Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Geny latentního viru chmelu a způsob jejich detekce
CZ293438B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
Narushi Suda Yutaka Itoga Tatsuzi Hataya
Worldwide applications
Application CZ19963170A events
1998-03-18
2004-04-14
Description
translated from
Oblast techniky
Předložený vynález se týká genů latentního viru chmelu a způsobu a metod detekce uvedeného viru.
Dosavadní stav techniky
Rozšíření infekce chmelovým latentním virem (dále zkráceno jako HLV) bylo hlášeno ze všech oblastí pěstování chmelu (Tresh & Ormerod, Rep. E. Malling Res. Stn. for 1968; 41 (1969), Probasco & Skotland, Phytopatology 68: 278 (1978), Adams & Barbara, Ann. appl. Biol., 101: 483 (1982), Inoue et al., Ann. Phytopath. Soc. Japan 39: 229 (1973).
HLV má fílamentní tvar a patří do skupiny celavirů. Doposud nebyla zjištěna ani genová, ani primární struktura obalové bílkoviny. Proto, jako metoda k selekci bezvirových kolon chmelu se využívá enzymoimunoabsorpční stanovení (ELISA) s použitím protilátek vůči HLV. Avšak diagnostická detekce HLV s ELISA způsobovala různé problémy, například snížení detekční citlivosti závislé na době odběrů vzorků a na zdlouhavé přípravě protilátek.
Z těchto důvodů, technickým problémem předloženého vynálezu je poskytnout rychlou a přesnou metodu identifikace HLV-infikovaných rostlin.
Tento technický problém je vyřešen provedeními vyjádřenými v patentových nárocích.
Jmenovitě, předložený vynález je založen na identifikaci genu obalové bílkoviny HLV a vyřešení jeho sekvence bází a tím také primární struktury uvedené bílkoviny.
Využitím genu pro HLV obalovou bílkovinu nebo DNA nesyntetizované podle jeho sekvence bází, může být HLV detekován genetickou metodou, například polymerázovou řetězovou reakcí (dále zkratka PCR) a Southemovou hybridizací. Například v PCR s částí sekvence bází nebo s DNA obsahující komplementární sekvenci jako očko, je HLV detekováno pomocí tvorby amplifikovaných produktů DNA, specifických ke HLV-infikovaným rostlinám. Kromě toho použitím hybridizace komplementárního vlákna DNA HLV genu, jako nukleotidové sondy, mohou být Southemovou analýzou pozorované specifické pásy s HLV-infikovaných rostlin.
Podstata vynálezu
Takto se předložený vynález týká DNA, která kóduje bílkovinu latentního viru chmelu vybrané ze skupiny skládající se z:
a) molekul nukleové kyseliny kódujících polypeptid obsahující sekvenci aminokyselin uvedenou v SEKV. IČ: 6 nebo 7;
b) molekul nukleové kyseliny obsahujících sekvenci nukleotidů uvedenou v SEKV. IČ: 1;
c) molekul nukleové kyseliny obsahujících sekvenci nukleotidů od nukleotidu 58 až do nukleotidu 975, nebo od nukleotidu 981 až do nukleotidu 1292 ze sekvence nukleotidů uvedené v SEKV. IČ: 1;
d) molekul nukleové kyseliny hybridizujících k molekulám nukleových kyselin, jak jsou definovány v a), b) nebo c); a
-1 CZ 293438 B6
e) molekul nukleových kyselin, u kterých je sekvence nukleotidů výsledkem degenerace genetického kódu DNA sekvencí definovaných v a), b), c) nebo d).
V tomto kontextu termín „hybridizace“ odpovídá spíše obvyklým hybridizačním podmínkám, jako hybridizačním podmínkám přísné hybridizace.
Dále se předložený vynález týká DNA, které hybridizují s DNA podle vynálezu a které kódují fragment nebo zmutovanou verzi bílkoviny, kódovanou výše popsanými DNA.
Předložený vynález se dále týká specifické sekvence molekul nukleových kyselin odvozených od DNA podle předkládaného vynálezu.
V tomto kontextu termín „specifická sekvence“ odpovídá molekulám nukleových kyselin, které po dobu hybridizace mohou specificky hybridizovat s geny a DNA podle předloženého vynálezu. Tak mohou být molekuly nukleových kyselin použity např. jako specifické nukleotidové sondy nebo specifická očka pro amplifikaci specifické sekvence, např. pro polymerázovou řetězovou reakci.
Výhodné provedení předloženého vynálezu se týká DNA kódující obalovou bílkovinu latentního viru chmelu, která obsahuje sekvenci bází popsanou pod identifikačním číslem 1 v seznamu sekvencí, kde
a) sekvence nukleotidů od 85 do 975 kóduje 306 zbytků aminokyselin a b) sekvence bází od 981 do 1292 kóduje 104 zbytků aminokyselin.
Předložený vynález se dále týká polypeptidů kódovaných s některou výše uvedenou DNA podle vynálezu.
Také se vztahuje na způsoby výroby uvedených polypeptidů včetně kultivace hostitelské buňky, které obsahují jakoukoli DNA podle vynálezu a izolaci polypeptidů z kultury. Důležité je, že uvedené DNA jsou účinně vázány na regulační jednotku umožňující jejich expresi v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Jako prokaryotické buňky jsou výhodné E. coli a jako eukaryotické buňky jsou výhodné rostlinné buňky.
Další výhodné provedení podle vynálezu zahrnuje rostlinné buňky, které obsahují jakoukoli z DNA výše uvedených ve vynálezu. Přesněji řečeno rostlinné buňky jsou odvozeny z chmelu.
Dále se vynález týká protilátek specificky rozpoznávajících polypeptidy z vynálezu.
