SK283202B6

SK283202B6 - Gény latentného vírusu chmeľu a spôsob ich detekcie

Info

Publication number: SK283202B6
Application number: SK1388-96A
Authority: SK
Inventors: Narushi Suda; Yutaka Itoga; Tatsuzi Hataya
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd.
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 2003-03-04
Also published as: DE69635882D1; AU717790B2; EP0775747A3; CZ317096A3; SK138896A3; US6132960A; US5869235A; AU7033796A; EP0775747B1; CA2188900A1; CZ293438B6; DE69635882T2; EP0775747A2; CN1157325A; CN1154731C; JPH09173100A

Abstract

Je uvedená DNA kódujúca bielkovinu latentného vírusu chmeľu vybraná zo skupiny pozostávajúcej z: (a) molekúl nukleových kyselín kódujúcich polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 6; (b) molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 58 až 975 z nukleotidovej sekvencie udanej v SEKV IČ: 1; (c) molekúl nukleovej kyseliny hybridizujúcimi s molekulou nukleovej kyseliny, ktorá je definovaná v (a) alebo (b), pri teplote 42 až 65 °C, výhodne pri 46 °C, počas 12 až 20 hodín, výhodne 16 hodín, (d) molekúl nukleových kyselín, ktorých nukleotidová sekvencia je výsledkom degenerácie genetického kódu DNA sekvencie definovanej v (a), (b) alebo (c). Ďalej je uvedené použitie opísanej DNA na detekciu latentného vírusu chmeľu.ŕ

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka génov latentného vírusu chmeľu a spôsobu a metód detekcie uvedeného vírusu.

Doterajší stav techniky

Rozšírenie infekcie chmeľovým latentným vírusom (ďalej skracované ako HLV) bolo hlásené zo všetkých oblastí pestovania chmeľu (Tresh & Ormerod, Rep. E. Malling Res. Stn. For 1968: 41 (1969), Probasco & Skotland, Phytopathology 68: 278 (1978), Adams & Barbara, Ann. Appl. Biol., 101: 483 (1982), Inoue et al., Ann. Phytopath. Soc. Japan 39: 229 (1973).

HLV má filamentný tvar a patrí do skupiny carlavírusov. Doteraz sa nezistila ani génová, ani primárna štruktúra obalovej bielkoviny. Preto, ako metóda na selekciu bezvírusových kolón chmeľu sa využíva enzýmoimunoadsorbentné stanovenie (ALISA), s použitím protilátok proti HLV. Ale diagnostická detekcia HLV s ELISA spôsobovala rôzne problémy, tak ako redukciu detekčnej citlivosti závislej od času odberu vzoriek a od zdĺhavej prípravy protilátok.

Z týchto dôvodov technickým problémom predkladaného vynálezu je poskytnúť pohotovú a presnú metódu identifikácie HLV - infikovaných rastlín.

Tento technický problém je vyriešený uskutočnením vyjadreným v patentových nárokoch.

Menovite predkladaný vynález je založený na identifikácii génu obalovej bielkoviny HLV a vyriešení jeho bázovej sekvencie a tým aj primárnej štruktúry uvedenej bielkoviny.

Využitím génu pre HLV obalovú bielkovinu alebo DNA nasyntetizovanej podľa jeho bázovej sekvencie, môže sa HLV detekovať genetickou metódou tak, ako polymerázovou reťazovou reakciou (ďalej skratka PCR) a Southernovou hybridizáciou. Napríklad v PCR s časťou bázovej sekvencie alebo s DNA obsahujúcou komplementárnu sekvenciu ako očko, je HLV detekované pomocou tvorby amplifikovaných produktov DNA, špecifických ku HLV - infikovaným rastlinám. Okrem toho použitím hybridizácie komplementárneho vlákna DNA HLV génu ako nukloetidovej sondy, môžu sa Southernovou analýzou pozorovať špecifické pásy s HLV - infikovaných rastlín.

Podstata vynálezu

Takto podľa prvého aspektu sa predkladaný vynález týka DNA, ktorá kóduje bielkovinu latentného vírusu chmeľu vybranej zo skupiny pozostávajúce z:

a) molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich polypeptid, ktorý’ obsahuje aminokyselinovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 6;

b) molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 58 až 975 z nukleotidovej sekvencie udanej v SEKV IČ: 1;

c) molekúl nukleovej kyseliny hybridizujúcimi s molekulami nukleových kyselín, tak ako sa definujú v (a) alebo (b), pri teplote 42 až 65 °C, výhodne pri 46 °C, počas 12 až 20 hodín, výhodne 16 hodín, a

d) molekúl nukleových kyselín, ktorých nukleotidová sekvencia je výsledkom degenerácie genetického kódu DNA sekvencii definovaných v (a), (b) alebo (c).

V tomto kontexte termín „hybridizácia“ zodpovedá skôr obvyklým hybridizačným podmienka, ako hybridizačným podmienkam prísnej hybridizácie.

Podľa ďalšieho aspektu predkladaný vynález sa týka DNA, ktoré hybridizujú s DNA podľa vynálezu, a ktoré kódujú fragment alebo mutovanú verziu bielkoviny, kódovanú opísanými DNA.

Predkladaný vynález sa ďalej týka špecifickej sekvencie molekúl nukleových kyselín odvodených od DNA podľa predkladaného vynálezu.

V tomto kontexte termín „špecifická sekvencia“ zodpovedá molekulám nukleových kyselín, ktoré počas hybridizácie môže špecificky hybridizovať s génmi a DNA podľa predkladaného vynálezu. Tak sa môžu molekuly nukleových kyselín použiť napríklad ako špecifické nukleotidové sondy alebo špecifické očká na amplifikáciu špecifickej sekvencie, napríklad na polymerázovú reťazovú reakciu.

Výhodné uskutočnenie predkladaného vynálezu sa týka DNA kódujúcej obalovú bielkovinu latentného vírusu chmeľu, ktorá obsahuje bázovú sekvenciu opísanú pod identifikačným číslom 1 v sekvenčnom zozname, kde:

a) nukleotidová sekvencia od 58 do 975 kóduje 306 aminokyselinových zvyškov a

b) bázová sekvencia od 981 do 1292 kóduje 104 aminokyselinových zvyškov.

Predložený vynález sa ďalej týka polypeptidov kódovaných s niektorou uvedenou DNA podľa vynálezu.

Tiež sa vzťahuje na spôsoby výroby uvedených polypeptidov, vrátane kultivácie hostiteľskej bunky, ktorá obsahujú hociktorú DNA podľa vynálezu a izoláciu polypeptidu z kultúry. Dôležité je, že uvedené DNA sa účinne viažu na regulačnú jednotku umožňujúcu ich expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Ako prokaryotické bunky sú výhodné E.coli a ako eukaryotické bunky sú výhodné rastlinné bunky.

