ES2808947T3

ES2808947T3 - Anticuerpos humanizados anti-BAG3

Info

Publication number: ES2808947T3
Application number: ES16790978T
Authority: ES
Inventors: Maria Caterina Turco; Alessandra Rosati; Laurenzi Vincenzo De; Gianluca Sala
Original assignee: Intrepida Bio Inc
Current assignee: Intrepida Bio Inc
Priority date: 2015-11-05
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2021-03-02
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CN108350065B; JP2019500855A; JP6979698B2; US20210122818A1; EP3371216A1; WO2017076878A1; CN108350065A; PL3371216T3; ITUB20155097A1; CA3003613A1; EP3693387A1; US20190153090A1; EP3371216B1; US10889644B2; AU2016348615A1; BR112018008977A2

Abstract

Un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que se une a la proteína BAG3 y que comprende: a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada como se muestra en SEQ ID N. 12 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma, y b) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se muestra en SEQ ID N. 20 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma, caracterizado en que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: H-CDR1 comprende los aminoácidos GFNIKDTYMY (SEQ ID N. 3), H-CDR2 comprende los aminoácidos GVDPANGNTRYDPKFQG (SEQ ID N. 4), H-CDR3 comprende los aminoácidos DGAMDY (SEQ ID N. 5) y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma, comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: L-CDR1 comprende los aminoácidos KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID N. 6), LCDR2 comprende los aminoácidos WASTRES (SEQ ID N. 7) y L-CDR3 comprende los aminoácidos QQYYTYPLT (SEQ ID N. 8).

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos humanizados anti-BAG3

La presente invención proporciona un anticuerpo humanizado anti-BAG3 o un fragmento del mismo, composiciones farmacéuticas que comprenden dicho anticuerpo y su uso como un medicamento, en particular, para uso en el tratamiento de tumores pancreáticos u otras patologías de una naturaleza inmunitaria, inflamatoria, neoplásica, cardiovascular y/o degenerativa.

Estado de la técnica

La proteína BAG3 es una proteína citoplásmica de 74 kDa que pertenece la familia de co-chaperonas que interaccionan con el dominio ATPasa de la proteína HSP70 (proteína de choque térmico) a través del dominio estructural conocido como el dominio BAG (aminoácidos 110-124). Además, la proteína BAG3 contiene un dominio WW (Trp-Trp), una región rica en prolina (PXXP), y dos motivos conservados IPV (Ile-Pro-Val), que pueden mediar la unión a otras proteínas. Gracias a la naturaleza de la proteína BAG3 como un adaptador, atribuible a la presencia de muchos dominios funcionales, tal proteína puede, por tanto, interaccionar con diferentes proteínas.

En seres humanos, la expresión del gen bag3 es constitutiva para unos pocos tipos de células normales, incluyendo miocitos, mientras que mutaciones del mismo se asocian con enfermedades de los músculos esquelético y cardiaco. Además, la proteína BAG3 se expresa en muchos tipos de tumores primarios o líneas de células tumorales (leucemias linfoide o mieloide, neuroblastoma, cáncer pancreático, cáncer de tiroides, cáncer de mama y cáncer de próstata, melanoma, osteosarcoma, glioblastoma y tumores del riñón, colon, ovario, etc.) (Rosati A. et al., 2011).

En tipos celulares normales, tal como leucocitos, células epiteliales y células de glía y células de la retina, la expresión del gen bag3 se puede inducir por agentes estresantes, tal como oxidantes, altas temperaturas, falta de suero, metales pesados, infecciones por VIH-1, etc. Estos hallazgos indican que la regulación de la expresión del gen bag3 es un componente importante en la respuesta celular a estrés y está correlacionada con la presencia de elementos que responden al factor de transcripción HSF1 (factor de transcripción de choque térmico), que se activa en varias formas de estrés celular en el promotor del gen bag3 (Franceschelli S., et al., 2008).

Además, debido a la presencia de muchos dominios de interacción proteína-proteína en la estructura de la misma, la proteína BAG3 influye la supervivencia celular en diferentes tipos de células, al interaccionar con diferentes compañeros moleculares (Rosati A. et al., 2011). El primer mecanismo descrito en relación a la actividad antiapoptótica de BAG3 se identificó en células de osteosarcoma y melanoma, donde se observó que la proteína BAG3 modula la activación del factor de transcripción NF-kB y la supervivencia celular (Ammirante M. et al., 2010). Se ha descrito un mecanismo molecular diferente en células de glioblastoma, donde la proteína BAG3 coopera de una manera positiva con la proteína HSP70 para mantener la proteína BAX en el citosol y prevenir la translocación de la misma a las mitocondrias (Festa M. et al., 2011). Por último, en algunos tumores, se ha mostrado que BAG3 regula proteínas que modulan la adhesión celular.

