JP6979698B2

JP6979698B2 - ヒト化抗−ｂａｇ３抗体

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Publication number: JP6979698B2
Application number: JP2018522955A
Authority: JP
Inventors: カテリナタルコマリア; ロサーティアレッサンドラ; デローレンツィヴィンチェンツォ; サーラジャンルカ
Original assignee: ビオウニヴェルサソシエタアレスポンサビリタリミタータ
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2021-12-15
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CN108350065B; JP2019500855A; US20210122818A1; EP3371216A1; WO2017076878A1; CN108350065A; PL3371216T3; ITUB20155097A1; CA3003613A1; EP3693387A1; US20190153090A1; EP3371216B1; US10889644B2; AU2016348615A1; ES2808947T3; BR112018008977A2

Description

本発明は、ヒト化抗−ＢＡＧ３抗体又はその断片、前記抗体を含む医薬組成物、及び医薬としてのその使用、特に、膵臓の腫瘍又は免疫、炎症、新生物、心血管及び／又は変性性の他の病状の治療における使用を提供する。

ＢＡＧ３タンパク質は７４ｋＤａの細胞質のタンパク質であり、ＢＡＧドメイン（１１０〜１２４のアミノ酸）として知られる構造ドメインを介してＨＳＰ７０タンパク質（熱ショックタンパク質）のＡＴＰアーゼドメインと相互作用するコシャペロニンのファミリーに属する。更に、ＢＡＧ３タンパク質は、他のタンパク質との結合を仲介することができるＷＷドメイン（Ｔｒｐ−Ｔｒｐ）、プロリンリッチ領域（ＰＸＸＰ）、及び２つの保存モチーフＩＰＶ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ）を含有する。多くの機能性ドメインの存在に起因する、アダプターとしてのＢＡＧ３タンパク質の性質のおかげで、そのようなタンパク質は異なるタンパク質と相互作用することができる。

ヒトにおいて、ＢＡＧ３遺伝子の発現は、筋細胞を含む少しの種類の正常細胞について本質的であり、一方、それらの変異は骨格筋及び心筋の疾患と関連している。更に、ＢＡＧ３タンパク質は、多くのタイプの原発腫瘍又は腫瘍細胞株（リンパ又は骨髄の白血病、神経芽細胞腫、膵臓癌、甲状腺癌、乳癌及び前立腺癌、黒色腫、骨肉種、グリア芽腫並びに腎臓、結腸、卵巣などの腫瘍）で発現している（Rosati A. et al., 2011（非特許文献１））。

白血球、上皮細胞及びグリア細胞、並びに網膜の細胞のような正常細胞型においては、ｂａｇ３遺伝子の発現は、酸化剤、高温、血清の欠乏、重金属、ＨＩＶ−１の感染などのようなストレス要因によって誘導され得る。これらの知見は、ｂａｇ３遺伝子発現調節がストレスに対する細胞の応答において重要な要素であり、ｂａｇ３遺伝子プロモーターにおける細胞ストレスの様々な形態において活性化される転写因子ＨＳＦ１（熱ショック転写因子）に対して応答する要素の存在に関連することを示している（Franceschelli S., et al.,2008（非特許文献２））。

更に、それらの構造における多くのタンパク質−タンパク質相互作用ドメインの存在によって、異なる分子のパートナーと相互作用するために、ＢＡＧ３タンパク質は、異なるタイプの細胞において細胞の生存に影響する（Rosati A. et al., 2011（非特許文献１））。ＢＡＧ３抗アポトーシス活性に関連して報告された最初のメカニズムは、ＢＡＧ３タンパク質が転写因子ＮＦ−ｋＢの活性及び細胞生存を調節することが観測された骨肉腫及び黒色腫細胞において同定された（Ammirante M.et al., 2010（非特許文献３））。異なる分子メカニズムは、ＢＡＧ３タンパク質がＨＳＰ７０タンパク質と共に、積極的に協働してサイトゾルにＢＡＸタンパク質を維持し、ミトコンドリアへのＢＡＸタンパク質の移動を抑止する膠芽腫細胞で説明されている（Festa M.et al., 2011（非特許文献４））。最後に、いくつかの腫瘍において、ＢＡＧ３は細胞接着を調節するタンパク質を調整することが示された。

細胞質ＢＡＧ３タンパク質の存在は、多くの異なる細胞系においても説明されてきており、様々な腫瘍だけでなく細胞生存に一般的に関連している病状とも関連付けられている。

更に、特許出願（国際公開２０１１／０６７３７７号（特許文献１））は、心臓病理及び膵臓の腫瘍のような特定の病理学的状態の診断に高度に特異的である、血清中の生化学マーカーとしていくつかの細胞型によって分泌される細胞外ＢＡＧ３タンパク質を記載している。

膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有する患者の３４６人中３４６人でＢＡＧ３タンパク質が発現され、膵臓の腫瘍の細胞から放出されていているが、そのようなタンパク質は周囲の非新生物性組織又は正常な膵臓の双方からは発現されていないことが近年報告されおり、同様に、ＢＡＧ３の発現レベルは患者の生存に関連していることが報告されている。研究結果は、ＢＡＧ３ｍＲＮＡに対する特異的ｓｉＲＮＡの使用がｂａｇ３遺伝子発現を抑えることを示し、ＢＡＧ３タンパク質が膵臓腫瘍細胞に対する重要な生存因子であり、ゲンタマイシンと組み合わせたときにＢＡＧ３タンパク質の下方調節は、腫瘍細胞の根絶に貢献するであろうことを確認した（Rosati A. et al., 2012（非特許文献２））。

