ES2720617T3 - Anticuerpo anti-gremlin-1 - Google Patents

Anticuerpo anti-gremlin-1 Download PDF

Info

Publication number
ES2720617T3
ES2720617T3 ES13760897T ES13760897T ES2720617T3 ES 2720617 T3 ES2720617 T3 ES 2720617T3 ES 13760897 T ES13760897 T ES 13760897T ES 13760897 T ES13760897 T ES 13760897T ES 2720617 T3 ES2720617 T3 ES 2720617T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
cancer
antibody
gremlin
cells
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13760897T
Other languages
English (en)
Inventor
Hyun Kee Kim
Junho Chung
Min Soo Kim
Soo Min Yoon
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SNU R&DB Foundation
Original Assignee
SNU R&DB Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SNU R&DB Foundation filed Critical SNU R&DB Foundation
Application granted granted Critical
Publication of ES2720617T3 publication Critical patent/ES2720617T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

Un anticuerpo anti-gremlin-1 que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo anti-gremlin-1
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo anti-gremlin-1 y, de manera más particular, a un anticuerpo antigremlin-1 que tiene el efecto de tratar cáncer mediante la inhibición de gremlin-1 de una manera independiente de la proteína morfogenética ósea (BMP) o del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2).
Antecedentes de la técnica
Gremlin-1 (20,7 kDa), un antagonista de la proteína morfogenética ósea (BMP), es una proteína que consta de 184 aminoácidos que tienen una estructura común con una región rica en cisteína, un motivo de nudo de cisteína y miembros de la superfamilia TGF-p. Esta proteína se conserva evolutivamente y el gen de gremlin humana (GREM1) se ha mapeado en el cromosoma 15q13-q15 (Topol LZ y col., (1997) Mol. Cell Biol., 17: 4801-4810; Topol LZ y col., Cytogenet Cell Genet., 89: 79-84). Gremlin-1 es una proteína secretada, y se han informado tres isoformas (Topol LZ y col., J. Biol. Chem., 275: 8785-8793). La isoforma 1 es la isoforma más común, y las isoformas 2 y 3 tienen deleciones de los aminoácidos 39-79 y 10-79, respectivamente.
Gremlin-1 forma heterodímeros con BMP-2, BMP-4 y BMP-7, y por lo tanto inhibe que la proteína morfogenética ósea (BMP) se una a los receptores en la superficie celular (Stanley E y col., (1998) Mech. Dev., 77: 173-184; Merino R y col., (1999) Development, 126: 5515-5522; Lappin DW y col., (2000) Curr. Opin. Nephrol. Hypertens., 9: 469-472). Además, gremlin-1 desempeña un papel importante en la regulación de las BMP durante el desarrollo de los pulmones, las extremidades y los riñones, así como durante la diferenciación de las células de la cresta neural (Lu MM y col., (2001) Dev. Dyn., 222: 667-680; Shi W y col., (2001) Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol., 280: L1030-1039). Además de su efecto antagonista sobre ligandos solubles, gremlin-1 interactúa intracelularmente con la proteína precursora BMP-4 y regula a la baja la actividad de señalización mediada por BMP-4 en los pulmones embrionarios (Sun J y col., (2006) J. Biol. Chem., 281: 29349-29356). Gremlin-1 también interactúa con proteínas Slit, una familia de proteínas secretadas de guía axonal, y actúa como un inhibidor de la quimiotaxis de monocitos (Chen B y col., (2004) J. Immunol., 173: 5914-5917). Recientemente, se informó que gremlin-1 se une al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) de manera independiente de BMP y modula la angiogénesis (Mitola S y col., (2010) Blood, 116: 3677-3680). Gremlin-1 está sobreexpresada en varios tumores humanos, incluidos los carcinomas del cuello uterino, endometrio, pulmón, ovario, riñón, mama, colon y páncreas (Namkoong H y col., (2006) BMC Cancer, 6: 74; Sha G y col., (2009) Fertil Steril., 91: 350-358), pero no se ha estudiado con detalle su papel en la carcinogénesis.
El documento WO 2005/029082 se refiere, entre otros, a un procedimiento in vitro para detectar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de los compuestos para el tratamiento del adenocarcinoma ductal pancreático y/o pancreatitis en un individuo, así como a los agentes que inhiben la expresión y/o actividad de la proteína DRM. En este sentido, el documento WO 2005/029082 divulga un anticuerpo específico para la proteína DRM.
Los presentes inventores han estudiado las características de gremlin-1 relacionadas con tumores y, como resultado, han encontrado que gremlin-1 interactúa directamente con las células cancerosas de manera independiente de BMP o VEGFR2, y basándose en este hallazgo, tienen un anticuerpo neutralizante capaz de inhibir gremlin-1.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-gremlin-1 que tiene el efecto de tratar cáncer o enfermedad inmunitaria mediante la inhibición de gremlin-1 de una manera independiente de la proteína morfogenética ósea (BMP) o del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2).
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende el anticuerpo anti-gremlin-1 y un aditivo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se describe adicionalmente un procedimiento para prevenir o tratar cáncer o enfermedad inmunitaria, que comprende la administración a un sujeto que lo necesite, del anticuerpo anti-gremlin-1 o una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-gremlin-1.
En el presente documento se describe adicionalmente un kit para diagnosticar cáncer o enfermedad inmunitaria, que comprende el anticuerpo anti-gremlin-1.
El anticuerpo anti-gremlin-1 de acuerdo con la presente invención puede inhibir la unión de gremlin-1 a las células cancerosas de una manera independiente de la proteína morfogenética ósea (BMP) o del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), y por lo tanto puede ser utilizado eficazmente para la prevención de varios tipos de cáncer, que son mediados por gremlin-1.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un gráfico que muestra los resultados obtenidos al tratar cuatro tipos de células cancerosas (A549, HeLa, A172 y A431) con cada uno de los anticuerpos secundarios, gremlin-1 solo, y una combinación de gremlin-1 con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un anticuerpo control, y analizar las células, a continuación, por citometría de flujo.
La FIG. 2A es un gráfico que muestra los resultados obtenidos al tratar células HUVEC con gremlin-1 y analizar las células, a continuación, por citometría de flujo.
La FIG. 2B muestra los resultados obtenidos al tratar células HUVEC, A549 y HeLa con gremlin-1, y medir, a continuación, la expresión de ARNm y proteína de VEGFR2 en las células mediante RT-PCR.
La FIG. 2C muestra los resultados obtenidos al tratar células HUVEC, A549 y HeLa con gremlin-1, y medir, a continuación, la expresión de ARNm y proteína de VEGFR2 en las células mediante análisis de inmunotransferencia.
La FIG. 3A muestra los resultados obtenidos al permitir que BMP2, BMP4 y BMP7 interactúen con cada uno de gremlin-1 solo, un anticuerpo solo de acuerdo con la presente invención y una combinación de los mismos, y medir, a continuación, la interacción de gremlin-1 con los BMP por un inmunoensayo enzimático.
La FIG. 3B es un gráfico que muestra los resultados obtenidos al tratar células A549 con gremlin-1, añadiendo un exceso 10 veces molar de BMP-2, BMP-4 y BMP-7 a las mismas, y analizar las células, a continuación, mediante citometría de flujo.
La FIG. 4A es una imagen de células A549 teñidas con cristal violeta después del tratamiento con gremlin-1. La FIG. 4B muestra los resultados obtenidos al tratar células A549 con gremlin-1, y medir, a continuación, la expresión de E-cadherina en las células mediante análisis de inmunotransferencia.
La FIG. 4C muestra los resultados obtenidos al tratar células A549 con gremlin-1, y medir, a continuación, la expresión de E-cadherina en las células mediante tinción con inmunofluorescencia.
La FIG. 4D es un gráfico que muestra los resultados obtenidos al tratar células A549 con cada uno de gremlin-1 solo, y una combinación de gremlin-1 con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un anticuerpo control, y medir, a continuación, la migración de las células.
La FIG. 5A muestra los resultados de medir de la expresión del ARNm y proteína de gremlin-1 en una línea celular gremlin-1-A549 y en una línea celular A549 simulada mediante RT-PCR y análisis de transferencia Western. La FIG. 5B muestra los resultados de medir los niveles de expresión de E-cadherina en una línea celular gremlin-1-A549, una línea celular A549 simulada y una línea celular gremlin-1-A549 tratada con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un anticuerpo control, mediante análisis de inmunotransferencia.
La FIG. 5C es un gráfico que muestra el número de células invadidas en una línea celular A549 simulada y en células gremlin-1-A549.
La FIG. 5D es un gráfico que muestra la migración de células en una línea celular gremlin-1-A549, una línea celular A549 simulada y una línea celular gremlin-1-A549 tratada con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o un anticuerpo control.
La FIG. 5E es un gráfico que muestra los resultados de medir el crecimiento celular de cada una de una línea celular gremlin-1-A549, una línea celular A549 simulada y una línea celular gremlin-1-A549 tratada con un anticuerpo de acuerdo con la presente invención.
La FIG. 5F es un gráfico que muestra los resultados de medir el volumen de tumores formados después de inyectar ratones atímicos con cada una de una línea celular gremlin-1-A549 y una línea celular A549 simulada.
Las figuras 6A a 6I muestran los resultados obtenidos al tratar tejidos normales y tejidos cancerosos (tejidos cancerosos de la piel, mama, ganglio linfático, pulmón, hígado, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, cuello uterino, endometrio y tiroides) con un anticuerpo (O-13) según la presente invención, y medir el nivel de expresión de gremlin-1 en los tejidos mediante tinción inmunohistoquímica.
Descripción detallada de la invención
A continuación, la presente invención se describirá con detalle.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-gremlin-1 que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. Este anticuerpo se caracteriza por tener el efecto de tratar el cáncer mediante la inhibición de gremlin-1 de una manera independiente de la proteína morfogenética ósea (BMP) o del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2). El anticuerpo puede seleccionarse entre anticuerpos quiméricos.
El anticuerpo anti-gremlin-1 se puede seleccionar usando, por ejemplo, tecnología de presentación en fagos. Concretamente, puede seleccionarse fusionando un gen que expresa el anticuerpo deseado a un gen que expresa una proteína de cubierta de fago filamentoso, produciendo partículas de virus de tipo anticuerpo-fago que tienen el anticuerpo fusionado expuesto a la superficie de partículas de bacteriófagos, y seleccionando, a continuación, el anticuerpo deseado de la biblioteca de fagos utilizando una técnica de biopanning. Usando la tecnología de presentación en fagos como se describe anteriormente, se puede obtener un gran número de anticuerpos que tienen efectos excelentes, y entre ellos, se seleccionaron 7 tipos de anticuerpos que tuvieron efectos significativamente excelentes.