La presencia de la proteína BAG3 citoplásmica también se ha descrito en muchos sistemas celulares diferentes y se ha asociado, no solo con varios tumores, sino también en patologías en general relacionadas con la supervivencia celular.

Además, la solicitud de patente no. WO2011/067377 describe la proteína BAG3 extracelular, secretada por algunos tipos de células, como un marcador bioquímico en suero, que es muy específico para el diagnóstico de ciertos estados patológicos, tal como patologías cardiacas y tumor pancreático.

Se ha descrito recientemente que la proteína BAG3 se expresa en 346/346 pacientes con adenocarcinoma ductal pancreático (ACDP) y es liberada por las células del tumor pancreático, pero tal proteína no se expresa ni en los tejidos no neoplásicos circundantes ni en un páncreas normal; asimismo, se ha descrito que los niveles de la expresión de BAG3 están relacionados con la supervivencia del paciente. Los resultados del estudio demuestran que el uso de moléculas de ARNip específicas para el ARNm de bAG3 pueden silenciar la expresión del gen bag3 e inducir muerte celular, lo que confirma que la proteína BAG3 es un importante factor de supervivencia para células de tumores pancreáticos y que el descenso de la misma, cuando se combina con gemcitabina, puede contribuir a la erradicación de las células tumorales (Rosati A. et al., 2012).

Además, en un artículo reciente hemos descrito que BAG3 liberada de ACDP se une a macrófagos induciendo su activación y la secreción de factores de apoyo de ACDP. También hemos identificado IFITM-2 como un receptor de BAG3 y mostrado que señaliza través de Pl3K y las rutas de p38 y MAPK. Por último, hemos mostrado que el uso de un anticuerpo monoclonal de ratón anti-BAG3 produce crecimiento tumoral reducido y previene la formación de metástasis en tres modelos de ratón diferentes. Por tanto, hemos identificado un bucle paracrino implicado en el crecimiento de ACDP y la expansión metastásica, y mostrado que un anticuerpo anti-BAG3 tiene potencial terapéutico (Rosati A. et al., Nat. Commun. 2015).

El documento WO03/055908 divulga la secuencia de BAG3, la producción de ARN antisentido y anticuerpos que se unen a BAG3 (Acm anti-BAG3 identificado con el número de registro PD02009) para la detección y tratamiento de cáncer.

Los tratamientos convencionales de quimioterapia para patologías tumorales, así como los tratamientos de enfermedades inflamatorias e inmunitarias con corticoesteroides o AINE (fármacos antiinflamatorios no esteroideos) plantean numerosos inconvenientes unidos a efectos secundarios y no hay, actualmente, medios definitivos de tratar tales patologías.

Por tanto, hay una evidente necesidad para un tratamiento terapéutico nuevo y mejorado que tenga la ventaja de ser muy específico y que tenga pocos o ningún efecto secundario, en comparación con las terapias convencionales, comúnmente conocidas usadas para el tratamiento de enfermedades de una naturaleza inflamatoria, inmunitaria y neoplásica descritas en la presente invención.

Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los términos de la técnica, anotaciones y otra terminología científica usados en el presente documento se pretende que tengan los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia a la que pertenece esta divulgación. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen en el presente documento por claridad y/o para facilidad de referencia; por tanto, la inclusión de tales definiciones en el presente documento no se debe interpretar que representa una diferencia sustancial sobre lo que se entiende en general en la técnica.

El término “anticuerpo” como se usa en el presente documento incluye “fragmentos” o “derivados”, que tienen al menos un sitio de unión al antígeno del anticuerpo y/o muestran la misma actividad biológica.

Un anticuerpo preferiblemente comprende al menos una cadena pesada de inmunoglobulina y al menos una cadena ligera de inmunoglobulina. Una cadena de inmunoglobulina comprende un dominio variable y opcionalmente un dominio constante. Un dominio variable puede comprender regiones determinantes de complementariedad (CDR), por ejemplo, una región CDR1, CDR2 y/o CDR3, y regiones marco.

El término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo de origen humano, cuya región hipervariable se ha sustituido por la región homóloga de anticuerpos monoclonales no humanos.

El término “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo que contiene porciones derivadas de diferentes anticuerpos.

El término “anticuerpo recombinante” se refiere a un anticuerpo obtenido usando métodos de ADN recombinante. El término “fragmento scFv” (fragmento variable monocatenario) se refiere a fragmentos de inmunoglobulinas solo capaces de unirse con el antígeno afectado. Los fragmentos scFv también se pueden sintetizar en dímeros (diacuerpos), trímeros (triacuerpos) y tetrámeros (tetracuerpos) usando enlazadores peptídicos.