更に、最近の論文において、我々は、ＰＤＡＣから放出されるＢＡＧ３がマクロファージに結合し、それらの活性化及びＰＤＡＣサポート因子の分泌を誘導することを報告した。我々はまた、ＢＡＧ３受容体としてＩＦＩＴＭ−２を同定し、これがＰＩ３Ｋ及びｐ３８ＭＡＰＫ経路を通してシグナル伝達することを示した。最後に、我々は、マウスモノクローナル抗−ＢＡＧ３抗体の使用が、３種の異なるマウスモデルで腫瘍の成長の低下をもたらし、転移形成を防止することを示した。従って、我々は、ＰＤＡＣ成長及び転移の拡大に関与するパラクリンループを同定し、抗−ＢＡＧ３抗体が治療の可能性を有することを示した（Rosati A. et al., 2015（非特許文献３））。

腫瘍の病状の従来の化学療法治療、並びに、コルチコステロイド又はＮＳＡＩＤs（非ステロイド性抗炎症薬）を用いた炎症及び免疫疾患の治療は、副作用に結びつけられる多くの障害を引き起こし、現在では、このような病状を治療する最終的な手段ではない。

国際公開第２０１１／０６７３７７号欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書国際公開第９０／０７８６１号国際公開第８９／０９６２２号国際公開第０３／０５５９０８号

Rosati A. et al., 2011 Franceschelli S., et al.,2008 Ammirante M.et al., 2010 Festa M.et al., 2011 Rosati A. et al., 2012 Rosati A. et al., 2015 Kohler and Milstein 1975 Clackson et al., 1991 Kettkeborough C. A. et al., 1991 Kalluri,2016

従って、本発明で開示されている炎症、免疫、及び新生物性の疾患の治療的処置に使用される、従来から一般的に知られている療法と比較して、高度に特異的であり、副作用がほとんどないか全くないという利点を有する新規で改善された治療に対する明白な必要性がある。

定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される当分野の全ての用語、表記、及び他の科学的術語は、この開示が関連する当業者によって共通して理解される意味を有することが意図される。いくつかの場合には、共通して理解される意味を有する用語は、明確性のために及び／又はすぐに参照できるように本明細書で定義される。従って、本明細書においてこのような定義を含めることは、当分野で一般に理解される意味を超える実質的な差を表すと解釈すべきではない。

本明細書で使用される用語「抗体」は、その抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有し及び／又は同じ生物学的活性を示す「断片」又は「誘導体」を含む。

抗体は、好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖と、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖を含む。免疫グロブリン鎖は、可変領域と、任意選択的に定常領域を含む。可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、例えばＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域、及び、フレームワーク領域を含みうる。

用語「ヒト化抗体」とは、ヒト起源の抗体であって、その超可変領域が、ヒト以外のモノクローナル抗体の相同領域によって置き換えられたものをいう。

用語「キメラ抗体」とは、異なる抗体に由来するタンパク質を含有する抗体をいう。

用語「組み換え抗体」とは、組み換えＤＮＡ法を用いて得られた抗体をいう。

用語「ｓｃＦｖ断片」（単鎖可変断片）とは、関連している抗原にのみ結合することができる免疫グロブリン断片をいう。ＳｃＦｖ断片はペプチドリンカーを用いて、二量体（ダイアボディ（diabodies））、三量体（トリアボディ（triabodies））、および四量体（テトラボディ（tetrabodies））にも合成できる。

用語「Ｆａｂ断片」（抗原結合断片）及び「Ｆａｂ２断片」とは、隣接する重鎖のＦｃ断片に結合している軽鎖からなるＦｃ断片免疫グロブリン断片をいい、そのような断片は一価抗体である。Ｆａｂ部分が２つで１組になっている場合、この断片はＦａｂ２と呼ばれる。

用語「ハイブリドーマ」とは、モノクローナル抗体を生産する細胞をいう。

用語「単一特異性抗体」とは、全てが同じ抗原に対して親和性を有する抗体をいう。

用語「多重特異性抗体」とは、いくつもの抗原に対して親和性を有する抗体をいう。

用語「二重特異性抗体」とは、２種類の異なる抗原に対して親和性を有する抗体をいう。

ペプチド２（ＢＡＧ３断片）を用いたコーティングによる抗体結合活性についてのスクリーニングを示すＥＬＩＳＡ。全長の組換えＢＡＧ３タンパク質を用いたコーティングによる抗体結合活性についてのスクリーニングを示すＥＬＩＳＡ。マクロファージ表面へのＢＡＧ３結合をブロックする抗体変異体の能力のフローサイトメトリー評価。ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍成長についてのヒト化ＡＣ−２抗体変異体の効果。腫瘍塊内の活性化された線維芽細胞についてのヒト化ＡＣ−２抗体変異体Ｈ２Ｌ４の効果。活性化された線維芽細胞数についてのＡＣ−２Ｈ２Ｌ４効果の定量化

本発明の開示
驚くべきことに、特異的ＢＡＧ３阻害剤が腫瘍の退行を誘導できることが、本発明者らによって見出された。特に、ヒト化抗−ＢＡＧ３抗体が試験され、ＢＡＧ３抗体に対して著しい親和性を示し、ＢＡＧ３阻害剤として治療に使用することができる。これは、ヒト化抗−ＢＡＧ３抗体は、ＢＡＧ３タンパク質と、マクロファージ表面のその受容体との間の相互作用を阻害するためである。

