JP2001510689A

JP2001510689A - ホップモザイクウイルス遺伝子およびホップモザイクウイルス検出方法

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Publication number: JP2001510689A
Application number: JP2000504159A
Authority: JP
Inventors: 成志須田; 達児畑谷
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd
Current assignee: Sapporo Breweries Ltd
Priority date: 1998-07-22
Filing date: 1998-07-22
Publication date: 2001-08-07

Abstract

(57)【要約】ＨＭＶ（ホップモザイクウイルス）遺伝子を単離精製するとともに、その塩基配列を解明した。そして、ＨＭＶ遺伝子またはその一部配列を含む精製された核酸を利用して、ＰＣＲやハイブリダイゼーションなどの遺伝子工学技術によりＨＭＶを検出する。従来のＥＬＩＳＡなどの免疫学的な検出方法に比して、簡便かつ確実に検出することが可能となる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、ホップモザイクウイルス（Hop Mosaic Virus、以下、ＨＭＶと略す
る）の遺伝子および遺伝子検出方法に関する。

【０００２】（背景技術）ＨＭＶは、カルラウイルスグループに属する一本鎖ＲＮＡのゲノムからなるホ
ップの病害ウイルスであり、ホップ潜在ウイルス（Hop Latent Virus）と同属の
ひも状ウイルスである。該ウイルスは罹病性ホップ品種に対して、モザイク病徴
を発生させる重要病害である（ Probasco & Skotland,CAN.J.MICROBIOL.22: 116
0-1162(1976), Adams & Barbara,Ann.Appl.Biol.96: 201-208(1980), Adams & B
arbara,Ann.Appl.Biol.101: 495-500.(1982),Yu & Liu,Plant Pathology 36: 38
-44(1987),Kanno et al,Ann.Phyto-path.Soc.Japan 60: 675-680(1994)）。この
ため、ホップを生産する際には、このウイルスに感染していない圃場の調査やウ
イルスフリー苗の検査等が行われている。

【０００３】従来、これらのウイルスフリー苗の保証あるいはウイルス再感染防止のために
圃場調査を行なう場合には、ＥＬＩＳＡのような免疫学的診断方法が用いられて
いた。しかし、ＥＬＩＳＡによるＨＭＶの診断では、抗体の作製や入手が困難で
あり、また、高価であるという問題がある。また、仮に抗体等を入手したとして
も、抗体非特異的反応により診断結果の精度が劣るという問題もある。

【０００４】一方、近年の分子生物学の進展より種々のウイルスの遺伝子配列の解明が進め
られ、ウイルスの種類によっては、遺伝子工学的技術により精度よくウイルスの
検出診断が行なえるようになっている。しかし、ＨＭＶについては、その遺伝子
配列が解明されていないため、上述した免疫学的な手法に頼らざるを得なかった
。

【０００５】そこで、本願発明者らは、鋭意研究を通じてＨＭＶ遺伝子を単離精製するとと
もにその塩基配列を解明した。そして、以下に示すＨＭＶ遺伝子の精製された核
酸及びＨＭＶの遺伝学的検出方法を開発した。

【０００６】（発明の開示）上記の通り、本発明は、ホップモザイクウイルス遺伝子又はその部分断片を含
む精製された核酸を提供する。

【０００７】この精製された核酸を用いることにより、ホップの苗や圃場に存在するウイル
スを遺伝学的手法に基づき検出することができる。例えば、ＰＣＲやハイブリダ
イゼーション法等の遺伝学的手法によれば、僅かに存在するウイルスをも精度よ
く検出することが可能となる。

【０００８】上記精製された核酸は、ホップモザイクウイルスのゲノムＲＮＡから調整する
こともできるが、ｃＤＮＡから調整することもできる。

【０００９】前記ホップモザイクウイルスのｃＤＮＡの塩基配列は、具体的には、配列番号
１に示される１から１８４４塩基を含む配列又はこれと実質的に同一な配列であ
る。ここで実質的に同一な配列とは、ハイブリダイゼーションなどの遺伝学的検
出方法によりホップモザイクウイルスを検出することが可能な配列を意味し、配
列番号１とハイブリッド形成できる配列等が含まれる。すなわち、こうした配列
番号１に実質的に同一な配列は、上記配列番号１に示される核酸を用いてハイブ
リダイゼーション法などの遺伝学的手法により得ることができる。

【００１０】また、上記部分断片としては、例えば、ウイルス粒子の構成成分、外被タンパ
ク質等をコードする遺伝子領域を好適に利用することができる。具体的は、配列
番号１の５２５〜１４４５塩基に相当する３０６残基のアミノ酸配列をコードす
る配列、配列番号１の１４４５〜１７５３塩基に相当する１０２残基のアミノ酸
をコードする配列又は配列番号１の３０２〜５０８塩基に相当する６８残基のア
ミノ酸をコードする配列を用いることができる。これら部分断片を用いる場合に
は、ここに記載した全長を用いることもできるが、例えば、ＰＣＲ法のプライマ
ーやハイブリダーゼション法のプローブとして用いる場合には、短くとも１５塩
基以上であってウイルス検出に適切な長さ、領域を選択することができる。例え
ば、ＰＣＲ法のプライマーやハイブリダーゼション法のプローブ等として用いる
場合には、配列番号２に示す塩基配列や配列番号３に示す塩基配列を好適に使用
することができる。