Los términos “fragmento Fab” (fragmento de unión al antígeno) y “fragmento “Fab2” se refieren a fragmentos de inmunoglobulinas que consisten en una cadena ligera unida al fragmento Fc de la cadena pesada adyacente, y tales fragmentos son anticuerpos monovalentes. Cuando las porciones Fab están en pares, el fragmento se llama Fab2. El término “hibridoma” se refiere a una célula que produce anticuerpos monoclonales.

El término “anticuerpos monoespecíficos” se refiere a anticuerpos que tienen todos afinidad por el mismo antígeno. El término “anticuerpos multiespecíficos” se refiere a anticuerpos que tienen afinidad por varios antígenos.

El término “anticuerpo biespecífico” se refiere a un anticuerpo que tienen afinidad por dos antígenos diferentes. Descripción de las figuras

Figura 1. ELISA que muestra el cribado para actividad de unión a anticuerpos con un recubrimiento que usa el péptido 2 (fragmento de BAG3).

Figura 2. ELISA que muestra el cribado para actividad de unión a anticuerpos con un recubrimiento que usa proteína BAG3 de longitud completa recombinante.

Figura 3. Evaluación por citometría de flujo de la capacidad de las variantes de anticuerpo para bloquear la unión de BAG3 a la superficie de macrófagos.

Figura 4. Efecto de las variantes humanizadas del anticuerpo AC-2 sobre el crecimiento tumoral in vivo.

Figura 5. Efecto de la variante humanizada H2L4 del anticuerpo AC-2 sobre fibroblastos activados en la masa tumoral. Figura 6. Cuantificación del efecto de AC-2 H2L4 sobre el número de fibroblastos activados.

Divulgación de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente que inhibidores específicos de BAG3 son capaces de inducir regresión de tumores. En particular, los anticuerpos humanizados anti-BAG3 ensayados mostraron una afinidad particular para la proteína BAG3 y se pueden usar en terapia como inhibidores de BAG3, ya que bloquean la interacción entre la proteína BAG3 y su receptor en las superficies de macrófagos.

Además, los datos experimentales descritos en la solicitud demuestran que dichos anticuerpos anti-BAG3 son particularmente eficaces en reducir la activación de fibroblastos y por tanto que se pueden usar en el tratamiento de todas las patologías en donde los fibroblastos se activan mucho, tal como enfermedades neoplásicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunitarias y/o enfermedades degenerativas.

Por tanto, una primera forma de realización de la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que se une a la proteína BAG3 y que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada codificada por SEQ ID NO: 12 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % a la misma, y

b) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera codificada por SEQ ID NO: 20 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % a la misma, caracterizado en que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % a la misma comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: H-CDR1 comprende los aminoácidos GFNIKDTYMY (SEQ ID N. 3), H-CDR2 comprende los aminoácidos GVDPANGNTRYDPKFQG (SEQ ID N. 4), H-CDR3 comprende los aminoácidos DGAMDY (SEQ ID N. 5) y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % a la misma, comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: L-CDR1 comprende los aminoácidos KSSQSLLYSSNQKNYLA (SEQ ID N. 6), L-CDR2 comprende los aminoácidos WASTRES (SEQ ID N. 7) y L-CDR3 comprende los aminoácidos QQYYTYPLT (SEQ ID N. 8).

Como se usa en el presente documento, “identidad de secuencia" entre dos secuencias de polipéptidos, indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias, preferiblemente a lo largo de la longitud entera de las secuencias de aminoácidos codificadas por SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 20. Las secuencias de polipéptido preferidas de la invención tienen una identidad de secuencia de al menos el 90 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En una forma de realización preferida de la presente invención dicha secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con respecto a SEQ ID N. 12 se selecciona de SEQ ID N. 14, SEQ ID N: 16 o SEQ ID N. 18.

En una forma de realización preferida adicional dicha secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con respecto a SEQ ID N. 20 se selecciona de SEQ ID N. 22, SEQ ID N: 24 o SEQ ID N. 26. En una forma de realización preferida el anticuerpo de la presente invención es el anticuerpo humanizado en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada está codificada por SEQ ID NO. 18 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera está codificada por Se Q ID NO 22 o SEQ ID N. 26.