Ďalšie výhodné uskutočnenie podľa vynálezu zahŕňa rastlinné bunky, ktoré obsahujú hociktorú z DNA uvedených vo vynáleze. Presnejšie povedané, rastlinné bunky sú odvodené z chmeľu.

Ďalej sa vynález týka protilátok špecificky rozpoznávajúcich polypeptidy z vynálezu.

Predkladaný vynález sa ďalej týka diagnostického zloženia, ktoré obsahuje hociktorú z doteraz uvedených DNA, molekúl nukleových kyselín a/alebo obsahuje vektor, polypeptidy alebo protilátky špecificky rozpoznávajúce takéto polypeptidy samotné alebo v kombinácii a optimálne výhodné na detekciu.

Podľa ďalšieho uskutočnenia sa vynález týka použitia uvedených DNA a molekúl nukleových kyselín, vektorov, polypeptidov a protilátok pre inžinierstvo patogénnej rezistencie rastlín.

Najvýhodnejšie uskutočnenie je, ak je patogén vírus, predovšetkým carlavírus a najvýhodnejšie je HLV a z rastlín je to chmeľ.

Gén obsahujúci DNA a RNK kódujúci HLV obalovú bielkovinu a časti z nej sa môže použiť na detekciu HLV. Ako nukleotidová sonda vhodná pre PCR a Southemovu hybridizáciu môže sa výhodne použiť bázová sekvencia zo zoznamu sekvencii, napríklad:

a) sekvencia s IČ 2 (zhodná so sekvenciou s IČ 1, od 405 do 23),

b) sekvencia s IČ 3 (zhodná so sekvenciou s IČ 1, od 457 do 474),

c) sekvencia s IČ 4 (zhodná so sekvenciou s IČ 1, od 618 do 637),

d) sekvencia s IČ 5 (zhodná so sekvenciou s IČ 1, od 761 do 781).

Tieto DNA sa môžu získať extrakciou a purifíkáciou z HLV alebo pripraviť s použitím automatického syntetizátora DNA. Najmä krátke jednovláknové DNA, tak to sú bázové sekvencie s IČ od 2 do 5, môžu sa obvykle získať chemickou syntézou.

Podľa iného aspektu predložený vynález sa týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahŕňa amplifikáciu DNA reverznou transkripciou PCR, uskutočnenú s nukleovou kyselinou extrahovanou z chmeľu, ktorá slúži ako templát a hociktorá syntetická sekvencia s IČ 2 až 5 slúži ako očko a na elektroforetickú analýzu takto získaných produktov.

Presnejšie, HLV sa môžu detekovať s DNA amplifikovanou reverznou transkripciou PCR so syntetickými sekvenciami DNA s IČ 2 a 4 slúžiacimi ako očkom následnou elektroforetickou analýzou takto obdržaných amplifikovaných produktov na potvrdenie špecifického DNA fragmentu obsahujúceho 233 bázových párov.

Podobne HLV sa môžu detekovať s DNA amplifikovanou reverznou transkripciou PCR so syntetickými sekvenciami DNA s IČ 3 a 4 slúžiacimi ako očko, následnou elektroforetickou analýzou takto získaných ampliftkovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNA fragment obsahujúci 188 bázových párov.

Tiež HLV sa môžu detekovať s DNA amplifikovanou reverznou transkripciou PCR so syntetickými sekvenciami DNA s IČ 2 a 5 slúžiacimi ako očko následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNA fragment obsahujúci 377 bázových párov.

Okrem toho HLV sa môžu detekovať s DNA amplifikovanou reverznou transkripciou PCR so syntetickými sekvenciami DNA s IČ 3 a 5 slúžiacimi ako očko následnou elektroforetickou analýzou takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzujúcich špecifický DNA fragment obsahujúci 325 bázových párov.

Podľa iného aspektu sa predložený vynález týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahŕňa hybridizáciu nukleovej kyseliny extrahovanej z chmeľu, očko obsahujúce syntetickú DNA s IČ 4 alebo 5 alebo komplementárne vlákno DNA predĺžené s DNA používanými ako očko.

Podľa iného aspektu sa predložený vynález týka spôsobu detekcie HLV, pričom spôsob zahŕňa nukleovú kyselinu extrahovanú z chmeľu a reštrikčný enzýmový fragment DNA opísaný v sekvencií s IČ 1 slúžiaci ako nukleotidová sonda.

Podľa ďalšieho aspektu predložený vynález sa týka HLV obalovej bielkoviny prepísanej z bázovej sekvencie od 58 do 975 sekvenčného IČ 1 v sekvenčnom zozname, obsahujúca 306 aminokyselinových zvyškov sekvencie s IČ 6 v sekvenčnom zozname.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Na obr. 1 je aminokyselinová sekvencia obalovej bielkoviny latentného vírusu chmeľu analyzovaná bielkovinovým sekvenčným analyzátorom.

Obr. 2 je elektroforetická fotografia zobrazujúca výsledky génovej diagnózy latentného vírusu chmeľu použitím PCR.

V predloženom vynáleze gén HLV sa analyzuje nasledujúcimi postupmi na identifikáciu obalovej bielkoviny HLV a vyriešenie jej bázovej sekvencie.

L Izolácia HLV

HLV sa môže z chmeľu izolovať štandardnými metódami, napríklad zahŕňajúcimi koncentráciu vírusu s polye tylénglykolom, prečistenie extraktu organickými rozpúšťadlami a tepelným spracovaním, frakčnou centrifugáciou, centrifugáciou v sacharózovom gradiente atď.

2. Extrakcia RNK z HLV

Extrakcia sa môže uskutočniť štandardnými metódami, tak ako SDS-fenolovou metódou, ktorá sa hlavne používa pre iné rastlinné vírusy.

3. Klonovanie s cDNA

Ako templát sa využíva RNK extrahovaná z častí HLV a dvojvláknová DNA je in vitro syntetizované Gubler-Hoffmanovou metódou (Gubler and Hoffman, Gene, 25, 263 (1983)). Takto nasyntetizovaná cDNA sa inkorpuruje do plazmidového vektora ligáciou, použitím štandardných techník. Prípadné plazmidové vektory, ktoré sa môžu použiť, sú pUC119, pBluescriptII atď. Kompetentné bunky E.coli sa transformujú použitím uvedenej ligačnej zmesi. Z takto získaných transformantov sa vyberú a purifikujú rekombinantné plazmidy, ktoré obsahujú cDNA.

4. Bázová sekvencia cDNA odvodená z genómu HLV pri použití rekombinantného plazmidu obdržaného opísanou metódou sa môže stanoviť podľa Maxam-Gilbertovej metódy (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560 (1977)) alebo s dideoxy metódou (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)).

