JP3069690B2 - 日本カンキツウイロイド１（ＪＣＶｄ１）遺伝子 - Google Patents
日本カンキツウイロイド１（ＪＣＶｄ１）遺伝子Info
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- JP3069690B2 JP3069690B2 JP10349471A JP34947198A JP3069690B2 JP 3069690 B2 JP3069690 B2 JP 3069690B2 JP 10349471 A JP10349471 A JP 10349471A JP 34947198 A JP34947198 A JP 34947198A JP 3069690 B2 JP3069690 B2 JP 3069690B2
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物に感染する病
原体であるウイロイドの塩基配列に関し、より詳細に
は、カンキツに感染性を有する日本カンキツウイロイド
１のＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、並びに日本カンキツウイロ
イド１の検出方法、及びそれに用いる核酸プローブ及び
核酸プライマーに関する。
原体であるウイロイドの塩基配列に関し、より詳細に
は、カンキツに感染性を有する日本カンキツウイロイド
１のＲＮＡ、そのｃＤＮＡ、並びに日本カンキツウイロ
イド１の検出方法、及びそれに用いる核酸プローブ及び
核酸プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウイロイド（感染性を持つ環状の１本鎖
ＲＮＡ）による植物病害は、近年果樹類で多く発生して
おり、その症状の性質又は程度によって様々な被害をも
たらす。カンキツに対して感染性を示すウイロイドとし
て、カラタチ台木に剥皮の症状を示すカンキツエクソコ
ーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）、カラタチ台カンキツ
に矮化や果実収量の低下をもたらすカンキツウイロイド
（ＣＶｄ）Ｉ、II、III及びIVの計５つのウイロイドグ
ループが存在することが報告されており、その塩基配列
も決定されている（畑谷、植物防疫、第51巻、第４号、
21-25、1997）。さらに、最近になって、日本カンキツ
ウイロイド１（ＪＣＶｄ１）が新たに発見されたが、そ
の塩基配列は未だに決定されていない。
ＲＮＡ）による植物病害は、近年果樹類で多く発生して
おり、その症状の性質又は程度によって様々な被害をも
たらす。カンキツに対して感染性を示すウイロイドとし
て、カラタチ台木に剥皮の症状を示すカンキツエクソコ
ーティスウイロイド（ＣＥＶｄ）、カラタチ台カンキツ
に矮化や果実収量の低下をもたらすカンキツウイロイド
（ＣＶｄ）Ｉ、II、III及びIVの計５つのウイロイドグ
ループが存在することが報告されており、その塩基配列
も決定されている（畑谷、植物防疫、第51巻、第４号、
21-25、1997）。さらに、最近になって、日本カンキツ
ウイロイド１（ＪＣＶｄ１）が新たに発見されたが、そ
の塩基配列は未だに決定されていない。
【０００３】従来、これらのウイロイドを検出するため
には、カンキツウイロイドの検定植物であるエトログシ
トロン系統アリゾナ８６１−Ｓ１を用いた木本検定によ
って、現れてくる病徴の観察を行う方法、若しくは罹病
植物より低分子ＲＮＡを抽出、純化し、電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）によってウイロイド様ＲＮＡを確認する方法
（N. Duran-Vilaら，Proc. 12th Conf. IOCV, Riversid
e, 343-352, 1993）、又はこれらの方法の組合せ（N. D
uran-vilaら、J. gen. Virol., 69, 3069-3080,1988）
が用いられていた。
には、カンキツウイロイドの検定植物であるエトログシ
トロン系統アリゾナ８６１−Ｓ１を用いた木本検定によ
って、現れてくる病徴の観察を行う方法、若しくは罹病
植物より低分子ＲＮＡを抽出、純化し、電気泳動法（Ｐ
ＡＧＥ）によってウイロイド様ＲＮＡを確認する方法
（N. Duran-Vilaら，Proc. 12th Conf. IOCV, Riversid
e, 343-352, 1993）、又はこれらの方法の組合せ（N. D
uran-vilaら、J. gen. Virol., 69, 3069-3080,1988）
が用いられていた。
【０００４】しかしながら、木本検定には観察に６〜９
ヶ月の長期間を要するという欠点があり、また電気泳動
法による方法には十分な感度が得られないという欠点が
ある。さらに、これらの方法では、一度に多数の試料を
取り扱うことが困難であり、正確なウイロイドの同定は
できない。そこで、ウイロイドの検出法として、遺伝子
診断法による検出法が開発された（Maria Esther de No
ronha Fonsecaら，J. Virol. Methods, 57, 203-207, 1
996; N. Yoshikawaら，Ann. Phytopathol. Soc. Jpn.,
62, 119-124, 1996）。この方法によれば、迅速かつ正
確な検定が可能となり、また、一度に多数の試料を取り
扱うことができる。
ヶ月の長期間を要するという欠点があり、また電気泳動
法による方法には十分な感度が得られないという欠点が
ある。さらに、これらの方法では、一度に多数の試料を
取り扱うことが困難であり、正確なウイロイドの同定は
できない。そこで、ウイロイドの検出法として、遺伝子
診断法による検出法が開発された（Maria Esther de No
ronha Fonsecaら，J. Virol. Methods, 57, 203-207, 1
996; N. Yoshikawaら，Ann. Phytopathol. Soc. Jpn.,
62, 119-124, 1996）。この方法によれば、迅速かつ正
確な検定が可能となり、また、一度に多数の試料を取り
扱うことができる。
【０００５】しかし、遺伝子診断法による検出法を行う
には、検出対象となるウイロイドの塩基配列が決定され
ていなければならない。上記の５つのウイロイドグルー
プについては塩基配列が決定されているため、この方法
を使用することができるが、上記ＪＣＶｄ１については
未だに塩基配列が決定されていないので、この方法を適
用することができなかった。
には、検出対象となるウイロイドの塩基配列が決定され
ていなければならない。上記の５つのウイロイドグルー
プについては塩基配列が決定されているため、この方法
を使用することができるが、上記ＪＣＶｄ１については
未だに塩基配列が決定されていないので、この方法を適
用することができなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＪＣ
Ｖｄ１の塩基配列を決定し、遺伝子診断法によるＪＣＶ
ｄ１の検出に利用できる核酸を提供することにある。
Ｖｄ１の塩基配列を決定し、遺伝子診断法によるＪＣＶ
ｄ１の検出に利用できる核酸を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツから分離
したＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いてＪＣＶｄ１由来のＲＮＡ遺伝子
をクローニングし、塩基配列を決定することに成功し、
本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、配列
番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡを提供する。
を達成すべく鋭意検討を行った結果、カンキツから分離
したＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素、ＤＮ
Ａポリメラーゼを用いてＪＣＶｄ１由来のＲＮＡ遺伝子
をクローニングし、塩基配列を決定することに成功し、
本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、配列
番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡを提供する。
【０００８】さらに、本発明は、配列番号１に示される
塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若し
くは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウ
イロイド１の機能を有するＲＮＡを提供する。ここで、
「日本カンキツウイロイド１の機能を有する」とは、配
列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡの示す挙動と
同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動とし
ては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件
下での二次構造（ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造な
ど）、感染することのできる植物、各感染植物において
示す病徴等が挙げられる。このようなＲＮＡの塩基配列
の、配列番号１に示される塩基配列に対する相同性
（％）は９０％以上、好ましくは９５％以上である。
塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若し
くは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウ
イロイド１の機能を有するＲＮＡを提供する。ここで、
「日本カンキツウイロイド１の機能を有する」とは、配
列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡの示す挙動と
同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動とし
ては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件
下での二次構造（ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造な
ど）、感染することのできる植物、各感染植物において
示す病徴等が挙げられる。このようなＲＮＡの塩基配列
の、配列番号１に示される塩基配列に対する相同性
（％）は９０％以上、好ましくは９５％以上である。
【０００９】さらに、本発明は、配列番号２に示される
塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若し
くは挿入されていてもよい塩基配列に相補的な配列を含
み、かつ、日本カンキツウイロイド１のＲＮＡにハイブ
リダイズする一本鎖ＤＮＡを提供する。前記ハイブリダ
イゼーションの条件は特に制限されないが、好ましくは
M. E. N. Fonsecaら（J. Virol. Methods 57, 203-207,
1996）の方法で用いられる条件である。このようなＤ
ＮＡの塩基配列の、配列番号２に示される塩基配列に相
補的な配列に対する相同性（％）は特に制限されない
が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上
である。
塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若し
くは挿入されていてもよい塩基配列に相補的な配列を含
み、かつ、日本カンキツウイロイド１のＲＮＡにハイブ
リダイズする一本鎖ＤＮＡを提供する。前記ハイブリダ
イゼーションの条件は特に制限されないが、好ましくは
M. E. N. Fonsecaら（J. Virol. Methods 57, 203-207,
1996）の方法で用いられる条件である。このようなＤ
ＮＡの塩基配列の、配列番号２に示される塩基配列に相
補的な配列に対する相同性（％）は特に制限されない
が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上
である。
【００１０】さらに、本発明は、上記の一本鎖ＤＮＡを
センス鎖又はアンチセンス鎖として含む二本鎖ＤＮＡを
提供する。さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド
１のＲＮＡと相補性を有する核酸の一部又は全部を含む
核酸プローブを提供する。核酸プローブは、さらに標識
を含むことが好ましい。前記日本カンキツウイロイド１
のＲＮＡは、好ましくは、（１）配列番号１に示される
塩基配列を含むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示さ
れる塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加
若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキ
ツウイロイド１の機能を有するＲＮＡのいずれかであ
る。また、前記核酸プローブは、ＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。さらに、本発明は、上記の核酸プロ
ーブを用いて、日本カンキツウイロイド１を検出する方
法を提供する。該方法では、被検植物中に存在する核酸
が上記の核酸プローブとハイブリダイズするか否かを調
べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド
１の存否を決定することが好ましい。
センス鎖又はアンチセンス鎖として含む二本鎖ＤＮＡを
提供する。さらに、本発明は、日本カンキツウイロイド
１のＲＮＡと相補性を有する核酸の一部又は全部を含む
核酸プローブを提供する。核酸プローブは、さらに標識
を含むことが好ましい。前記日本カンキツウイロイド１
のＲＮＡは、好ましくは、（１）配列番号１に示される
塩基配列を含むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示さ
れる塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加
若しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキ
ツウイロイド１の機能を有するＲＮＡのいずれかであ
る。また、前記核酸プローブは、ＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。さらに、本発明は、上記の核酸プロ
ーブを用いて、日本カンキツウイロイド１を検出する方
法を提供する。該方法では、被検植物中に存在する核酸
が上記の核酸プローブとハイブリダイズするか否かを調
べることにより、被検植物中の日本カンキツウイロイド
１の存否を決定することが好ましい。
【００１１】さらに、本発明は、日本カンキツウイロイ
ド１のＲＮＡ又はその塩基配列においてウラシルがチミ
ンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プライマーを
提供する。前記日本カンキツウイロイド１のＲＮＡは、
好ましくは、（１）配列番号１に示される塩基配列を含
むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示される塩基配列
において１以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入
された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド
１の機能を有するＲＮＡのいずれかである。前記核酸プ
ライマーは、ＤＮＡであることが好ましい。前記核酸プ
ライマーとしては、例えば、配列番号３に示される塩基
配列を含むものが挙げられる。
ド１のＲＮＡ又はその塩基配列においてウラシルがチミ
ンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プライマーを
提供する。前記日本カンキツウイロイド１のＲＮＡは、
好ましくは、（１）配列番号１に示される塩基配列を含
むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示される塩基配列
において１以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入
された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツウイロイド
１の機能を有するＲＮＡのいずれかである。前記核酸プ
ライマーは、ＤＮＡであることが好ましい。前記核酸プ
ライマーとしては、例えば、配列番号３に示される塩基
配列を含むものが挙げられる。
【００１２】さらに、本発明は、日本カンキツウイロイ
ド１のＲＮＡと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プ
ライマーを提供する。前記日本カンキツウイロイド１の
ＲＮＡは、好ましくは、（１）配列番号１に示される塩
基配列を含むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示され
る塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若
しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツ
ウイロイド１の機能を有するＲＮＡのいずれかである。
前記核酸プライマーは、ＤＮＡであることが好ましい。
前記核酸プライマーとしては、例えば、配列番号４に示
される塩基配列を含むものが挙げられる。
ド１のＲＮＡと相補性を有する核酸の一部を含む核酸プ
ライマーを提供する。前記日本カンキツウイロイド１の
ＲＮＡは、好ましくは、（１）配列番号１に示される塩
基配列を含むＲＮＡ、又は、（２）配列番号１に示され
る塩基配列において１以上の塩基が置換、欠失、付加若
しくは挿入された塩基配列を含み、かつ、日本カンキツ
ウイロイド１の機能を有するＲＮＡのいずれかである。
前記核酸プライマーは、ＤＮＡであることが好ましい。
前記核酸プライマーとしては、例えば、配列番号４に示
される塩基配列を含むものが挙げられる。
【００１３】さらに、本発明は、日本カンキツウイロイ
ド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウラシルが
チミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プライマ
ー、及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相補性を
有する核酸の一部を含む核酸プライマーを用いて、日本
カンキツウイロイド１を検出する方法を提供する。該方
法では、被検植物中に存在する核酸が日本カンキツウイ
ロイド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウラシ
ルがチミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プラ
イマー及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相補性
を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増幅さ
れるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カン
キツウイロイド１の存否を決定することができる。
ド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウラシルが
チミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プライマ
ー、及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相補性を
有する核酸の一部を含む核酸プライマーを用いて、日本
カンキツウイロイド１を検出する方法を提供する。該方
法では、被検植物中に存在する核酸が日本カンキツウイ
ロイド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウラシ
ルがチミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸プラ
イマー及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相補性
を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増幅さ
れるか否かを調べることにより、被検植物中の日本カン
キツウイロイド１の存否を決定することができる。
【００１４】さらに、該方法では、被検植物中に存在す
るＲＮＡから、日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相
補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーによりｃ
ＤＮＡが合成され、さらにこのｃＤＮＡが日本カンキツ
ウイロイド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウ
ラシルがチミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸
プライマー及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相
補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増
幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本
カンキツウイロイド１の存否を決定することができる。
ｃＤＮＡの合成に用いる核酸プライマーとしては、例え
ば、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドが挙げられる。増幅に用いる核酸プライマーとし
ては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチド及び配列番号４に示される塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
るＲＮＡから、日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相
補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーによりｃ
ＤＮＡが合成され、さらにこのｃＤＮＡが日本カンキツ
ウイロイド１のＲＮＡ若しくはその塩基配列においてウ
ラシルがチミンに置き換わったＤＮＡの一部を含む核酸
プライマー及び日本カンキツウイロイド１のＲＮＡと相
補性を有する核酸の一部を含む核酸プライマーにより増
幅されるか否かを調べることにより、被検植物中の日本
カンキツウイロイド１の存否を決定することができる。
ｃＤＮＡの合成に用いる核酸プライマーとしては、例え
ば、配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチドが挙げられる。増幅に用いる核酸プライマーとし
ては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチド及び配列番号４に示される塩基配列を
含むオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
ＪＣＶｄ１のＲＮＡは、ＪＣＶｄ１感染樹から抽出する
ことができる。該感染樹としては、感染の事実が確認さ
れているものであればよく、発病の有無を問わない。樹
木の種類としては、ＪＣＶｄ１が感染できるものであれ
ばよく、特に限定しないが、好ましくはカンキツ、より
好ましくはウンシュウミカン、オレンジ、エトログシト
ロン等を用いる。「カンキツ」とは、一般的にミカン科
ミカン亜科（Rutaceae Lignosae）に属する植物を意味
し、例としては、ウンシュウミカン、オレンジ、カラタ
チ等が挙げられる。
ＪＣＶｄ１のＲＮＡは、ＪＣＶｄ１感染樹から抽出する
ことができる。該感染樹としては、感染の事実が確認さ
れているものであればよく、発病の有無を問わない。樹
木の種類としては、ＪＣＶｄ１が感染できるものであれ
ばよく、特に限定しないが、好ましくはカンキツ、より
好ましくはウンシュウミカン、オレンジ、エトログシト
ロン等を用いる。「カンキツ」とは、一般的にミカン科
ミカン亜科（Rutaceae Lignosae）に属する植物を意味
し、例としては、ウンシュウミカン、オレンジ、カラタ
チ等が挙げられる。
【００１６】樹木がＪＣＶｄ１に感染しているかどうか
は、公知の方法により確認することができ、例えば、電
気泳動を行うことにより確認することができる。上記の
抽出に使用できるＪＣＶｄ１感染樹の例としては、例え
ば、ＪＣＶｄ１感染エトログシトロン系統アリゾナ８６
１−Ｓ１（Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.）が挙
げられる。抽出に用いる樹木の部分としては、ＪＣＶｄ
１が存在する可能性のある部分であればよいが、好まし
くは樹皮及び／又は葉を用いる。さらに、これらの樹皮
及び／又は葉は、核酸抽出を効率よく行うことができる
ように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素
を用いて粉砕することができる。
は、公知の方法により確認することができ、例えば、電
気泳動を行うことにより確認することができる。上記の
抽出に使用できるＪＣＶｄ１感染樹の例としては、例え
ば、ＪＣＶｄ１感染エトログシトロン系統アリゾナ８６
１−Ｓ１（Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.）が挙
げられる。抽出に用いる樹木の部分としては、ＪＣＶｄ
１が存在する可能性のある部分であればよいが、好まし
くは樹皮及び／又は葉を用いる。さらに、これらの樹皮
及び／又は葉は、核酸抽出を効率よく行うことができる
ように粉砕しておくことが好ましく、例えば、液体窒素
を用いて粉砕することができる。
【００１７】ＪＣＶｄ１のＲＮＡを抽出する方法として
は、公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定しな
いが、好ましくは抽出用緩衝液として知られる種々の溶
液を用いることができる。本発明に使用する好適な抽出
用緩衝液としては、例えば、0.83%ドデシル硫酸ナトリ
ウム、5％ポリビニルピロリドン、1M塩化リチウム、0.0
17M EDTA pH7.0、1.4％２−メルカプトエタノールを含
む0.13M Tris-HCl緩衝液（pH 8.9）が挙げられる。この
際に、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを十分に抽出するためには、
該抽出用緩衝液中で磨砕処理を行うことが好ましい。こ
の処理は公知の方法を用いて行うことができる。このよ
うにして得られる試料から、遠心分離などの公知の方法
を用いて液体だけを回収し、該液体から、エタノール沈
殿又はイソプロパノール沈殿などの公知の方法を用いて
核酸を濃縮することができる。さらに核酸分子を濃縮す
るために、濃縮した核酸を再び抽出緩衝液などの溶液に
懸濁し、フェノール、クロロホルム、フェノール／クロ
ロホルム等によって抽出した後、エタノール沈殿法、イ
ソプロパノール沈殿法等によって沈殿させてもよい。ま
た、抽出用緩衝液によりＪＣＶｄ１のＲＮＡを抽出した
後に、遠心分離、沈殿及び再懸濁を行うことなく、直接
フェノール、クロロホルム、フェノール／クロロホルム
等による抽出を行ってもよい。以上のようにして、ＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡを含有する粗抽出核酸試料を得ることが
できる。
は、公知のいずれの方法を用いてもよく、特に限定しな
いが、好ましくは抽出用緩衝液として知られる種々の溶
液を用いることができる。本発明に使用する好適な抽出
用緩衝液としては、例えば、0.83%ドデシル硫酸ナトリ
ウム、5％ポリビニルピロリドン、1M塩化リチウム、0.0
17M EDTA pH7.0、1.4％２−メルカプトエタノールを含
む0.13M Tris-HCl緩衝液（pH 8.9）が挙げられる。この
際に、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを十分に抽出するためには、
