CZ317096A3

CZ317096A3 - Gen latentního viru chmele a způsob jeho detekce

Info

Publication number: CZ317096A3
Application number: CZ963170A
Authority: CZ
Inventors: Narushi Suda; Yutaka Itoga; Tatsuzi Hataya
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd.
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-29
Publication date: 1998-03-18
Also published as: DE69635882D1; AU717790B2; EP0775747A3; SK138896A3; US6132960A; US5869235A; AU7033796A; EP0775747B1; CA2188900A1; CZ293438B6; DE69635882T2; EP0775747A2; CN1157325A; CN1154731C; SK283202B6; JPH09173100A

Description

(57) Anotace:

DNA kódující obálkovou bílkovinu latentního viru chmelu obsahujících sekvenci nukleotidů udanou v SEKV.IČ: 1. Způsobu detekce latentního viru chmelu nebo příbuzného viru v infikovaných rostlinách.

CZ 3170-96 A3 < TJ r— 73

W c z! .5 Ξ £ > o ° O -I <

Xi;

O

O czx

Γ— o

o<

T¹' Wv-aÉ

Geny latentního viru chmelu a způsob jejich detekce Oblast techniky

Předložený vynález se týká genů latentního viru chmelu a způsobu a metod detekce uvedeného viru.

Dosavadní stav techniky

Rozšíření infekce chmelovým latentním virem (dále zkráceno jako HLV) bylo hlášeno ze všech oblastí pěstování chmelu (Tresh & Ormerod, Rep. E. Mailing Res. Stn. for 1968: 41 (1969), Probasco & Skotland, Phytopatology 68: 278 (1978), Adams & Barbara, Ann. appl. Biol., 101: 483 (1982), Inoue et. al., Ann. Phytopath. Soc. Japan 39: 229 (1973).

HLV má filamentní tvar a patří do skupiny calavirů. Doposud nebyla zjištěna ani genová, ani primární struktura obalové bílkoviny. Proto, jako metoda k selekci bezvirových kolon chmelu se využívá enzymoimunoabsorbční stanovení (ELISA) s použitím protilátek vůči HLV. Avšak diagnostická detekce HLV s ELISA způsobovala různé problémy, například snížení detekční citlivosti závislé na době odběru vzorků a na zdlouhavé přípravě protilátek.

Z těchto důvodů, technickým problémem předloženého vynálezu je poskytnout rychlou a přesnou metodu identifikace HLV-infikovaných rostlin.

Tento technický problém je vyřešen provedeními vyjádřenými v patentových nárocích.

Jmenovitě, předložený vynález je založen na identifikaci genu obalové bílkoviny HLV a vyřešení jeho sekvence bází a tím také primární struktury uvedené bílkoviny.

Využitím genu pro HLV obalovou bílkovinu nebo DNA nasyntetizované podle jeho sekvence bází, může být HLV detekován genetickou metodou, například polymerázovou řetězovou reakcí (dále zkratka PCR) a Southernovou hybridizací. Například v PCR s částí sekvence bází nebo s DNA obsahující komplementární sekvenci jako očko, je HLV detekováno pomocí tvorby amplifikovaných produktů DNA, specifických ke HLV-infikovaným rostlinám. Kromě toho použitím hybridizace komplementárního vlákna DNA HLV genu, jako nukleotidové sondy, mohou být Southernovou analýzou pozorované specifické pásy s HLV-infikovaných rostlin.

Podstata vvnálezu

Takto se předložený vynález týká DNA, která kóduje bílkovinu latentního viru chmelu vybrané ze skupiny skládající se z:

I

a) molekul nukleové kyseliny kódujících polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin uvedenou v SEKV. IČ: 6 nebo 7;

b) molekul nukleové kyseliny obsahujících sekvenci nukleotidů uvedenou v SEKV. IČ: 1;

c) molekul nukleové kyseliny obsahujících sekvenci nukleotidů od nuleotidu 58 až 975, nebo od nukleotidu 981 až 1292 ze sekvence nukleotidů uvedevé v SEKV. IČ: 1;

d) molekul nukleové kyseliny hybridizujících k molekulám nukleových kyselin jak jsou definovány v

a), b), nebo c); a

e) molekul nukleových kyselin, u kterých je sekvence nukleotidů degenerována výsledkem genetického kódu vůči sekvenci nukleotidů molekul nukleových kyselin definovaných v a), b), c) nebo d).

V tomto kontextu termín „hybridizace“ odpovídá spíše obvyklým hybridizačním podmínkám, jako hybridizačním podmínkám přísné hybridizace.

Dále se předložený vynález týká DNA, které hybridizují s DNA podle vynálezu a které kódují fragment nebo zmutovanou verzi bílkoviny, kódovanou výše popsanými DNA.

Předložený vynález se dále týká specifické sekvence molekul nukleových kyselin odvozených od DNA podle předkládaného vynálezu.

V tomto kontextu termín „specifická sekvence“ odpovídá molekulám nukleových kyselin, které po dobu hybridizace mohou specificky hybridizovat s geny a DNA podle předloženého vynálezu. Tak mohou být molekuly nukleových kyselin použity např. jako specifické nukleotidové sondy nebo specifická očka pro amplifikaci specifické sekvence, např. pro polymerázovou řetězovou reakci.

Výhodné provedení předloženého vynálezu se týká DNA kódující obalovou bílkovinu latentního viru chmelu, která obsahuje sekvenci bází popsanou pod identifikačním číslem 1 v seznamu sekvencí, kde

a) sekvence nukleotidů od 85 do 975 kóduje 306 zbytků aminokyselin a b) sekvence bází od 981 do 1292 kóduje 104 zbytků aminokyselin.