También se divulga un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une a la proteína BAG3 y que comprende: a) una secuencia de nucleótidos de la cadena pesada codificada por SEQ ID NO: 11 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % a la misma, y b) una secuencia de nucleótidos de la cadena ligera codificada por SEQ ID NO: 19 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % a la misma. Como se usa en el presente documento, “identidad de secuencia" entre dos secuencias de nucleótidos, indica el porcentaje de nucleótidos que son idénticos entre las secuencias, preferiblemente a lo largo de la longitud entera de las secuencias de nucleótidos codificadas por SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 19. Las secuencias de nucleótidos preferidas divulgadas tienen una identidad de secuencia de al menos el 85 %, más preferiblemente el 90 %, incluso más preferiblemente el 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %.

En una divulgación adicional dicha secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a SEQ ID N. 11 se selecciona de SEQ ID N. 13, SEQ ID N: 15 o SEQ ID N. 17.

En una divulgación adicional dicha secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80 % con respecto a SEQ ID N. 19 se selecciona de SEQ ID N. 21, SEQ ID N: 23 o SEQ ID N: 25.

En una divulgación adicional el anticuerpo es el anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada está codificada por SEQ ID NO. 17 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera está codificada por SEQ ID NO 21 o SEQ ID N. 25.

El anticuerpo humanizado o fragmentos del mismo según la presente invención puede ser cualquier anticuerpo de origen natural y/o sintético, por ejemplo, un anticuerpo de origen mamífero. Preferiblemente, el dominio constante, si está presente, es un dominio constante humano. El dominio variable es preferiblemente un dominio variable de mamífero, por ejemplo, un dominio variable humanizado o humano.

Los anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son preferidos. En particular, los anticuerpos de la presente invención preferiblemente se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpo recombinantes, anticuerpos humanizados o totalmente humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiespecíficos, en particular, anticuerpos biespecíficos o fragmentos de los mismos.

Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por cualquier método adecuado tal como el de Kohler y Milstein (1975) o por métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de genotecas de anticuerpos de fagos usando técnicas descritas en Clackson et al. (1991).

Las formas humanizadas de los anticuerpos se pueden generar según los métodos conocidos en la técnica (Kettleborough C. A. et al., 1991), tal como quimerización o injerto de CDR. Los métodos alternativos para la producción de anticuerpos humanizados se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos EP 0239400 y WO 90/07861. Los anticuerpos humanos también se pueden derivar por métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen, pero no están limitados a, presentación en fagos, presentación en levaduras, y similares.

Según la presente invención “anticuerpo quimérico” se refiere a anticuerpos que comprenden polipéptidos de diferentes especies, tal como, por ejemplo, ratón y humano. La producción de anticuerpos quiméricos se describe, por ejemplo, en el documento WO 89/09622.

El término anticuerpo incluye “fragmentos” o “derivados”, que tienen al menos un sitio de unión al antígeno del anticuerpo.

Según una forma de realización preferida el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un fragmento Fv, un diacuerpo, un scFv, un inmunofármaco modular pequeño (SMIP), un aficuerpo, un avímero, un nanocuerpo, un anticuerpo de dominio y/o cadenas individuales.

El anticuerpo humanizado de la invención puede ser preferiblemente del tipo de anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente tal isotipo sino, más bien que el anticuerpo como se genera puede poseer cualquier isotipo y que el anticuerpo puede cambiar de isotipo.

Una forma de realización adicional de la invención es un vector que comprende el ácido nucleico que codifica el anticuerpo humanizado de la invención. Dicho vector se selecciona de un fago, un plásmido, un vector vírico o retrovírico. Preferiblemente, el vector de la invención es un vector de expresión en donde la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una o más secuencias de control que permitan la transcripción y opcionalmente la expresión en células huéspedes procariotas y/o eucariotas.

Una forma de realización adicional de la presente invención es un huésped que comprende el vector de la invención, seleccionado de una célula procariota o eucariota, preferiblemente una célula de mamífero o humana, o un animal transgénico no humano.

También se divulga un método para la preparación del anticuerpo o un fragmento del mismo divulgado anteriormente, que comprende cultivar el huésped de la invención en condiciones que permitan la síntesis de dicho anticuerpo y recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.

Se divulga un anticuerpo o fragmento del mismo obtenido por los métodos divulgados anteriormente.

Una forma de realización adicional de la presente invención es el uso del anticuerpo humanizado anteriormente mencionado o un fragmento del mismo como medicamento, preferiblemente en el tratamiento de un estado patológico particular que implica la activación de macrófagos. Tal estado patológico se puede elegir de: enfermedades neoplásicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunitarias o enfermedades degenerativas.

Preferiblemente, tales enfermedades neoplásicas pueden ser tumor pancreático o tumor de vejiga, más preferiblemente tumor pancreático.