該抽出用緩衝液中で磨砕処理を行うことが好ましい。こ
の処理は公知の方法を用いて行うことができる。このよ
うにして得られる試料から、遠心分離などの公知の方法
を用いて液体だけを回収し、該液体から、エタノール沈
殿又はイソプロパノール沈殿などの公知の方法を用いて
核酸を濃縮することができる。さらに核酸分子を濃縮す
るために、濃縮した核酸を再び抽出緩衝液などの溶液に
懸濁し、フェノール、クロロホルム、フェノール／クロ
ロホルム等によって抽出した後、エタノール沈殿法、イ
ソプロパノール沈殿法等によって沈殿させてもよい。ま
た、抽出用緩衝液によりＪＣＶｄ１のＲＮＡを抽出した
後に、遠心分離、沈殿及び再懸濁を行うことなく、直接
フェノール、クロロホルム、フェノール／クロロホルム
等による抽出を行ってもよい。以上のようにして、ＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡを含有する粗抽出核酸試料を得ることが
できる。
【００１８】さらに、ＪＣＶｄ１のＲＮＡの純度を上げ
るために、上記の粗抽出核酸試料を精製処理することが
できる。この精製処理は公知の方法を用いて行うことが
でき、特に限定しないが、例えば、塩化リチウム水溶液
を用いる低分子核酸抽出法によって行う。さらに、試料
中のＤＮＡを分解するために、ＤＮａｓｅ等の酵素を用
いて処理することが好ましく、これは公知の方法により
行うことができる。このような処理によって得られる液
体試料から、上記のフェノール／クロロホルム抽出及び
エタノール沈殿などの方法を適宜用いて、精製核酸試料
を得ることができる。
るために、上記の粗抽出核酸試料を精製処理することが
できる。この精製処理は公知の方法を用いて行うことが
でき、特に限定しないが、例えば、塩化リチウム水溶液
を用いる低分子核酸抽出法によって行う。さらに、試料
中のＤＮＡを分解するために、ＤＮａｓｅ等の酵素を用
いて処理することが好ましく、これは公知の方法により
行うことができる。このような処理によって得られる液
体試料から、上記のフェノール／クロロホルム抽出及び
エタノール沈殿などの方法を適宜用いて、精製核酸試料
を得ることができる。
【００１９】精製核酸試料からＪＣＶｄ１のＲＮＡを単
離するため、該試料をさらに分離する。分離に用いる方
法としては公知の方法を使用することができるが、好ま
しくは電気泳動法を使用することができる。本発明に使
用することのできる分離法の例としては、例えば、シー
クエンシャルポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ｓＰ
ＡＧＥ）（Roistacherら、Graft-transmissible diseas
es of citrus: Handbook for detection and diagnosi
s, FAO, Rome, 286pp, 1991）が挙げられる。ウイロイ
ドＲＮＡは、未変性条件ゲル内では分子内結合によって
棒状構造をとるが、変性条件ゲル内では分子内結合の切
断によって環状構造をとる。従って、ウイロイドＲＮＡ
は、変性条件ゲルでの電気泳動では、未変性条件ゲルを
用いる場合に比べて著しく遅く泳動される。このウイロ
イドＲＮＡの性質を利用して、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを電
気泳動法を用いて特定する方法は、当業者であれば容易
に確立することができる。また、電気泳動における特性
の知られている他のウイロイド分子との比較によって、
ＪＣＶｄ１のＲＮＡを特定することもできる。以上のよ
うにして、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを単離することができ
る。
離するため、該試料をさらに分離する。分離に用いる方
法としては公知の方法を使用することができるが、好ま
しくは電気泳動法を使用することができる。本発明に使
用することのできる分離法の例としては、例えば、シー
クエンシャルポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ｓＰ
ＡＧＥ）（Roistacherら、Graft-transmissible diseas
es of citrus: Handbook for detection and diagnosi
s, FAO, Rome, 286pp, 1991）が挙げられる。ウイロイ
ドＲＮＡは、未変性条件ゲル内では分子内結合によって
棒状構造をとるが、変性条件ゲル内では分子内結合の切
断によって環状構造をとる。従って、ウイロイドＲＮＡ
は、変性条件ゲルでの電気泳動では、未変性条件ゲルを
用いる場合に比べて著しく遅く泳動される。このウイロ
イドＲＮＡの性質を利用して、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを電
気泳動法を用いて特定する方法は、当業者であれば容易
に確立することができる。また、電気泳動における特性
の知られている他のウイロイド分子との比較によって、
ＪＣＶｄ１のＲＮＡを特定することもできる。以上のよ
うにして、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを単離することができ
る。
【００２０】次いで、単離されたＪＣＶｄ１のＲＮＡに
基づいてｃＤＮＡ合成を行い、クローニング及び部分的
な配列決定を行う。ｃＤＮＡ合成の方法としては公知の
方法を用いることができ、特に限定しないが、例えば、
ランダムプライマーを使用する方法を用いることができ
る。この際に、cDNA Synthesis Kits（ベーリンガーマ
ンハイム社製）などの市販のキットを用いてもよい。
基づいてｃＤＮＡ合成を行い、クローニング及び部分的
な配列決定を行う。ｃＤＮＡ合成の方法としては公知の
方法を用いることができ、特に限定しないが、例えば、
ランダムプライマーを使用する方法を用いることができ
る。この際に、cDNA Synthesis Kits（ベーリンガーマ
ンハイム社製）などの市販のキットを用いてもよい。
【００２１】合成したｃＤＮＡをクローニングする方法
としては公知の方法を用いることができる。例えば、適
切なベクターにライゲーションした後に、該ベクターを
大腸菌などの適切な宿主に導入してもよい。この場合に
は、ベクターとしては、例えば、pBluescript（Stratag
ene）などの公知のベクターを適切な制限酵素で消化し
たものを用いることができる。ライゲーションの方法と
しては、当業者であれば適切な方法を選択することがで
きるため、特に限定しないが、例えば、ライゲーション
キット（宝酒造社製）などの市販のキットを用いること
ができる。宿主への導入については、当業者に公知のい
ずれの方法をも用いることができ、例えば、E. coli Co
mpetent Cells JM109（宝酒造社製）などの市販のキッ
トを用いてもよい。
としては公知の方法を用いることができる。例えば、適
切なベクターにライゲーションした後に、該ベクターを
大腸菌などの適切な宿主に導入してもよい。この場合に
は、ベクターとしては、例えば、pBluescript（Stratag
ene）などの公知のベクターを適切な制限酵素で消化し
たものを用いることができる。ライゲーションの方法と
しては、当業者であれば適切な方法を選択することがで
きるため、特に限定しないが、例えば、ライゲーション
キット（宝酒造社製）などの市販のキットを用いること
ができる。宿主への導入については、当業者に公知のい
ずれの方法をも用いることができ、例えば、E. coli Co
mpetent Cells JM109（宝酒造社製）などの市販のキッ
トを用いてもよい。
【００２２】部分的な配列決定は、上述のようにして得
たクローンを用いて、公知の方法により行うことができ
る。通常用いられる方法に従えば、クローンから目的の
インサートを含むプラスミドを抽出し、これを用いて適
切な方法により配列決定を行う。プラスミドの抽出方法
としては、例えば、少量迅速調製法を用いることができ
る。多くの場合には、複数のプラスミドが得られるが、
これらのサイズについては、例えば、電気泳動法などの
公知の方法を用いて確認することができる。得られるプ
ラスミドに含まれるインサートの配列決定の方法として
は、公知のいずれの方法を用いてもよいが、好ましくは
ジデオキシ法を用いる。以上のようにして、ＪＣＶｄ１
のｃＤＮＡの部分的な塩基配列を決定することができ
る。また、ＪＣＶｄ１のＲＮＡは、ＪＣＶｄ１のｃＤＮ
Ａの塩基配列中のＴをＵに置換したものであるので、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡの塩基配列も決定される。
たクローンを用いて、公知の方法により行うことができ
る。通常用いられる方法に従えば、クローンから目的の
インサートを含むプラスミドを抽出し、これを用いて適
切な方法により配列決定を行う。プラスミドの抽出方法
としては、例えば、少量迅速調製法を用いることができ
る。多くの場合には、複数のプラスミドが得られるが、
これらのサイズについては、例えば、電気泳動法などの
公知の方法を用いて確認することができる。得られるプ
ラスミドに含まれるインサートの配列決定の方法として
は、公知のいずれの方法を用いてもよいが、好ましくは
ジデオキシ法を用いる。以上のようにして、ＪＣＶｄ１
のｃＤＮＡの部分的な塩基配列を決定することができ
る。また、ＪＣＶｄ１のＲＮＡは、ＪＣＶｄ１のｃＤＮ
Ａの塩基配列中のＴをＵに置換したものであるので、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡの塩基配列も決定される。
【００２３】ＪＣＶｄ１のｃＤＮＡの部分的塩基配列に
基づいて１組のプライマーを合成し、該プライマーを用
いてＪＣＶｄ１のｃＤＮＡを増幅する。プライマーの合
成は、公知の方法を用いて行うことができ、その方法に
ついては特に限定しない。合成するプライマーの配列
は、上記の部分的塩基配列に基づいて、適切と思われる
ものでよいが、適切な例を挙げれば、以下のような配列
がある。
基づいて１組のプライマーを合成し、該プライマーを用
いてＪＣＶｄ１のｃＤＮＡを増幅する。プライマーの合
成は、公知の方法を用いて行うことができ、その方法に
ついては特に限定しない。合成するプライマーの配列
は、上記の部分的塩基配列に基づいて、適切と思われる
ものでよいが、適切な例を挙げれば、以下のような配列
がある。
【００２４】 CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） CB3-TP：5'-CGTGTGGTTCCTGTGGGTCA-3' （配列番号５） CB3-TM：5'-GAGTTTCCTCCGGGGAAACA-3' （配列番号６） これらのプライマーは、CB3-CPとCB3-CMの組合せ及びCB
3-TPとCB3-TMの組合せで用いることができ、CB3-CP及び
CB3-TPはフォワードプライマー、CB3-CM及びCB3-TMはリ
バースプライマーである。
3-TPとCB3-TMの組合せで用いることができ、CB3-CP及び
CB3-TPはフォワードプライマー、CB3-CM及びCB3-TMはリ
バースプライマーである。
【００２５】増幅用の鋳型となるｃＤＮＡは公知の方法
により合成することができる。本発明の場合には、例え
ば、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型として使用し、ＲＮＡ-
ＰＣＲキット（宝酒造社製）などの市販のキットを用い
て合成することができる。この際に使用するプライマー
としては、例えば、ランダムプライマーが挙げられる。
このようにして得られる一本鎖ｃＤＮＡ及びＪＣＶｄ１
のＲＮＡを鋳型として使用し、上述のプライマーを用い
て、ＪＣＶｄ１のｃＤＮＡを増幅する。増幅に用いる方
法としては、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を用いる。ＰＣＲを行う方法としては公知の方法を
用いることができ、特に限定しないが、例えば、TaKaRa
Taq（宝酒造社製）などの市販のＰＣＲキットを用いる
ことができる。この際に使用するプライマーとしては、
例えば、上述のCB3-CPとCB3-CMの組合せ、又はCB3-TPと
CB3-TMの組合せが挙げられる。以上のようにして、ＪＣ
Ｖｄ１のｃＤＮＡを増幅することができる。
により合成することができる。本発明の場合には、例え
ば、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型として使用し、ＲＮＡ-
ＰＣＲキット（宝酒造社製）などの市販のキットを用い
て合成することができる。この際に使用するプライマー
としては、例えば、ランダムプライマーが挙げられる。
このようにして得られる一本鎖ｃＤＮＡ及びＪＣＶｄ１
のＲＮＡを鋳型として使用し、上述のプライマーを用い
て、ＪＣＶｄ１のｃＤＮＡを増幅する。増幅に用いる方
法としては、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）を用いる。ＰＣＲを行う方法としては公知の方法を
用いることができ、特に限定しないが、例えば、TaKaRa
Taq（宝酒造社製）などの市販のＰＣＲキットを用いる
ことができる。この際に使用するプライマーとしては、
例えば、上述のCB3-CPとCB3-CMの組合せ、又はCB3-TPと
CB3-TMの組合せが挙げられる。以上のようにして、ＪＣ
Ｖｄ１のｃＤＮＡを増幅することができる。
【００２６】次いで、増幅したｃＤＮＡの塩基配列を決
定し、最終的にＪＣＶｄ１のＲＮＡの全塩基配列を決定
する。配列決定は、上述のようにして得た増幅産物を用
いて、公知の方法により行うことができる。このような
方法としては、例えば、それぞれの増幅に用いたプライ
マーセットを使用するダイレクトシークエンス法が挙げ
られる。
定し、最終的にＪＣＶｄ１のＲＮＡの全塩基配列を決定
する。配列決定は、上述のようにして得た増幅産物を用
いて、公知の方法により行うことができる。このような
方法としては、例えば、それぞれの増幅に用いたプライ
マーセットを使用するダイレクトシークエンス法が挙げ
られる。
【００２７】以上のようにして決定される各クローンの
配列を相互に比較することにより、ＪＣＶｄ１のｃＤＮ
Ａの全塩基配列を決定することができ、したがって、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡの全塩基配列を決定することができ
