenen Cyclin-Molekülen gesteuert (Übersicht: C.J. Sherr, Mammalian G 1 Cyclins, Cell 73: 1 059- 1 065, 1 993) . Zum Beispiel sind Cdk2, Cdk4 und Cdk5, jeweils assoziiert mit den Untereinheiten Cyclin D 1 , D2, D3, an der Einleitung der G 1 Phase des Zellzyklus beteiligt. Dabei kann eine cyclin-abhängige Kinase mit verschiedenen Cyclinen assoziiert verschiedene Punkte des Zellzyklus kontrollieren. Zum Beispiel ist Cdk2 assoziiert mit Cyclin E an der Kontrolle des G 1 -S Übergang beteiligt, während Cdc2 assoziiert mit Cyclin A und B den G2-M Übergang kontrolliert. Der Kenntnisstand zur Kontrolle des Zellzyklus ist noch weit von einem einheitlichen Modell entfernt und es werden noch immer weitere Cdk- und Cyclin-Moleküle entdeckt, die definierte Positionen des Zellzyklus und damit der Zellproliferation kontrollieren.
Während der Zellzyklus normaler proliferierender Zellen durch die oben beschiebenen Mechanismen und noch andere, bisher nicht geklärte Prozesse in seinem koordinierten Ablauf kontrolliert ist, nimmt man an, daß tumorigen transformierte Zellen einen oder mehrere Defekte in einem oder mehreren der Kontrollmechanismen des Zellzyklus aufweisen. Diese Vorstellung wird an folgendem Beispiel deutlich. Die Cyclin-abhängigen Proteinkinasen können den Übergang von einer Phase des Zellzyklus in die nächst-folgende Phase sowohl katalysieren als auch hemmen. Schädigung der DNS durch Bestrahlung oder chemische Wirkstoffe bewirkt jedoch eine Stabilisierung des Tumorsuppressor-Proteins p53, das dadurch die Synthese u.a. eines Cyclin-abhängigen Kinaseinhibitors stimuliert. Dieser Kinase-inhibitor bindet seinerseits den G 1 -spezifischen Cdk/Cyclin Komplex, worauf die Zelle bis zur Reparatur der DNS-Schäden und zum Absinken des p53 Spiegels in der G 1 -Phase verbleibt. Diese komplexe Regulation gewährleistet eine Vermehrung ausschließlich der Zellen, die die aufgetretenen DNS-Schäden vollständig repariert haben. Sollte die Reparatur nicht erfolgreich sein, unterliegt die Zelle dem programmierten Zelltod, wodurch einer Entartung der Zelle zu ungehemmter Proliferation bei bestehenden DNS-Schäden vorgebeugt wird. Bei Mutation des p53 kodierenden Gens bleibt jedoch die durch p53 induzierte Verzögerung des G 1 -S Übergangs aus, wodurch es zu einer Replikation geschädigter DNS und Vermehrung geschädigter Zellen kommt, ohne daß die Zelle dem programmierten Zelltod zugeführt wird.
Es wird angenommen, daß diese und andere Defekte in der Kontrolle des Zellzyklus zur permanenten Proliferation und schließlich zur tumorigenen Entartung der Zelle beitragen. Da noch nicht annähernd alle wesentlichen Kontrollproteine und deren Regulatoren identifiziert sind, ist die derzeitige Einsicht der Fachwelt in die Defekte der Zellzyklus-Kontrolle bei tumorigen entarteten Zellen sehr lückenhaft. Erschwerend kommt hinzu, daß der Phänotyp von tumorigen tranformierten Zellen außerordentlich vielfältig sein kann und durch ein extrem heterogenes Bild zahlreicher genetischer, phänotypisch-morphologischer und physiologischer Änderungen gekennzeichnet ist, die ihrerseits von zahlreichen anderen Parametern, wie z. B. Differenzierungsgrad, Zellmatrix, umgebende Zellen, lokale Wachstums- faktor-Konzentrationen oder die immunologische Abwehr, abhängig sind, ohne daß gemeinsame obligate Eigenschaften molekular definiert werden können. Dieses Problem soll anhand der Zellvermehrung normaler und tumorigen transformierter Zellen illustriert werden.
Während alle normalen menschlichen und tierischen Zellen ein begrenztes Potential zur Zellvermehrung (Proliferation) haben, zeigen tumorigen transformierte Zellen häufig eine unbegrenzte Zellteilung. Sie bilden stetig wachsende Zellverbände, die zur Ausbildung eines Tumors und schließlich zusammen mit der veränderten Ausprägung anderer Eigenschaften (z.B. verminderter Bedarf an Wachstumsfaktoren, Proliferation ohne Verankerung und Kontakt-Inhibition, Induktion von Gefäßneubildung usw.) zur Tumorerkrankung führen. Nach dem derzeitigen Verständnis der Tumorentstehtung sind Zellen mit großer Wahrscheinlichkeit dann neoplastisch (tumorigen) transformiert, wenn ( 1 ) die Zellen unbegrenzt in vivo proliferieren und/oder (2) in ihrem Zelltod arrettiert sind. Die tumorigene Transformation ist eine Mehrstufen-Prozeß, an dessen Endpunkt die Tumor-Zellen die Eigenschaften ( 1 ) und/oder (2) neben zahlreichen anderen Eigenschaften ausprägen.
Ein frühes Ereignis in diesem Prozeß ist die unbegrenzte Proliferation (" Immortalisierung"), die dadurch charakterisiert ist, daß die Zelle die Fähigkeit erworben hat, im Zellzyklus zu verbleiben und fortlaufende Zellteilungen vollziehen zu können (Freund et al., Oncogene 7: 1 979-1 992) . Mit der Immortalisierung erwirbt die Zelle jedoch noch nicht die Fähigkeit zur Tumorbildung in einem Gewebeverband (Medina und Kttrell, Carcinogenesis 1 4: 25-28, 1 993; Strauss und Griffin, Cancer Cells 2: 360-365, 1 990) . Hierzu bedarf es einer Vielzahl von zusätzlichen "transformierenden Ereignissen" , die im einzelnen noch nicht charakterisiert sind.
Andererseits erfordert die Induktion des neoplastisch transformierten Phänotyps keine vorhergehende Immortalisierung (O ' Brien et al., Proc. Natl.Acad.Sci. USA 83: 8659-8663, 1 986) . Ein Beispiel dafür sind Zellen der chronischen lymphatischen Leukämie, die sich nicht mehr zu teilen vermögen, jedoch durch ein transformierendes Ereignis in ihrem programmierten Zelltod (Apoptose) arrettiert sind (Buschle et al., J. Exp. Med. 1 77, 21 3-21 8, 1 993) . Durch die ständige Differenzierung von Vorläuferzellen werden stets neue Zellen gebildet, die dann in ihrem Zelltod inhibiert sind. Dadurch nimmt die Zahl der Zellen stets zu, was zur Tumorbildung führt.
Tumor-Zellen können sich auf verschiedenen Stufen der neoplastischen Transformation befinden und verschiedene "Tumor-assoziierte" Eigenschaften erworben oder Eigenschaften differenzierter Zellen verloren haben. Es ist bei der phänotypischen Heterogenetität und den verschiedenen Mechanismen, die zur neoplastischen Transformation führen, außerordentlich schwierig, eine Zelle mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation und Tumorbildung in einer Umgebung von normalen Zellen zu identifizieren. Für die Diagnostik und Therapie und letztlich für das Überleben des Patienten ist es jedoch von entscheidender Bedeutung, diejenigen Zellen aufzufinden, die der normalen Proliferationskontrolle und Zellzyklus-Regulation nicht mehr unterliegen und das Potential zur unbegrenzten Proliferation und Tumorbildung erworben haben.
Eine besondere Schwierigkeit bildet dabei stets die Unterscheidung der Proliferation neoplastisch transformierter Zellen von der physiologischer Proliferation von normalen Zellen im Rahmen der Regeneration oder Differenzierung von Geweben, wie z.B. bei der Blutbildung im Knochenmark oder bei der Wundheilung. Die physiologische Proliferation kann sowohl kurzzeitig oder auch permanent als Antwort auf eine physiologische Stimulation erfolgen, wobei das Ausmaß einer physiologischen regenerativen Proliferation dasjenige von Tumorzellen bei weitem überschreiten kann. Dies wird bei der Proliferation und Differenzierung von Blut-bildenden Zellen besonders deutlich. Deswegen ist es nicht möglich, für die Identifizierung von Tumorzellen das Maß der Proliferation einer Zelle (Zellteilungen pro Zeit) oder die Progression im Zellzyklus sowie den Aktivierungsgrad (Phosphorilie- rung) der Zellzyklus-Kontroll-Proteine zu nutzen. Die bekannten Verfahren zum Nachweis von Tumorzellen beruhen auf klinischen, morphologisch-histologischen, zytologischen oder physiologischen Parametern oder auf Antikörpern, welche Antigene erkennen, die bevorzugt von proliferierenden (normalen und Tumor-) Zellen erhöht exprimiert werden, z. B. das Ki-67 Antigen oder PCN-Antigen, somit auf indirekten Parametern, die ohne kausalen Zusammenhang zur neoplastischen Transformation der Zellen stehen. Bei der Vielfalt der möglichen Prozesse, die zur neoplastischen Transformation der Zelle führen können, ist es naheliegend, daß Mutationen in bevorzugten Gen . n bei nur einigen wenigen Tumorentitäten gefunden werden. Beispiele sind Mutationen von membranständigen oder intrazellulären Rezeptoren der intrazellulären Signalweiterleitung (z.B. , fms, erb-B/A, src, yes), Mutationen von Protein- Kinasen (z.B. mos, raf, ras) oder nuklearen Transkriptionsfaktoren (z.B. fos, jun, myc) oder von Zellzyklus-assoziierten Kontroll-Proteinen (z.B. p53, rb) .
Aufgabe der Erfindung ist es daher, in einem Gewebeverband in situ oder in einer Zeil-Suspension die Zellen nachzuweisen, zu beseitigen oder in ihrem Wachstum zu hemmen, die eine gestörte Zellzyklus-Kontrolle aufweisen oder die Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung erworben haben, wobei die tumorigen transformierten Zellen von normalen Zellen mit transienter oder physiologischer Proliferation unterschieden werden sollen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung, zur Gewinnung oder Beseitigung von menschlichen oder tierischen Zellen mit gestörter Zellzykluskontrolle oder mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man das Vorliegen eines Assoziats aus dem cdc37Protein mit extrachromosomaler Nukleinsaure in Zellen oder Gewebs- flüssigkeiten nachweist. Der Polypeptid-Anteil des Polypeptid-Nukleinsäure Assoziats stellt das menschliche oder tierische homologe Protein zu dem Hefe cdc37 Protein und seinen Untereinheiten dar. Der Nukleinsäure-Anteil besteht aus extrachromosomalen DNS- oder RNS-Kopien von chromosoma- len DNS-Sequenzen der jeweiligen Tumorzelle (im weiteren als cdc37- Nu kleinsäure Heteromer bezeichnet) . Dieses cdc37-Nukleinsäure-Heteromer ist zum Nachweis von menschlichen und tierischen Zellen mit der Fähigkeit zur unbegrenzten Proliferation oder Tumorbildung geeignet. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Gewinnung des cdc37-Nukleinsäure-Heteromers durch Isolierung aus einer löslichen Fraktion aus permanent teilungsfähigen menschlichen oder tierischen Zellen, Fällung in Gegenwart von 1 ,5 M NaCI und Isolierung durch Extraktion mit Phenol und Fällung mit Ethanol oder Ammoniumacetat.
Bei der Erfindung werden folgende unerwartete Eigenschaften von permanent proliferierenden oder Tumor-bildenden Zellen genutzt:
(i) In Zellen mit der Fähigkeit zur Tumorbildung oder unbegrenzter Prolifera- tion, jedoch nicht in normalen Zellen mit physiologischer transienter oder permanenter Proliferation, sind Moleküle des cdc37 homologen Proteins zusammen assoziiert mit Nukleinsäuren in einem Heteromer; (ii) Das cdc37-Nukleinsäure Heteromer eignet sich zum Nachweis von Zellen mit der Fähigkeit zur Tumorbildung oder unbegrenzter Proliferation, unabhängig davon, welchen Differenzierungsgrad oder Stufe der neoplastischen Transformation die Zellen haben oder von welchem Gewebe die Zellen stammen.
(iii) Moleküle, die an das cdc37-Nukleinsäure Heteromer binden, eignen sich zur Beseitigung oder Anreicherung von Zellen mit der Fähigkeit zur Tumorbildung oder unbegrenzter Proliferation sowie zur Hemmung des Wachstums oder der Einleitung des Zelltods dieser Zellen.
Aus Proc. Natl.Acad.Sci.USA 90: 651 9-6922 ( 1 993) und PCT WO 95/02701 ist bekannt, daß Tumorzellen oder unbegrenzt proliferierende
Zellen eine extrachromosomale DNS tragen, die mit Proteinen assoziiert ist.
Die beschriebenen DNS-Protein Komplexe sind dadurch charakterisiert, daß die Komplexe in Fraktionen der Dichte von 1 ,82- 1 ,86 g/cm3 bei Gleichge- wichtszentrifugation in einem CsCI Dichtegradienten sich anreichern, die DNS mit den Proteinen in einer SDS und Salz-Stabilen Bindung assoziiert und die Proteine Molekulargewichte von 52 kD, 62 kD und 64 kD auf- 5 weisen. Die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere unterscheiden sich jedoch von den o.g. DNS-Protein Komplexen in folgenden Eigenschaften:
- Das cdc37 Protein hat ein Molekulargewicht von ca. 40 kD. Polypeptide mit Molekulargewichten von 52 kD, 62 kD oder 64 kD sind in dem ι o erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromer nicht nachweisbar.
- Die Bindung der Nukleinsaure an das cdc37 Protein ist in Gegenwart von Detergentien und hoher Temperatur, z.B. 0, 1 % SDS und 90 °C lösbar, nicht jeoch die Bindung des o.g. DNS-Protein Komplexes.
- Die cdc37 Protein assoziierten DNS-Sequenzen unterscheiden sich von 15 denen der DNS-Protein Komplexe aus PCT WO 95/02701 .
Um die Erfindung näher zu beschreiben, wird der relevante Kenntnisstand zur Biochemie des cdc37 Proteins im folgenden zusammengefaßt.
20 Das cdc37 Protein ist bekannt und wurde zuerst aus Hefe isoliert aufgrund der Eigenschaft, daß Mutationen dieses Proteins zu einem gestörten Zellzyklus führen (Ferguson et al. , 1 986) . Erst sehr viel später gelang die Isolierung aus Drosophila, insbesondere dadurch, daß Mutationen von cdc37 und hsp83 mit dem Signalweg durch den "sevenless" receptor
25 Tyrosin Kinase interferieren (Cutforth et al., Cell 77: 1027, 1 994) . Im Verlauf der letzten drei Jahre wurde das Mammalia homologe cdc37 Protein kloniert aufgrund der hoch konservierten Aminosäure-Sequenz zur Hefe cdc37 Sequenz und der Eigenschaft, Teil eines Multi-Protein Komplexes zu sein, der die cyclin-abhängige Kinase-4 (cdk4) und das heat-shock-protein
30 hsp90 beinhaltet (Dai et al., J. Biol. Chem. 271 : 22030, 1 996; Lamphere et al. , Oncogene 1 4: 1 999, 1 997) . Weiterhin ist bekannt, dass das cdc37 Protein mit zahlreichen anderen Proteinen in Wechselwirkung treten kann, z. B. mit dem Retinoblastom-Protein RB und mit viral kodierten Proteinen mit transformierender Aktivität, z. B. mit SV40 large T, Adenovirus E 1 A, Papillon-Virus E7, pp60v-src oder raf (Ozaki und Sakiyama, DNA Cell Biol. 1 5: 975, 1 996; Perdew et al., Biochem. 36: 3600, 1 997) . Das cdc37 Protein bindet außerdem Hyaluronsäure (Grammatikakis et al., J. Biol.Chem. 270: 1 61 98, 1 995) . Die Vielfalt der Interaktionen des cdc37 Proteins mit anderen Molekülen der Zelle ist bisher unklar. Hsp90 bindet die Proteinki- nase cdk4 und stabilisiert den cdc37/cdk4 Komplex. In dieser Form wird cdk4 durch Cyclin D 1 aktiviert. Nach Transition der Zelle durch die G 1 Phase in die S-Phase des Zellzyklus zerfällt dieser Komplex und baut sich erst dann wieder auf, wenn die Zelle die G 1 Transitionsstelle des Zyklus wieder erreicht hat (Stepanova et al., Genes Develop. 1 0: 1 491 , 1 996) . Der cdc37/hsp90 Komplex kann durch ein Antibiotikum, Geldanamycin, destabilisiert werden, was zu dem Zerfall des Komplexes führt. Die Zelle kann nicht mehr in die S-Phase des Zellzyklus eintreten (Stepanova et al., Genes Develop. 10: 1491 , 1 996) . Der derzeitige Kenntnisstand geht davon aus, daß cdc37 an der Kontrolle des G 1 -S Übergangs der Zelle im Zellzyklus beteiligt ist und somit immer dann exprimiert wird, wenn die Zelle diesen Punkt des Zellzyklus erreicht (Ozaki et al., DNA Cell Biol. 1 4: 1 01 7, 1 995) . Dieses steht in Übereinstimmung mit der Beobachtung, daß die Genexpression für das cdc37 Protein in proliferierenden Zellen ausschließlich bei dem Übergang der Zelle von der G 1 in die S-Phase nachweisbar ist und nach Eintritt in die S-Phase sofort abgebaut wird. Die cdc37 Expression persistiert somit maximal 9 Stunden bei einer Zyklusdauer proliferierender Zellen von ca. 24 - 36 Stunden und ist während der anderen Phasen des Zellzyklus nicht nachweisbar.
Aus Ozaki und Sakiyama (FEBS Lett. 375: 1 55, 1 995) ist bekannt, daß das cdc37 Protein in vitro DNS zu binden vermag. Dieses zeigten die Autoren dadurch, daß sie cdc37 Protein mit genomischer DNS aus Ratten-Zellen inkubierten und die unter in vitro Bedingungen an cdc37 gebundene DNS klonierten. Die Autoren erhielten dabei einen DNS Klon genomischer DNS, der an cdc37 Protein bindet. Die Autoren spekulierten "cdc37 might play an important role in the control of cell cycle progression via a sequence- specific DNA binding mechanism. " Im Gegensatz zu diesen in-vitro- Bindungsstudien und der Spekulation der Autoren, cdc37 Protein könnte an chromosomale DNS binden, wurde eine DNS-Assoziation des cdc37 Proteins in vivo in der Zelle bisher nicht nachgewiesen. Im Gegenteil, das cdc37 Protein in normalen Zellen mit physiologischer Proliferation hat keine nachweisbare DNS gebunden.
Um so überraschender war es, daß in neoplastisch transformierten Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung eine DNS gebunden an das cdc37 Protein gefunden wurde. Hierbei handelt es sich jedoch entgegen der oben beschriebenen Annahme von Ozaki und Sakiyama um eine extrachromosomale DNS. Die im erfindungsgemäßen Heteromer enthaltenen DNS Sequenzen sind deswegen auch nicht mit der von Ozaki und Sakiyama isolierten genomischen DNS-Sequenz homolog. Das Heteromer aus cdc37 Protein und extrachromosomaler Nukleinsaure ist daher neu und ein Gegenstand der Erfindung.
