CN108350065A - 人源化的抗bag3抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了人源化的抗BAG3抗体或其片段，包含所述抗体的药物组合物及其作为药物的用途，特别是用于在胰腺肿瘤或免疫、炎性、肿瘤、心血管和/或退行性质的其他病理的治疗中使用。

Description

人源化的抗BAG3抗体
描述
本发明提供了人源化的抗BAG3抗体或其片段，包含所述抗体的药物组合物及其作为药物的用途，特别是用于在胰腺肿瘤或免疫、炎性、肿瘤、心血管和/或退行性质的其他病理的治疗中使用。
发明背景
BAG3蛋白是一种74kDa胞质蛋白，其属于共伴侣蛋白家族，所述共伴侣蛋白与蛋白HSP70(热休克蛋白)的ATP酶结构域(domain)通过称为BAG结构域(氨基酸110-124)的结构域(structural domain)相互作用。此外，BAG3蛋白包含WW结构域(Trp-Trp)、脯氨酸富集区(PXXP)、和两个保守基序IPV(Ile-Pro-Val)，其可介导与其他蛋白的结合。由于BAG3蛋白作为衔接子(adapter)的性质(可归因于许多功能结构域的存在)，因此此类蛋白可以与不同的蛋白相互作用。
在人类中，bag3基因表达对于包括肌细胞的数种正常细胞而言是组成型的，然而其突变与骨骼肌和心肌的疾病相关。此外，BAG3蛋白在许多类型的原发性肿瘤或肿瘤细胞系(淋巴或骨髓性白血病、神经母细胞瘤、胰腺癌、甲状腺癌、乳腺癌和前列腺癌、黑素瘤、骨肉瘤、成胶质细胞瘤和肾肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤等)中表达(Rosati A.等人，2011)。
在正常的细胞类型诸如白细胞、上皮细胞和神经胶质细胞和视网膜的细胞中，bag3基因表达可以通过应激物诸如氧化剂、高温、缺乏血清、重金属、HIV-1感染等来诱导。这些发现表明，bag3基因表达调控是细胞应激反应中的重要组成部分，并与响应转录因子HSF1(热休克转录因子)的元件的存在相关，所述元件在各种形式的细胞应激中在bag3基因启动子中被激活(Franceschelli S.等人，2008)。
此外，由于许多蛋白-蛋白相互作用结构域在其结构中的存在，BAG3蛋白影响不同类型细胞的细胞存活，与不同的分子伴侣相互作用(Rosati A.等人，2011)。关于BAG3抗凋亡活性报道的第一个机制在骨肉瘤和黑色素瘤细胞中鉴定，其中观察到BAG3蛋白调节转录因子NF-kB的活化和细胞存活(Ammirante M.等人，2010)。不同的分子机制已经在成胶质细胞瘤细胞中描述，其中BAG3蛋白以正向的方式(in a positive way)与HSP70蛋白合作，以维持细胞溶胶中的BAX蛋白并阻止其易位进入线粒体(Festa M.等人，2011)。最后，已示出了BAG3在一些肿瘤中调控调节细胞粘附的蛋白。
细胞质BAG3蛋白的存在也已经在许多不同的细胞系统中被描述，并且不但与各种肿瘤关联，而且与通常与细胞存活有关的病理学关联。
此外，专利申请第WO2011/067377号描述了由一些细胞类型分泌的细胞外BAG3蛋白作为血清中的生化标志物，其对于某些病理学状况(诸如心脏病理学和胰腺肿瘤)的诊断是高度特异性的。
最近已报道了BAG3蛋白在患有胰腺导管腺癌(PDAC)的346/346名患者中表达并由胰腺肿瘤的细胞释放，但此蛋白既不在周围的非肿瘤组织中表达，也不在正常胰腺中表达；同样地，已报道了BAG3表达的水平与患者存活相关。研究的结果证明了，使用BAG3mRNA的特异性siRNA分子可以沉默bag3基因表达并诱导细胞死亡，证实了BAG3蛋白是胰腺肿瘤细胞的重要存活因子，且证实了当与吉西他滨组合时，其下调可以有助于根除肿瘤细胞(RosatiA.等人，2012)。
此外，在最近的一篇文章中，我们报道了PDAC-释放的BAG3结合巨噬细胞，诱导其活化和PDAC支持因子的分泌。我们还已经鉴定了IFITM-2作为BAG3受体，并示出了IFITM-2通过PI3K和p38MAPK途径进行信号传导。最后，我们已经示出了使用小鼠单克隆抗-BAG3抗体导致减少的肿瘤生长并在三种不同的小鼠模型中预防转移形成。因此我们已经鉴定了参与PDAC生长和转移性扩散的旁分泌环路(paracrine loop)，并且示出了抗-BAG3抗体具有治疗潜力(Rosati A.等人，Nat.Commun.2015)。
用于肿瘤病理的常规化学疗法治疗以及用皮质类固醇或NSAID(非甾体抗炎药)对炎性疾病和免疫疾病的治疗带来与副作用相关的许多缺点，并且目前不是治疗此类病理的决定性方法。
因此，存在对新的及改进的治疗性治疗(therapeutic treatment)的明显需求，与用于治疗本发明中描述的炎性、免疫、和肿瘤性质的疾病的常规的、通常已知的疗法相比，新的及改进的治疗性治疗具有高度特异性及具有很少或无副作用的优势。
定义
除非另有定义，本领域所有术语、符号以及本文使用的其他科学术语意图具有本公开内容所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语为了清楚和/或为了便于查找在本文中被定义；因此，本文中包含此类定义不应该被解释为代表相对于本领域通常理解的实质性差异。
如本文使用的术语“抗体”包括“片段”或“衍生物”，其具有抗体的至少一个抗原结合位点和/或显示相同的生物学活性。