る。この全塩基配列の決定は、当業者であれば容易に行
うことができる。このようにして決定される塩基配列の
例としては、例えば、配列番号１のＲＮＡ配列及び配列
番号２のｃＤＮＡ配列が挙げられる。
配列を相互に比較することにより、ＪＣＶｄ１のｃＤＮ
Ａの全塩基配列を決定することができ、したがって、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡの全塩基配列を決定することができ
る。この全塩基配列の決定は、当業者であれば容易に行
うことができる。このようにして決定される塩基配列の
例としては、例えば、配列番号１のＲＮＡ配列及び配列
番号２のｃＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２８】ＪＣＶｄ１のＲＮＡの塩基配列を、カンキ
ツに感染する他のウイロイドの塩基配列と比較した結
果、ＣＶｄIIIに属するウイロイド（Rakowskiら、J. Ge
n. Virol., 75, 3581-3584,1994、Stasysら、FEBS Lett
ers, 358, 182-184, 1995）と最も近似していたが、そ
の相同性は約６７％という低い値であった。その他の既
知のウイロイドで塩基配列が近似しているもとしては、
apple dimple fruit viroid（Di Serioら、J. Gen. Vir
ol., 77, 2833-2837, 1996）があったが、約６９％の相
同性しかなかった。以上のように、ＪＣＶｄ１のＲＮＡ
は既知のウイロイドとは異なる新規なＲＮＡである。
ツに感染する他のウイロイドの塩基配列と比較した結
果、ＣＶｄIIIに属するウイロイド（Rakowskiら、J. Ge
n. Virol., 75, 3581-3584,1994、Stasysら、FEBS Lett
ers, 358, 182-184, 1995）と最も近似していたが、そ
の相同性は約６７％という低い値であった。その他の既
知のウイロイドで塩基配列が近似しているもとしては、
apple dimple fruit viroid（Di Serioら、J. Gen. Vir
ol., 77, 2833-2837, 1996）があったが、約６９％の相
同性しかなかった。以上のように、ＪＣＶｄ１のＲＮＡ
は既知のウイロイドとは異なる新規なＲＮＡである。
【００２９】ＪＣＶｄ１のＲＮＡ又はｃＤＮＡは、以上
のようにして得ることができるが、本発明によって提供
される塩基配列、ＲＮＡについては配列番号１の塩基配
列、ＤＮＡについては配列番号２の塩基配列、に基づい
て、公知の他の方法により調製することもできる。ま
た、以下のプライマーを用いて、植物から抽出したＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅を行っ
てもよい。ＰＣＲ増幅の具体的な方法としては、好まし
くはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いる。
のようにして得ることができるが、本発明によって提供
される塩基配列、ＲＮＡについては配列番号１の塩基配
列、ＤＮＡについては配列番号２の塩基配列、に基づい
て、公知の他の方法により調製することもできる。ま
た、以下のプライマーを用いて、植物から抽出したＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡを鋳型として、ＰＣＲによる増幅を行っ
てもよい。ＰＣＲ増幅の具体的な方法としては、好まし
くはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）を用いる。
【００３０】 CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） CB3-TP：5'-CGTGTGGTTCCTGTGGGTCA-3' （配列番号５） CB3-TM：5'-GAGTTTCCTCCGGGGAAACA-3' （配列番号６） なお、プライマーとしてCB3-CPとCB3-CMの組合せを用い
て得られた第一の増幅産物は、配列番号２中の塩基第８
３番〜第８２番（すなわち、配列番号２で示される塩基
配列を有する環状ＤＮＡを、塩基第８２番と第８３番の
間で切断したもの）を含み、CB3-TPとCB3-TMの組合せを
用いて得られた第二の増幅産物は、配列番号２中の塩基
第１２番〜第１１番（すなわち、配列番号２で示される
塩基配列を有する環状ＤＮＡを、塩基第１１番と第１２
番の間で切断したもの）を含む。これらの増幅産物から
本発明のＲＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡを調製するために
は、上記第一の増幅産物及び上記第二の増幅産物を制限
酵素MspＩでそれぞれ消化し、得られる２つの断片をDNA
Ligation Kit Ver2 （Takara）などを用いてライゲー
ションすることができる。
て得られた第一の増幅産物は、配列番号２中の塩基第８
３番〜第８２番（すなわち、配列番号２で示される塩基
配列を有する環状ＤＮＡを、塩基第８２番と第８３番の
間で切断したもの）を含み、CB3-TPとCB3-TMの組合せを
用いて得られた第二の増幅産物は、配列番号２中の塩基
第１２番〜第１１番（すなわち、配列番号２で示される
塩基配列を有する環状ＤＮＡを、塩基第１１番と第１２
番の間で切断したもの）を含む。これらの増幅産物から
本発明のＲＮＡ及び二本鎖ｃＤＮＡを調製するために
は、上記第一の増幅産物及び上記第二の増幅産物を制限
酵素MspＩでそれぞれ消化し、得られる２つの断片をDNA
Ligation Kit Ver2 （Takara）などを用いてライゲー
ションすることができる。
【００３１】本発明のＲＮＡの塩基配列は配列番号１に
示されるものに限定されるものではなく、実質的にＪＣ
Ｖｄ１として機能するものであれば、１以上の塩基が置
換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。ここで、
「日本カンキツウイロイド１の機能を有する」とは、配
列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡの示す挙動と
同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動とし
ては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件
下での二次構造（ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造な
ど）、感染することのできる植物、各感染植物において
示す病徴等が挙げられる。このようなＲＮＡの塩基配列
の、配列番号１に示される塩基配列に対する相同性
（％）は９０％以上、好ましくは９５％以上である。同
様に、本発明の一本鎖ｃＤＮＡの塩基配列は配列番号２
に示されるものに相補的な配列に限定されるものではな
く、本発明のＲＮＡにハイブリダイズするものであれ
ば、１以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されてい
てもよい。前記ハイブリダイゼーションの条件は特に制
限されないが、好ましくはM. E. N. Fonsecaら（J. Vir
ol.Methods 57, 203-207, 1996）の方法で用いられる条
件（すなわち、0.1％(w/v)Ｍ−ラウロイルサルコシン、
0.02％(w/v)ＳＤＳ、及びDIG nucleic acid detection
kit（ベーリンガーマンハイム社製）に含まれる１％(w/
v)ブロッキング試薬を含む５×ＳＳＣ）と同一の条件で
ある。このようなＤＮＡの塩基配列の、配列番号１に示
される塩基配列に相補的な配列に対する相同性（％）は
特に制限されないが、好ましくは８０％以上、より好ま
しくは９０％以上である。また、本発明の二本鎖ｃＤＮ
Ａは、上記一本鎖ｃＤＮＡをセンス鎖又はアンチセンス
鎖として含むものであるため、その塩基配列において上
記一本鎖ｃＤＮＡと同様の置換、欠失、付加又は挿入が
あってもよい。このような、配列番号１又は２に示され
る塩基配列に対して１以上の塩基が置換、欠失、付加又
は挿入されている塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ
は、部位特異的変異誘発法（Zollerら, Nucleic Acids
Res., Vol. 10, No. 20, 6487-6500 (1982)）によっ
て、当業者であれば容易に調製することができる。
示されるものに限定されるものではなく、実質的にＪＣ
Ｖｄ１として機能するものであれば、１以上の塩基が置
換、欠失、付加又は挿入されていてもよい。ここで、
「日本カンキツウイロイド１の機能を有する」とは、配
列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡの示す挙動と
同一の挙動を示すことを意味する。ここでいう挙動とし
ては、例えば、電気泳動したときの泳動度、未変性条件
下での二次構造（ヘアピン構造、ハンマーヘッド構造な
ど）、感染することのできる植物、各感染植物において
示す病徴等が挙げられる。このようなＲＮＡの塩基配列
の、配列番号１に示される塩基配列に対する相同性
（％）は９０％以上、好ましくは９５％以上である。同
様に、本発明の一本鎖ｃＤＮＡの塩基配列は配列番号２
に示されるものに相補的な配列に限定されるものではな
く、本発明のＲＮＡにハイブリダイズするものであれ
ば、１以上の塩基が置換、欠失、付加又は挿入されてい
てもよい。前記ハイブリダイゼーションの条件は特に制
限されないが、好ましくはM. E. N. Fonsecaら（J. Vir
ol.Methods 57, 203-207, 1996）の方法で用いられる条
件（すなわち、0.1％(w/v)Ｍ−ラウロイルサルコシン、
0.02％(w/v)ＳＤＳ、及びDIG nucleic acid detection
kit（ベーリンガーマンハイム社製）に含まれる１％(w/
v)ブロッキング試薬を含む５×ＳＳＣ）と同一の条件で
ある。このようなＤＮＡの塩基配列の、配列番号１に示
される塩基配列に相補的な配列に対する相同性（％）は
特に制限されないが、好ましくは８０％以上、より好ま
しくは９０％以上である。また、本発明の二本鎖ｃＤＮ
Ａは、上記一本鎖ｃＤＮＡをセンス鎖又はアンチセンス
鎖として含むものであるため、その塩基配列において上
記一本鎖ｃＤＮＡと同様の置換、欠失、付加又は挿入が
あってもよい。このような、配列番号１又は２に示され
る塩基配列に対して１以上の塩基が置換、欠失、付加又
は挿入されている塩基配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ
は、部位特異的変異誘発法（Zollerら, Nucleic Acids
Res., Vol. 10, No. 20, 6487-6500 (1982)）によっ
て、当業者であれば容易に調製することができる。
【００３２】すでに、幾つかのカンキツウイロイドで
は、決定された塩基配列を基に、ＲＴ−ＰＣＲなど様々
な方法で遺伝子診断できることが報告されている（畑谷
ら、植物防疫, 第51巻, 第4号, 21-25,1997）。従っ
て、本発明のＪＣＶｄ１のＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利
用することにより、ＪＣＶｄ１の遺伝子診断に利用でき
る核酸プローブやプライマーを設計することができる。
は、決定された塩基配列を基に、ＲＴ−ＰＣＲなど様々
な方法で遺伝子診断できることが報告されている（畑谷
ら、植物防疫, 第51巻, 第4号, 21-25,1997）。従っ
て、本発明のＪＣＶｄ１のＲＮＡ遺伝子の塩基配列を利
用することにより、ＪＣＶｄ１の遺伝子診断に利用でき
る核酸プローブやプライマーを設計することができる。
【００３３】上記核酸プローブの塩基数は、通常のハイ
ブリダイゼーション解析に用いる塩基数であってよく、
特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好
ましくは１００塩基以上である。上記核酸プライマーの
塩基数は、通常のＰＣＲに用いる塩基数であってよく、
特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好
ましくは２０塩基以上である。
ブリダイゼーション解析に用いる塩基数であってよく、
特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好
ましくは１００塩基以上である。上記核酸プライマーの
塩基数は、通常のＰＣＲに用いる塩基数であってよく、
特に制限されないが、好ましくは１０塩基以上、より好
ましくは２０塩基以上である。
【００３４】これらの核酸プローブ又はプライマーは、
ＪＣＶｄ１の塩基配列の部分配列を選択することによっ
て設計することができる。選択される部分配列はどの部
分であってもよく、特に制限されないが、ＪＣＶｄ１の
塩基配列に特異的な部分であることが好ましい。ここで
「ＪＣＶｄ１の塩基配列に特異的な」とは、ＪＣＶｄ１
の塩基配列以外の配列に、分析条件下においてハイブリ
ダイズしないことを意味する。上記核酸プローブは、選
択された部分配列に基づいて、その配列に相補なＤＮＡ
又はＲＮＡとすることができ、上記核酸プライマーは、
その配列に相同又は相補なＤＮＡとすることができる。
なお、上記核酸プローブは、ＪＣＶｄ１の全塩基配列に
相補なＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
ＪＣＶｄ１の塩基配列の部分配列を選択することによっ
て設計することができる。選択される部分配列はどの部
分であってもよく、特に制限されないが、ＪＣＶｄ１の
塩基配列に特異的な部分であることが好ましい。ここで
「ＪＣＶｄ１の塩基配列に特異的な」とは、ＪＣＶｄ１
の塩基配列以外の配列に、分析条件下においてハイブリ
ダイズしないことを意味する。上記核酸プローブは、選
択された部分配列に基づいて、その配列に相補なＤＮＡ
又はＲＮＡとすることができ、上記核酸プライマーは、
その配列に相同又は相補なＤＮＡとすることができる。
なお、上記核酸プローブは、ＪＣＶｄ１の全塩基配列に
相補なＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。