Předložený vynález se dále týká polypeptidů kódovaných s některou výše uvedenou DNA podle vynálezu.

Také se vztahuje na způsoby výroby uvedených polypeptidů včetně kultivace hostitelské buňky, které obsahují jakoukoli DNA podle vynálezu a izolaci polypeptidů z kultury. Důležité je, že uvedené DNA jsou účinně vázány na regulační jednotku umožňující jejich expresi v prokaryotických ·-· > ·> -· r -A *· nebo eukaryotických buňkách. Jako prokaryotické buňky jsou výhodné E. co//'a jako eukaryotické buňky jsou výhodné rostlinné buňky.

Další výhodné provedení podle vynálezu zahrnuje rostlinné buňky, které obsahují jakoukoli z DNA výše uvedených ve vynálezu. Přesněji řečeno rostlinné buňky jsou odvozeny z chmelu.

Dále se vynález týká protilátek specificky rozpoznávajících polypeptidy z vynálezu. Předložený vynález se dále týká diagnostického složení, které obsahuje jakoukoli z doposud uvedených DNA, molekul nukleových kyselin eventuálně obsahuje vektor, polypeptidy nebo protilátky specificky rozpoznávající takové polypeptidy samotné, nebo v kombinaci a optimálně výhodné pro detekci.

Podle dalšího provedení se vynález týká použití uvedených DNA a molekul nukleových kyselin, vektorů, polypeptidů a protilátek pro inženýrství patogenní rezistence rostlin.

Nejvýhodnějším provedením je, jestliže je patogen vir, především carlavir a nejvýhodnějši je HLV a z rostlin je to chmel.

Gen obsahující DNA a RNA, kódující HLV obalovou bílkovinu a části z ní, může být použit k detekci HLV. Jako nukleotidová sonda vhodná pro PCR a Southernovu hybridizaci může být s výhodou použita sekvence bází ze seznamu sekvencí, např.

a) sekvence s identifikačním číslem 2 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 405 do 23),

b) sekvence s identifikačním číslem 3 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 457 do 474),

c) sekvence s identifikačním číslem 4 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 618 do 637),

d) sekvence s identifikačním číslem 5 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 761 do 781).

Tyto DNA se mohou získat extrakcí a purifikací z HLV nebo připravit použitím automatického syntezátoru DNA. Zejména krátké jednovláknové DNA, například sekvence bázi s identifikačním číslem od 2 do 5 mohou být obvykle získány chemickou syntézou.

Dále se předkložený vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje amplifikaci DNA reverzní transkripcí PCR, uskutečněnou s nukleovou kyselinou extrahovanou z chmelu, která slouží jako templát a kterákoli syntetická sekvence s identifikačním číslem 2 až 5 slouží jako očko a k elektroforetické analýze takto získaných produktů.

Přesněji, HLV mohou být detekovány s DNA, amplifikovanou reverzní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 2 a 4 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů k potvrzení specifického DNA fragmentu obsahujícího 233 párů bází.

Podobně HLV mohou být detekovány s DNA, amplifikovanou reverzibilní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 3 a 4 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 188 párů bází.

Také HLV mohou být detekovány s DNA, amplifikovanou reverzibilní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 2 a 5 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 377 párů bází.

Kromě toho HLV mohou být detekovány s DNA, amplifikovanou reverzibilní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 3 a 5 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 325 párů bází.

Dále se předložený vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje hybridizaci nukleové kyseliny extrahované s chmelu, očko obsahující syntetickou dna s identifikačním číslem 4 nebo 5, nebo komplementární vlákno DNA prodloužené pomocí DNA používanými jako očko.

Dále se předložený vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje nukleovou kyselinu extrahovanou z chmelu a restrikční enzymový fragment DNA popsaný v sekvenci s identifikačním číslem 1 sloužící jako nukleotidová sonda.

Dále se předložený vynález týká HLV obalové bílkoviny, přepsané ze sekvence bází od 58 do 975 sekvenčního identifikačního čísla 1 v sekvenčním seznamu, obsahující 306 zbytků aminokyselin sekvence s identifikačním číslem 6 v sekvenčním seznamu.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr.1 je sekvence aminokyselin obalové bílkoviny latentního viru chmelu, analyzovaná bílkoviným sekvenčním analyzátorem.

Obr. 2 je elektroforetická fotografie zobrazující výsledky genové diagnózy latentního viru chmelu, použitím PCR.

V předloženém vynálezu, gen HLV je analyzován následujícími postupy k identifikaci obalo vé bílkoviny HLV a vyřešení její sekvence bází.

1.Izolace HLV

HLV může být z chmelu izolován standardními metodami, např., zahrnujícími koncentraci viru s polyethylenglykolem, přečištění extraktu organickými rozpouštědly a tepelné zpracování, frakčni centrifugací, centrifugací v sacharozovém gradientu, atd.

2. Extrakce RNA z HLV.

Extrakce může být provedena standardními metodami, například SDS-fenolovou metodou, která se hlavně používá pro jiné rostlinné viry.

3. Klonování s cDNA.

Jako templát se využívá RNA extrahovaná z částí HLV a dvojvláknová cDNA je in vitro syntezovaná Gubler-Hoffmanovou metodou (Gubler and Hoffman, Gene, 25, 263 (1983)). Takto nasyntetizovaná cDNA je inkorporována do plazmidového vektoru ligací, použitím standardních technik. Případné plazmidové vektory, které mohou být použity, jsou pUC119, pBluescriptlí, atd. Kompetentní buňky E. coli jsou transformovány použitím uvedené ligační směsi. Z takto získaných transformátů jsou vybrány a purifikovány rekombinantní plazmidy, které obsahují cDNA.

