JPH06303999A - 特定な２種のプローブを用いるハイブリダイゼーション法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】カーラウィルスグループに属するウィルス用の
プローブとしてある特定の塩基配列を有する遺伝子ある
いはその一部またはその同効物を用いる、およびポティ
ウィルスグループに属するウィルス用のプローブとして
ある特定の塩基配列を有する遺伝子あるいはその一部ま
たはその同効物を用いることを特徴とするウィルスフリ
ー判定のためのネギ属野菜用ハイブリダイゼーション
法。 【効果】本発明方法によって、きわめて効率的にネギ属
野菜に感染したウィルスの検出が可能となり、ネギ属野
菜のよりすぐれたウィルスフリー種苗の判定ができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウィルスフリー判定の
ためのネギ属野菜用ハイブリダイゼーション法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】植物に感染するウィルスは、電子顕微鏡
によって観察される粒子の形態から大きく３つ、すなわ
ち球状、楕円体状および棒状に分けられる。さらに、棒
状ウィルスは真直な棒状および屈曲棒状の２種に分けら
れる。従来、ネギ属野菜に感染する屈曲棒状ウィルスが
複数知られているが、該屈曲棒状ウィルスについての種
類、病原性等に関しては多くの点が不明なままであっ
た。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】現在栽培されているネ
ギ属野菜のほとんどすべての品種がウィルスに感受性で
ある。ウィルスがネギ属野菜に感染すると、該ウィルス
の病原性に応じて１０〜５０％の減収となり、農業生産
性が著しく低下する。このため、ウィルスフリー種苗の
供給が強く求められている。ウィルスフリー種苗は、生
長点培養法によってウィルスフリー植物体を作出した
後、該植物体を大量に増殖することにより、実際の生産
に利用させる。しかしながら、ウィルスフリーである生
長点の摘出が難しい場合が多く、このため生長点培養法
によってもすべての個体についてウィルスを完全に除去
することは難しかった。また、ウィルスフリー植物体の
大量増殖は、通常、網室などの隔離囲場で数年間行なわ
れるが、その際ウィルスの再感染が生じていた。このた
め、ネギ属野菜に感染したウィルスを高感度で、かつ容
易に検出するための方法が必要であった。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況を鑑み、すぐれたウィルスフリー判定のためのネギ属
野菜用ハイブリダイゼーション法を見い出すべく鋭意検
討を重ねた結果、屈曲棒状ウィルス群内のある特定の２
種のグループに属する各々のウィルス用に、ある特定の
塩基配列である遺伝子をプローブとして用いるハイブリ
ダイゼーション法によってきわめて効率的にネギ属野菜
に感染したウィルスの検出が可能であることを見い出
し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、カーラウ
ィルスグループ（Carlavirus group) に属するウィルス
用のプローブとして式化７の塩基配列（以下、配列番号
１と記す。）を3'末端に有する遺伝子あるいはその一部
またはその同効物を用いる、およびポティウィルスグル
ープ（Potyvirus group)に属するウィルス用のプローブ
として式化８の塩基配列（以下、配列番号２と記す。）
を3'末端に有する遺伝子あるいはその一部またはその同
効物を用いることを特徴とするウィルスフリー判定のた
めのネギ属野菜用ハイブリダイゼーション法（以下、本
発明方法と記す。）およびプローブとして使用される遺
伝子（以下、本発明遺伝子と記す。）を提供するもので
ある。

【化７】配列番号１

【化８】配列番号２

【０００５】本発明方法において、ネギ属野菜とは、ア
リウム属に属する植物を意味し、たとえばニンニク、シ
ャロット、ラッキョウ、ワケギ、リーキ等の栄養繁殖性
野菜、タマネギ、ネギ等の種子繁殖性野菜等をあげるこ
とができる。好ましくはニンニクがよい。