【００１１】また、本発明は、上述した精製された核酸を用い遺伝学的手法によりホップ検
体にホップモザイクウイルスが感染していることを検出するホップモザイクウイ
ルス検出方法を提供する。

【００１２】本発明の方法によれば、従来の免疫学的な手法に比して、微量の試料で感度よ
くウイルスを検出することができる。上記遺伝学的手法として、例えば、ポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を好適に用いることができる。すなわち、ホップモ
ザイクウイルス遺伝子の部分断片からなる核酸をＰＣＲプライマーとして用いＰ
ＣＲによりホップ検体の核酸を増幅し、次いで増幅産物の長さを測定することに
より、迅速にホップモザイクウイルスの感染を検出することができる。

【００１３】上記ＰＣＲプライマーとしては、例えば、配列番号２及び配列番号３の核酸を
好適に利用することができ、これらをプライマーとして用いた場合には、最終的
に増幅断片として３９５塩基対の特異的ＤＮＡ断片を検出することによりホップ
モザイクウイルスの感染を検出することができる。これら配列番号２及び３の組
合わせに限定することなく、配列番号１の配列から適当な領域を選択してプライ
マーを設計することもできる。また、ホップモザイクウイルスの遺伝子とアニー
リングし、増幅することができる配列であれば、配列番号１、２、３と一部異な
る配列を有するプライマーを用いることができる。

【００１４】ＰＣＲ以外の遺伝学的手法として、ハイブリダイゼーション法を好適に利用す
ることができる。このハイブリダイゼーション法に用いる検出プローブは、ホッ
プモザイクウイルス遺伝子又はその部分断片に基づいて作成する。例えば、この
プローブとしては、配列番号１に記載の核酸、その相補鎖またはこれら一部領域
を用いることができる。この一部領域としては、配列番号３の核酸を好適に使用
することができる。また、配列番号１の配列と一部異なる配列を有する核酸であ
っても、ホップモザイクウイルスとハイブリッド形成をする配列番号１に実質的
に同一の核酸も好適に使用することができる。

【００１５】また、本発明は、上記核酸及び方法に基づき、ホップモザイクウイルスを簡便
に検出することができる検出キットを提供する。例えば、ＰＣＲ法によりＨＭＶ
を検出する場合には、上記核酸以外にポリメラーゼ等のＰＣＲに必要な試薬を含
めることができる。また、必要に応じて陽性、陰性対照サンプルを含めることが
できる。このようにキットとして提供することにより、ホップモザイクウイルス
の検出をより一層簡便に行なうことが可能となる。

【００１６】（発明を実施するための最良の形態）１．ＨＭＶ遺伝子の単離精製及びその塩基配列の決定 (i)ＨＭＶの濃縮ＨＭＶの濃縮は、ＨＭＶ感染ホップから常法により濃縮することができ、例え
ばポリエチレングリコールによる濃縮、有機溶媒や熱処理による清澄化、分画遠
心などによって行うことができる。

【００１７】 (ii) ＨＭＶ濃縮液からのＲＮＡ抽出ＨＭＶ濃縮液からのＲＮＡ抽出は、例えば他の植物ウイルスで主に用いられて
いるＳＤＳ−フェノール法により行うなどの常法により実施することができる。

【００１８】 (iii) ｃＤＮＡのクローニング抽出したＲＮＡをもとにして２本鎖ｃＤＮＡを試験管内で合成する。この２本
鎖ｃＤＮＡの合成は、同属であるカルラウイルスの塩基配列（Mackenzie et al, J.Gen.Virol.:70,1053-1063(1983). Rupasov et al, J.Gen.Virol.:70,1861-18
69(1989). Foster et al, J.Gen.Virol.:71,1877-1880(1990) Memelink et al,
J.Gen.Virol.:71,917-924(1990). Morozov et al, Virology:183,782-785(1991)
. Levay & Zavriev, J.Gen.Virol.:72,2333-2337(1991). Foster & Mills, VIRU
S GENE:6:3,213-220(1992). Cavileer et al, J.Gen.Virol.:75,711-720(1994) ）をもとに設計したプライマーを使用し、逆転写−ＰＣＲを行うことが有効であ
る。ここで合成されたｃＤＮＡは、常法によりプラスミドベクターに組み込むこ
とができる。このプラスミドとしては、ｐＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
IIなどの大腸菌内で自己複製可能なものであればいかなるものも使用することが
できる。

【００１９】クローニング後、プラスミドを大腸菌のコンピテントセルに導入し、目的のプ
ラスミドが導入された細胞を選択後、培養し増殖させる。ここで得られた大腸菌
から常法によりプラスミドを回収し精製する。これらクローニングからプラスミ
ドの回収までの操作は、例えば、Maniatisらの方法（Cold Spring Harbor La
boratory Press、1989）に基づき行なうことができる。