El anticuerpo es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8. En el presente documento se describe además un anticuerpo que comprende una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena pesada, una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada, en la que la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada se seleccionan entre las que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos, respectivamente:
(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4;
(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6;
(4) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; este es el anticuerpo anti-gremlin-1 de la presente invención;
(5) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10;
(6) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; y
(7) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
En la presente invención, los anticuerpos (1) a (7) como se describen anteriormente se denominaron R-80, R-88, O-1, O-13, O-26, J-1, y O-13 (humanizado), respectivamente.
La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada del anticuerpo pueden ser de origen humano o de conejo. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada del anticuerpo pueden usarse solas o en combinación entre ellas mismas, pueden usarse en combinación con la región constante de cadena ligera y la región constante de cadena pesada conocidas en la técnica, o también se pueden usar fragmentos de las mismas. La región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada pueden producirse en forma de fragmento variable de cadena sencilla (scFv) de acuerdo con un procedimiento conocido.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, los aminoácidos 1­ 22 corresponden a la región marco 1 (FR1), los aminoácidos 23-33 corresponden a la región determinante de complementariedad 1 (CDR1), los aminoácidos 34-48 corresponden a la región marco 2 (FR2), los aminoácidos 49­ 55 corresponden a la región determinante de complementariedad 2 (CDR2), los aminoácidos 56-87 corresponden a la región marco 3 (FR3), los aminoácidos 88-100 corresponden a la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) y los aminoácidos 101-110 corresponden a la región marco 4 (FR4).
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, los aminoácidos 1-24 corresponden a FR1, los aminoácidos 25-34 corresponden a CDR1, los aminoácidos 35-48 corresponden a FR2, los aminoácidos 49-64 corresponden a CDR2, los aminoácidos 65-95 corresponden a FR3, los aminoácidos 96-105 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 106-116 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, los aminoácidos 1­ 22 corresponden a FR1, los aminoácidos 23-33 corresponden a CDR1, los aminoácidos 34-48 corresponden a FR2, los aminoácidos 49-55 corresponden a CDR2, los aminoácidos 56-87 corresponden a FR3, los aminoácidos 88-100 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 101-110 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, los aminoácidos 1-24 corresponden a FR1, los aminoácidos 25-34 corresponden a CDR1, los aminoácidos 35-48 corresponden a FR2, los aminoácidos 49-64 corresponden a CDR2, los aminoácidos 65-95 corresponden a FR3, los aminoácidos 96-109 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 110-120 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, los aminoácidos 1­ 22 corresponden a FR1, los aminoácidos 23-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-50 corresponden a FR2, los aminoácidos 51-57 corresponden a CDR2, los aminoácidos 58-89 corresponden a FR3, los aminoácidos 90-100 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 101-110 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6, los aminoácidos 1-25 corresponden a FR1, los aminoácidos 26-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-66 corresponden a CDR2, los aminoácidos 67-98 corresponden a FR3, los aminoácidos 99-110 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 111-122 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, los aminoácidos 1­ 22 corresponden a FR1, los aminoácidos 23-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-50 corresponden a FR2, los aminoácidos 51-57 corresponden a CDR2, los aminoácidos 58-89 corresponden a FR3, los aminoácidos 90-100 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 101-110 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, los aminoácidos 1 a 25 corresponden a FR1, los aminoácidos 26-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-66 corresponden a CDR2, los aminoácidos 67-98 corresponden a FR3, los aminoácidos 99­ 110 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 111-121 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, los aminoácidos 1­ 22 corresponden a FR1, los aminoácidos 23-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-50 corresponden a FR2, los aminoácidos 51-57 corresponden a CDR2, los aminoácidos 58-89 corresponden a FR3, los aminoácidos 90-100 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 101-110 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10, los aminoácidos 1-25 corresponden a FR1, los aminoácidos 26-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-66 corresponden a CDR2, los aminoácidos 67-98 corresponden a FR3, los aminoácidos 99-110 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 111-121 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11, los aminoácidos 1-23 corresponden a FR1, los aminoácidos 24-34 corresponden a CDR1, los aminoácidos 35-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-56 corresponden a CDR2, los aminoácidos 57-88 corresponden a FR3, los aminoácidos 89-97 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 98-107 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12, los aminoácidos 1-30 corresponden a FR1, los aminoácidos 31-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-66 corresponden a CDR2, los aminoácidos 67-98 corresponden a FR3, los aminoácidos 99-110 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 111-121 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13, los aminoácidos 1-23 corresponden a FR1, los aminoácidos 24-36 corresponden a CDR1, los aminoácidos 37-51 corresponden a FR2, los aminoácidos 52-58 corresponden a CDR2, los aminoácidos 59-90 corresponden a FR3, los aminoácidos 91-101 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 102-111 corresponden a FR4.
En la región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, los aminoácidos 1-25 corresponden a FR1, los aminoácidos 26-35 corresponden a CDR1, los aminoácidos 36-49 corresponden a FR2, los aminoácidos 50-66 corresponden a CDR2, los aminoácidos 67-98 corresponden a FR3, los aminoácidos 99-110 corresponden a CDR3, y los aminoácidos 111-121 corresponden a FR4.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 15; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 16; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 17; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18; la secuencia de aminoácidos de la s Eq ID NO: 5 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 19; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 20; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 22; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 23; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 24; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 25; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 26; la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 27; y la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 puede codificarse por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 28.
Se sabe que Gremlin-1 se expresa en tejido canceroso, pero aún no se ha identificado su papel específico. Se sabe que Gremlin-1 es un antagonista de la proteína morfogenética ósea (BMP), y se informó que gremlin-1 se une al receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) para regular la formación vascular. Por lo tanto, se esperaba que gremlin-1 interactuara con las células cancerosas de una manera dependiente de BMP o VEGFR2. Sin embargo, sorprendentemente, los presentes inventores han encontrado que gremlin-1 se une directamente a las células cancerosas de una manera independiente de BMP o VEGFR2 para inducir la migración, invasión y proliferación celular. Además, gremlin-1 induce el crecimiento de células cancerosas al inhibir la expresión de E-cadherina.
La migración, invasión y proliferación celular se inhiben mediante el anticuerpo anti-gremlin-1 como se describe anteriormente. Por lo tanto, el anticuerpo contra gremlin puede mostrar el efecto de tratar el cáncer mediante la inhibición de gremlin-1 de manera independiente de BMP o VEGFR2, es decir, inhibiendo la unión directa de gremlin-1 a las células cancerosas.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer, que comprende el anticuerpo anti-gremlin-1 de la presente invención y un transportador farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento se describe adicionalmente una composición farmacéutica para prevenir o tratar cáncer, que comprende el anticuerpo anti-gremlin-1 y un aditivo farmacéuticamente aceptable. El aditivo puede incluir un transportador, un excipiente u otros aditivos.
La composición de la presente invención se puede preparar como una formulación farmacéutica de acuerdo con un procedimiento convencional. En la preparación de la formulación, el anticuerpo se mezcla o diluye preferentemente con un transportador o se encierra en un transportador tipo envase. Si un transportados se utiliza como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido que actúa como un transportador, excipiente o medio para el anticuerpo. Por lo tanto, la formulación puede estar en forma de comprimido, píldora, polvo, sobrecito, elixir, suspensión, emulsión, solución, jarabe, aerosol, cápsula de gelatina blanda y dura, solución inyectable estéril, polvo estéril o similares. Ejemplos de transportadores, excipientes y diluyentes adecuados incluyen lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, silicato cálcico, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, metilhidroxibenzoato, propilhidroxibenzoato, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. La composición farmacéutica de la presente invención también puede incluir adicionalmente, rellenos, agentes antiaglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, agentes aromatizantes, emulsionantes, conservantes y similares. La composición de la presente invención puede formularse usando un procedimiento bien conocido en la técnica, de manera que proporcione una liberación rápida, sostenida o retardada del anticuerpo después de su administración a un mamífero. La composición de anticuerpos de la presente invención puede comprender, además del anticuerpo descrito anteriormente, un agente antiviral tal como interferón, un anticuerpo monoclonal del VHB, un anticuerpo policlonal del VHB, un análogo de nucleósido, un inhibidor de la ADN polimerasa, un fármaco de ARNip, o una vacuna terapéutica. Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención o una composición farmacéutica que comprende el mismo puede administrarse a sujetos que lo necesiten, por ejemplo, mamíferos, incluyendo seres humanos, para tratar el cáncer. La dosis del anticuerpo se determina de acuerdo con el sujeto que se va a tratar, la gravedad de la enfermedad o afección, la tasa de administración y el criterio del médico. El anticuerpo como principio activo se puede administrar por vía parenteral en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 10 mg/kg (peso corporal), preferentemente de 0,005 a 1 mg/kg, en una dosis única o en dosis divididas por día. En algunos casos, el anticuerpo puede administrarse en una cantidad menor que el límite inferior del intervalo mencionado anteriormente y puede administrarse en una cantidad mayor que el límite superior, siempre que no cause efectos secundarios graves. Si el anticuerpo se administra en una cantidad mayor que el límite superior, puede administrarse varias veces al día.
Por lo tanto, en el presente documento también se describe un procedimiento para tratar cáncer, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite el anticuerpo de acuerdo con la presente invención o la composición farmacéutica descrita anteriormente. En el presente documento, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención, se caracteriza por tener el efecto de tratar el cáncer mediante la inhibición de gremlin-1 de una manera independiente de la proteína morfogenética ósea (BMP) o del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2).
Ejemplos del cáncer descrito anteriormente incluyen, pero sin limitación, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de piel, cáncer de huesos, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de esófago y cáncer de cabeza y cuello.
Mientras tanto, el anticuerpo de la presente invención se puede usar para la prevención o el tratamiento de enfermedades inmunitarias. Una serie de publicaciones demostraron que gremlin-1 está estrechamente asociada con enfermedades inmunitarias (Mezzano S, y col. (2007) Expression of gremlin, a bone morphogenetic protein antagonist, in glomerular crescents of pauci-immune glomerulonephritis. Nephrology, dialysis, transplantation: official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association 22(7):1882-1890).
Por lo tanto, el anticuerpo anti-gremlin-1 de acuerdo con la presente invención se puede usar para la prevención o el tratamiento de enfermedades inmunitarias.
Ejemplos de enfermedades inmunitarias incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide, esclerosis sistémica progresiva (esclerodermia), lupus eritematoso sistémico, dermatitis atópica, alopecia areata, psoriasis, pénfigo, asma, estomatitis aftosa, tiroiditis crónica, anemia aplásica autoinmunitaria, cirrosis primaria, colitis ulcerosa, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, silicosis, asbestosis, nefropatía IgA, glomerulonefritis postestreptocócica (PSGN), síndrome de Sjogren, síndrome de Guillain-Barre, dermatomiositis, polimiositis, esclerosis múltiple, anemia hemolítica autoinmunitaria, encefalomielitis autoinmunitaria, miastenia grave, enfermedad de Grave, poliarteritis nodosa, espondilitis anquilosante, síndrome de fibromialgia y arteritis temporal.