Preferiblemente dichas enfermedades inflamatorias se pueden elegir de enfermedades relacionadas con inflamación de la piel, los nervios, los huesos, los vasos sanguíneos o tejidos conjuntivos, y más preferiblemente psoriasis, artritis, neuritis o conectivitis.

Preferiblemente, dichas enfermedades inmunitarias se pueden elegir de enfermedades autoinmunitarias tal como enfermedades reumáticas, enfermedades del tejido conjuntivo, enfermedades neuromusculares, enfermedades endocrinas, enfermedades gastrointestinales, enfermedades hematológicas, enfermedades de la piel o vasculitis, y más preferiblemente, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, conectivitis, lupus eritematoso, endometriosis o colitis ulcerosa.

Preferiblemente, dichas enfermedades degenerativas se pueden elegir de enfermedades neurodegenerativas y enfermedades degenerativas musculares, y más preferiblemente enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, o distrofia muscular.

Un fin adicional de la presente invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado anteriormente mencionado o fragmento del mismo en asociación con al menos un excipiente o soporte farmacéuticamente aceptable.

Una divulgación adicional es el uso de dicha composición como un medicamento.

Una divulgación adicional es el uso de la composición en el tratamiento de enfermedades neoplásicas y enfermedades de una naturaleza inflamatoria, inmunitaria y/o degenerativa, preferiblemente enfermedad neoplásica, seleccionada de tumor pancreático o tumor de vejiga.

La composición de la presente invención se puede formular en una forma adecuada para la administración oral o en una forma adecuada para la administración parenteral o tópica.

En una divulgación preferida dicha forma oral se puede elegir de las siguientes: comprimidos, cápsulas, soluciones, suspensiones, gránulos y cápsulas oleaginosas.

En una divulgación preferida adicional dicha forma tópica se puede elegir de los siguiente: crema, pomada, pomada, solución, suspensión, gotas oculares, óvulo vaginal, solución nebulizadora, espray, polvo o gel.

En una divulgación preferida adicional dicha forma parenteral puede ser o bien una solución tampón acuosa o una suspensión oleaginosa.

Dicha administración parenteral incluye administración por medio intramuscular, intravenoso, intradérmico, subcutáneo, intraperitoneal, intranodal o intraesplénico.

Preferiblemente la composición farmacéutica según la presente invención comprende un principio activo adicional, seleccionado de antimetabolitos, camptotecinas o taxanos.

Más preferiblemente dichos principios activos se seleccionan de: gemcitabina, 5-fluorouracilo, irinotecano, oxaliplatino, paclitaxel unido a albúmina, capacitabina, cisplatino, paclitaxel, docetaxel o liposoma de irinotecano.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Quimerización y humanización del anticuerpo AC2.

El anticuerpo murino AC-2 se produce por un hibridoma aislado del clon madre de hibridoma no. PD02009 depositado el 17/12/2002 en el Centro de Biotecnología Avanzada de Génova y divulgado en el documento WO03/055908. El ARN total se extrajo y se realizó RT-PCR para clonar y secuenciar las regiones variables del anticuerpo usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos).

Basado en información de secuencia de la región variable, la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo murino AC-2 (SEQ ID No. 1 y SEQ ID N. 2 para las secuencias de aminoácidos y SEQ ID 9 y SEQ ID N. 10 para las secuencias de nucleótidos), se han obtenido diferentes variantes humanizadas de dicha región por síntesis génica usando procedimientos estándar.

Las secuencias que codifican las variantes del anticuerpo se clonaron en el vector de expresión Evi-5 (Evitria AG, Suiza) y se expresaron en células CHO-K1.

Para la quimerización del anticuerpo, las regiones constantes murinas se sustituyeron con las regiones constantes humanas. Se hizo una versión quimérica de la cadena pesada (HC) en un contexto de IgG1.

Para la humanización del anticuerpo, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino se injertaron en un marco del humano.

Se hicieron veinticuatro versiones humanizadas de la cadena pesada (HC) en un contexto de IgG1 y LC-kappa. Cada versión se caracteriza por mutaciones puntuales específicas en la FR.

Ejemplo 2 - Cribado para actividad de unión de anticuerpo

Se ensayaron Ac quiméricos y variantes humanizadas en paralelo para la capacidad de unirse a BAG3, usando un ensayo ELISA indirecto.