Předložený vynález se dále týká diagnostického složení, které obsahuje jakoukoli z doposud uvedených DNA, molekul nukleových kyselin eventuálně obsahuje vektor, polypeptidy nebo protilátky specificky rozpoznávající takové polypeptidy samotné, nebo v kombinaci a optimálně výhodné pro detekci.
Podle dalšího provedení se vynález týká použití uvedených DNA a molekul nukleových kyselin, vektorů, polypeptidů a protilátek pro inženýrství patogenní rezistence rostlin.
Nejvýhodnějším provedením je, jestliže je patogen vir, především carlavir a nejvýhodnější je HLV a z rostlin je to chmel.
Gen obsahující DNA a RNA, kódující HLV obalovou bílkovinu a části zní, může být použit k detekci HLV. Jako nukleotidová sonda vhodná pro PCR a Southemovu hybridizací může být s výhodou použita sekvence bází ze seznamu sekvencí, např.
-2CZ 293438 B6
a) sekvence s identifikačním číslem 2 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 105 do 23),
b) sekvence s identifikačním číslem 3 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 457 do 474),
c) sekvence s identifikačním číslem 4 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 618 do 637),
d) sekvence s identifikačním číslem 5 (shodná se sekvencí s identifikačním číslem 1, od 761 do 781).
Tyto DNA se mohou získat extrakcí a purifikací z HLV nebo připravit použitím automatického syntezátoru DNA. Zejména krátké jednovláknové DNA, například sekvence bází s identifikačním číslem od 2 do 5 mohou být obvy kle získány chemickou syntézou.
Dále se předpokládaný vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje amplifikaci DNA reverzní transkripcí PCR, uskutečněnou s nukleovou kyselinou extrahovanou z chmelu, která slouží jako templát a kterákoli syntetická sekvence s identifikačním číslem 2 až 5 slouží jako očko a k elektroforetické analýze takto získaných produktů.
Přesněji, HLV mohou být detekovány sDNA, amplifikovanou reverzní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 2 a 4 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů k potvrzení specifického DNA fragmentu obsahujícího 233 párů bází.
Podobně HLV mohou být detekovány s DNA. amplifikovanou reverzibilní transkripci PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 3 a 4 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifíkovaxiých produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 188 párů bází.
Také HLV mohou být detekovány sDNA, amplifikovanou reverzibilní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 2 a 5 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 377 párů bází.
Kromě toho HLV mohou být detekovány s DNA, amplifikovanou reverzibilní transkripcí PCR se syntetickými sekvencemi DNA s identifikačním číslem 3 a 5 sloužícími jako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktů potvrzujících specifický fragment DNA obsahující 325 párů bází.
Dále se předložený vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje hybridizaci nukleové kyseliny extrahované z chmelu, očko obsahující syntetickou dna s identifikačním číslem 4 nebo 5, nebo komplementární vlákno DNA prodloužené pomocí DNA používanými jako očko.
Dále se předložený vynález týká způsobu detekce HLV, přičemž způsob zahrnuje nukleovou kyselinu extrahovanou z chmelu a restrikční enzymový fragment DNA popsaný v sekvenci s identifikačním číslem 1 sloužící jako nukleotidová sonda.
Dále se předložený vynález týká HLV obalové bílkoviny, přepsané ze sekvence bází od 58 do 975 sekvenčního identifikačního čísla 1 v sekvenčním seznamu, obsahující 306 zbytků aminokyselin sekvence s identifikačním číslem 6 v sekvenčním seznamu.
- J CZ 293438 B6
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je sekvence aminokyselin obalové bílkoviny latentního viru chmelu, analyzovaná bílkovinným sekvenčním analyzátorem.
Obr. 2 je elektroforetická fotografie zobrazující výsledky genové diagnózy latentního viru chmelu, použitím PCR.
V předloženém vynálezu, gen HLV je analyzován následujícími postupy k identifikaci obalové bílkoviny HLV a vyřešení její sekvence bází.
1. Izolace HLV.
HLV může být z chmelu izolován standardními metodami, např., zahrnujícími koncentraci viru s polyethylenglykolem, přečištění extraktu organickými rozpouštědly a tepelné zpracování, frakční centrifugaci, centrifugaci v sacharózovém gradientu, atd.
2. Extrakce RNA z HLV.
Extrakce může být provedena standardními metodami, například SDS-fenolovou metodou, která se hlavně používá pro jiné rostlinné viry.
3. Klonování s cDNA.
Jako preparát se využívá RNA extrahovaná z částí HLV a dvojvláknová cDNA je in vitro syntezovaná Gubler-Hoffmanovou metodou (Gubler and Hoffman, Gene, 25,263 (1983)). Takto nasyntetizovaná cDNA je inkorporována do plazmidového vektoru ligací, použitím standardních technik. Případné plazmidové vektory, které mohou být použity, jsou pUC19, pBluescriptlI, atd. Kompetentní buňky E. coli jsou transformovány použitím uvedené ligační směsi. Z takto získaných transformátů jsou vybrány a purifikovány rekombinantní plazmidy, které obsahují cDNA.
4. Sekvence bází cDNA odvozená zgenomu HLV při použití rekombinantního plazmidu, získaného výše popsanou metodou, může být stanovena podle Maxam-Gilbertové metody (Maxam and Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 560 (1977)), nebo dideoxy metodou (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).
Takže sekvence bází DNA zahrnující gen, kódující HLV obalovou bílkovinu (dále zkráceno jako HLV gen obalové bílkoviny), je stanovena a je popsána v sekvenci s identifikačním číslem 1 v seznamu sekvencí.
