JPH04181162A - カルラウイルス抗体、その調製法及びそれを使用する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産粟上■剋朋分団 本発明は、ワサビカルラウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕ
ｓ）、その断片及びそのコートたん白質と特異的に結合
するカルラウィルス抗体及びその調製法に関する。

さらに、本発明は、この抗体を使用するカルラウィルス
の検出方法に関する。

災来夏伎歪 ワサビ（Ｗａｓａｂｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）の多くの
品種は、実生で増殖されているが、「真妻」等の優良品
種は株分けで増殖されている。しかしこれらの株分は品
種は、株分けを繰り返すことによって根茎の肥大の低下
、採苗率の低下及び罹病率の上昇などのいわゆる退化現
象が現れており、品種絶滅の危機に瀕している。この品
種退化の主な原因となっているのがウィルス感染による
ものと考えられている〔鈴木春夫ら、静岡農試研報■、
５５〜６６　（１９７６）　］　。

ワサビから分離されるウィルスは、　ＴＭＶ−ｗ（ワサ
ビ系゛タバコモザイクウィルス）ＣＭＶ（キュウリモザ
イクウィルス）及びＴｕＭＶ　（カブモザイクウィルス
）の３種が報告されていた〔鈴木春夫ら、静岡農試研報
■、５５〜６６　（１９７６）　、小室康雄ら、植物防
疫酋、４８６〜４８８（１９６６）　、栃原比呂志ら、
関東東山病虫研報１１．４６（１９６４）］。

しかし、最近カルラウィルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）
に属するウィルス及びラブドウィルス（Ｒｈａｂｄｖｉ
ｒｕｓ）に属するウィルスの２種の新種ウィルスがワサ
ビから見出された〔岸良日出男ら、日本植物病理学会報
５６，１００（１９９０）］　、これらのうちカルラウ
ィルスは、ワサビの多くの品種に感染していることがわ
かり、重要なウィルスであることが示唆された。

一般に植物のウィルスの検定法には生物検定法、電子顕
微鏡検定法、抗血清検定法等があるが、ワサビカルラウ
ィルスにおいては、多量の試料を迅速に検定する必要性
から抗血清検定法の確立が望、まれでいた。

日　げ　しよ゛と　る晋 本発明は、従来技術のこのような点に注目し、ワサビカ
ルラウィルスに対する抗体を調製し、これを用いて多量
のワサビからワサビカルラウィルスを迅速に検出する方
法を提供しようとするものである。

。　占　”るための すなわち、本発明は、ワサビから検出されたカルラウィ
ルス（Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ）のウィルス粒子、ウィル
ス断片あるいはウィルスコートたん白質と特異的に結合
することができる抗体、この抗体の調製法及びこの抗体
を用いるカルラウィルス検出法に関する。

本発明におけるカルラウィルス抗体は、カルラウィルス
粒子、ウィルス粒子断片あるいはウィルスコートたん白
質を抗原として生産されたものであり、ワサビカルラウ
ィルスの粒子、ウィルス断片あるいはウィルスコートた
ん白質と特異的に結合することができる。

また、本発明のカルラウィルス検出法は、カルラウィル
ス抗体のこのような特異的に結合できる性質を利用して
カルラウィルス抗体をワサビ等の植物体から調製された
試料と接触させ、該抗体と該試料との特異的抗原抗体反
応を検出する方法である。該抗体と該試料との特異的反
応を検出するには、スライド法、微量沈降反応法、重層
法、赤血球凝集反応法、ラテックス凝集反応法、寒天ゲ
ル内拡散法、ＥＬＩ　ＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫電顕法等
、従来、抗原の検出に用いられる通常の方法が用いられ
る。

本発明のカルラウィルス抗体を調製するには、まず、ワ
サビからカルラウィルスを単離し、これを増殖する０次
にこのカルラウィルスを純化し、これを抗原として任意
の哺乳動物に注射し、採血し、抗体血清を得て、この抗
血清から抗体を調製する。この抗体の調製は、通常行わ
れている抗体調製方法に従ってカルラウィルス抗体を得
るとよい。

得られるカルラウィルス抗体を用いて抗原抗体反応を利
用してカルラウィルスを迅速的確に検出することができ
る。

さらに、本発明のカルラウィルス抗体の調製方法につい
て詳細に述べると次のとおりである。

１、抗原ウィルスの単離及び増殖 抗原ウィルスの単離は、原植物が、ワサビ品種「真妻」
の樟に、はとんどの個体がカルラウィルス（Ｃａｒｌａ
ｖｉｒｕｓ）以外の他のウィルスに重複感染している場
合には、カルラウィルスには感染するが他のウィルスに
は感染しない宿主植物に原植物を接種することにより行
なうか、あるいは茎頂培養法により、カルラウィルス単
独感染植物を作出することにより行なうことができる。