【０００６】本発明方法において、ウィルスフリーとは
ウィルスに感染していない状態を示すことはもちろんで
あるが、ネギ属野菜の種類等に応じて強い病原性のある
ウィルスに非感染であり、かつ農業生産性を著しく低下
させない状態を包含する場合もある。

【０００７】本発明方法の利用において、ネギ属野菜に
感染したウィルスを検出するためには、検体であるネギ
属野菜から、たとえば、下記の方法によって、１−(1)
ウィルス粒子を調製し、該ウィルス粒子からウィルスゲ
ノム遺伝子であるＲＮＡを抽出し、または１−(2) 検体
である植物から直接ウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮ
Ａを抽出し、２．該ＲＮＡに対する相補的なＤＮＡ（以
下、ｃＤＮＡと記す。）を作製（逆転写：ＲＴ）する必
要がある。３．得られるｃＤＮＡは、必要に応じてポリ
メレースチェーンリアクション法（ＰＣＲ法）により増
幅された後、本発明方法によってウィルスの感染および
非感染を検定され、ウィルスに非感染な検体が選び出さ
れることにより、ウィルスフリーネギ属野菜が選抜され
る。なお、ポリメレースチェーンリアクション法により
増幅が必要な場合とは、検体である植物に感染している
ウィルス量が少ない場合等をあげることができる。

【０００８】１−(1) ウィルス粒子の調製は、新編 植
物ウィルス学第３版 著作代表者平井篤造 発行所
（株）養賢堂(1984)、日本植物病理学会報 第52巻、第
３号第453 頁(1986)等に記載される通常の方法によって
行なうことができる。該粒子からのウィルスゲノム遺伝
子であるＲＮＡの抽出は、生物化学実験のてびき ３核
酸の分離・分析法 著作代表者 泉 美治 発行所
（株）化学同人(1986)等に記載される通常の方法によっ
て行なうことができる。１−(2) 検体である植物からの
直接ウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡの抽出は、植
物遺伝子工学マニュアル 内宮博文ら編著 発行所
（株）講談社、植物分子生物学実験法 遠山益監訳発行
所 丸善株式会社(1991)等に記載される通常の方法によ
って行なうことができる。 ２．該ＲＮＡに対するｃＤＮＡの作製は、ヴィロロジー
第 132巻、第 271頁(1984)等に記載させる通常の方法に
よって行なうことができる。 ３．得られるｃＤＮＡは、必要に応じてポリメレースチ
ェーンリアクション法（ＰＣＲ法）により増幅された
後、電気泳動にて分離せずにそのままの状態で、または
分離後、プローブとして本発明遺伝子あるいはその一部
または同効物を使用してＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを
形成させることにより選択的に視覚検出される。

【０００９】本発明方法において、プローブとして使用
される本発明遺伝子あるいはその一部またはその同効物
は、カーラウィルスグループに属するウィルス用には、
配列番号１で示される塩基配列を3'末端に有する遺伝子
あるいはその一部、たとえば、式化９の塩基配列（以
下、配列番号３と記す。）を有する遺伝子等またはその
同効物、たとえば、式化１１のアミノ酸配列（以下、配
列番号５と記す。）をコードする塩基配列を3'末端に有
する遺伝子あるいは一部であり、ポティウィルスグルー
プに属するウィルス用には、配列番号２で示される塩基
配列を3'末端に有する遺伝子あるいはその一部、たとえ
ば、式化１０の塩基配列（以下、配列番号４と記す。）
を有する遺伝子等またはその同効物、たとえば、式化１
２のアミノ酸配列（以下、配列番号６と記す。）をコー
ドする塩基配列を3'末端に有する遺伝子あるいは一部で
ある。ここで、同効物とは、同じアミノ酸配列をコード
する異なる塩基配列を有する遺伝子のことである。