5. Stanovení částečné sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny.
Toto je provedeno pomocí analyzátoru bílkovin (ABI) po částečném opracování HLV obalové bílkoviny, následnou frakcionací a purifikací výtěžku pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie. Takto stanovená částečná sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny se sekvencí odvozené ze sekvence HLV genu obalové bílkoviny ukázané v sekvenčním seznamu, primární struktura (sekvence aminokyselin) obalové bílkoviny byla vyřešená (viz obr. 1).
6. Virová genová diagnóza HLV-infikovaného chmelu.
1) Diagnóza genu reverzní transkripcí PCR
Očko DNA, dlouhé pravděpodobně 20 bází, obsahující částečnou sekvenci HLV genu obalové bílkoviny, která byla stanovená výše popsanou metodou nebo sekvencí bází jako
-4CZ 293438 B6 komplementárního vlákna, je syntetizováno standardními metodami. Virová genová diagnóza HLV-infikovaného chmelu je možnou detekce přítomného nebo nepřítomného amplifikovaného produktu získaného pomocí PRC, při použití uvedeného očka.
Jako očka mohou být použity oligonukleotidy, zahrnující sekvenci bází se sekvencemi s identifikačním číslem 2 až 5 v sekvenčním seznamu. Mezi nimi, sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 2 sekvenčního seznamu je stejná jako sekvence bází od 405 do 423 popsaná v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 3P. Sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 3 sekvenčního seznamu je stejná jako sekvence bází od 457 do 474 popsaná v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 4P. Také sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 4 v sekvenčním seznamu je komplementární vlákno sekvence bází od 618 do 637 sekvence bází popsané v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 3M. Sekvence bází popsaná v sekvenci identifikačního čísla 5 v sekvenčním seznamu je komplementární vlákno sekvence bází od 761 do 781 sekvence bází popsané v sekvenci identifikačního čísla 1 a dále označená 4M.
Také mohou být jako očka použity oligonukleotidy zahrnující část sekvence bází popsané v sekvencích s identifikačním číslem 2 až 5. To znamená, dokud PCR je primární metodou pro amplifikaci kopie specifických genových informací získaných z mnoha sekvencí bází, oligonukleotidy obsahující sekvenci bází podobnou očkům v předloženém vynálezu, mohou být použity podobně jako očka.
Očka DNA, použité v předloženém vynálezu mohou být získány např. β-kyanoethylfosfoamidovou metodou nebo komerčním automatickým DNA syntetizátorem, používajícím thiofosfitovou metodu.
Nukleové kyseliny z chmelových rostlin, použité v předloženém vynálezu, mohou být extrahovány kteroukoli standardní metodou, která je obvyklá pro extrakci nukleových kyselin.
Použitím takto získané nukleové kyseliny z chmelu a očka popsaná výše, DNA odvozené z HLV genomu jsou amplifikovány kombinací technik reverzibilní transkripce virových RNA s polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). PCR je postup opakujícího se DNA replikačního cyklu, zahrnující stupeň denaturace, tepelné hybridizace očka a elongace pomocí DNA polymerázy a tato všeobecná metoda je popsána např. v Saiki et al., Science, 230,1350-1354, atd.
PCR provedená v předloženém vynálezu je doložena metodou, ve které se DNA replikační cyklus opakuje pravděpodobně 20 až 50 krát, s výhodou pravděpodobně 25 až 40 krát, v amplifikačním tlumivém roztoku skládajícím se z 1,0 mM až 4,0 mM, pravděpodobně 1,5 mM až 3,0 mM MgCl2 roztoku, který byl předtím smíchán se syntetickými oligonukleotidy, DNA polymerázou, 4 typy nukleotidů (dATP, dTTP, dCTPa dGTP) a chmelovými DNA, chloridem draselným, želatinou, hovězím sérovým albuminem, povrchově aktivní látkou (Tween 20, NP-40, Triton X-100, atd. (vše obchodní názvy)), dimethylsulfoxidem atd.
Kromě toho může být proveden každý krok v PCR za následujících podmínek.
Denaturační krok je proveden zahřátím obecně při 90 °C do 95 °C, s výhodou při 94 °C do 95 °C, pravděpodobně 1 až 3 minuty, s výhodou 1 až 2 minuty.
Stupeň tepelné hybridizace očka je proveden inkubací s očky obecně při teplotě 30 °C do 50 °C, s výhodou při teplotě 35 °C do 42 °C po dobu 1 až 3 minut, s výhodou po dobu 1 až 2 minut.
Elongační stupeň pomocí DNA polymerázy je výhodný pomocí termostabilní DNA polymerázy obecně při teplotě 70 °C do 73 °C, s výhodou při teplotě 72 °C do 73 °C, po dobu 1 až 4 minut, s výhodou 2 až 3 minut. Jako příklad DNA polymerázy může být uveden komerční produkt od Perkin Elmera, s.r.o..
-5CZ 293438 B6
Takto amplifíkované DNA mohou být vizualizovány barvicí metodou, použitím sloučeniny, která interaguje s nukleovými kyselinami, např. barviva fenantridinové série, například ethidiumbromid atd., a která je předtím přidána k elektroforetickému tlumivému roztoku, např. v konečné koncentraci pravděpodobně 5pg/ml a během elektroforézy, při ozáření gelu ultrafialovým světlem při 254 nm nebo 366 nm ve tmě, mohou být pozorovány červené pásy DNA-ethidiumbromidového komplexu. Avšak obecně, červené pásy DNA-ethidiumbromidového komplexu jsou detekovatelné ponořením elektroforetického gelu do roztoku ethidiumbromidu atd. po dobu pravděpodobně 10 až 60 minut po skončení elektroforézy a následně se gel ozáří ultrafialovým světlem při 254 nm nebo 366 nm ve tmě.