【００２０】 (iv) ＨＭＶゲノム由来ｃＤＮＡの塩基配列の決定上記においてｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドを用いて塩基配列を決
定する。この塩基配列の決定に当たっては、マクサムギルバート法もしくはジデ
オキシ法のいずれの方法を用いてもよい。

【００２１】２．ＨＭＶ感染ホップのウイルス遺伝子診断（１）逆転写−ＰＣＲを用いたウイルス遺伝子診断 (i) プライマーの合成上記の方法により同定されたＨＭＶゲノムの塩基配列又は該塩基配列の相補鎖
配列に基づき、オリゴヌクレオチドを合成し、これをプライマーとして用いる。
ＰＣＲ用のプライマーとして用いるためには、このオリゴヌクレオチドの長さは
、少なくとも１５塩基以上とし、好ましくは１７塩基以上、さらに好ましくは２
０塩基以上とする。プライマーの長さは例えば２０，２５，３０，３５，４５ま
たは５０塩基長とすることができ、これらすべての特定の値及びこれらの間の数
値をも含めることができる。

【００２２】より具体的には、配列番号２または配列番号３の塩基配列を有するプライマー
を好適に利用することができる。また、配列番号２、３に示した塩基配列と全く
同一でなくても、その一部配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして
用いることもできる。すなわち、ＰＣＲは本来、多数の塩基配列の中から特定の
遺伝子情報を得て、そのコピーを増幅するものである。そのため、本発明のプラ
イマーの塩基配列と近似の塩基配列を持ったオリゴヌクレオチドでも、同様にウ
イルス遺伝子診断のプライマーとして用いることができると考えられる。

【００２３】なお、上記オリゴヌクレオチドは、例えばβ−シアノエチルホスホアミダイト
法やチオホスファイト法を用いる市販の自動ＤＮＡ合成装置によって得ることが
できる。

【００２４】 (ii) ホップ検体からの核酸抽出ホップ植物からの核酸は、ウイルス濃縮用緩衝液に検体組織を磨砕・懸濁後、
フェノール処理等を行うことにより抽出することができる。また、上記ホップ検
体は、いかなる生長段階のものも使用することができる。

【００２５】 (iii) 逆転写−ＰＣＲ上記において得られたホップの核酸と上記プライマーを用い、逆転写−ＰＣＲ
によりＨＭＶゲノム由来のＤＮＡの増幅を試みる。このＰＣＲの条件は、例えば
Saikiら、Science,第230巻, 1350-1354頁などの方法を採用することができる。

【００２６】具体的には、ＰＣＲの反応液は、次のように調整することができる。塩化マグ
ネシウム（約１．０ｍＭ、好ましくは約１．５ｍＭから約３．０ｍＭ）、塩化カ
リウム、ゼラチン、牛血清アルブミン、界面活性剤(Tween 20, NP-40, Triton X
-100など)、ジメチルスルホキシドなどを含有する増幅用緩衝液に、２種類のオリゴヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、４種類の塩基(dATP,dTTP, dCTP, dGTP
)、検体であるホップより抽出した核酸を添加する。なお耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、PERKIN ELMER社製の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼなどの市販のもの
を挙げることができる。

【００２７】ＰＣＲの反応は、次の一連の工程を２０〜５０サイクル、好ましくは２５〜４
０サイクル繰り返す。変性工程は、通常９０℃から９５℃、好ましくは約９４℃
から９５℃で約３０秒から約３分間、好ましくは約３０秒から２分間加熱するこ
とにより行う。プライマーのアニーリング工程は、通常３０℃から６０℃、好ま
しくは約３５℃から５５℃で約１分間から約３分間、好ましくは約１分間から約
２分間プライマーとインキュベートすることにより行う。ＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長工程は、通常約７０℃から約７３℃、好ましくは約７２℃から約７３℃
で約３０秒から約４分間、好ましくは約３０秒から約２分間耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理することにより行う。

【００２８】上記のＰＣＲにより得られた増幅ＤＮＡは、電気泳動によって分画される。こ
の電気泳動に用いられる泳動用ゲルは、ＤＮＡのサイズによってアガロースやア
クリルアミド等を選択できる。アガロースゲルを用いる場合には、一般には、約
０．５％から約３％の濃度のものを用いることができる。電気泳動に用いる緩衝
液としては、Ｔｒｉｓ−リン酸系（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ−酢酸
系（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．０）、Ｔｒｉｓ−ホウ酸系（ｐＨ７．５〜ｐＨ８．３
）などが挙げられ、好ましくはＴｒｉｓ−ホウ酸系である。また、必要に応じて
ＥＤＴＡなどを添加することもできる。