【化９】配列番号３

【化１０】配列番号４

【化１１】配列番号５

【化１２】配列番号６

【００１０】これらの本発明遺伝子あるいはその一部ま
たはその同効物は、ウィルス感染植物組織からウィルス
粒子を調製し、該ウィルス粒子からウィルスゲノム遺伝
子であるＲＮＡに対するｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡ
を発現ベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリ
ーを作製し、該ｃＤＮＡライブラリーをウィルス外被蛋
白質の抗体を用いてまたはウィルス外被蛋白質の部分ア
ミノ酸配列に基づいた合成ＤＮＡをプローブとして用い
てスクリーニングを行ない、選抜されたｃＤＮＡの塩基
配列を解析することにより、目的遺伝子であることを確
認する。このような通常のｃＤＮＡのクローニング法に
よって得ることができる。なお、ウィルス外被蛋白質の
抗体はウィルス感染植物組織からウィルス粒子を調製・
精製し、該ウィルス粒子から抗血清を作製する等の通常
の抗体調製方法によって得ることができる。

【００１１】本発明方法において、プローブの作製およ
びハイブリダイゼーションは、植物防疫 第44巻、第12
号、第 549頁(1990)等に記載される通常の非放射性標識
を用いた方法や、最新農学実験の基礎 東北大学農学部
農学科編 発行所（株）ソフトサイエンス社(1990)、第
182頁等に記載される通常の放射性標識を用いた方法等
によって行なうことができる。具体的には、たとえば、
本発明遺伝子あるいはその一部またはその同効物に〔α
−³²Ｐ〕ｄＣＴＰ等の放射性ヌクレオチドをニックトラ
ンスレーション法によって取り込ませて、³²Ｐ等で標識
した放射性もしくはビオチン−11−ｄＵＴＰあるいはビ
オチン−14−ｄＡＴＰ等のビオチン化ヌクレオチドをニ
ックトランスレーション法あるいはランダムプライミン
グ法によって取り込ませて標識した非放射性プローブ、
またはアルカリ性フォスファターゼあるいはペルオキシ
ダーゼ等の酵素をグルタールアルデヒドを用いて塩基部
位へ架橋結合させて標識した非放射性プローブの作製を
行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、(1)
たとえば、９０〜１００℃で、３〜５分間の熱変性等に
よって１本鎖の状態にされたｃＤＮＡをナイロンフィル
ター（HybondN 登録商標、アマシャム製）にスポット
し、濾紙上で乾燥後、紫外線照射させることにより固定
する、(2) 得られたＤＮＡ固定フィルターと上記のプロ
ーブ、すなわち標識された本発明遺伝子あるいはその一
部またはその同効物を、たとえば、４０〜５０℃で、１
０〜２０時間インキュベートすることにより、ハイブリ
ッド形成させ、各種方法によってハイブリットを形成し
たプローブのみを検出する、等の順に行なわれる。プロ
ーブとして³²Ｐ等で標識した放射性プローブを用いる場
合は、そのままＸ線フィルムに感光させてシグナルを検
出する。ビオチン化ヌクレオチドで標識した非放射性プ
ローブを用いる場合は、ストレプトアビジンを介してビ
オチン化アルカリ性フォスファターゼによる酵素標識
後、基質であるニトロブル−テトラゾリウムおよび５−
ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸を加え、酵
素反応による基質の発色あるいは発光をＸ線フィルムに
感光させてシグナルを検出する。また、アルカリ性フォ
スファターゼあるいはペルオキシダーゼ等の酵素で標識
した非放射性プローブを用いる場合は、前者では４−メ
トキシ−４−（３−フォスフェイトフェニル）スピロ
〔１，２−ジオキシエタン−３，２−アダマンタン〕
（ＰＰＤ）等、後者ではルミノール等を基質として用
い、酵素反応による基質の発色あるいは発光をＸ線フィ
ルムに感光させてシグナルを検出する。

【００１２】

【実施例】以下、実施例についてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらの実施例になんら限定されるもので
はない。