Virová infekce může být identifikována potvrzením přítomnosti nebo nepřítomnosti amplifikovaných DNA. Takže, když PCD je provedena s tím stejným očkem, specifická amplifikovaná DNA je detekovaná se vzorky pocházejícími z chmelu infikovaného virem, ale ne se vzorky z neinfikovaného chmelu.
Např. HLV může být detekován podle metody patentového nároku 14, přítomností specifického DNA fragmentu obsahujícího 233,181,377 a respektive 325 párů bází.
2) Diagnóza genu hybridizací
Diagnóza HLV na rozdíl od obvyklého stanovení imuno-testem, může být provedena nukleotidy, které mají sekvenci komplementární ke genu kódujícímu HLV obalovou bílkovinu, připravenými chemickou syntézou nebo genovou manipulací a hybridizujícími s oligonukleotidy jako očky.
Používané nukleotidové sondy jsou obecně dlouhé 20 až několik tisíc párů bází a měly by být např. takové, které mají sekvenci bází popsanou v sekvenční identifikaci číslo 6 a 7 v sekvenčním seznamu a fragmenty DNA získané účinkem restrikčních enzymů z cDNA, která byla připravena z plazmidů získaných klonováním genu HLV obalové bílkoviny. Tyto nukleotidové sondy jsou používány k hybridizací po označení izotopy, biotinem, fluorescerem atd., standardními metodami.
Při použití nukleových kyselin při hybridizací se mohou extrahovat standardními metodami, např. standardními metodami extrakce nukleových kyselin, které jsou popsané např. v Murray & Thomson, Nucl. Acid Res., 8, 4321-4325, (19980), atd. Takto získané nukleové kyseliny jsou předmětem denaturačního opracování a pak jsou nakapány na membránový filtr, například nitrocelulózový filtr nebo nylonový filtr, vhodný je např., Hybond-N+ (Amersham).
Denaturační opracování nukleových kyselin se provádí zahřátím nukleové kyseliny v roztoku obsahujícím formamid, formaldehyd, MOPS, kyselinu octovou, EDTA atd. při 60 °C až 70 °C, s výhodou při 75 °C, 5 až 20 minut, s výhodou 15 minut, s následným rychlým ochlazením. Po tomto denaturačním opracování se nukleové kyseliny smíchají s 20 x SSC a pak se nakapou na membránový filtr.
Hybridizace se provede použitím takto získaného membránového filtru (s nakapanými nukleovými kyselinami z chmelu) a sondy v hybridizačním roztoku při 42 °C až 65 °C, s výhodou při 46 °C, 12 až 20 h, s výhodou 16 h. Potom se membránový filtr promyje, vysuší a přítomnost nebo nepřítomnost signálu v kapkách se prověří detekčními metodami jako je např. autoradiografie, atd.
Takže signál je detekovaný nukleovými kyselinami pocházejícími z virem-infikovaného chmelu, protože hybridizují s nukleotidovou sondou, ale nedetekovatelný, jestliže pocházejí z neinfikovaného chmelu, protože nedochází k hybridizací.
-6CZ 293438 B6
Příklady provedení vynálezu
V následujícím bude předložený vynález popsán detailně s odkazy na příklady, které jsou určeny pro ilustraci a neomezují vynález.
Příklad 1
Izolace HLV
Mladá úponková rostlina HLV-infikovaného chmelu (1 kg) se rozemele se 3-mi objemy 0,05M tlumivého roztoku (obsahujícího 0,2 % askorbové kyseliny, 0,2 % nikotinu a 0,2 % PVP, pH 8,0), nechala se stát 1 h při pokojové teplotě a filtrovala se přes gázu, aby se získala surová šťáva. Šťáva se tepelně zpracovala (při 55 °C, 8 min.), okamžitě se ochladila v ledové lázni a centrifugovala se při 3000 x g, 30 min, aby se získal supematant. K tomuto supematantu se přidal polyethylenglykol a chlorid sodný v koncentraci 5%, respektive 0,5 M a výsledný roztok se 1 h míchal a pak centrifugoval při 3000 x g, 30 min. Takto získaná sraženina byla suspendována v 0,5M fosfátovém tlumivém roztoku (obsahujícím 0,2M EDTA, pH 7,4).
Dále výše uvedená suspenze se centrifugovala při vysokých otáčkách (při 15 000 x g, 10 min), aby se získal supematant, který pak byl ultracentrifugován (při 100 000 x g, 120 min), aby se získala sraženina. Tento proces se opakoval dvakrát, aby byla virová frakce bez kontaminace.
Takto získaná sraženina se suspendovala v 2 ml 0,01 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0) a centrifugovala se (při 150 000 x g, 120 min.) v sacharózovém hustotním gradientu (20 až 10%), aby se sesbíraly frakce, které obsahují vir. Nakonec byly frakce centrifugovány při 180 000g, 150 min., aby se získala sraženina, obsahující virové částice, která byla dále rozsuspendována v 0,01 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0) a uložena jako vyčištěný virový preparát.
Je třeba ještě uvést, že výše popsané postupy se prováděly při 4 °C.
Příklad 2
Extrakce RNA z HLV.
Extrakce RNA z částic HLV se provedla SDS-fenolovou metodou (Proll et al., Potato research 24,1-10,(1981)).
K vyčištěnému preparátu HLV (1 pg/ml, 84 μΐ), získaného stejnou metodou jako v příkladu 1, se přidal 20% SDS (5 μΐ), 20 x SCC (1 μΐ) a proteáza (výrobní název: Proteáza K) (lOmg/ml, 10 μΐ) a výsledná směs se ohřívala při 37 °C, 30 min.