Materiales y Métodos

Se recubrieron microplacas de 96 pocillos (NUNC Maxisorp) usando una secuencia específica (Pep2) en la proteína BAG3 de longitud completa (desde el aa 385 al aa 399) reconocida por el anticuerpo murino (AC-2). La placa se incubó durante la noche con 1 pg/ml de Pep2 (50 pl/pocillo) en un tampón fosfato (PBS, pH 7,4). A continuación, la placa se lavó dos veces con una solución detergente (Tween-20 al 0,05 % en PBS), y el bloqueo de los sitios no específicos se realizó durante una hora a temperatura ambiente usando, para cada pocillo, 150 pl de una solución de gelatina de pescado al 0,5 % (Sigma) en tampón fosfato (PBS, pH 7,4). Las placas se lavaron dos veces con el tampón de lavado y después los anticuerpos se cargaron. En algunos de los pocillos, se cargaron diluciones a escala de variantes quiméricas y humanizadas del anticuerpo, 500 ng/ml (50 pl/pocillo) en duplicado. Los anticuerpos se diluyeron en una solución de gelatina de pescado al 0,5 %, Tween al 0,05 % en PBS (BSA/Tween). La placa se incubó durante 2 h a temperatura ambiente y después se lavó durante 5 veces con tampón de lavado. Las muestras se incubaron después 30 minutos a temperatura ambiente con 50 pl/pocillo de anti-IgG de ratón conjugado a HRP o anti-IgG humana conjugado a HRP como el anticuerpo secundario. Después de 6 lavados con el tampón de lavado, el sustrato de la peroxidasa, tetrametilbenzidina (TMB) se añadió a los pocillos (50 pl/pocillo). La reacción colorimétrica se bloqueó después de 10 minutos por la adición de ácido sulfúrico 0,5 M (25 pl/pocillo) y los valores de densidad óptica (DO) se detectaron usando un espectrofotómetro a la longitud de onda de 450 nm (Figura 1). Las variantes quiméricas y humanizadas del anticuerpo también se ensayaron usando placas recubiertas con proteína de longitud completa BAG3 recombinante (rBAG3) por ensayo ELISA indirecto usando el mismo protocolo descrito anteriormente (Figura 2).

Resultados

La unión de las diferentes variantes de anticuerpo se detectó en ELISA usando el péptido 2 como recubrimiento (Fig. 1) o BAG3 de longitud completa recombinante (Fig. 2). Las siguientes variantes de anticuerpo mostraron mayor capacidad de unión y se eligieron para análisis adicional: H1L2, H1L3, H1L4, H2L2, H2L3, H2L4, H3L2, H3L3, H3L4, H4L2, H4L3, H4L4.

Ejemplo 3 - Determinación de la KD de variantes de anticuerpo humanizadas

Materiales y Métodos

Se realizaron experimentos de unión en Octet Red96 a 25 °C. Los anticuerpos se capturaron en sensores de inmersión y lectura AHC (captura anti-Fc de IgG humana), seguido por unión de Ag (rBAG3 de E. coli) a concentraciones variables. La unión del antígeno a los anticuerpos se siguió en tiempo real para obtener las constantes de asociación (ka) y disociación (kd). La constante de equilibrio (KD) se calculó a partir de las ka y kd observadas.

Se realizó el análisis cinético completo usando concentraciones de analito desde 100 nM a 0. El análisis se realizó usando concentraciones de analito de 100 nM y carrera con diluciones en serie en tampón de ensayo, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,56 y 0 nM. Se llevó a cabo análisis de Chi cuadrado (x2) entre el sensorgrama real (línea coloreada) y el sensorgrama generado del software de análisis Fortebio Octet (línea roja) para determinar la precisión del análisis. Un valor en 1-2 se considera significativo (preciso) y por debajo de 1 es muy significativo (muy preciso).

Nota: se usaron 2x 8 sensores para 1 análisis cinético completo, los sensores se regeneraron y usaron múltiples veces y capturaron con BAG-H-L, BAG-H1-L2, BAG-H1-L3, BAG-H1-L4, BAG-H2-L2, BAG-H2-L3, BAG-H2-L4, BAG-H3-L2, BAG-H3-L3, BAG-H3-L4, BAG-H4-L2 BAG-H4-L3, BAG H4-L4 para realizar 13 cinéticas completas.

Resultados

La afinidad para las diferentes variantes calculado como antes se describe a continuación. El anticuerpo murino AC-2 mostró una KD (M) de 10-12 mientras que todas las variantes humanas mostraron una KD (M) de 10-9 (véase la tabla 1). Sin embargo, esta diferencia no tuvo impacto en la actividad biológica de las variantes como se describirá.

Tabla 1. Afinidad de las variantes del anticuerpo AC-2

Ejemplo 4 - Evaluación de la capacidad de las variantes del anticuerpo para bloquear la unión de BAG3 a superficie de macrófagos

BAG3 se une a la superficie de macrófagos y se ha mostrado que la unión se inhibe específicamente por el anticuerpo murino anti-BAG3 AC-2 que secuestra la proteína BAG3. Aquí se ensayó la capacidad de las variantes quiméricas y humanizadas del anticuerpo de bloquear la unión a la superficie de macrófagos.