4. Sekvence bází cDNA odvozená z genomu HLV při použití rekombinantního plazmidu, zí skaného výše popsanou metodou, může být stanovena podle Maxam-Gilbertové metody (Maxam and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 560 (1977)), nebo dideoxy metodou (Sanger et al., Proč. Na tl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).

Takže sekvence bází DNA zahrnující gen, kódující HLV obalovou bílkovinu (dále zkráceno jako HLV gen obalové bílkoviny), je stanovena a je popsána v sekvenci s identifikačním číslem 1 v seznamu sekvencí.

5. Stanovení částečné sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny.

Toto je provedeno pomocí analyzátoru bílkovin (ABI) po částačném opracování HLV obalové bílkoviny, následnou frakcionací a purifikací výtěžku pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Takto stanovená částečná sekvence aminokyselin obalové bílkoviny je ukázána na obr. 1. Když se porovná tato částečná sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny se sekvencí odvozené ze sekvence HLV genu obalové bílkoviny ukázané v sekvenčním seznamu, primární struktura (sekvence aminokyselin) obalové bílkoviny byla vyřešená (viz obr.1).

6. Virová genová diagnóza HLV-infikovaného chmelu.

1) Diagnóza genu reverzní transkripcí PCR

Očko DNA, dlouhé pravděpodobně 20 baží, obsahující částečnou sekvenci HLV genu obalové bílkoviny, která byla stanovená výše popsanou metodou nebo sekvencí bází jeho komplementárního vlákna, je syntetizováno standardními metodami. Virová genová diagnóza HLVinfikovaného chmelu je možnou detekce přítomného nebo nepřítomného amplifikovaného produktu získaného pomocí PRC, při použití uvedeného očka.

Jako očka mohou být použity oligonukleotidy, zahrnující sekvenci bází se sekvencemi s identifikačním číslem 2 až 5 v sekvenčním seznamu. Mezi nimi, sekvencg,,bézí popsaná v sekvenci identifikačního čísla 2 sekvenčního seznamu je stejná jako sekvence bází od 405 do 423 popsaná v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 3P. Sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 3 sekvenčního seznamu je stejná jako sekvence bází od 457 do 474 popsaná v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 4P. Také sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 4 v sekvenčním seznamu je komplementární vlákno sekvence bází od 618 do 637 sekvence bází popsané v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 3M. Sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 5 v sekvenčním seznamu je komplementární vlákno sekvence bází od 761do 781 sekvence bází popsané v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená

4M.

Také mohou být jako očka použity oligonukleotidy zahrnující část sekvence bází popsané v sekvencích s identifikačním číslem 2 až 5. To znamená, dokud PCR je primární metodou pro amplifikaci kopie specifických genových informací získaných z mnoha sekvencí bází, oligonukleotidy obsahující sekvenci bází podobnou očkům v předloženém vynálezu, mohou být použity podobně jako očka.

Očka DNA, použité v předloženém vynálezu mohou být získány např. βkyanoethylfosfoamidovou metodou nebo komerčním automatickým DNA syntetizátorem, používajícím thiofofitovou metodu.

Nukleové kyseliny z chmelových rostlin, použité v předloženém vynálezu, mohou být extrahovány kteroukoli standardní metodou, která je obvyklá pro extrakci nukleových kyselin.

Použitím takto získané nukleové kyseliny z chmelu a očka popsaná výše, DNA odvozené z HLV genomu jsou amplifikovány kombinací technik reverzibilnl transkripce virových RNA s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR je postup opakujícího se DNA replikačního cyklu, zahrnující stupeň denaturace , tepelné hybridizace očka a elongace pomocí DNA polymerázy a tato všeobecná metoda je popsána např. v Saiki etal., Science, 230, 1350-1354, atd.

PCR provedená v předloženém vynálezu je doložena metodou, ve které se DNA replikační cyklus opakuje pravděpodobně 20 až 50 krát, s výhodou pravděpodobně 25 až 40 krát, v amplifikačním tlumivém roztoku skládajícím se z 1,0 mM až 4,0 mM, pravděpodobně 1,5 mM až 3,0 mM MgCI₂ roztoku, který byl předtím smíchán se syntetickými oligonukleotidy, DNA polymerázou, 4 typy nukleotidů (dATP, dTTP, dCTPa dGTP) a chmelovými DNA, chloridem draselným, želatinou, hovězím sérovým albuminem, povrchově aktivní látkou (Tween 20, NP-40, Troton X-100, atd. (vše obchodní názvy)), dimethylsulfoxidem atd.

Kromě toho může být proveden každý krok v PCR za následujících podmínek.

Denaturační krok je proveden zahřátím obecně při 90 °C do 95 °C, s výhodou při 94 °C do 95 °C, pravděpodobně 1 až 3 minuty, s výhodou 1 až 2 minuty.

Stupeň tepelné hybridizace očka je proveden inkubací s očky obecně při teplotě 30 °C do 50 °C, s výhodou při teplotě 35 °C do 42 °C po dobu 1 až 3 minut, s výhodou po dobu po dobu 1 až 2 minut.

Elongační stupeň pomocí DNA polymerázy je výhodný pomocí termostabilní DNA polymerázy obecně při teplotě 70 °C do 73 °C, s výhodou přbteplotě 72 °C do 73 °C, po dobu 1 až 4 minut, s výhodou 2 až 3 minut. Jako příklad DNA polymerázy může být uveden komerční produkt od Perkin Elmera, s.r.o..