【００１３】実施例１ （プローブの作製 その１：ウ
ィルス粒子の調製） ニンニク植物のモザイク病罹病葉２４０ｇを−８０℃の
ディープフリーザー内で凍結後、１mMのＥＤＴＡ、0.25
重量％の２−メルカプトエタノール、 0.1重量％ジエチ
ルジチオカルバミン酸ナトリウムを含む 0.1Ｍのホウ酸
ナトリウム緩衝液(pH8.0) ９６０mlを加え、ワーリング
ブレンダーにより４℃下で充分に磨砕した。該磨砕物を
ガーゼでろ過し、得られたろ液を遠心分離（10,000rpm,
10min,４℃）後、上清を回収することによって粗抽出
液を得た。該粗抽出液に終濃度として２重量％になるよ
うにTriton X-100を加え、４℃で２０分間攪拌後、２０
％ショ糖クッションを用いた超遠心分離 (156,000g, 60
min,４℃）によってウィルス濃縮画分を沈澱とした得
た。該画分を蒸留水４８mlに懸濁後、前記と同条件での
超遠心分離操作を３回繰り返し、最終的に蒸留水に懸濁
したウィルス粒子を６００μｌ（ウィルスタンパク量と
して３９３μｇ）得た。

【００１４】実施例２ （プローブの作製 その２：ウ
ィルス粒子からのウィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡの
抽出） 実施例１によって得られたウィルス粒子６００μｌ（ウ
ィルスタンパク量として３９３μｇ）に等量の終濃度と
して２００μｇ／mlのプロティナーゼＫ、１００mMの塩
化ナトリウムおよび 0.5重量％のＳＤＳを含む１０mM
Tris−ＨＣｌ緩衝液（pH7.6)を加え、３７℃で１０分間
インキュベートした。次に等量のフェノール−クロロホ
ルム（１：１）を加え、１分間ボルテックスを用いて混
合した。これを遠心分離（10,000ｇ，１min,４℃）して
得られた水層を回収した。このフェノール−クロロホル
ム抽出操作は３回繰り返された。次に等量のクロロホル
ムを加え、１分間ボルテックスを用いて混合した。これ
を遠心分離（10,000ｇ，１min,４℃）して得られた水層
を回収し、２倍量のエタノールを加え、ボルテックスを
用いて１５秒間混合した。遠心分離によって得られた沈
澱を回収後、風乾によりエタノールを除去して、ウィル
スゲノム遺伝子であるＲＮＡを得た。該ＲＮＡをＴＥ緩
衝液[1mM EDTA,10mM Tris-HCl(pH8.0) ]に懸濁し、該懸
濁液をＯｌｉｇｏ ｄＴ セルロースカラム(5' →3'社
製) に通して、目的物を吸着後、溶出させることによ
り、約８〜１０ｋｂのポリA 末端を有すウィルスゲノム
遺伝子であるＲＮＡを６．７６μｇ得た。

【００１５】実施例３ （プローブの作製 その３：ウ
ィルスゲノム遺伝子であるＲＮＡに対するｃＤＮＡの作
製） 実施例２によって得られたポリＡ末端を有するウィルス
ゲノム遺伝子であるＲＮＡを RNaseフリー滅菌蒸留水１
０μｌに懸濁し、該懸濁液のうち、６μｌ、すなわちＲ
ＮＡ量として４μｇからｃＤＮＡ合成システム（アマシ
ャム社製）によってｃＤＮＡを３００ng得た。

【００１６】実施例４ （プローブの作製 その４：ｃ
ＤＮＡライブラリーの調製） 実施例３によって得られたｃＤＮＡ １００ngをEcoRI-
Not I-BamHI アダプター（TAKARA社製）とＴ４ライゲー
ス（ligase) により１６℃で、Ｏ／Ｎの条件下でライゲ
ーションし、市販のThe GENECLEAN II KIT (BIO 101 社
製）により過剰アダプターを除去した。これに80units
のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、３７℃で３０
分間インキュベートすることにより、アダプター末端を
リン酸化した。さらに、ベクターアームEcoRI 消化λ Z
AP II (STRATA GENE社製）により４℃で、Ｏ／Ｎの条件
下でライゲーション後、GIGA PACK II (STRATA GENE 社
製）を用いて、in vitroパッケージングを行なうことに
より、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。