抗体优选地包含至少一种免疫球蛋白重链和至少一种免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白链包含可变结构域以及任选地恒定结构域。可变结构域可以包含互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区，以及框架区。
术语“人源化的抗体”是指其高变区已经替换为非人单克隆抗体的同源区的人类起源的抗体。
术语“嵌合抗体”是指包含源自不同抗体的部分的抗体。
术语“重组抗体”是指使用重组DNA方法获得的抗体。
术语“scFv片段”(单链可变片段)是指仅能够与相关的抗原结合的免疫球蛋白片段。scFv片段还可使用肽接头合成为二聚体(双抗体)、三聚体(三抗体)和四聚体(四抗体)。
术语“Fab片段”(抗原结合片段)和“Fab2片段”是指由连接至相邻重链的Fc片段的轻链组成的免疫球蛋白片段，且此类片段是单价抗体。当Fab部分成对时，片段称为Fab2。
术语“杂交瘤”是指产生单克隆抗体的细胞。
术语“单特异性抗体”是指对同样的抗原都具有亲和力的抗体。
术语“多特异性抗体”是指对数种抗原具有亲和力的抗体。
术语“双特异性抗体”是指对两种不同的抗原具有亲和力的抗体。
附图描述
图1.示出了用肽2(BAG3片段)涂层筛选抗体结合活性的ELISA。
图2.示出了用重组全长BAG3蛋白涂层筛选抗体结合活性的ELISA。
图3.抗体变体阻断BAG3结合巨噬细胞表面的能力的流式细胞术评价。
图4.人源化的AC-2抗体变体对体内肿瘤生长的影响。
图5.人源化的AC-2抗体变体H2L4对肿瘤团块内的活化的成纤维细胞的影响。
图6.AC-2H2L4对活化的成纤维细胞数目的影响的量化。
发明的公开内容
发明人已惊人地发现特异性BAG3抑制剂能够诱导肿瘤退化。特别地，受试的人源化的抗BAG3抗体显示出对BAG3蛋白的特别的亲和力，并且可以作为BAG3抑制剂在疗法中使用，因为它们阻断了BAG3蛋白和它在巨噬细胞表面上的受体之间的相互作用。
此外，在申请中报道的实验数据证明了所述抗BAG3抗体在减少成纤维细胞的活化中特别有效，并因此证明了它们可以在其中成纤维细胞被高度活化的所有病理(诸如肿瘤疾病、炎性疾病、免疫性疾病和/或退行性疾病)的治疗中使用。
因此，本发明的第一个实施方案涉及结合至BAG3蛋白的抗体或其片段，并且所述抗体或其片段包含：
a)由SEQ ID NO:12编码的重链氨基酸序列或至少所述重链氨基酸序列的可变结构域或与所述重链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，和
b)由SEQ ID NO:20编码的轻链氨基酸序列或至少所述轻链氨基酸序列的可变结构域或与所述轻链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。
如本文使用的，两个多肽序列之间的“序列同一性”指示在序列之间相同的氨基酸的百分比，优选地在由SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20编码的氨基酸序列的全部长度上。本发明的优选的多肽序列具有至少85％、更优选地90％、甚至更优选地93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在本发明的优选的实施方案中，相对于SEQ ID N.12具有至少80％的序列同一性的所述氨基酸序列选自SEQ ID N.14、SEQ ID N:16或SEQ ID N.18。
在另外的优选的实施方案中，相对于SEQ ID N.20具有至少80％的序列同一性的所述氨基酸序列选自SEQ ID N.22、SEQ ID N:24或SEQ ID N.26。
在优选的实施方案中，本发明的抗体是其中重链氨基酸序列由SEQ ID NO.18编码并且轻链氨基酸序列由SEQ ID NO 22或SEQ ID N.26编码的抗体。
在优选的实施方案中，重链氨基酸序列或至少重链氨基酸序列的可变结构域或与重链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列包含具有以下氨基酸组成的CDR区：H-CDR1包含氨基酸GFNIKDTYMY(SEQ ID N.3)，H-CDR2包含氨基酸GVDPANGNTRYDPKFQG(SEQ ID N.4)，H-CDR3包含氨基酸DGAMDY(SEQ ID N.5)，以及轻链氨基酸序列或至少轻链氨基酸序列的可变结构域或与轻链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列包含具有以下氨基酸组成的CDR区：L-CDR1包含氨基酸KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID N.6)，L-CDR2包含氨基酸WASTRES(SEQ ID N.7)和L-CDR3包含氨基酸QQYYTYPLT(SEQ ID N.8)。
本发明的另外的实施方案是结合至BAG3蛋白的抗体或其片段，并且所述抗体或其片段包含：
a)由SEQ ID NO:11编码的重链核苷酸序列或至少所述重链核苷酸序列的可变结构域或与重链核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列，和