Materiales y Métodos

Se incubaron células J774 A.1 (1 x 106/ml) con solución de bloqueo (PBS que contenía SBF al 5 %/NaN3 al 0,1 %) y con FcR bloqueante de ratón (Miltenyi Biotec-cod. 130-092-575) (1 pl/1x106 células) durante 30 min a 4 °C. A continuación, se incubaron 1x105 células con proteína FITC-rBAG3 (40 pg/ml) sola o en presencia de anticuerpo de ratón anti-BAG3 (AC2) (3200 pg/ml) o IgG1 murina (3200 pg/ml) en solución de bloqueo, durante 30 minutos en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS y se analizaron por citometría de flujo.

Resultados

Evaluación por citometría de flujo de unión de BAG3 fluorescente a la superficie de la línea celular de macrófagos J774 A.1. Los datos se describen como intensidad de fluorescencia media (Figura 3). En base a estos resultados, se eligieron las variantes del anticuerpo humanizadas H4L2, H4L3, H4L4 y H2L4.

Ejemplo 5 - Evaluación de la capacidad de variantes humanizadas del anticuerpo AC-2 para bloquear la activación de monocitos primarios

Se seleccionaron las variantes humanizadas del anticuerpo H4L2, H4L3, H4L4 y H2L4, se purificaron por medio de captura con proteína A (HiTrap Protein A HP, GE Healthcare), y se ensayó además su capacidad de bloquear la activación de monocitos humanos primarios.

Hemos mostrado previamente que BAG3 puede activar macrófagos humanos primarios. Aquí se usa la secreción de IL-6 como una lectura de la activación de macrófagos para mostrar la capacidad de las variantes de anticuerpo humanizadas H4L2, H4L3 y H4L4 para bloquear la activación de monocitos dependiente de BAG3.

Materiales y Métodos

Se obtuvieron capas leucocíticas (CompoFlex® Triple “Top and Top” System -Fresenius Kabi) de donantes sanos y se almacenaron durante la noche a 4 °C. Se aislaron las CMSP en gradientes de densidad Ficoll-Hypaque estándar. Las células mononucleares se aislaron y sometieron a lavados secuenciales con 50 ml de PBS 1X con el fin de eliminar contaminaciones de plaquetas y eritrocitos; (I: a 1100 g durante 20 min; II: a 800 g durante 10 min; III: a 400 g durante 10 min; IV: a 300 g durante 10 min; V y VI: a 100 g durante 10 min). Todas las centrifugaciones se hicieron con el freno desconectado. Las células se comprobaron después en el microscopio y si todavía había contaminaciones presentes, se realizó una centrifugación adicional a 100 g durante 10 min.

Las CMSP se sembraron después en microplacas de 96 pocillos (2X106 células/ml) y se cultivaron en RPMI sin glutamina (100 pl/pocillo) sin SBF y con reactivo de bloqueo FcR humano (1 pl cada millón de células) (Miltenyi 130 059-901) durante 16 horas (durante la noche).

El día después, las células se trataron durante 6 h con rBAG3 (0,5 pg/ml). Se realizaron ensayos de bloqueo de Acm incubando la rBAG3 junto con diferentes concentraciones de AC-2 o las variantes humanizadas.

El tratamiento se realizó sin cambiar el medio a las células, pero añadiendo 100 pl de RPMI sin SBF a cada pocillo que contenía moléculas descritas anteriormente. Todas las moléculas se añadieron a 100 pl de RPMI sin SBF en un tubo estéril y las moléculas se añadieron al doble de su concentración final a las células. Las moléculas se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en los tubos y después se añadieron a las células. La preincubación es necesaria para los ensayos de bloqueo de Acm. Después del tratamiento, el medio de cultivo de las células se recogió después de centrifugación a 400 g durante 5 minutos. Los sobrenadantes se analizaron para el contenido de IL-6 en duplicado a una dilución 1:10 con un kit de IL-6 ELISA humano (eBioscience, San Diego, CA). La concentración de IL-6 se evaluó por comparación de la DO de la muestra con la de una curva patrón de IL-6 recombinante.

Resultados

Los resultados descritos en la tabla 2 se expresan como el % de inhibición de la producción de IL-6 inducida por rBAG3 por los diferentes anticuerpos. Todas las variantes muestran capacidad inhibidora comparable al anticuerpo anti-BAG3 AC2 murino. H4L2 y H4L4 se eligieron para ensayo adicional in vivo, para su capacidad para bloquear el crecimiento tumoral en un modelo tumoral de xenoinjerto.