【００２９】電気泳動の条件としては、例えば５０Ｖから３００Ｖ、１０分間から１２０分
間、好ましくは１５０Ｖ、３０分間であり、サイズマーカーとしては、例えば１
００ Base-Pair Ladder(Pharmacia 社製)などの市販のものを用いることができ
る。電気泳動後、分画された増幅ＤＮＡは、例えばエチジウムブロミドなどの核
酸と相互作用するフェナントリジン系色素を用いた染色法によって、視覚化した
後検出することができる。該染色色素は、泳動後に添加してもよいが、予め電気
泳動用の緩衝液に添加しておくこともできる。電気泳動終了後に染色を行なう場
合には、ゲルをエチジウムブロミドなどの物質の溶液に約６０分間浸してから暗
所で２５４ｎｍまたは３６６ｎｍの紫外線をゲルに照射して赤色バンドを検出す
る。また、泳動中に染色を行なう場合には、色素、例えばエチジウムブロミドを
泳動用緩衝液に最終濃度として約０．５μｇ／ｍｌを添加する。このように泳動
と同時に染色を行なう場合には、電気泳動中でも暗所で２５４ｎｍまたは３６６
ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって、赤色バンドを検出できる。

【００３０】検出された増幅ＤＮＡの存在の有無によって、ウイルス感染を識別することが
可能である。すなわち、同一プライマーを用いてＰＣＲを行った場合、ウイルス
が感染しているホップ由来のものでは特異的な増幅ＤＮＡが検出されるが、未感
染のホップ由来のものでは特異的な増幅ＤＮＡが検出されない。

【００３１】例えば、上述した配列番号２及び３をプライマーとして用いた場合、感染ホッ
プでは、３９５塩基対の特異的ＤＮＡ断片が増幅される。但し、ＨＭＶが変異を
有する場合には、この特異的ＤＮＡ断片の長さが変動する場合があり得る。

【００３２】（２）ハイブリダイゼーションによる遺伝子診断ＨＭＶゲノム遺伝子の相補配列を有する核酸を化学合成または遺伝子操作によ
り調整し、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、従
来の免疫学的方法と異なる診断を行うことができる。

【００３３】プローブとしては、通常、鎖長２０から数千塩基のものが用いられ、上記ＨＭ
ＶゲノムのｃＤＮＡを制限酵素で切断したＤＮＡフラグメントなどが挙げられる
。これらのプローブは、ハイブリダイゼーションに用いる前に、放射性同位元素
、蛍光物質などのエネルギー放射体、ビオチン、ジゴキシゲニンなどの二次標識
可能な物質、アルカリフォスファターゼなどの酵素などで常法により末端または
内部修飾する。

【００３４】ハイブリダイゼーションに用いるホップ植物からの抽出核酸は、常法により抽
出することができ、例えば、Murray & Thompson, Nucl.Acid Res.,8,4321-4325(
1980)などに記載された通常の核酸抽出方法により行うことができる。得られた核酸は変性処理した後にメンブランフィルターにスポットする。メンブランフィ
ルターとしては、ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターなどが用い
られ、例えばHybond-N+（アマシャム社製）が好ましい。

【００３５】核酸の変性処理は、核酸をホルムアミド、ホルムアルデヒド、ＭＯＰＳ、酢酸
ナトリウム、ＥＤＴＡなどを含有する変性溶液中にて６０〜７０℃、好ましくは
６５℃で５〜２０分間、好ましくは１５分間処理した後急冷して行う。この変性
処理後、２０ＸＳＳＣを加えて混合し、メンブランフィルターにスポットする。

【００３６】スポット後のメンブランフィルターは、ハイブリダイゼーション溶液中で上記
プローブとハイブリッド形成を行なう。ハイブリダイゼーションの条件は、４２
〜６５℃、好ましくは４６℃の温度下で、反応時間を１２〜２０時間、好ましく
は１６時間とする。反応後、メンブランフィルターを洗浄し、乾燥させる。乾燥
後、オートラジオグラフィーなどの検出手段により、スポット位置におけるシグ
ナルの有無を観察する。すなわち、ウイルス感染ホップ由来の核酸（ＤＮＡ＋Ｒ
ＮＡ）は、プローブとハイブリッド形成するためシグナルが検出されるが、未感
染ホップ由来の核酸はプローブと相補する配列がないため、ハイブリッド形成は
せずシグナルは検出されないことになる。

【００３７】３．ＨＭＶ遺伝子の精製された核酸の応用ＨＭＶ遺伝子の精製された核酸は、上述したようなＨＭＶウイルスの検出方法
以外にも、アンチセンス技術による本ウイルス抵抗性ホップの作出にも応用する
ことができる。具体的には、ＨＭＶ遺伝子を発現ベクターにアンチセンスＲＮＡ
を産生可能な方法に接続して、ホップに形質転換する。形質転換されたホップは
、本ウイルスに抵抗性を示すことになる。