Da alle bekannten Beobachtungen darauf hinweisen, daß das cdc37 Protein ausschließlich bei dem G 1 -S Phase Übergang des Zellzyklus exprimiert wird, jedoch nicht konstitutiv während des gesamten Zellzyklus, war es um so überraschender, daß das cdc37-Nukleinsäure-Heteromer in Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle oder der Fähigkeit zu unbegrenzter Prolifera- tion oder zur Tumorbildung konstitutiv unabhängig von der Zellzyklus-Phase exprimiert ist. Im Gegensatz dazu ist das cdc37-Nukleinsäure-Heteromer in normalen Zellen nicht exprimiert, unabhängig davon, ob die Zellen proliferieren, ruhen oder seneszieren. Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren ist daher unabhängig davon, in welcher Zellzyklus-Phase sich die Zelle mit diesen Eigenschaften befindet. Überraschenderweise können die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure- Heteromere auch dazu verwendet werden, Zellen in unterschiedlichen Stadien der neoplastischen Transformation, insbesondere in sehr frühen Stadien, nachzuweisen, unabhängig davon, durch welche Mechanismen die Zelle neoplastisch transformiert wurde. Insbesondere lassen sich mit Hilfe der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere Zellen nachweisen, die eine gestörte Kontrollfunktion des Zellzyklus oder unbegrenzte, tumorigene Proliferationskapazität aufweisen, jedoch noch keinen Tumor gebildet haben. Bevorzugtes Prüfmaterial sind Gewebebiopsien oder Zellgemische aus Körperflüssigkeiten oder geeignete Zeil- oder Zytoplasma- Fraktionen, die in spezifischen Reaktionen zur Detektion der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere durch Nachweis der Nukleinsaure, des Proteins oder deren besonderen Konfiguration als Heteromer oder dessen Reaktivität mit Substraten oder Antikörpern oder anderen Bindemole- külen verwendet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist somit der Nachweis von Tumorzellen und anderen Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität unter Verwendung einer Gewebebiopsie, eines Gewebeabstriches, einer Körperflüssigkeit oder von geeigneten Zellaufschlüssen, unabhängig davon, ob ein klinisch nachweisbarer Tumor bereits gebildet ist. Bevorzugte Anwendungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Tumordiagnostik oder Vorsorge-Zwecke in der Gesundheitsüberwachung.
Als Ausgangsmaterial zur Gewinnung der erfindungsgemäßen cdc37- Nukleinsäure-Heteromere können generell beliebige menschliche und tierische Zellen verwendet werden, die eine gestörte Zellzyklus-Kontrolle aufweisen oder die Fähigkeit zur permanenten Proliferation oder Tumorbildung ausprägen, permanent proliferierende Zellen verschiedener Gewebe oder Differenzierungsgrade oder Spezies sowie andere, dem Fachmann geläufige Tumorzell-Linien oder Tumore oder Tumor-Biopsien der gewünschten Gewebe, Differenzierungsgrade oder Spezies. Es ist dabei überraschenderweise unerheblich, durch welche Prozesse (z.B. ionisierende Strahlen), transformierende Gene (z.B. virale Onkogene), chemische Carcinogene (z. B. Nitroso-Harnstoff) oder andere Mechanismen die entsprechende Zelle neoplastisch transformiert wurde. Auch ist es ohne Einfluß auf die Isolierbarkeit der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere, welchen Differenzierungsgrad die Zelle hat (z. B. Epithel, Lymphozyt, Myelozyt, Fibroblast, Melanozyt) oder von welcher Spezies (z.B. Mensch, Maus, Ratte, Drosophila) die Zellen abstammen.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere aus einer Zytoplasma-Fraktion aus permanentteilungsfähigen menschlichen oder tierischen Zellen gewonnen, z.B. mit Hilfe von Detergentien, wie NP40 oder SDS, oder mit Hilfe von wiederholtem Einfrieren und Auftauen der Zellen, bevorzugt in Gegenwart Mg + + haltiger Lösungen. Die Mitochondrien werden dann aus dieser Zytoplasma-Fraktion abgetrennt, vorzugsweise mit Hilfe eines Sucrosegradienten nach dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Zytoplasma-Fraktion mit cdc37-Nukleinsäure Heteromeren kann alternativ auch durch die Gewinnung einer Protein-haltigen Zellfraktion erhalten werden, die frei von nuklearer DNS ist. Eine solche Fraktion gewinnt man bevorzugt durch Lyse der Zellen in Gegenwart von NaCI und SDS und anschließender Zentrifugation ("Hirt-Extraktion", J. Mol. Biol. 26: 3655 - 369, 1 967). Aus dem Überstand der "Hirt-Extraktion" oder aus Mitochondrien-freien Zell-Lysaten können die erfindungsgemäßen cdc37- Nukleinsäure Heteromere durch selektive Präzipitationen oder elektrophore- tische oder chromatographische Verfahren erhalten werden, bevorzugt durch Präzipitation mit 1 ,5 M NaCI und Fällung des Überstandes mit Ethanol oder Ammoniumsulfat.
Die cdc37-Nukleinsäure-Heteromere weisen ein überraschend schlechtes Lösungsverhalten sowohl in organischen als auch in wäßrigen Lösungs- mittein auf. Gemäß einem weiteren Isolierungsverfahren für die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere aus einem zytoplasmatischen Lysat wird daher das Lysat einer Extraktion in organischen Lösungsmitteln, bevorzugt Phenol und Chloroform, unterzogen. Dabei sammeln sich die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere in der organischwäßrigen Interphase der Extraktion und können von anderen Molekülen des Lysates abgetrennt werden, bevorzugt durch Fällung mit Ethanol.
Die erfindungsgemäße cdc37-Nukleinsäure-Heteromere weisen ferner eine überraschend hohe Stabilität gegenüber Proteinasen und Nukleasen auf, während zytoplasmatische Organellen und Membranen oder mitochondriale oder virale DNS oder RNS schnell durch Nukleasen abgebaut werden. Aufgrund dieser Eigenschaften können die erfindungsgemäßen cdc37- Nukleinsäure-Heteromere auch gemäß einem weiteren Gegenstand der Erfindung durch Inkubation in Gegenwart von proteolytischen Enzymen, bevorzugt Proteinase K ( 1 00 /vg/ml) 1 h bei 60 °C, und anschließender Fällung in Gegenwart von Ethanol oder Ammoniumsulfat oder chromatogra- phischer Reinigung, bevorzugt mit Hilfe HPLC, gewonnen werden.
Während der Protein-Anteil des Heteromers stets das cdc37 Protein enthält, hat es sich überraschenderweise gezeigt, daß sich die Nukleinsäure- Sequenzen der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere in Zellen verschiedenen Differenzierungsgrades und Spezies unterscheiden. So unterscheidet sich die Sequenz der assoziierten DNS der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromere aus Melanom-Zellen von der aus Mamma- Carcinom oder aus Colon-Carcinom Zellen. Die meisten cdc37 assoziierten DNS-Molekülen weisen eine Länge von ca. 30 bp - 1 .000 bp auf, jedoch kommen auch Moleküle größerer Länge, z. B. bis zu 3.000 bp in Zellen der akuten myeloischen Leukämie, vor.
Aus den erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure-Heteromeren können die Nukleinsäure(RNS/DNS)-Sequenzen isoliert werden nach dem Fachmann bekannten Verfahren, bevorzugt unter Verwendung von proteolytischen Enzymen, Detergentien, hoher Temperatur, enzymatischer Vermehrung oder molekularer Klonierung. Auch können die Nukleinsäure-Sequenzen der cdc37-Nukleinsäure-Heteromere enzymatisch vermehrt werden, bevorzugt unter Verwendung der reversen Transkriptase oder Klenow-Polymerase oder bei Anwendung des PCR-Verfahrens unter Verwendung thermostabiler DNS- Polymerasen. Weiterhin können die DNS-Sequenzen durch Hybridisieren einer genomischen Genbank oder einer cDNS Bank mit den erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromeren gewonnen werden. Ein weiteres bevorzugtes Verfahren ist die Gewinnung der Nukleinsaure durch Affinitäs- bindung an das cdc37 Protein, bevorzugt unter Verwendung von extra- chromosomaler DNS oder von cDNS und anschließender Anreicherung des gebildeten cdc37-Nukleinsäure Heteromers, bevorzugt durch Sedimentation oder Verwendung von Antigen-Antikörper Reaktionen.
Die gewonnenen DNS-Sequenzen können dann zu dem Nachweis von menschlichen oder tierischen Zellen mit unbegrenzter Proliferation oder der Fähigkeit zur Tumorbildung eingesetzt werden. Bevorzugt sind dazu dem Fachmann bekannte Verfahren der DNS- oder RNS-Hybridisierung, der enzymatischen Vermehrung unter Verwendung von Sequenz-spezifischen Oligonukleotiden, der in situ Hybridisierung an Zellen oder Gewebe-Biopsien, oder der Bindung der Nukleinsäuren an das cdc37-Protein oder des Proteins an die Nukleinsäuren in einem Lysat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des cdc37 Proteins aus dem cdc37-Nukleinsäure Heteromer zum Nachweis von menschlichen und tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung. Es zeigte sich, daß diese Zellen im Vergleich zu normalen Zellen mit physiologischer Proliferation das cdc37 Protein und dessen mRNS in erhöhter Anzahl von Molekülen exprimieren. Der Vergleich der Expression der cdc37 Protein Moleküle erfolgt bevorzugt durch eine Antigen-Antikörper-Erkennungsreaktion, bevorzugt mit Hilfe der Western Blot Detektion, der Immunfluoreszenz oder der FACS Analyse ("fluorescence activated cell sorter") unter Verwendung eines cdc37 Protein spezifischen Antikörpers (z.B. Dai et al. , J. Biol. Chem. 271 :22030 - 22034, 1 996) oder einer gleichwertigen Bindereaktion eines Bindemoleküls oder einer cdc37-bindenden Nukleinsaure (South-Western Blot) nach dem Fachmann bekannten Verfahren (Harlow et al., Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) . Der Vergleich der mRNS Expression erfolgt bevorzugt mit Hilfe der Northern Blot Hybridisierung unter Verwendung einer geeigneten Hybridisierungsprobe, z.B. der menschlichen cdc37 cDNS Sequenz (z.B. dbEST data base, GenBank™ ID clone R87892) . Unter Anwendung dieser Analysen zeigt sich z.B. eine 5fach erhöhte cdc37 mRNS Expression (Northern Blot Analyse) und eine 8-1 Ofache cdc37 Protein Expression (Western Blot Analyse) in MCF-7 Mamma Carcinom Zellen im Vergleich zu der in normalen Mamma Epithelzellen und eine 7fach erhöhte cdc37 mRNS Expression in L540 Hodgkin Lymphom Zellen im Vergleich zu der in normalen Lymphozyten.
Bei Verwendung des South-Western Verfahrens oder anderer Verfahren der Bindung von Nukleinsäuren an das cdc37 Protein werden bevorzugt DNS oder RNS oder einzel- oder doppelsträngigen Desoxy- oder Oxy-oligonukleo- tiden oder markierte (z.B. mit Digoxigenin oder Biotin) oder modifizierte Nukleinsäuren, z.B. PNA "peptide nucleic acid ", verwendet. Die Binding der Nukleinsäuren an cdc37 Protein in vitro erfordert die Gegenwart von Zn2 + Ionen (bevorzugt 8 mM) und einwertigen Ionen, z.B. Na+ (bevorzugt 8 mM), sowie ATP oder GTP (bevorzugt 2 mM). Die Nukleinsäure-cdc37 Interaktion schließt den N-terminalen Teil der cdc37 Polypeptidsequenz ein.
Das cdc37 Protein ist aus dem erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromer erhältlich durch Behandlung mit DNase I, bevorzugt matrixgebundene DNasel, oder durch proteolytische Spaltung oder Behandlung mit Detergenz oder in Gegenwart von hoher Temperatur, bevorzugt 90° C, und chromatographischer oder elektrophoretischer Isolierung des freigesetzten cdc37 Proteins oder von dessen Fragmenten. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Antikörper und Antiseren mit Spezifität oder rekombinante Moleküle mit Antikörper-ähnlicher Bindungs- sepzifität für die erfindungsgemäßen cdc37Protein-Nukleinsäure Hetero- ere. Diese sind zum Nachweis von menschlichen und tierischen Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Tumorbildung geeignet. Diese Antikörper oder Antiseren können in polyklonaler Form an sich bekannten Verfahren durch Immunisierung von immunkompetenten Tieren, wie z.B. Mäuse, Kaninchen oder Schafe, mit den erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromeren oder dem cdc37 Protein oder der Nukleinsaure des Heteromers gewonnen werden. Monoklonale Antikörper produzierende Hybridom-Klone können ebenfalls nach an sich bekannten Methoden durch Fusion von Antikörpern bildenden Lymphozyten mit geeigneten Myelom-Zelien, z.B. Ag8.653 Zellen, gewonnen werden. Neben kompletten Antikörpern können auch Antikörper- Fragmente zur Anwendung gelangen, die nach an sich bekannten proteinchemischen und molekulargenetischen Verfahren erhältlich sind. Auch können mit Hilfe der cDNS Sequenzen der VH- und/oder VL-lmmunglobulin Ketten aus immunkom- peteten Spender-Lymphozyten einzeln oder in Kombination bindungsfähige Hybrid-Moleküle mit Antikörper-ähnlicher Spezifität isoliert werden, bevorzugt rekombinante "single-chain" Antikörper, die die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere zu binden vermögen. Bevorzugt ist auch die Isolierung von rekombinanten Antikörpern aus einer "phage display library", indem die geeigneten rekombinanten Phagen durch spezifische Bindung ( "panning") an die cdc37-Nukleinsäure Heteromere angereichert werden. Die Antikörper-ähnlichen Fusionsproteine auf der Oberfläche der Phagen oder in löslicher Form können dann wie ein Antikörper in geeigneten Nachweisverfahren verwendet werden. Die Verwendung einer " Kombinantionsbibliothek" ("combinational library") ist für die Isolierung eines solchen rekombinanten Antikörpers mit Spezifität für cdc37-Nukleinsäure Heteromere ebenso möglich und dem Fachmann bekannt (Orlandi et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 3833-3837, 1 989; Chiang et al., Biotechniques 7: 360-366, 1 989; Winter und Milstein, Nature 349: 293-299, 1 991 )
Überraschenderweise binden die nach Immunsierung mit den erfindungs- gemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromeren erhaltenen Antikörper so spezifisch an Zellen mit unbegrenzter Proliferation, gestörter Zellzyklus- Kontrolle oder der Fähigkeit zur Tumorbildung, daß sie auch für Markierungen von Zellen in einem Gewebeverband in situ eingesetzt werden können. Die Markierung der gesuchten Zellen erfolgt dabei bevorzugt im Zytoplasma, während normale Zellen mit physiologischer permanenter oder in transienter Proliferation nicht markiert werden. Dieses ist um so überraschender, da proliferierende normale Zellen bei dem Übergang von der G 1 in die S-Phase des Zellzyklus das cdc37 Protein exprimieren. Die erfindungsgemäßen Antikörper vermögen zwischen dem cdc37-Nukleinsäure Heteromer in Tumorzellen und dem cdc37 Protein normalen Zellen zu unterscheiden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Antikörper und Antiseren, die an cdc37-Nukleinsäure Heteromere zu binden vermögen. Bevorzugter Einsatz ist die Verwendung der Antikörper oder Antiseren oder rekom- binanter Antikörper-ähnlicher Moleküle zur Beseitigung oder Wachstumshemmung für Nachweisreaktionen in einer Biopsie in situ oder in einem Gewebeschnitt oder bei Reaktionen mit Zellsuspensionen oder Körperflüssigkeiten oder von cdc37-Nukleinsäure Heteromeren dieser Zellen in einem Lysat oder in Körperflüssigkeiten oder für die Beseitigung oder Wachstumshemmung dieser Zellen im Gewebe oder in einem Zellgemisch. Die Antikörper oder deren Fragmente oder rekombinante Bindemoleküle können mit Trägern oder Markierungsmolekülen, wie z.B. Proteinen, Zuckern, Sepharose, Enzymen, Farbstoffen, Haptenen oder radioaktiven Ionen, gekoppelt und für geeignete Nachweis-Verfahren eingesetzt werden. Für die Nachweisreaktion stehen eine Vielzahl, an sich bekannte Antigen- Antikörper-Erkennungsreaktionen zur Verfügung, wie z.B. ELISA, RIA, Fluoreszenz-lmmuno-assay oder Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (FACS).
Eine Ausführungsform der Erfindung besteht in der Messung des Gehalts der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere, des cdc37 Protein- Anteils oder der Nukleinsaure des Heteromers in einer mitochondrien-freien Zytoplasma-Fraktion der zu untersuchenden Zelle, bevorzugt aus einer Biopsie, einem Gewebeschnitt oder Zellsuspensionen oder aus einer löslichen Fraktion von Körperflüssigkeiten. Normale Zellen mit physiologischer Proliferationskapazität und reguliertem Zeil-Zyklus enthalten keine derartigen Heteromere in dieser Fraktion, während Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle diese Heteromere unabhängig von der Zellzyklus-Phase in hoher Kopienzahl tragen. Für die Messung des Gehalts der erfindungs- gemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere werden Antigen-Antikörper- Reaktionen oder Nukleinsaure Hybridisierungen bevorzugt. Dem Fachmann stehen jedoch eine Vielfalt von Detektionsverfahren zur Verfügung, wie z.B. ELISA, RIA, Fluoreszenz-lmmuno-assay, FACS Analyse, Nukleinsäure- Hybridisierung im Southern- oder South-Western Blot, PCR usw.
Der Nachweis des Heteromers kann auch durch enzymatische Reaktion des Heteromers mit einem Substrat, bevorzugt unter Spaltung einer Energiereichen Phosphat-Bindung, oder die Bindung an Hyaluronsäure, erfolgen. Das cdc37-Protein-Nukleinsäure Heteromer der Erfindung weist eine Kinase- Aktivität auf oder/und wird (auto)kinasiert und hierauf beruht diese Nachweismethode.
Von besonderer Bedeutung für die Erfindung ist die überraschende Feststellung, daß die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere auf der Zelloberfläche von Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung zu finden sind, jedoch nicht auf der Oberfläche von normalen Zellen mit physiologischer Proliferationskapazität. Daher besteht eine weitere Ausführungsform der Erfindung im Nachweis von Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung durch Verwendung von Reagentien, die die erfindungs- gemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere auf der Oberfläche der Zelle zu identifizieren bzw. zu binden vermögen. Bevorzugt werden hierbei markierte Antikörper, Antiseren, oder rekombinante Polypeptide mit Bindungsspezifität für die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere verwendet. Besonders bevorzugt ist der Nachweis der Zellen in situ oder in einem Zellgemisch unter Verwendung eines erfindungsgemäßen cdc37-Nu- kleinsäure Heteromer-bindenden Antikörpers oder dessen Derivate, der mit einem Farbstoff oder Enzym gekoppelt ist, in einem an sich bekannten Verfahren der Immunfärbung von Biopsien oder histologischen Präparaten, oder Anreicherung von Zellen durch Fluoreszenz- oder Magnet-aktiviertes Zellsortieren.
Die erfindungsgemäßen Antikörper, Antiseren oder rekombinanten antikörper-ähnlichen Moleküle gegen die cdc37-Nukleinsäure Heteromere auf der Oberfläche der Zellmembran können auch für das Aufspüren von Zellen mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung in vivo eingesetzt werden. Bevorzugt ist dabei die Verwendung der erfindungsgemäßen Antikörper oder rekombinanten antikörper-ähnlichen Moleküle oder deren Derivate nach geeigneter Markierung, z.B. mit 99mTc oder 121J, in der Immunszintigraphie oder anderer Bild-gebener Verfahren. Die Antikörper reichern sich in Geweben an dem Ort an, wo Zellen mit gestörter Zellzyklus- Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung vorliegen. Gewebe mit normalen ruhenden oder proliferierenden Zellen (z.B. Gehirn oder Knochenmark) und Zellen in physiologischer Regeneration, z. B. bei der Wundheilung, werden nicht mit dem erfindungs- gemäßen Verfahren markiert. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Antikörper, Nukleinsäuren oder deren Derivate mit anderen detektierbaren oder reaktiven Molekülen oder Atomen, z.B. Proteinen, Zuckern, Enzymen, biologisch wirksamen Mediatoren, Metallkomplexen, radioaktiven Isotopen oder Toxinen, gekoppelt werden und für die Detektion oder/und Zerstörung von Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung eingesetzt werden. Bevorzugt ist die Verwendung von Fusionsproteinen aus einem cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromer-spezifischen Antikörper mit einen zellulären Toxin, z.B. Pseudo- monas Exotoxin, wodurch ein sog. Immun-Toxin generiert wird, das spezifisch an Zellen mit unbegrenzter Proliferation oder Tumorbildung bindet und die Zellen abtötet. Weiterhin ist die Koppelung des Antikörpers mit einem immunologisch wirksamen Protein, z.B. einem Zytokin oder einem Chemokin, möglich, wodurch ein Fusionsprotein generiert wird, das an Tumorzellen bindet und dort Immunzellen zur Tumorzell-Lyse aktiviert.