【００１７】実施例５ （プローブの作製 その５：カ
ーラウィルスグループに属するウィルス用プローブの作
製） カーラウィルスグループに属するウィルス用プローブの
作製は、次の方法で行なった。モザイク病徴を示さず
に、一種類のウィルスのみ（以下、供試ウィルスと記
す。）に感染したニンニク植物の葉から実施例１に準じ
た方法によってウィルス粒子を、Allison らの報告〔ヴ
ィロロジー 第 147巻、第 309頁(1985)〕に従い、トリ
プシンによる部分消化することにより、トリプシンコア
ペプチドを得た。該トリプシンコアペプチドのＮ末端ア
ミノ酸配列を解析し、この配列より予想されるＤＮＡ配
列を有する合成ＤＮＡをＲＩ末端標識したプローブを用
いて実施例４で得られたｃＤＮＡライブラリーである形
質転換株のプラークハイブリダイゼーションを行ない、
供試ウィルスの外被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有
する組み換えファージを取得した。該組み換えファージ
をプラスミドBLUESCRIPTSK(-)にサブクローニングし、
供試ウィルスの外被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有
するプラスミドを得た（pGLA-9と命名した。）。該プラ
スミドの制限酵素地図を第１図に示す。なお、pGLA-9
は、Escherichia coli XL1-BLUE/pGLA-9（受託番号：Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１３４９９）として平成５年３月４日付け
で工業技術院生命工学工業技術研究所によって受託され
た。次に得られた供試ウィルスの外被蛋白質遺伝子に対
するｃＤＮＡクローンの遺伝子塩基配列を解析し、3'末
端から１４２４bp（ポリＡ末端を除くと１４１３bp）の
塩基配列を決定した（配列番号１）。さらに塩基配列か
ら予想されるウィルス外被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮ
Ａの塩基配列（配列番号３）ないしアミノ酸配列（配列
番号５）および非構造蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡの
塩基配列ないしアミノ酸配列を決定した。結果、該遺伝
子構造は、3'末端にポリＡ末端を有し、非翻訳領域に引
続き、非構造蛋白質をコードしており、その上流に外被
蛋白質をコードする領域が存在した。これはカーラウィ
ルスグループに属するウィルスと一致する。さらに、上
記のウィルス外被蛋白質のアミノ酸配列および非構造蛋
白質のアミノ酸配列をデーターベーズによりホモロジー
検索した結果、カーラウィルスグループに属するウィル
スの外被蛋白質と最も高い相同性を示した。このことよ
り供試ニンニク植物の葉に感染した一種類のウィルスは
カーラウィルスグループに属するウィルスであると同定
された。上記のプラスミドpGLA-9から制限酵素EcoRV お
よびNdeIを用いて、カーラウィルスグループに属するウ
ィルスの外被蛋白質遺伝子領域に特異的な塩基配列を有
するＤＮＡ(935bp) を切り出し、該ＤＮＡを１００ng／
１０μｌ ＴＥ緩衝液になるように調製後、１００℃
で、５分間の熱処理でＤＮＡを変性させた。変性後、す
ぐに氷中で、５分間放置し、一本鎖状態のＤＮＡを得
た。該ＤＮＡは、市販のＥＣＬ direct nucleic acid l
abeling system（アマシャム社製）を用いて、標識とし
てペルオキシダーゼを塩基部位へ架橋結合させた非放射
性プローブを得た。