【００３５】植物（例えば、樹木など）からＪＣＶｄ１
を検出するための遺伝子診断法としては、例えば、ＲＴ
−ＰＣＲ法を応用する方法（X. Yangら、Phytopathol.,
82,No.3, 279,1992; N. Yoshikawaら, Ann. Phytopath
ol. Soc. Jpn., 62, 119-124, 1996）や、非放射性標識
ｃＤＮＡ（ｃＲＮＡであってもよい）をプローブとして
用いるハイブリダイゼーション法（J. Romero-Durban
ら, J. Virol. Methods, 55, 37-47, 1995; Maria Esth
er de Noronha Fonsecaら, J. Virol. Methods, 57, 20
3-207, 1996）などが挙げられる。また、上記のＲＴ−
ＰＣＲ法及びマイクロプレートを用いるハイブリダイゼ
ーション法を組合わせた方法（斉藤ら、植物防疫、第48
巻第４号、169-173, 1994）も知られている。このよう
な診断法は、当業者に公知の方法を用いて実施すること
ができる。
を検出するための遺伝子診断法としては、例えば、ＲＴ
−ＰＣＲ法を応用する方法（X. Yangら、Phytopathol.,
82,No.3, 279,1992; N. Yoshikawaら, Ann. Phytopath
ol. Soc. Jpn., 62, 119-124, 1996）や、非放射性標識
ｃＤＮＡ（ｃＲＮＡであってもよい）をプローブとして
用いるハイブリダイゼーション法（J. Romero-Durban
ら, J. Virol. Methods, 55, 37-47, 1995; Maria Esth
er de Noronha Fonsecaら, J. Virol. Methods, 57, 20
3-207, 1996）などが挙げられる。また、上記のＲＴ−
ＰＣＲ法及びマイクロプレートを用いるハイブリダイゼ
ーション法を組合わせた方法（斉藤ら、植物防疫、第48
巻第４号、169-173, 1994）も知られている。このよう
な診断法は、当業者に公知の方法を用いて実施すること
ができる。
【００３６】ＲＴ−ＰＣＲを用いるＪＣＶｄ１の検出は
以下のようにして行うことができる。第一に、被検植物
から核酸を調製する。これは公知の方法を用いて行うこ
とができ、例えば、上述の方法を用いて行うことができ
る。第二に、調製した核酸中に含まれている可能性のあ
るＪＣＶｄ１のＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡ合成及び増幅を
行う。
以下のようにして行うことができる。第一に、被検植物
から核酸を調製する。これは公知の方法を用いて行うこ
とができ、例えば、上述の方法を用いて行うことができ
る。第二に、調製した核酸中に含まれている可能性のあ
るＪＣＶｄ１のＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡ合成及び増幅を
行う。
【００３７】一本鎖ｃＤＮＡの合成は、公知の方法によ
り行うことができるが、例えば、次のようにして行うこ
とができる。まず、上述のようにして調製した核酸に、
イオン交換滅菌水及びプライマーを添加する。ここで使
用するプライマーとしては、例えば、ランダムプライマ
ー、配列番号４、６又は８に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチド等を用いることができる。次いで、得
られる混合物を１００℃前後で約５分間保持した後に急
冷して熱変性した後、室温で静置することによりＪＣＶ
ｄ１のＲＮＡと上記プライマーをアニールさせる。ここ
に反応溶液（一本鎖ｃＤＮＡ緩衝液、２−メルカプトエ
タノール、ｄＮＴＰ及びイオン交換水を含み、必要に応
じてＲＮａｓｅも含む。）及び逆転写酵素を添加し、逆
転写反応を行う。該逆転写反応の温度条件及び時間はそ
れぞれ、使用する酵素の至適温度及びその温度での活性
に依存する。以上のようにして一本鎖ｃＤＮＡを合成す
ることができるが、これはFirst-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）など
の市販のキットを用いて行ってもよい。
り行うことができるが、例えば、次のようにして行うこ
とができる。まず、上述のようにして調製した核酸に、
イオン交換滅菌水及びプライマーを添加する。ここで使
用するプライマーとしては、例えば、ランダムプライマ
ー、配列番号４、６又は８に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチド等を用いることができる。次いで、得
られる混合物を１００℃前後で約５分間保持した後に急
冷して熱変性した後、室温で静置することによりＪＣＶ
ｄ１のＲＮＡと上記プライマーをアニールさせる。ここ
に反応溶液（一本鎖ｃＤＮＡ緩衝液、２−メルカプトエ
タノール、ｄＮＴＰ及びイオン交換水を含み、必要に応
じてＲＮａｓｅも含む。）及び逆転写酵素を添加し、逆
転写反応を行う。該逆転写反応の温度条件及び時間はそ
れぞれ、使用する酵素の至適温度及びその温度での活性
に依存する。以上のようにして一本鎖ｃＤＮＡを合成す
ることができるが、これはFirst-Strand cDNA Synthesi
s Kit（アマシャムファルマシアバイオテク社製）など
の市販のキットを用いて行ってもよい。
【００３８】次に、以上のようにして合成した一本鎖ｃ
ＤＮＡを増幅する。該増幅は公知の方法により行うこと
ができるが、例えば、上記一本鎖ｃＤＮＡにＰＣＲ緩衝
液（Tris-HCl、KCl、MgCl2、ゼラチン等を含む。）、ｄ
ＮＴＰ、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、
サイクル反応を行うことができる。ここで使用するプラ
イマーは、ＪＣＶｄ１の塩基配列（配列番号１）に基づ
いて設計することができ、該プライマーの塩基配列は特
定のものに限定されない。例えば、配列番号３に示され
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号４に
示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを組み合わ
せて用いることができる。また、上述のＲＴ−ＰＣＲ法
において、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドに代えて配列番号５又は７に示される塩基
配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることができ、配
列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
に代えて配列番号６又は８に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドを用いることができる。さらに、一本
鎖ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーとしては、ランダ
ムプライマーを使用してもよい。上記サイクル反応の条
件は、使用するプライマーのＴｍ値、ＤＮＡポリメラー
ゼの至適温度等に基づいて、当業者であれば容易に設定
することができる。以上のようにして一本鎖ｃＤＮＡを
増幅して二本鎖ｃＤＮＡとすることができるが、これは
Takara Taq（宝酒造社製）などの市販のキットを使用し
て行うことができる。
ＤＮＡを増幅する。該増幅は公知の方法により行うこと
ができるが、例えば、上記一本鎖ｃＤＮＡにＰＣＲ緩衝
液（Tris-HCl、KCl、MgCl2、ゼラチン等を含む。）、ｄ
ＮＴＰ、プライマー及びＤＮＡポリメラーゼを添加し、
サイクル反応を行うことができる。ここで使用するプラ
イマーは、ＪＣＶｄ１の塩基配列（配列番号１）に基づ
いて設計することができ、該プライマーの塩基配列は特
定のものに限定されない。例えば、配列番号３に示され
る塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号４に
示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを組み合わ
せて用いることができる。また、上述のＲＴ−ＰＣＲ法
において、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドに代えて配列番号５又は７に示される塩基
配列を含むオリゴヌクレオチドを用いることができ、配
列番号４に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
に代えて配列番号６又は８に示される塩基配列を含むオ
リゴヌクレオチドを用いることができる。さらに、一本
鎖ｃＤＮＡ合成に使用するプライマーとしては、ランダ
ムプライマーを使用してもよい。上記サイクル反応の条
件は、使用するプライマーのＴｍ値、ＤＮＡポリメラー
ゼの至適温度等に基づいて、当業者であれば容易に設定
することができる。以上のようにして一本鎖ｃＤＮＡを
増幅して二本鎖ｃＤＮＡとすることができるが、これは
Takara Taq（宝酒造社製）などの市販のキットを使用し
て行うことができる。
【００３９】最後に、このようにして得られるＲＴ−Ｐ
ＣＲ産物を分析する。これは、ＲＴ−ＰＣＲ産物を分離
し、その後にＪＣＶｄ１に由来する核酸を検出すること
により行うことができる。分離法としては公知のいずれ
の方法を用いてもよいが、好ましくは電気泳動法、より
好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用い
る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、例えば、６
％ポリアクリルアミドゲルを使用し、８０Ｖで１時間４
５分電気泳動することによって行うことができる。
ＣＲ産物を分析する。これは、ＲＴ−ＰＣＲ産物を分離
し、その後にＪＣＶｄ１に由来する核酸を検出すること
により行うことができる。分離法としては公知のいずれ
の方法を用いてもよいが、好ましくは電気泳動法、より
好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用い
る。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、例えば、６
％ポリアクリルアミドゲルを使用し、８０Ｖで１時間４
５分電気泳動することによって行うことができる。
【００４０】このようにして分離した核酸試料について
ＪＣＶｄ１由来核酸を検出するためには公知の方法を用
いることができるが、例えば、核酸を銀染色によって可
視化する方法又はサザンハイブリダイゼーション分析法
を用いることができる。銀染色による可視化は、例え
ば、Hadidiら（J. Virol. Meth., 30, 261 (1990)）の
方法に従って行うことができる。サザンハイブリダイゼ
ーション分析は公知の方法により行うことができるが、
例えば、Hadidiら（Phytopathology, 80, 263-268 (199
0)）の方法に従って行うことができる。この場合に使用
するプローブとしては、ＪＣＶｄ１に特異的な核酸プロ
ーブ、好ましくはｃＤＮＡプローブ又はｃＲＮＡプロー
ブを用いることができる。このようなプローブの合成
は、当業者であれば、本発明に基づいて容易に行うこと
ができる。
ＪＣＶｄ１由来核酸を検出するためには公知の方法を用
いることができるが、例えば、核酸を銀染色によって可
視化する方法又はサザンハイブリダイゼーション分析法
を用いることができる。銀染色による可視化は、例え
ば、Hadidiら（J. Virol. Meth., 30, 261 (1990)）の
方法に従って行うことができる。サザンハイブリダイゼ
ーション分析は公知の方法により行うことができるが、
例えば、Hadidiら（Phytopathology, 80, 263-268 (199
0)）の方法に従って行うことができる。この場合に使用
するプローブとしては、ＪＣＶｄ１に特異的な核酸プロ
ーブ、好ましくはｃＤＮＡプローブ又はｃＲＮＡプロー
ブを用いることができる。このようなプローブの合成
は、当業者であれば、本発明に基づいて容易に行うこと
ができる。
【００４１】以上のようにして得られるデータから、Ｊ
ＣＶｄ１の存否を判断する。上記のｃＤＮＡ増幅におい
て、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチド及び配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用する場合には約３
３０ｂｐの断片、配列番号５に示される塩基配列を含む
オリゴヌクレオチド及び配列番号６に示される塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する
場合には約３３０ｂｐの断片、並びに、配列番号７に示
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号
８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして使用する場合には約１７０ｂｐの断片の有
無によって、ＪＣＶｄ１の存否を判断することができ
る。これらの断片の塩基数は、公知の方法により容易に
知ることができる。例えば、電気泳動を行う際に、公知
のＤＮＡサイズマーカーをローディングしておくことに
より、検出される断片の塩基数を知ることができる。
ＣＶｄ１の存否を判断する。上記のｃＤＮＡ増幅におい
て、配列番号３に示される塩基配列を含むオリゴヌクレ
オチド及び配列番号４に示される塩基配列を含むオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして使用する場合には約３
３０ｂｐの断片、配列番号５に示される塩基配列を含む
オリゴヌクレオチド及び配列番号６に示される塩基配列
を含むオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する
場合には約３３０ｂｐの断片、並びに、配列番号７に示
される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号
８に示される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドをプラ
イマーとして使用する場合には約１７０ｂｐの断片の有
無によって、ＪＣＶｄ１の存否を判断することができ
る。これらの断片の塩基数は、公知の方法により容易に
知ることができる。例えば、電気泳動を行う際に、公知
のＤＮＡサイズマーカーをローディングしておくことに
より、検出される断片の塩基数を知ることができる。
【００４２】ハイブリダイゼーション法を用いるＪＣＶ
ｄ１の検出は、M.E.N.Fonsecaら（J. Virol. Methods,
57, 203-207 (1996)）の方法のような公知の方法により
行うことができるが、例えば、以下のようにして行うこ
とができる。第一に、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプロー
ブを調製する。これらのプローブは、検出可能な標識を
含むことが好ましい。標識としては、後の検出が可能で
あれば放射性同位体、ビオチンなどの公知のいずれの標
識を用いてもよいが、好ましくは化学発光標識、より好
ましくはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いる。
ｄ１の検出は、M.E.N.Fonsecaら（J. Virol. Methods,
57, 203-207 (1996)）の方法のような公知の方法により
行うことができるが、例えば、以下のようにして行うこ
とができる。第一に、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプロー
ブを調製する。これらのプローブは、検出可能な標識を
含むことが好ましい。標識としては、後の検出が可能で
あれば放射性同位体、ビオチンなどの公知のいずれの標
識を用いてもよいが、好ましくは化学発光標識、より好
ましくはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）を用いる。
【００４３】標識ＤＮＡプローブは化学的合成法などの
公知の方法により調製することができるが、好ましく
は、本発明のｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いて調
製する。この場合には、本発明のｃＤＮＡを含有するプ
ラスミドＤＮＡを、適当な制限酵素で切断し、生成する
断片を精製することができる。該精製は、フェノール／
クロロホルム処理及びエタノール沈殿などの公知の方法
により行うことができる。標識としてＤＩＧを用いる場
合には、例えば、DIG DNA labeling mixture（ベーリン
ガーマンハイム社製）を使用して標識ＤＮＡプローブを
調製することができる。
公知の方法により調製することができるが、好ましく
は、本発明のｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いて調
製する。この場合には、本発明のｃＤＮＡを含有するプ
ラスミドＤＮＡを、適当な制限酵素で切断し、生成する
断片を精製することができる。該精製は、フェノール／
クロロホルム処理及びエタノール沈殿などの公知の方法
により行うことができる。標識としてＤＩＧを用いる場
合には、例えば、DIG DNA labeling mixture（ベーリン
ガーマンハイム社製）を使用して標識ＤＮＡプローブを
調製することができる。
【００４４】標識ＲＮＡプローブは化学的合成法などの
公知の方法により調製することができるが、好ましく
は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のｃＤＮＡ又
はこれを含むプラスミドから調製することができる。Ｒ
ＮＡポリメラーゼとしては、公知のポリメラーゼの中か
ら適切なものを選択して使用することができるが、好ま
しくはＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いる。この
場合には、本発明のｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮ
Ａを、標識用混合液を含む転写混合液中に添加し、転写
を行う。標識としてＤＩＧを用いる場合には、前記標識
用混合液としては、例えば、RNA labeling kit（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を使用することができる。転写
混合液及び反応条件などは、当業者であれば、適切に設
定することができる。
公知の方法により調製することができるが、好ましく
は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のｃＤＮＡ又
はこれを含むプラスミドから調製することができる。Ｒ
ＮＡポリメラーゼとしては、公知のポリメラーゼの中か
ら適切なものを選択して使用することができるが、好ま
しくはＴ７又はＴ３ＲＮＡポリメラーゼを用いる。この
場合には、本発明のｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮ
Ａを、標識用混合液を含む転写混合液中に添加し、転写
を行う。標識としてＤＩＧを用いる場合には、前記標識
用混合液としては、例えば、RNA labeling kit（ベーリ
ンガーマンハイム社製）を使用することができる。転写
混合液及び反応条件などは、当業者であれば、適切に設
定することができる。
【００４５】第二に、核酸試料中に含まれるＪＣＶｄ１
由来核酸と上記プローブとのハイブリダイゼーションを
行う。上述のようにして被検植物から抽出した核酸試料
を適切な条件下で変性させる（例えば、White B.A. and
Bancroft F.C., J. Biol. Chem. 257, 8569-8572 (198
2)参照）。該変性は、例えば、上記核酸試料にその３倍
の容量の１０×ＳＳＣ（２０％(w/v)のホルムアルデヒ
ドを含む）を添加し、６５℃で１５分間加熱して氷上で
冷却することにより行うことができる。該変性の後、必
要であれば種々の濃度調整を行った後に、適切な膜にス
ポットする。このような膜としては公知のものを用いる
ことができるが、好ましくはナイロン膜を使用する。膜
にスポットした変性核酸試料は、適切な条件下で、例え
ば、８０℃で２時間処理し、膜に核酸を固定する。次い
で、膜に固定された核酸と標識プローブのハイブリダイ
ゼーションを行う。これは公知の適切な方法を用いて行
うことができるが、好ましくはM.E.N.Fonsecaら（上
述）の方法に従って行う。この場合には、変性核酸試料
が固定されている膜に対して、プローブを含まないハイ
ブリダイゼーション溶液中でプレハイブリダイゼーショ
ンを行った後に、プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン溶液中でハイブリダイゼーションを行う。
由来核酸と上記プローブとのハイブリダイゼーションを
行う。上述のようにして被検植物から抽出した核酸試料
を適切な条件下で変性させる（例えば、White B.A. and
Bancroft F.C., J. Biol. Chem. 257, 8569-8572 (198
2)参照）。該変性は、例えば、上記核酸試料にその３倍
の容量の１０×ＳＳＣ（２０％(w/v)のホルムアルデヒ
ドを含む）を添加し、６５℃で１５分間加熱して氷上で
冷却することにより行うことができる。該変性の後、必
要であれば種々の濃度調整を行った後に、適切な膜にス
ポットする。このような膜としては公知のものを用いる
ことができるが、好ましくはナイロン膜を使用する。膜
にスポットした変性核酸試料は、適切な条件下で、例え
ば、８０℃で２時間処理し、膜に核酸を固定する。次い
で、膜に固定された核酸と標識プローブのハイブリダイ
ゼーションを行う。これは公知の適切な方法を用いて行
うことができるが、好ましくはM.E.N.Fonsecaら（上
述）の方法に従って行う。この場合には、変性核酸試料
が固定されている膜に対して、プローブを含まないハイ
ブリダイゼーション溶液中でプレハイブリダイゼーショ
ンを行った後に、プローブを含むハイブリダイゼーショ
ン溶液中でハイブリダイゼーションを行う。
【００４６】このようなプレハイブリダイゼーション及
びハイブリダイゼーションは、例えば、次のようにして
行うことができる。まず、上記の変性核酸試料固定化膜
を、該膜100cm2当たり２０mlのハイブリダイゼーション
緩衝液（５×ＳＳＣ、0.1％(w/v)Ｍ−ラウロイルサルコ
シン、0.02％(w/v)ＳＤＳを含み、必要に応じてDIG nuc
leic acid detection kit（ベーリンガーマンハイム社
製）に含まれる１％(w/v)ブロッキング試薬を含む）と
ともに、６８℃で１時間、プレハイブリダイズさせる。
その後、100ng/mlのプローブを添加し、６８℃で１６時
間、インキュベートする。この際、プローブは、予め９
５℃で３分間加熱した後に氷上で冷却することにより変
性させておく。
びハイブリダイゼーションは、例えば、次のようにして
行うことができる。まず、上記の変性核酸試料固定化膜
を、該膜100cm2当たり２０mlのハイブリダイゼーション
緩衝液（５×ＳＳＣ、0.1％(w/v)Ｍ−ラウロイルサルコ
シン、0.02％(w/v)ＳＤＳを含み、必要に応じてDIG nuc
leic acid detection kit（ベーリンガーマンハイム社
製）に含まれる１％(w/v)ブロッキング試薬を含む）と
ともに、６８℃で１時間、プレハイブリダイズさせる。
その後、100ng/mlのプローブを添加し、６８℃で１６時
間、インキュベートする。この際、プローブは、予め９
５℃で３分間加熱した後に氷上で冷却することにより変
性させておく。
【００４７】必要であれば、M.E.N.Fonsecaら（上述）
の方法に改良を加えて行うことができ、このような改良
は、当業者であれば容易に行うことができる。また、使
用するプローブとしては、ＤＮＡであってもＲＮＡであ
ってもよいが、どちらを用いるかによって、上記の各条
件の幾つかが異なることは当業者に理解されよう。この
ような異なる条件の設定は、当業者であれば容易に行う
ことができる。
の方法に改良を加えて行うことができ、このような改良
は、当業者であれば容易に行うことができる。また、使
用するプローブとしては、ＤＮＡであってもＲＮＡであ
ってもよいが、どちらを用いるかによって、上記の各条
件の幾つかが異なることは当業者に理解されよう。この
ような異なる条件の設定は、当業者であれば容易に行う
ことができる。
【００４８】最後に、核酸試料にハイブリダイズしたプ
ローブを検出する。必要であれば、ハイブリダイゼーシ
ョンの終わった膜を洗浄してから検出を行ってもよい。
この洗浄処理は、当業者に公知の方法を用いて行うこと
ができる。検出の方法としては、プローブに含有される
標識を検出することができる方法であればよく、各種標
識の検出は、当業者に公知の方法を用いて行うことがで
きる。例えば、標識としてＤＩＧを用いている場合に
は、DIG luminescent detection kit（ベーリンガーマ
ンハイム社製）又はDIG nucleic acid detection kit
（ベーリンガーマンハイム社製）などの市販のキットを
用いて検出することができる。
ローブを検出する。必要であれば、ハイブリダイゼーシ
ョンの終わった膜を洗浄してから検出を行ってもよい。
この洗浄処理は、当業者に公知の方法を用いて行うこと
ができる。検出の方法としては、プローブに含有される
標識を検出することができる方法であればよく、各種標
識の検出は、当業者に公知の方法を用いて行うことがで
きる。例えば、標識としてＤＩＧを用いている場合に
は、DIG luminescent detection kit（ベーリンガーマ
ンハイム社製）又はDIG nucleic acid detection kit
（ベーリンガーマンハイム社製）などの市販のキットを
用いて検出することができる。
【００４９】
【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明をより具体的
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕ＪＣＶｄ１のＲＮＡの調製 長崎県で採集した、カンキツウイロイド罹病の「不知
火」（（Citrus unshiu×C. sinensis）×C. reticulat
a）について、エトログシトロン系統アリゾナ８６１−
Ｓ１（Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.）を用いる
木本検定及び電気泳動を行った。その結果としてＪＣＶ
ｄ１、ＣＶｄII及びＣＶｄIIIの保毒が示唆されたもの
を用いて、ウイロイド純化（ＪＣＶｄ１のＲＮＡの調
製）を以下のようにして行った。
に説明する。ただし、これらの実施例は説明のためのも
のであり、本発明の技術的範囲を制限するものではな
い。 〔実施例１〕ＪＣＶｄ１のＲＮＡの調製 長崎県で採集した、カンキツウイロイド罹病の「不知
火」（（Citrus unshiu×C. sinensis）×C. reticulat
a）について、エトログシトロン系統アリゾナ８６１−
Ｓ１（Citrus medica L. Var. Ethrog Engl.）を用いる
木本検定及び電気泳動を行った。その結果としてＪＣＶ
ｄ１、ＣＶｄII及びＣＶｄIIIの保毒が示唆されたもの
を用いて、ウイロイド純化（ＪＣＶｄ１のＲＮＡの調
製）を以下のようにして行った。
【００５０】罹病エトログシトロン系統アリゾナ８６１
−Ｓ１の葉及び樹皮を合計３０ｇ採取し、これを７０ｍ
ｌの抽出用緩衝液（0.13M Tris-Cl pH8.9、0.83%ドデシ
ル硫酸ナトリウム、5％ポリビニルピロリドン、1M塩化
リチウム、0.017M EDTA pH7.0、1.4％２−メルカプトエ
タノール）中で磨砕した。次いで、水飽和フェノール・
クロロホルム（１：１）抽出を２回行い、イソプロパノ
ール沈澱によって濃縮した後、２Ｍ塩化リチウム１０ｍ
ｌで処理して低分子核酸を抽出した。この抽出液にＤＮ
ａｓｅＩ2.5μl（2.5Ｕ）及びＤＮａｓｅ緩衝液（0.05
ＭTris-HCl, ｐＨ7.5、0.15ＭNaCl、0.005ＭMgCl2）を
添加して、３７℃で６０分間インキュベートし、該抽出
液中のＤＮＡを分解した。その後、フェノール・クロロ
ホルム（１：１）抽出及びエタノール沈澱によって、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを得た。
−Ｓ１の葉及び樹皮を合計３０ｇ採取し、これを７０ｍ