【００３８】（実施例）次に、本発明を実施例により詳しく説明するが、本発明はこれにより限定され
るものではない。

【００３９】実施例１：ＨＭＶの濃縮ＨＭＶ感染ホップ(品種;Bullion , ELISAでHMV単独感染を確認)の萌芽茎１００ｇを４倍容の０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２（１％亜硫酸ナトリ
ウムを含む）で磨砕後、ガーゼで濾過し、粗汁液を得た。次に、TritonX-100を８ml加え、１時間攪拌後、３０００Ｘｇで１０分間遠心し、上清を得た。上清に
１／３容量の四塩化炭素を加え、氷中で３分間攪拌し、３００ＯＸｇで１０分間
遠心し、再び上清を得た。得られた上清に２０ｇポリエチレングリコール、２．４ｇ塩化ナトリウを加え、４０分間攪拌後、１時間静置し、３０００Ｘｇで４０分間遠心した沈澱を０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．２（１％ Tri
tonX-100を含む）に懸濁した。さらに、高速遠心（15,000xg 10分間）で上清を得、超遠心（100,000xg 120分間）で沈澱を回収する分画遠心操作を２回繰り返すことによりウイルスと夾雑物を分離し、０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
７．２に再懸濁してＨＭＶ濃縮液として保存した。

【００４０】なお、上記において、特に温度条件が記載されていない操作に関しては、全て
４℃条件下で行った。

【００４１】実施例２：ＨＭＶからのＲＮＡ抽出ＨＭＶ濃縮液からのＲＮＡ抽出は、ＳＤＳ-フェノール法(Proll et al.,Potat
o Research 24,1-10(1981))により行った。

【００４２】実施例１と同様の方法で得られたＨＭＶ濃縮液（１７８μl）に、２０％ＳＤ
Ｓ（１０μl）、２０ＸＳＳＣ（２μl）、プロテアーゼ(20mg/ml)（１０μl）を加えて混合し、３７℃で３０分間保温した。次いで、０．５％ベントナイト懸濁液（１００μl）とＴＥ飽和フェノール（３００μl）を加え、フェノール抽
出を行った。その後、フェノール:クロロホルム混合液(1:1)を等量加え、再びフ
ェノール抽出を行った。水層をクロロホルム抽出した後、得られた水層に３Ｍ酢酸ナトリウム１０μl、冷エタノール２５０μlを加えて混合し、−８０℃で
３０分間静置した。その後、１５，０００Ｘｇで５分間遠心して沈澱を得、７０
％エタノールで遠心洗浄し、エタノールを乾燥除去後、沈澱に蒸留水１００μl を加え溶解し、４Ｍ塩化リチウム１００μlを加え混合後、氷中で一晩静置した。

【００４３】その後、１５，０００Ｘｇで５分間遠心して沈澱を得、再び７０％エタノールで遠心洗浄し、エタノールを乾燥除去後、沈澱に蒸留水２０μlを加え溶解し
、ＲＮＡ試料として保存した。

【００４４】実施例３：ｃＤＮＡのクローニング最初に、同属であるカルラウイルスの塩基配列をもとに、CARORF３プライマー
(5'-TGCCACTTACACCGCCTCCT-3')（配列番号４）とオリゴ-ｄTにアダプターを付加
したAP２プライマー(5'-GCTACCATGGACGTCCGCGCGG(T)１５-3')（配列番号５）、さらにそれに相補性の３NTRAP２プライマー(5'-CGATGGTACCTGCAGGCGCGCC-3')（配列番号６）を合成した。次に、ＲＮＡ試料（３μl）に１０μＭ AP２プライマ
ー（１μl）と蒸留水（７μl）を加え、６５℃で１０分間静置した。その後、急
冷してＲＮＡを変性させ、５ｘ逆転写酵素緩衝液(GIBCO BRL（４μl ）と２．５
ｍＭ dNTP（１μl）、逆転写酵素(200U/μl GIBCO BRL)（１μl）を加え、４２ ℃で１時間の逆転写反応を行った。

【００４５】ＰＣＲを行なうために次の反応溶液を調整した。１０ｘＰＣＲ緩衝液（ベーリ
ンガー社製）（５μl）、２．５ｍＭ dNTP（４μl）、１０μＭ３NTRAP２プライマー（１μl）、１０μＭ CARORF３プライマー（１μl）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（5U/μl：ベーリンガー社製）（１μl）蒸留水（３３μl）。反応条件
は、変性工程を９８℃、３０秒間とし、伸長工程を６８℃、５分間とし、これを
３０サイクルとした。増幅産物は、１／１０量を１．０％アガロースゲル電気泳
動(１xTBE緩衝液)に供試し、約１．８ＫｂのＤＮＡ増幅断片を確認した（図１）
。

【００４６】次に、上記において増幅したＰＣＲ産物を平滑末端化後、ｐＵＣ１１９のＳｍ
ａＩ制限酵素部位に接続した。詳細には、プラスミドｐＵＣ１１９をＳｍａＩ消
化し、かつ、脱リン酸化処理した断片(50ng/μl)（２μl）を調整し、これに平滑末端化したＰＣＲ産物（１μl）を混合する。さらに、この混合液に１０ｍＭＡＴＰ、１０ｘライゲーション緩衝液( ベーリンガー社製)、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ(5U/μl ベーリンガー社製)、蒸留水（１３μl）を加え混合した後、２２℃ で一晩保温し、ライゲーション反応を行った。