En el presente documento se describe adicionalmente un kit para diagnosticar cáncer o enfermedad inmunitaria, que comprende el anticuerpo de la presente invención. El kit puede comprender, además del anticuerpo de la presente invención, reactivos convencionales para tinción inmunohistoquímica. Los componentes que pueden incluirse adicionalmente en el kit incluyen, pero sin limitación, reactivo FITC, una solución de recuperación de antígeno, un anticuerpo control, un polímero conjugado con HRP, una solución DAB (3-3'-diaminobezidina tetracloruro), una solución de hematoxilina de Mayer, etc. Cuando se usa el kit, se tratan un tejido normal y un tejido para diagnóstico con el anticuerpo marcado de acuerdo con la presente invención, se tiñen y se observan con un microscopio, y se puede diagnosticar el tejido que interactuó con el anticuerpo de acuerdo con la presente invención como un tejido afectado por cáncer o enfermedad inmunitaria.
A continuación, se describirá la presente invención en detalle con referencia a ejemplos. Debe entenderse, sin embargo, que estos ejemplos son únicamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención.
Ejemplo 1: Expresión y purificación de gremlin-1
1-1: Cultivo de células
Las células A549, HeLa, A172 y A431 se obtuvieron del Korean Cell Line Bank (Seúl, República de Corea), y las células endoteliales de la vena umbilical humanas (HUVEC) se obtuvieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Mientras tanto, se cultivaron células A549, A172 y A431 en medio Rp M i-1640 (Welgene) suplementado con FBS al 10 %, y se cultivaron células HeLa en medio MEM (Welgene) suplementado con FBS al 10%, y se cultivaron HUVEC en medio de crecimiento de células endoteliales 2 (EGM-2, Lonza, Walkersville, MD).
1-2: Preparación del vector de expresión de gremlin-1 y transfección celular
El ADNc de gremlin se amplificó a partir de una biblioteca de ADNc de tejido cervical humano como se describe en Namkoong H y col., (2006) BMC Cancer 6: 74. A continuación, los sitios de enzimas de restricción MMM y XhoI se introdujeron en los extremos 5 'y 3' del ADNc de gremlin mediante PCR utilizando los siguientes cebadores de PCR:
5'-CCC AAG CTT ATG AGC CGC ACA GCC TAC AC-3' (SEQ ID NO: 29);
5'-CCG CTC GAG ATC CAA ATC GAT GGA TAT GC-3' (SEQ ID NO: 30).
El producto de PCR se digirió con MMM y XhoI, y se unió, a continuación al vector pcDNA3.1/myc-His (Invitrogen), preparando, de este modo, un vector de expresión de gremlin-1.
1 día antes de la transfección, las células A549 (5,0x105 células) se colocaron en placas para lograr una confluencia del 70%. A continuación, el vector de expresión de gremlin-1 preparado se transfectó en las células A549 utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron utilizando 1,0 mg/ml de antibiótico G418 (Invitrogen). La línea celular seleccionada se denominó "línea celular gremlin-1-A549".
Mientras tanto, las células A549 se transfectaron con un vector pcDNA3.1/myc-His, que no contiene gremlin-1, del mismo modo descrito anteriormente, obteniendo, de este modo, una línea celular A549 simulada.
1-3: Expresión y purificación de gremlin-1
Se construyó un gen que codifica la proteína de fusión gremlin-1 humana e IgG1-Fc humana usando una PCR solapante como se describe en Park S y col., (2010) Clin Chim Acta 411: 1238-1242. Las secuencias del cebador de enlace para gremlin-1 e IgG-Fc, utilizadas en la PCR, son las siguientes:
(1) Gremlin-1
D: 5'-GGC CCC ACC GGC CCC ATC CAA ATC GAT-3' (SEQ ID NO: 31);
I: 5'-GGG GCC GGT GGG GCC TCG GGT GGC GGT GGC-3' (SEQ ID NO: 32);
(2) IgG-Fc
D: 5'-AAG CTT GTG GCC CAG GCG GCC ATG AGC CGC ACA GCC TAC-3' (SEQ ID NO: 33);
I: 5'-GGA TCC TCA TTT TGG CGG GGA CAG GGA GAG-3' (SEQ ID NO: 34).
Los productos de PCR se digirieron con HindIII y BamHI, y se clonaron en un vector de expresión pCEP4 (Invitrogen), construyendo, de este modo, un vector que expresa la proteína de fusión gremlin-1-Fc.
Mientras tanto, se cultivaron células HEK293F (Invitrogen) en medio de expresión GIBCO FreeStyle ™ 293 (Invitrogen) a una densidad celular entre 0,1 x106 y 2,0x106 células/ml, y se cultivaron, a continuación, en matraces de cultivo de tejidos Erlenmeyer desechables con tapas ventiladas (Corning Inc.) a 135 rpm en una incubadora de agitación orbital (37, 37 ° C, 8 % de CO2, Minitron, INFORSHT, Suiza). Un día antes de la transfección, se diluyeron los cultivos celulares con medios nuevos para lograr una densidad de 1,0x106 células/ml, lo que d'o como resultado una densidad de 2,0x106 células/ml el día de la transfección. A continuación, las células HEK293F se transfectaron con el vector de expresión de la proteína de fusión gremlin-1/IgG-Fc humana utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células transfectadas se cultivaron de nuevo en la incubadora de agitación orbital y los sobrenadantes de cultivo se recogieron 3 días después de la transfección. A continuación, la proteína de fusión gremlin-1-Fc se purificó utilizando cromatografía en gel de afinidad con proteína A como se describe en Park S y col., (2010) Clin Chim Acta 411: 1238­ 1242.
Ejemplo 2: Generación de anticuerpo anti-gremlin-1
2-1: Inmunización
Se mezclaron 5 |jg de gremlin-1-Fc con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, y la mezcla se emulsionó en un adyuvante de emulsión de aceite en agua (Sigma, St. Louis, Mo) que contiene endotoxina destoxificada MPL (especies de lípidos A monofosforilados) y componentes de la pared celular micobacteriana (TDW y CWS) en escualeno al 2%, y, a continuación, se inyectaron en conejos blancos de Nueva Zelanda. La inmunización se realizó tres veces a intervalos de 3 semanas. El título de anticuerpos de los conejos inmunizados se determinó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando anticuerpo policlonal IgG anti-conejo de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).
El ARN total se obtuvo a partir del bazo y la médula ósea de los conejos inmunizados utilizando el reactivo TRI (Invitrogen). El bazo y la médula ósea extraídos se homogeneizaron en reactivo TRI utilizando un homogeneizador a una salida del 50% durante 1 minuto y se incubaron a temperatura ambiente durante 5 minutos. Las muestras homogeneizadas se centrifugaron a 2.500 g a 4oC durante 10 minutos. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos de centrifugación de 50 ml y se agregaron 3 ml de 1-bromo-3-cloro-propano (BCP, Sigma) a cada uno de los sobrenadantes. A continuación, cada una de las mezclas se agitó en vórtex durante 15 segundos y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se centrifugó a 17.000 g a 4 °C durante 15 minutos, y la capa acuosa superior incolora se transfirió a un tubo nuevo de 50 ml. A continuación, se añadieron 15 ml de isopropanol a la capa acuosa y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de centrifugar a 17.500 g a 4 °C durante 15 minutos, se retiró cuidadosamente el sobrenadante y se lavó el sedimento con 30 ml de etanol al 75% sin resuspenderse. El sedimento se centrifugó de nuevo durante 10 minutos y el sobrenadante se eliminó, después de lo cual el sedimento se secó al aire a temperatura ambiente. A continuación, el sedimento se disolvió en agua libre de RNasa y se almacenó a -80 °C. Se midió la densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar la concentración de ARN (40 ng/jl de ARN produce DO260 = 1), y se calculó la pureza mediante la relación DO260/DO280 (generalmente variando de 1,6 a 1,9).
2-2: Síntesis de ADNc de la primera cadena a partir de ARN total
El ADNc de la primera cadena se sintetizó utilizando el sistema Superscript ™ III (Invitrogen) para el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena con cebado con oligo (dT). Se mezclaron 5 jg del ARN total aislado con 1 j l de 0,5 jg / j l de oligo (dT), 1 j l de dNTP 10 mM y agua tratada con dietilpirocarbonato (DEPC) para obtener un volumen final de 10 jl. La mezcla se incubó a 65 °C durante 5 minutos y se enfrió en hielo. A la muestra de ARN, se agregaron 2 j l de tampón de reacción 10x, 4 j l de MgCh 25 mM, 2 j l de ditiotreitol 100 mM (DTT), 1 j l de RNasa OUT (inhibidor de la ribonucleasa) y 1 j l de transcriptasa inversa Superscript III, y se incubó la mezcla a 50 °C durante 50 minutos. Después de incubar a 85 °C durante 5 minutos, la mezcla de reacción se enfrió en hielo para detener la reacción. A continuación, se le añadieron, a la misma, 1 j l de RNasa H, seguido de incubación a 37 °C durante 20 minutos. El ADNc de la primera cadena se almacenó a -20 °C.
2-3: PCR Primaria
El ADNc de la primera cadena obtenido del bazo y la médula ósea de los conejos se sometió a PCR durante 30 ciclos utilizando el sistema de PCR Expand High Fidelity (Roche Molecular Systems, IN, EE.UU). En la PCR, también se usó una combinación de 10 cebadores para la amplificación de una secuencia codificante de conejo Vl (9xVky 1xVa) y una combinación de 4 cebadores para la amplificación de una secuencia codificante de conejo Vh (Tabla 1). En cada reacción, se mezclaron 1 j l de ADNc con 60 pmol de cada cebador, 10 j l de tampón de reacción 10x, 8 j l de dNTP de 2,5 mm (Promega, Madison, WI), 0,5 j l de ADN polimerasa Taq y agua para obtener un volumen final de 100 jl. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 30 ciclos, consistiendo cada uno en 94 °C durante 15 segundos, 56 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 90 segundos, y la extensión final, a continuación, a 72 °C durante 10 minutos. Los fragmentos que tenían una longitud de aproximadamente 350 pb se cargaron y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, y se purificaron, a continuación, utilizando el kit de extracción en gel QIAEX II (QIAGEN, Valencia, CA). Los productos de la PCR purificados se cuantificaron a una DO de 260 nm (1 unidad de OD = 50 jg/ml).