Takže bázová sekvencia DNA zahŕňajúca gén kódujúci HLV obalovú bielkovinu (ďalej skrátené ako HLV gén obalovej bielkoviny) je stanovená a opísaná v sekvencií s IČ 1 v zozname sekvencií.

5. Stanovenie čiastočnej sekvencie aminokyselín HLV obalovej bielkoviny

Toto sa vykonáva pomocou bielkovinového analyzátora (ABI) po čiastočnom opracovaní HLV obalovej bielkoviny následnou frakcionáciou a purifíkáciou výťažku s vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou. Takto stanovená čiastočná aminokyselinová sekvencia obalovej bielkoviny je ukázaná na obr. 1. Ak sa porovná táto čiastočná aminokyselinová sekvencia HLV obalovej bielkoviny so sekvenciou dedukovanou z bázovej sekvencie HLV génu obalovej bielkoviny ukázanej v sekvenčnom zozname, primárna štruktúra (aminokyselinová sekvencia) obalovej bielkoviny sa vyriešila (pozri obr. 1).

6. Virálna génová diagnóza HLV-infikovaného chmeľu.

1. Diagnóza génu reverznou transkripciou PCR

Očko DNA dlhé okolo 20 báz obsahujúce čiastočnú sekvenciu HLV génu obalovej bielkoviny, ktorá sa stanovila opísanou metódou, alebo bázovú sekvenciu jeho komplementárneho vlákna, sa syntetizuje štandardnými metódami. Virálna génová diagnóza HLV-infikovaného chmeľu sa stáva možnou detekciou prítomného alebo neprítomného amplifikovaného produktu získaného s PCR pri použití uvedeného očka.

Ako očká (priméry) sa môžu použiť oligonukleotidy zahŕňajúce bázovú sekvenciu so sekvenciami s IČ 2 až 5 v sekvenčnom zozname. Medzi nimi bázová sekvencia opísaná v sekvencií PČ 2 sekvenčného zoznamu je rovnaká ako bázová sekvencia od 405 do 423 opísaná v sekvencií IČ 1 a ďalej označená 3P. Bázová sekvencia opísaná v sekvencii IČ 3 sekvenčného zoznamu je rovnaká ako bázová sekvencia od 457 do 474 bázovej sekvencie opísanej v sekvencii IČ 1 a ďalej označená 4P. Tiež bázová sekvencia opísaná v sekvencií IČ 4 sekvenčného zoznamu je komple mentárne vlákno bázovej sekvencie od 618 do 637 bázovej sekvencie opísanej v sekvencií IČ 1 a ďalej označená 3M. Bázová sekvencia opísaná v sekvencií IČ 5 v sekvenčnom zozname je komplementárne vlákno bázovej sekvencie od 761 do 781 bázovej sekvencie opísanej v sekvencií IČ 1 a ďalej označená 4M.

Tiež ako očká sa môžu použiť oligonukleotidy zahŕňajúce časť bázovej sekvencie opísanej v sekvenciách s IČ 2 až 5. To znamená, pokiaľ PCR je primárnou metódou pre amplifikáciu kópií špecifických génových informácií získaných z mnohých bázových sekvencií, oligonukleotidy obsahujúce bázovú sekvenciu podobnú očkám v predloženom vynáleze, môžu sa použiť podobne ako očká.

Očká DNA použité v predloženom vynáleze sa môžu získať napríklad β-kyanoetylfosfoamidovou metódou alebo komerčným automatickým DNA syntetizérom používajúcim tiofosfitovú metódu.

Nukleové kyseliny z chmeľových rastlín použitých v predloženom vynáleze sa môžu extrahovať hociktorou štandardnou metódou, ktorá je obvyklou metódou extrakcie nukleových kyselín.

Použijúc takto získané nukleové kyseliny z chmeľu a opísané očká, DNA odvodené od HLV génomu sa amplifikujú kombináciou techník reverznej transkripcie virálnych ERNK s polymerázovou reťazovou reakciou (PCR). PCR je procedúra opakujúceho sa DNA replikačného cyklu zahŕňajúca stupeň denaturácie, tepelnej hybridizácie očka a predĺženie s DNA polymerázou a táto všeobecná metóda je opísaná napríklad v Saiki et al., Science, 230, 1350 - 1354 atď.

PCR vykonávaná v predloženom vynáleze je doložená metódou, v ktorej DNA replikačný cyklus sa opakuje okolo 20 až 50-krát, skôr okolo 25 až 40-krát, v amplifikačnom tlmivom roztoku skladajúcom sa z 1,0 mM až 4,0 mM, skôr 1,5 mM až 3,0 mM MgCl roztoku, ktorý sa predtým zmiešal so syntetickými oligonukleotidmi, DNA polymerázou, 4 typmi nukleotidov (dATP, dTTP, dCTP a dGTP) a chmeľovými DNA, chloridom draselným želatínou, hovädzím sérom albumínom, povrchovo aktívnou látkou (Tween 20, NP-40, Tritón X-100 atď., všetko obchodné názvy), dimetylsulfoxidom atď.

Okrem toho, každý krok v PCR sa môže vykonať pri nasledujúcich podmienkach.

Denaturačný krok sa uskutoční zohriatím všeobecne od 90 °C do 95 °C, vhodnejšie pri 94 °C do 95 “C okolo 1 až 3 minút, vhodnejšie okolo 1 až 2 minút.

Stupeň tepelnej hybridizácie očka sa vykoná inkubáciou s očkami všeobecne pri teplote 30 °C až 50 °C, výhodnejšie pri teplote 35 °C až 42 °C počas 1 až 3 minút, výhodnejšie v čase 1 až 2 minúty.

Predlžovací stupeň s DNA polymerázou sa vykoná pomocou termostabilnej DNA polymerázy všeobecne pri teplote 70 °C až 73 °C, výhodnejšie pri teplote 72 °C až 73 °C, počas 1 až 4 minút, výhodnejšie počas 2 až 3 minút. Ako príklad termostabilnej DNA polymerázy sa môže uviesť komerčný produkt od Perkin Elmera, s. r. o.

Takto amplifikované DNA sa môžu vizualizovať vyfarbovacou metódou použitím zlúčeniny, ktorá interaguje s nukleovými kyselinami, napríklad farbivá fenantridínovej série tak ako etídiumbromid atď., a ktorá sa predtým pridá ku elektroforetickému tlmivému roztoku, napríklad pri konečnej koncentrácii okolo 50 pg/ml a počas elektroforézy s ožiarením gélu s ultrafialovým svetlom pri 254 nm alebo 366 nm v tme sa môžu pozorovať červené pásy DNA-etídiumbromidového komplexu. Ale vo všeobecnosti červené pásy DNA-etídiumbromidového komplexu sa detekujú ponorením elektroforetického gélu do roztoku etí diumbromidu atď. na okolo 10 až 60 minút po skončení elektroforézy a následne sa gél ožiari s ultrafialovým svetlom pri 254 nm alebo 366 nm v tme.