b)由SEQ ID NO:19编码的轻链核苷酸序列或至少所述轻链核苷酸序列的可变结构域或与轻链核苷酸序列具有至少80％的序列同一性的核苷酸序列。
如本文使用的，两个核苷酸序列之间的“序列同一性”指示在序列之间是相同的核苷酸的百分比，优选地在由SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:19编码的核苷酸序列的全部长度上。本发明的优选的核苷酸序列具有至少85％、更优选地90％、甚至更优选地93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在本发明的优选的实施方案中，相对于SEQ ID N.11具有至少80％的序列同一性的所述核苷酸序列选自SEQ ID N.13、SEQ ID N:15或SEQ ID N.17。
在另外的优选的实施方案中，相对于SEQ ID N.19具有至少80％的序列同一性的所述核苷酸序列选自SEQ ID N.21、SEQ ID N:23或SEQ ID N.25。
在优选的实施方案中，本发明的抗体是其中重链氨基酸序列由SEQ ID NO.17编码并且轻链氨基酸序列由SEQ ID NO 21或SEQ ID N.25编码的抗体。
根据本发明的抗体或其片段可以是天然来源和/或合成来源的任何抗体，例如哺乳动物来源的抗体。优选地，恒定结构域，如果存在，是人类恒定结构域。可变结构域优选地是哺乳动物可变结构域，例如人源化的或人类可变结构域。
根据本发明的抗体或其片段可以是多克隆抗体或单克隆抗体。单克隆抗体是优选的。特别地，本发明的抗体优选地选自由以下组成的组：重组抗体、人源化的抗体或完全人类抗体、嵌合抗体、多特异性抗体特别地双特异性抗体、或其片段。
单克隆抗体可以通过任何合适的方法诸如和Milstein(1975)的方法或通过重组DNA方法来生产。单克隆抗体也可以使用在Clackson等人(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
抗体的人源化的形式可以根据本领域已知的方法(Kettleborough C.A.等人，1991)，诸如嵌合(chimerization)或CDR接枝来生成。用于生产人源化的抗体的可选择的方法在本领域是熟知的并且在例如EP 0239400和WO90/07861中描述。人类抗体也可以通过体外方法获得。合适的实例包括但不限于噬菌体展示、酵母展示等。
根据本发明，“嵌合抗体”涉及包含来自不同物种诸如例如小鼠和人类的多肽的抗体。嵌合抗体的生产例如在WO 89/09622中描述。
术语抗体包括“片段”或“衍生物”，所述“片段”或“衍生物”具有抗体的至少一个抗原结合位点。
根据优选的实施方案，抗体或其片段可以是Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、Fv片段、双抗体、scFv、小模块免疫药物(SMIP)、亲和体(affibody)、亲和多聚体(avimer)、纳米抗体、结构域抗体和/或单链。
本发明的抗体可以优选地是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD和IgE抗体类型。应了解的是，生成的抗体不需要最初地具有这样的同种型，而是所生成的抗体可以具有任何同种型，并且抗体可以是同种型转换的(isotype-switched)。
本发明的另外的实施方案是包含编码本发明的抗体的核酸的载体。所述载体选自噬菌体、质粒、病毒载体或逆转录病毒载体。优选地，本发明的载体是表达载体，其中核酸分子被可操作地连接至允许在原核宿主细胞和/或真核宿主细胞中的转录以及任选地表达的一种或更多种控制序列。
本发明的另外的实施方案是包含本发明的载体的宿主，所述宿主选自原核细胞或真核细胞、优选地哺乳动物或人类细胞、或非人类转基因动物。
本发明的另外的实施方案是用于制备以上公开的抗体或其片段的方法，所述方法包括在允许合成所述抗体的条件下培养本发明的宿主以及从所述培养物回收所述抗体。
另外的实施方案是通过以上公开的方法获得的抗体或其片段。
优选地，根据本发明的抗体或其片段是人源化的抗体。
本发明的另外的实施方案是上述抗体或其片段作为药物的用途，优选地在治疗涉及巨噬细胞的活化的特定病理学状态中的用途。此类病理学状态可以选自：肿瘤疾病、炎性疾病、免疫疾病或退行性疾病。
优选地，此类肿瘤疾病可以是胰腺肿瘤或膀胱肿瘤，更优选地胰腺肿瘤。
优选地，所述炎性疾病可以选自与皮肤、神经、骨骼、血管或结缔组织的炎症相关的疾病，且更优选地，银屑病、关节炎、神经炎或结缔组织炎症(connectivitis)。
优选地，所述免疫疾病可以选自自身免疫性疾病诸如风湿病、结缔组织疾病、神经肌肉疾病、内分泌疾病、胃肠疾病、血液病(haematologic diseases)、皮肤病或脉管炎，并且更优选地，类风湿性关节炎、多发性硬化症、结缔组织炎症、红斑狼疮、子宫内膜异位症或溃疡性结肠炎。
优选地，所述退行性疾病可以选自神经变性疾病和肌肉退行性疾病，且更优选地阿尔茨海默氏病、帕金森氏症或肌肉萎缩症。
本发明的另外目标是包含与至少一种药学上可接受的赋形剂或载体联合的前述抗体或其片段的药物组合物。
本发明的另外的实施方案是所述组合物作为药物的用途。
本发明的优选的实施方案是该组合物在肿瘤疾病和炎性、免疫和/或退行性质的疾病，优选地选自胰腺肿瘤或膀胱肿瘤的肿瘤疾病的治疗中的用途。