ｌの抽出用緩衝液（0.13M Tris-Cl pH8.9、0.83%ドデシ
ル硫酸ナトリウム、5％ポリビニルピロリドン、1M塩化
リチウム、0.017M EDTA pH7.0、1.4％２−メルカプトエ
タノール）中で磨砕した。次いで、水飽和フェノール・
クロロホルム（１：１）抽出を２回行い、イソプロパノ
ール沈澱によって濃縮した後、２Ｍ塩化リチウム１０ｍ
ｌで処理して低分子核酸を抽出した。この抽出液にＤＮ
ａｓｅＩ2.5μl（2.5Ｕ）及びＤＮａｓｅ緩衝液（0.05
ＭTris-HCl, ｐＨ7.5、0.15ＭNaCl、0.005ＭMgCl2）を
添加して、３７℃で６０分間インキュベートし、該抽出
液中のＤＮＡを分解した。その後、フェノール・クロロ
ホルム（１：１）抽出及びエタノール沈澱によって、Ｊ
ＣＶｄ１のＲＮＡを含む低分子ＲＮＡを得た。
【００５１】さらに、該低分子ＲＮＡをシークエンシャ
ルポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ｓＰＡＧＥ，Ro
istacherら、Graft-transmissible diseases of citru
s: Handbook for detection and diagnosis, FAO, Rom
e, 286pp, 1991）により、ＪＣＶｄ１の環状分子のみを
分画した。すなわち、該低分子ＲＮＡを５％未変性ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動した後、ウイロイド画分
を切り出し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲルに上
層して電気泳動した。次いで、このゲルをSYBR II RNA
Gel Stain （Takara）を用いて染色した。分画したＪＣ
Ｖｄ１の環状分子を単離するために、これを含むゲル片
から電気溶出法（Roistacherら、上掲）を用いて溶出し
た。すなわち、ゲル片を透析膜中に入れて緩衝液（８ｍ
ＭTris、４ｍＭ酢酸ナトリウム、0.2ｍＭＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ7.2）中で通電後、該ゲル片から透析膜中に溶出した
ＲＮＡを回収した。最後に、エタノール沈澱を行って、
ＪＣＶｄ１のＲＮＡを単離した。
ルポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ｓＰＡＧＥ，Ro
istacherら、Graft-transmissible diseases of citru
s: Handbook for detection and diagnosis, FAO, Rom
e, 286pp, 1991）により、ＪＣＶｄ１の環状分子のみを
分画した。すなわち、該低分子ＲＮＡを５％未変性ポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動した後、ウイロイド画分
を切り出し、８Ｍ尿素変性ポリアクリルアミドゲルに上
層して電気泳動した。次いで、このゲルをSYBR II RNA
Gel Stain （Takara）を用いて染色した。分画したＪＣ
Ｖｄ１の環状分子を単離するために、これを含むゲル片
から電気溶出法（Roistacherら、上掲）を用いて溶出し
た。すなわち、ゲル片を透析膜中に入れて緩衝液（８ｍ
ＭTris、４ｍＭ酢酸ナトリウム、0.2ｍＭＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ7.2）中で通電後、該ゲル片から透析膜中に溶出した
ＲＮＡを回収した。最後に、エタノール沈澱を行って、
ＪＣＶｄ１のＲＮＡを単離した。
【００５２】〔実施例２〕ｃＤＮＡの合成及び塩基配列
の決定 得られたＪＣＶｄ１のＲＮＡからのランダムプライマー
によるｃＤＮＡ合成、プライマーによる増幅、プラスミ
ドベクターへの組み込み、及び塩基配列の一部決定を行
った。すなわち、まずＪＣＶｄ１のＲＮＡ１μｇにPrim
er-R及びPrimer-AS（１０μＭ：ともにサワディー社
製）各１μｌを加え、さらに水を加えて計１０μｌと
し、８０℃で１０分間インキュベートした後に４℃で急
冷することにより熱変性を行った。この混合物に５×Ex
pRB４μｌ、１００ｍＭＤＴＴ２μｌ、２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ２μｌ、Expand Reverse（５０Ｕ／μｌ）１μｌ、及
びRNase Inhibitor（１０Ｕ／μｌ）0.5μｌ（これらは
全てベーリンガー・マンハイム社製）を添加し、３０℃
で１０分間、４２℃で１時間及び８０℃で１０分間の逆
転写反応により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一本
鎖ｃＤＮＡ１μｌにPrimer（２５μＭ：サワディー社
製）0.5μｌとSuper Taq Premix（サワディー社製）48.
5μｌを添加して、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件
は、９０℃で１分間を１サイクル、９５℃で３０秒間
（熱変性）−５５℃で３０秒間（アニーリング）−６８
℃で１分間（伸長）を３０サイクル、及び７２℃で３０
分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ増幅産物を、
TA-cloning Kit（プロメガ社製）を用いてpGEM T Vecto
r中にクローニングした。次いで、該ベクターに添付のT
7及びSP6 primerを用いて、ABI377シークエンサーを使
用して行うダイターミネーター法により塩基配列を解析
した。
の決定 得られたＪＣＶｄ１のＲＮＡからのランダムプライマー
によるｃＤＮＡ合成、プライマーによる増幅、プラスミ
ドベクターへの組み込み、及び塩基配列の一部決定を行
った。すなわち、まずＪＣＶｄ１のＲＮＡ１μｇにPrim
er-R及びPrimer-AS（１０μＭ：ともにサワディー社
製）各１μｌを加え、さらに水を加えて計１０μｌと
し、８０℃で１０分間インキュベートした後に４℃で急
冷することにより熱変性を行った。この混合物に５×Ex
pRB４μｌ、１００ｍＭＤＴＴ２μｌ、２０ｍＭｄＮＴ
Ｐ２μｌ、Expand Reverse（５０Ｕ／μｌ）１μｌ、及
びRNase Inhibitor（１０Ｕ／μｌ）0.5μｌ（これらは
全てベーリンガー・マンハイム社製）を添加し、３０℃
で１０分間、４２℃で１時間及び８０℃で１０分間の逆
転写反応により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。この一本
鎖ｃＤＮＡ１μｌにPrimer（２５μＭ：サワディー社
製）0.5μｌとSuper Taq Premix（サワディー社製）48.
5μｌを添加して、ＰＣＲを行った。該ＰＣＲの条件
は、９０℃で１分間を１サイクル、９５℃で３０秒間
（熱変性）−５５℃で３０秒間（アニーリング）−６８
℃で１分間（伸長）を３０サイクル、及び７２℃で３０
分間を１サイクルとした。得られたＰＣＲ増幅産物を、
TA-cloning Kit（プロメガ社製）を用いてpGEM T Vecto
r中にクローニングした。次いで、該ベクターに添付のT
7及びSP6 primerを用いて、ABI377シークエンサーを使
用して行うダイターミネーター法により塩基配列を解析
した。
【００５３】得られた配列を基に、２組のプライマーセ
ット： （プライマーセット１）； CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） （プライマーセット２）； CB3-TP：5'-CGTGTGGTTCCTGTGGGTCA-3' （配列番号５） CB3-TM：5'-GAGTTTCCTCCGGGGAAACA-3' （配列番号６） を合成し、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型として、初めにＲ
ＮＡ-ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いて、説明書に
従ってランダムプライマーによりｃＤＮＡの合成を行っ
た。さらに、合成した２組のプライマーセットを用い、
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Takara Taq（宝酒造社
製）を使用して、説明書に従ってＰＣＲを行った。該Ｐ
ＣＲは、９４℃で５分間-５５℃で１０秒間-７２℃で５
秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）-５５℃
で１０秒間（アニーリング）-７２℃で５秒間（伸長）
を３５サイクル、そして７２℃で５分間-１５℃で５分
間を１サイクルの条件で行った。得られた２種の増幅産
物は、各々の増幅に用いたプライマーセットを用いて各
々両方向からダイレクトシークエンス法により塩基配列
を決定した。すなわち、上記増幅産物１００ｎｇに、上
記プライマー４pmolになるように添加し、ABI377シーク
エンサーを使用して行うダイターミネーター法によって
塩基配列を解析した。これらの塩基配列を比較し、ＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡの全塩基配列（配列番号１）を決定し
た。
ット： （プライマーセット１）； CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） （プライマーセット２）； CB3-TP：5'-CGTGTGGTTCCTGTGGGTCA-3' （配列番号５） CB3-TM：5'-GAGTTTCCTCCGGGGAAACA-3' （配列番号６） を合成し、ＪＣＶｄ１のＲＮＡを鋳型として、初めにＲ
ＮＡ-ＰＣＲキット（宝酒造社製）を用いて、説明書に
従ってランダムプライマーによりｃＤＮＡの合成を行っ
た。さらに、合成した２組のプライマーセットを用い、
得られたｃＤＮＡを鋳型とし、Takara Taq（宝酒造社
製）を使用して、説明書に従ってＰＣＲを行った。該Ｐ
ＣＲは、９４℃で５分間-５５℃で１０秒間-７２℃で５
秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）-５５℃
で１０秒間（アニーリング）-７２℃で５秒間（伸長）
を３５サイクル、そして７２℃で５分間-１５℃で５分
間を１サイクルの条件で行った。得られた２種の増幅産
物は、各々の増幅に用いたプライマーセットを用いて各
々両方向からダイレクトシークエンス法により塩基配列
を決定した。すなわち、上記増幅産物１００ｎｇに、上
記プライマー４pmolになるように添加し、ABI377シーク
エンサーを使用して行うダイターミネーター法によって
塩基配列を解析した。これらの塩基配列を比較し、ＪＣ
Ｖｄ１のＲＮＡの全塩基配列（配列番号１）を決定し
た。
【００５４】〔実施例３〕樹木のＪＣＶｄ１感染につい
ての遺伝子診断 ＪＣＶｄ１に感染している可能性のあるエトログシトロ
ンを対象として、ＲＴ−ＰＣＲによるＪＣＶｄ１の検出
を行った。対照区では、健全エトログシトロンを対象と
して上記検出を行った。検定すべきカンキツ樹の新梢部
分を0.05〜0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯ
ＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、説明書に従って
全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全Ｒ
ＮＡ約１μｇに相当）を９５℃で５分間インキュベート
した後に急冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２
次構造を解消した。この溶液を用い、First-Strand cDN
A Synthesis Kit（アマシャムファルマシアバイオテク
社製）を用い、添付のランダムヘキサマーを使用して、
説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。
ての遺伝子診断 ＪＣＶｄ１に感染している可能性のあるエトログシトロ
ンを対象として、ＲＴ−ＰＣＲによるＪＣＶｄ１の検出
を行った。対照区では、健全エトログシトロンを対象と
して上記検出を行った。検定すべきカンキツ樹の新梢部
分を0.05〜0.1g採集し、この新梢部分試料から、ＩＳＯ
ＧＥＮ（ニッポンジーン社製）を用い、説明書に従って
全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡ抽出液１μｌ（全Ｒ
ＮＡ約１μｇに相当）を９５℃で５分間インキュベート
した後に急冷することにより熱変性を行い、ＲＮＡの２
次構造を解消した。この溶液を用い、First-Strand cDN
A Synthesis Kit（アマシャムファルマシアバイオテク
社製）を用い、添付のランダムヘキサマーを使用して、
説明書に従ってｃＤＮＡを合成した。
【００５５】次いで、そのｃＤＮＡを鋳型として用い、
以下の塩基配列： CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） からなるプライマーセット及びTakara Taq（宝酒造社
製）を用い、説明書に従ってＰＣＲを行った。このＰＣ
Ｒは、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（PerkinElme
r社）を使用し、９４℃で５分間-５５℃で１０秒間-７
２℃で５秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）
-５５℃で１０秒間（アニーリング）-７２℃で５秒間
（伸長）を３５サイクル、そして７２℃で５分間-１５
℃で５分間を１サイクルの反応を行った。
以下の塩基配列： CB3-CP：5'-CGTCGACGAAGGCATGTGAGCT-3'（配列番号３） CB3-CM：5'-ACGACAGGTGAGTTCTCCTT-3' （配列番号４） からなるプライマーセット及びTakara Taq（宝酒造社
製）を用い、説明書に従ってＰＣＲを行った。このＰＣ
Ｒは、ＤＮＡサーマルサイクラー４８０型（PerkinElme
r社）を使用し、９４℃で５分間-５５℃で１０秒間-７
２℃で５秒間を１サイクル、９４℃で３０秒間（変性）