【００４７】大腸菌ＭＶ１１８４のコンピテントセルを作製し、コンピテントセル（１００μl）と上記のライゲーション反応液を混合し、氷上で３０分間静置した。次に、４２℃下、６０秒間保温後、直ちに氷中で急冷した。その後、この細胞液に
ＳＯＣ培地５００μlを加え、３７℃で１時間保温した。保温後、細胞液を寒天
培地に均質に植菌し、３７℃で一晩培養した。なお、ここで用いた寒天培地は、
２ｘＹＴ寒天培地に２％Ｘ−ｇａｌ（５０μｌ）、１００ｍＭＩＰＴＧ（５０ μl）及び５０μg/ml アンピシリンを添加したものを用いた。

【００４８】一晩培養後、複数の白色コロニー（ＬａｃＺ⁻）を選択し、それぞれ液体培地
に植菌し培養した。これら培養液から常法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。
約ＨＭＶゲノム由来のｃＤＮＡ断片（１．８Ｋｂ）が挿入されたプラスミドを持
つ大腸菌を選抜、保存した。

【００４９】実施例４：ＨＭＶゲノム由来ｃＤＮＡの塩基配列の決定実施例３で選抜された大腸菌を２ｘＹＴ培地で３７℃ 一晩振湯培養し、常法によりプラスミドを調整し、これを鋳型として用い、ジデオキシ法(Sanger et a
l.,Proc.Natl.Acid.Sci., 74,5463(1977))によりＤＮＡシークエンサー(Li-Cor 社製)およびシークエンスキット(アマシャム社製）で塩基配列を解読して1844塩
基の配列を決定した。この結果を配列番号１に示す。

【００５０】得られた塩基配列から翻訳領域の解析を行なった。その結果、該塩基配列のう
ち分子量約６．９ｋＤのタンパク質（６８アミノ酸）をコードする翻訳領域（配
列表の配列番号１に記載した３０２〜５０８番目の塩基配列）と外被タンパク質
（３０６アミノ酸；分子量３３．９ｋＤ）をコードすると予想される翻訳領域（
配列表の配列番号１に記載した５２５〜１４４５番目の塩基配列）と分子量約１
１．３ｋＤのタンパク質（１０２アミノ酸）をコードする翻訳領域（配列表の配
列番号１に記載した１４４５〜１７５３番目の塩基配列）が確認された。

【００５１】実施例５：ＨＭＶ感染ホップの逆転写ＰＣＲによるウイルス遺伝子診断ＨＭＶ感染ホップ葉(品種;Bullion)およびウイルスフリーホップ葉(同品種)（
０．１ｇ）を０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（１ｍｌ）中で磨砕した。破砕液をクロロホルム抽出後、得られた上清をフェノール処理を行い、
さらに３回のエーテル処理を行った。処理後の溶液にエタノールを添加して、核
酸を沈澱させた。次に、沈澱を７０％エタノールを用いて遠心しながら洗浄し、残存するエタノールを乾燥除去した。乾燥後の核酸を蒸留水（５０μl）に溶
解し、その２μlを用いて逆転写−ＰＣＲに供試した。

【００５２】ＰＣＲ用プライマーは、本塩基配列をもとに設計し、ＡＢＩ社製のＤＮＡシン
セサイザー(Model 380B)を用いて定法により合成した。ここで合成したプライマ
ーの配列を配列表の配列番号２及び３に示した。なお、これらプライマーを以降
１Ｐ、１Ｍと略記する。

【００５３】これらプライマーを用いて逆転写反応を行なった。先ず、１Ｍプライマー２５
ｐＭ、５Ｕの逆転写酵素（ニッポンジーン社製）、前記で調整した２μgのホップ核酸を混合した。混合液に５０ｍＭＴｒｉｓ-塩酸緩衝液(pH8.3)（７５ｍＭＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ2，１０ｍＭ DDT，０．５ｍＭ dNTPを含有）を添加し、３７℃、１時間行った。

【００５４】その後、逆転写産物に０．５U の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ(ベーリンガー社製)と２５ｐＭの増幅用プライマーを加え、ＰＣＲを行った。反応液量は１０μl
とし、反応液の蒸発を防ぐために、約２０μlのミネラルオイルを添加した。

【００５５】ＰＣＲにおける各工程は次の条件で行った。先ず９４℃で３分間保持した後、
変性工程は９４℃で１分間、プライマーのアニーリング工程は５５℃で１分間、
ＤＮＡの伸長工程は７２℃で２分間行うサイクルを３０回行い、７２℃で５分間
保持後、４℃で保存した。

【００５６】上記のポリメラーゼ連鎖反応により得られた増幅ＤＮＡはアガロースゲル電気
泳動法によりそのサイズを分析した。電気泳動は、２％アガロースゲルを用いて
、２ｍＭＥＤＴＡを含有するＴｒｉｓ−ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で、１００Ｖ、３０分間行なった。サイズマーカーとして、Φx174ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｆＩで消化したもの（ニッポンジーン社製）を用いた。