Virálna infekcia sa môže identifikovať potvrdením prítomnosti alebo neprítomnosti amplifikovaných DNA. Takže, keď PCR sa vykoná s tým istým očkom, špecifická amplifíkovaná DNA sa detekuje so vzorkami pochádzajúcimi z vírusu infikovaného chmeľu, ale nie so vzorkami z neinfikovaného chmeľu.

Napríklad HLV sa môže detekovať podľa metódy patentového nároku 14 prítomnosťou špecifického DNA fragmentu obsahujúceho 233, 181, 377 a resp. 325 bázových párov.

2. Diagnóza génu hybridizáciou

Diagnóza HLV na rozdiel od obvyklého stanovenia imuno-testom sa môže uskutočniť nukleotidmi, ktoré majú sekvenciu komplementárnu ku génu kódujúcemu HLV obalovú bielkovinu pripravenými alebo chemickou syntézou, alebo génovou manipuláciou a hybridizujúcimi s oligonukleotidmi ako očkami.

Používané nukleotidové sondy sú všeobecne dlhé 20 až niekoľko tisíc bázových párov a mali by byť napríklad také, ktoré majú bázovú sekvenciu opísanú v sekvenčnej identifikácii číslo 6 a 7 v sekvenčnom zozname a fragmenty DNA získané účinkom reštrikčných enzýmov z cDNA, ktorá sa pripravila z plazmidov získaných klonovaním génu HLV obalovej bielkoviny. Tieto nukleotidové sondy sa používajú na hybridizáciu po značení izotopmi, biotínom, fluorescerom atď., štandardnými metódami.

Aby sa nukleové kyseliny použili na hybridizáciu, môžu sa extrahovať štandardnými metódami, napríklad štandardnými metódami extrakcie nukleových kyselín, ktoré sú opísané napríklad v Murray & Thompson, Nucl. Acid Res., 8, 4321-4325 (1980) atď. Takto získané nukleové kyseliny sú predmetom denaturačného opracovania a potom sa nakvapkajú na membránový filter, tak ako nitrocelulózový filter alebo nylonový filter, vhodný je napríklad Hybond-N⁺(Amersham).

Denaturačné opracovanie nukleových kyselín sa uskutočňuje zahriatím nukleovej kyseliny v roztoku obsahujúcom formamid, formaldehyd, MOPS, kyselinu octovú, EDTA atď. pri 60 °C až 70 °C, výhodnejšie pri 75 °C, 5 až 20 minút, výhodnejšie 15 minút, s následným rýchlym ochladením. Po tomto denaturačnom opracovaní sa nukleové kyseliny zmiešajú s 20 x SSC a potom sa nakvapkajú na membránový filter.

Hybridizácia sa uskutoční použitím takto obdržaného membránového filtra (s nakvapkanými nukleovými kyselinami z chmeľu) a sondy v hybridizačnom roztoku pri 42 °C až 65 °C, výhodnejšie pri 46 °C, 12 až 20 hodín, výhodnejšie 16 hodín. Potom sa membránový filter premyje, vysuší a prítomnosť alebo neprítomnosť signálu v kvapkách sa preverí detekčnými metódami, ako je napríklad autorádiografia atď.

Takže signál sa detekuje nukleovými kyselinami pochádzajúcimi z vírusom infikovaného chmeľu, pretože hybridizujú s nukleotidovou sondou, ale nedetekovateľný, ak pochádzajú z neinfikovaného chmeľu, pretože chýba hybridizácia.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcom sa predložený vynález opíše detailne s odkazmi na príklady, ktoré sú určené na ilustráciu, neobmedzujúc vynález.

Príklad 1

Izolácia HLV

Mladá úponková rastlina HLV-infíkovaného chmeľu (1 kg) sa zomlela s 3 objemami 0,05 M fosfátového tlmivého roztoku (obsahujúceho 0,2 % askorbovej kyseliny, 0,2 % nikotínu a 0,2 % PVP, pH 8,0), nechala sa stáť 1 hodinu pri izbovej teplote a filtrovala sa cez gázu, aby sa získala surová šťava. Šťava sa tepelne spracovala (pri 55 °C, 8 minút), ihneď ochladila vo vodnom ľadovom kúpeli a centrifúgovala pri 3 000 x g, 30 minút, aby sa obdržal supematant. K nemu sa pridal polyetylénglykol a chlorid sodný v koncentrácii 5 %, resp. 0,5 M a výsledný roztok sa 1 hodinu miešal a potom centrifugoval pri 3 000 x g, 30 minút. Takto obdŕžaná zrazenina sa suspendovala v 0,5 M fosfátovom tlmivom roztoku (obsahujúcom 0,2 M EDTA, pH 7,4).

Ďalej uvedená suspenzia sa centrifugovala pri vysokých otáčkach (pri 15 000 x g, 10 minút), aby sa získal supematant, ktorý sa potom ultracentrifugoval (pri 100 000 x g, 120 minút), aby sa získala zrazenina. Tento proces sa opakoval dvakrát, aby bola virálna frakcia bez kontaminácie.

Takto získaná zrazenina sa suspendovala v 2 ml 0,01 M fosfátového tlmivého roztoku (pH 8,0) a centrifugovala (pri 150 000 x g, 120 minút) v sacharózovom hustotnom gradiente (20 až 10 %), aby sa zbierali frakcie, ktoré obsahujú vírus. Konečne, frakcie sa centrifugovali pri 180 000 x g, 150 minút, aby sa získala zrazenina obsahujúca vírusové častice, ktorá sa ďalej resuspendovala v 0,01 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0) a odložila ako vyčistený vírusový preparát.

Treba ešte uviesť, že opísané postupy sa uskutočňovali pri 4 °C.

Príklad 2

Extrakcia RNK z HLV

Extrakcia RNK z častíc IILV sa vykonala SDS-fenolovou metódou (Proll et al., Potato research 24, 1-10, 1981).

K vyčistenému preparátu HLV (1 pg/ml, 84pl), obdržaného tou istou metódou ako v príklade 1, sa pridal 20 % SDS (5 pl), 20 x SCC (1 pl) a proteáza (výrobný názov: Proteáza K) (10 mg/ml, 10 pl) a výsledná zmes sa zohrievala pri 37 °C 30 minút.