Die bekannten Immun-Toxine oder Immun-Zytokine sind über ihren Antikörper-Anteil gegen Antigene gerichtet, die fast ausschließlich auf Tumorzellen eines bestimmten Gewebes oder Differenzierungsgrades exprimiert sind. Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle mit Spezifität für cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere gegen eine Vielzahl verschiedener Tumorzellen gerichtet, unabhängig davon, von welchem Gewebe die Zellen abstammen oder welchen Differenzierungsgrad die Tumorzelle aufweist. Die meisten Tumorzellen verlieren mit zunehmender Malignität und Metastasierung eine Vielzahl von Antigenen auf ihrer Oberfläche, wodurch die bekannten Immun-Konjugate ihre Bindung an diese hoch-malignen Zellen und Zellen in Metatasen verlieren. Die erfindungsgemäßen Fusionsmoleküle mit Spezifität für cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere binden dagegen auch an diese hoch-malignen Zellen und Zellen von Metastasen, da die Fusionsmoleküle an ein Molekül binden, das von der Zelle für jede weitere Zellteilung benötigt wird. Dies führt zu einer Wirksamkeit, die derjenigen der bekannten Immun-Konjugate überlegen ist. Es zeigte sich weiterhin überraschenderweise, daß erfindungsgemäße Fc- tragende Antikörper oder deren Derivate mit Bindungsfähigkeit der erfindungsgemäßen cdc37-Nu kleinsäure Heteromere bei Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung eine Zell-Lyse auszulösen vermögen. Die Zell-Lyse erfolgt mit Hilfe der Complement-Aktivierung durch den Fc-Anteil des Antikörper- Moleküls.
Die Erfindung betrifft deswegen auch die Verwendung von Molekülen mit der Fähigkeit zur Bindung der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere für den Einsatz der Lyse von Zellen mit gestörter Zellzyklus- Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung, wobei die Bindemoleküle selbst oder Fusionsprodukte dieser Moleküle mit anderen pharmakologisch wirksamen Substanzen eingesetzt werden.
Weiterhin können Nukleinsäuren dercdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere oder abgeleitete Oligonukleotide dieser Nukleinsäuren für die Hemmung der Proliferation von Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität eingesetzt werden. Bevorzugt werden dazu Teilsequenzen (Oligonukleotide) dieser Nukleinsäuren, die homolog sind zu der Binderegion der Nukleinsaure mit dem cdc37Protein. Diese Oligonukleotide interferieren mit der Nukleinsäure- cdc37Protein Bindung und destabilisieren dadurch das Heteromer. Überraschenderweise zeigte sich, daß die Tumorzelle dabei ihre unbegrenzte Proliferation einstellt, den Zellzyklus verläßt und dem Zelltod unterliegt. Eine besondere Ausführungsform der Erfindung ist somit die Verwendung von Oligonukleotiden und Nukleinsäure-Derivaten, die an die Binderegion der Nukleinsaure mit dem cdc37-Protein der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere binden und destabilisieren, zur Wachstumshemmung und/oder Einleitung des Zelltods der Tumorzelle. Auch andere Substanzen, die die Stabilität des cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromers verändern, können zu diesem Zweck verwendet werden. Überraschenderweise induzieren derartige Substanzen Wachstumshemmung und/oder den Zelltod von Zellen mit gestörter Zellzykluskontrolle, unbegrenz- ter Proliferation und Tumorbildung. Bevorzugt werden hierzu Substanzen, die mit der Heteromer-Bildung durch Bindung der Nukleinsaure oder des cdc37Proteins interferieren. Hierzu werden mehr bevorzugt Peptid- Sequenzen verwendet, die aus der Nukleinsäure-bindenden Region des cdc37Proteins abgeleitet werden, insbesondere aus der cdc37 Proteinse- quenz Aminosäure 62 bis 1 20. Besonders bevorzugt sind die Peptide der Sequenz
CysGlnArgLysLeuLysGluLeuGIuValAlaGluSerAspGlyGInValGluLeuGluArg LeuArgAlaGluCys und der Sequenz CysGluLeuGluArgLeuArgAlaGluAlaGInGInLeuArgLysGluGluArgSerTrpGlu GlnLysLeuGluCys. Es zeigte sich, daß diese Peptide das Wachstum der Tumorzellen inhibieren, jedoch nicht das von normalen Zellen mit physiologischer Proliferation. Auch können geeignete Peptide für diese Anwendung verwendet werden, die über N- und C-terminale Cystein-Reste cyclisiert und/oder deren basische Aminosäuren gegen neutrale Aminosäuren ausgetauscht sind.
Weiterhin werden Substanzen bevorzugt, die die Funktion des cdc37Protein- Nukleinsäure Heteromers in der Kontrolle des G 1 /S Transition des Zellzyklus blockieren, wie z.B. Antibiotika, Fungizide, oder andere physiologische oder synthetische Substanzen.
G emäß der Erfindung werden daher cdc37Protein-Nukleinsäure blockierende oder destabilisierende Substanzen zur Hemmung der Proliferation von Zellen mit unbegrenzter Proliferation und Tumorbildung sowie zur Einleitung des Zelltods dieser Zellen, verwendet. Erfindungsgemäß kann auch eine An- oder Abreicherung von Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung aus einem Zellgemisch mit Hilfe von Reagentien, die die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere zu binden vermögen erfolgen. Dazu können die Antikörper, Antiseren oder rekombinanten antikörper-ähnlichen Moleküle gegen die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere eingesetzt werden. Bevorzugt sind hierzu Verfahren durch Fluoreszenz-aktiviertes Sortieren (FACS) oder Magnet-aktiviertes Sortieren (MACS) . Auch können die Antikörper oder deren Derivate mit Reaktivität gegen die erfindungs- gemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere für die Entfernung von Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung aus einer Zellsuspension oder einem Gewebe eingesetzt werden, bevorzugt für ein " Purging" von Transplantaten, z.B. von autologen Knochenmarkstransplantaten. Bevorzugt werden Antiköper oder deren Derivate mit Bindungs- domäne für die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere an eine Matrix gebunden, das Zellgemisch mit dieser Matrix inkubiert und die nichtgebundenen Zellen chromatographisch eluiert. Es zeigte sich, daß mit Hilfe dieses Verfahrens Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung aus einem Zellgemisch normaler Zellen sehr effizient entfernt werden können, unabhängig davon, von welchem Gewebe die Tumorzelle abstammt oder welchen Differenzierungsgrad, Proliferations- status oder Malijnität die jeweilige neoplastisch transformierte Zelle in diesem Zellgemisch hat. Als Zellgemische werden bevorzugt peripheres Blut, Knochenmark, oder andere Körperflüssigkeiten verwendet. Dieses Verfahren ist in einer bevorzugten Anwendungsform für die Befreiung von Blut, Knochenmark oder anderen Körperflüssigkeiten von Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung geeignet.
Es zeigte sich weiterhin überraschenderweise, daß die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere von Zellen mit unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung sezerniert werden. Die cdc37- Nukleinsäure Heteromere können daher z.B. im Kulturüberstand von Tumorzellen oder auch im Blut, Knochenmark, Serum, Plasma, Liquor, Urin oder anderen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Daher können menschliche und tierische Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, unbegrenzter Proliferationskapazität oder der Fähigkeit zur Tumorbildung durch Nachweis der erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere in Körperflüssigkeiten oder in zellfreien Überständen oder Filtraten nachgewiesen werden.
Die cdc37-Nukleinsäure Heteromere werden bevorzugt mit Hilfe von Antikörpern, die die Heteromere binden, nachgewiesen, wobei die erfindungsgemäß isolierten cdc37-Nukleinsäure Heteromere als Standard mitgeführt werden können. Jedoch sind auch Kombinationen der Verfahren möglich, bevorzugt eine Anreicherung mit Hilfe eines Antikörpers mit
Bindungsspezifität für die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere und Detektion mit einem zweiten Antikörper oder mit Hilfe von
Nukleinsäuren, die das cdc37 Molekül oder die Nukleinsaure des cdc37-
Nukleinsäure Heteromers zu binden vermag, oder mit Hilfe eine enzymati- schen Reaktion, die von dem erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure
Heteromer selbst ausgeht, z. B. die Spaltung einer Energie-reichen Phosphat- Bindung eines Substrats.
Die Empfindlichkeit des Verfahrens kann noch weiter dadurch gesteigert werden, indem die assoziierte Nukleinsaure der cdc37-Nukleinsäure Heteromere durch Hybridisierung mit geeigneten Nukleinsäure-Sonden detektiert oder enzymatisch, bevorzugt durch Polymerase-Ketten-Reaktion (Mullis und Fallona, Meth. Enzymol. 1 55: 335-350, 1 987; Saiki et al., Science 239: 487-491 , 1 988) unter Verwendung von Sequenz-spezifischen oder raπdom-Sequenz Oligonukleotiden als Primer, amplifiziert wird . In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden daher die cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere aus einem Lysat einer Biopsie oder aus Körperflüssigkeiten oder Zellüberständen mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers angereichert und anschließend wird die assoziierte Nukleinsaure enzymatisch vermehrt.
Die beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung eignen sich zum Nachweis maligner und benigner Tumore oder deren Vorstufen oder von Zellen mit gestörter Zellzyklus-Kontrolle, wobei die Zellen einer Biopsie, eines Gewebeschnittes oder Zellen oder deren Lysate oder sezernierte Komplexe aus Körperflüssigkeiten von Menschen oder Tieren als Probenmaterial eingesetzt werden. Die beschriebenen Verfahren eignen sich ebenso zum Auffinden und Lokalisieren solcher Zellen in vitro und in vivo. Weiterhin können diese Verfahren in entsprechend abgewandelter Form zur Isolierung der Zellen aus einem Zellgemisch oder zu ihrer An- oder Abreicherung und Eliminierung aus einem Zellgemisch eingesetzt werden. Schließlich können Antikörper oder rekombinante Moleküle mit Bindungs- spezifität für die erfindungsgemäßen cdc37-Nukleinsäure Heteromere für die Eliminierung der Zellen in vivo und in vitro eingesetzt werden, wobei die Antikörper oder rekombinanten Moleküle alleine oder als Fusions-Produkte mit anderen bioaktiven Molekülen eingesetzt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Isolierung von cdc37 -Nukleinsaure Heteromeren aus MCF- 7 Mamma Carcinom Zellen.
MCF-7 Mamma-Carcinom-Zellen (ATTC HTB22) wurden in Gegenwart von 50 mM Tris-HCI, pH 7,2, 1 0 mM EDTA, 1 , 5 mM MgCI2 durch mehrmaliges Einfrieren und Auftauen lysiert und die Zellkerne anschließend durch 30minütige Zentrifugation bei 6000 x g sedimentiert. Die Mitochondrien wurden aus dem Überstand mit Hilfe eines Sucrosegradienten (J. Biol. Chem. 249: 76991 - 1 995, 1 974) abgetrennt. Die Mitochondrien-freie Fraktion wurde mit RNase A (20 /jg/ml) und RNase T1 ( 1 000 U/ml) 30 min bei 37 ° C, anschließend 20 Min bei 60°C mit Proteinase K ( 1 00 μg/ml) inkubiert. Diesem Ansatz wurde SDS (ad 0,4% SDS w/v) und NaCI (ad 4 M NaCI) hinzugesetzt, 60 min auf Eis gekühlt und anschließend 20 min bei 6000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde in Phenol (neutralisiert mit Tris- HCI, pH 7,2) und anschließend in Chloroform/Isoamyalkohol (24: 1 v/v) extrahiert. Die cdc37Protein-Nukleinsäure-Heteromere konzentrieren sich dabei in der organisch-wässrigen Interphase. Diese Interphase wurde entnommen, die cdc37-Nukleinsäure Heteromere durch Zugabe von 2 vol Ethanol gefällt und in 0, 1 mM EDTA, 1 mM Tris-HCI, pH 7.2 resuspendiert.
Die cdc37-Nukleinsäure Heteromere wurden in einem nativen Agarose- (0,7 %) oder Polyacrylamid (4%)-Gel aufgetrennt, wobei die Heteromere aus MCF-7 Zellen die Wanderungsgeschwindigkeit einer Protein-freien DNS der Größe von 100 - 500 bp zeigen. In einem denaturierenden SDS-Poly- acrylamid-Gel wandern diese cdc37-Nukleinsäure Heteromere bei ca. 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD.
Beispiel 2
Molekulare Klonierung der Nukleinsaure der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere aus Tumorzellen.
Die cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere (aus Beispiel 1 ) wurden in Gegenwart von Proteinase K (500 //g/ml) und 0, 1 % SDS für 1 0 Std. bei 60°C inkubiert. Dieser Ansatz wurde einer erneuten Extraktion in Phenol und anschließend in Chloroform/Isoamylalkohol unterzogen. Die aus dem cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromer freigesetzte DNS sammelte sich dabei in der wässrigen Phase der Extraktion. Die DNS wurde mit Ethanol gefällt und in 1 0 mM Tris-HCI, pH 7, 2, 1 mM EDTA gelöst.
Zur Klonierung wurde die DNS (ca. 20 ng) der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere einer "Auffüllreaktion" durch Klenow-Polymerase ( 1 0 U) in Gegenwart von 1 0 mM Tris-HCI, pH 7, 6, 6 mM ß-Mercaptoethanol, 50 mM NaCI, 1 0 mM MgCI2 und je 0, 1 mM TTP, dATP, dCTP, dGTP unterzogen. Anschließend erfolgte eine Klonierung in die DNS des Smal-geschnittenen pUC 1 9 Vektors in Gegenwart von 1 0 U T4 DNA Ligase. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde in E.coli K1 2 Bakterien transformiert. Es wurden 4 unabhängige Plasmid-Klone erhalten (pMCF-7) . Diese Plasmid- Klone enthalten inserierte DNS-Sequenzen, die den Nukleinsaure Anteil der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere repräsentieren und geeignet sind für den Nachweis von neoplastisch transformierten Zellen. Analog zu diesem Vorgehen wurden die Nukleinsäure-Sequenzen der cdc37Protein-Nu- kleinsäure Heteromere aus Colon-Carcinom-, Hodgkin-Lymphom-, Melanom- Zellen sowie Zellen der akuten myeioischen Leukämie gewonnen. Die DNS- Sequenzen sind in SEQ ID NO 1 gezeigt.
Beispiel 3
Gewinnung von Antikörper gegen cdc37-Nukleinsäure Heteromere.
Maus Ehrlich-Aszites Tumor Zellen (ATCC CCL77) und Mensch MCF-7 (ATCC HTB22) Mamma Carcinom Zellen tragen in ihrem Zytoplasma cdc37- Nukleinsäure Heteromere, während in normalen embryonalen Maus Fibroblasten diese Heteromere nicht nachgewiesen werden konnten. Gesucht ist ein Antikörper, der spezifisch sowohl die Maus- als auch die Mensch-cdc37-Nukleinsäure Heteromere aus Tumor Zellen bindet, jedoch nicht mit normalen Zellen reagiert.
Die cdc37-Nukleinsäure Heteromere werden aus Maus Ehrlich-Aszites Tumor Zellen (ATCC CCL 77) nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gewonnen. Cdc37-Nukleinsäure Heteromere mit einem Anteil von ca. 100 ng assoziierter DNS (gelöst in 50 μ\ PBS und versetzt mit Freundschem Adjuvanz) werden in eine Balb/c Maus s.c. injiziert. Zweitinjektionen mit derselben Menge Antigen ("booster-Injektionen") ohne Adjuvanz erfolgten am Tag 32 und am Tag 54 nach Erstinjektion. Am Tag 62 wurden ca. 500 μ\ But entnommen für die Gewinnung von Antiserum ( "anti-cdc37-Nukleinsäure Heteromer Antiserum") für weitere Analysen.
Am Tag 62 nach Injektion wurde die Milz der immunisierten Maus gewonnen, die Milz-Lymphozyten isoliert und zur Herstellung von Hybridomen mit Zellen der Myelom-Linie X3-Ag8.653 mit Hilfe von Polyethylen- glycoll fusioniert (Köhler G. und Milstein C. Nature 256: 495 - 497, 1 975; Köhler, G. (Hsg.) Hybridoma techniques. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1 980) . Die Selektion der enstandenen Hybridom- Zellen erfolgte in Gegenwart von HAT-Selektionsmedium ( 1 0"4 M Hypoxanthin, 4x 1 0"7 M Aminopterin, 1 ,6 x 1 0"5 M Thymidin in RPMI 1 640 Medium) . Am Tag 5 nach Fusion wurden die Zellen in "limiting dilution" Kulturen in Mikrotiter-Platten mit ca. 50- 1 00 Zellen pro well ausgesät. Am Tag 28 und am Tag 35 nach Fusion wurden die Überstände von ca. 400 Kulturen hinsichtlich Antikörper abgesucht, die mit cdc37-Nukleinsäure Heteromere in Tumorzellen reagieren.
Dazu wird wie folgt vorgegangen: Maus Ehrlich Aszites Zellen, Maus embryonale Fibroblasten (als negative Kontrolle) und Mensch MCF-7 Mamma Carcinom Zellen (ca. 1 00 Zellen pro Loch einer "Terasaki"- Mikrotiter-Platte) werden jeweils mit dem Überstand der Hybridom-Kultur (ca. 1 0 μ\ pro Loch, Überstand 1 : 100 verdünnt in PBS) 1 Std. bei 37 °C inkubiert, anschließend zweimal mit PBS gewaschen und anschließend 1 Std. mit einem Peroxidase-gekoppelten Antikörper gegen Maus-Immunglobu- line (anti-Maus-lg Antikörper) bei 37 °C inkubiert. Nach erneutem Waschen und der Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat AEC wurden in 6 aus ca. 400 Überständen Antikörper gefunden, die mit dem Zytoplasma von Maus Ehrlich Aszites Tumor und Mensch MCF-7 Carcinom-Zellen reagieren, nicht jedoch mit normalen embryonalen Fibroblasten.
Die Hybridom-Zellen dieser Kulturen wurden durch "limiting dilution" und schließlich durch Einzelzell- Aussaat subkloniert. Dabei wurden insgesamt ca. 300 Kulturen angelegt, deren Überstände am Tag 24 mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens nochmals hinsichtlich reaktiver Antikörper abgesucht wurden. Hybridom-Zellen mit reaktiven Überständen wurden nochmals subkloniert. Dabei wurde ein stabiler Hybridom-Klon ("3D6") erhalten, der monklonale Antikörper mit Spezifität gegen Maus- und Mensch cdc37-Nukleinsäure Heteromere aus Tumorzellen zeigt, jedoch nicht mit normalen Zellen reagiert.
Beispiel 4
Verwendung des cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromer-spezifischen Antikörpers 3D6 zum Nachweis von Tumorzellen in einem Zell-Lysat.
Tumorzellen sollen in einem Gemisch mit normalen Zellen nachgewiesen werden. Da der Gewebeerhalt häufig für histologische Analysen unzurei- chend ist, soll in diesem Beispiel demonstriert werden, Tumorzellen in einem Zell-Lysat nachzuweisen.
Die Mensch Mamma Carcinom Linie MCF-7 (ATCC HTB22) und menschliche normale Hautfibroblasten werden in Gegenwart von 50 mM Tris-HCI, pH 7, 2, 1 0 mM EDTA, 3 mM MgCI2, 0,2% NP40 lysiert. Zelltrümmer, Zellkerne und andere Organellen werden durch Zentrifugation bei 8.000 x g, 2 min abgetrennt. Der Überstand (entsprechend ca. 1 04 Zellen) sowie isolierte cdc37Protein-Nukleinsäure heteromere (als positive Kontrolle) werden in Gegewart von SDS denaturiert, in einem 1 2, 5%igen SDS Polyacrylamid Gel elektrophoretisch aufgetrennt und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose Membran übertragen. Die Membran wird in TBS (20 mM Tris, 1 37 mM NaCI, pH 7,6) 3 % Tween 20, 5 % (w/v) Trockenmilchpulver für 1 Std. inkubiert, anschließend der anti-cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromer- spezifische Antikörper 3D6 ( 1 : 1 00 Hybridomüberstand) hinzugegeben und nochmals 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membran wird in TBS, 3% Tween 20 gewaschen und 1 Std. mit dem Peroxidase gekoppelten anti- Maus-Ig Antikörper inkubiert. Anschließend wird die Membran nochmals in TBS, 3% Tween 20 gewaschen, mit dem Detektionsreagenz ECL (Amersham) inkubiert und eine Autoradiographie angefertigt.