Takto amplifikované DNA mohou být vizualizovány barvící metodou, použitím sloučeniny, která interaguje s nukleovými kyselinami, např. barviva fenantridinové série, například ethidiumbromid atd., a která je předtím přidána k elektroforetickému tlumivému roztoku, např. v konečné koncentraci pravdě8 podobně 5gg/ml a během elektroforézy, při ozáření gelu ultrafialovým světlem při 254 nm nebo 366 nm ve tmě, mohou být pozorovány červené pásy DNA-ethidiumbromidového komplexu. Avšak obecně, červené pásy DNA -ethidiumbromidového komplexu jsou detekovatelné ponořením elektroforetického gelu do roztoku ethidiumbromidu atd. po dobu pravděpodobně 10 až 60 minut po skončení elektroforézy a následně se gel ozáří ultrafialovým světlem při 254 nm nebo 366 nm ve tmě.

Virová infekce může být identifikována potvrzením přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaných DNA. Takže, když PCD je provedena s tím stejným očkem, specifická amplifikovaná DNA je detekovaná se vzorky pocházajícími z chmelu infikovaného virem, ale ne se vzorky z neinfikovaného chmelu.

Např. HLV může být detekován podle metody patentového nároku 14, přítomností specifického DNA fragmentu obsahujícího 233,181, 377 a respektive 325 párů bází.

2) Diagnóza genu hybridizací

Diagnóza HLV na rozdíl od obvyklého stanovení imuno-testem, může být provedena nukleotidy, které mají sekvenci komplementární ke genu kódujícímu HLV obalovou bílkovinu, připravenými chemickou syntézou nebo genovou manipulací a hybridizujícími s oligonukleotidy jako očky.

Používané nukleotidové sondy jsou obecně dlouhé 20 až několik tisíc párů bází a měly by být např. takové, které mají sekvenci bází popsanou v sekvenční identifikaci číslo 6 a 7 v sekvenčním seznamu a fragmenty DNA získané účinkem restrikčních enzymů z cDNA, která byla připravena z plazmidů získaných klonováním genu HLV obalové bílkoviny. Tyto nukleotidové sondy jsou používány k hybridizací po označení izotopy, biotinem, fluorescerem atd., standardními metodami.

Při použití nukleových kyselin při hybridizací se mohou extrahovat standartními metodami, např. standardními metodami extrakce nukleových kyselin, které jsou popsané např. v Murray & Thomson, Nucl. Acid Res., 8, 4321-4325, (1980), atd. Takto získané nukleové kyseliny jsou předmětem denaturačního opracování a pak jsou nakapány na membránový filtr, například nitroceluózový filtr nebo nylonový filtr, vhodný je např., Hybond-N⁺ (Amersham).

Denaturační opracování nukleových kyselin se provádí zahřátím nukleové kyseliny v roztoku obsahujícím formamid, formaldehyd, MOPS, kyselinu octovou, EDTA atd. při 60 °C až 70 °C, s výhodou při 75 °C, 5 až 20 minut, s výhodou 15 minut, s následným rychlým ochlazením. Po tomto denaturačním opracování se nukleové kyseliny smíchají s 20 x SSC a pak se nakapou na membránový filtr.

Hybridizace se provede použitím takto získaného membránového filtru (s nakapanými nukleovými kyselinami z chmelu) a sondy v hybridizačním roztoku při 42 °C až 65 °C, s výhodou při 46°C, 12 až 20h, s výhodou 16 h. Potom se membránový filtr promyje, vysuší a přítomnost nebo nepřítomnost signálu v kapkách se prověří detekčními metodami jako je např. autoradiografie, atd.

Takže signál je detekovaný nukleovými kyselinami pocházejícími z virem-infikovaného chmelu, protože hybridizují s nukleotidovou sondou, ale nedekovatelný, jestliže pocházejí z neinfikovaného chmelu, protože nedochází k hybrídizaci.

Příklady provedení vynálezu

V následujícím bude předložený vynález popsán detailně s odkazy na příklady, které jsou určeny pro ilustraci a neomezují vynález.

Příklad 1.

Izolace HLV

Mladá úponková rostlina HLV-infikovaného chmelu (1 kg) se rozemele se 3-mi objemy 0,05M tlumivého roztoku (obsahujícího 0,2% askorbové kyseliny, 0,2 % nikotinu a 0,2 % PVP, pH 8,0), nechala se stát 1 h při pokojové teplotě a filtrovala se přes gázu, aby se získala surová šťáva. Šťáva se tepelně zpracovala (při 55 °C, 8 min.), okamžitě se ochladila v ledové lázni a cenrifugovala se při 3 000 x g, 30 min, aby se získal supernatant K tomuto supernatantu se přidal polyethy lengly kol a chlorid sodný v koncentraci 5%, respektive 0,5 M a výsledný roztok se 1 h míchal a pak centrifugoval při 3000 x g, 30 min. Takto zíslaná sraženina byla suspendována v 0,5M fosfátovém tlumivém roztoku (obsahujícím 0,2M EDTA, pH 7,4).

Dále výše uvedená suspenze se centrifugovala při vysokých otáčkách (při 15 000 x g, 10 min), aby se získal supernatant, který pak byl ultracentrifugován (při 100 000 x g, 120 min), aby se získala sraženina. Tento proces se opakoval dvakrát, aby byla vírová frakce bez kontaminace.

Takto získaná sraženina se suspendovala v 2 ml 0,01 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0) a centrifugovala se (při 150 000 x g, 120 min.) v sacharózovém hustotním gradientu (20 až 10%), aby se sesbíraly frakce, které obsahují vir. Nakonec byly frakce centrifugovány při 180 OOOg, 150 min., aby se získala sraženina, obsahující virové částice, která byla dále rozsuspendována v 0,01 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0) a uložena jako vyčištěný virový preparát.