更に、本出願で報告される実験データは、前記抗−ＢＡＧ３抗体が線維芽細胞の活性化を低下させるのに特に効果的であり、従って、線維芽細胞が高度に活性化される全ての病状、例えば新生物性疾患、炎症性疾患、免疫疾患及び／又は変性疾患などの治療に、これらを使用することができることを示している。

従って、本発明の第１の実施形態は、ＢＡＧ３タンパク質に結合する抗体又はその断片であって、
ａ）配列番号１２によってコードされる重鎖アミノ酸配列若しくは少なくともその可変領域、又はこれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、及び、
ｂ）配列番号２０によってコードされる軽鎖アミノ酸配列若しくは少なくともその可変領域、又はこれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含む抗体又はその断片に関する。

本明細書において使用される２種類のポリペプチド配列間の「配列同一性」とは、その配列間、好ましくは、配列番号１２及び配列番号２０によってコードされるアミノ酸配の全長にわたる配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを指す。本発明の好ましいポリペプチド配列は、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、更に好ましくは、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。

本発明の好ましい実施形態では、配列番号１２に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１８から選択される。

更に好まし実施形態では、配列番号２０に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列は、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６から選択される。

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、重鎖アミノ酸配列が配列番号１８によってコードされ、軽鎖アミノ酸配列が配列番号２２又は配列番号２６によってコードされる抗体である。

好ましい実施形態では、重鎖アミノ酸配列若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲｓ領域を含み：Ｈ−ＣＤＲ１はアミノ酸ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＹ（配列番号３）を含み、Ｈ−ＣＤＲ２はアミノ酸ＧＶＤＰＡＮＧＮＴＲＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号４）を含み、Ｈ−ＣＤＲ３はアミノ酸ＤＧＡＭＤＹ（配列番号５）を含み、軽鎖アミノ酸配列若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲｓ領域を含み：Ｌ−ＣＤＲ１はアミノ酸ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号６）を含み、Ｌ−ＣＤＲ２はアミノ酸ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７）を含み、Ｌ−ＣＤＲ３はアミノ酸ＱＱＹＹＴＹＰＬＴ（配列番号８）を含む。

本発明の更なる実施形態は、ＢＡＧ３タンパク質に結合する抗体又はその断片であって、
ａ）配列番号１１によってコードされる重鎖ヌクレオチド配列若しくは少なくともその可変領域、又はそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列、及び、
ｂ）配列番号１９によってコードされる軽鎖ヌクレオチド配列若しくは少なくともその可変領域、又はそれらの少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列
を含む抗体又はその断片である。

本明細書において使用される２種類のヌクレオチド配列の間の「配列同一性」とは、その配列間、好ましくは、配列番号１１及び配列番号１９によってコードされるヌクレオチド配列の全長にわたる配列間で同一であるヌクレオチドのパーセンテージを指す。本発明の好ましいヌクレオチド配列は、少なくとも８５％、より好ましくは９０％、更に好ましくは、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。

本発明の好ましい実施形態では、配列番号１１に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記ヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１７から選択される。

更に好まし実施形態では、配列番号１９に関して少なくとも８０％の配列同一性を有する前記ヌクレオチド配列は、配列番号２１、配列番号２３又は配列番号２５から選択される。

好ましい実施形態では、本発明の抗体は、重鎖アミノ酸配列が配列番号１７によってコードされ、軽鎖アミノ酸配列が配列番号２１又は配列番号２５によってコードされる抗体である。

本発明による抗体又はその断片は、天然及び／又は合成起源の任意の抗体、例えば哺乳動物起源の抗体であってよい。好ましくは、存在する場合、定常領域はヒト定常領域である。可変領域は、好ましくは、哺乳動物可変領域、例えばヒト化された可変領域又はヒト可変領域である。

本発明による抗体又はその断片は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体でありうる。モノクローナル抗体が好ましい。特に、本発明の抗体は、好ましくは、組換え抗体
、ヒト化抗体若しくは完全ヒト抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体、又はこれらの断片よりなる群から選択される。

モノクローナル抗体は、ケーラー及びミルスタイン（１９７５）（Kohler and Milstein (1975)（非特許文献７））の方法などの任意の適切な方法によって、又は組換えＤＮＡ法によって産生することができる。モノクローナル抗体はまた、クラクソンら（１９９１）（Clackson et al. (1991)（非特許文献８））に開示された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離されうる。

抗体のヒト化形態は、キメラ化又はＣＤＲグラフティングなどの当分野で公知の方法（Kettkeborough C. A. et al., 1991（非特許文献９））によって生成することができる。ヒト化抗体の産生の別の方法は、当分野で周知であり、例えば欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書（特許文献２）及び国際公開第９０／０７８６１号（特許文献３）に記載されている。ヒト抗体は、ｉｎｖｉｔｒｏ法によっても誘導することができる。適切な例には、ファージディスプレイ、イーストディスプレイなどが含まれるが、これらに限定されない。

本発明によれば、「キメラ抗体」は、例えばマウスとヒトなどの異なる種からのポリペプチドを含む抗体に関する。キメラ抗体の産生は、例えば国際公開第８９／０９６２２号（特許文献４）に記載されている。