Ergebnis:
Der monoklonale Antikörper 3D6 erkennt im Western Blot spezifisch die Banden der cdc37-Nukleinsäure Heteromere (ca. 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD bei Mensch Tumorzellen) in dem Zell-Lysat der MCF-7 Mamma Carcinom Zellen und der isolierten cdc37-Nukleinsäure Heteromere (positiv Kontrolle), reagiert jedoch nicht mit dem zytoplasmatischen Proteinlysat aus normalen Mensch-Fibroblasten. Beispiel 5
Markierung von menschlichen Tumor-Zellen in einem Gewebeschnitt mit Hilfe des monoklonalen Antikörpers 3D6 mit Spezifität für cdc37-Nu- k leinsäure Heteromere.
Aufgabe ist es, Tumorzellen eines malignen Meianoms in einem Gewebeschnitt einer Biopsie aufzuzeigen. Dazu wurden Kryostat-Schnitte einer Gewebebiopsie hergestellt und mit Aceton/Methanol fixiert. Die endogenen Peroxidasen wurden durch Inkubation mit 1 % H202 (v/v) in 40% Metha- nol/60% PBS für 1 5 min blockiert, die Schnitte anschließend gewaschen und 1 0 Min mit 0,2% Triton X- 1 00 in PBS inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Schnitte mit bovinem Serumalbumin (3% w/v in PBS) für 1 Std. inkubiert und erneut gewaschen. Anschließend erfolgte die Inkubation mit dem anti-cdc37-Nukleinsäure Heteromer-spezifischen Antikörper 3D6 ( 1 : 1 0 verdünnter Hybridomüberstand in PBS) für 2 Std bei Raum-Temperatur. Als Kontrollen dienten "Schein-Inkubationen" mit Puffer ohne Antikörper und Inkubation mit einem anti-TAG72 Antikörper (B72-3) mit Spezifität für das TAG72 Antigen, das auf Zellen des Gastrointestinal- trakts, nicht jedoch auf Melanozyten oder auf Zellen der Epidermis exprimiert ist. Die Schnitte wurden anschließend viermal mit PBS gewaschen und mit einem Peroxidase-gekoppeiten Ziege anti-Maus-lgG(H + L) Antikörper (Dianova, Hamburg) ( 1 :50 in PBS) 1 Std bei Raum-Temperatur inkubiert. Nach viermaligem Waschen erfolgte die Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat AEC für 20 Min. Die Zellkerne wurden mit Hämalaun gefärbt.
Ergebnis:
Die Zellen des malignen Meianoms reagierten in ihrem Zytoplasma mit dem cdc37-Nukleinsäure Heteromer-spezifischen Antikörper 3D6 während der Zellkern der Melanom-Zellen nicht mit dem 3D6 Antikörper reagiert. Die das Melanom umgebenden normalen Zellen sowie die Zellen der normalen Epidermis zeigen keine Färbung mit dem 3D6 Antikörper. Infiltrierende Tumorzellen in dem Normalgewebe werden durch Anfärbung mit dem 3D6 Antikörper identifiziert. Kontrollmarkierungen ohne 3D6 Antikörper zeigen keine spezifischen Färbungen, ebenso nicht Reaktionen mit dem anti-TAG72 Antikörper.
Beispiel 6
Nachweis von cdc3 -Nukleinsaure Heteromere auf der Zelloberfläche von Tumorzellen
Aufgabe ist es, an lebenden Zellen cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere auf der Zelloberfläche zu detektieren. Die intakte Zellmembran der lebenden Zellen verhindert ein Eindringen der Antikörper in die Zelle während tote Zellen den Antikörper eindringen lassen. Tote Zellen werden durch Färbung mit Propidiumjodid erkannt und in dem anschließenden Meßverfahren ausgegrenzt.
Menschliche MCF-7 Mamma Carcinom Zellen (A) und normale menschliche Fibroblasten (B) werden in PBS gewaschen, in jeweils 4 Ansätze geteilt und mit folgenden Reagentien für 30 min bei Raum-Temperatur inkubiert: ( 1 ) anti-cdc37-Nukleinsäure Heteromer-spezifischer Antikörper 3D6 (Hybridom-Überstand 1 : 1 00 in PBS)
(2) anti-TAG72 spezifischer Antikörper B72-3 (Hybridomüberstand 1 : 1 00 in PBS)
(3) PBS ohne Antikörper (4) PBS ohne Antikörper
Die Zellen wurden in PBS gewaschen und die Ansätze ( 1 ), (2) und (3) anschließend mit einem FITC-gekoppelten anti-Maus-IgG Antikörper (Dianova, Hamburg) ( 1 :500) für 30 min bei Raum-Temperatur inkubiert. Die Zellen wurden nochmals in PBS gewaschen und mit Hilfe der Fluoreszenzaktivierten Zeil-Sortierung (FACS) analysiert (FACscan, Fa. Becton- Dickinson, Mountain View, Cal.) . Dabei wurden durch die Konfiguration geeigneter Meßfenster ("gates") tote Zellen aus der Analyse ausgeschlossen, so daß die gewonnenen Signale ausschließlich von lebenden Zellen mit intakter Oberflächen-Membran stammen.
Ergebnis:
MCF-7 Mamma Carcinom Zellen des Ansatzes ( 1 ) zeigten ein FITC- Fluoreszenz-Signal. Zellen der Ansätze (2) und (3) zeigten eine um den Faktor 5-1 0 schwächere Hintergrund-Fluoreszenz, die dieselbe Stärke wie der Kontroll-Ansatz (4) ohne Sekundärantikörper aufweist und die "Eigen- fluoreszenz" der Zellen anzeigt. Die Markierung in Ansatz ( 1 ) zeigte, daß MCF-7 Zellen spezifisch von dem 3D6 Antikörper markiert wurden, nicht jedoch durch einen Kontroll-Antikörper (B72-3) , der mit einem Antigen reagiert, das nicht auf MCF-7 Zellen exprimiert wird. Normale menschliche Fibroblasten zeigten im Gegensatz zu MCF-7 Zellen in dem Ansatz ( 1 ) ausschließlich Hintergrundfluoreszenz, ebenso wie in den Ansätzen (2), (3) und (4) . Daraus ist zu schließen, daß 3D6 Antikörper reaktive cdc37-Nukleinsäure Heteromere auf der Oberfläche von MCF-7 Mamma Carcinom Zellen, nicht aber auf der Oberfläche von normalen Fibroblasten exprimiert sind.
Beispiel 7
Nachweis von cdc37 -Nukleinsaure Heteromeren im Serum von Tumorpatienten.
Von jeweils zwei Patienten mit Mamma Carcinom und mit Melanom sowie von zwei gesunden Spendern wurde Blutserum gewonnen und 2 μ\ des Serums jeweils mit DNasel ( 1 0 U, 1 Std., 37 °C) oder mit Proteinase K ( 1 0 μg, 1 Std, 60°C) inkubiert. Unbehandeltes sowie DNasel- oder Proteinase- behandeltes Serum wurde in Gegenwart von SDS (0, 1 % w/v) 2 min bei 90°C inkubiert, in einem SDS-Polyacrylamid Gel elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend elektrophoretisch in Gegenwart von 50 mM Tris, 380 mM Glycin, 0, 1 % (w/v) SDS, 20% Methanol auf eine Nitrozel- lulose-Membran übertragen. Die unspezifische Bindung der Membran wurde durch Inkubation mit 5% (w/v) Trockenmilch-Pulver in TBS (20 mM Tris, 1 37 mM NaCI, pH 7,6) 3% (v/v) Tween 20 für 1 Std bei Raumtemperatur blockiert. Die Membran wurde anschließend mit dem cdc37Protein- Nukleinsaure Heteromer spezifischen Antikörper 3D6 ( 1 : 1 00 Hybridomüber- stand in Blockierungspuffer) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, dreimal gewaschen und mit einem Perxidase gekoppelten Schaf anti-Maus Ig (Amersham) ( 1 :200) für 1 Stunde inkubiert. Nach viermaligem Waschen wurde der gebundene Antikörper durch Reaktion der Peroxidase mit dem ECL Detection Reagent (Amersham) und anschließender Autoradiographie auf einem Röntgenfilm nachgewiesen.
Ergebnis:
In den Seren der Patienten mit Mamma Carcinom und mit Melanom detektiert der 3D6 Antikörper Banden mit dem relativen Mr ca. 37 kD, 48 kD, 82 kD, 90 kD, zeigt jedoch keine Reaktion mit Seren der gesunden Probanden. Das detektierte Mr entspricht der relativen Wanderungsgeschwindigkeit der isolierten cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere. Die 3D6 Antikörper reaktiven Banden im Serum der Tumorpatienten sind durch Vorinkubation des Serums sowohl mit DNasel als auch mit Proteinase K abbaubar. Dieses zeigt, daß die detektierten Banden Material enthält, das sowohl aus Protein und aus DNS besteht.
Beispiel 8 Anreicherung von Tumorzellen aus einem Gemisch normaler Zellen mit Hilfe des A n tikörp ers 3D 6 mit Sp ezifität für cdc37 Pro tein-Nuk/einsäure Heteromere.
Zur Demonstration der Anreicherung von Tumorzellen aus einem Gemisch mit normalen Zellen werden SK-Mel5 Zellen eines malignen Meianoms zu
1 06 normalen menschlichen Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBL) in folgenden Mischungsverhältnissen gegeben: Sk-Mel5 : PBL 1 : 1 0, 1 : 1 00, 1 : 1 .000, 1 : 1 0.000, 1 : 1 00.000. Die Sk-Mel5 Melanom-Zellen exprimieren das HMW-MAA ("high molecular weight melanoma associated antigen") auf der Oberfläche und können mit einem anti-HMW-MAA Antikörper nachgewiesen werden. Dieses ermöglicht die Detektion der Melanom-Zellen in der Population normaler Zellen unabhängig von dem verwendeten Verfahren. Normale menschliche Lymphozyten exprimieren dieses Antigen nicht.
Das Zellgemisch (ca. 1 06 Zellen in 1 ml PBS) wurde mit dem Antikörper 3D6 (200μg gereinigter Antikörper) 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert, viermal mit PBS gewaschen und anschließend mit einem anti-Maus-lg Antikörper
(ca. 50 μg), der paramagnetisch markiert ist (Fa. Miltenyi, Bergisch-
Gladbach), nochmals 1 Std. inkubiert. Die Zellsuspension wird viermal gewaschen, anschließend auf eine 20 ml-Trenn-Säule gegeben (Miltenyi) gegeben und einem hohen magnetischen Feld ausgesetzt. Die Säule wird mit dem 1 0fachen Volumen PBS gewaschen, um die nicht-markierten Zellen zu entfernen (Durchfluß-Fraktion) . Die Säule wird sodann aus dem magnetischen Feld entfernt und die markierten Zellen werden eluiert. Die
Anzahl HMW-MAA + Tumorzellen in den jeweiligen Fraktionen wird mit Hilfe des anti-HMW-MAA Antikörpers 763.74 bestimmt. Das Ergebnis der FACS
Analyse ist in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1
Aniahl der Zellen Anicil SK-Mcl5 Anzahl Sl.-Mcl5 Zellen Anteil SK-Mel5 Anreicherung.
im Zellpcmisch Zellen im IGcsamαcIliahl aller Zellen) Zellen in öer fa or
Zellgemisch in der Durchfluß- Eluai- Eluai Fraktion
FBL Sk-Mel5 Fraktion
ιoc ιo- 95 ±. 53 8.5*1.7 x I0 0.315 3 , 15
0.1
|2.7*.0.8 x I05] ιo< 10 9.3*1.9 i I03 0.216 21. «
10" 0.01
|4.3*.l.l x I04] ιol ιo- 10-3 _ 10 7.6i.2.S x I02 0.042 4 2
|I.S*0.4 x 104)
I0ς ιo- 10-* _ ιo 43*.39 0.019 1 9 0 [2.2-0.3 x I03)
10c I01 10-5 10 < 10
12.6*0.3 x I03)
I0C 10 < 10
|2.8*.0.4 x I03
10- 70 _ 4E 1.9 _ 1.5 x 10*
Die Meßgrenze des Verfahrens liegt bei ca. 10 Zellen bei 5000 Zählereignissen pro Messung.
Angegeben sind Mittelwerte ±_ Standardabweichung von 6 Versuchsdurch- führungen.
Beispiel 9
Befreiung eines Zellgemisches von Tumorzellen mit Hilfe des Festphasen- gebundenen Antikörpers 3D6 mit Spezifität für cdc37 Protein-Nukleinsäure Heteromere. Dieses Beispiel wurde wie Beispiel 8 durchgeführt, die Trennung jedoch mit Hilfe des Festphasen-gekoppelten Antikörpers 3D6 durchgeführt.
Zur Demonstration der Reinigung von Tumorzellen aus einem Zellgemisch werden SK-Mel5 Zellen eines malignen Meianoms zu 1 06 normalen menschlichen Lymphozyten aus dem peripheren Blut (PBL) in folgenden Mischungsverhältnissen gegeben: Sk-Mel5 : PBL 1 : 1 0, 1 : 1 00, 1 : 1 .000, 1 : 1 0.000, 1 : 100.000. Die Sk-Mel5 Melanom-Zellen exprimieren das HMW- MAA ("high molecular weight melanoma associated antigen") auf der Oberfläche und können mit einem anti-HMW-MAA Antikörper nachgewiesen werden. Normale menschliche Lymphozyten exprimieren dieses Antigen nicht.
Der Antikörper 3D6 (2 mg gereinigtes Protein) wurde an CNBr-aktivierte Sepharose (0, 5 ml) (Pharmacia) gebunden und die Sepharose anschließend in PBS, 0,2% (w/v) Trockenmilchpulver gewaschen. Das Zellgemisch (ca. 106 Zellen in 1 ml PBS) wurde auf eine Säule mit 3D6 Antikörper-gekoppelter Sepharose (0, 5 ml) gegeben und l Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Säule viermal mit dem 1 0fachen Volumen PBS gewaschen, um die nicht-gebundenen Zellen zu entfernen (Durchfluß- Fraktion) . Die gebundenen Zellen wurden in Gegenwart von 2 M MgCI2, 1 0 mM NaP04, pH 7,2, eluiert. Die Anzahl HMW-MAA+ Tumorzellen in den jeweiligen Fraktionen wurde mit Hilfe des anti-HMW-MAA Antikörpers 763.74 bestimmt und die Effizienz der Reinigung (Abreicherungsfaktor) bestimmt. Die Ergebnisse der FACS Analyse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Tabelle 2
Anzahl der Zellen Anzahl Sk-Mel5 Zellen Abreicherungs- im Zeil gemisch in der Durchfluß-Fraktion faktor PBL Sk-Mel5
[M] [N] [ M IN ]
lθ6 105 345 + 93 289
106 104 114 + 29 87
106 103 < 10
106 102 < 10
106 101 < 10
106 0 < 10
0 105 169 + 76
Die Meßgrenze des Verfahrens liegt bei ca. 10 Zellen bei 5000 Zähler¬ eignissen pro Messung.
Angegeben sind Mittelwerte __ Standardabweichung von 4 Versuchsdurch¬ führungen.
Beispiel 10
Nachweis von cdc37 Protein-Nukleinsäure Heteromere mit Hilfe der Nuk/einsäure-in situ Hybridisierung
Zellen der menschlichen Mamma Carcinom Linie MCF7 (ATCC HTB22) (A) und primäre Hautfibroblasten (Passage 12) (B) wurden auf Objektträgern kultiviert. Mehr als 90% der Zellen beider Kulturen proliferieren, wobei die
MCF-7 Zellen ein unbegrenztes Proliferationspotential haben, primäre menschliche Hautfibroblasten aber ihre Proliferation nach ca. 1 5 -20 Passagen in vitro einstellen, altern und sterben. Weiterhin wurde durch subkutane Injektion von MCF-7 Zellen in Balb/c Mäusen ein solider Tumor erzeugt, ein Gefrierschnitt von diesem Tumor angefertigt und auf einen Objektträger übertragen (C) .
Die Objektträger wurden zweimal kurz mit PBS gewaschen, zur Fixierung mit 200 μ\ Paraformaldehyd-Lösung (5% v/v) 5 Min überschichtet und anschließend zweimal in 70%igem Ethanol gewaschen. Zum Nachweis der Zellen mit unbegrenztem Proliferationspotential wurde die in SEQ ID NO 1 gezeigte DNS-Sequenz verwendet. Diese DNS-Sequenz istder Nukleinsäure- Anteil der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere aus MCF-7 Zellen und wurde durch molekulare Klonierung wie in Beispiel 1 a beschrieben gewonnen. Die DNS-Sequenz ist in die S al Schnittstelle des Vektors pUC 1 9 kloniert. Durch Restriktionsspaltung der DNS mit Smal wurde das 221 bp große MCF-7/sml DNS Fragment aus dem Vektor freigesetzt. Das Fragment wurde in einem Agarose-Gel elektrophoretisch von der pUC1 9 Vektor DNS (2,7 kb) getrennt, eluiert und mit Ethanol gefällt. Die MCF- 7/sm 1 DNS ( 1 _J/g DNS) wurde denaturiert und mit Hilfe der Klenow Polymerase ( 1 U) in Gegenwart von 1 0 mM Tris-HCI, pH 7,6, 6 mM ß- Mercaptoethanol, 50 mM NaCI, 1 0 mM MgCI2 und 0,2 mM Digoxigenin-1 1 - dUTP (Dig-dUTP) (Boehringer Mannheim), je 0, 1 mM dATP, dCTP, dGTP und Hexanukleotiden einer Zufallssequenz als Primer (Boehringer Mannheim) durch Inkubation bei 37 °C für 2 Std markiert. Nicht-eingebaute Nukleotide wurden durch Filtration durch eine Sepharose G50 Säule (Pharmacia) abgetrennt.
Zur in situ Hybridisierung wurden die Objektträger mit den fixierten Zellen oder Gewebeschnitten mit 200 μl Hybridisierungslösung (50% deionisiertes Formamid, 4 x SSC, 10% Dextransulfat, 1 x Denhardts-Lösung, 0,25 mg/ml denaturierte tRNS, 0, 5 mg/ml denaturierte Heringssperma DNS) überschichtet. Die Lösung wurde mit Deckgläschen auf dem Objektträger abgedeckt und 1 Std. bei 42°C in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wurde die Lösung entfernt, die Zellen mit Dig-dUTP markierter MCF-7/sm1 DNS (200 ng DNS in 40 μl Hybridisierungsslösung) überschichtet und über Nacht bei 42 °C inkubiert. In einem Kontrollexperiment ( "Scheinhybridisierung") wurde die Hybridisierung ohne Digoxigenin- markierte DNS-Probe durchgeführt. Schließlich wurden die Objektträger zweimal 20 Min. in 2 x SSC bei 42°C gewaschen. Zum Nachweis der hybridisierten DNS-Probe wurden die Zellen mit einem FITC-gekoppelten anti-Digoxigenin-Antikörper (Boehringer Mannheim) 20 Min bei Raumtempe- ratur inkubiert. Nicht-gebundene Antikörper wurden durch zweimaliges Waschen in PBS entfernt. Die Auswertung der Präparate erfolgte mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie bei 470 nm Anregungswellenlänge.
Ergebnis: (A) Die MCF-7 Tumorzellen zeigen starke, distinkte Fluoreszenzsignale im Zytoplasma, während der Kern keine Fluoreszenz aufweist. In dem Kontrollexperiment ("Scheinhybridisierung") waren keine Fluoreszenzsignale nachweisbar.
(B) Nach Hybridisierung primärer menschlicher Haut-Fibroblasten wurde keine Markierung der Zellen erhalten.
(C) Nach Hybridisierung des Gewebeschnitts des durch MCF-7 Zellen induzierten Tumors zeigen ausschließlich die Tumorzellen eine Fluoreszenz, während das umgebende normale Bindegewebe, das Subkutangewebe und die Epidermis keine Signale zeigen. Die Hybridisierungssignale der Tumor- zellen sind ebenfalls ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert. In Kontroll- hybridisierungen ("Scheinhybridisierung" und Hybridisierung mit Digoxige- nin-markierter pUC 1 9 DNS) wurde kein Fluoreszenzsignal erhalten.