Pak se provedla fenolová extrakce přidáním 0,5% bentonitové suspenze (50 μΐ) a TE-nasyceného fenolu (150 μΐ) kvýše uvedené směsi a následná druhá extrakce při použití směsi fenol: chloroform (1:1, v/v). Vodná vrstva se extrahovala chloroformem. Ktéto vodné vrstvě se přidal 3 M octan sodný (10 μΐ) a chlazený ethanolem (250 μΐ) a směs se nechala stát při -80 °C, 30 min. Pak se směs centrifugovala při 15 000 x g, 5 min, aby se získala sraženina. Sraženina se promývala centrifugací v 70% ethanolu. Po odstranění ethanolu sušením se takto získaná sraženina rozpustila v destilované vodě (50 μΐ). K. tomuto roztoku se přidal 4M chlorid lithný (50 μΐ) a výsledná směs se v ledu nechala stát přes noc.
Výše uvedená směs se centrifugovala při 15 000 x g, 5 min., aby se získala sraženina, která se znovu promyla centrifugací v 70% ethanolu, jak bylo uvedeno výše. Po odstranění ethanolu sušením, se sraženina rozpustila v destilované vodě (8 μΐ) a uložila jako vzorek RNA.
Příklad 3
Klonování cDNA cDNA byla připravena ze vzorku RNA připravené v Příkladě 2 za použití cDNA syntetizační soupravy (Amersham) podle protokolu specifikovaného dodavatelem a rozpuštěná v TE tlumivém roztoku (1 μΐ).
Pak se plazmid pUCl 19 (500 ng/μΐ) rozštěpil s SmaL a defosforyloval. K štěpu (2 μΐ) se přidala nasyntezovaná cDNA (1 μΐ), 10 mM ATP, 10 x ligační tlumivý roztok (Behringer), T4DNA ligáza (5 U/μΙ, Behringer) a destilovaná voda (13 μΐ) a směs se kvůli ligaci inkubovala přes noc při 22 °C.
Připravily se kompetentní buňky Escherichia coli MV1184 a smíchali se s ligačním reakčním roztokem (100 μΐ) a nechaly se stát v ledu 30 min.
Pak se reakční roztok, ohřívaný 60 sekund při 37 °C, okamžitě ochladil ledem, smíchal se s SOC médiem (500 μΐ) a výsledná směs se udržovala 1 h, při 37 °C. K této směsi se přidalo z každého, 2% X-gal a 100 mM IPTG po 50 μΐ a výsledná směs se rozetřela na dvě 2 x YT agarové plotny obsahující ampicilin (50 μΐ/ml) a inkubovala se přes noc při 37 °C.
Z bílých kolonií E. coli se takto získané plazmidy DNA extrahovaly standardními metodami a vybraly se a uložily buňky mající dlouhé cDNA inzertní fragmenty.
Pak se kvůli potvrzení, že cDNA pochází z HLV genomu, se vyčištěná HLV-RNA částečně denaturovala alkáliemi a vybraná jednovláknová cDNA se podrobila Southemové hybridizaci při použití nukleotidové sondy, značené s T4 polynukleotid kinázou na 5-konci s [γ32 P]ATP.
Výsledkem je získání kmene E. coli nesoucí plazmid cDNA s inzertními fragmenty dlouhými 0,7 kb, 1,2 kb, 1,35 kb, 3,5 kb a 5,0 kb pocházejícími z HLV genomu.
Příklad 4
Stanovení sekvence bází cDNA, pocházející z HLV genomu
Buňky E. coli, nesoucí plazmid cDNA inzertním fragmentem pocházejícím z HLV genomu, který byl získán v Příkladu 3, se kultivoval na třepačce přes noc v 2 x YT médiu, při 37 °C a plazmid se vyčistil standardní metodou. cDNA fragmenty pocházející z HLV genomu byly připraveny zplazmidu standardními metodami a s fragmenty jako templátem a jejich sekvence bází byla dekódována pomocí dideoxy metody (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)), použitím DNA sekvenátoru (ABI) a sekvenční soupravy (USB, SEQUENASE) a z toho se stanovila sekvence dlouhá 1375 bází.
Výsledkem toho byla identifikace dvou otevřených čtecích rámců (sekvence bází od 58 do 975 a sekvence bází od 981 do 1292 sekvence identifikačního čísla 1 ze sekvenčního seznamu) údajně kódujících HLV obalovou bílkovinu (306 aminokyselinových zbytků, molekulová hmotnost pravděpodobně 31,4 kD) a pro bílkovinu pravděpodobně 12,0 kD a 101 aminokyselinových zbytků.
-8CZ 293438 B6
Kromě toho domnělé sekvence aminokyselin odvozené z každé sekvence bází jsou ukázány v sekvenci identifikačního čísla 6 a 7 sekvenčního seznamu. Mezi nimi, protože sekvence aminokyselin ukázaná v sekvenci identifikačního čísla 6 obsahuje sekvencí odpovídající části sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny níže detailně popsané, jejich přítomnost byla potvrzená.
Velmi se očekává, že tento vynález přispěje k produkci chmelové rezistence uvedeného viru transformací takto získaného genu kódujícího HLV obalovou bílkovinu. A tak transformace takových mikroorganismů jako E. coli atd., se jmenovanou obalovou bílkovinou, kódovanou takto získaným genem umožňuje produkci uvedené bílkoviny. Tedy na základě sekvence aminokyselin uvedené bílkoviny se zní může získat fragment použitím např. bílkovinného analyzátoru, atd. Obalová bílkovina nebo fragment zní se může použít kprodukci HLV protilátek, využitelných k detekci HLV.