Potom sa vykonala fenolová extrakcia pridaním 0,5 % bentonitovej suspenzie (50 pl) k uvedenej zmesi a následná druhá extrakcia pri použití zmesi fenohchloroform (1:1, v/v). Vodná vrstva sa extrahovala chloroformom. K tejto vodnej vrstve sa pridal 3 M octan sodný (10 pl) a chladený etanol (250 pl) a zmes sa nechala stáť pri -80 °C 30 minút. Potom sa zmes centrifugovala pri 15 000 x g 5 minút, aby sa získala zrazenina. Zrazenina sa premývala centrifugáciou v 70 % etanole. Po odstránení etanolu sušením sa takto získaná zrazenina rozpustila v destilovanej vode (50 pl). K tomuto roztoku sa pridal 4M chlorid lítny (50 pl) a výsledná zmes sa nechala stáť cez noc na ľade.

Uvedená zmes sa centrifugovala pri 15 000 x g 5 minút, aby sa získala zrazenina, ktorá sa znova premyla centrifugáciou v 70 ° etanole, ako je uvedené. Po odstránení etanolu sušením sa zrazenina rozpustila v destilovanej vode (8 pl) a odložila ako vzorka RNK.

Príklad 3

Klonovanie cDNA cDNA sa pripravila zo vzorky RNK pripravenej v príklade 2 pri použití cDNA syntetizačnej súpravy (Amersham) podľa protokolu špecifikovaného dodávateľom a rozpustila v TE tlmivom roztoku (1 pl).

Potom sa plazmid pUC119 (500 ng/pl) rozštiepil so Smal a defosforylol. K štepu (2 pl) sa pridala nasyntetizovaná cDNA (1 pl), 10 mM ATP, 10 x ligačný tlmivý roztok (Behringer), T4DNA ligáza (5U/pl, Behringer) a destilovaná voda (13 pl) a zmes sa inkubovala pri 22 °C cez noc na ligáciu.

Pripravili sa kompetentné bunky Eschrichia coli MV 1184 a zmiešali s ligačným reakčným roztokom (100 pl) a nechali sa stáť na ľade 30 minút.

Potom sa reakčný roztok, zohrievaný 60 sekúnd pri 37 °C, ihneď ochladil ľadom, zmiešal s SOC médiom (500 pl) a výsledná zmes sa udržiavala 1 hodinu pri 37 °C. K nej sa pridalo z každého 2 % X-gal a 100 mM IPTG po 50 pl a výsledná zmes sa rozotrela na dve 2 x YT agarové platničky obsahujúce ampicilín (50 pl/ml) a inkubovala cez noc pri 37 °C.

Z bielych kolónii E.coli takto získané plazmidy DNA sa extrahovali štandardnými metódami a vybrali sa a odložili bunky majúce dlhé cDNA inzertné fragmenty.

Potom na potvrdenie, že cDNA pochádza z HLV genómu, vyčistená HLV-RNK sa čiastočne denaturovala alkáliami a vybraná jednovláknová cDNA sa podrobila Southemovej hybridizácii pri použití nukleotidovej sondy, značenej s T4 polynukleotid kinázou na 5 - konci s [τ³²Ρ] ATP.

Výsledkom je, že sa získali kmene E.coli nesúce plazmid cDNA inzertnými fragmentmi dlhými 0,7 kb, 1,2 kb, 1,35 kb, 3,5 kb a 5,0 kb pochádzajúcimi z HLV genómu.

Príklad 4

Stanovovanie bázovej sekvencie cDNA pochádzajúce z HLV genómu

Bunky E.coli nesúce plazmid s cDNA inzertným fragmentom pochádzajúcim z HLV genómu, ktorý sa získal v príklade 3 sa kultivovali na trepačke cez noc v 2 x YT médiu pri 37 °C a plazmid sa vyčistil štandardnou metódou. cDNA fragmenty pochádzajúce z HLV genómu sa pripravili z plazmidu štandardnými metódami a s fragmentmi ako templátom a ich bázová sekvencia sa dekódovala s dideoxy metódou (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977)) použitím DNA sekvenátora (ABI) a sekvenčnej súpravy (USB, SEQUENASE) a z toho sa stanovila sekvencia dlhá 1 375 báz.

Výsledkom toho bola identifikácia dvoch otvorených čítacích rámcov (bázová sekvencia od 58 do 975 a bázová sekvencia od 981 do 1292 sekvencie IČ 1 zo sekvenčného zoznamu) údajne kódujúcich HLV obalovú bielkovinu (306 aminokyselinových zvyškov, molekulová hmotnosť okolo 31,4 kD) a bielkovinu okolo 12,0 kD a 101 aminokyselinových zvyškov.

Okrem toho myslené aminokyselinové sekvencie odvodené z každej bázovej sekvencie sú ukázané v sekvencií IČ 6 a 7 sekvenčného zoznamu. Medzi nimi, pretože aminokyselinová sekvencia ukázaná v sekvencií IČ 6 obsahuje sekvenciu zodpovedajúcu časti aminokyselinovej sekvencie HLV obalovej bielkoviny opísanej detailne dolu, ich prítomnosť sa potvrdila.

Veľmi sa očakáva, že tento vynález prispeje k produkcii chmeľovej rezistencie uvedeného vírusu transformáciou takto získaného génu kódujúceho HLV obalovú bielkovinu A tak transformácia takých mikróbov ako E.coli atď. s menovanou obalovou bielkovinou kódovanou takto získaným génom umožňuje produkciu uvedenej bielkoviny. Teda na základe aminokyselinovej sekvencie uvedenej bielkoviny sa môže získať z nej hociktorý fragment použitím napríklad bielkovinového analyzátora atď. Obalová bielkovina alebo fragment z nej sa môže použiť na produkciu HLV protilátok využiteľných na detekciu HLV.

Príklad 5

Stanovenie čiastočnej aminokyselinovej sekvencie HLV obalovej bielkoviny

Vyčistená vzorka HLV obalovej bielkoviny (1 μΐ/ml, 120 μΐ) pripravená v príklade 1 sa čiastočnej opracovala proteolytickým enzýmom (Lysyl Endopeptidase, Wako Pure Chemikals) 16 hodín pri izbovej teplote (25 °C). Fragmenty takto získaných peptidov sa čistili frakcionáciou reverznou fázovou HPLC (použitím RepRPC HR5/5 kolónou, Pharmacia) a ich aminokyselinová sekvencia sa analyzovala z N-konca bielkovinovým sekvenátorom (ABI). Zistilo sa, že aminokyselinová sekvencia na N-koncoch troch peptidových fragmentov je kompletne identická s myslenou aminokyselinovou sekvenciou HLV obalovej bielkoviny. N-koniec aminokyselinovej sekvencie týchto troch peptidových fragmentov a ich lokalizácia v aminokyselinovej sekvencii v HLV obalovej bielkovine sú znázornené na obr. 1.