2-4: PCR secundaria
En la PCR secundaria, los productos de Vl primarios se unieron aleatoriamente con los productos de Vh primarios mediante PCR de extensión por solapamiento (Tabla 2). Para un fragmento enlazador de cadena sencilla largo, se realizaron al menos 10 reacciones. En cada reacción, se mezclaron 100 ng del producto de cadena ligera o producto de cadena pesada purificado con 60 pmol de cada cebador, 10 j l de tampón de reacción 10x, 8 j l de dNTP 2,5 mM (Promega), 0,5 |jl de ADN polimerasa Taq y agua para obtener un volumen final de 100 jl. La PCR se realizó en las siguientes condiciones: 20 ciclos, consistiendo cada uno en 94 °C durante 15 segundos, 56 °C durante 30 s y 72 °C durante 2 min, seguido de una extensión final a 72 °C durante 10 min. Se cargaron aproximadamente fragmentos de 700 pb y se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, y se purificaron, a continuación, utilizando el kit de extracción en gel QIAEX II (QIAGEN, Valencia, CA). Los productos de la PCR purificados se cuantificaron a una DO de 260 nm (1 unidad de OD = 50 jg/ml).
2-5: Tratamiento del producto de extensión por solapamiento purificado y del vector de ADN con enzima de restricción
Se trataron el producto de PCR y el vector pComb3x (The Scripps Research Institute) con una enzima de restricción SfiI para la clonación. Se mezclaron 10 jg del producto de PCR por solapamiento purificado con 360 unidades de SfiI (16 unidades por jg de ADN, Roche Molecular Systems), 20 j l de tampón de reacción M 10x y agua para obtener un volumen final de 200 jl. Se mezclaron 20 jg del vector pComb3x con 120 unidades de Sfil (6 unidades por jg de ADN, Roche Molecular Systems), 20 j l de tampón de reacción M 10x y agua para obtener un volumen final de 200 jl. Las mezclas se incubaron a 50 °C durante 5 horas. Los insertos digeridos que tienen una longitud de aproximadamente 700 pb se purificaron en gel de agarosa al 1%, y se purificaron aproximadamente 3.400 pb de ADN del vector y el fragmento de aproximadamente 1.600 pb contenidos en el vector pComb3x en gel de agarosa al 0,6%.
2-6: Unión del producto de PCR por solapamiento tratado con el ADN del vector tratado
Con el fin de evaluar la idoneidad del vector y el inserto para la unión y transformación de alta eficacia, se realizó una unión a pequeña escala. Se evaluó una reacción de unión que contenía el ADN del vector tratado con Sfil solo para la unión de fondo con un tamaño de biblioteca inferior al 5%. Para la unión, se mezclaron 140 ng del ADN del vector tratado con SfiI y purificado, 70 ng del producto de PCR purificado y tratado con Sfil o ADN de relleno, 4 j l de tampón de ligasa 5x, 1 j l de ligasa T4 (Invitrogen) y agua para obtener un volumen total de 20 jl. Se incubó la mezcla para la unión a temperatura ambiente durante 4 horas. Se transformó 1 j l del producto unido en 50 j l de células electrocompetentes ER2738 (NEB) por electroporación 2,5 kV, 25 j l y 200 u> utilizando una cubeta de 0,2 cm y un generador de pulsos genéticos (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las células se resuspendieron en 3 ml de medio SB y se incubaron a 37 ° C durante 1 hora con agitación a 225-250 rpm. Se sembraron 1 jl, 10 j l y 100 j l de los transformantes en placas de carbenicilina LB para determinar el número total de transformantes. Idealmente, el tamaño de la biblioteca final debe ser de al menos 108 unidades formadoras de colonias (ufc) por jg del vector de ADN y debe tener menos de 5% de unión de fondo.
2-7: Construcción de E. coli electrocompetente
La cepa de E. coli ER2738 se cultivó en un tubo de polipropileno de 50 ml que contenía 15 ml de SB y se cultivó durante la noche a 37 °C con agitación a 250 rpm. Al día siguiente, se diluyeron 2,5 ml del cultivo en un matraz de 2 l que contenía 500 ml de SB, 10 ml de glucosa al 20% (p/v) y 5 ml de MgCh 1 M, y se agitó a 250 rpm a 37 °C hasta que la DO 600 nm alcanzó 0,8-0,9. A continuación, El cultivo se colocó en una botella de centrifugación de 500 ml previamente enfriada y se centrifugó a 3.000 g a 4 °C durante 20 minutos. El sobrenadante se eliminó y el sedimento se resuspendió en 30 ml de glicerol al 10% (v/v) previamente enfriado. El sedimento resuspendido se centrifugó, se lavó tres veces con glicerol, se resuspendió en 5 ml de glicerol al 10% y se almacenó a -80 °C.
2-8: Preparación de fagos auxiliares
Se sembraron 10 j l de la suspensión ER2738 preparada en el Ejemplo 2-7 en 10 ml de medio SB y se agitó a 250 rpm a 37°C durante 1 hora. La única placa de fago auxiliar obtenida de la placa recién preparada se transfirió al cultivo utilizando una punta de pipeta. Se transfirieron 10 ml del cultivo infectado a un matraz Erlenmeyer de 2 l que contenía 500 ml de medio SB precalentado (37 °C) que contenía kanamicina y se ajustó a una concentración final de 70 jg/ml, y se agitó, a continuación, a 250 rpm durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, se centrifugó el cultivo a 2.500 g durante 15 minutos y el sobrenadante se incubó en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. Después de centrifugar a 2.500 g durante 15 minutos, el sobrenadante se transfirió a un tubo de polipropileno nuevo de 50 ml y se almacenó a 4 °C.
2-9: Unión y transformación de la biblioteca
La unión de la biblioteca se realizó utilizando 1,4 jg de pComb3x digerido con SffI, 700 ng del producto de PCR digerido con SfiI obtenido en el Ejemplo 2-5, 40 j l de tampón ligasa 5x, 10 j l de ADN ligasa T4 y agua (obteniendo un volumen final de 200 jl). La mezcla para la unión se incubó durante la noche a temperatura ambiente y se dejó precipitar, a continuación, con etanol durante la noche a -80 °C.Después de la centrifugación en una microcentrífuga a la velocidad máxima durante 15 minutos a 4 ° C, se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó con 1 ml de etanol al 70% (v/v) y se secó. El sedimento se disolvió en 15 j de agua. La muestra de la biblioteca unida se transformó en 300 j l de células E. coli electrocompetentes, que se cultivaron, a continuación, en 5 ml de medio SB a 37 °C durante 1 hora. Se añadieron 100 ml de medio SB precalentado y 3 j l de carbenicilina 100 mg/ml al cultivo. Se sembraron 0,1 jl, 1 j l y 10 j l del cultivo en medio LB que contenía 50 jg/m l de carbenicilina para determinar el tamaño de la biblioteca. El cultivo se agitó a 250 rpm durante 1 hora. Se añadieron 4,5 j l de carbenicilina 100 mg/ml al cultivo, que se cultivó, a continuación, durante 1 hora. Al cultivo, se agregaron 2 ml de fago auxiliar VCSM13, 183 ml de SB precalentado y 92,5 j l de carbenicilina 100 mg/ml, y la mezcla se agitó a 300 rpm y 37 °C durante 2 horas. Se añadieron 280 pl de kanamicina 50 mg/ml al cultivo, que se agitó, a continuación, durante la noche a 300 rpm y 37 °C.Al día siguiente, el cultivo se centrifugó a 3.000 g a 4 °C durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a una botella de centrifugación de 500 ml y, a continuación, se agregaron 8 g de polietilenglicol (PEG) -8000 y 6 g de NaCl a la misma. Después del almacenamiento en hielo durante 30 minutos, el sobrenadante se centrifugó a 15.000 g y 4 °C durante 15 minutos. El sobrenadante se eliminó y el sedimento de fagos se resuspendió en solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía BSA al 1%.
2-10: Panning de la biblioteca en antígeno inmovilizado
El biopanning se realizó con perlas paramagnéticas (Dynal Biotech, Lake Success, NY). Se unieron 3 |jg de gremlin-1 a 1x107 perlas a temperatura ambiente durante 20 horas. Las perlas se lavaron cuatro veces con PBS y se incubaron con tampón de bloqueo a temperatura ambiente durante 1 hora. Las perlas unidas a gremlin-1 se incubaron con los fagos que presentan scFv, obtenidos en el Ejemplo 2-9, a temperatura ambiente durante 2 horas. Las etapas de lavado aumentaron de tres veces en la primera ronda a 10 veces en la cuarta ronda. Los fagos unidos se eluyeron con 50 j l de glicina/HCl 0,1 M (pH 2,2) y se neutralizaron con 3 j l de Tris-HCl 2M (pH 9,1). La cepa ER2738 se infectó con este sobrenadante que contenía fagos, y los fagémidos se rescataron con el fago auxiliar VCSM13 para la amplificación durante la noche. Al día siguiente, como se describe en el Ejemplo 2-9, se añadieron PEG-8000 y NaCl para preparar fagos. Además, el cultivo infectado con los fagos se sembró en una placa LB que contenía carbenicilina 50 jg/m l para determinar los títulos de fagos de entrada y salida.
2-11: Selección de clones mediante ELISA de fagos
Con el fin de confirmar la unión de scFv de clones individuales seleccionados para un análisis adicional, se realizó un ELISA para gremlin-1 recombinante purificada utilizando fagos que presentan scFv. Se bloqueó una placa de microtitulación recubierta con gremlin-1 con BSA al 3% en PBS a 37 °C durante 1 hora. A continuación, el sobrenadante del fago se mezcló con BSA al 6% en PBS de la misma manera, y se incubó a 37 °C durante 1 hora. Después de lavar con PBST al 0,05 %, la placa se incubó con anticuerpo anti-M13 conjugado con HRP (dilución 1: 5000, Pierce Chemical Co.). Para la reacción de color, se utilizó la solución de sustrato 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico, ABTS) (Amresco, Solon, OH).
Los fragmentos scFv se convirtieron en IgG de longitud completa y se sobreexpresaron. La especificidad del anticuerpo (O-13) de la presente invención se determinó usando análisis de transferencia Western. Para determinar la especificidad del anticuerpo (O-13) de la presente invención, se aisló el sobrenadante de cultivo de las células HEK293F transfectadas con pcDNA3.1/myc-His-gremlin-1 mediante SDS-PAGE. Las transferencias se incubaron con 100 ng/ml del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención durante la noche a 4°C, y se incubaron, a continuación, con IgG anti-humana conjugada con HRP (específica de Fc, dilución 1: 1000; Pierce Chemical Co.) a temperatura ambiente durante 1 hora. Las transferencias se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gel se visualizó utilizando azul brillante de Coomassie G-250 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los 7 anticuerpos obtenidos a través de los procedimientos descritos anteriormente se denominaron anticuerpos R-80, R-88, O-1, O-13, O-26, J-1, y O-13 (humanizado), respectivamente, y se analizaron las secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos de los mismos.