用語「抗体」は、その抗体の少なくとも１つの抗原結合部位を有する、「断片」又は「誘導体」を含む。

好ましい実施形態によれば、抗体又はその断片は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、ＳｃＦｖ、小モジュラー免疫医薬（small modular immunopharmaceutical）（ＳＭＩＰ）、アフィボディ（affibody）、アビマー（avimer）、ナノボディ、ドメイン抗体及び／又は一本鎖でありうる。

本発明の抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡｓｅｃ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体タイプでありうる。生成される抗体は、最初からそのようなイソタイプを有する必要はなく、むしろ生成されたままの抗体は任意のアイソタイプを有することができ、その抗体がアイソタイプの転換を起こしうることが理解されるであろう。

本発明の更なる実施形態は、本発明の抗体をコードする核酸を含むベクターである。前記ベクターは、ファージ、プラスミド、ウイルス又はレトロウイルスベクターから選択される。好ましくは、本発明のベクターは、核酸分子が１以上の制御配列に操作可能に結合され、原核及び／又は真核宿主細胞中で転写及び任意選択的に発現できる発現ベクターである。

本発明の更なる実施形態は、本発明のベクターを含む宿主であり、原核細胞又は真核細胞、好ましくは哺乳動物若しくはヒト細胞、又はヒト以外のトランスジェニック動物から選択される。

本発明の更なる実施形態は、先に開示した抗体又はその断片を調製する方法であり、前記抗体の合成を可能にする条件下でホストを培養する工程と、前記培養物から前記抗体を回収する工程を含む。

更なる実施形態は、先に開示した方法によって得られる抗体又はその断片である。

好ましくは、本発明による抗体又はその断片は、ヒト化抗体である。

本発明の更なる実施形態は、好ましくはマクロファージの活性化を伴う特定の病理的状態の治療における医薬としての、前述の抗体又はその断片の使用である。このような病理的状態は、新生物性疾患、炎症性疾患、免疫疾患又は変性疾患から選択される。

好ましくは、このような新生物性疾患は膵臓腫瘍又は膀胱腫瘍のいずれかであり、より好ましくは膵臓腫瘍である。

好ましくは、前記免疫疾患は皮膚、神経、骨、血管又は結合組織の炎症に関連した疾患、より好ましくは乾癬、関節炎、神経炎又は膠原病（connectivitis）から選択されうる。

好ましくは、前記免疫疾患は、リューマチ性疾患、結合組織疾患（connective tissue diseases）、神経筋疾患、内分泌疾患、消化器疾患、血液疾患、皮膚疾患又は血管炎のような自己免疫疾患、より好ましくは、リウマチ性関節炎、多発性硬化症、膠原病、エリテマトーデス、子宮内膜症又は潰瘍性大腸炎から選択することができる。

好ましくは、前記変性疾患は、神経変性疾患および筋肉変性疾患、より好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病又は筋ジストロフィーから選択することができる。

本発明の更なる目的は、少なくとも１種の薬学的に許容しうる賦形剤又は担体と共に、前述の抗体又はその断片を含む医薬組成物である。

本発明の更なる実施形態は、医薬としての前記組成物の使用である。

本発明の好ましい実施形態は、新生物性疾患及び、炎症性、免疫及び／又は変性性の疾患、好ましくは、膵臓腫瘍又は膀胱腫瘍から選択される新生物性疾患の治療における前記組成物の使用である。

本発明の組成物は、経口投与に適した形態又は非経口若しくは局所投与に適した形態で処方されうる。

本発明の好ましい実施形態では、前記経口形態は、以下のもの：錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、顆粒及び油性カプセルから選択されうる。

本発明の更に好ましい実施形態では、前記局所形態は、以下のもの：クリーム、軟膏、軟膏、溶液、懸濁液、点眼、ペッサリー、噴霧溶液、スプレー、粉末、又はゲルから選択されうる。

本発明の更に好ましい実施形態では、前記非経口形態は、水性緩衝液又は油性懸濁液のいずれかでありうる。

前記非経口投与には、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、結節内、又は脾臓内の手段による投与が含まれる。

好ましくは、本発明による医薬組成物は、代謝拮抗物質、カンプトテシン又はタキサン類から選択される、更なる活性素（active principle）を含む。

更に好ましくは、前記活性素は、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、アルブミン結合パクリタキセル、カペシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル又はイリノテカンリポソームから選択される。

実施例１ − ＡＣ２抗体のキメラ化及びヒト化
ＡＣ−２ネズミ抗体を、ジェノヴァのＣｅｎｔｒｏＢｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅＡｖａｎｚａｔｅで２００２年１２月１７日に寄託され、国際公開第０３／０５５９０８号（特許文献５）に開示されたハイブリドーママザークローンＮｏ．ＰＤ０２００９から単離されたハイブリドーマから産生した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、従来の手順を用いて（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）抗体の可変領域をクローニングし、配列決定した。

ＡＣ−２ネズミ抗体（アミノ酸配列に対して配列番号１及び配列番号２、及び、ヌクレオチド配列に対して配列番号９及び配列番号１０）の可変領域、重鎖及び軽鎖の配列情報に基づいて、前記領域の異なるヒト化変異体を、標準の手順を用いる遺伝子合成によって得た。

抗体変異体をコードする配列を、Ｅｖｉ−５発現ベクター（ＥｖｉｔｒｉａＡＧ、スイス）にクローニングし、ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で発現した。