あるいはカルラウィルスに単独に感染しているワサビ植
物体を原植物として用いれば単離の必要はない。

次に抗原ウィルスの増殖は、上記単離したウィルスをこ
のウィルスに全身感染する植物や、局部感染する植物に
接種することによって行なうことができる。例えば、単
独感染メリクロンをマルチプルシュート法によって増殖
させてウィルスを増殖させると、他のウィルスによる汚
染の危険性が少な（抗原ウィルスだけを増殖させること
ができる。

２、抗原ウィルスの純化 上記の様に単離され、植物体中で増殖したウィルスを抗
体を得るための抗原として用いるためには純化濃縮する
ことが必要である。カルラウィルスに感染している材料
となる植物体の種類によって純化法は若干異なる。しか
し、この工程は、−船釣には、罹病葉からのウィルスの
抽出、汁液の清澄、ウィルスの純化に分けることができ
る。これらの方法は、ウィルスの抗原性を変化させない
方法であれば、どの様な方法でも用いることができる。

ａ）　ウィルスの抽出： 凍結または生のウィルス感染葉を乳鉢やホモジナイザー
等を用いて磨砕する。このとき植物汁液中にある物質が
ウィルスと結合して沈澱を生成しないように緩衝液また
は塩類を加えるとよい、１１衝液にはクエン酸緩衝液等
が用いられ、また塩には、ＫＪＰＯ４、ＮａｚＨＰＯｎ
　、（ＮＨ４）ｚｓＯｎ等が用いられる。その濃度は、
約３％程度がよい、　ｐｌ＋は、４．５〜９．０、好ま
しくは６．８付近がよい。

ｂ）　汁液清澄： 前記のようにしてウィルスを抽出した汁液を清澄する。

汁液の清澄には、種々の方法を用いることができる。例
えば、凍結、加塩、加熱、珪藻土濾過、有機溶剤添加、
遠心分離等の方法を適当に組合せることにより、汁液を
清澄化することができる。

Ｃ）　ウィルスの純化 このようにして得られる清澄液からウィルスを純化する
。この純化にも種々の方法を用いることができる。例え
ば、塩沈澱法、分画遠心分離法、密度勾配遠心分離法、
等電点沈澱法、電気泳動分離法、クロマトグラフ分離法
、ゲル濾過法等を適当に組合せることによりウィルスを
純化することができる。

３、　抗体の調製 このようにして得られた純化ウィルスを適宜のアジュバ
ント等と混合乳化しこれを抗体産生に通−常使用される
哺乳動物、例えば、ウサギ、マウス等に注射する。注射
は筋肉注射、静脈注射あるいは両者を併用してもよく、
通常は数回行なう、−定期間飼育後、動物から採血して
これから抗血清を得、抗体を調製する。これらの抗体調
製手段は常法による　（例えば、「野菜のウィルス病」
養賢堂ｐ４２７〜４４６、「単クローン抗体」講談社Ｐ
３０〜１４３参照）。抗体はモノクロナール抗体でもポ
リクロナール抗体でもよい。

４、　抗原カルラウィルスの検出 得られた抗体は、これを植物体から調製された試料と接
触させ、抗体と試料中のカルラウィルス粒子、その断片
あるいはウィルスコートたん白とを特異的に結合させる
ことによって抗原カルラウィルスを検出することができ
る。この検出には、通常抗原抗体反応の検出に用いられ
ているスライド法、微量沈降反応法、重層法、赤血球凝
集反応法、ラテックス凝集反応法、寒天ゲル内拡散法、
ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、免疫電顕法等の方法が用いら
れる。検出に用いられる植物体は、ワサビがあるがこれ
以外にもカルラウィルスに感染していると思われる植物
体であればどのようなものでも用いられる。

次に実施例を挙げ、本発明をより具体的に説明する。

裏施桝 １、抗原ウィルスの単離及び増殖 抗体を作成するための抗原カルラウィルス（Ｃａｒｌａ
νｊｒｕｓ）の単離・増殖は、茎頂培養法によりカルラ
ウィルス単独感染メリクロンを作成し、マルチプルシュ
ート法でメリクロンを増殖させることにより行なった。