Los resultados del análisis de secuencia indicaron que el anticuerpo R-80 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; el anticuerpo R-88 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; el anticuerpo O-1 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; el anticuerpo O-13 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; el anticuerpo O-26 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; el anticuerpo J-1 comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; el anticuerpo O-13 (humanizado) comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
Los resultados de los experimentos preliminares indicaron que el anticuerpo O-13 tuvo el mejor efecto entre los anticuerpos anteriores. Por lo tanto, se utilizó el anticuerpo O-13 en experimentos posteriores.
Ejemplo 3: Análisis de la interacción de gremlin-1 con células cancerosas
Para examinar si gremlin-1 interactúa directamente con células cancerosas, se incubó gremlin-1 con cuatro tipos de células cancerosas (A549, HeLa, A172 y A431) y se analizó, a continuación, mediante citometría de flujo.
De manera específica, las células adherentes se tripsinizaron y se lavaron con BSA al 1% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células en suspensión se recogieron por centrifugación a 500 xg durante 2 min y se lavaron con BSA al 1% (p/v) en PBS. Todas las células se incubaron con gremlin-1 etiquetada con His (R&D Systems, Minneapolis, MN) a una concentración final de 100 nM en BSA al 1% (p/v) en PBS a 37 °C durante 1 hora. Las células se lavaron, a continuación, dos veces con BSA al 1% (p/v) en PBS y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C en la oscuridad con un anticuerpo His conjugado con FITC (Abcam, Cambridge, Reino Unido) a una concentración final de 5 mg./ml. A continuación, las células se lavaron dos veces con BSA al 1% (p/v) en PBS y se resuspendieron en 500 pl de PBS antes del análisis en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences, San José, CA).
Mientras tanto, para determinar la eficacia neutralizante del anticuerpo anti-gremlin-1 (O-13), las células se incubaron con 100 nM de gremlin-1 etiquetada con His y 10 pM del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención en 1 % (p/v) de BSA en PBS durante 1 hora a 37 °C, y se sondaron con un anticuerpo de His conjugado con FITC (Abcam).
Se trató a células A549 con 1 pM de BMP-2, BMP-4, o BMP-7 (R&D Systems, Minneapolis, MN) y 100 nM de gremlin-1-Fc simultáneamente y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Las células se sondaron con un anticuerpo específico IgG-Fc conjugado con FlTC (5 pg/m \, Invitrogen). Las células se analizaron, a continuación, en un citómetro de flujo FACSCanto II.
Los resultados del experimento se muestran en la FIG. 1. Como se puede observar en la FIG. 1, gremlin-1 interactuó directamente con las células cancerosas, y esta interacción fue inhibida por el anticuerpo anti-gremlin-1.
Ejemplo 4: Efecto de VEGFR2 en la interacción de gremlin-1 con células cancerosas
Para examinar si la interacción de gremlin-1 con líneas celulares está mediada por VEGFR2 conocida como el único receptor de superficie celular de gremlin-1, se realizó el siguiente experimento.
4-1: Citometría de flujo
Se analizó si gremlin-1 se une a HUVEC mediante citometría de flujo de la misma manera como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados del análisis se muestran en la FIG. 2A. Como se puede ver en la misma, gremlin-1 no se unió a HUVEC. Debido a que HUVEC expresa VEGFR2, el hecho de que gremlin-1 no se una a HUVEC sugiere que gremlin-1 se une a las células cancerosas de manera independiente de VEGFR2.
4-2: RT-PCR
La expresión del ARNm y la proteína de VEGFR2 en células A549, células HeLa y células HUVEC se midió mediante RT-PCR y análisis de inmunotransferencia.
De manera específica, para la RT-PCR, se aisló el ARN total de las células A549, células HeLa y células HUVEC utilizando el reactivo TRizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, el ADNc se sintetizó a partir del ARN utilizando el sistema de síntesis Superscript® III First-Strand (Invitrogen). Usando los siguientes cebadores, se realizó la RT-PCR en el Termociclador 2720 (Applied Biosystems, Foster City, CA). La RT-PCR se realizó durante 35 ciclos, consistiendo cada uno en 94 °C durante 30 segundos, 56 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 min.
(1) VEGFR-2
D: 5'-TGATCGGAAATGACACTGGA-3' (SEQ ID NO: 35);
I: 5'-TGCTTCACAGAAGACCATGC-3' (SEQ ID NO: 36)
(2) Gremlin-1
D: 5'-AACAGTCGCACCATCATCAA-3' (SEQ ID NO: 37);
I: 5'-AATTTCTTGGGCTTGCAGAA-3' (SEQ ID NO: 38);
(3) GAPDH
D: 5'-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3' (SEQ ID NO: 39);
I: 5'-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3' (SEQ ID NO: 40).
Los resultados de la RT-PCR se muestran en la FIG. 2B. Como puede observarse en la FIG. 2B, VEGFR2 estaba presente en las células HUVEC, pero no se detectó VEGFR2 en células A549 y HeLa. Aunque gremlin-1 interactuó con células cancerosas en el Ejemplo 3, el hecho de que no se detectara el ARNm de VEGFR2 indica que la interacción entre gremlin-1 y las células cancerosas no está mediada por VEGFR2.
4-3: Análisis de inmunotransferencia
Se lisaron células HUVEC, A549 y células HeLa en tampón de lisis enfriado con hielo [Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Triton-X 100 al 1%, 0,1 % de SDS, PMSF 1 mM] que contiene un cóctel de inhibidor de proteasa, y, a continuación, se realizaron transferencias Western de acuerdo con el procedimiento descrito en Lee Ms y col., (2008) Hybridoma (Larchmt) 27: 18-24. En el presente documento, se utilizaron VEGFR-2 (dilución 1:1.000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) y p-actina (dilución 1:10.000; Applied Biological Materials, Richmond, BC) como los anticuerpos primarios, y se usó IgG anti ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1: 1.000; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) o IgG anti conejo conjugada con HRP (dilución 1:1.000; Pierce Chemical Co.) como anticuerpo secundario. Las transferencias se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados del análisis de inmunotransferencia, se muestran en la FIG. 2C. Como puede observarse en la FIG.
2C, Las células A549 y HeLa no expresaron VEGFR2, a diferencia de HUVEC. Tales resultados también muestran que la interacción entre gremlin-1 y las células cancerosas no está mediada por VEGFR2.
Ejemplo 5: Efecto de BMP en la interacción de gremlin-1 con células cancerosas
Gremlin-1 es un antagonista de BMP que se une específicamente a BMP-2, BMP-4 y BMP-7 para inhibir sus actividades. Las BMP son factores de crecimiento multifuncionales que desempeñan un papel importante en la formación y en la homeostasis de muchos tejidos. Asimismo, BMP-2, BMP-4 y BMP-7 están frecuentemente sobreexpresados en varios cánceres, incluyendo cáncer de mama y cáncer de próstata (Singh A y col., (2010) Cytokine Growth Factor Rev 21: 299-313; Chen D y col., (2004) Growth Factors 22: 233-241; Bobinac D y col., (2005) Croat Med J 46: 389-396). Se informó que BMP-4 reduce la proliferación de células BCC y que la adición de gremlin-1 reduce indirectamente el efecto antiproliferativo de BMP-4 (Sneddon JB y col., (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103: 14842 -14847). Por lo tanto, se examinó si BMP afecta la interacción de gremlin-1 con células cancerosas.
5-1: Inmunoensayo enzimático
Para examinar si gremlin-1 se une a BMP, se realizó un inmunoensayo enzimático de la siguiente manera. De manera específica, las placas de microtitulación (Corning Costar Corp., Cambridge, MA) se recubrieron con 100 nM de BMP-2, BMP-4 o b MP-7 (R&D Systems) y se bloquearon con leche desnatada al 1% (p/v) en PBS. A continuación, se agregaron a cada pocillo Gremlin-1-Fc (10 nM) solo o Gremlin-1-Fc (10 nM) más 500 nM del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención. Después del lavado, las placas se incubaron con un anticuerpo específico de IgG-Fc conjugado con HRP (dilución 1: 5.000; Pierce Chemical Co.). A continuación, se utilizó la solución de sustrato 2,2'-azino-bis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico, ABTS) (Amresco, Solon, OH) para la reacción de coloración como se describe en Chung J y col., (2004) FASEB J 18: 361-363, y se midió la absorbancia a 405 nm. Los resultados la medición se muestran en la FIG. 3A. Como puede observarse en la FIG. 3A, gremlin-1 interactuó con BMP-2 y BMP-4, excluyendo BMP-7, y el anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención no afectó a la interacción de gremlin-1 con BMP-2 o BMP-4.
5- 2: Citometría de flujo
Las células A549 se trataron con gremlin-1, y se agregaron, a las mismas, BMP-2, BMP-4 y BMP-7 en un exceso 10 veces molar, seguido de citometría de flujo de la misma manera que se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la FIG. 3B. Como puede observarse en la FIG. 3B, la presencia de BMP no afectó la interacción de gremlin-1 con células A549. Estos resultados indican que hay dos motivos separados en gremlin-1 que median su interacción con las células A549 y BMP.
Ejemplo 6: Análisis de los efectos de gremlin-1 y su anticuerpo en la dispersión y migración de células cancerosas
6- 1: Ensayo de dispersión celular
Para examinar la morfología de las células cancerosas tratadas con gremlin-1, se analizaron las células A549 mediante un ensayo de tinción con cristal violeta. De manera específica, las células A549 se sembraron en placas de 24 pocillos (1,0 x 104 células/pocillo) y se trataron con 100 nM de gremlin-1 etiquetada con His durante 3 días. El medio se eliminó y las células se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min. Las células se tiñeron con cristal violeta al 0,05% en agua destilada durante 30 minutos. La solución de tinción se eliminó y las células se lavaron 3 veces con PBS de acuerdo con el procedimiento descrito en Li XL y col., (2009) Cancer Chemother Pharmacol 64: 1097-1104. Las imágenes se obtuvieron utilizando una cámara Leica DFL290 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania) y se analizaron con el software de la suite de aplicaciones Leica (Leica Microsystems).
Las imágenes obtenidas se muestran en la FIG. 4A. Como puede observarse en la FIG. 4A, la morfología de las células A549 tratadas con gremlin-1 fue similar a la de los fibroblastos, las células comenzaron a dispersarse.
6-2: Análisis del cambio en la expresión de E-cadherina
La regulación negativa de E-cadherina se asocia con la transición epitelial mesenquimatosa (EMT), y la inhibición de la E-cadherina y la EMT se observa en el desarrollo del cáncer (Perl AK y col., (1998) Nature 392: 190-193). Por lo tanto, el cambio en la expresión de E-cadherina causado por el tratamiento con gremlin-1 se examinó mediante análisis de inmunotransferencia y tinción con inmunofluorescencia.