本发明的组合物可以配制为适合于口服施用的形式或适合于肠胃外施用或局部施用(topical administration)的形式。
在本发明的优选的实施方案中，所述口服形式可以选自以下：片剂、胶囊、溶液、悬浮液、颗粒和油性胶囊。
在本发明的另外的优选的实施方案中，所述局部形式可选自以下：乳膏剂、软膏剂、软膏剂、溶液、悬浮液、滴眼剂、阴道栓、雾化溶液、喷雾、粉末或凝胶。
在本发明的另外的优选的实施方案中，所述肠胃外形式可以是缓冲水溶液或油性悬浮液。
所述肠胃外施用包括通过肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、结内(intranodal)、或脾内手段施用。
优选地根据本发明的药物组合物包含另外的活性成分，所述活性成分选自抗代谢物类、喜树碱类或紫杉烷类。
更优选地，所述活性成分选自：吉西他滨、5-氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、白蛋白结合紫杉醇、卡培他滨、顺铂、紫杉醇、多西他赛或伊立替康脂质体。
实施例
实施例1-AC2抗体的嵌合和人源化。
AC-2鼠抗体从由2002年12月17日保藏在Centro Biotecnologie Avanzate diGenova并公开于WO03/055908的杂交瘤母克隆n°PD02009分离的杂交瘤产生。提取总RNA并且使用常规的程序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行RT-PCR以克隆并测序抗体的可变区。
基于AC-2鼠抗体的重链和轻链可变区的序列信息(对于氨基酸序列为SEQ IDNo.1和SEQ ID N.2以及对于核苷酸序列为SEQ ID 9和SEQ ID N.10)，所述区的不同的人源化的变体已经通过使用标准程序的基因合成获得。
编码抗体变体的序列在Evi-5表达载体(Evitria AG,Switzerland)中克隆并在CHO-K1细胞中表达。
对于抗体嵌合，鼠恒定区被人类恒定区代替。重链(HC)的一个嵌合形式在IgG1环境中制造。
对于抗体人源化，将来自鼠的互补决定区(CDR)接枝到人类抗体框架中。
重链(HC)的24种人源化的形式在IgG1和LC-κ环境中制造。每一种形式通过FR中的特定点突变来表征。
实施例2-筛选抗体结合活性
使用间接的ELISA测试，平行地测试了嵌合Ab和人源化的变体结合至BAG3的能力。
材料和方法
使用在由鼠抗体(AC-2)识别的BAG3全长蛋白中的特定序列(Pep2)(从aa 385至aa399)来包被96孔微板(NUNC Maxisorp)。将板用在磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)中的1μg/mlPep2(50μl/孔)孵育过夜。然后，将板用去垢剂溶液(PBS中的0.05％吐温-20)洗涤两次，并且对于每个孔，使用150μl的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)中的0.5％鱼明胶(Sigma)溶液在室温进行非特异性位点的封闭，持续一小时。将板用洗涤缓冲液洗涤两次，然后将抗体加载在板上。在一些孔中，将抗体的嵌合变体和人源化的变体的标量稀释液500ng/ml(50μl/孔)一式两份地加载。抗体在PBS中的0.5％鱼明胶、0.05％吐温的溶液(BSA/吐温)中稀释。将板在室温孵育持续2h，然后用洗涤缓冲液洗涤5次。然后将样品用50μl/孔的作为第二抗体的HRP缀合的抗小鼠IgG或HRP缀合的抗人类IgG在室温孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤6次之后，将过氧化物酶底物四甲基联苯胺(TMB)添加至孔(50μl/孔)。10分钟后，通过添加硫酸0.5M(25μl/孔)来阻断比色反应，并在450nm的波长用分光光度计来检测光密度值(OD)(图1)。还通过利用以上所述的相同方案的间接ELISA测试，使用被重组BAG3全长蛋白(rBAG3)包被的板测试抗体的嵌合变体和人源化的变体(图2)。
结果
不同抗体变体的结合在使用肽2作为涂层(图1)或重组全长BAG3(图2)的ELISA中检测。以下的抗体变体显示更高的结合能力并且被选择用于进一步的分析：H1L2、H1L3、H1L4、H2L2、H2L3、H2L4、H3L2、H3L3、H3L4、H4L2、H4L3、H4L4。
实施例3-人源化的抗体变体KD确定
材料和方法
结合实验在25℃在Octet Red96上进行。抗体在浸入(dip)和读出(read)AHC(抗人类IgG Fc捕获)传感器上捕获，随后是结合可变浓度的Ag(大肠杆菌rBAG3)。实时监测抗原与抗体的结合以获得结合(ka)速率和解离(kd)速率。从观察到的ka和kd计算平衡常数(KD)。
利用从100nM至0的分析物浓度进行全动力学分析(full kinetic analysis)。利用100nM的分析物浓度进行分析，并且用测定缓冲液中的100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.56nM和0nM系列稀释液运行。在实际的传感图(着色线)和从FortebioOctet分析软件生成的传感图(红线)之间进行卡方(χ2)分析以确定分析的准确度。在1-2以内的2个值被认为是显著的(准确的)，并且低于1是高度显著的(高度准确的)。