【００５７】電気泳動終了後、泳動ゲルを０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド水溶液に
１０分間浸し、暗所で２５４ｎｍの紫外線をゲルに照射することによって赤色バ
ンドとして検出した。電気泳動分析によって得られた分画パターンを図２に示し
た。

【００５８】アガロースゲル電気泳動の結果、感染ホップでは用いたプライマーに応じて特
異的なＤＮＡ増幅断片（395bp）が得られるが、未感染ホップではこのようなＤＮＡ増幅断片が得られず、両者を区別することができた。

【００５９】実施例６：ドットブロットハイブリダイゼーションによる遺伝子診断以下の操作により、ドットハイブリダイゼーションに供する試料を調整する。

【００６０】ＨＭＶ感染ホップ葉およびウイルスフリーホップ葉（０．１ｇ）を０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（１ｍｌ）中で磨砕した。この磨砕液をク
ロロホルム抽出後、その上清をさらにフェノール処理と３回のエーテル処理を行
った。処理後の溶液にエタノールを添加して核酸を沈澱させた。次に、この沈澱
を７０％エタノール用いて遠心しながら洗浄し、余分なエタノールを乾燥除去した。乾燥後の核酸をＴＥ緩衝液（２０μl）に溶解した。

【００６１】溶解液の一部（２μl）に３倍容の核酸変性溶液（65% ホルムアミト゛、20% ホルムアルテ゛ヒト゛、1.54M MOPS、6.5mM 酢酸ナトリウム、1.3mM EDTA)を添加し、６５℃ １５分間保温した後、急冷した。次に、この溶液に２０ｘＳＳＣ（0.15M塩化ナトリウム、0.015M クエン酸ナトリウム、pH7.0）（８μl）を加えて混合した。この混合液（１０μl）をメンブランフィルター（アマシャム社製、商品名；Hybond-N＋）にスポットし、ド
ットブロットハイブリダイゼーションに供した。

【００６２】プローブは、実施例４で調整した大腸菌由来のプラスミドを制限酵素ＢａｍＨ
ＩとＥｃｏＲＩにより消化した後、精製して用いた。この精製は、消化後のフラ
グメントをアガロースゲルによって分離し、カラム（宝酒造(株)社製、商品名：
Suprec-01ＴＭカラム）でＨＭＶゲノム由来のｃＤＮＡを溶出することにより行なった。

【００６３】次いで、溶出したｃＤＮＡは、ランダムラベリングキット（宝酒造(株)社製）
により［α３２P］dCTPでラベル後、Sephadex G-50カラムを通して未結合の［α
３２P］dCTPを除いた。

【００６４】ハイブリダイゼーションは、５ｘＳＳＣ、１００μg/ml 酵母ｔＲＮＡ (ベーリンガー社製）、０．５％ＳＤＳ、０．１％フィコール、０．１％ PVP、０．
１％ＢＳＡ溶液中で４６℃ 、１６時間の条件で行った。オートラジオグラムの
結果、ＨＭＶ感染ホップ由来のスポットはシグナルが観察されたが、ウイルスフ
リーホップ由来のものにはシグナルは観察されなかった。

【００６５】以上の結果より、シグナルの有無によって、ＨＭＶ感染ホップとウイルスフリ
ーホップを区別できることが確認された。

【００６６】以上の通り、ＨＭＶゲノムの３’末端から１８４４塩基までの遺伝子構造を明
らかにするとともに、本発明のＨＭＶ遺伝子診断方法を開発し、ＨＭＶの精度の
高い検出方法を提供することを可能とした。本発明の遺伝学的な検出方法では、
従来の免疫学的方法において必要とされた複数の検出工程、すなわちＨＭＶの単
離、抗血の作製、抗血清の作製などが不要となり、より迅速にＨＭＶの検出を行
うことが可能なった。また、本発明の遺伝学的な検出方法は、従来のＥＬＩＳＡ
のような免疫学的な方法によりも高い感度、精度でホップにおけるＨＭＶ感染を
診断することが可能となる。さらに、この遺伝子のアンチセンスをホップに形質
転換することなどにより、例えば本ウイルス抵抗性ホップの作出にも貢献するこ
とが可能となる。

【００６７】本願発明の種々の変形及び改良は、上記開示範囲内において可能であることは
明かである。そのため、本願発明の思想の範囲内で本明細書の記載を超えて本願
発明を実施し得ることは理解できるであろう。

【００６８】この出願は、特願平９ー２１２５６８号（１９９７年７月２３日出願）に基づ
くものであり、ここに引用し全て本願に包含される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＰ２、３ＮＴＲＡＰ２及びＣＡＲＯＲＦ３プライマーを用いて
ＲＴ-ＰＣＲにより検出した際のＨＭＶ遺伝子のｃＤＮＡ断片のサイズを示す電気泳動図であって、レーンＭはＤＮＡサイズマーカー（ＳｔｙＩで消化したλＤ
ＮＡ）、レーン１はポテトウイルスＳ、レーン２はホップ潜在ウイルス、レーン
３はホップモザイクウイルス、レーン４は脱イオン水を泳動したパターンを示す
図である。