抗体のキメラ化に対して、ネズミ定常領域をヒト定常領域で置き換えた。重鎖（ＨＣ）の１つのキメラ型（version）をＩｇＧ１コンテキスト中に作成した。

抗体のヒト化に対して、ネズミからの相補性決定領域（ＣＤＲｓ）をヒト抗体フレームワークにグラフト化した。

重鎖（ＨＣ）の２４種のヒト化型（version）を、ＩｇＧ１及びＬＣ−カッパーコンテキスト中に作成した。各型をＦＲ中の特異的点突然変異によって特徴付けた。

実施例２ − 抗体結合活性についてのスクリーニング
キメラＡｂ及びヒト化型を、間接ＥＬＩＳＡ試験を用いて、ＢＡＧ３に結合する能力について、並行して試験した。

材料及び方法
９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣＭａｘｓｏｒｐ）を、ネズミ抗体（ＡＣ−２）によって認識されるＢＡＧ３全長タンパク質（ａａ３８５からａａ３９９）内の特異的配列（Ｐｅｐ２）を用いてコーティングした。このプレートを、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のＰｅｐ２（５０μｌ／ウェル）の１μｇ／ｍｌと共に一夜インキュベートした。次いで、このプレートを洗浄溶液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回洗浄し、非特異的部位のブロッキングを、各ウェルに対して、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中０．５％フィッシュゼラチン（シグマ）の溶液の１５０μｌを用いて室温で１時間実施した。プレートを洗浄用緩衝液で２回洗浄し、次いで抗体を装填した。ウェルの幾つかにおいて、抗体のキメラ変異体及びヒト化変異体のスカラー希釈物、５００ｎｇ／ｍｌ（５０μｌ／ウェル）を、２つ作成して、装填した。抗体をＰＢＳ中０．５％フィッシュゼラチン、０．０５％Ｔｗｅｅｎの溶液（ＢＳＡ／Ｔｗｅｅｎ）に希釈した。このプレートを室温で２時間インキュベートし、次いで洗浄用緩衝液で５回洗浄した。次に、試料を、２次抗体として５０μｌ／ウェルのＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ（HRP-conjugated anti-mouse IgG）又はＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ(HRP-conjugated anti-human IgG)と共に室温で３０分インキュベートした。洗浄用緩衝液で６回洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに加えた（５０μｌ／ウェル）。０．５Ｍ硫酸（２５μｌ／ウェル）を添加することによって、１０分後に比色反応をブロックし、光学密度の値（ＯＤ）を、４５０ｎｍの波長の分光光度計を用いて決定した（図１）。抗体のキメラ変異体及びヒト変異体を、上記と同じプロトコルを用いた間接ＥＬＩＳＡ試験によって組換えＢＡＧ３全長タンパク質（ｒＢＡＧ３）でコーティングしたプレートを用いても試験した（図２）。

結果
異なる抗体変異体の結合を、コーティング（図１）又は組換え全長ＢＡＧ３（図２）としてペプチド２を用いたＥＬＩＳＡで検出した。以下の抗体変異体が、より高い結合能を示し、更なる分析用に選択された：Ｈ１Ｌ２、Ｈ１Ｌ３、Ｈ１Ｌ４、Ｈ２Ｌ２、Ｈ２Ｌ３、Ｈ２Ｌ４、Ｈ３Ｌ２、Ｈ３Ｌ３、Ｈ３Ｌ４、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３、Ｈ４Ｌ４。

実施例３ − ヒト化抗体変異体のＫＤ決定
材料と方法
結合実験を、２５℃でＯｃｔｅｔＲｅｄ９６について実施した。抗体を、ディプアンドリードＡＨＣ（抗ヒトＩｇＧＦｃキャプチャー）センサーで捕捉し、次いで可変濃度でＡｇ（Ｅ．ＣｏｌｉｒＢＡＧ３）を結合した。抗体への抗原の結合をリアルタイムでモニターし、オン（ｋａ）及びオフ（ｋｄ）レートを得た。平衡定数（ＫＤ）を得られたｋａ及びｋｄから計算した。

完全な動力学的分析を、１００ｎＭから０までの分析物濃度を用いて実施した。分析を、１００ｎＭの分析物濃度を用いて実施し、アッセイ緩衝液中で連続的希釈、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５、１．５６及び０ｎＭで行った。カイ二乗（χ²）検定を、実際のセンサー記録（着色線）と、ＦｏｒｔｅｂｉｏＯｃｔｅｔ分析ソフトウェア（赤線）の間で実施し、分析の精度を決定した。１〜２内の２の値は有意（正確）と見做され、１未満は非常に有意（非常に正確）である。

注：２×８センサーを１つの完全な動力学的分析に使用し、センサーを再生し、複数回使用して、ＢＡＧ−Ｈ−Ｌ、ＢＡＧ−Ｈ１−Ｌ２、ＢＡＧ−Ｈ１−Ｌ３、ＢＡＧ−Ｈ１−Ｌ４、ＢＡＧ−Ｈ２−Ｌ２、ＢＡＧ−Ｈ２−Ｌ３、ＢＡＧ−Ｈ２−Ｌ４、ＢＡＧ−Ｈ３−Ｌ２、ＢＡＧ−Ｈ３−Ｌ３、ＢＡＧ−Ｈ３−Ｌ４、ＢＡＧ−Ｈ４−Ｌ２、ＢＡＧ−Ｈ４−Ｌ３、ＢＡＧ−Ｈ４−Ｌ４で捕捉し、１３種の完全な動力学を実施した。