すなわち、ワサビ、カルラウイルス、ラブドウィルス（
Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）及びＴＷＶ−ｗの３種が重複
感染している伊豆湯ケ島産のワサビ（品種゛「真妻」）
を供試し、根茎あたり７〜８個の腋芽茎頂を摘出し、こ
の茎頂をベンジルアミノプリンＩＷｇ／ｊ２及び寒天１
０ｇ／　１を含むムラシゲスクーク培地上に置床して培
養した。培養は１８°Ｃで２００１ｔ　ｕｘの光線を１
６時間／ｄａｙ照射する人工気象器内で行なった。培養
１〜２力月後、１〜２１に生長したメリクロンを生物検
定法、電子顕微鏡検定法及び抗血清検定法によりウィル
ス検定を行ない、カルラウィルスが単独感染したメリク
ロンを選抜した。このメリクロンをマルチプルシュート
法により増殖させることによりカルラウィルスを増殖さ
せた。

λ　抗原ウィルスの純化 ウィルスの純化には、上記のワサビカルラウィルス単独
感染メリクロンを一８０″Ｃで凍結保存し、純化材料と
して用いた。この凍結葉の湿重量１に対し、２容の０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，８，０，１％チオグリセ
ロールを含む）を加えてホモジナイザー（１００００〜
１２０００　ｒｐｍ）で粉砕後、２重にしたガーゼで濾
過した。この濾液に１１５容の四塩化炭素を加えて１５
分間攪拌後、８０００ｒｐ−で１５分間遠心した。この
上清にポリエチレングリコール６０００を５％、ＮａＣ
ｌを０．３　ＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％になるよ
うにそれぞれ加えて１時間マグネチックスターラーで攪
拌した後、８０００ｒｐ−で１５分間遠心し、その沈澱
を０．１　Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に懸濁した
。この溶液を６０００ｒｐ−で１０分間遠心し、この上
清にポリエチレングリコール６０００を５％、ＮａＣＩ
！を０．３、ＭＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１％になるよ
うにそれぞれ加えて、１時間マグネチックスクーラーで
攪拌した後、８０００ｒｐｍで１５分間遠心した。その
沈澱を０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に懸濁
した後６０００ｒｐ＋＊で１０分間遠心した。この上清
を２５％のショ糖（０，１Ｍクエン酸緩衝液ｐｉ（６，
８）に重層し、４０００ｒｐｍ）で９０分間遠心した。

この沈澱を０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶
解し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心した。この上清を
１０〜４０％ショ糖連続密度勾配（０，１Ｍクエン酸緩
衝液、ｐＨ６，８）に重層し、２４０００ｒｐ−で１５
０分間遠心したところ、チューブの中程に乳白色のバン
ドが認められた。この部分を採取し、４００００　ｒｐ
−で９０分間遠心した後、沈澱を２ｄの蒸留水で溶解し
、純化ウィルスを得た。

３、　抗体の作成 ａ）純化ウィルスの注射 Ｆｒｅｕｎｄ　　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ
と前記の方法で得られた純化ウィルスとを混合、乳化し
、ウサギに８〜２２日間隔で計５回筋肉注射を行ない、
さらにその後１０日目に静脈注射し、その６日後に全採
血を行なった。すなわち、 〔１回目注射〕 純化ウィルス２．ＯＩｄを等量のＦｒｅｕｎｄ　Ｃｏｍ
ｐｌｅｔｅＡｄｊｕｖａｎｔと混合し乳化して後脚に筋
肉注射した。

〔２回目注射〕 前回から８日後に、前記と同じ乳化ウィルス２−を後脚
に筋肉注射した。

〔３回目注射〕 前回から１５日後に、前記と同じ乳化ウィルス４ｄを後
脚に筋肉注射した。

〔４回目注射〕 前回から８日後に、前記と同じ乳化ウィルス２−を後脚
に筋肉注射した。

〔５回目注射〕 前回から２２日後に、前記と同じ乳化ウィルス２−を後
脚に筋肉注射した。

〔６回目注射〕 前回から１０日後に、純化ウィルス０．５　ｄを等量の
リン酸緩衝液に溶解して耳翼の静脈に注射した。

〔採血〕

静脈注射から６日後に全採血した。

ｂ）抗血清の調製 全採血した血液を試験管に入れて凝固させた後３７℃の
恒温槽に３０分間入れて血液の凝固、血餅の形成を促進
させた。次いでガラス捧を用いて血餅を除去し、４°Ｃ
の冷蔵庫内に１２時間静置すると、透明な抗血清を得る
ことができた。