-５５℃で１０秒間（アニーリング）-７２℃で５秒間
（伸長）を３５サイクル、そして７２℃で５分間-１５
℃で５分間を１サイクルの反応を行った。
【００５６】以上のようにして得られたＰＣＲ産物をＤ
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図１に示した。図１中のレーンＭはＤＮＡ
サイズマーカー、レーン１〜１３は各供試サンプル由来
の増幅産物、及びレーンＨは健全（ＪＣＶｄ１無感染）
サンプル由来の増幅産物をそれぞれ示す。図１におい
て、約３３０塩基の特異的断片の有無を確認することに
より、ＪＣＶｄ１を検出することができた。
ＮＡサイズマーカーとともに６％ポリアクリルアミドゲ
ルにローディングし、８０Ｖで１時間４５分電気泳動し
た後に、銀染色法により染色した。こうして得られた電
気泳動写真を図１に示した。図１中のレーンＭはＤＮＡ
サイズマーカー、レーン１〜１３は各供試サンプル由来
の増幅産物、及びレーンＨは健全（ＪＣＶｄ１無感染）
サンプル由来の増幅産物をそれぞれ示す。図１におい
て、約３３０塩基の特異的断片の有無を確認することに
より、ＪＣＶｄ１を検出することができた。
【００５７】
【発明の効果】本発明により、ＪＣＶｄ１ゲノムＲＮＡ
の全塩基配列が明らかとなり、これにより、他のカンキ
ツウイロイドとの類縁関係を明らかにすることが可能と
なる。さらに、ＪＣＶｄ１ゲノムＲＮＡの塩基配列に基
づいて設計した核酸プローブや核酸プライマーを用いる
ことにより、ＪＣＶｄ１の選択的な遺伝子検出が可能と
なる。これにより、ＪＣＶｄ１に感染したカンキツ樹の
早期診断や迅速な幼苗検定が可能となり、ウイロイドフ
リーのカンキツ苗木供給に大きな効果を発揮する。
の全塩基配列が明らかとなり、これにより、他のカンキ
ツウイロイドとの類縁関係を明らかにすることが可能と
なる。さらに、ＪＣＶｄ１ゲノムＲＮＡの塩基配列に基
づいて設計した核酸プローブや核酸プライマーを用いる
ことにより、ＪＣＶｄ１の選択的な遺伝子検出が可能と
なる。これにより、ＪＣＶｄ１に感染したカンキツ樹の
早期診断や迅速な幼苗検定が可能となり、ウイロイドフ
リーのカンキツ苗木供給に大きな効果を発揮する。
【００５８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Tohru Maotani, Director-General of National Institute of Fruit Tree Science, Ministry Of Agriculture, Forestry And Fisheries <120> Japanese Citrus Viroid 1 Gene <130> P98-0399 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 331 <212> RNA <213> Japanese Citrus Viroid 1 <400> 1 cggaggaaac uccguguggu uccugugggu caccccccgg cacccucuaa agaaaagaaa 60 gguaaggaga acucaccugu cgucgucgac gaaggcaugu gagcuucaaa cucgaugaag 120 agcgucagcg gacggccucu gagacgagcg auggacagua gagcucgucu cuaccagucg 180 cgugcugacu cucacgccca cccgcacggc ugcuccgaga gugagagcuc ucugccgcua 240 gucgagcgga cuccagagug acucucccac ccuauuuuca gcggagagcc ggcgguggag 300 uccccagggu aaaacacgau ugguguuucc c 331 <210> 2 <211> 331 <212> DNA <213> Japanese Citrus Viroid 1 <400> 2 cggaggaaac tccgtgtggt tcctgtgggt caccccccgg caccctctaa agaaaagaaa 60 ggtaaggaga actcacctgt cgtcgtcgac gaaggcatgt gagcttcaaa ctcgatgaag 120 agcgtcagcg gacggcctct gagacgagcg atggacagta gagctcgtct ctaccagtcg 180 cgtgctgact ctcacgccca cccgcacggc tgctccgaga gtgagagctc tctgccgcta 240 gtcgagcgga ctccagagtg actctcccac cctattttca gcggagagcc ggcggtggag 300 tccccagggt aaaacacgat tggtgtttcc c 331 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 3 cgtcgacgaa ggcatgtgag ct 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 4 acgacaggtg agttctcctt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 5 cgtgtggttc ctgtgggtca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 6 gagtttcctc cggggaaaca 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 7 cgtcgacgaa ggcatgtgag ctt 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed oligonucleotide based on the sequence of Japanese Citrus Viroid 1 gene <400> 8 gtccgctcga ctagcggcag agagc 25
【００５９】
【００６０】
【配列番号３〜８】 日本カンキツウイロイド１遺伝子
の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
の配列に基づいて設計したオリゴヌクレオチドである。
【図１】ＲＴ−ＰＣＲによるＪＣＶｄ１の検出結果を示
す電気泳動写真である。
す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ. 75，Ｎｏ．12（1994）ｐ．3581−3584 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．358, Ｎｏ．２（1995）ｐ．182−184 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/11 C12Q 1/68 ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)
Claims (19)
- 【請求項１】 配列番号１に示される塩基配列を含むＲ
ＮＡ。 - 【請求項２】 配列番号１に示される塩基配列において
１以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩
基配列を含み、かつ、カンキツに対して感染性を有する
ＲＮＡ。 - 【請求項３】 配列番号２に示される塩基配列において
１以上の塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩
基配列に相補的な塩基配列を含み、かつ、配列番号１に
示される塩基配列を含むＲＮＡに、0.1％（w/v）のＭ−
ラウロイルサルコシン及び0.02％（w/v）のＳＤＳを含
む５×ＳＳＣ中６８℃という条件下でハイブリダイズす
る、下記の（１）又は（２）のＲＮＡの検出用プローブ
として機能し得る一本鎖ＤＮＡ。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項４】 請求項３記載の一本鎖ＤＮＡをセンス鎖
又はアンチセンス鎖として含む二本鎖ＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列番号１に示される塩基配列を含むＲ
ＮＡと相補性を有する核酸の全部又は該ＲＮＡに特異的
な部分を含む、下記の（１）又は（２）のＲＮＡを検出
し得る核酸プローブ。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項６】 さらに標識を含む請求項５記載の核酸プ
ローブ。 - 【請求項７】 前記核酸プローブがＤＮＡである請求項
５又は６記載の核酸プローブ。 - 【請求項８】 前記核酸プローブがＲＮＡである請求項
５又は６記載の核酸プローブ。 - 【請求項９】 請求項５〜８のいずれか１項に記載の核
酸プローブを用いて、下記の（１）又は（２）のＲＮＡ
を検出する方法。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項１０】 被検植物中に存在する核酸が請求項５
〜８のいずれか１項に記載の核酸プローブとハイブリダ
イズするか否かを調べることにより、被検植物中の前記
ＲＮＡの存否を決定する請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 配列番号１に示される塩基配列を含む
ＲＮＡ又はその塩基配列においてウラシルがチミンに置
き換わったＤＮＡの、該ＲＮＡ又はＤＮＡに特異的な部
分を含む、下記の（１）又は（２）のＲＮＡを増幅し得
る核酸プライマー。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項１２】 前記核酸プライマーがＤＮＡである請
求項１１記載の核酸プライマー。 - 【請求項１３】 前記核酸プライマーが、配列番号３に
示される塩基配列を含む請求項１２記載の核酸プライマ
ー。 - 【請求項１４】 配列番号１に示される塩基配列を含む
ＲＮＡと相補性を有する核酸の、該ＲＮＡに特異的な部
分を含む、下記の（１）又は（２）のＲＮＡを増幅し得
る核酸プライマー。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項１５】 前記核酸プライマーがＤＮＡである請
求項１４記載の核酸プライマー。 - 【請求項１６】 前記核酸プライマーが、配列番号４に
示される塩基配列を含む請求項１５記載の核酸プライマ
ー。 - 【請求項１７】 請求項１１〜１３のいずれか１項に記
載の核酸プライマー及び請求項１４〜１６のいずれか１
項に記載の核酸プライマーを用いて、下記の（１）又は
（２）のＲＮＡを検出する方法。（１）配列番号１に示される塩基配列を含むＲＮＡ。 （２）配列番号１に示される塩基配列において１以上の
塩基が置換、欠失、付加若しくは挿入された塩基配列を
含み、かつ、カンキツに対して感染性を有するＲＮＡ。 - 【請求項１８】 被検植物中に存在する核酸が請求項１
１〜１３のいずれか１項に記載の核酸プライマー及び請
求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸プライマー
により増幅されるか否かを調べることにより、被検植物
中の前記ＲＮＡの存否を決定する請求項１７記載の方
法。 - 【請求項１９】 被検植物中に存在するＲＮＡから、請
求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸プライマー
によりｃＤＮＡが合成され、さらにこのｃＤＮＡが請求
項１１〜１３のいずれか１項に記載の核酸プライマー及
び請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の核酸プライ
マーにより増幅されるか否かを調べることにより、被検
植物中の前記ＲＮＡの存否を決定する請求項１７又は１
８記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349471A JP3069690B2 (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | 日本カンキツウイロイド１（ＪＣＶｄ１）遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10349471A JP3069690B2 (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | 日本カンキツウイロイド１（ＪＣＶｄ１）遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000166566A JP2000166566A (ja) | 2000-06-20 |
| JP3069690B2 true JP3069690B2 (ja) | 2000-07-24 |
Family
ID=18403979
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10349471A Expired - Lifetime JP3069690B2 (ja) | 1998-12-09 | 1998-12-09 | 日本カンキツウイロイド１（ＪＣＶｄ１）遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3069690B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-09 JP JP10349471A patent/JP3069690B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．３５８，Ｎｏ．２（１９９５）ｐ．１８２−１８４ |
| Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１２（１９９４）ｐ．３５８１−３５８４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000166566A (ja) | 2000-06-20 |
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|---|---|---|---|
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