Tabla 2

Ejemplo 6 - Efecto de variantes humanizadas del anticuerpo AC2 sobre el crecim iento tumoral in vivo

Basado en experimentos in vitro se eligen las variantes H4L2 y H2L4 para la posterior validación in vivo.

Materiales y métodos

Se suspendieron células Mia-Paca 2 (2x106) en PBS (200 j l) y se inyectaron en el flanco derecho de ratones CD1 hembras (6 semanas de edad; Charles River, Italia). Después de 10 días los ratones se dividieron en cuatro brazos consistentes en 7 (control) o 6 (tratados) ratones cada uno en los que el volumen tumoral medio variaba de 80-100 mm3. El grupo control recibió inyección i.p. de vehículo (PBS) cada 48 horas mientras que los grupos tratados recibieron inyección i.p. cada 48 horas de Acm anti-BAG3 murino (AC2) o humanizado H2L4, H4L2 a las dosis de 20 mg/kg en p Bs durante 5 semanas. Los animales se pesaron y el volumen tumoral se midió por calibrador (Dxd2/2) una vez a la semana.

Resultados

La figura 4 describe el cambio tumoral en veces a intervalos semanales de control (PBS) o animales tratados con los anticuerpos indicados. La proporción es entre el volumen medio en el punto de tiempo indicado y el volumen medio el día 0. Mientras que los animales tratados control muestran un aumento de 4 veces, los animales tratados solo aumentan en 2,5 veces.

Ejemplo 7 - Impacto de la variante H2L4 de AC-2 humanizada sobre el número de fibroblastos activados en la masa tumoral

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo que se une a la proteína BAG3 y que comprende:

a) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada como se muestra en SEQ ID N. 12 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma, y

b) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera como se muestra en SEQ ID N. 20 o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma,

caracterizado en que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: H-CDR1 comprende los aminoácidos GFNIKDTYMY (SEQ ID N. 3), H-CDR2 comprende los aminoácidos GVDPANGNTRYDPKFQG (SEQ ID N. 4), H-CDR3 comprende los aminoácidos DGa Md Y (SEQ ID N. 5) y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera o al menos el dominio variable de la misma o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con la misma, comprende las regiones CDR que tienen la siguiente composición de aminoácidos: L-CDR1 comprende los aminoácidos KSSQSLLYSSNQKn YlA (SEQ ID N. 6), L-CDR2 comprende los aminoácidos WASTRES (SEQ ID N. 7) y L-CDR3 comprende los aminoácidos QQYYTYPLT (SEQ ID N. 8).

2. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según la reivindicación 1, caracterizado en que dicha secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con respecto a SEQ ID N. 12 se selecciona de SEQ ID N. 14, SEQ ID N. 16 o SEQ ID N. 18.

3. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según la reivindicación 1, caracterizado en que dicha secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 95 % con respecto a SEQ ID N. 20 se selecciona de SEQ ID N. 22, SEQ ID N. 24 o SEQ ID N. 26.

4. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado en que la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada se muestra en SEQ ID NO. 18 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera se muestra en SEQ ID NO 22 o SEQ ID N. 26.

5. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado en que es un anticuerpo de origen natural o sintético, preferiblemente un anticuerpo de origen mamífero.

6. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizado en que dicho anticuerpo es un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un fragmento Fv, un diacuerpo, un fragmento scFv, un inmunofármaco modular pequeño (SMIP).

7. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 7.

9. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 7 o el vector de la reivindicación 8.

10. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones previas para uso como un medicamento.

11. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo para uso según la reivindicación 10, en el tratamiento de un estado patológico que implica la activación de macrófagos, seleccionado de enfermedades neoplásicas, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunitarias y/o enfermedades degenerativas.

12. Anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo para uso según la reivindicación 11, en el tratamiento de una enfermedad neoplásica, seleccionada de tumor pancreático o tumor de vejiga, más preferiblemente tumor pancreático.

13. Composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones 1 a 6 y al menos un excipiente o soporte farmacéuticamente aceptable.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13 caracterizada en que dicha composición se puede formular en una forma adecuada para la administración oral o en una forma adecuada para la administración parenteral o tópica.

15. Composición farmacéutica según la reivindicación 13 caracterizada en que comprende un principio activo adicional, seleccionado de antimetabolitos, camptotecinas o taxanos, preferiblemente gemcitabina, 5-fluorouracilo, irinotecano, oxaliplatino, paclitaxel unido a albúmina, capecitabina, cisplatino, paclitaxel, docetaxel o liposomas de irinotecano.