Príklad 6

Stanovenie prítomnosti HLV v HLV-infikovanom chmele reverznou transkripciou PCR

Lístky HLV-infikovaného chmeľu (kultivar, Shinshu Wase) a bez-vírusivého chmeľu (kultivar, Shinshu Wase), (každého 0,1 g) sa zomleli v 0,05 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0,1 ml) a extrahovali chloroformom. Potom sa supernatant opracoval s fenolom a trikrát s éterom, a aby sa nukleové kyseliny vyzrážali, pridal sa etanol. Takto získaná zrazenina sa premyla centrifugáciou v 70 % etanole a potom sa nadbytočný etanol odstránil sušením a zrazenina sa rozpustila v TE tlmivom roztoku (100 μΐ). Z tohto sa použilo 2 μΐ podielu na reverznú transkripciu PCR.

Pre PCR sa vybrali štyri rôzne očká na základe existujúcich bázových sekvencii a syntetizované štandardnými metódami s použitím DNA syntetizátora Model 380B (ABI), ktoré majú bázovú sekvenciu opísanú v sekvenciách IČ 2 až 5 (označených 3P, 4P, 3M, resp. 4M). Každé očko sa na reverznú transkripciu PCR použilo v kombinácii 3P/3M, 4P/3M, 3P/4M a 4P/4M.

Reverzná transkripčná reakcia sa uskutočnila v tlmivom roztoku Tris-HCl (pH 8,3) pozostávajúcom zo 75 mM KCI, 3mM MgCl₂, 10 mM DTT a 0,5 mM dNTPs s komplementárnym vláknovým očkom (25 pmol) a reverznou transkriptázou (ANV-Rtase XL, Takara Shuzo, 5 jednotiek) a k tomu sa pridala chmeľová nukleová kyselina (2 pg) upravená, ako je uvedené predtým, na 30 minút pri 55 °C.

Potom sa k uvedenej reakčnej zmesi pridala termostabilná DNA polymeráza (Behringer 0,5 jednotky) a na amplifikáciu očko (25 pmol) a vykonala sa PCR. Objem reakčného roztoku sa upravil na 10 μΐ a na povrch sa navrstvil minerálny olej (20 μΐ), aby sa zabránilo odparovaniu reakčnej zmesi.

Každý stupeň sa uskutočnil pri nasledujúcich podmienkach.

Jeden cyklus PCR pozostáva z denaturačného stupňa pri 94 °C 1 minútu z tepelnej hybridizácie očka, pri 55 °C 1 minútu a zo stupňa predĺženia DNA pri 72 °C 5 minút a odloží sa pri 4 °C.

Amplikované genomické DNA získané opísaným PCR sa analyzovali elektroforézou na agarózovom géli.

DNA sa frakcionovali elektroforézou na 2 % agarózovom géli v Tris-borátovom tlmivom roztoku (pH 8,0) obsahujúcom 2mM EDTA 30 minút pri 100V. Ako markery veľkosti sa použili markery molekulových hmotností DNA a DNA opracovaná s reštrikčnými enzýmami HindlII a EcoRI (Nippon Energy).

Po ukončení eiektroforézy sa gél ponorií na 10 minút do vodného roztoku etídiumbromidu (0,5 pg/ml) a červené pásy DNA-etídium bromidového komplexu sa detekovali po ožiarení gélu v tme s UV 254 nm.

Výsledky eiektroforézy (dvakrát opakované) sú znázornené na obr. 2, kde DW znamená sterilizovanú vodu.

Výsledkom agarózovej gélovej eiektroforézy je, že sa získali špecifické DNA amplifikované fragmenty z HLV-infikovaného chmeľu v závislosti od použitého očka, ale nezískali sa z neinfikovaného chmeľu, čo umožňuje tieto dve vzorky rozlíšiť.

Špecifické amplikované fragmenty DNA zodpovedajúce použitým očkám boli nasledujúce:3P/4 M: 233 bázových párov 4P/3M: 181 bázových párov 3P/4M: 377 bázových párov a 4P/4M: 325 bázových párov.

Príklad 7

Stanovenie prítomnosti HLV v HLV-infikovanom chmele, dotblotovou hybridizáciou

Lístky HLV-infikovaného chmeľu (kultivar, Shinshu Wase) a bez-vírusového chmeľu (kultivar, Shinshu Wase) (každého 0,1 g) sa zomleli v 0,05 M fosfátovom tlmivom roztoku (pH 8,0,1 ml) a extrahovali chloroformom. Potom sa supernatant opracovaný s chloroformom a trikrát s éterom a na vyzrážanie nukleových kyselín sa pridal etanol. Potom sa takto získaná zrazenina premyla centrifugáciou v 70 % etanole a po odstránení prebytočného etanolu sa rozpustila v TE tlmivom roztoku (100 μΐ). Z toho sa 2 μΐ podielu pridalo k trom objemom tlmivého roztoku denaturujúceho nukleové kyseliny (pozostávajúceho zo 63 % formamidu, 20 % formaldehydu, 1,54 M MOPS, 6,5 mM octanu sodného a 1,3 mM EDTA) a zmes sa zahrievala 15 minút pri 65 °C a potom sa ihneď ochladila. K tomuto roztoku sa pridalo 8 μΐ 20 x SSC (pozostávajúceho z 0,15 M chloridu sodného, 0,015 M citrátu sodného, pH 7,0) a pomiešalo. Z toho sa 10 μΐ podielu kvaplo na membránový filter (Amersham, výrobný názov Hyobond-N⁺) a uskutočnila sa bodová hybridizácia.

Výsledkom toho je vyriešenie génovej štruktúry, ktorá kóduje HLV obalovú bielkovinu a vyvinutie spôsobu detekcie HLV podľa vynálezu, kde zdĺhavé postupy, tak ako sú obvyklá izolácia HLV, príprava antiséra, čistenie protilátok atď., sa stávajú nepotrebné a stáva sa prístupná diagnóza vírusov HLV-infikovaného chmeľu, ktorá je pohodlnejšia a presnejšia ako ELISA. Okrem toho predložený vynález môže prispieť k produkcii chmeľu rezistentného proti HLV použitím nukleových kyselín, bielkovín a protilátok z vynálezu.

Sekvenčný zoznam

1. VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ:

(A) NÁZOV : SAPPORO BREWERIES LTD.