Je třeba ještě uvést, že výše popsané postupy se prováděly při 4 °C.

Příklad 2

Extrakce RNA z HLV.

Extrakce RNA z částic HLV se provedla SDS-fenolovou metodou (Proll et al., Potato research 24,1-10,(1981)).

K vyčištěnému preparátu HLV (1 pg/ml, 84 μΙ), získaného stejnou metodou jako v příkladu 1, se přidal 20% SDS (5 μΙ), 20 x SCC (1 μΙ) a proteáza (výrobní název: Proteáza K) (10 mg/ml, 10 μΙ) a výsledná směs se ohřívala při 37 °C, 30 min.

Pak se provedla fenolová extrakce přidáním 0,5% bentonitové suspenze (50μΙ) a TEnasyceného fenolu (150 μΙ) k výše uvedené směsi a následná druhá extrakce při použití směsi fenol: chloroform (1:1, v/v). Vodná vrstva se extrahovala chloroformem. Ktéto vodné vrstvě se přidal 3 M octan sodný (1 ΟμΙ) a chlazený ethanolem (250 μΙ) a směs se nechala stát při -80 °C, 30 min. Pak se směs centrifugovala při 15 000 x g, 5 min, aby se získala sraženina. Sraženina se promývala centrifugací v 70% ethanolu. Po odstranění ethanolu sušením se takto získaná sraženina rozpustila v destilované vodě (50 μΙ). K tomuto roztoku se přidal 4M chlorid litný (50 μΙ) a výsledná směs se v ledu nechá la stát přes noc.

Výše uvedená směs se centrifugovala při 15 000 x g, 5 min., aby se získala sraženina, která se znovu promyla centrifugací v 70% ethanolu, jak bylo uvedeno výše. Po odstranění ethanolu sušením, se sraženina rozpustila v destilované vodě (8 μΙ) a uložila jako vzorek RNA.

Příklad 3

Klonování cDNA cDNA byly připravena ze vzorku RNA připravené v Příkladě 2 za použití cDNA syntetizační soupravy (Amersham) podle protokolu specifikovaného dodavatelem a rozpuštěná v TE tlumivém roztoku (1 μΙ).

Pak se plazmid pUC119 (500 ng/μΐ) rozštěpil s Smál a defosforyloval. K štěpu (2 μΙ) se přidá la nasyntezovaná cDNA (1 μΙ), 10 mM ATP, 10 x ligační tlumivý roztok (Behringer), T4DNA ligáza (5υ/μΙ, Behringer) a destilovaná voda (13 μΙ) a směs se kvůli ligaci inkubovala přes noc při 22 °C.

Připravily se kompetentní buňky Escherichia coli MV1184 a smíchali se s ligačním reakčním roztokem (100 μΙ) a nechaly se stát v ledu 30 min.

Pak se reakční roztok, ohřívaný 60 sekund při 37°C, okamžitě ochladil ledem, smíchal se s SOC médiem (500 μΙ) a výsledná směs se udržovala 1 h, při 37 °C. K této směsi se přidalo z každého, 2% X-gal a 100 mM IPTG po 50 μΙ a výsledná směs se rozetřela na dvě 2 x YT agarové plotny obsahující ampicilin (δθμΐ/ml) a inkubovala se přes noc při 37 °C.

Z bílých kolonií E. coli se takto získané plazmidy DNA extrahovaly standardními metodami a vybraly se a uložily buňky mající dlouhé cDNA inzertní fragmenty.

Pak se kvůli potvrzení, že cDNA pochází z HLV genomu, se vyčištěná HLV-RNA částečně denaturovala alkáliemi a vybraná jednovláknová cDNA se podrobila Southernové hyybridizaci při použití nukleotidové sondy, značené s T4 polynukleotid kinázou na 5-konci s [γ³² Ρ] ATP.

Výsledkem je získání kmene E. coli nesoucí plazmid cDNA s inzertními fragmenty dlouhými 0,7 kb, 1,2 kb, 1,35 kb, 3,5 kb a 5,0 kb pocházejícími z HLV genomu.

Příklad 4:

Stanovení sekvence bází c DNA, pocházející z HLV genomu

Buňky E. coli, nesoucí plazmid s cDNA inzertním fragmentem pocházejícím z HLV genomu, který byl získán v Příkladu 3, se kultivovali na třepačce přes noc v 2 x YT médiu, při 37 °C a plazmid se vyčistil standardní metodou. cDNA fragmenty pocházející z HLV genomu byly připraveny z plazmidu standardními metodami a s fragmenty jako templátem a jejich sekvence bází byla dekódována pomocí dideoxy metody (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)), použitím DNA sekvenátoru (ABI) a sekvenční soupravy (USB, SEQUENASE) a z toho se stanovila sekvence dlouhá 1375 bází.

Výsledkem toho byla identifikace dvou otevřených čtecích rámců (sekvence bází od 58 do 975 a sekvence bází od 981 do 1292 sekvence identifikačního čísla 1 ze sekvenčního seznamu) údajně kódujících HLV obalovou bílkovinu (306 aminokyselinových zbytků, molekulová hmotnost pravděpodobně 31,4 kD) a pro bílkovinu pravděpodobně 12,0 kD a 101 aminokyselinových zbytků.