Die zytoplasmatischen cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere können somit spezifisch in Tumorzellen durch Hybridisierung geeigneter DNS-Proben mit der an die Heteromere assoziierte Nukleinsaure nachgewiesen werden. Die
Durchführung als in-situ Hybridisierung erlaubt die Identifizierung der einzelnen neoplastisch transformierten Zellen in einem Gewebeschnitt oder in einer Biopsie.
Beispiel 1 1 Nachweis von cdc37Preotein-Nukleinsäure Heteromeren mit Hilfe des Antikörpers und der Polymerase-Ketten-Reaktion der assoziierten Nukleinsaure.
Die Zellen der akuten myeloischen Leukämie (AML) enthalten zytoplasma- tische cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere, die mit Hilfe des cdc37Pro- tein-Nukleinsäure Heteromer-spezifischen Antikörpers aus einem Zell-Lysat angereichert werden können und deren Nukleinsaure mit Hilfe der Polyme- rase-Kettenreaktion und Sequenz-spezifischer Oligonukleotide amplifiziert werden kann.
Jeweils 1 04 Zellen einer AML (A) und normaler periphere Blut-Lymphozyten (B) oder ein Gemisch von 1 00 AML Zellen in 1 04 Blutlymphozyten (C) oder von 1 00 normalen menschlichen Fibroblasten in 1 04 Blutlymphozyten (D) wurde hergestellt. Während normale menschliche Lymphozyten des peripheren Bluts ohne Antigen-Stimulierung keine Proliferation zeigen, proliferieren normale Fibroblasten physiologisch, bis sie der Zellalterung nach etwa 50 - 60 Passagen unterliegen. Die Zellen der akuten myeloischen Leukämie zeigen dagegen eine unbegrenzte Proliferation und eine Hemmung des Eintritts in den physiologischen Zelltod. Obwohl die Zellen in vitro nur begrenzt überleben, induzieren sie in vivo einen malignen Tumor und zeigen unbegrenzte Proliferation.
Die Zellen der Ansätze A-D wurden sedimentiert, in 1 00 μl 1 0 mM Tris-HCI, pH 7.2, 1 , 5 mM MgCI2 resuspendiert, sofort bei -20°C eingefroren und wieder aufgetaut. Die Proben wurden durch Zentrifugation bei 2.000 x g für 1 0 Min sedimentiert und der Überstand in ein Loch einer Mikrotiterplatte gegeben, deren Oberfläche mit dem cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromer- spezifischen Antikörper 3D6 beschichtet ist. Nach Inkubation für 1 Std. bei Raumtemperatur wurde die Probe viermal mit PBS, 2% (w/v) bovines Serumalbumin, gewaschen. Auf der Mikrotiterplatte waren nunmehr die cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere aus den Zellen angereichert. Durch diese Anreicherung wurde gewährleistet, daß in dem nachfolgenden Schritt der DNS-Amplifikation nur die DNS der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere als Matrize für die DNS-Polymerase dienen kann, nicht aber die nukleare DNS oder eine andere kontaminierende DNS.
Die Detektion der cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromere erfolgt durch eine spezifische Amplifikation der assoziierten DNS. Besonderer Vorteil ist, daß dieser Vorgang im Anschluß an die Anreicherung ebenfalls auf der Mikrotiterplatte durchgeführt werden kann.
Das Loch mit den angereicherten cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromeren wurde mit Proteinase K ( 100 μg/ml) für 1 Std. bei 55 °C inkubiert und anschließend bei 95 °C für 1 0 Min erhitzt. Anschließend wurde die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) nach bekanntem Verfahren durchgeführt (Mullis und Fallona, Methods Enzymol. 1 55: 335 - 350, 1 987; Saiki et al, Science 239: 487 - 491 , 1 988) . Dabei wurde folgender Ansatz gewählt.
3 μl 1 0x Taq-Puffer (200 mM Tris-HCI, pH 8,4, 250 mM KCI, 0,5% Tween 20, 1 mg/ml BSA); 0, 5 μl 1 00 mM MgCI2; 1 μl dNTP Lösung (2 mM dATP, 2 mM dCTP, 2 mM dGTP, 2mM dTTP); 1 U Taq-DNA Polymerase (Boehringer Mannheim); je 1 00 ng Primer-Oligonukleotide A und B für die Amplifikation der DNS (SEQ-ID NO 1 ) des cdc37Protein-Nukleinsäure Heteromers aus AML Zellen.
Primer Oligonukleotid A:
5 ' ACCGCCTCTCCCCGCGCG3' Primer Oligonukleotid B:
5 ' GCGTTGCTGGCGTTTTTCATA3'
Es wurden 35 Zyklen mit folgendem Temperaturprofil durchgeführt: 1 . 1 x [2 min 95 °C]
2. 35 x [30 sec 55 °C; 90 sec 72 °C; 60 sec 95 °C]
3. 1 x [ 1 5 min 72°C]
Die amplifizierte DNS wird in einem 1 %igen Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und nach Inkubation mit Ethidiumbromid im UV-Licht sichtbar gemacht.
Ergebnis:
Bei der Analyse der Zellen der akuten Leukämie (A) wurde eine DNS von ca. 221 bp Länge amplifiziert, nicht aber bei der Verwendung von normalen menschlichen Lymphozyten (B) . Bei der Verwendung eines Gemischs aus AML Zellen mit normalen Lymphozyten (C) wurde ebenfalls eine Amplifikation der DNS erhalten, nicht aber, wenn die normalen Lymphozyten mit normalen Fibroblasten (D) vermischt waren. Dieser Mischungsversuch von Tumorzellen mit normalen Zellen zeigt, daß mit Hilfe dieses Versuchsansatzes eine Kontamination von Tumorzellen mit unbegrenzter Proliferation in normalen Zellen nachgwiesen werden kann. Der Versuchsansatz wird durch eine Kontamination mit physiologisch proliferierenden Zellen, wie normalen Fibroblasten, nicht gestört.
Diese Versuchsdurchführung zeigt außerdem, daß eine Kontamination mit Zellen eines malignen Tumors auch dann nachgewiesen werden kann, wenn (i) die Zellen in der zu analysierenden Probe nicht mehr intakt sind, sondern ein Lysat der Zellen vorliegt, und (ii) die malignen Zellen ausschließlich in vivo, nicht aber in vitro die Fähigkeit zur Tumorbildung und unbegrenzter Proliferation zeigen. Beispiel 12
Hemmung des Wachstums von Tumorzellen mit Hilfe synthetischer Peptide, die an die Nukleinsaure des cdc37 Protein-Nukleinsäure Heteromers binden.
Zellen der menschlichen Lymphom-Linie L540 (Probe A) sowie normale menschliche Lymphozyten aus dem peripheren Blut (Probe B) wurden jeweils in einer Konzentration von 1 04 Zellen pro 1 00 μl RPMI 1 640 Kulturmedium, 1 0 % (v/v) fötales Kälberserum, in jeweils 4 Löcher einer 96- Loch-Mikrotiterplatte ausgesät. Die normalen Lymphozyten wurden außerdem in Gegenwart von 1 0 μg/μl pokeweed mitogen (PWM) mitogen stimuliert (Probe C) . Die Proben wurden 1 2 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Die Peptide 1 , 2 und 3 wurden mit 2 μl DOTAP "transfection reagent" (Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat.-Nr. 1 81 1 1 77) gemischt und jeweils in das Loch 1 -3 der Proben A-C in der Konzentration von 40 μM Peptid gegeben, in das Loch 4 wurde Puffer /PBS) plus 2 μl DOTAP "transfection reagent" hinzugegeben.
Peptid 1 und Peptid 2 leiten sich von einer N-terminalen Sequenz des cdc37Proteins ab und enthalten die Nukleinsäure-Binderegion des Proteins. Peptid 3 ist eine Peptid-Zufallssequenz gleicher Länge. Die Peptide sind jeweils über ihre N- und C-terminalen Cys-Reste cyclisiert.
Peptid 1 :
CysGlnArgLysLeuLysGluLeuGluValAlaGluSerAspGlyGInValGluLeuGluArg LeuArgAlaGluCys
Peptid 2:
CysGluLeuGluArgLeuArgAlaGiuAlaGInGInLeuArgLysGluGluArgSerTrpGlu
GlnLysLeuGluCys
Peptid 3: CysGluAlaGInValLeuAspAlaLeuValGluGluLysArgGInValSerGluGluLysArg GlnLysGluAlaCys
Die Kulturen wurden 3 Tage bei 37 °C inkubiert und anschließend die Zellvitalität mit Hilfe des XTT-Tests (Boehringer Mannheim, Mannheim, Cat- Nr. 1 46501 5) bestimmt. Dabei wird das Tetrazolium-Salz XTT zu den Zellen gegeben, die XTT mit Hilfe des Succinat-Tetrazolium-Reduktase Systems der mitochondrialen Atmungskette zu Formazan spalten. Der Metabolit kann anschließend photometrisch bestimmt werden. Die Menge des Metaboliten ist proportional der Anzahl lebender Zellen und dient der Abschätzung der Vitalität und Proliferation einer Zellpopulation.
Ergebnis:
L540 Lymphom Zellen (Probe A) zeigen in Gegenwart von Peptid 1 (Loch 1 ) und Peptid 2 (Loch 2) nur 1 5-20 % der XTT-Metabolisierung im Vergleich zu Kulturen in Gegenwart des Kontroll-Peptids 3 (Loch 3) und in der "Leerprobe" ohne Peptid (Loch 4) . Normale menschlihce Lymphozyten aus dem peripheren Blut (Probe B) zeigen in Gegenwart der Peptide (Loch 1 -3) und in der "Leerprobe" dieselbe XTT-Metabolisierung, ebenso die Kulturen (Loch 1 -4) mit Lymphozyten nach mitogener Stimulierung (Probe C) .
Offensichtlich stellen L540 Lymphom Zellen ihr Wachstum in Gegenwart des Peptids 1 und Peptids 2 ein, während ein Kontrollpeptid (Peptid 3) diese Wachstumshemmung nicht auszulösen vermag. Die Proliferation normaler Lymphozyten nach mitogener Stimulierung wird jedoch durch diese Peptide nicht beeinflußt. SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALLGEMEINE ANGABEN:
( i ) ANMELDER :
(A) NAME: Univ. -Prof. Dr. med. Hinrich Ab en
(B) STRASSE: Rhoenstrasse la
(C) ORT: Meudt
(E) LAND: DE
(F) POSTLEITZAHL: 56414
(ii ) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG : Verfahren zum Nachweis , zur Identif izieung , zur Gewinnung oder Beseitigung von mens chl ichen odertieris chen Zel len mit gestoerter
Zel l zykluskontrol l e oder mi t der Faehigkeit zu unbegrenzter Prolifer . .
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN : 121
(iv) COMPUTER- LESBARE FASSUNG :
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 19744335.4
(B) ANMELDETAG: 07-OCT-1997
(vi) DATEN DER URANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: DE 19749118.9
(B) ANMELDETAG: 06-NOV-1997
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1:
{i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 221 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 1:
CGCGCGGGGA GAGGCGGTTT GCGTATTGGG CGCTGTTCCG CTTCCTCGCT CACTGACTCG 60
CTGCGCTCGG TCGTTCGGCT GCGGCGAGCG GTATCAGCTC ACTCAAAGGC GGTAATACGG 120
TTATCACAGA ATCAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC CAGCAAAAGG 180
CCAGGAACCG TAAAAAGGCC GCGTTGCTGG CGTTTTTCAT A 221 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 120 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB3
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2: ATATGTCTTG AAGATGCACT TCCAAGGTCA TGAATGGAAC TCCACCAGCC ACAAAAAGAC 60 CTGCCTATAC CTGGAGTATC GTGCAGTCAG AGTGCTCCGA CTCCTGTGGT GGAGGTAGAT 120
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB2
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 3: AGACCTAAAA CCATAAAAAC CCTAGAGAAA ACCTAAGGCA TTAACCAATT CAGGACATAG 60 GTGGGCAGGA TTAAGTCAAA ACACCAAAAA AATGGCAACA AAAGCCAAAA 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 218 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
AAGACCAATG AGAGACAATG CAGTCGCTGG GACAACCAGA TTGGACCAGG CAGTCAAGGT 60
GGCTTGGAGG CCACAGCGAG AATTAAAATA CACTGAGAGA TTATACTTCA GGATCCTCTA 120
GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTGCTA ATGCATGGTC TCATAGCTGT TTCCTGTGTG 180
AAATTGTTAT TCCTCCTCAC AATTCCACAC AACATACC 218 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 5:
( i) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 184 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB1
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 5:
GGCAACCTAC AGAATGGGAG AAAATTTTTG CAATCTATCA TCTGACAGAG GTCTAATATC 60
AGAATCTAAG AAAAACTTAA ACAAGTTTAC AAGAAAAAAA CAAACAACCC CATAAAAAAG 120
TGGGTGAAGG ATATGAACAG ACAGTTCTCA AAAGAAGACA TTTATGTGGT CAACGAACAT 180
ATGA 184 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 6:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 131 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB5
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 6:
AAGGTAAATT AACTGAAAGT AAAATTGGAA AATGTGGCTA AAAGGGGGGA AAATAATCAA 60
GTTTAAACCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGACAACGTT GGCGTAATCA AGGTCATAGC 120
TGTGTCCTGT G 131 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 7:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 323 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB7
(xi) SEQUENZBEΞCHREIBUNG : SEQ ID NO : 7:
GTCAATCAAT TTTATGAGAA TAGCATTGAA TCTATAAATT ACTTTGGGCA GTATGGCCAT 60
TTTCATGATA TTGATTCTTC CTATCCATGA GGATGGAATG TTTTTCCATT TGTTTGTGTC 120
CTCTCTTATT TCCTTGAGCA GTGGTTTGTA GTTCTCCTTG AAGAGGTCTT TCACATCTCT 180
TCTTACCTGT GTTCTTAGGT ATTTATTCTC TTTGTAGCAG TGGCAAATGG GAGTTTATTC 240 ATGATTGGCT CTCTGCTTGT TATTGTTGAG TAAGGAGTAC TGTGATTTGC ACATGCTTGC 300 ATCTAGACTT ATGAGTGCTA CAG 323
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8 :
(i) SΞQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB9
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 8: ACTGTCACTC AGGCTGGAGG GTAGTTAAAC 30
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 9:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 219 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB11
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 9:
CAGACATGAG CCACCACGCC CGGCCAGGAA TGAATGTTCT ATGCATGAAA CTGTAAACGG 60
CTTATTGCTA TAATTGTCCT AGTTTATTAT TGTTAATTTC TTACTGTACC TAATTTATAA 120
ATTAAGCTTT ATCAGAGGTA TGTATGTATT AGAAAAAATA TAACATATAT AGGATACAGT 180
ACTATCCAGG ATCAGGAATC TACTGGGCAT ACTAGAAAG 219 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 179 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB12
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10: AACTGTAAAC GGCTTATTGC TATAATTATC CTAGTTTATT ATTGTTAATT TCTTACTGTA 60 CCTAATTTAT AAATTAAACT TTATCAGAGG TATGTATGTA TTAGAAAAAA TATAACATAT 120 ATAGGATACA GTACTATCCA TGGTTTCAGG AATCTACTGG GCATACTAGA AAGATCCCC 179 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 234 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB14
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
GGAGCTACAA TTCAAGATGA GATTTGGATC GGGACACTGC CAAACCATAT CATGGGGTTT 60
GTCACTGGCC TGGATGGAAC ATCCTTGTCA AGAGCACACA CACACACACA CACACACACA 120
CACACTTAGA GAGACAGACA AAGAAGAGAG AGAGGAGAGG CACGGTTATA ATGAGGATGG 180
ACAGGTGATT TTGGAAGCTG AGAGTCATTA CTGCCACTGC CAGCTAGGTG TAAT 234 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 269 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB16
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
TGTTATTATA ATTATCAGTC CTGAAACCTG TCTCATCTTA GAAACATAGA TTCTATACAA 60
GTGGCCCTGG AGTGCCTTTT AAGATGTTCT CAGGAGATTT TGGTTGTCTT CTAAACTTTC 120
TGGAAACATC TTGTTCATTT CGTATTCTGG TGGAAACATC TTGTTCATTT CGTATTCTGG 180
ATTTAAAATT AGCTATTTCT CCAAGGAGAT GTCAGCCATT GTGTTTATAC AAACTTGAGT 240
TCCTTTAAGG TTTAACCTTC ATTCAAGAA 269 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 256 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : 17
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
GAAACTGATA AGTTGTTTCT CTAGCTTTTA AAAATACATG GAGTGAGTTC TATAATTCCT 60
CAGGAAGTAA GAGCTGTTCC TTTTGAGCTG AAGAACATAT TGCAATTCCT ATTTCATTGC 120
AGAGATATTT CTCTACTTTA AAATGCTACC CGCTTCTCAT CCACACAAAA ATTGTGAAAC 180
AGAGGGGGCT GGGGCAGTAA GGAAGTTATC AAGAAAGTAA TTCACATTAG GTGAGCTGGA 240
GCCAATAGCT TAATTT 256 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 295 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB18
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
TAGGTGGTGC GTGCCTGTAG TCCCAGCTAC TCGGGAGGCT GAGGCACGAG AATCACTTGA 60
ACCCGTGAAG CAGAGGTTGC AGTGAGCCGA GATCACCCAC TGCACTTCAG CCTGGGCAAC 120
AGAGCAAGAC TCCGTCTCAA AAAAAAAAAA CAAAAAACCA AAAACTTCTT TATATGTAAG 180
AAGAGATGTT CCTGACATGA AAAATAGCAC CTTTACAGCA CTTTTCTCTA GTGTGGACAC 240
TGGCGGATTA CCAAGGTTGT CATTTAAATA GAVATGACAG TTCCACTCAG AGGTT 295 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 166 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB19
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 15:
CCGTCACCAT GCCCAGCTAA TTTTTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATGGGGT TTCACTATGT 60
TGGCCAGGTG GTCTTGAACT CCTGAACTTG TGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC 120
AAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT CCTGTGTGA ATGTTA 166 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 244 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB20
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
AGACGCCATC TCAAAAAAAA AAAAAGCTAT GATTGGGTAA GATTATAAGA AGGATAGTTA 60
AAAATAAATA CCACCTAAAT ATGAACCTAA AGAAAGCGAG TATAAAAATG TAAATATGTG 120
ATATGATAAA CTTAGGTTTA AAAATATCAA TAAGGGCTAC TCTGTATCAT AGTATACAAG 180
TGGACATGGC TGGGCCAGTG GCTCACGCCT GTAATCCAAC ACTTTGGGAG GCAGAGGCAG 240
GCGT 244 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 180 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB22
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
GTCAATCTCA CTCTCTCCCC CAGGCTGAAG AGCAGTGGTG CGATCCTCTA GAGTCGACCT 60
GCAGGCATGC AAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC 120
GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCGGA AGCATAAGTG TAAAGGCCTG GGTGCCTTAA 180
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 176 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB24 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
AAAATTTTTG GGCATTTCTA TATCATATTA ACCAGAAACT CAGCATACTT TAAAAAGTTA 60
CCACATACAC AAAAAAGCAA GAAATACAGA CTCATAAAAA ATAAATCAAT TATTAAAAAC 120
AAATTCACAG ATAATCCAGA TATTGGAGTT AATAGATAGG GCATCATAAT ATCTAT 176 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 220 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB25
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:
GGCACATGTC ACCATACTGC ACTATTTTAA ATTTTTTGTA GGTCTTGCTA TGTTGCCCAG 60
TCTGGTCTCG AACTCCTGAC CTCAAGCAAT CCTCCCACCT TGGCCTCCCA AAGTGCTTGC 120
ATTACAGGCA TGAGCACTGC CTGGCCCACC CAGGCAGTTC AAAAGCATCT TGAGAGTTCA 180
AAAGCATATT GGTGAGACTC ATTCCATGAG GCTGGTGAGG 220 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 20:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 192 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB27
(Xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 20:
AGATGTGAGC ACCCTACTTG GCCAGCCACC TGAAATTCTA TCAGTGACAG ATTCCTTTAG 60
CTGAAGTCAT GTTCAAATGT AATCCTCCCA AGAATGGTAA CATTATACAT CAATGCATTA 120
AACAAAACAA CCTGTGCTTA TGAAAAAGTC ATATGTGCAC ACGGTAAAAC AAAATTCAAA 180
TAGTACAAAG GG 192 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 21:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 215 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
( C) STRANGFORM : Einzel strang
(D) TOPOLOGIE : linear
( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB32
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 21:
ACAGAGCAAG ACCCCATCTC AAAAAAAAAA AAAGCTATGA TTGGGTAAGA TTATAAGAGG 60
GATAGTTAAA AATAAATACC ACCTAAATAT GAACCTAAAG AAAGCGAGAT AAAAAGTAAA 120
TATGTGATAT GATAAACTTA GGTTTAAAAA TACAATAAGG GCTACTCTGT ATGTATAGTA 180
TACAGTGGTA CATGGCGGGC CAGTGGCTCA CGCTG 215 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 222 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB34
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