Příklad 5
Stanovení částečné sekvence aminokyselin HLV obalové bílkoviny
Vyčištěný vzorek HLV obalové bílkoviny (1 μΐ/ml, 120 μΐ) připravená v Příkladu 1 se částečně opracovala proteolytickým enzymem (Lysyl Endopeptidase, Wako Pure Chemicals), 16 h, při pokojové teplotě (25 °C). Fragmenty takto získaných peptidů se čistily frakcionací reverzní fázovou HPLC (použitím RepRPC HR5/5 kolony, Pharmacie), a jejich sekvence aminokyselin se analyzovala zN-konce bílkovinným sekvenátorem (ABI). Zjistilo se, že sekvence aminokyselin na N-koncích třech peptidových fragmentů je zcela identická s domnělou sekvencí aminokyselin HLV obalové bílkoviny. N-konec sekvence aminokyselin těchto tří peptidových fragmentů a jejich lokalizace v sekvenci aminokyselin v HLV obalové bílkovině jsou znázorněny na Obr. 1.
Příklad 6
Stanovení přítomnosti HLV v HLV-infikovaném chmelu reverzibilní transkripcí PCR
Lístky HLV-infikovaného chmelu (kultivar, Shinsu Wase) a chmelu bez viru (kultivar, Shinsu Wase) (každého 0,1 g) se rozemlely v 0,5 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0, 1 ml) a extrahovaly chloroformem. Pak se supematant opracoval fenolem třikrát etherem a přidal se ethanol, aby se nukleové kyseliny vysrážely. Takto získaná sraženina se promyla centrifugací v 70% ethanolem a potom se nadbytečný ethanol odstranil sušením a sraženina se rozpustila v TE tlumivém roztoku (100 μΐ). Z toho se použilo 2 μΐ podílu na reverzibilní transkripci PCR.
Pro PCR byla vybrána čtyři různá očka na základě existujících sekvencí bází a syntezována standardními metodami s použitím DNA syntetizátoru Model 380B (ABI), které mají sekvenci bází popsánu v sekvencích identifikačního čísla 2 až 5 (označených 3P, 4P, 3M, resp. 4M). Každé očko se pro reverzní transkripci PCR použilo v kombinaci 3P/3M, 4P/3M, 3P/4M a 4P/4M.
Reverzní transkripční reakce byla provedena v tlumivém roztoku Tris-HCl (pH 8,3) skládajícím se z 75 mM KC1, 3mM MgCl2, 10 mM DTT a 0,5 mM dNTPs komplementárním vláknovým očkem (25 pmol) a reverzní transkriptázou (ANV-RTase XI, Takara Shuzo, 5 jednotek) a k tomu se přidala nukleová kyselina chmelu (2 pg) připravená, jak je uvedeno výše, na 30 min., při 55 °C.
Pak se k výše uvedené reakční směsi přidala termostabilní DNA polymeráza (Behringer, 0,5 jednotky) a pro amplifikaci očko (25 pmol) a provedla se PCR. Objem reakčního roztoku byl
-9CZ 293438 B6 upraven na 10 μΐ a na povrch se navrstvil minerální olej (20 μΐ), aby se zabránilo odpařování reakční směsi.
Každý stupeň se provedl za následujících podmínek. Jeden cyklus PCR se skládá z denaturačního stupně při 94 °C, 1 min., z tepelné hybridizace očka při 55 °C, 1 min. a ze stupně elongace DNA při 72 °C, 5 min. a uloží se při 4 °C.
Amplifikované genomické DNA, získané výše popsaným PCR se analyzovaly elektroforézu na agarózovém gelu.
DNA se frakcionovaly elektroforézou na 2% agarózovém gelu v Tris-borátovém tlumivém roztoku (pH 8,0), obsahujícím 2 mM EDTA, 30 min., při 100 V. Jako markéry velikosti se použily markéry molekulových hmotností DNA a DNA opracovaná restrikčními enzymy HindlII a EcoRI (Nippon Energy).
Po skončení elektroforézy se gel ponořil na 10 min. do vodného roztoku ethidiumbromidu (0,5 μΐ/ml) a červené pásy DNA-ethidiumbromidového komplexu byly detekovány po ozáření gelu ve tmě UV při 254 nm.
Výsledky elektroforézy (dvakrát opakované) jsou znázorněny na Obr. 2, kde DW znamená sterilizovaná voda.
Výsledkem agarózové gelové elektroforézy je, že se získaly specifické DNA amplifikované fragmenty z HLV-infikovaného chmelu v závislosti na použitém očku, ale nebyly získány z neinfikovaného chmelu, což umožňuje tyto dva vzorky rozlišit.
Specifické amplifikované fragmenty DNA odpovídající použitým očkům byly následující, 3P/4M: 233 párů bází 4P/3M: 181 párů bází 3P/4M: 377 párů bází a 4P/4M: 325 párů bází.
Příklad 7
Stanovení přítomnosti HLV v HLV-infikovaném chmelu pomocí dot blotovou hybridizací
Lístky HLV-infikovaného chmelu (kultivar, Shinsu Wase) a chmelu bez viru (kultivar, Shinsu Wase) (každého 0,1 g) se rozemlelo v 0,05 M fosfátovém tlumivém roztoku (pH 8,0, 1 ml) a extrahovalo chloroformem. Pak se supematant opracoval s chloroformem a třikrát etherem a přidal se ethanol, aby se nukleové kyseliny vysrážely. Pak se takto získaná sraženina promyla centrifugací v 70% ethanolu a po odstranění nadbytečného ethanolu se sraženina rozpustila v TE tlumivém roztoku (100 μΐ). Z toho se 2 μΐ podílu přidalo ke třem objemům tlumivého roztoku denaturujícího nukleové kyseliny (skládajícího se z 63% formamidu, 20% formaldehydu, 1,54 M MOPS, 6,5 mM octanu sodného a 1,3 mM EDTA) a směs se ohřívá 15 min při 65 °C a potom se okamžitě ochladí. K tomuto roztoku se přidalo 8 μΐ 20 x SSC (skládajícího se z 0,15M chloridu sodného, 0,015M citrátu sodného, pH 7,0) a promíchalo. Z toho se 10 μΙ podílu nakapalo na membránový filtr (Amersham, výrobní název Hyobond-N+) a byla provedena bodová hybridizace.