Kromě toho domnělé sekvence aminokyselin odvozené z každé sekvence bází jsou ukázány v sekvenci identifikačního čísla 6 a 7 sekvenčího seznamu. Mezi nimi, protože sekvence aminokyselin ukázaná v sekvenci identifikačního čísla 6 obsahuje sekvenci odpovídající části sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny níže detailně popsané, jejich přítomnost byla potvrzená.

v ' λ oy-v

Velmi se očekává, že tento vynález přispěje k produkci chmelové rezistence uvedeného viru transformací takto získaného genu kódujícího HLV obalovou bílkovinu. A tak transformace takových mikrorganismů jako £. coli atd., se jmenovanou obalovou bílkovinou, kódovanou takto získaným genem umožňuje produkci uvedené bílkoviny. Tedy na základě sekvence aminokyselin uvedené bílkoviny se z ní může získat fragment použitím např. bílkoviného analyzátoru, atd. Obalová bílkovina nebo fragment z ní se může použít k produkci HLV protilátek, využitelných k detekci HLV.

Příklad 5

Stanovení částečné sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny

Vyčištěný vzorek HLV obalové bílkoviny (1 μΙ/ml, 120 μΙ) připravená v Příkladu 1 se částečně opracovala proteolytickým enzymem ( Lysyl Endopeptidase, Wako Pure Chemicals), 16 h, při pokojové teplotě (25°C). Fragmenty takto získaných peptidů se čistily frakcionací reverzní fázovou HPLC (použitím RepRPC HR5/5 kolony, Pharmacia), a jejich sekvence aminokyselin se analyzovala z N-konce bílkovinným sekvenátorem (ABI). Zjistilo se, že sekvence aminokyselin na N-koncích třech peptidových fragmentů je zcela identická s domnělou sekvencí aminokyselin HLV obalové bílkoviny. N-konec sekvence aminokyselin těchto tří peptidových fragmentů a jejich lokalizace v sekvenci aminokyselin v HLV obalové bílkovině jsou znázorněny na Obr.1.

Příklad 6

Stanovení přítomnosti HLV v HLV-infikovaném chmelu reverzibilní transkripcí PCR

Lístky HLV-infikovaného chmelu (kultivar, Shinshu Wase) a chmelu bez viru (kultivar, Shinshu Wase) (každého 0,1 g) se rozemlely v 0,05 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0,1 ml) a extrahovaly chloroformem. Pak se supernatant opracoval fenolem třikrát etherem a přidal se ethanol, aby se nukleové kyseliny vysrážely. Takto získaná sraženina se promyla centrifugací v 70% ethanole a potom se nadbytečný ethanol odstranil sušením a sraženina se rozpustila v TE tlumivém roztoku (100μΙ). Z toho se použilo 2 μΙ podílu na reverzibilní transkripci PCR.

Pro PCR byla vybrána čtyři různá očka na základě existujících sekvencí bází a syntezována standardními metodami s použitím DNA syntetizátoru Model 380B (ABI), které mají sekvenci bází popsánu v sekvencích identifikačního čísla 2 až 5 (označených 3P, 4P, 3M, resp.

4M). Každé očko se pro reverzní transkripci PCR použilo v kombinaci 3P/3M, 4P/3M, 3P/4M a 4P/4M.

Reverzní transkripční reakce byla provedena v tlumivém roztoku Tris-HCl (pH 8,3) skládajícím se z 75 mM KCI, 3mM MgCI₂, 10 mM DTT a 0,5 mM dNTPs komplementárním vláknovým očkem (25 pmol) a reverzní transkriptázou (ANV-RTase XL, Takara Shuzo, 5 jednotek) a k tomu se přidala nukleová kyselina chmelu (2 pg) připravená, jak je uvedeno výše, na 30 min., při 55 °C.

Pak se k výše uvedené reakční směsi přidala termostabilní DNA polymeráza (Behringer, 0,5 jednotky) a pro amplifikaci očko (25 pmol) a provedla se PCR. Objem reakčního roztoku byl upraven na 10 μΙ a na povrch se navrstvil minerální olej (20 μΙ), aby se zabránilo odpařování reakční směsí.

Každý stupeň se provedl za následujících podmínek. Jeden cyklus PCR se skládá z denaturačního stupně při 94 °C, 1 min., z tepelné hybridizace očka při 55 °C, 1 min. a ze stupně elongace DNA při 72 °C, 5 min. a uloží se při 4 °C.

Amplifikované genomické DNA, získané výše popsaným PCR se analyzovaly elektroforézou na agarózovém gelu.

DNA se frakcionovaly elektroforézou na 2% agarozóvém gelu v Tris-borátovém tlumivém roztoku (pH 8,0), obsahujícím 2 mM EDTA, 30 min., při 100 V. Jako markéry velikosti se použily markéry molekulových hmotností DNA a DNA opracovaná restrikčními enzymy HindiII a EcoRI (Nippon Energy).

Po skončení elektoforézy se gel ponořil na 10 min. do vodného roztoku ethidiumbromidu (0,5 μΙ/ml) a červené pásy DNA-ethidiumbromidového komplexu byly detekovány po ozáření gelu ve tmě UV při 254 nm.

Výsledky elektroforézy (dvakrát opakované) jsou znázorněny na Obr.2, kde DW známe ná sterilizovaná voda.

Výsledkem agarózové gelové elektroforézy je, že se získaly specifické DNA amplifikované fragmenty z HLV-infikovaného chmelu v závislosti na použitém očku, ale nebyly získány z neinfikovaného chmelu, což umožňuje tyto dva vzorky rozlišit.

Specifické amplifikované fragmenty DNA odpovídající použitým očkům byly následující, 3P/4M: 233 párů bází 4P/3M: 181 párů baží 3P/4M: 377 párů bází a 4P/4M: 325 párů bází.