注意：2x8个传感器被用于一组全动力学分析，传感器被多次再生和使用并且用BAG-H-L、BAG-H1-L2、BAG-H1-L3、BAG-H1-L4、BAG-H2-L2、BAG-H2-L3、BAG-H2-L4、BAG-H3-L2、BAG-H3-L3、BAG-H3-L4、BAG-H4-L2、BAG-H4-L3、BAG H4-L4捕获以进行13组全动力学分析。
结果
下文报道了如上计算的对于不同变体的亲和力。Ac-2鼠抗体示出了10-12的KD(M)，而全部人类变体示出了10-9的KD(M)(参见表1)。然而，这个差异不影响如将描述的变体生物学活性。
表1.AC-2抗体变体的亲和力
配体 分析物 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) 以nM计的浓度 卡方
BAG-H-L rBAG3 2.15x105 5.71x10-4 2.66x10-9 0-50 0.145
BAG-H1-L2 rBAG3 2.23x105 6.35x10-4 2.84x10-9 0-50 0.174
BAG-H1-L3 rBAG3 2.17x105 6.15x10-4 2.83x10-9 0-50 0.168
BAG-H1-L4 rBAG3 2.42x105 5.66x10-4 2.34x10-9 0-50 0.186
BAG-H2-L2 rBAG3 2.46x105 6.47x10-4 2.63x10-9 0-50 0.514
BAG-H2-L3 rBAG3 2.25x105 4.47x10-4 1.98x10-9 0-50 0.283
BAG-H2-L4 rBAG3 2.33x105 4.75x10-4 2.04x10-9 0-50 0.298
BAG-H3-L2 rBAG3 1.93x105 3.45x10-4 1.78x10-9 0-50 0.128
BAG-H3-L3 rBAG3 2.05x105 3.35x10-4 1.61x10-9 0-50 0.128
BAG-H3-LA rBAG3 2.29x105 3.91x10-4 1.70x10-9 0-50 0.270
BAG-H4-L2 rBAG3 1.92x100 3.90x10-4 2.02x10-9 0-50 0.185
BAG-H4-L3 rBAG3 2.02x105 4.03x10-4 1.98x10-9 0-50 0.193
BAG-H4-L4 rBAG3 2.33x105 4.01x10-4 1.72x10-9 0-50 0.240
实施例4-抗体变体的阻断BAG3结合巨噬细胞表面的能力的评价
BAG3结合至巨噬细胞的表面，并且我们已经展示了结合被掩蔽(sequester)BAG3蛋白的鼠抗BAG AC-2抗体特异性地抑制。在此我们测试了抗体的嵌合变体和人源化的变体阻断与巨噬细胞表面结合的能力。
材料和方法
将J774A.1细胞(1x 106/ml)用封闭液(含5％FBS/0.1％NaN3的PBS)和用小鼠FcR阻断(FcR blocking mouse)(Miltenyi Biotec-cod.130-092-575)(1μl/1x106个细胞)在4℃孵育30分钟。然后将1x105个细胞用FITC-rBAG3蛋白(40μg/ml)单独地或在抗BAG3小鼠抗体(AC2)(3200μg/ml)或鼠IgG1(3200μg/ml)的存在下、或者用抗体的嵌合变体和人源化的变体(3200μg/ml)或人类IgG(3200μg/ml)在封闭液中在冰上孵育30分钟。孵育之后，用PBS洗涤细胞并通过流式细胞术分析细胞。
结果
结合至J774A.1巨噬细胞细胞系的表面的荧光BAG3的流式细胞术评估。数据被报告为平均荧光强度(图3)。在这些结果的基础上，选择了H4L2、H4L3、H4L4和H2L4人源化的抗体变体。
实施例5-人源化的AC-2抗体变体阻断初级单核细胞(primary monocyte)活化的能力的评价
选择H4L2、H4L3、H4L4和H2L4人源化的抗体变体、通过蛋白A捕获(HiTrap ProteinA HP,GE Healthcare)的手段来纯化并且进一步测试它们阻断初级人类单核细胞活化的能力。
我们先前已经展示了BAG3可以活化初级人类巨噬细胞。在此，我们利用IL6分泌作为巨噬细胞活化的读出(read out)以显示H4L2、H4L3和H4L4人源化的抗体变体阻断BAG3依赖性的单核细胞活化的能力。
材料与方法
血沉棕黄层(Buffy Coats)(Triple“Top and Top”SystemFresenius Kabi)从健康供体获得并在4℃储存过夜。在标准Ficoll-Hypaque密度梯度上分离PBMC。分离单核细胞并使其经受用50ml的PBS 1X顺序洗涤以消除血小板和红细胞污染物；(I：在1100g持续20分钟；II：在800g持续10分钟；III：在400g持续10分钟；IV：在300g持续10分钟；V和VI：在100g持续10分钟)。所有的离心分离都用关闭制动(brake off)来进行。然后在显微镜下检查细胞，并且如果仍然存在污染物，在100g进行另外的离心持续10分钟。
然后将PBMC涂布在96孔微板(2X106个细胞/ml)中并在不含FBS的无谷氨酰胺的RPMI(100μl/孔)中以及用人类FcR封闭试剂(FcR Blocking Reagent human)(每一百万个细胞1μl)(Miltenyi 130-059-901)培养16小时(过夜)。