Para el análisis de inmunotransferencia, se sembraron células A549 (1,0 x 105 células/pocillo) en una placa de 60 mm y se cultivaron hasta un 50% de confluencia. Las células se trataron con 100 nM de gremlin-1 etiquetada con His durante 3 días. Las células se lisaron en un tampón de lisis frío [Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Triton-X 100 al 1%, 0,1 % de SDS, PMSF 1 mM] que contiene un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), y se analizaron mediante transferencia Western de acuerdo con el procedimiento descrito en Lee MS y col., (2008) Hybridoma (Larchmt) 27: 18-24. En el presente documento, los anticuerpos E-cadherina (dilución 1: 1.000; Abcam) y p-actina (dilución 1: 10.000; Applied Biological Materials, Richmond, BC) se utilizaron como los anticuerpos primarios, y la IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (dilución 1: 1.000; Pierce Chemical Co., Rockford, IL) o IgG anti conejo conjugada con HRP (1:1.000 dilution; Pierce Chemical Co.) como anticuerpo secundario. Las transferencias se visualizaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia mejorado (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los resultados se muestran en la FIG. 4B. Como puede observarse en la FIG. 4B, la expresión de E-cadherina en células A549 tratadas con gremlin-1 disminuyó significativamente.
Para la tinción con inmunofluorescencia, se sembraron células A549 (1,0 x 105 células/pocillo) en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-L-lisina (100 pg/ml, Sigma) y se cultivaron hasta un 50 % de confluencia. Las células se trataron con 100 nM de gremlin-1 etiquetada con His durante 3 días, se enjuagaron en PBS y se fijaron en paraformaldehído al 4% en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se permeabilizaron con 0,2% de Triton X-100 en PBS (PBST) a temperatura ambiente durante 10 min, y se bloquearon, a continuación, con 1% de gelatina en PBST durante 30 min a temperatura ambiente. La tinción inmunofluorescente se realizó utilizando un anticuerpo E-cadherina (Abcam) seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Alexa 488 (Invitrogen). Los núcleos se tiñeron con DAPI (dilución 1: 1.000; Invitrogen), y los filamentos de actina se tiñeron usando rodamina-faloidina (dilución 1: 1.000; Invitrogen). Los cubreobjetos se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje acuoso con agentes anti-desvanecimiento (Biomeda Corp., Foster City, CA). A continuación, se consiguieron las imágenes utilizando un microscopio de Escaneo Láser LSM 5 PASCAL (Carl Zeiss, Alemania) y se analizaron utilizando el software LSM 5 PASCAL.
Los resultados se muestran en la FIG. 4C. Como puede observarse en la FIG. 4C, la expresión de E-cadherina en células A549 tratadas con gremlin-1 disminuyó significativamente.
6- 3: Ensayo de migración celular
Para examinar si las células migran, se realizó un ensayo de migración celular de la siguiente manera. De manera específica, las células se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 1,0 x105 células por pocillo. Se generó una lesión por rasguño al rascar con una punta de pipeta. Después de enjuagar con medio para eliminar las células desprendidas, se añadieron 100 nM de gremlin-1 etiquetada con His a los cultivos durante 24 horas. Se tomaron imágenes de cada pocillo inmediatamente y nuevamente después de 24 horas usando una cámara Leica DFL290 (Leica Microsystems). La distancia que las células migraron a través del área creada al rascar se determinó midiendo el ancho de la lesión a las 24 horas y restándola del ancho de la lesión al comienzo. Los valores obtenidos se expresaron, a continuación, como % de migración, estableciendo la distancia de migración de las células sin tratar como 100%.
Para determinar la eficacia neutralizante del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención, las células raspadas se incubaron durante 24 horas con gremlin-1 etiquetada con His sola o con más 10 pM de anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención ( o 10 pM de anticuerpo control). La distancia se determinó como se describe anteriormente.
Usando el mismo protocolo, las células A549 transfectadas de forma simulada y las células A549 transfectadas con gremlin-1 se sembraron y se rasparon. Las células A549 simuladas se cultivaron sin ningún tratamiento, mientras que las células gremlin-1-A549 se cultivaron durante 24 horas en presencia de anticuerpo 10 pM (O-13) de acuerdo con la presente invención o de anticuerpo control. La distancia se determinó como se describe anteriormente. Los resultados fueron representativos de tres experimentos independientes.
Los resultados la medición se muestran en la FIG. 4D. Como puede observarse en la FIG. 4D, el tratamiento con gremlin-1 aumentó significativamente la migración de las células A549, y este efecto se eliminó completamente al agregar el anticuerpo neutralizante.
Estos resultados indican que gremlin-1 induce la dispersión y migración de las células cancerosas y que esta dispersión y migración pueden inhibirse utilizando el anticuerpo anti-gremlin-1.
Ejemplo 7: Caracterización de células A6549 transfectadas con gremlin-1
7- 1: Medición de los niveles de expresión del ARNm y la proteína de gremlin-1
Para la línea celular gremlin-1 A549 y la línea celular A549 simulada construida en el Ejemplo 1-2, los cambios en los niveles de expresión del ARNm y la proteína de gremlin-1 se analizaron mediante RT-PCR y transferencia Western como se describe anteriormente.
Los resultados del análisis se muestran en la FIG. 5A. Como puede observarse en la FIG. 5A, el ARNm y la proteína de gremlin-1 no se expresaron en la línea celular A549 simulada, mientras que sus niveles de expresión aumentaron significativamente en la línea celular gremlin-1-A549.
7-2: Medición del nivel de expresión de E-cadherina
Además, el nivel de expresión de E-cadherina se midió de acuerdo con el procedimiento de análisis de inmunotransferencia de la siguiente manera. De manera específica, se sembraron células gremlin-1-A549 y células A549 simuladas (1,0 x 105 células/pocillo) en placas de 60 mm y se cultivaron hasta un 50% de confluencia. Las células A549 simuladas se cultivaron sin ningún tratamiento, mientras que las células gremlin-1-A549 se cultivaron durante horas en presencia de anticuerpo 10 pM (O-13) de acuerdo con la presente invención o de anticuerpo control (Palivizumab, Synagis, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) durante 24 horas. Las células se lisaron y se analizaron de acuerdo con el procedimiento de análisis de inmunotransferencia descrito en el Ejemplo 6.
Los resultados del análisis se muestran en la FIG. 5B. Como puede observarse en la FIG. 5B, la expresión de E-cadherina disminuyó en las células gremlin1-A549 en comparación con las células A549 simuladas, y aumentó ligeramente con la adición del anticuerpo neutralizante.
7-3: Ensayo de invasión celular
Los ensayos de invasión celular se realizaron utilizando cámaras internas recubiertas con ECM (Chemicon, Temecula, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células A549 simuladas y las células gremlin-1-A549 (3,0x105 células por pocillo) se suspendieron en 300 pl de medio sin suero. Se añadieron medios completos (500 pl) que contenían un 10% de FBS a los pocillos inferiores de la placa. Las células se incubaron durante 48 horas. Las células no migratorias se quitaron frotando y se lavaron con PBS. Las membranas se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS y se tiñeron con una solución de tinción de cristal violeta (Chemicon). Las imágenes se consiguieron con una cámara Leica DFL290 (Leica Microsystems) y se analizaron con el software de la suite de aplicaciones Leica. Las células migradas se contaron en cuatro campos separados por pocillo. Los valores obtenidos se expresaron, a continuación, como % de invasión, estableciendo los recuentos celulares de células A549 simuladas como 100%.
Los resultados se muestran en la FIG. 5C. Como puede observarse en la FIG. 5C, un mayor número de células gremlin-1-A549 migraron en comparación con las células A549 simuladas.
7-4: Ensayo de migración celular
Se realizó un ensayo de migración celular de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Las células A549 simuladas y las células gremlin-1-A549 se sembraron y se rasparon. Las células A549 simuladas se incubaron sin ningún tratamiento, mientras que las células gremlin-1-A549 se incubaron durante horas en presencia de anticuerpo 10 pM (O-13) de acuerdo con la presente invención o de anticuerpo control durante 24 horas. La distancia se determinó como se describe anteriormente.
Los resultados la medición se muestran en la FIG. 5D. Como puede observarse en la FIG. 5D, las células gremlin-1-A549 mostraron una migración incrementada en comparación con las células A549 simuladas, y esta migración aumentada se inhibió significativamente al agregar el anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención.
7-5: Ensayo de proliferación celular
Para examinar si gremlin-1 afecta al crecimiento celular, se realizó un ensayo de proliferación celular utilizando el ensayo de Proliferación Celular de una Solución Acuosa de CellTiter 96 (Promega, Madison, WI) en medio RPMI-1640 que contiene FBS al 10% en placas de 96 pocillos. De manera específica, se sembraron células A549 simuladas y células gremlin-1-A549 a una densidad de 1.000 células por pocillo. Después de 24 horas, Las células se lavaron dos veces con medio sin suero y se cultivaron en 100 pl de medio completo con o sin 3 pM del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención. La proliferación celular se determinó utilizando el lector de placas Fotométrico Multiskan Ascent (Thermo Labsystems, Franklin, MA) para una placa de 96 pocillos con un filtro de 492 nm. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Los resultados la medición se muestran en la FIG. 5E. Como puede observarse en la FIG. 5E, las células gremlin-1-A549 mostraron una mayor tasa de crecimiento en comparación con las células A549 simuladas, y tasa de crecimiento aumentada se inhibió por la adición del anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención.
7-6: Ensayo de crecimiento tumoral
Para evaluar el efecto de gremlin-1 en la tumorigénesis, se inyectaron subcutáneamente células gremlin-1-A549 o células A549 simuladas en ratones atímicos como se describe a continuación, y se midieron, a continuación, los volúmenes de los tumores.
Todos los experimentos con animales fueron autorizados por el Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio de la Universidad Nacional de Seúl y el Comité de Uso (Número de permiso: SNU-11-0207). Las células Gremlin-1-A549 y células A549 simuladas (1,0x106 células/ratón) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones atímicos hembra de 4 a 6 semanas de edad, (7 ratones en cada grupo de tratamiento). La formación y el tamaño tumoral se evaluaron semanalmente mediante mediciones de calibre de la longitud y el ancho de los tumores. Los volúmenes de los tumores se calcularon usando la siguiente fórmula (Tomayko MM y col., (1989) Cancer Chemother Pharmacol 24: 148-154):
Volumen del tumor = (largo * ancho * alto)/2
Los resultados la medición se muestran en la FIG. 5F. Como se puede ver en la misma, el volumen de los tumores en ratones inyectados con células gremlin-1-A549 aumentó más rápidamente que en aquellos inyectados con células A549 simuladas, con una diferencia de aproximadamente 500 mm3 en el volumen tumoral a las 14 semanas después de la inyección. Este resultado sugiere que la expresión aumentada de gremlin-1 puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis.