Výsledkem toho je vyřešení genové struktury, která kóduje HLV obalovou bílkovinu a vyvinutí způsobu detekce HLV podle vynálezu, kde zdlouhavé postupy, tak jako jsou obvyklá izolace HLV, příprava antiséra, čištění protilátek atd., se stávají nepotřebnými a přístupnou se stává diagnóza virů HLV-infikovaného chmelu, která je pohodlnější a přesnější jako ELISA. Kromě toho předložený vynález může přispět k produkci chmelu rezistentního vůči HLV použitím nukleových kyselin, bílkovin a protilátek z vynálezu.
-10CZ 293438 B6
SEKVENČNÍ SEZNAM:
1) VŠEOBECNÉ INFORMACE:
(i) PŘIHLAŠOVATEL:
(A) NÁZEV: SAPPORO BREWERIES LTD.
(B) ULICE: 20-1, Ebisu 4-chome, Shibuya-ku (C) MĚSTO: Tokyo (E) STÁT: Japonsko (F) POŠTOVNÍ KÓD: 150 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: GENY LATENTNÍHO VIRU CHMELU A
ZPŮSOB JEJICH DETEKCE (iii) POČET SEKVENCÍ: 7 (iv) FORMA ROZPOZNÁVACÍ POČÍTAČEM (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRÁVO PŘEDNOSTI Z PŘIHLÁŠKY:
(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-302297 (B) DATUM PODÁNÍ: 27. 10. 1995 (vi) PRÁVO PŘEDNOSTI Z PŘIHLÁŠKY:
(A) PŘIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-352285 (B) DATUM PODÁNÍ: 28. 12. 1995 (2) INFORMACE O SEKV. IČ 1:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1375 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: bílkovina
-11 CZ 293438 B6 (xi) POPIS SEKVENCE IČ 1:
TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG 60
GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120
GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180
TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240
AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300
CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360
CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420
AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480
CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540
AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600
GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660
TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720
GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780
AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840 ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900
GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960
TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020
TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080
ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAG AAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140
GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200
ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260
GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320
TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375 (2) INFORMACE O SEKV. IČ 2:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 19 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ 2:
TGAGGTCGTG TCAAACAAC (2) INFORMACE O SEKV. IČ 3:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
-12CZ 293438 B6
| (A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární | ||
| (xi) POPIS SEKVENCE IČ 3: | 18 | |
| GTTGATCTGG AGGGGTTG | ||
| (2) | INFORMACE 0 SEKV. IČ 4: (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: (A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ 4: | |
| TCTCGGCATC CTTCTTTATT | 20 | |
| (2) | INFORMACE 0 SEKV. IČ 5: (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE: (A) DÉLKA: 21 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina | |
| (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE IČ 5: | ||
| TTTCAACGTA ATCCAAGCAA T | 21 | |
| (2) | INFORMACE 0 SEKV. IČ 6: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 306 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (ii) TYP MOLEKULY: peptid |
-13CZ 293438 B6 (xi) POPIS SEKVENCE IČ 6:
Met Ala Asp Lyz Gin Gly Gin Met Tre Glu Gin Gin Lyz.Val Asp Ser 15 1015
Gin Lyz Leu Gin Gly Glu Ala Lyz Asn Lys Glu Lyz Ala Glu Ser Ser 20 2530
Lyz Arg Lyz Asp Glu Leu Leu Lyz Lyz Tyr lle Asp Pro Gly Leu Gly
4045
Ser Asp Asp Asp Glu Glu Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lyz Leu 50 5560
Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg Ala Ala lle Arg Val Tre Asn Ala 65 70 7580
Gly Leu Glu Tre Gly Arg Pro Ala Leu Lyz Pro Tre Pro Asp Met Leu 85 9095
Pro Asp Pro Tre Asn Pro Tyr Asn Lyz Pro Ser Leu Asp Ala Leu Leu 100 105110
Met lle Lyz Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Tre Ser Glu Asp 115 120125
Met Met Lyz lle Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu 130 135140
His Val Gin Ser Val lle Leu Gin Ala Val Phe Tyr Cys Lyz Asp Ser 145 150 155160
Ser Ser Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Try Arg Gly 165 170175
Gly Ala lle Ser Ala Asp Ser Val Leu Ala lle lle Lyz Lyz Asp Ala 180 185190
Glu Tre Leu Arg Arg Val Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Tre Try Asn 195 200205
Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro Pro Ser Asp Try Ser Glu Met Gly 210 215220
Phe Gin Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe Asp Cys Leu Asp Tyr Val 225 230 235240
Glu Asn Ala Ala Ala Val Gin Pro Leu Glu Gly Leu lle Arg Val Pro 245 250255
Tyr Ala Arg Glu Lyz lle Ala Asn Lyz Tre His Lyz Asp Leu Ala Leu 260 265270
Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gin Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu lle 275 280285
Tre Gly Gly Lyz Asn Gly Pro Glu Leu Gin Arg Asp Tyr Ser Lyz Ser 290 295300
Asn Asn
305
-14CZ 293438 B6 (2) INFORMACE O SEKV. IČ 7:
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 104 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP: peptid (xi) POPIS SEKVENCE IČ 7:
Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lyz Phe Leu Glu 15 1015
Gin Cys Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met lle Ser Leu Gin 20 2530
Val His Arg Pro Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg 35 4045
Arg Ala Lys Leu Val Gly Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Try Pro 50 5560
Pro Tre Ala Phe Tre Tre Arg Cys Asp Asn Lyz Tre Cys Phe Pro Gly 65 70 7580
Leu Tre Tyr Asn Ala Ser lle Ala Arg Phe lle Arg Asp Gly Val Tre 85 9095
Glu Val lle Pro Ser Ala Pro Asn
Claims (26)
Hide Dependent
translated from
Claims (26)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÉ NÁROKY1. DNA kódující obalový protein latentního viru chmelu vybraná ze skupiny sestávající z:a) molekul nukleových kyselin kódujících polypeptid obsahujících sekvenci aminokyselin uvedenou v SEKV. IČ: 6 nebo 7;b) molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů uvedenou v SEKV. IČ: 1;c) molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů od nukleotidů 58 až do nukleotidu 975, nebo od nukleotidu 981 až do nukleotidu 1292 ze sekvence nukleotidů uvedené v SEKV IČ: 1;d) molekul nukleových kyselin hybridizujících ze stringentních hybridizačních podmínek s molekulami nukleových kyselin, které jsou definovány v a), b) nebo c); ae) molekul nukleových kyselin, jejichž sekvence nukleotidů je výsledkem degenerace genetického kódu DNA sekvencí, které jsou definovány v a), b), c) nebo d).- 15CZ 293438 B6
- 2. DNA, která hybridizuje s DNA podle nároku 1 a která kóduje fragment nebo zmutovanou verzi obalového proteinu latentního viru chmelu, který je definován v nároku 1.
- 3. Molekula nukleové kyseliny, nejméně 15 nukleotidů dlouhá, hybridizující za stringentních hybridizačních podmínek specificky s DNA podle nároku 1 nebo její komplementární vlákno.
- 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, vybraná ze skupiny skládající se z molekul nukleových kyselin obsahujících sekvenci nukleotidů udanou v SEKV. IČ: 2, 3,4, a 5.
- 5. Vektor obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2.
- 6. Vektor podle nároku 5, kde DNA je účinně vázána na regulační jednotku umožňují expresi v prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buňkách.
- 7. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 5 nebo 6.
- 8. Hostitelská buňka podle nároku 7, kterou je bakteriální, houbová, rostlinná nebo živočišná buňka.
- 9. Polypeptid kódovaný pomocí DNA podle nároku 1 nebo 2.
- 10. Způsob výroby polypeptidu latentního viru chmelu podle nároku 9, vyznačující se tím, že se hostitelské buňky podle nároků 7 a 8 kultivují za podmínek dovolujících expresi polypeptidu, načež se získají produkované peptidy.
- 11. Protilátky rozpoznávající specificky polypeptidy podle nároku 9.
- 12. Diagnostická kompozice k detekci latentního viru chmelu, vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle nároku 1 nebo 2, molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, vektor podle nároku 5 nebo 6, polypeptid podle nároku 10 a/nebo protilátku podle nároku 11 a případně prostředky vhodné pro detekci.
- 13. Způsob detekce latentního viru chmelu nebo příbuzného rostlinného viru, vyznačující se t í m , že se z rostlin získají nukleové kyseliny, načež se amplifíkuje cílová nukleová kyselina reverzní transkripční řetězovou reakcí za použití získané nukleové kyseliny jako templát a molekuly nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4 jako primer; přičemž se následně provede analýza takto získaných amplifikovaných produktů, případně elektroforetická analýza, a tím i detekce přítomnosti latentního viru chmelu.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že jako primery na amplifikaci cílové nukleové kyseliny jsou vybrány primery v páru ze skupiny skládající se z oligonukleotidů, jejichž sekvence nukleových kyselin je udána v SEKV. IČ: 2 a 4, SEKV. IČ: 3 a 4, SEKV. IČ: 2 a 5 a SEKV. IČ: 3 a 5 a elektroforetická analýza takto získaných amplifikovaných produktů potvrzuje přítomnost nebo nepřítomnost specifických fragmentů DNA obsahujících 233, 181, 377 respektive 325 párů bází.
- 15. Způsob detekce latentního viru chmelu, vyznačující se tím, že se provede extrakce nukleových kyselin z rostlin; načež se získané nukleové kyseliny hybridizují spróbou obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2 nebo molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4 a provede se detekce na výskyt specifickou hybridizací.
- 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že próba obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 4 nebo k ní komplementární nukleovou kyselinu prodlouženou o molekulu nukleové kyseliny jako primeru.-16CZ 293438 B6
- 17. Rostlinné buňky, obsahující DNA podle nároku 1 nebo 2, nebo molekulu nukleové kyseliny podle nároku 3 nebo 4, nebo vektor podle nároků 5 nebo 6.
- 18. Rostlinné buňky podle nároku 17, kde rostlinou je chmel.
- 19. Použití DNA podle nároku 1 nebo 2, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 20. Použití DNA podle nároku 3 nebo molekuly nukleové kyseliny podle nároku 4, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 21. Použití vektoru podle nároku 5 nebo 6, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 22. Použití hostitelské buňky podle nároku 7 nebo 8, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 23. Použití polypeptidu podle nároku 9, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 24. Použití protilátky podle nároku 11, pro generování rezistence rostlin vůči patogenům.
- 25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 19 až 24, kde patogenem je vir.
- 26. Použití podle nároku 25, kde virem je latentní vir chmelu a rostlinou je chmel.