結果
上記のように計算された異なる変異体に対する親和性を以下に報告する。ＡＣ−２ネズミ抗体は１０^-12のＫＤ（Ｍ）を示し、一方、全てのヒト変異体は１０^-9のＫＤ（Ｍ）を示した（表１参照）。しかし、この差は、記載されているように、変異体の生物学的活性について影響を与えなかった。

実施例４ − マクロファージ表面へ結合するＢＡＧ３をブロックする抗体変異体の能力の評価
ＢＡＧ３はマクロファージの表面に結合し、我々は、結合がＢＡＧ３タンパク質を封鎖するネズミ抗ＢＡＧＡＣ−２抗体によって特異的に阻害されることを示している。ここでは、我々は、マクロファージ表面への結合をブロックする該抗体のキメラ変異体及びヒト化変異体の能力を試験した。

材料と方法
Ｊ７７４Ａ．１細胞（１×１０６／ｍｌ）を、ブロッキング溶液（５％ＦＢＳ／０．１ＮａＮ₃を含有する％ＰＢＳ）及び、ＦｃＲブロッキングマウス（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ−ｃｏｄ．１３０−０９２−５７５）（１μｌ／１×１０６細胞）を用いて、４℃で３０分インキュベートした。次いで、１×１０５の細胞をＦＩＴＣ−ｒＢＡＧ３タンパク質（４０μｇ／ｍｌ）単独、又は抗ＢＡＧ３マウス抗体（ＡＣ２）（３２００μｇ／ｍｌ）若しくはネズミＩｇＧ１（３２００μｇ／ｍｌ）の存在下で、或いは、該抗体のキメラ及びヒト化変異体（３２００μｇ／ｍｌ）、又はヒトＩｇＧ（３２００μｇ／ｍｌ）を用いて、ブロッキング溶液中、氷上で３０分インキュベートした。インキュベ−ション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、フローサイトメトリーで分析した。

結果
Ｊ７７４Ａ．１マクロファージ細胞系の表面へ結合する蛍光ＢＡＧ３のフローサイトメトリー評価。データを、蛍光の平均強度として報告する（図３）。これらの結果を基にして、Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３、Ｈ４Ｌ４及びＨ２Ｌ４ヒト化抗体変異体を選択した。

実施例５ − １次単球活性化をブロックするヒト化ＡＣ−２抗体変異体の能力の評価
Ｈ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３、Ｈ４Ｌ４及びＨ２Ｌ４ヒト化抗体変異体を選択し、ＰｒｏｔｅｉｎＡ捕捉（ＨｉＴｒａｐＰｒｏｔｅｉｎＡＨＰ、ＧＥヘルスケア）の手段によって精製し、１次ヒト単球の活性化をブロックするそれらの能力について更に試験した。

我々は、ＢＡＧ３が１次ヒトマクロファージを活性化できることを以前に示した。ここでは、我々は、ＢＡＧ３依存性単球活性化をブロックするＨ４Ｌ２、Ｈ４Ｌ３及びＨ４Ｌ４ヒト化抗体変異体の能力を示すために、マクロファージ活性化の読み出しとしてＩＬ６の分泌を利用する。

材料と方法
バフィーコート（Buffy Coats）（コンポフレックス（登録商標）トリプル「トップアンドトップ」システム − フレゼニウスカービ（CompoFlex（登録商標） Triple "Top and Top" System - Fresenius Kabi））を、健常なドナーから得、４℃で一夜保存した。ＰＢＭＣを、標準のフィコール−ハイパーク密度勾配（Ficoll-Hypaque density gradients）で単離した。単核細胞を単離し、血小板及び赤血球汚染物を除去するために５０ｍｌのＰＢＳ１Ｘで連続的に洗浄した（Ｉ：１１００ｇで２０分間、ＩＩ：８００ｇで１０分間、ＩＩＩ：４００ｇで１０分間、ＩＶ：３００ｇで１０分間、Ｖ及びＶＩ：１００ｇで１０分間）。全ての遠心はブレーキをかけずに行った。次に、細胞を顕微鏡下でチェックし、まだ汚染物が存在している場合、１００ｇで１０分間の追加の遠心を実施した。

次いで、ＰＢＭＣを９６ウェルマイクロプレートに置き（２×１０⁶細胞／ｍｌ）、グルタミン（１００μｌ／ウェル）を用いず、ＦＢＳを用いず、ＦｃＲブロッキング剤ヒト型（FcR Blocking Reagent human）（細胞１００万毎に１μｌ）を用いたＲＰＭＩ中で１６時間（一夜）培養した。

当該日の後、細胞をｒＢＡＧ３（０．５μｇ／ｍｌ）で６時間処理した。ｍＡｂブロッキングアッセイを実施し、異なる濃度のＡＣ−２又はそのヒト化変異体と共にｒＢＡＧ３をインキュベートした。

細胞に対して媒体を交換しないが、上記の分子を含有する各ウェルにＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１００μｇを添加して、処理を実施した。全ての分子は、無菌管中の、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１００μｇに加えられ、分子はこれらの最終濃度を２回に分けて細胞に加えられた。分子を管中で室温において３０分プレインキュベートした。プレインキュベートは、ｍＡｂブロッキングアッセイに必要である。処理後、４００ｇで５分間の遠心の後、細胞培養培地を集めた。上清を、ヒトＥＬＩＳＡＩＬ−６キット（ｅバイオサイエンス、サンディエゴ、ＣＡ（eBioscience, San Diego, CA））を用いて、１：１０希釈物を２つ作成してＩＬ−６含有量について分析した。試料のＯＤを組換えＩＬ−６の標準曲線のものと比較することによって、ＩＬ−６濃度を評価した。