Příklad 7

Stanovení přítomnosti HLV v HLV-infikovaném chmelu pomocí dot blotovou hybridizací

Lístky HLV-infikovaného chmelu (kultivar, Shinshu Wase) a chmelu bez viru (kultivar, Shinshu Wase) (každého 0,1 g) se rozemlelo v 0,05 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0, 1 ml) a extrahovalo chloroformem. Pak se supernatant opracoval s chloroformem a třikrát etherem a přidal se ethanol, aby se nukleové kyseliny vysrážely. Pak se takto získaná sraženina promyla centrifugací v 70% ethanolu a po odstranění nadbytečného ethanolu se sraženina rozpustila v TE tlumivém roztoku (100 μΙ). Z toho se 2 μΙ podílu přidalo ke třem objemům tlumivého roztoku denaturujícího nukleové kyseliny ( skládajícího se z 63% formamídu, 20% formaldehydu, 1,54 M MOPS, 6,5 mM octanu sodného a 1,3 mM EDTA) a směs se ohřívá 15 min při 65 °C a potom se okamžitě ochladí. K tomoto roztoku se přidalo 8 μί 20 x SSC (skládajícího se z 0,15 M chloridu sodného, 0,015 M citrátu sodného, pH 7,0) a promýchalo. Z toho se 10 μΙ podílu nakapalo na membránový filtr (Amersham, výrobní název Hyobond-N⁺) a byla provedena bodová hybridizace.

Výsledkem toho je vyřešení genové struktury, která kóduje HLV obalovou bílkovinu a vyvinutí způsobu detekce HLV podle vynálezu, kde zdlouhavé postupy, tak jako jsou obvyklá izolace HLV, příprava antiséra, čištění protilátek atd., se stávají nepotřebnými a přístupnou se stává diagnóza virů HLV-infikovaného chmelu, která je pohodlnější a přesnější jako ELISA. Kromě toho předložený vynález může přispět k produkci chmelu rezistentního vůči HLV použitím nukleových kyselin, bílkovin a protilátek z vynálezu.

SEKVENČNÍ SEZNAM

1) VŠEOBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) NÁZEV : SAPPORO BREWERIES LTD.

(B) ULICE: 20-1, Ebisu 4-chome, Shibuya-ku (C) MĚSTO: Tokyo (E) STÁT: Japonsko (F) POŠTOVNÍ KÓD: 150 ii) NÁZEV VYNÁLEZU: GENY LATENTNÍHO VIRU CHMELU A ZPŮSOB JEJICH DETEKCE iii) POČET SEKVENCI: 7 iv) FORMA ROZPOZNÁVACÍ POČÍTAČEM (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRÁVO PŘEDNOSTI Z PŘIHLÁŠKY:

(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-302297 (B) DATUM PODANÍ: 27.10.1995 (vi) PRÁVO PŘEDNOSTI Z PŘIHLÁŠKY:

(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-352285 (B) DATUM PODÁNI: 28.12.1995 (2) INFORMACE O SEKV. IČ 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1375 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: bílkovina (xi) POPIS SEKVENCE IČ 1:

TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG 60

GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120

GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180

TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240

AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300

CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360

CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420

AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480

CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540

AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600

GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660

TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720

GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780

AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840

ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900 .

GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960

TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020

TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080

ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140 GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200

ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260

GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320

TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375 (2) INFORMACE O SEKV. IČ 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ 2:

TGAGGTCGTG TCAAACAAC 19 (2) INFORMACE O SEKV.IČ: 3:

(i)' CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ: 3:

GTTGATCTGG AGGGGTTG 18 (2) INFORMACE O SEKV: IČ: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYPE: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovlákonavá (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ:4:

TCTCGGCATC CTTCTTTATT 20

2) INFORMACE O SEKV: IČ: 5:

(i) CHARACTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovlákonavá (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ:5:

TTTCAACGTA ATCCAAGCAA T 21 (2) INFORMACE O SEKV. IČ: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 306 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknové (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE IČ: 6:

Met Ala Asp Lyz Gin Gly Gin Met Tre Glu Gin Gin Lyz.Val Asp Ser 15 10 15

Gin Lyz Leu Gin Gly Glu Ala Lyz Asn Lys Glu Lyz Ala Glu Ser Ser 20 25 30

Lyz Arg Lyz Asp Glu Leu Leu Lyz Lyz Tyr Ile Asp Pro Gly Leu Gly

40 45

Ser Asp Asp Asp Glu Glu Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lyz Leu 50 55 60

Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg Ala Ala Ile Arg Val Tre Asn Ala 65 70 75 80

Gly Leu Glu Tre Gly Arg Pro Ala Leu Lyz Pro Tre Pro Asp Met Leu 85 90 95

Pro Asp Pro Tre Asn Pro Tyr Asn Lyz Pro Ser Leu Asp Ala Leu Leu 100 105 110

Met Ile Lyz Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Tre Ser Glu Asp 115 120 125

Met Met Lyz Ile Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu 130 135 140

His Val Gin Ser Val Ile Leu Gin Ala Val Phe Tyr Cys Lyz Asp Ser 145 150 155 160

Ser Ser Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Try Arg Gly 165 170 175

Gly Ala Ile Ser Ala Asp Ser Val Leu Ala Ile Ile Lyz Lyz Asp Ala 180 185 190

Glu Tre Leu Arg Arg Val Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Tre Try Asn

195 200 205

Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro Pro Ser Asp Try Ser Glu Met Gly 210 215 220

Phe Gin Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe Asp Cys Leu Asp Tyr Val 225 230 235 240

Glu Asn Ala Ala Ala Val Gin Pro Leu Glu Gly Leu Ile Arg Val Pro 245 250 255

Tyr Ala Arg Glu Lyz lle Ala Asn Lyz Tre His Lyz Asp Leu Ala Leu 260 265 270

Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gin Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu lle 275 280 285