次日，用rBAG3(0.5μg/ml)处理细胞6小时。进行mAb阻断测定，将rBAG3与不同浓度的AC-2或人源化的变体一起孵育。
不更换培养基，但是向含有上述分子的每个孔中添加不含FBS的100μl的RPMI对细胞进行处理。将所有的分子添加到无菌管中的不含FBS的100μl的RPMI中，并且将分子以两倍于它们的最终浓度添加到细胞中。将分子在管中在室温预孵育30分钟，然后添加到细胞中。对于mAb阻断测定，预孵育是必需的。处理后，在400g离心5分钟后收集细胞培养基。用人类ELISA IL-6试剂盒(eBioscience,San Diego,CA)以1:10稀释度一式两份地分析上清液的IL-6含量。通过比较样品的OD与重组IL-6的标准曲线的OD评价IL-6的浓度。
结果
在表2中报道的结果表示为通过不同抗体对由rBAG3诱导的IL-6生产的％抑制。所有变体示出了与鼠AC2抗BAG3抗体相当的抑制能力。选择H4L2和H4L4用于进一步体内测试它们在异种移植肿瘤模型中阻断肿瘤生长的能力。
表2
实施例6-人源化的AC-2抗体变体对体内肿瘤生长的影响。
基于体外实验，我们选择变体H4L2和H2L4用于随后的体内验证。
材料与方法
将Mia-Paca 2细胞(2x106)悬浮在PBS(200μl)中，并注射入雌性CD1小鼠(6周龄；Charles River,Italy)的右胁腹中。10天后，将小鼠分成4个臂(arms)，每个臂由7只(对照)或6只(处理的)小鼠组成，每个臂中平均肿瘤体积在80mm3-100mm3的范围。对照组每48小时接受媒介物(PBS)i.p.注射，而处理组每48小时以PBS中20mg/kg的剂量接受鼠抗BAG3mAb(AC2)或人源化的H2L4、H4L2抗BAG3mAb的i.p.注射，持续5周。每周一次将动物称重并且通过卡尺测量肿瘤体积(Dxd2/2)。
结果
图4报道了对照(PBS)或用指定抗体处理的动物以周间隔的肿瘤倍数变化。比率是指定时间点的平均体积和第0天的平均体积之间的比率。对照处理的动物的肿瘤显示4倍增长，而处理的动物肿瘤只增长了2.5倍。
实施例7-人源化的AC-2H2L4变体对肿瘤团块内的活化的成纤维细胞数目的影响。
在肿瘤生长上获得的结果促使我们进一步研究肿瘤微环境中的变化。肿瘤发展中一个主要的参与者是与肿瘤团块有关的成纤维细胞。
材料与方法
在实施例6中描述的实验结束时，将肿瘤石蜡包埋并且利用抗αsma抗体(A2547,Sigma-Aldrich,以1:350)通过免疫荧光法分析切片。核用1μg ml-1Hoechst 33342(Molecular Probes,Oregon,USA)复染。当比较实验和对照材料时，通过使用相同的采集参数(激光强度、增益光电倍增管(gain photomultipliers)、针孔光圈(pinhole aperture)、目镜×40、放大1)在顺序扫描模式中获取图像。使用Leica Confocal软件和ImageJ进行数据分析(α-sma阳性面积(positive area)的％)。
结果
图5示出了来自α-sma染色的两种PBS处理的肿瘤和两种AC-2H2L4处理的肿瘤的代表性图像。与在对照动物中生长的团块有关的活化的成纤维细胞的存在是非常高的，如通过α-sma蛋白阳性(positivity)所显示的。相反，AC-2H2L4处理的动物是阴性的。在图6中，通过比较对照(PBS-处理的)样品和AC-2H2L4处理的样品，我们报道了α-sma阳性面积的定量。
这些数据有力地支持了人源化的抗BAG3抗体对成纤维细胞具有影响的证据，所述成纤维细胞不但在肿瘤疾病而且在其他的病理过程例如炎症中也具有重要作用(Kalluri，2016)。
参考文献
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序列表
<110> 比奥尤尼沃萨有限责任公司
<120> 人源化的抗体
<160> 26
<170> BiSSAP 1.2
<210> 1
<211> 115
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 2
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
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Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln
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Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
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Lys
<210> 3
<211> 10
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<213> 小鼠(mouse)
<400> 3
Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 4
Gly Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