【図２】実施例５のＨＭＶ遺伝子診断方法におけるＰＣＲ産物を電気泳動
を行なった際の結果を示す図であって、レーンＭはＤＮＡサイズマーカー（Ｈｉ
ｎｆＩで消化したφＸ１７４）、レーン１はＥＬＩＳＡでＨＬＶ及びＨＭＶ陽性
のホップ、レーン２はＥＬＩＳＡでＨＬＶ及びＨＭＶ陰性のホップ、レーン３は
ＥＬＩＳＡでＨＬＶ及びＨＭＶ陽性のホップ、レーン４はＥＬＩＳＡでＨＬＶ及
びＨＭＶ陰性のホップを泳動した結果を示す図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ホップモザイクウイルス遺伝子又はその部分断片を含む単離
精製された核酸。
【請求項２】前記ホップモザイクウイルス遺伝子がホップモザイクウイル
スのｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】前記ホップモザイクウイルスのｃＤＮＡが配列番号１におけ
る１から１８４４塩基を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸。
【請求項４】部分断片が、配列番号１の５２５から１４４５までの塩基に
対応する３０６残基のアミノ酸をコードすることを特徴とする請求項１に記載の
核酸。
【請求項５】部分断片が、配列番号１の１４４５から１７５３までの塩基
に対応する１０２残基のアミノ酸をコードすることを特徴とする請求項１に記載
の核酸。
【請求項６】部分断片が、配列番号１の３０２から５０８までの塩基に対
応する６８残基のアミノ酸をコードすることを特徴とする請求項１に記載の核酸
。
【請求項７】部分断片が、少なくとも１５塩基以上であることを特徴とす
る請求項１に記載の核酸。
【請求項８】部分断片が配列番号２の塩基配列を含むことを特徴とする請
求項１に記載の核酸。
【請求項９】部分断片が配列番号３の塩基配列を含むことを特徴とする請
求項１に記載の核酸。
【請求項１０】部分断片が配列番号２又は３の塩基配列からなることを特
徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】配列番号１の少なくとも１５の連続する塩基を含むことを
特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】前記核酸が前記部分断片であることを特徴とする請求項１
の核酸。
【請求項１３】前記部分断片が少なくとも１５塩基を含むことを特徴とす
る請求項１２の核酸。
【請求項１４】配列番号１中の少なくとも１５の連続する塩基を含む請求
項１３に記載の核酸。
【請求項１５】配列番号２又は３を含むことを特徴とする請求項１４に記
載の核酸。
【請求項１６】配列番号２又は３からなることを特徴とする請求項１４に
記載の核酸。
【請求項１７】ホップ検体中のホップモザイクウイルスの存在を検出する
ための方法であって、前記ホップモザイクウイルス遺伝子又はその部分断片を含む単離精製された核
酸（ａ）と、ホップ検体から得られた核酸（ｂ）を含む検体とを接触させ、前記核酸（ａ）と前記検体中の核酸（ｂ）との間のハイブリッド形成の有無を
判定することを含むホップモザイクウイルス検出方法。
【請求項１８】前記核酸（ａ）が前記部分断片であり、この部分断片が少
なくとも１５ヌクレオチド長を有することを特徴とする請求項１７に記載の検出
方法。
【請求項１９】前記部分断片が配列番号２又は３の配列を含むことを特徴
とする請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２０】前記部分断片が配列番号２又は３の配列からなることを特
徴とする請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２１】前記核酸（ａ）には、制限酵素で切断された配列番号１の
核酸が含まれることを特徴とする請求項１８に記載の検出方法。
【請求項２２】前記検体中におけるホップモザイクウイルスの有無が前記
検出方法を実施する前に未知であることを特徴とする請求項１７に記載の検出方
法。
【請求項２３】ホップ検体中のホップモザイクウイルスの存在を検出する
ための方法であって、前記ホップモザイクウイルス遺伝子又はその少なくとも１５塩基長を有する部
分断片を含む前記単離精製された核酸（ａ）と、ホップ由来の核酸（ｂ）を含む
検体とをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により処理するＰＣＲ処理工程と、前記ポリメラーゼ連鎖反応における前記核酸（ａ）による前記核酸（ｂ）中の
ホップモザイクウイルス遺伝子配列の増幅核酸の有無を検出する検出工程とを含
むホップモザイクウイルス検出方法。
【請求項２４】前記核酸（ａ）が前記部分断片であることを特徴とする請
求項２３に記載の検出方法。
【請求項２５】前記部分断片が配列番号２又は３を含むことを特徴とする
請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２６】前記部分断片が配列番号２又は３からなることを特徴とす
る請求項２４に記載の検出方法。
【請求項２７】前記検出工程において、前記ホップモザイクウイルス遺伝
子の３９５塩基対の断片の有無が検出されることを特徴とする請求項２３に記載
の検出方法。
【請求項２８】請求項１の核酸を含むホップモザイクウイルスの検出用の
キット。