結果
表２に報告した結果は、異なる抗体によってｒＢＡＧ３により誘導されるＩＬ−６の阻害の％として表されている。全ての変異体は、ネズミＡＣ２抗ＢＡＧ３抗体に匹敵する阻害能力を示した。Ｈ４Ｌ２及びＨ４Ｌ４を、異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍成長をブロックするこれらの能力についての、ｉｎｖｉｖｏでの更なる試験用に選択した。

実施例６ − ｉｎｖｉｖｏでの腫瘍成長に関するヒト化ＡＣ−２抗体変異体の効果
ｉｎｖｉｔｒｏの実験に基づいて、我々は、後続のｉｎｖｉｖｏでの有効性について、変異体Ｈ４Ｌ２及びＨ２Ｌ４を選択した。

材料と方法
Ｍｉａ−Ｐａｃａ２細胞（２×１０⁶）を、ＰＢＳ（２００μｌ）に懸濁し、メスＣＤ１マウス（６週齢、チャールズ・リバー、イタリア）の右わき腹に注射した。１０日後、マウスを７匹（対照）又は６匹（処理済）マウスからなる４群（four arms）に分け、これらのそれぞれで、腫瘍の平均体積は８０〜１００ｍｍ³の範囲であった。５週間、対照群にはビヒクル（ＰＢＳ）を４８時間毎に腹腔内注射で与え、一方、処理群には、ネズミ（ＡＣ２）又はヒト化Ｈ２Ｌ４、Ｈ４Ｌ２抗ＢＡＧ３ｍＡｂｓを、ＰＢＳ中２０ｍｇ／ｋｇの用量で、４８時間毎に腹腔内注射で与えた。動物を秤量し、腫瘍の体積を一週間に一度カリパス（Ｄｘｄ²／２）により測定した。

結果
図４に、対照（ＰＢＳ）又は示した抗体で処理した動物の、一週間間隔での腫瘍の変化を倍数で（tumor fold change）報告した。比は、示した時間点での平均体積とゼロ日での平均体積の間のものである。対照の処理動物の腫瘍は４倍の増加を示したが、処理動物はわずか２．５倍の増加であった。

実施例７ − 腫瘍塊中の活性化された線維芽細胞数に関するヒト化ＡＣ−２Ｈ２Ｌ４変異体の影響
腫瘍成長で得られた結果は、腫瘍の微細環境での変化を更に研究することを我々に促した。腫瘍の発達における主要なプレーヤーの１つは、腫瘍塊に関連する線維芽細胞である。

材料と方法
実施例６で記載した実験の最後に、腫瘍をパラフィンに包埋し、抗−α ｓｍａ抗体（Ａ２５４７、シグマ−アルドリッチ、１：３５０において）を用いる免疫蛍光法によって切片（sections）を分析した。核を、１μｇｍｌ^-1のヘキスト（Hoechst）３３３４２（モレキュラープローブス、オレゴン、ＵＳＡ（Molecular Probes, Oregon, USA））で対比染色した。実験と対照材料を比較する際に、画像を、同じ取得パラメータ（レーザー強度、光電子増倍管の利得、ピンホール口径、対物レンズ×４０、ズーム１）を用いて取得した。ライカ共焦点ソフトウェア及びイメージＪ（Leica Confocal Software and Image J）をデータ分析（α−ｓｍａポジティブ領域の％）に使用した。

結果
図５は、α−ｓｍａ染色した２つのＰＢＳ−処理腫瘍及び２つのＡＣ−２Ｈ２Ｌ４処理腫瘍からのそれぞれのイメージを示す。対照動物中で成長した塊に関連する、活性化された線維芽細胞の存在はα−ｓｍａタンパク質陽性によって示されるように、非常に高かった。これに対して、ＡＣ−２Ｈ２Ｌ４処理動物は陰性であった。図６には、対照（ＰＢＳ−処理）試料とＡＣ−２Ｈ２Ｌ４処理試料を比較することによって、α−ｓｍａ陽性領域の定量化を報告している。

これらの結果は、ヒト化抗−ＢＡＧ３抗体が、新生物性疾患だけでなく、炎症などの他の生理学的プロセスにおいて重要な役割を持つ線維芽細胞に有効であるという証拠（Kalluri,2016（非特許文献７）を強く指示する。

参考文献
− Ammirante M, Rosati A, Arra C, Basile A, Falco A, Festa M, Pascale M, d'Avenia M, Marzullo L, Belisario MA, De Marco M, Barbieri A, Giudice A, Chiappetta G, Vuttariello E, Monaco M, Bonelli P, Salvatore G, Di Benedetto M, Deshmane SL, Khalili K, Turco MC, Leone A. “IKK{gamma} protein is a target of BAG3 regulatory activity in human tumor growth”. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(16):7497-502.

− Clackson T, Hoogenboom HR, Griffiths AD, Winter G. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 1991; 15;352(6336):624-8.

− Festa M, Del Valle L, Khalili K, Franco R, Scognamiglio G, Graziano V, De Laurenzi V, Turco MC, Rosati A. “BAG3 protein is overexpressed in human glioblastoma and is a potential target for therapy”. Am J Pathol. 2011;178(6):2504-12.