TTTTTCACAT TCCAATGGGA AAATAACATG GAGCACGGCG TGTTCCCCTC AAGGATAGCT 60
GACAAAGGAA AAGGCCCTTC CTTTATCTCC ACTGGGAGTT TTGTTTTCCT TTTATCTAAA 120
AGGGGTTATC AGTGCTGCTC AAATAAAGAA GAAATGTGTG ATTGAAATGG GTGGAGGATA 180
TGCTAGGGAG AAAAAGAAAG CCTGAACAAA TGAAAATTGT AT 222 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 23:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 103 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB36
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 23: AACCCCCAAC CCCCCCTCTC CTCCTTCTTA CTCAACGCCT TCGGGCTACT CAACGCCACT 60 CCCTTCTCAC CCCTCAGCAC CCTCCAAACA GACACATCGA ACA 103
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 24:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 253 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB37
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 24:
AAGAGTCTGT TGGATTTAAT ATTTTTTAGA AGGTTTGGTG AATTGGTGTT TGCAAAAGCC 60
AATTGCTGTG CATTGAGGAA TGTGTTTGAT TATTCATTCA AGTAATAAAA AACAAAAAAT 120
CAAGCTGACT CTTGAAGAGG CCCCCCCACA CACACACAAA AGAAAGAAAT GTTTGTCTTA 180
TGTGCTAAGC CTGTTCTAGG TTGTTGAGGA TGTACTGGTA AACCAAATGT CCTGTGTTAT 240
GACACTTAGA TCT 253 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 25:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 245 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB39
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 25:
GCCAGTTCCT TTAGGTGCAT CATTAGGCTG TTTATTTGAA GTCTTTCTAT CTTTTTGATG 60
AAAGCATTTA TTGCTATAAT CTTCCCTCTT AGAACAGTTT TTGCTGTATC CCATAGGTTT 120
TGATATATTG TGTTTCCATT GCCATTTGTC TTAAATTTTT AAATTTTCTT TTTAATTTCT 180
TCACTGGCTC ATTCATTGTC CAGGAGCATT GCTGTTTAAT TTCATGAGTT TGTGCAGTTT 240
CAACA 245 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 26:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 98 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB40
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 26: TTATCAGAAG ACAGGTAATG TTGACACATG GAGCTCTGAG ATAAATGGTC TCAAGAGAAG 60 GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTGG 98
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 27:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 243 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB41
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 27:
AGAAGGTTTG GTGAATTGGT GTTTGCAAAA GCCAATTGCT GTGCATTGAG GAATATGTTT 60
GATTATTCAT TCAAGTAATA AAAAAGAAAA AAGCAAGCTG ACTCTTGAAG AGGCCCCCCC 120
ACACACACAC AAAAGAAAGA AATGTTTGTC TTATGTGCTA AGCACTGTTC TAGGTTGTTG 180
AGGATGTACT GGTAAACCAA AATGTCCTGT GTTTATGACA CTTAGATTCT AATAGTTGGA 240
GAT 243 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 28:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 306 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB43
(xi) SEQUΞNZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 28:
CCCTGTCTCT ATTAAAAATA CAAAATTAGC TGTGTGTGGT GGCACACGCC TGTAGTCCCA 60
GCTACTTAGG AGGGGAGGGA GGTGCCAGGC TGTTTTTAAC AATCAGCTCC CACAGGAACT 120
AATAGAGGAA GAACTCACTC ATTACCACAA GGACAGCACC AAGCCATTCA TGACGGATCT 180
ACCTGCATGA CCCCAACACC TCCAGTTAGG CCCAAGCTTA GGGATCATGA TAACTATGGG 240
TGTGGTTATG ACTTTTTAGA TGGTACACCA AAGGCACATA AATGAAAAGA TAACTGAATC 300
CTAGAC 306 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 29:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 237 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear (ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB44
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 29:
GGAAAAGCAT GGATGGGATT TAAGCTACAC ATACATGCTC CAAGGTTATT TTAATTTCTG 60
CAAATAACAA TGAAATAAGG TATTTCTTTA GCTGTAATAA ACATCCTTTG CAAATCATTA 120
TTAGATGTTT TATCTTAAGA TAAATTTTTC AAACCAAAGA AAGTTTCAAA CTTTGAACTT 180
TAAATGAAAT ATCAAATTCC TTAATATCAC TTTTAATATT CAAATTAAAT CCATGCA 237 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 30:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 212 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB45
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 30:
GAGAATTCTT CTGTCTAGCA GAATATGAAG AAATCCCGAA ACCAACGAAG GCCTCAAGGA 60
GGTCTGAATA TCCACTTGCA GACTTTACAA ACAGAGTGTT TCCTAACTGC TCTATGAAAA 120
AGAAAGGTTA AACTCTGTGA GTTGAACGCA CACAAACACA AAAGGAGTTT ATGAGAATAC 180
TTACTGTACT AGTTTCTATA AAGAAGATAT TT 212 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 31:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 503 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML02
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 31:
CGCTTATGGG CAGGACTCCA CAGTGTGTCA CCACTGATTT GTTTCCACCC CTTATATTTC 60
TCAGTTTCTC TCTCCTGAGG TGAGGGCTCA AAATGTTGGG TAATCAGCCC TTATATGCTT 120
TTCCTGGACA AGATTTTTTT TTTGTCTCTG TCACCCAGGC TGGAGTGCAA TGGCTTGATC 180
TCAGCTCACT GCAACCTCTG CCTCCCGGGT TCAAGTGATT CCTCTGCCTT ACCCTTCCAA 240 ATTGCTGGGA CTACAGGTTT GCCCCATGAC CCCCGACTAA TTTTTGGATG GTATTTTATT 300
TTATTTAGTA GAAAAGGAGT TTCACCATAT TTGCCAGGCT GGTCTCAAAC TCCTGACCTT 360
ATGATCCGCC CCCTCACCTC CCCAAATGCT GGGAATGCGG GTTTAACCAC CTCCCCGGGC 420
TGCCTTTTTT TAAATCAATT TTTGTTGGGG ATTTCCCTGT AGGGCCACTG CATGTTGTGA 480
GGGGATGCCG CAGACCCTGG TGG 503 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 32:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 365 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML12
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 32:
CCCTCAGAGC GCTCCAAATA TCCACTTGCA CATACTACAA AAAGAGTGCC TCAAAGCTGC 60
TCTCTGAAAC GGAATGTTCA ACTCTATGAG TTGAATGCAA ACATCACAAA GACGTTTCTG 120
AGAATGCTTC TGTCTAGATT TGATATGAAG ATATTCCCGT TTCCAACGAA ATCTTCAAAT 180
CTATCCAAAT GTCCACTTGC AGATTCAACA AAAAGTGTTT TTCAGAACTG CTCTTTCAAA 240
AGAAAGATCC ACCTCTGTTG GCTGAGTTCA CACATCACAA ACAAGTTTAT GAGAATGCTT 300
CTGTCTAGTT TTTATTTGAA GATATTTCCT TTCTCACCAT AGACCTGAAA GCTGTCCTAA 360
TGTTC 365 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 33:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 355 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML18
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 33:
CAGTATAACC CCAAATAGGA AAGGGTGGGA AATGTCTATG AAATAAGAAC AATCAAGTAA 60
CTTTGGTCAA GTTCTTATTT TAGGATTAAT GAATGATACC CAGGGCCTTC GTTTTTCGTT 120
TTTGACTGTG TTATTCAATG GTTGCTTTTT TTCTGGGGCA ACCTCCAGAT TTGCTGTTTC 180
TTTGATATCT TATAAATGGT CCATTCCACT TTTGATAAAC TGCAACTCTT GATCTAATAA 240
GTTTATAATG ACTGCTTAAG CTTTACACTT TGTTAAGCCT TTGGAAAAAC TCCACTCACC 300 TTGTTTCAAA GTGGGTTGGG TTTTAAGTTA AAAATAGTTT TCATCTTGAA TTGCC 355
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 34:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 385 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML19
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 34:
CAATTTCTGC TTTTGCTATA ATTGCTTTTG GTGTCTTTGT CAGGAAATCT TTGCCTGTGC 60
CTATGTTTCT AAATGGTATT GACTAAGTTT TCTTCTACAG TTTTTATAGT TTTGGGTTTT 120
ACATTGAAGT CTTTAATCCA TCTTGAAATT GATTTTTGTA TATGAATGCA AGGAAGGGGT 180
CTGGGTTTCA AGTTTCCTGC ATATGGCTAG CCAGTTCTCC TAGTACCATT TATTGAAACG 240
GGGAACCTTT CCCCCTTGCT TGTTTTTGGT CAGTTTGTTT AAAAAAAAAA ATAGCGGTTA 300
TTTGTGCAGT CTAATTTCTG GGTTCTCTAT TCTGTTCCAT TGTTCTGTGT GTCTGTTCTT 360
ATACCAGTAC CACGCTGTTT CGGTC 385 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 35:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 406 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML20
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 35:
CAACATTTCT CTTCTCACCT CAGTACACCT TTCCAAGAAG ATTGCAAAGC CAAACTCTAA 60
GATGGTCCAA GTCAAGCCCT ACCAATAAGT GTGCAGAAGA CAGAATCTTC TTAAGACTGG 120
GTATTTGAGA GAGCTTCTAA AGCTCTTAAC TATACTCATT CCTTAGGTGG AGGAAAATCC 180
TAACACCTGG CAGGGAACTT TCTTTCCTTT TCTTAGTTTT ATGCAACTTT GTCCTCTAAT 240
ACGTACACTG AAGTTAGGAA TTGAACTAAA AGCTAGCCTT TGTCAAGAAT TGAAATTTGG 300
TTCTGGTGGT CTGTTCATCA ACTCTCTCAA ACAGTCTCTT TCCATACTAT CTCAACTCTC 360
ATGCTCTCTT TTCCTTAGTT TCAAAAATGC CCTTGGGCCG AAAATT 406 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 36: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LÄNGE: 167 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML28
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 36:
CTCCATAGAA GAGGAAGGCA AAGGCTGTGA CAGGCATCTT TCTCATTGTG AGCTGCTGCC 60
AAAGCCAGTG CTCCTGTGTA TCTCCTGGGT GAGGGTTTCC CAAGGGGCCT TTTCACTCCT 120
GAGGCTCAAG ATGAATTCTT CCAGTTACTG TCTCAAGCTC TGAATCC 167 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 37:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 372 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML29
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 37:
CACATTTTCT GTATATATGA ATTTGCATGG TTGGATTGTT AATGCTGTAA TCAACCATGA 60
TCATGTTATG ATTTAGTACA ATTCGGTCTC ATTTAACTGA ACTATATATG TCTATCACCA 120
CTTATGCTTT ATTGTCTTCT TATTGTCAAA TCTGAAAGAG AAGTAATTAA TTTGATGCTT 180
GCTGTATAGA CCAATGCAAT GACCTTGTAA TTCAGACAAC AAATGGGCCA CTTTCTCTGT 240
TGAAACTTTT TTTTTACGGC TGCCTGCACT CCTCAGGGCA TTCCAATACA TAGCACTCTG 300
TTTCATTCAC ATAAAACTTA GACTTGACAT TCAATTCTAC ATCCTTCTGG CTTTTCTGCA 360
GAATATTTTA TC 372 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 38:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 566 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML31 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 38:
CCTCCTACAC AATCGGATGC CCAAAGTCCA CACCAGAGGT TCATTGAAAA ATGATCAGGC 60
TGATTTTTTA AAGAGCTTTT CCTTCAGATT GAGTGAAGAA ATTGACCAAC CTTAATCTGA 120
ATAAATATAA AGTCTAAATA AACTAAGCAT ATGCTTTCAG AAAAATGCCA CTTGCTATGA 180
CAGCATACAT ACAAGAAAAA CGATAAGGAG GTCATACAGC TTAAAACGAT AAGCAAGAGC 240
TGACCAGGGT TAAATCAGGT CACAGGGGTA GGGCCTATTC TGATAGGGAT GGTGGCCTTA 300
TAGGAAGAGG GAAGCCAGCA CGTGCCCCTC TCTCTCCCTC TCCCAATCCC TCTCTCTTTT 360
CTCTCTCCAT GTAAGGACAC AATGAGAAGG AAGCCATAAA CCAGAGAGAG TTCTTTTCAG 420
GGAACCAAAT CCAGACCCTT GATCTTGAAC TTCTCAGCTC CCAGAATTGT GTGAAAATAA 480
ATTTCTATTA TTTAAAGCCT CCCAGTCTAT GGTATTTTGT TATGACAGGC TGACCTGAGT 540
AATCATTATT ACTCTTGCTA AATATG 566 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 39:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 680 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML35
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 39:
CACAGTGGAC ATGACTTCAA GTGGTAAATT TAGTTGTATA CTTTGGTCCA GGGGATGGTT 60
AGCACTACAT TGATTCATGA GCAGTTGCTA ATGGTTTAGC TGGATGATCA GGGACTTGGA 120
AAGAACAAAA TAGCAAGACT GGTGATAAAG AGGTCTGGGG AAAAGGTAGG TGGATGGACC 180
TCTTGGGATA GGTACAGAGT AAGAGGATAT TTGTGCCCCA TGTGAGAGTT TATCAAAGGA 240
CATGATGAAA ACAGTCTTTC AATAATCAGG TGGACAAAAT GGCATGACCT ATGGTATGTT 300
AGCTTGTTTT CTTTAATAAT TGGAAATAGA AACTTAAGAA TTAGTAGAGA AACTGATTTA 360
AAACAACAAA GGAAGGTGGA AGGGTCCCAC GTGGAATGAA GGTAATTCCC TCTTGTCAAA 420
TTGGGTTTCA GGTGCCTAAG GCACAGGGAA ACAGGAATGT TTGTGTTATT TCTACAAGTA 480
CTTGACAGTC CCTAGGCAAA GTGGGATTGA AGGAGGGAAA CAGCAGGCCA CCATCTCTCT 540
GCCCTTAGAC ATGTAAAAAT GCACCTGCTT AATTCAAGGC ATGAGGATGC ATATCTCATG 600
GAGTCATGAG TATTAACACT TGCAGTCTCA GAACTTTTCT AGGAAACACA CTTTATGAAG 660
CAGAACTGTA GATTTATCCC 680 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 40:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 543 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML38
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 40:
CTCTCAAGTC ACAAAGTCAA GATTTTTTAA CCGTGATTTT AGTTATCTCC ATGACTCCCA 60
GTGCAGTCCA TACACATACG CAAACACACA CAGAAAACTC ACCAGTGCCA TTCTCTTCTC 120
CCAAGAATTG ACAACCCTAT GATAGAATCT TCCACTGGTT ATATTTCAGT GCTTTTGAGC 180
AGTTATTTCT TAAATTTTTT CATGTGTTAT AGTTATCTGT GAGAGGATCA GTACAATAAG 240
AGCTTTTCTA GTCTTTACTA ATGGTGAAAA CTAAACTCTG CAAATATATT TTAGCCACTT 300
TGTATACCTT TATTATACTT AAAGAGATAA TAAAAAGAAA AGGTGTGGAG AAGAAATCTC 360
AAGATTGTGA TTTTTTTGGA AATAAATATT TTACGGGAGG CATGAATGAT GATTTAGAGT 420
TTTCTGAGCT TATAATAAAT AACCTCAGAT TGGTTTGGTT TTTAAGTTCT AGAATTAACA 480
TGTATAACTT TCCTAGTGCC ACTTATCACC CTCCTATTTT ATTGGTGTAT CATCAAGCCA 540
GTC 543 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 41:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 580 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML40
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 41:
CACTTTTTGC CGACTTGGTC CCCAAACCTT TGATTAATCT AAAACATGGT GGTCACTAAA 60
GTCTTACATC TAAAAGATTT TTCCTTTGTT ATTAAAAATC AGAATAAATG ATGGAGATAT 120
CTAAAAGGAA AGGTGTAGAC AAAATAACAT TTATCAGTTC CATTATCAAA AAAAAAACAG 180
ATCTGAGTGT TTGAAATTCT AAATTACAAG TCAGCCCACT TTCTTTTGCA CAGCATTACT 240
TCTTTTCCTA AATGACAACA TTTCATCTGT AAAACACCCT TAGGTCTCTC AATTGCACAT 300
TACAATATAA ATCCTCTGTG GTGTAAGAGA CAGTACATTC TGAACTGAGA GATACTCCAT 360
TTTGTCACTT GGCCTGCTCC CCAGTAATGT GTGGTCTGCT GCAACTCCAC ATGTGAATGA 420
CAGGAAAGAC AAAGGCAAAC CAGGGGGTTG AATGGGAAGT ACAGCTAAAT AGTTGTGTTA 480
TTTGTTTTCA CTTGATGTCC ATAGTTAACA GAAAATATAG CTGTCCTATC TCTAGGATTT 540 AACTCTTTCA CAACTGAAGT GTTCCTTCAC TCCATAATCC 580
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 42:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 557 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML41
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 42:
CAGCAACAAC CAGATTAACA GTCCAAACCT GCTCTCTAGA TTCCAGATAA AACAGCTTAT 60
TTGACATCAC CACTTGGCTG CCTAATAGAA ATCTCAAATT CAGCATGTCA AAAACTCAAT 120
CCTTTATTTC TAGCAGGGAG GACAGAGGAC AAAGAAGCTG GCTGGGCCTT GCAACTCAGA 180
GCATCTGGGC TGGGAAATGC AGCAAGACAT GGAATTGGTG AAGAGTAATT AAAGAACTAT 240
GGGAACTCCA TTTTAGACCT GGTAGGTATT AGTAGTAAAA GTTGTCATTC GGTTTTATTT 300
TTGGCATTTA TAATAGGTTC AAATATTAAA GAAGAGACAA CACCCAATAA ATTGATCCAC 360
AGGGGCAGTT AATTCTTCCA ATGGTCTCAA CTTCCTCAGT TATTACTTGA TAGTTCCAAT 420
AGTAACTGCA TCTATTGCCA TGCATATTTC CCATTTGAGG GAAATCTCAT CCCTTGTCTA 480
CCTCTAAGAT CCATCTTCAC CTTATAGAGG CCATGGGAAA ACTTCCTTTT TGCTCTCTGA 540
AAGTTTGCTC AAAAATC 557 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 43:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 593 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : AML47
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 43:
CGCCACATTT TTAAATTGTG CAAACTGGTG TCAGGTTAAC CCAGGCAAAA GGCGCTGCCC 60
TGAGGCCCAC ACTTTGAAGG GCCCTGCTCT GACTCTCCTA TGGTTGCAAC TCTCCCCCCA 120
AAGTGGGCCA TGGGGCCTCA GGGACATGCA CATTTTGAGT TCAGATCCTC AGCTTCTATA 180
AACAAAATTT AAGTGAATGA AACCCCAGAA ATTTTCTGCT CAAACACCAT GAACACTACA 240
GATGGGAAGG TAATTGTGCA GGACTCTTGA TGGGAGTTAT CCCTCTCGGG GTACGCATTG 300
CCACAGGTGT ACAAAGCCCT ACCTTGTTGG GTGACATATG GCCAGTTGTT TTGGGAATTA 360 GAGTGCTAGA TCAAACTTGG ACGTGTATGC TGGCATGTCC ATGTGCTTGA ACCCTCTTGT 420
TAATGTGGAA AAGAGAGCCC AGGGATAAGA ATAAAAAATT CCAGGGGTAA GAATATGAAA 480
AAGGGCGTGG GGTTTAAGTG CCCAGGGCCA AATCCTCCCT TTGTTAAAAT GACTGTGGCC 540
CGCAGATATT AGATGGAAGA TTGCCTGATG GTTATGCCTT GTTACAACGA ATA 593 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 44:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 196 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-1
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 44:
TAAATATCAC GTGGCAACCT ACAGAATGGG AGAAAATTTT TGCAATCTAT CATCTGACAG 60
AGGTCTAATA TCAGAATCTA AGAAAAACTT AAACAAGTTT ACAAGAAAAA AACAAACAAC 120
CCCATAAAAA AGTGGGTGAA GGATATGAAC AGACAGTTCT CAAAAGAAGA CATTTATGTG 180
GTCAACGAAC ATATGA 196 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 45:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 78 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-101
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 45: GATCAAAACG CAGAACCATT TGTGTTCTAT ACAATTTATC ACATCAATTA GTAGATTTGT 60 GCAATGACCA GCATGATC 78
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 46:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 122 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(vii ) UNMITTELBARE HERKUNFT : (B ) CLON ( E ) : HT29 - 103 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 46: GATCGATTCC ATACCTTGTC TATTGTGAAT AATGCAATAA TAAACATGAG AGTGCAGGTA 60 TCCCTTTGAC ATACTGATTT CTCGTGCTTT GGATAAATGC CAATTAGTGA CATTTTTGGA 120 TC 122
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 47:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-104
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 47: GATCCTGTCC ATATCCTGTG CAGTGATAAC TCCAGGAACT TGAACTACTG CCAAGAATTT 60 TCTACTGATA CTCATGGATC 80
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 48:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-105
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 48:
GATCAAGTCG TCAGCTCCGT AACCAGCTTA TGCCAGGCTA GAACCTCATG GCCCCCAGTG 60
ATC 63 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 49:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 107 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(vii ) UNMITTELBARE HERKUNFT : ( B ) CLON (E ) : HT29 - 106 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 49:
GATCAATTGC AATGTAAACT CACTCTTTGT GTGAAAGGAA AAAAAATGCT TAATATCTTT 60 TTGCTGGTGG AGGGCCTTGC CTCAGTGTGG ATGGCTGCTG ACTGATC 107
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 50:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E): HT29-107
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 50: GATCTGGCTT TCAAATGCCT GGGAGGCCAA CAGATC 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 51:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 231 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-11
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 51:
TATATAACAC GTCAGACATG AGCCACCACG CCCGGCCAGG AATGAATGTT CTATGCATGA 60
AACTGTAAAC GGCTTATTGC TATAATTGTC CTAGTTTATT ATTGTTAATT TCTTACTGTA 120
CCTAATTTAT AAATTAAGCT TTATCAGAGG TATGTATGTA TTAGAAAAAA TATAACATAT 180
ATAGGATACA GTACTATCCA GGATCAGGAA TCTACTGGGC ATACTAGAAA G 231 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 52:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 191 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-12
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 52: TATATATCAC GTAACTGTAA ACGGCTTAT GCTÄTAATTA TCCTAGTTTA TTATTGTTAA 60
TTTCTTACTG TACCTAATTT ATAAATTAAA CTTTATCAGA GGTATGTATG TATTAGAAAA 120
AATATAACAT ATATAGGATA CAGTACTATC CATGGTTTCA GGAATCTACT GGGCATACTA 180 GAAAGATCCC C 191
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 53:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 246 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-14
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 53:
TATATANCAC GTGGAGCTAC AATTCAAGAT GAGATTTGGA TGGGGACACT GCCAAACCAT 60
ATCATGGGGT TTGTCACTGG CCTGGATGGA ACATCCTTGT CAAGAGCACA CACACACACA 120
CACACACACA CACACACTTA GAGAGACAGA CAAAGAAGAG AGAGAGGAGA GGCACGGTTA 180
TAATGAGGAT GGACAGGTGA TTTTGGAAGC TGAGAGTCAT TACTGCCACT GCCAGCTAGG 240
TGTAAT 246 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 54:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 281 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-16