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Gly
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 5
Asp Gly Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 6
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
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Ala
<210> 7
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<213> 小鼠(mouse)
<400> 7
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<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 8
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 9
<211> 345
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<220>
<221> source
<222> 1..345
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/生物体="小鼠"
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gctatggact actggggtca ggggacttcc gtcactgtct cgagc 345
<210> 10
<211> 339
<212> DNA
<213> 小鼠(mouse)
<220>
<221> source
<222> 1..339
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<400> 10
gatattgtga tgtctcagtc cccaagcagc ctggcagtct cagtcggcga aaaggtgacc 60
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<210> 11
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<220>
<221> source
<222> 1..1416
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<400> 11
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
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Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Gly Val Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Arg Tyr Asp Pro Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Asp Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
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Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala
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Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly
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gtctgtctgc tgaacaactt ctaccctaga gaggccaaag tccagtggaa agtggacaat 540
gctctgcaga gtgggaattc ccaggaatct gtcactgagc aggactctaa ggatagcaca 600
tactccctgt cctctactct gacactgagc aaggctgatt acgagaaaca caaagtgtac 660
gcctgtgaag tcacacatca ggggctgtct agtcctgtga ccaaatcctt caatagggga 720
gagtgctgat agtaaaagct t 741
<210> 24
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 25
<211> 741
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<220>
<221> source