Tre Gly Gly Lyz Asn Gly Pro Glu Leu Gin Arg Asp Tyr Ser Lyz Ser 290 295 300

Asn Asn 305 (2) INFORMACE O SEKV. IČ.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP: peptid (xi) POPIS SEKVENCE IČ:7:

Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lyz Phe Leu Glu 15 10 15

Gin Cys Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met lle Ser Leu Gin 20 25 30

Val His Arg Pro Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg 35 40 45

Arg Ala Lys Leu Val Gly Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Try Pro 50 55 60

Pro Tre Ala Phe Tre Tre Arg Cys Asp Asn Lyz Tre Cys Phe Pro Gly 65 70 75 80

Leu Tre Tyr Asn Ala Ser lle Ala Arg Phe lle Arg Asp Gly Val Tre 85 90 95

Glu Val lle Pro Ser Ala Pro Asn 100

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA, kódující bílkovinu latentbího viru chmelu, vybraná ze skupiny skládající se z:

a) molekul nukleových kyselin kódujících polypeptid obsahujících sekvenci aminokyselin uvedenou v SEKV. IČ: 6 nebo 7;

b) molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů uvedenou v SEKV. IČ: 1;

c) molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů od nuleotidu 58 až 975, nebo od nukleotidu 981 až 1292 ze sekvence nukleotidů uvedevé v SEKV IČ: 1;

d) molekul nukleových kyselin hybridizujícími s molekulou nukleové kyseliny,která je definována v a), b), nebo c); a

e) molekul nukleových kyselin, u kterých je sekvence nukleotidů vytvořena výsledkem genetického kódu vůči sekvenci nukleotidů molekul nukleové kyseliny, která je definována v a), b), c) nebo d).
2. DNA, která hybridizuje na DNA podle nároku 1 a která kóduje fragment nebo zmutovanou verzi polypeptidu, jak je definováno v nároku 1.
3. Molekula nukleové kyseliny, nejméně 15 nukleotidů dlouhá, hybridizující specificky s DNA podle nároku 1 nebo 2 nebo její komplementární vlákno.
4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, vybraná ze skupiny skládající se z molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů uvedenou v SEKV. IČ: 2, 3, 4 a 5.
5. Vektor obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2.
6. Vektor podle nároku 5, kde DNA je účinně vázána na regulační jednotku, umožňující expresi v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách.
7. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároků 5 nebo 6.

Id
8. Hostitelská buňka podle nároku 7, kterou je bakteriální, houbová, rostlinná nebo živočišná buňka.
9. Způsob výroby polypeptidu latentního viru chmelu nebo fragmentu nebo jeho zmutované verze skládající se z kultivace hostitelských buněk podle nároku 7 a 8 za podmínek dovolujících expresi polypeptidu a získávání produkovaných peptidů z kultury.
10. Polypeptid kódovaný pomocí DNA podle nároku 1 nebo 2 nebo připravený způsobem podle nároku 9.
11. Protilátky rozpoznávající specificky polypeptidy podle nároku 10.
12. Diagnostické složení obsahující DNA, podle nároku 1 nebo 2 .molekulu nukleové kyseliny, podle nároku 3 nebo 4, vektor, podle patentového nároku 5 nebo 6, polypeptid, podle patentového nároku 11 a podmínky vhodné pro detekci.
13. Způsob detekce latentního viru chmelu nebo příbuzného rostlinného viru,v y z n a č u j i c i se t i m, že obsahuje:

a) získání nukleových kyselin z rostlin;

b) amplifikaci cílové nukleové kyseliny reverzní transkripční řetězovou reakcí, používající nukleovou kyselinu z a) jako templát a molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4 jako očko; a volitelně,

c) elektroforetickou analýzu takto získaných amplifikovaných produktů a tím detekci přítomnosti latentního viru chmelu nebo příbuzného viru.
14. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c í se t í m ,že jako očka na amplifikaci cílové nukleové kyseliny jsou vybrány párová očka ze skupiny skládající se z oligonukleotidů, jejichž sekvence nukleových kyselin je uvedena v SEKV. IČ: 2 a 4, SEKV. IČ: 3 a 4, SEKV. IČ: 2 a 5 a SEKV. IČ: 3 a 5 a elektroforetická analýza takto získaných amplifikovaných produktů potvrzuje přítomnost nebo nepřítomnost specifických fragmentů DNA obsahujících 233, 181,

377, respektive 325 párů bází.
15. Způsob detekce latentního viru chmelu, v y z n a č uj í c í se t í m, že zahrnuje

a) extrakci nukleových kyselin z rostlin; a

b) hybridizace nukleové kyseliny, která byla získána s očkem obsahujícím DNA podle nároku 1 nebo 2 a molekuly nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že očko obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo k ní komplementární nukleovou kyselinu prodlouženou s uvedenou nukleovou kyselinou, jako očko.
17. Rostlinné buňky, obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2, nebo molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, eventuálně vektor podle nároku 5 nebo 6.
18. Rostlinné buňky podle nároku 17, v y z n a č u j í c í se t í m, že rostlinou je chmel.
19. Použití DNA podle nároku 1 nebo 2, molekuly nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, eventuálně vektoru podle nároku 5 nebo 6, eventuálně hostitelské buňky podle nároku 7 nebo 8 eventuálně polypeptidu podle nároku 10, eventuálně protilátky podle nároku 11 pro inženýrství patogenní rezistence rostlin.
20. Použití podle patentového nároku 19, v y z n a č u j í c í se t í m, že patogenem je vir.
21. Použití podle nároku 20,vyznačující se tím, že virem je latentní vir chmelu a rostlinou je chmel.