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 54:
TATATATCAC GTTGTTATTA TAATTATCAG TCCTGAAACC TGTCTCATCT TAGAAACATA 60
GATTCTATAC AAGTGGCCCT GGAGTGCCTT TTAAGATGTT CTCAGGAGAT TTTGGTTGTC 120
TTCTAAACTT TCTGGAAACA TCTTGTTCAT TTCGTATTCT GGTGGAAACA TCTTGTTCAT 180
TTCGTATTCT GGATTTAAAA TTAGCTATTT CTCCAAGGAG ATGTCAGCCA TTGTGTTTAT 240
ACAAACTTGA GTTCCTTTAA GGTTTAACCT TCATTCAAGA A 281 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 55:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 268 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-17
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 55:
TATATATCAC GTGAAACTGA TAAGTTGTTT CTCTAGCTTT TAAAAATACA TGGAGTGAGT 60
TCTATAATTC CTCAGGAAGT AAGAGCTGTT CCTTTTGAGC TGAAGAACAT ATTGCAATTC 120
CTATTTCATT GCAGAGATAT TTCTCTACTT TAAAATGCTA CCCGCTTCTC ATCCACACAA 180
AAATTGTGAA ACAGAGGGGG CTGGGGCAGT AAGGAAGTTA TGAAGAAAGT AATTCACATT 240
AGGTGAGCTG GAGCCAATAG CTTAATTT 268 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 56:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 307 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-18
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 56:
TATATATCAC GTTAGGTGGT GCGTGCCTGT AGTCCCAGCT ACTCGGGAGG CTGAGGCACG 60
AGAATCACTT GAACCCGTGA AGCAGAGGTT GCAGTGAGCC GAGATCACCC ACTGCACTTC 120
AGCCTGGGCA ACAGAGCAAG ACTCCGTCTC AAAAAAAAAA AACAAAAAAC CAAAAACTTC 180
TTTATATGTA AGAAGAGATG TTCCTGACAT GAAAAATAGC ACCTTTACAG CACTTTTCTC 240
TAGTGTGGAC ACTGGCGGAT TACCAAGGTT GTCATTTAAA TACAGATGAC AGTTCCACTC 300
AGAGGTT 307 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 57:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 245 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
( ii ) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA
(vi i ) UNMITTELBARE HERKUNFT : (B ) CLON ( E) : HT29 - 2 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 57:
TGCAGGCATG CAAGCTTGGC GTAATCATGG TCATAGCTGT TTCCTGTGTG AAATTGTTAT 60
CCGCTCACAA TTCCACACAA CATACGAGCC GGAAGCATAA AGTGTAAAGC CTGGGGTGCC 120
TAATGAGTGA GCTAACTCAC ATTAATTGCG TTGCGCTCAC TGCCCGCTTT CAGTCGGGAA 180
ACCTGTCGTG CCAGCTGCAT TAATGAATCG GCCAACGCGC GGGGAGAGGC GGTTTGCGTA 240
TTGGG 245 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 58:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 256 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-20
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 58: TATATATCAC GTAGACGCCA TCTCAAAAAA AAAAAAAGCT ATGATTGGGT AAGATTATAA 60
AAAGGATAGT TAAAAATAAA TACCACCTAA ATATGAACCT AAAGAAAGCG AGTATAAAAA 120
TGTAAATATG TGATATGATA AACTTAGGTT TAAAAATATC AATAAGGGCT ACTCTGTATC 180
ATAGTATACA AGTGGACATG GCTGGGCCAG TGGCTCACGC CTGTAATCCA ACACTTTGGG 240
AGGCAGAGGC AGGCGT 256 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 59:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 122 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-202
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 59: TATATATCAC GTAGACCTAA AACCATAAAA ACCCTAGAGA AAACCTAAGG CATTAACCAA 60 TTCAGGACAT AGGTGGGCAG GATTAAGTCA AAACACCAAA ATAATGGCAA CAAAAGCCAA 120 AA 122
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 60:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 132 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-203
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 60: TATATATCAC GTATATGTCT TGAAGATGCA CTTCCAAGGT CATGAATGGA ACTCCACCAG 60 CCACAAAAAG ACCTGCCTAT ACCTGGAGTA TCGTGCAGTC AGAGTGCTCC GACTCCTGTG 120 GTGGAGGTAG AT 132
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 61:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 230 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-206
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 61:
TATATATCAC GTAAGACCAA TGAGAGACAA TGCAGTCGCT GGGACAACCA GATTGGACCA 60
GGCAGTCAAG GTGGCTTGGA GGCCACAGCG AGAATTAAAA TACACTGAGA GATTATACTT 120
CAGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTGC TAATGCATGG TCTCATAGCT 180
GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATTCCTCCTC ACAATTCCAC ACAACATACC 230 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 62:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 335 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-207
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 62:
TATATATCAC GTGTCAATCA ATTTTATGAG AATAGCATTG AATCTATAAA TTACTTTGGG 60
CAGTATGGCC ATTTTCATGA TATTGATTCT TCCTATCCAT GAGGATGGAA TGTTTTTCCA 120
TTTGTTTGTG TCCTCTCTTA TTTCCTTGAG CAGTGGTTTG TAGTTCTCCT TGAAGAGGTC 180 TTTCACATCT CTTCTTACCT GTGTTGTTAG GTATTTATTC TCTTTGTAGC AGTGGCAAAT 240
GGGAGTTTAT TCATGATTGG CTCTCTGCTT GTTATTGTTG AGTAAGGAGT ACTGTGATTT 300
GCACATGCTT GCATCTAGAC TTATGAGTGC TACAG 335 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 63:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 192 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-22
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 63:
TATATATCAC GTGTCAATCT CACTCTCTCC CCCAGGCTGA AGAGCAGTGG TGCGATCCTC 60
TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT 120
GAAATTGTTA TCGCTCACAA TTCCACACAA CATACGAGCG GAAGCATAAG TGTAAAGGCC 180
TGGGTGCCTT AA 192 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 64:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 188 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-24
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 64:
TATATATCAC GTAAAATTTT TGGGCATTTC TATATCATAT TANCCAGAAA CTCAGCATAC 60
TTTAAAAAGT TACCACATAC ACAAAAAAGC AAGAAATACA GACTCATAAA AAATAAATCA 120
ATTATTAAAA ACAAATTCAC AGATAATCCA GATATTGGAG TTAATAGATA GGGCATCATA 180
ATATCTAT 188 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 65:
( i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 232 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-24
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 65:
TATATATCAC GTGGCACATG TCACCATACT GCACTATTTT AAATTTTTTG TAGGTCTTGC 60
TATGTTGCCC AGTCTGGTCT CGAACTCCTG ACCTCAAGCA ATCCTCCCAC CTTGGCCTCC 120
CAAAGTGCTT GCATTACAGG CATGAGCACT GCCTGGCCCA CCCAGGCAGT TCAAAAGCAT 180
CTTGAGAGTT CAAAAGCATA TTGGTGAGAC TCATTCCATG AGGCTGGTGA GG 232 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 66:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 204 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-27
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 66:
TATATATCAC GTAGATGTGA GCACCCTACT TGGCCAGCCA CCTGAAATTC TATCAGTGAC 60
AGATTCCTTT AGCTGAAGTC ATGTTCAAAT GTAATCCTCC CAAGAATGGT AACATTATAC 120
ATCAATGCAT TAAACAAAAC AACCTGTGCT TATGAAAAAG TCATATGTGC ACACGGTAAA 180
ACAAAATTCA AATAGTACAA AGGG 204 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 67:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 192 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-3
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 67:
TAGCGTTTCC TGTGTGAAAT AGAATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG 60
CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG 120
CTCACTGCCC GCTTTCAGTG GAAACCTGTC TGGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG 180
CGCGGGAGAG GC 192 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 68: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 227 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-32
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 68:
TATATATCAC GTACAGAGCA AGACCCCATC TCAAAAAAAA AAAAAGCTAT GATTGGGTAA 60
GATTATAAGA GGGATAGTTA AAAATAAATA CCACCTAAAT ATGAACCTAA AGAAAGCGAG 120
ATAAAAAGTA AATATGTGAT ATGATAAACT TAGGTTTAAA AATACAATAA GGGCTACTCT 180
GTATGTATAG TATACAGTGG TACATGGCGG GCCAGTGGCT CACGCTG 227 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 69:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 234 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-34
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 69:
TATATATCAC GTTTTTTCAC ATTCCAATGG GAAAATAACA TGGAGCACGG CGTGTTCCCC 60
TCAAGGATAG CTGACAAAGG AAAAGGCCCT TCCTTTATCT CCACTGGGAG TTTTGTTTTC 120
CTTTTATCTA AAAGGGGTTA TCAGTGCTGC TCAAATAAAG AAGAAATGTG TGATTGAAAT 180
GGGTGGAGGA TATGCTAGGG AGAAAAAGAA AGCCTGAACA AATGAAAATT GTAT 234 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 70:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 115 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-36
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 70: TATATATCAC GTAACCCCCA ACCCCCCCTC TCCTCCTTCT TACTCAACGC CTTCGGGCTA 60 CTCAACGCCA CTCCCTTCTC ACCCCTCAGC ACCCTCCAAA CAGACACATC GAACA 115
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 71:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 265 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-37
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 71:
TATATANCAC GTAAGAGTCT GTTGGATTTA ATATTTTTTA GAAGGTTTGG TGAATTGGTG 60
TTTGCAAAAG CCAATTGCTG TGCATTGAGG AATATGTTTG ATTATTCATT CAAGTAATAA 120
AAAACAAAAA ATCAAGCTGA CTCTTGAAGA GGCCCCCCCA CACACACACA AAAGAAAGAA 180
ATGTTTGTCT TATGTGCTAA GCCTGTTCTA GGTTGTTGAG GATGTACTGG TAAACCAAAT 240
GTCCTGTGTT ATGACACTTA GATCT 265 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 72:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 256 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-39
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 72:
TATATATCAC GTGCCAGTTC CTTTAGGTGC ATCATTAGGC TGTTTATTTG AAGTCTTTCT 60
ATCTTTTTGA TGAAAGCATT TATTGCTATA ATCTTCCCTC TTAGAACAGT TTTGCTGTAT 120
CCCATAGGTT TTGATATATT GTGTTTCCAT TGCCATTTGT CTTAAATTTT TAAATTTTCT 180
TTTTAATTTC TTCACTGGCT CATTCATTGT CCAGGAGCAT TGCTGTTTAA TTTCATGAGT 240
TTGTGCAGTT TCAACA 256 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 73:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-40
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 73: TATATATCAC GTTTATCAGA AGACAGGTAA TGTTGACACA TGGAGCTCTG AGATAAATGG 60 TCTCAAGAGA AGGGATCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGGCAT GCAAGCTTGG 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 74:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 255 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-41
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 74:
TATATATCAC GTAGAAGGTT TGGTGAATTG GTGTTTGCAA AAGCCAATTG CTGTGCATTG 60
AGGAATATGT TTGATTATTC ATTCAAGTAA TAAAAAAGAA AAAAGCAAGC TGACTCTTGA 120
AGAGGCCCCC CCACACACAC ACAAAAGAAA GAAATGTTTG TCTTATGTGC TAAGCACTGT 180
TCTAGGTTGT TGAGGATGTA CTGGTAAACC AAAATGTCCT GTGTTTATGA CACTTAGATT 240
CTAATAGTTG GAGAT 255 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 75:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 318 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-43
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 75:
TATATATCAC GTCCCTGTCT CTATTAAAAA TACAAAATTA GCTGTGTGTG GTGGCACACG 60
CCTGTAGTCC CAGCTACTTA GGAGGGGAGG GAGGTGCCAG GCTCTTTTTA ACAATCAGCT 120
CCCACAGGAA CTAATAGAGG AAGAACTCAC TCATTACCAC AAGGACAGCA CCAAGCCATT 180
CATGACGGAT GTACCTGCAT GACCCCAACA CCTCCAGTTA GGCCCAACGT TAGGGATCAT 240
GATAACTATG GGTGTGGTTA TGACTTTTTA GATGGTACAC CAAAGGCACA TAAATGAAAA 300
CATAACTGAA TCCTAGAC 318 ( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 76 :
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE : 249 Basenpaare
(B) ART : Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-44
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 76:
TATATATCAC GTGGAAAAGC ATGGATGGGA TTTAAGCTAC ACATACATGC TCCAAGGTTA 60
TTTTAATTTC TGCAAATAAC AATGAAATAA GGTATTTCTT TAGCTGTAAT AAACATCCTT 120
TGCAAATCAT TATTAGATGT TTTATCTTAA GATAAATTTT TCAAACCAAA GAAAGTTTCA 180
AACTTTGAAC TTTAAATGAA ATATCAAATT CCTTAATATC ACTTTTAATA TTCAAATTAA 240
ATCCATGCA 249 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 77:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 224 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-45
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 77:
TATATATCAC GTGAGAATTC TTCTGTCTAG CAGAATATGA AGAAATCCCG AAACCAACGA 60
AGGCCTCAAG GAGGTCTGAA TATCCACTTG CAGACTTTAC AAACAGAGTG TTTCCTAACT 120
GCTCTATGAA AAAGAAAGGT TAAACTCTGT GAGTTGAACG CACACAAACA CAAAAGGAGT 180
TTATGAGAAT ACTTACTGTA CTAGTTTCTA TAAAGAAGAT ATTT 224 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 78:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 143 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-5 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 78: TATATATCAC GTAAGGTAAA TTAACTGAAA GTAAAATTGG AAAATGTGGC TAAAAGGGGG 60 GAAAATAATC AAGTTTATAC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGACAACG TTGGCGTAAT 120 CAAGGTCATA GCTGTGTCCT GTG 143
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 79:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 76 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 79: GATCTGCCCA CCTCGGCCTC CCAAAGTGCT GGGATTACAG GTGTGAGCCA CCACGGCTGG 60 CTGCATCAGT GTGATC 76
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 80:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 106 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 80: GATCAATTGC AATGTAAACT CACTCTTTGT GTGAAAGGAA AAAAAATGCT TAATATCTTT 60 TTGCTGGTGG AGGGCCTTGC TCAGTGTGGA TGGCTGCTGA CTGATC 106
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 81:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 38 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HT29-9
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 81: TATATATCAC GTACTGTCAC TCAGGCTGGA GGGTAGTT 38
( 2 ) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 82 :
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE : 78 Basenpaare
(B) ART : Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH1
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 82: GATCAAAACG CAGAACCATT TGTGTTCTAT ACAATTTATC ACATCAATTA GTAGATTTGT 60 GCAATGACCA GCATGATC 78
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 83:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 122 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH3
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 83:
GATCGATTCC ATACCTTGTC TATTGTGAAT AATGCAATAA TAAACATGAG AGTGCAGGTA 60
TCCCTTTGAC ATACTGATTT CTCGTGCTTT GGATAAATGC CAATTAGTGA CATTTTTGGA 120
TC 122 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 84:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 80 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH4
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 84: GATCCTGTCC ATATCCTGTG CAGTGATAAC TCCAGGAACT TGAACTACTG CCAAGAATTT 60 TCTACTGATA CTCATGGATC 80 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 85:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH5
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 85: GATCAAGTCG TCAGCTCCGT AACCAGCTTA TGCCAGGCTA GAACCTCATG GCCCCCAGTG 60 ATC 63
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 86:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 107 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 86: GATCAATTGC AATGTAAACT CACTCTTTGT GTGAAAGGAA AAAAAATGCT TAATATCTTT 60 TTGCTGGTGG AGGGCCTTGC CTCAGTGTGG ATGGCTGCTG ACTGATC 107
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 87:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 36 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : BH7
(xi) ΞEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO: 87: GATCTGGCTT TCAAATGCCT GGGAGGCCAA CAGATC 36
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 88:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 184 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid (C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB1
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 88:
GGCAACCTAC AGAATGGGAG AAAATTTTTG CAATCTATCA TCTGACAGAG GTCTAATATC 60
AGAATCTAAG AAAAACTTAA ACAAGTTTAC AAGAAAAAAA CAAACAACCC CATAAAAAAG 120
TGGGTGAAGG ATATGAACAG ACAGTTCTCA AAAGAAGACA TTTATGTGGT CAACGAACAT 180
ATGA 184 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 89:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 219 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB11
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 89:
CAGACATGAG CCACCACGCC CGGCCAGGAA TGAATGTTCT ATGCATGAAA CTGTAAACGG 60
CTTATTGCTA TAATTGTCCT AGTTTATTAT TGTTAATTTC TTACTGTACC TAATTTATAA 120
ATTAAGCTTT ATCAGAGGTA TGTATGTATT AGAAAAAATA TAACATATAT AGGATACAGT 180
ACTATCCAGG ATCAGGAATC TACTGGGCAT ACTAGAAAG 219 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 90:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 179 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB12
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 90: AACTGTAAAC GGCTTATTGC TATAATTNTC CTAGTTTATT ATTGTTAATT TCTTACTGTA 60 CCTAATTTAT AAATTAANCT TTATCAGAGG TATGTATGTA TTAGAAAAAA TATAACATAT 120 ATAGGATACA GTACTATCCA TGGTTTCAGG AATCTACTGG GCATACTAGA AAGATCCCC 179 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 91:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 234 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB14
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 91:
GGAGCTACAA TTCAAGATGA GATTTGGATG GGGACACTGC CAAACCATAT CATGGGGTTT 60
GTCACTGGCC TGGATGGAAC ATCCTTGTCA AGAGCACACA CACACACACA CACACACACA 120
CACACTTAGA GAGACAGACA AAGAAGAGAG AGAGGAGAGG CACGGTTATA ATGAGGATGG 180
ACAGGTGATT TTGGAAGCTG AGAGTCATTA CTGCCACTGC CAGCTAGGTG TAAT 234 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 92:
( i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 269 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB16
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 92:
TGTTATTATA ATTATCAGTC CTGAAACCTG TCTCATCTTA GAAACATAGA TTCTATACAA 60
GTGGCCCTGG AGTGCCTTTT AAGATGTTCT CAGGAGATTT TGGTTGTCTT CTAAACTTTC 120
TGGAAACATC TTGTTCATTT CGTATTCTGG TGGAAACATC TTGTTCATTT CGTATTCTGG 180
ATTTAAAATT AGCTATTTCT CCAAGGAGAT GTCAGCCATT GTGTTTATAC AAACTTGAGT 240
TCCTTTAAGG TTTAACCTTC ATTCAAGAA 269 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 93:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 256 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB17 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 93:
GAAACTGATA AGTTGTTTCT CTAGCTTTTA AAAATACATG GAGTGAGTTC TATAATTCCT 60
CAGGAAGTAA GAGCTGTTCC TTTTGAGCTG AAGAACATAT TGCAATTCCT ATTTCATTGC 120
AGAGATATTT CTCTACTTTA AAATGCTACC CGCTTCTCAT CCACACAAAA ATTGTGAAAC 180
AGAGGGGGCT GGGGCAGTAA GGAAGTTATG AAGAAAGTAA TTCACATTAG GTGAGCTGGA 240
GCCAATAGCT TAATTT 256 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 94:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 295 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB18