Ejemplo 8: Diagnóstico de cáncer utilizando anticuerpo anti-gremlin-1
Los tejidos normales y los tejidos cancerosos (tejidos cancerosos de la piel, mama, ganglio linfático, pulmón, hígado, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, cuello uterino, endometrio y tiroides) se trataron con el anticuerpo (O-13) de acuerdo con la presente invención, y se midieron los niveles de expresión de gremlin-1 en los tejidos mediante tinción inmunohistoquímica.
De manera específica, 0,5 ml del anticuerpo (O-13) (2 mg/ml) de acuerdo con la presente invención se mezclaron con reactivo FITC para marcar el anticuerpo con FITC de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de marcaje de anticuerpos Pierce FITC, 53027). Los portaobjetos de matriz de tejido (Superbiochip BC8) inmovilizados con tejidos normales y tejidos con cáncer se desparafinaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los portaobjetos se colocaron en un frasco de vidrio que contenía una solución de recuperación de antígeno (TE pH 9,0) y se calentaron, a continuación, en una olla a presión durante 30 minutos. Los portaobjetos se sacaron del frasco, se enfriaron a 60 ~ 65 °C, se lavaron con agua destilada, se sumergieron en etanol frío al 95% durante 10 minutos y se lavaron, a continuación, con agua corriente durante 10 minutos. A continuación, los portaobjetos se trataron con el anticuerpo marcado con FITC utilizando el sistema de detección Thermo Ultra-Vision LP (Thermo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo se usó a 1:75, y la IgG de ratón anti-FITC (LS bio) se usó a 1: 200. Posteriormente, los portaobjetos se trataron con un polímero conjugado con HRP (Labvision) durante 15 minutos y se trataron, a continuación, con solución DAB durante 1 minuto. Los portaobjetos se tiñeron de forma opuesta con la solución de hematoxilina de Mayer y luego se observaron con un microscopio del orden de aumentos de 4x, 200x y 400x. En el experimento, se usó anticuerpo IgG kappa como control.
Los resultados de ese experimento se muestran en las figuras 6A a 6I. Como se puede observar en la FIG. 6, el anticuerpo de la presente invención mostró una fuerte reactividad en tejido con cáncer en piel, mama, ganglio linfático, pulmón, hígado, esófago, estómago, colon, recto, riñón, vejiga urinaria, próstata, testículos, cuello uterino, endometrio y tiroides en comparación con los tejidos normales. Esto indica que gremlin-1 está distribuido y sobreexpresado en varios tejidos cancerosos. Por lo tanto, se espera que el cáncer o la enfermedad inmunitaria puedan diagnosticarse utilizando el anticuerpo anti-gremlin-1 de la presente invención.
<110> SNU R&DB FOUNDATION KIM, Hyun Kee
<120> Anticuerpos contra gremlin-1
<130> FPD201303-0018
<150> US 61/611,285
<151> 15/03/2012
<160> 40
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo R-80
<400> 1
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Ser Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Ser 85 90 95
Tyr Gln Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr
100 105 110
<210>2
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo R-80
<400>2
Lys Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Arg Tyr Ala
20 25 30
Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tyr lie Gly
35 40 45
lie lie Asn Pro Asn Thr Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60
Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys lie
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr 85 90 95
Ala Gly Gly Asn Arg Val Phe Lys Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210>3
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo R-88
<400>3
Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Gln Val Asn Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Ser Leu Thr Cys Thr Ala Asp Thr Leu Ser Arg Arg Tyr Ala
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Leu lie Tyr
35 40 45
Arg Asp Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60
Ser Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Ala Gln Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Ser Asp Gly Ser Gly Ser Ser 85 90 95
Tyr Gln Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr
100 105 110
<210>4
<211> 120
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo R-88
<400> 4
Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala
20 25 30
Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly
35 40 45
Leu lie Ser Ser Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly 50 55 60
Arg Phe Thr lie Ser Asn Pro Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys lie
65 70 75 80
Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Tyr 85 90 95
Leu Tyr Glu Ser Asp Gly Tyr Val Asn Ala Leu Asp Leu Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>5
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-1
<400>5
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn
20 25 30
Ser Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Asp Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>6
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-1
<400> 6
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Gly Met Trp Asn Glu Val Ser Ala Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>7
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> 11
<400>7
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn
20 25 30
Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Tyr Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95
Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>8
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo 0-13
<400> 8
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Asp Gly Tyr His Asn Glu lie Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>9
<211> 110
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-26
<400> 9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr lie Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asn
20 25 30
Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
lie Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Ser Gly Leu Arg
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 10
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-26
<400> 10
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala lie Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Gly Leu Glu Asn Glu Thr Ala Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo J-1
<400> 11
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105
<210> 12
<211> 121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo J-1
<400> 12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg lie Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Arg Gly Val Gly Lys Ser Arg His Gln Arg Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-13 (humanizado)
<400> 13
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser
20 25 30
Asn Asp Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu lie Tyr Tyr Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser 85 90 95
Leu Ser Ala Tyr Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys
100 105 110
<210> 14
<211>121
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-13 (humanizado)
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ala lie Ser Tyr Asp Asn Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ser Arg Asp Gly Tyr His Asn Glu lie Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo R-80
<400> 15
gagctcgtgc tgactcagtc gccctcagtg caggtgaact tgggacagac ggtctccctc 60 acatgcactg cagatacact gagcagaagt tatgcttcct ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctgctcat ctacagggat accagtcggc cctcaggggt ccctgaccgg 180 ttctctggct ccagctcagg gaacacggcc accctgacca tcagtggggc ccaggctggg 240 gacgaggctg actactattg tgctacaagc gatggcagtg gcagcagcta tcagtttgtg 300
ttcggcggag ggacccagct gaccgtcaca 330
<210> 16
<211> 348
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo R-80
<400> 16
aagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggattctc cctcagtagg tatgcaatgg gctgggtccg ccaggctcca 120 gggaaggggc tggaatacat cggaatcatt aatcctaata ctggcgcata ctacgcgagc 180 tgggcaaaag gccgattcac catctccaaa acctcgtcga ccacggtgga tctgaaaatc 240 accagtccga caaccgaaga cacggccacc tatttctgcg ccagatatgc tggtggtaat 300 cgggttttta aattgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca 348 <210> 17
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo R-88
<400> 17
gagctcgtgc tgactcagtc gccctcagtg caggtgaact tgggacagac ggtctccctc 60 acatgcactg cagatacact gagcagaagg tatgcttcct ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctgctcat ctacagggat accagtcggc cctcaggggt ccctgaccgc 180 ttctctggct ccagctcagg gaacacggcc accctgacca tcagtggggc ccaggctggg 240 gacgaggctg actactattg tgctacaagc gatggcagtg gcagcagcta tcagtttgtg 300 ttcggcggag ggacccagct gaccgtcaca 330 <210> 18
<211> 360
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo R-88
<400> 18
cagtcggtgg aggagtccgg gggtcgcctg gtcacgcctg ggacacccct gacactcacc 60 tgcacagtct ctggattctc cctcagtagc tatgcaatga gttgggtccg ccaggctcca 120
gggaaggggc tggaatggat cggactcatt agtagtagtg gtagcgcata ctacgcgagc 180 tgggcgaaag gccgattcac catctccaac ccctcgtcga ccacggtgga tctcaaaatc 240 accagtccga caaccgagga cacggccacc tatttctgcg ccagatacct ttacgagagt 300 gatggttatg ttaatgccct tgacttgtgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcctca 360
360 <210> 19
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-1
<400> 19
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaattctg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gatgatagta agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 20
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-1
<400> 20
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atetettatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggt 300 atgtggaatg aggttagtgc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tea 363 <210> 21
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo 0-13
<400> 21
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatgatg tcaactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tatgatagta agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct acttgggatg atagcctgag tgcttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 22
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo 0-13
<400> 22
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atetettatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatggt 300 tatcataatg agattgctcc gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tea 363 <210> 23
<211> 330
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-26
<400> 23
cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaatgatg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctgatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240
tccgaggatg aggctgatta ttactgtgct gcttgggatg atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 24
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-26
<400> 24
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagcg atetettatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaagatggt 300 cttgagaatg agacggctgg gttcgactac tggggccagg gtacactggt caccgtgagc 360 tea 363 <210> 25
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo J-1
<400> 25
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcc ctgtccgcct ccgtgggcga ccgcgtgacc 60 atcacctgca gagcatcaca agatgtaaat acagcagtag catggtacca gcagaagccc 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctactca gcatcatttt tatatteagg cgtgccctcc 180 cgcttctccg gctcccgctc cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240 gaggacttcg ccacctacta ctgccaacaa cattatacaa caccaccaac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa g 321 <210> 26
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo J-1
<400> 26
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgcgcctg 60 tcctgcgccg cctccggttt taatattaaa gatacatata ttcattgggt gcgccaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccaga atttatccaa caaatggtta tacaagatat 180 gcagattcag taaaaggtcg cttcaccatc tccgccgaca cctccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg cgccgaggac accgccgtgt actactgctc ccgcggtgtt 300 ggtaaatctc gtcatcagcg tttcgactac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 360 tcc 363 <210> 27
<211> 333
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena ligera del anticuerpo O-13 (humanizado)
<400> 27
gacatccaga tgacccagtc cccctcctcg ctgagcgcct ccgtgggcga ccgggtgacc 60 atcacctgca gtggctcttc atctaatatt ggcagtaatg atgtcaactg gtatcagcag 120 aagcctggca aggcgcctaa gctgctgatc tactatgata gtaagcggcc aagcggcgtg 180 ccttcccggt tctccggatc ccggtccggc accgacttca ccctgaccat ctcctccctg 240 caacctgagg acttcgccac ctactactgc gctacttggg atgatagcct gagtgcttat 300 gtcttcggcc agggtaccaa ggtggagatc aag 333 <210> 28
<211> 363
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> región variable de la cadena pesada del anticuerpo O-13 (humanizado)
<400> 28
gaggtgcagc tggtggagtc tggcggcgga ctggtgcagc ctggcggaag cttgcggctg 60 tcctgcgccg cctccggatt cacctttagc agttatgata tgagctgggt gcggcaggcc 120 cctggcaagg gcctcgagtg ggtggccgcg atctcttatg ataatggtaa tacatattac 180 gctgattctg taaaaggtcg gttcaccatc tccgccgaca cctccaagaa caccgcctac 240 ctgcagatga actccctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgctc cagagatggt 300 tatcataatg agattgctcc gttcgactac tggggccagg gcacactagt gaccgtgtcc 360 tcc 363 <210> 29
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR
<400> 29
cccaagctta tgagccgcac agcctacac 29
<210> 30
<211> 29
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR
<400> 30
ccgctcgaga tccaaatcga tggatatgc 29
<210>31
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR (Gremlin-1)
<400>31
ggccccaccg gccccatcca aatcgat 27
<210> 32
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR (Gremlin-1)
<400> 32
ggggccggtg gggcctcggg tggcggtggc 30
<210> 33
<211> 39
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR (IgG-Fc)
<400> 33
aagcttgtgg cccaggcggc catgagccgc acagcctac 39
<210> 34
<211> 30
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR (IgG-Fc)
<400> 34
ggatcctcat tttggcgggg acagggagag 30
<210> 35
<211> 20
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR (VEGFR-2) <400> 35
tgatcggaaa tgacactgga 20
<210> 36
<211> 20
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR (VEGFR-2)
<400> 36
tgcttcacag aagaccatgc 20
<210> 37
<211> 20
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR (Gremlin-1)
<400> 37
aacagtcgca ccatcatcaa 20
<210> 38
<211> 20
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR (Gremlin-1)
<400> 38
aatttcttgg gcttgcagaa 20
<210> 39
<211> 21
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador directo para PCR (GAPDH)
<400> 39
aggtgaaggt cggagtcaac g 21
<210> 40
<211> 20
<212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador inverso para PCR (GAPDH)
<400> 40
aggggtcatt gatggcaaca 20

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-gremlin-1 que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
2. El anticuerpo anti-gremlin-1 de la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo se selecciona de anticuerpos quiméricos.