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ctggcttggc accagcagaa gccaggacag ccccctaaac tgctgatcta ctgggcaagc 240
accagggaat ctggcgtgcc cgaccggttc agcggctctg gaagtgggac agattttacc 300
ctgacaatct catccctgca agccgaggac ctggctatct actattgtca gcagtactat 360
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195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220

Claims (16)

1.一种人源化的抗体或其片段，所述人源化的抗体或其片段与BAG3蛋白结合并且包含：
a)由SEQ ID N.12编码的重链氨基酸序列或至少所述重链氨基酸序列的可变结构域或与所述重链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，和
b)由SEQ ID N.20编码的轻链氨基酸序列或至少所述轻链氨基酸序列的可变结构域或与所述轻链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的人源化的抗体或其片段，特征在于相对于SEQ ID N.12具有至少80％的序列同一性的所述氨基酸序列选自SEQ ID N.14、SEQ ID N.16或SEQ ID N.18。
3.根据权利要求1所述的人源化的抗体或其片段，特征在于相对于SEQ ID N.20具有至少80％的序列同一性的所述氨基酸序列选自SEQ ID N.22、SEQ ID N.24或SEQ ID N.26。
4.根据前述权利要求中任一项所述的人源化的抗体或其片段，特征在于所述重链氨基酸序列或至少所述重链氨基酸序列的可变结构域或与所述重链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列包含具有以下氨基酸组成的CDR区：H-CDR1包含氨基酸GFNIKDTYMY(SEQ ID N.3)，H-CDR2包含氨基酸GVDPANGNTRYDPKFQG(SEQ ID N.4)，H-CDR3包含氨基酸DGAMDY(SEQ ID N.5)，以及所述轻链氨基酸序列或至少所述轻链氨基酸序列的可变结构域或与所述轻链氨基酸序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列包含具有以下氨基酸组成的CDR区：L-CDR1包含氨基酸KSSQSLLYSSNQKNYLA(SEQ ID N.6)，L-CDR2包含氨基酸WASTRES(SEQ ID N.7)和L-CDR3包含氨基酸QQYYTYPLT(SEQ ID N.8)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的人源化的抗体或其片段，特征在于所述重链氨基酸序列由SEQ ID NO.18编码，并且所述轻链氨基酸序列由SEQ ID NO 22或SEQ ID N.26编码。
6.根据前述权利要求中任一项所述的人源化的抗体或其片段，特征在于它是天然来源和/或合成来源的抗体，优选地哺乳动物来源的抗体。
7.根据前述权利要求中任一项所述的人源化的抗体或其片段，特征在于所述抗体是Fab片段、Fab'片段、F(ab')片段、Fv片段、双抗体、scFv、小模块免疫药物(SMIP)、亲和体、亲和多聚体、纳米抗体、结构域抗体和/或单链。
8.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其片段。
9.一种载体，所述载体包含根据权利要求8所述的核酸。
10.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求8所述的核酸或如权利要求9所述的载体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的人源化的抗体或其片段用于作为药物使用。
12.根据权利要求11所述的人源化的抗体或其片段，用于在治疗涉及巨噬细胞的活化的病理状态中使用，所述病理状态选自肿瘤疾病、炎性疾病、免疫疾病和/或退行性疾病。
13.根据权利要求12所述的人源化的抗体或其片段，用于在选自胰腺肿瘤或膀胱肿瘤的肿瘤疾病、更优选地胰腺肿瘤的治疗中使用。
14.药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载体。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，特征在于所述组合物能够配制为适合于口服施用的形式或适合于肠胃外施用或局部施用的形式。
16.根据权利要求14所述的药物组合物，特征在于所述药物组合物包含另外的活性成分，所述活性成分选自抗代谢物类、喜树碱类或紫杉烷类，优选地吉西他滨、5-氟尿嘧啶、伊立替康、奥沙利铂、白蛋白结合紫杉醇、卡培他滨、顺铂、紫杉醇、多西他赛或伊立替康脂质体。
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