(B) ULICA: 20-1, Ebisu 4-chome, Shibuya-ku (C) MESTO: Tokyo (E) KRAJINA: Japonsko (F) POŠTOVÝ KÓD: 150 ii) NÁZOV VYNÁLEZU: GÉNY LATENTNÉHO VÍRUSU CHMEĽU A SPÔSOB

ICH DETEKCIE iii) POČET SEKVENCIÍ: 7 iv) FORMA ROZPOZNÁVACIA POČÍTAČOM (A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTVÉR: Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) PRÁVO PREDNOSTI Z PRIHLÁŠKY:

(A) PRIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-302297 (B) DÁTUM PODANIA: 27.10.1995 (vi) PRÁVO PREDNOSTI Z PRIHLÁŠKY:

(A) PRIHLÁŠKA ČÍSLO: JP Hei 7-352285 (B) DÁTUM PODANIA: 28.12.1995

2. INFORMÁCIA O SEKV. IČ 1:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1375 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: bielkovina (xi) OPIS SEKVENCIE IČ 1:

TAAAGTGTTG CAAATAGTGT AGCTTTAGGT GTTTAGCAGT AGATCGAAGT TGAAGCAATG 60 GCCGACAAAC AAGGACAGAT GACTGAACAA CAGAAGGTGG ATTCTCAGAA GCTGCAGGGG 120 GAAGCAAAGA ATAAAGAAAA AGCTGAGTCC TCAAAGAGGA AAGATGAGTT GCTTAAGAAG 180 TACATTGATC CTGGGCTAGG GTCTGATGAT GATGAAGAGG AGATGGTGGA ATTGAGATTG 240 AGCAAATTGA GGGAGTTCCT GGCTCGTAGA AGGGCCGCTA TTCGCGTGAC TAACGCAGGG 300 CTAGAAACAG GCAGGCCCGC ACTCAAGCCC ACACCCGACA TGCTGCCTGA CCCTACCAAC 360 CCGTACAATA AACCCTCGTT GGATGCTTTG TTGATGATTA AGCCTAGGGT CGTGTCAAAC 420 AACATGGCCA CCTCAGAGGA TATGATGAAG ATCTGCGTTG ATCTGGAGGG GTTGGGCGTG 480 CCCACTGAAC ACGTGCAAAG CGTGATCTTG CAAGCGGTGT TCTATTGCAA GGACTCCAGC 540 AGTTCACCCT ATGTGGACCC TCGGGGCTCT TTCGAGTGGC GTGGTGGGGC GATCTCGGCC 600 GATTCAGTGC TTGCGATAAT AAAGAAGGAT GCCGAGACCT TGAGGCGCGT CTGCAGGTTG 660 TATGCACCAC TCACGTGGAA CTACATGTTG CTACATAACA ATCCCCCTTC TGACTGGTCC 720 GAAATGGGCT TTCAGCGCGA AGATCGCTTT GCTGCTTTTG ATTGCTTGGA TTACGTTGAA 780 AATGCTGCGG CTGTGCAACC ATTGGAAGGG CTGATCAGAG TCCCCACAGC AAGAGAGAAG 840 ATTGCAAATA AGACTCATAA GGATCTAGCG CTGCGCCGTG CGAATAGGAA TCAGCTTTTC 900 GGGAATCTGG ATGTGGAAAT AACCGGGGGA AAGAATGGGC CCGAGCTTCA ACGCGACTAC 960 TCTAAGTCTA ATAATTGAGT ATGTTTTACC TGCGTGTCGC TTTGCTGTTG CATAATAAGT 1020 TCTTAGAACA GTGTGGTAGG AGTGATTTTC ATTTGTGTGT TATGATTTCT CTGCAAGTCC 1080 ATCGCCCTGT GGGGGTTGGA AGGTCGTCGT ATGCTAGAAG GCGTAGAGCT AAGCTAGTAG 1140 GTCGCTGCCA CCGGTGTTAC CGGTTGTGGC CACCTACGGC TTTCACTACG AGGTGTGATA 1200 ATAAAACATG CTTTCCTGGC CTAACTTACA ATGCTAGCAT TGCTAGGTTC ATACGAGATG 1260 GAGTAACTGA GGTGATACCA TCTGCACCCA ACTAGTGTGG GGGTGGCCGC TAAAGCCTAT 1320 TTAATATATA AGGCGTGTCA CTATAATAAA ACTTTGGTTT TTAAATATTT TCACC 1375

2. INFORMÁCIA O SEKV. IČ 2 (i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IC 2:

TGAGGTCGTG TCAAACAAC 19

2. INFORMÁCIA O SEKV. IČ; 3:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ: 3:

GTTGATCTGG AGGOGTTG 18

2. INFORMÁCIA O SEKV: IČ: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párových báz (B) TYPE: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPÓLOGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ: 6:

(xi) OPIS SEKVENCIE IC: 4:

TCTCGGCATC CTTCTTTATT 20

2. INFORMÁCIA O SEKV: IČ: 5:

(i) CHARACTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párových báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPÓLOGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE IČ:5:

TTTCAACGTA ATCCAAGCAA T 21

2. INFORMÁCIE O SEKV. IČ: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 306 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid

Met Ala Asp Lyz Gin Gly Gin Met Tre Glu Gin Gin Lyz.Val Asp Ser 15 1015

Gin Lyz Leu Gin Gly Glu Ala Lyz Asn Lys Glu Lyz Ala Glu Ser Ser 20 2530

Lyz Arg Lyz Asp Glu Leu Leu Lyz Lyz Tyr íle Asp Pro Gly Leu Gly 35 4045

Ser Asp Asp Asp Glu Glu Glu Met Val Glu Leu Arg Leu Ser Lyz Leu 50 5560

Arg Glu Phe Leu Ala Arg Arg Arg Ala Ala íle Arg Val Tre Asn Ala 65 70 7580

Gly Leu Glu Tre Gly Arg Pro Ala Leu Lyz Pro Tre Pro Asp Met Leu 85 9095

Pro Asp Pro Tre Asn Pro Tyr Asn Lyz Pro Ser Leu Asp Ala Leu Leu 100 105110

Met íle Lyz Pro Arg Val Val Ser Asn Asn Met Ala Tre Ser Glu Asp 115 120125

Met Met Lyz íle Cys Val Asp Leu Glu Gly Leu Gly Val Pro Thr Glu 130 135140

His Val Gin Ser Val íle Leu Gin Ala Val Phe Tyr Cys Lyz Asp Ser

145 150 155160

Ser Ser Ser Pro Tyr Val Asp Pro Arg Gly Ser Phe Glu Try Arg Gly 165 170175

Gly Ala íle Ser Ala Asp Ser Val Leu Ala íle íle Lyz Lyz Asp Ala 180 185190

Glu Tre Leu Arg Arg Val Cys Arg Leu Tyr Ala Pro Leu Tre Try Asn 195 200205

Tyr Met Leu Leu His Asn Asn Pro Pro Ser Asp Try Ser Glu Met Gly 210 215220

Phe Gin Arg Glu Asp Arg Phe Ala Ala Phe Asp Cys Leu Asp Tyr Val

225 230 235240

Glu Asn Ala Ala Ala Val Gin Pro Leu Glu Gly Leu íle Arg Val Pro

245 250255

Tyr Ala Arg Glu Lyz íle Ala Asn Lyz Tre His Lyz Asp Leu Ala Leu

260 265270

Arg Arg Ala Asn Arg Asn Gin Leu Phe Gly Asn Leu Asp Val Glu íle 275 280285

Tre Gly Gly Lyz Asn Gly Pro Glu Leu Gin Arg Asp Tyr Ser Lyz Ser 290 295300

Asn Asn

305

2. INFORMÁCIE O SEKV. IČ.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 104 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednovláknová (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE IČ: 7:

Met Phe Tyr Leu Arg Val Ala Leu Leu Leu His Asn Lyz Phe Leu Glu 15 1015

Gin Cys Gly Arg Ser Asp Phe His Leu Cys Val Met íle Ser Leu Gin 20 2530

Val His Arg Pro Val Gly Val Gly Arg Ser Ser Tyr Ala Arg Arg Arg 35 4045

Arg Ala Lys Leu Val Gly Arg Cys His Arg Cys Tyr Arg Leu Try Pro 50 5560

Pro Tre Ala Phe Tre Tre Arg Cys Asp Asn Lyz Tre Cys Phe Pro Gly

65	70 75	80
Leu	Tre Tyr Asn Ala Ser íle Ala Arg	Phe íle Arg Asp Gly Val Tre
	85 90	95
Glu	Val íle Pro Ser Ala Pro Asn
	100

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA kódujúca bielkovinu latentného vírusu chmeľu vybraná zo skupiny pozostávajúcej z: a) molekúl nukleových kyselín kódujúcich polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 6; b) molekúl nukleovej kyseliny obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu od nukleotidu 58 až 975 z nukleotidovej sekvencie udanej v SEKV IČ: 1; c) molekúl nukleovej kyseliny hybridizujúcimi s molekulou nukleovej kyseliny, ktorá jc definovaná v (a) alebo (b), pri teplote 42 až 65 °C, výhodne pri 46 C, počas 12 až 20 hodín, výhodne 16 hodín, d) molekúl nukleových kyselín, ktorých nukleotidová sekvencia je výsledkom degenerácie genetického kódu DNA sekvencie definovanej v (a), (b) alebo (c).
2. DNA, ktorá hybridizuje s DNA podľa patentového nároku 1, a ktorá kóduje mutovanú verziu polypeptidu definovaného SEKV IČ 6, pričom sa zachová jeho plná funkčnosť.
3. Molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje minimálne 15 nukleotidov hybridizujúci špecificky s DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2, alebo s jej komplementárnym vláknom, pri teplote 42 až 65 °C, výhodne pri 46 °C, počas 12 až 20 hodín, výhodne 16 hodín.
4. Molekula nukleovej kyseliny vybraná zo skupiny pozostávajúcej z molekúl nukleových kyselín obsahujúcich nukleotidovú sekvenciu udanú v SEKV. IČ: 2, 3, 4 a 5.
5. Vektor obsahujúci DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2.
6. Vektor podľa patentového nároku 5, ktorého DNA je účinne viazaná na regulačnú jednotku, umožňujúcu expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách.
7. Hostiteľská bunka obsahujúca vektor podľa patentových nárokov 5 alebo 6.
8. Hostiteľská bunka podľa patentového nároku 7, ktorou je bakteriálna, hubová, rastlinná alebo živočíšna bunka.
9. Spôsob výroby polypeptidu latentného vírusu chmeľu alebo jeho mutovanej verzie, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z kultivácie hostiteľských buniek podľa patentového nároku 7 a 8 pri podmienkach dovoľujúcich expresiu polypeptidu a získavanie produkovaných polypeptidov z kultivačného média.
10. Polypeptid kódovaný DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2, alebo pripravený spôsobom podľa patentového nároku 9.
11. Protilátky špecificky rozoznávajúce polypeptidy podľa patentového nároku 10.
12. Diagnostická kompozícia na detekciu HLV, vyznačujúca sa tým, že obsahuje DNA podľa patentového nároku 3, ktorá je voliteľne označená, a dotblot hybridizačný tlmivý roztok.
13. Diagnostická kompozícia na detekciu HLV, vyznačujúca sa tým, že obsahuje pár nukleových kyselín podľa nároku 4, DNA polymerázu a PCR tlmivý roztok.
14. Spôsob detekcie latentného vírusu chmeľu, vyznačujúci sa tým, že pozostáva zo: a) získania nukleových kyselín z testovaných rastlín chmeľu, b) amplifikácie cielenej nukleovej kyseliny reverznou transkripčnou reťazovou reakciou s použitím nukleovej kyseliny z (a) ako templátu a molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4 ako primér, a voliteľne (a) elektroforetickú analýzu takto získaných amplifikovaných produktov a tým detekciu prítomnosti latentného vírusu chmeľu.
15. Spôsob podľa patentového nároku 14, vyznačujúci sa tým, že ako priméry na amplifikáciu cieľovej nukleovej kyseliny sú vybraté párové priméry zo skupiny pozostávajúcej z oligonukleotidov, ktorých sekvencia nukleových kyselín je udaná v SEKV. IČ: 2 a 4, SEKV. IČ: 3 a 4, SEKV. IČ: 2 a 5 a SEKV. IČ: 3 a 5 a elektroforetická analýza takto získaných amplifikovaných produktov potvrdzuje prítomnosť alebo neprítomnosť špecifických fragmentov DNA obsahujúcich 233, 181, 377, resp. 325 bázových párov.
16. Spôsob detekcie latentného vírusu chmeľu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa: a) extrakciu nukleových kyselín z rastlín a b) hybridizáciu nukleovej kyseliny, ktorá sa získala s očkom obsahujúcim DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2, alebo molekuly nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4.
17. Spôsob podľa patentového nároku 16, vyznačujúci sa tým, že očko obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 4 alebo jej komplementárnu nukleovú kyselinu predĺženú s uvedenou kyselinou ako primér.
18. Rastlinné bunky obsahujúce DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2, alebo molekulu nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4, a/alebo vektor podľa patentového nároku 5 alebo 6.
19. Rastlinné bunky podľa patentového nároku 18, vyznačujúce sa tým, že rastlinou je chmeľ.
20. Použitie DNA podľa patentového nároku 1 alebo 2, molekuly nukleovej kyseliny podľa patentového nároku 3 alebo 4, a/alebo vektora podľa patentového nároku 5 alebo 6, a/alebo hostiteľskej bunky podľa patentového nároku 7 alebo 8, a/alebo polypeptidu podľa patentového nároku 10, a/alebo protilátky podľa patentového nároku 11 pre inžinierstvo rastlín rezistentných proti patogénom.
21. Použitie podľa patentového nároku 20, vyznačujúce sa tým, že patogénom je vírus.
22. Použitie podľa patentového nároku 21, vyznačujúce sa tým, že vírusom je latentný vírus chmeľu a rastlinou je chmeľ.