3. El anticuerpo anti-gremlin-1 de la reivindicación 1, caracterizado porque la región constante de la cadena ligera y la región constante de la cadena pesada del anticuerpo son de origen humano o de conejo.
4. El anticuerpo anti-gremlin-1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 precedentes, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la unión directa de gremlin-1 a células cancerosas.
5. El anticuerpo anti-gremlin-1 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 precedentes, caracterizado porque el anticuerpo inhibe la migración celular, la invasión celular y la proliferación celular, siendo dependiente de gremlin-1.
6. Una composición farmacéutica para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 y 5 y un transportador farmacéuticamente aceptable.
7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque el tipo de cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de piel, cáncer de huesos, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de piel, cáncer de esófago y cáncer de cabeza y cuello.
8. El anticuerpo de la reivindicación 1, para su uso en un procedimiento de tratamiento de cáncer.
9. El anticuerpo para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque el tipo de cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de riñón, cáncer de ovarios, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de mama, cáncer de tiroides, cáncer de piel, cáncer de huesos, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de vejiga, cáncer de útero, cáncer de piel, cáncer de esófago y cáncer de cabeza y cuello.
ES13760897T 2012-03-15 2013-03-15 Anticuerpo anti-gremlin-1 Active ES2720617T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261611285P 2012-03-15 2012-03-15
PCT/KR2013/002119 WO2013137686A1 (ko) 2012-03-15 2013-03-15 그렘린-1에 대한 항체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2720617T3 true ES2720617T3 (es) 2019-07-23

Family

ID=49161504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13760897T Active ES2720617T3 (es) 2012-03-15 2013-03-15 Anticuerpo anti-gremlin-1

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9631011B2 (es)
EP (1) EP2826790B1 (es)
JP (1) JP6339063B2 (es)
KR (1) KR102119223B1 (es)
CN (1) CN104321342B (es)
AU (1) AU2013232855B2 (es)
ES (1) ES2720617T3 (es)
TR (1) TR201905395T4 (es)
WO (1) WO2013137686A1 (es)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2898620T3 (es) * 2013-03-14 2022-03-08 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra GREM 1
DE202014007202U1 (de) 2014-09-03 2014-11-24 Lg Electronics Inc. Wäschebehandlungsvorrichtung
CN106399316B (zh) * 2016-08-26 2019-03-01 西安交通大学第一附属医院 用于识别Gremlin-1的核酸适配子及其应用
GB201621635D0 (en) * 2016-12-19 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl Crystal structure
JP7033601B2 (ja) * 2017-01-05 2022-03-10 コリア リサーチ インスティチュート オブ バイオサイエンス アンド バイオテクノロジー 抗コチニンキメラ抗原受容体を発現するナチュラルキラー細胞
GB201802486D0 (en) * 2018-02-15 2018-04-04 Ucb Biopharma Sprl Methods
MX2020013808A (es) * 2018-06-18 2021-05-27 UCB Biopharma SRL Antagonista de gremlina-1 para la prevencion y el tratamiento del cancer.
CN111308074B (zh) * 2019-12-12 2022-11-01 中山大学附属第三医院 检测肝细胞癌诊断标志物及筛查或辅助诊断产品中的应用
AU2021366287A1 (en) * 2020-10-20 2023-04-13 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to Gremlin-1 and uses thereof
KR20230132544A (ko) * 2021-01-18 2023-09-15 쑤저우 트랜스센타 테라퓨틱스 컴퍼니 리미티드 신규한 항-그렘린1 항체
BR112023018204A2 (pt) * 2021-03-11 2023-10-24 Univ Shanghai Jiaotong Método de tratamento de doenças usando antagonistas de gremlin1
GB202205200D0 (en) * 2022-04-08 2022-05-25 Ucb Biopharma Sprl Combination with chemotherapy

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60217152T2 (de) * 2001-10-31 2007-10-31 Alcon Inc. Knochen-morphogene proteine (bmp), bmp-rezeptoren und bmp-bindungsproteine und ihre verwendung bei der diagnose und behandlung des glaukoms
WO2006006948A2 (en) * 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
ES2303390B1 (es) * 2003-09-24 2009-08-17 Progenika Biopharma, S.A. Metodos para el diagnostico in vitro y pronostico in vitro del adenocarcinoma ductal de pancreas y/o de una pancreatitis; y para el desarrollo de farmacos contra el adenocarcinoma ductal de pancreas y/o contra una pancreatitis.
KR100556660B1 (ko) 2003-11-11 2006-03-10 국립암센터 Ｈｇｆ의 중화가능 에피토프 및 이에 결합하는 중화 항체
CN1901930B (zh) 2003-12-03 2012-05-30 斯克利普斯研究院 整合蛋白αⅡbβ3特异性抗体和肽
KR100664588B1 (ko) 2004-12-28 2007-01-04 김현기 인간 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질
KR100664590B1 (ko) 2004-12-28 2007-01-04 김현기 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질, 이를포함하는 발현벡터 및 이 벡터로 형질전환된 세포
KR100689275B1 (ko) 2005-03-30 2007-03-08 김현기 인간 원암유전자 ｔｒｇ 및 이에 의해 코드되는 단백질
KR100689274B1 (ko) 2005-03-30 2007-03-08 김현기 인간 원암 유전자, 이에 의해 코드되는 단백질
US20090203041A1 (en) * 2006-04-21 2009-08-13 Wei Shi Bmp4 inhibitors
EP2021373A4 (en) 2006-05-31 2010-06-02 Hanwa Chemical Corp MONOCLONAL ANTIBODY VCAM-1 SPECIFIC
US20100172902A1 (en) 2006-05-31 2010-07-08 Hanwha Chemical Corporation Method for treating a vcam-1 mediated disease
KR100786759B1 (ko) 2006-07-07 2007-12-18 김현기 Ｈｃｃｒ-1을 포함하는 유방암 예후 마커 및 비만 유도조성물
KR100829972B1 (ko) 2006-07-14 2008-05-16 재단법인서울대학교산학협력재단 항-ｈｇｆ/ｓｆ 인간화 항체 및 이의 제조방법
CN101517081A (zh) * 2006-08-24 2009-08-26 爱尔康研究有限公司 RNAi介导的Gremlin抑制用于治疗眼内压相关的状况
US8008448B2 (en) 2007-03-14 2011-08-30 National Cancer Center Cotinine neutralizing antibody
US8383349B2 (en) * 2007-03-16 2013-02-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Bone morphogenetic protein antagonist and uses thereof
KR101648960B1 (ko) 2011-04-15 2016-08-22 서울대학교산학협력단 접합 물질과 코티닌과의 접합체에 항-코티닌 항체가 결합된 복합체 및 이의 용도
ES2898620T3 (es) * 2013-03-14 2022-03-08 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos contra GREM 1

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013137686A1 (ko) 2013-09-19
JP2015512894A (ja) 2015-04-30
AU2013232855A1 (en) 2014-10-02
AU2013232855B2 (en) 2016-10-27
CN104321342B (zh) 2017-12-22
US20150158938A1 (en) 2015-06-11
US9631011B2 (en) 2017-04-25
KR20130105541A (ko) 2013-09-25
EP2826790A1 (en) 2015-01-21
TR201905395T4 (tr) 2019-05-21
KR102119223B1 (ko) 2020-06-05
CN104321342A (zh) 2015-01-28
EP2826790A4 (en) 2015-11-25
JP6339063B2 (ja) 2018-06-06
EP2826790B1 (en) 2019-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2720617T3 (es) Anticuerpo anti-gremlin-1
CN107847596B (zh) 抗ror1抗体
ES2753756T3 (es) Politerapia de anticuerpos frente al CSF-1R humano y usos de los mismos
JP5685442B2 (ja) ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子抗原結合タンパク質
CN111499747B (zh) 一种抗cd73单克隆抗体及其应用
US8329178B2 (en) Antibodies against CXCR4 and methods of use thereof
KR101671039B1 (ko) 항 ｃｘｃｒ4 항체 및 그들의 암의 치료를 위한 용도
US9249220B2 (en) Human monoclonal antibody neutralizing vascular endothelial growth factor receptor and use thereof
ES2469369T3 (es) Anticuerpos anti-CXCR4 humanizados para el tratamiento del cáncer
BR112012013717B1 (pt) anticorpos de ligação ao csf-1r humano, composição farmacêutica e usos do anticorpo
US9296817B2 (en) Antibodies cross-reactive to human and mouse c-Met and uses thereof
KR20170137073A (ko) 항-인간 ｎｏｔｃｈ4 항체
US20210122818A1 (en) Humanized anti-bag3 antibodies
CN114096563A (zh) 与b7-h3特异性结合的抗体及其用途
CN111741975A (zh) 抗血管生成素-2抗体及其用途
KR101745025B1 (ko) 항-ｍｓｔ１ｒ 항체 및 그의 용도
CN115362176A (zh) 用于抑制cd73免疫检查点的单克隆抗体及其抗原结合片段以及其用途
KR20220029563A (ko) Actrii 결합 단백질 및 이의 용도
JP2024508673A (ja) Ｃｃｄｃ１１２に基づく腫瘍細胞の増殖を抑制する方法