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 94:
TAGGTGGTGC GTGCCTGTAG TCCCAGCTAC TCGGGAGGCT GAGGCACGAG AATCACTTGA 60
ACCCGTGAAG CAGAGGTTGC AGTGAGCCGA GATCACCCAC TGCACTTCAG CCTGGGCAAC 120
AGAGCAAGAC TCCGTCTCAA AAAAAAAAAA CAAAAAACCA AAAACTTCTT TATATGTAAG 180
AAGAGATGTT CCTGACATGA AAAATAGCAC CTTTACAGCA CTTTTCTCTA GTGTGGACAC 240
TGGCGGATTA CCAAGGTTGT CATTTAAATA CAGATGACAG TTCCACTCAG AGGTT 295 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 95:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 166 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB19
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 95: CCGTCACCAT GCCCAGCTAA TTTTTTTTGT ATTTTTAGTA GAGATGGGGT TTCACTATGT 60 TGGCCAGGTG GTCTTGAACT CCTGAACTTG TGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC 120 AAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT CCTGTGTGAA ATGTTA 166
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 96: (i) SEQUENZKENNZEICHEN: (A) LANGE: 110 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB2
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 96: AGACCTAAAA CCATAAAAAC CCTAGAGAAA ACCTAAGGCA TTAACCAATT CAGGACATAG 60 GTGGGCAGGA TTAAGTCAAA ACACCAAAAT AATGGCAACA AAAGCCAAAA 110
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 97:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 244 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB20
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 97:
AGACGCCATC TCAAAAAAAA AAAAAGCTAT GATTGGGTAA GATTATAAGA AGGATAGTTA 60
AAAATAAATA CCACCTAAAT ATGAACCTAA AGAAAGCGAG TATAAAAATG TAAATATGTG 120
ATATGATAAA CTTAGGTTTA AAAATATCAA TAAGGGCTAC TCTGTATCAT AGTATACAAG 180
TGGACATGGC TGGGCCAGTG GCTCACGCCT GTAATCCAAC ACTTTGGGAG GCAGAGGCAG 240
GCGT 244 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 98:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 180 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB22
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 98: GTCAATCTCA CTCTCTCCCC CAGGCTGAAG AGCAGTGGTG CGATCCTCTA GAGTCGACCT 60 GCAGGCATGC AAGCTTGGCG TAATCATGGT CATAGCTGTT TCCTGTGTGA AATTGTTATC 120 GCTCACAATT CCACACAACA TACGAGCGGA AGCATAAGTG TAAAGGCCTG GGTGCCTTAA 180
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 99:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 176 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB24
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 99: AAAATTTTTG GGCATTTCTA TATCATATTA NCCAGAAACT CAGCATACTT TAAAAAGTTA 60 CCACATACAC AAAAAAGCAA GAAATACAGA CTCATAAAAA ATAAATCAAT TATTAAAAAC 120 AAATTCACAG ATAATCCAGA TATTGGAGTT AATAGATAGG GCATCATAAT ATCTAT 176
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 100:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 220 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB25
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 100:
GGCACATGTC ACCATACTGC ACTATTTTAA ATTTTTTGTA GGTCTTGCTA TGTTGCCCAG 60
TCTGGTCTCG AACTCCTGAC CTCAAGCAAT CCTCCCACCT TGGCCTCCCA AAGTGCTTGC 120
ATTACAGGCA TGAGCACTGC CTGGCCCACC CAGGCAGTTC AAAAGCATCT TGAGAGTTCA 180
AAAGCATATT GGTGAGACTC ATTCCATGAG GCTGGTGAGG 220 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 101:
(i ) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 192 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB27 (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 101:
AGATGTGAGC ACCCTACTTG GCCAGCCACC TGAAATTCTA TCAGTGACAG ATTCCTTTAG 60
CTGAAGTCAT GTTCAAATGT AATCCTCCCA AGAATGGTAA CATTATACAT CAATGCATTA 120
AACAAAACAA CCTGTGCTTA TGAAAAAGTC ATATGTGCAC ACGGTAAAAC AAAATTCAAA 180
TAGTACAAAG GG 192 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 102:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 120 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB3
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 102: ATATGTCTTG ANGATGCACT TCCAAGGTCA TGAATGGAAC TCCACCAGCC ACAAAAAGAC 60 CTGCCTATAC CTGGAGTATC GTGCAGTCAG AGTGCTCCGN CTCCTGTGGT GGAGGTAGAT 120
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 103:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 215 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB32
(xi) SEQUENZBEΞCHREIBUNG : SEQ ID NO: 103:
ACAGAGCAAG ACCCCATCTC AAAAAAAAAA AAAGCTATGA TTGGGTAAGA TTATAAGAGG 60
GATAGTTAAA AATAAATACC ACCTAAATAT GAACCTAAAG AAAGCGAGAT AAAAAGTAAA 120
TATGTGATAT GATAAACTTA GGTTTAAAAA TACAATAAGG GCTACTCTGT ATGTATAGTA 180
TACAGTGGTA CATGGCGGGC CAGTGGCTCA CGCTG 215 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 104:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 222 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
( i i ) ART DES MOLEKÜLS : Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB34
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 104:
TTTTTCACAT TCCAATGGGA AAATAACATG GAGCACGGCG TGTTCCCCTC AAGGATAGCT 60
GACAAAGGAA AAGGCCCTTC CTTTATCTCC ACTGGGAGTT TTGTTTTCCT TTTATCTAAA 120
AGGGGTTATC AGTGCTGCTC AAATAAAGAA GAAATGTGTG ATTGAAATGG GTGGAGGATA 180
TGCTAGGGAG AAAAAGAAAG CCTGAACAAA TGAAAATTGT AT 222 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 105:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 103 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB36
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 105: AACCCCCAAC CCCCCCTCTC CTCCTTCTTA CTCAACGCCT TCGGGCTACT CAACGCCACT 60 CCCTTCTCAC CCCTCAGCAC CCTCCAAACA GACACATCGA ACA 103
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 106:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 253 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB37
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 106:
AAGAGTCTGT TGGATTTAAT ATTTTTTAGA AGGTTTGGTG AATTGGTGTT TGCAAAAGCC 60
AATTGCTGTG CATTGAGGAA TATGTTTGAT TATTCATTCA AGTAATAAAA AACAAAAAAT 120
CAAGCTGACT CTTGAAGAGG CCCCCCCACA CACACACAAA AGAAAGAAAT GTTTGTCTTA 180
TGTGCTAAGC CTGTTCTAGG TTGTTGAGGA TGTACTGGTA AACCAAATGT CCTGTGTTAT 240
GACACTTAGA TCT 253
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 107:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 245 Basenpaare (B) ART: Nucleotid 87
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vi-.) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB39
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 107:
GCCAGTTCCT TTAGGTGCAT CATTAGGCTG TTTATTTGAA GTCTTTCTAT CTTTTTGATG 60
AAAGCATTTA TTGCTATAAT CTTCCCTCTT AGAACAGTTT TTGCTGTATC CCATAGGTTT 120
TGATATATTG TGTTTCCATT GCCATTTGTC TTAAATTTTT AAATTTTCTT TTTAATTTCT 180
TCACTGGCTC ATTCATTGTC CAGGAGCATT GCTGTTTAAT TTCATGAGTT TGTGCAGTTT 240
CAACA 245 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 108:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 98 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB40
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 108: TTATCAGAAG ACAGGTAATG TTGACACATG GAGCTCTGAG ATAAATGGTC TCAAGAGAAG 60 GGATCCTCTA GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTGG 98
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 109:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 243 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB41
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 109:
AGAAGGTTTG GTGAATTGGT GTTTGCAAAA GCCAATTGCT GTGCATTGAG GAATATGTTT 60
GATTATTCAT TCAAGTAATA AAAAAGAAAA AAGCAAGCTG ACTCTTGAAG AGGCCCCCCC 120
ACACACACAC AAAAGAAAGA AATGTTTGTC TTATGTGCTA AGCACTGTTC TAGGTTGTTG 180 AGGATGTACT GGTAAACCAA AATGTCCTGT GTTTATGACA CTTAGATTCT AATAGTTGGA 240 GAT 243
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 110:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 306 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB43
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 110:
CCCTGTCTCT ATTAAAAATA CAAAATTAGC TGTGTGTGGT GGCACACGCC TGTAGTCCCA 60
GCTACTTAGG AGGGGAGGGA GGTGCCAGGC TCTTTTTAAC AATCAGCTCC CACAGGAACT 120
AATAGAGGAA GAACTCACTC ATTACCACAA GGACAGCACC AAGCCATTCA TGACGGATGT 180
ACCTGCATGA CCCCAACACC TCCAGTTAGG CCCAACGTTA GGGATCATGA TAACTATGGG 240
TGTGGTTATG ACTTTTTAGA TGGTACACCA AAGGCACATA AATGAAAACA TAACTGAATC 300
CTAGAC 306 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 111:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 237 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB44
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 111:
GGAAAAGCAT GGATGGGATT TAAGCTACAC ATACATGCTC CAAGGTTATT TTAATTTCTG 60
CAAATAACAA TGAAATAAGG TATTTCTTTA GCTGTAATAA ACATCCTTTG CAAATCATTA 120
TTAGATGTTT TATCTTAAGA TAAATTTTTC AAACCAAAGA AAGTTTCAAA CTTTGAACTT 180
TAAATGAAAT ATCAAATTCC TTAATATCAC TTTTAATATT CAAATTAAAT CCATGCA 237 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 112:
( i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 212 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB45
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 112:
GAGAATTCTT CTGTCTAGCA GAATATGAAG AAATCCCGAA ACCAACGAAG GCCTCAAGGA 60
GGTCTGAATA TCCACTTGCA GACTTTACAA ACAGAGTGTT TCCTAACTGC TCTATGAAAA 120
AGAAAGGTTA AACTCTGTGA GTTGAACGCA CACAAACACA AAAGGAGTTT ATGAGAATAC 180
TTACTGTACT AGTTTCTATA AAGAAGATAT TT 212 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 113:
(i ) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 131 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB5
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 113: AAGGTAAATT ATCTGAAAGT AAAATTGGAA AATGTGGCTA AAAGGGGGGA AAATAATCAA 60 GTTTATACCT CTAGAGTCGA CCTGCAGGCA TGACAACGTT GGCGTAATCA TGGTCATAGC 120 TGTGTCCTGT G 131
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 114:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 218 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB6
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 114: AAGACCANTG AGAGACAATG CAGTCGCTGG GACAACCAGA TTGGACCAGG CAGTCAAGGT 60 GGCTTGGAGG CCACAGCGAG AATTAAAATA CACTGAGAGA TTATACTTCA GGATCCTCTA 120 GAGTCGACCT GCAGGCATGC AAGCTTGCTA ATGCATGGTC TCATAGCTGT TTCCTGTGTG 180 AAATTGTTAT TCCTCCTCAC AATTCCACAC AACATACC 218
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 115: (i ) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LÄNGE: 323 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB7
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 115:
GTCAATCAAT TTTATGAGAA TAGCATTGAA TCTATAAATT ACTTTGGGCA GTATGGCCAT 60
TTTCATGATA TTGATTCTTC CTATCCATGA GGATGGAATG TTTTTCCATT TGTTTGTGTC 120
CTCTCTTATT TCCTTGAGCA GTGGTTTGTA GTTCTCCTTG AAGAGGTCTT TCACATCTCT 180
TCTTACCTGT GTTGTTAGGT ATTTATTCTC TTTGTAGCAG TGGCAAATGG GAGTTTATTC 240
ATGATTGGCT CTCTGCTTGT TATTGTTGAG TAAGGAGTAC TGTGATTTGC ACATGCTTGC 300
ATCTAGACTT ATGAGTGCTA CAG 323 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 116:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT: (B) CLON(E) : HB9
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 116: ACTGTCACTC AGGCTGGAGG GTAGTT 26
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 117:
( i) SEQUENZKENNZEICHEN :
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: beides
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 117:
Cys Gin Arg Lys Leu Lys Glu Leu Glu Val Ala Glu Ser Asp Gly Gin
1 5 10 15
Val Glu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Glu Cys
20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 118: (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: beides
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 118:
Cys Glu Leu Glu Arg Leu Arg Ala Glu Ala Gin Gin Leu Arg Lys Glu 1 5 10 15
Glu Arg Ser Trp Glu Gin Lys Leu Glu Cys 20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 119:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: beides
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 119:
Cys Glu Ala Gin Val Leu Asp Ala Leu Val Glu Glu Lys Arg Gin Val 1 5 10 15
Ser Glu Glu Lys Arg Gin Lys Glu Ala Cys 20 25
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 120:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 18 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 120: ACCGCCTCTC CCCGCGCG 18
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 121:
(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) ART: Nucleotid
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Genom-DNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO : 121: GCGTTGCTGG CGTTTTTCAT A 21

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis, zur Identifizierung, zur Gewinnung oder Beseitigung von menschlichen oder tierischen Zellen mit gestörter
Zellzykluskontrolle oder mit der Fähigkeit zu unbegrenzter Proliferation oder zur Turmorbildung, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man das Vorliegen eines Assoziats aus dem cdc37Protein mit extrachromosomaler Nukleinsaure in Zellen oder Gewebsflüssigkei- ten nachweist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass der Nachweis des Assoziats mit einer mit dem Assoziat spezifisch bindefähigen nachweisbaren Substanz erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man als spezifisch bindefähige Substanz einen mit dem
Assoziat bindefähigen Antikörper verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man als Antikörper polyklonale Antikörper, einen monoklona- len Antikörper, einen rekombinanten Antikörper oder ein bindefähiges Fragment eines dieser Antikörper verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man Antikörper verwendet, die gegen das cdc37Protein gerichtet sind.
6. Verfahren nach Anspruch 4, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man Antikörper verwendet, die gegen die extrachromosomale Nukleinsaure gerichtet sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man einen markierten Antikörper verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 7, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man einen Antikörper verwendet, der mit einem Enzym, einem Radionuklid, einem Farbstoff oder einer toxisch wirksamen Substanz gekoppelt ist.
9. Verfahren nach Anspruch 2, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass man als bindefähige Substanz eine mit der Nukleinsaure des Assoziats hybridisierende Nukleinsaure oder Oligonukleotid ver- wendet.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u rc h g e k e n n ze i c h n et , dass der Nachweis des Assoziats in einer Gewebebiopsie, einem Gewebeabstrich, einer Körperflüssigkeit oder einem Zellaufschluss durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass der Nachweis des Assoziats in einer mitochondrienfreien
Cytoplasmafraktion oder einer Körperflüssigkeit durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass der Nachweis des Assoziats auf einer Zelloberfläche durchgeführt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass der Nachweis des Assoziats auf Zelloberflächen mit bindefähi gen Substanzen durchgeführt wird, welche an einen festen Träger gebunden vorliegen und die dadurch gebundenen Zellen von den übrigen Zellen abgetrennt werden.
14. Anwendung des Verfahrens von Anspruch 13 zur Entfernung von Zellen mit gestörter Zellzykluskontrolle, mit der Fähigkeit zu unbe- grenzter Proliferation oder zur Tumorbildung aus Blut, Knochenmark oder anderen Körperflüssigkeiten.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8 und 10 bis 14, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man Fc-tragende Antikörper verwendet und mit dem zell- haltigen Substrat inkubiert bis das Assoziat tragende Zellen lysiert sind.
16. cdc37Protein als Assoziat mit extrachromosomaler Nukleinsaure.
17. Assoziat nach Anspruch 16, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass die extrachromosomale Nukleinsaure DNS einer Tumorzelle oder eine RNS-Kopie solcher DNS darstellt.
18. Verfahren zur Gewinnung eines Assoziats nach einem der Ansprüche 16 und 17, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die Cytoplasmafraktion permanent teilungsfähiger menschlicher oder tierischer Zellen durch Zusatz von Detergenzien oder/und durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Zellen behandelt, die Mitochondrien aus der behandelten Cyctoplasma- fraktion abtrennt und das Assoziat durch selektive Präzipitation, elektrophoretisch oder chromatografisch gewinnt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man die mitochondrienfreie Cytoplasmafraktion durch NaCI- Zusatz auf 1,5 M, Entfernung des gebildeten Präzipitats und Fällung des Assoziats aus dem erhaltenen Überstand mit Ethanol oder Ammoniumsulfat gewinnt.
20. Verfahren nach Anspruch 18, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man eine Cytoplasmafraktion, welche Organellen oder/und Membranen enthält, mit einem proteolytischen Enzym inkubiert und anschließend das Assoziat aus dem Lysat gewinnt.
21. Verfahren nach Anspruch 20, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man das Assoziat aus dem Lysat mit Ethanol oder Ammoniumsulfat fällt oder chromatografisch reinigt.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n e t , dass man als proteolytisches Enzym Proteinase K bei einer Tempe- ratur von 50 bis 70 °C während 0,5 bis 3 Stunden inkubiert.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 23, d a d u rc h g e k e n n z e i c h n et , dass man das cytoplasmische Lysat mit einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch extrahiert und das Assoziat aus der organisch wässrigen Interphase gewinnt.
24. Verfahren nach Anspruch 23, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass man die Interphase mit Phenol und Chloroform extrahiert.
25. Verfahren nach Anspruch 24, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass man das Assoziat aus der organisch wässrigen Interphase mit
Ethanol fällt.
26. Antikörper mit Spezifität für cdc37Protein-Nukleinsäure-Heteromere in markierter oder unmarkierter Form.
27. Antikörper nach Anspruch 26, der mit einem Enzym, einem Radio- nuklid, einem Farbstoff oder einer toxisch wirksamen Substanz gekoppelt ist.
28. Antikörper nach Anspruch 26, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n et , dass er mit einem Enzym, Radionuklid, Farbstoff oder Toxin gekop- pelt ist.
29. Pharmazeutisches Präparat, g e k e n n ze i c h n et d u r c h einen Gehalt an Antikörper nach Anspruch 26.
30. Präparat nach Anspruch 29, enthaltend Antikörper gemäß Anspruch 27.
31. Pharmazeutisches Präparat, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h einen Gehalt an Nukleinsaure oder Peptid, die an die Nukleinsaure nach Anspruch 17 binden.
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