Ｃ）抗体の調製 抗体の調製は、上記抗血清を用い常法によって行った。

すなわち、前記抗血清１容に対し、９容の蒸留水を加え
抗血清を希釈した。これに等量の硫酸アンモニウム飽和
液を撹拌しながら加え、これを８００Ｏｒｐｍで２０分
間遠心した。沈澱を蒸留水で２倍希釈したリン酸緩衝液
２ｄに溶解し、これを２倍希釈リン酸緩衝液に対し透析
し、硫酸アンモニウムを除去した。透析後、抗血清をＤ
ＥＡＥセルロースクロマトグラフィーにかけた。ＤＥＡ
Ｅセルロースは、塩酸及び水酸化ナトリウムで活性化し
た後、２倍希釈のリン酸緩衝液で懸濁・溶出し、０Ｄｚ
ｙｓのピーク部分を集め、抗体を得た。

４、　抗原ウィルスの検出 ａ）免疫電顕法 前記抗血清を、１ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液で１００
０倍に希釈した後、コロジオン支持膜をはったグリッド
上に滴下し、次いでカミソリで切り出した植物組織片（
ワサビカルラウィルスに感染しているワサビおよびカブ
モザイクウィルスに感染しティるコマツナ）の切り口を
この液に浸した。室温でグリッドを乾燥させた後、２％
のリンタングステン酸水溶液を滴下し、余分な一液を濾
紙で吸い取った。

室温で乾燥させた後、透過型電子顕微鏡で検鏡した。こ
の結果、ワサビカルラウィルスの粒子は、抗血清を用い
ない方法の粒子より、粒子像が太く、粒子周囲に濃い影
を作って観察された。一方、ワサビカルラウィルスと形
態的に似ているカブモザイクウィルスでは、このような
ことはなかった。

以上のことから本発明の抗血清は、ワサビカルラウィル
スに特異的に反応する抗血清であることが確認できた。

ｂ）ＥＬＩＳＡ法 Ｍ、　Ｆ、　Ｃ１ａｒｋ、らの方法（Ｊ、　Ｇｅｎ、　
Ｖｉｃｏｌ、　１９７７＋田、　４７５−４８３）に従
って、上記抗体からＥＬＩＳＡ用に、コーティイング液
とコンシュケート液を調製し、ウィルスの検出を行なっ
た。その結果、第１表に示した様に、本発明の抗体を用
いたＥＬＩＳＡ検定においては、ワサビカルラウィルス
にのみ反応し他の３種のウィルスには全く反応しなかっ
た０以上のことから、本発明の抗体はワサビカルラウィ
ルスに特異的に反応する唯一の抗体であることが明らか
となった。

第１表 ＴｕＭＶ　　感染カブ　　　０．０６　　　１．２２Ｃ
ＭＶ感染タハ：７　　０．０５　　０．０６発１凶従果 本発明のワサビカルラウィルス抗体は免疫；順法等通常
のウィルス検定法によるウィルス検出に用いることがで
きる。

これらの検出法によると大量の試料の迅速がっ特異性の
高いウィルス検定を行なうことができ、ウィルス病憂延
の防止や、組織培養等により作出した植物のウィルスフ
リー化のｉ［Ｈに利用することができる。

また、茎頂培養等組織培養法によりウィルスフリー植物
を作出する際に培地に抗体を添加する等、外植体を抗体
に接触させることにより、ウィルスフリー化率を向上す
ることができる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワサビから検出されたカルラウイルス（Ｃａｒｌ
   ａ−ｖｉｒｕｓ）のウィルス粒子、その断片またはウィ
   ルスコートたん白質を抗原として哺乳動物内で産生され
   る抗体であって、カルラウイルス粒子、その断片または
   ウイルスコートたん白質と特異的に結合するカルラウイ
   ルス抗体
2. （２）カルラウイルスを単離し、増殖し、純化し、これ
   を抗原として哺乳動物中に投与し、採血し、抗血清を得
   、この抗血清からカルラウイルス抗体を得ることを特徴
   とするカルラウイルス抗体の調製法
3. （３）請求項（１）記載のカルラウイルス抗体を植物体
   から調製した試料と接触させ、該抗体と該試料との特異
   的抗原抗体反応を検出することを特徴とするカルラウイ
   ルスの検出法
4. （４）植物体がワサビであることを特徴とする請求項（
   ３）記載のカルラウイルスの検出法