− Franceschelli S, Rosati A, Lerose R, De Nicola S, Turco MC, Pascale M. “Bag3 gene expression is regulated by heat shock factor 1”. J Cell Physiol. 2008; 215(3):575-7.

− Kalluri R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 2016; 16, 582-598

− Kettleborough CA, Saldanha J, Heath VJ, Morrison CJ, Bendig MM. “Humanization of a mouse monoclonal antibody by CDR-grafting: the importance of framework residues on loop conformation”. Protein Eng. 1991; 4(7):773-83.

− Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975;256:495-497.

− Rosati A, Graziano V, De Laurenzi V, Pascale M, Turco MC. “BAG3: a multifaceted protein that regulates major cell pathways”. Cell Death Dis. 2011 Apr 7;2:e141.

− Rosati A, Bersani S, Tavano F, Dalla Pozza E, De Marco M, Palmieri M, De Laurenzi V, Franco R, Scognamiglio G, Palaia R, Fontana A, di Sebastiano P, Donadelli M, Dando I, Medema JP, Dijk F, Welling L, di Mola FF, Pezzilli R, Turco MC, Scarpa A. “Expression of the antiapoptotic protein BAG3 is a feature of pancreatic adenocarcinoma and its overexpression is associated with poorer survival”. Am J Pathol. 2012 Nov;181(5):1524-9.

− Rosati A, Basile A, D’Auria R, d’Avenia M, De Marco M, Falco A, Festa M, Guerriero L, Iorio V, Parente R, Pascale M, Marzullo L, Franco R, Arra C, Barbieri A, Rea D, Menichini G, Hahne M, Bijlsma M, Barcaroli D, Sala G, di Mola FF, di Sebastiano P, Todoric J, Antonucci L, Corvest V, Jawhari A, Firpo MA, Tuveson DA, Capunzo M, Karin M, De Laurenzi V, Turco MC. “BAG3 promotes pancreatic ductal adenocarcinoma growth by activating stromal macrophages”. Nat Commun., 6:8695 doi: 10.1038/ncomms9695.

Claims

ＢＡＧ３タンパク質に結合するヒト化抗体又はＢＡＧ３タンパク質に結合するその断片であって、
ａ）配列番号１２若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる重鎖アミノ酸配列、及び
ｂ）配列番号２０若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列によってコードされる軽鎖アミノ酸配列
を含み、
重鎖アミノ酸配列若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲｓ領域を含み：
Ｈ−ＣＤＲ１はアミノ酸ＧＦＮＩＫＤＴＹＭＹ（配列番号３）を含み、Ｈ−ＣＤＲ２はアミノ酸ＧＶＤＰＡＮＧＮＴＲＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号４）を含み、Ｈ−ＣＤＲ３はアミノ酸ＤＧＡＭＤＹ（配列番号５）を含み、
軽鎖アミノ酸配列若しくはその少なくとも可変領域、又はそれらの少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列は、以下のアミノ酸組成を有するＣＤＲｓ領域を含み：
Ｌ−ＣＤＲ１はアミノ酸ＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡ（配列番号６）を含み、Ｌ−ＣＤＲ２はアミノ酸ＷＡＳＴＲＥＳ（配列番号７）を含み、Ｌ−ＣＤＲ３はアミノ酸ＱＱＹＹＴＹＰＬＴ（配列番号８）を含む
ことを特徴とする、ヒト化抗体又はその断片。
配列番号１２に関して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列が、配列番号１４、配列番号１６又は配列番号１８から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
配列番号２０に関して少なくとも９５％の配列同一性を有する前記アミノ酸配列が、配列番号２２、配列番号２４又は配列番号２６から選択されることを特徴とする、請求項１に記載のヒト化抗体又はその断片。
前記重鎖のアミノ酸配列が配列番号１８によってコードされ、前記軽鎖のアミノ酸配列が配列番号２２又は２６によってコードされることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片。
ヒト化抗体又はその断片が天然及び／又は合成起源の抗体、好ましくは哺乳動物起源の抗体であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片。
前記抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、ＳｃＦｖ、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、アフィボディ、アビマー、ナノボディ、ドメイン抗体及び／又は一本鎖であることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片。
請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体又はその断片をコードする核酸。
請求項７に記載の核酸を含むベクター。
請求項７の核酸又は請求項８のベクターを含む宿主細胞。
医薬として使用するための請求項１から９のいずれか一項に記載のヒト化抗体又はその断片。
新生物性疾患、炎症性疾患、免疫疾患及び／又は変性疾患から選択される、マクロファージの活性化を伴う病理的状態の治療に使用するための、請求項１０に記載のヒト化抗体又はその断片。
膵臓腫瘍又は膀胱腫瘍、より好ましくは膵臓腫瘍から選択される新生物性疾患の治療に使用するための、請求項１１に記載のヒト化抗体又はその断片。
請求項１から６のいずれか一項に記載の、少なくとも一種の抗体又はその断片と、少なくとも一種の薬学的に許容しうる賦形剤又は担体とを含む医薬組成物。
前記組成物は、経口投与に適した形態又は非経口若しくは局所投与に適した形態で処方されうることを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
代謝拮抗物質、カンプトテシン又はタキサン類、好ましくは、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン、アルブミン結合パクリタキセル、カペシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル又はイリノテカンリポソームから選択される活性素を更に含むことを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。