【００１８】実施例６ （プローブの作製 その６：ポ
ティウィルスグループに属するウィルス用プローブの作
製） 実施例４で得られたｃＤＮＡライブラリーである形質転
換株から実施例５で得られた供試ウィルスの外被蛋白質
遺伝子に対するｃＤＮＡとは別のウィルス外被蛋白質遺
伝子に対するｃＤＮＡを有する組み換えファージを選抜
した。得られたファージをプラスミド BLUESCRIPT SK
(-) にサブクローニングし、ウィルスの外被蛋白質遺伝
子に対するｃＤＮＡを有するプラスミドを得た（pGMA-2
と命名した。) 。該プラスミドの制限酵素地図を第２図
に示す。pGMA-2は、Escherichia coli XL1-BLUE/pGMA-2
（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３５００）として平成５
年３月４日付けで工業技術院生命工学工業技術研究所に
よって受託された。次に得られたウィルスの外被蛋白質
遺伝子に対するｃＤＮＡクローンの遺伝子塩基配列を解
析し、3'末端から１９９６bp（ポリＡ末端を除くと１９
７４bp) の塩基配列を決定した（配列番号２）。さらに
塩基配列から予想されるウィルス外被蛋白質遺伝子に対
するｃＤＮＡの塩基配列（配列番号４）ないしアミノ酸
配列（配列番号６）および非構造蛋白質遺伝子に対する
ｃＤＮＡの塩基配列ないしアミノ酸配列を決定した。結
果、該遺伝子構造は、3'末端にポリＡ末端を有し、非翻
訳領域に引続き、3'末端から６１９番目の塩基から上流
に一つの大きなＯＲＦ構造を有していた。これはポティ
ウィルスグループに属するウィルスと一致する。さら
に、上記のウィルス外被蛋白質のアミノ酸配列をデータ
ベースによりホモロジー検索した結果、ポティウィルス
グループに属するウィルスの外被蛋白質と最も高い相同
性を示した。このことより、ニンニク植物のモザイク病
罹病葉に感染したカーラウィルスグループに属するウィ
ルスとは別なウィルスはポティウィルスグループに属す
るウィルスであると同定された。上記のプラスミドpGMA
-2から制限酵素HincII およびAccIを用いて、ポティウ
ィルスグループに属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領
域に特異的な塩基配列を有するＤＮＡ(1077bp ) を切り
出し、該ＤＮＡを１００ng／１０μｌ ＴＥ緩衝液にな
るように調製後、１００℃で、５分間の熱処理でＤＮＡ
を変性させた。変性後、すぐに氷中で、５分間放置し、
一本鎖状態のＤＮＡを得た。該ＤＮＡは、市販のＥＣＬ
direct nucleic acid labeling system（アマシャム社
製）を用いて、標識としてペルオキシダーゼを塩基部位
へ架橋結合させた非放射性プローブを得た。

【００１９】試験例１ （検体である植物からのウィル
スゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡの抽出） ニンニク植物の各種組織として、モザイク病罹病葉（生
葉、−８０℃凍結保存葉）、リン片、生長点培養により
作出されたウィルスフリー培養苗、生長点培養により作
出されたウィルスフリー小種球を用いた。該植物体組織
各々５０mg（生重量）を乳鉢中で約５mlの液体窒素に約
１分間浸し、凍結させた。該凍結物を乳棒を用いて液体
窒素中で粉末状にした後、液体窒素を気化させた。得ら
れた粉末に室温下で、フェノール及びチオシアン酸グア
ニジン含有試薬（ISOGEN：ニッポンジーン製）１mlを加
えて室温下、１０分間放置した。更に該試料溶液にクロ
ロホルム 0.2mlを加え、１５秒間激しく振とう後、室温
下、３分間放置し、遠心分離（12,000rpm, 10min, ４
℃）後、水層を回収した。得られた水層にイソプロパノ
ール 0.5mlを加え、混合後、室温下５分間放置し、遠心
分離（12,000rpm, 10min, ４℃）して得られた沈澱に７
５％エタノール１mlを加え、１５秒間激しく振とう後、
遠心分離（7,500rpm, ６min ，４℃）した。得られた沈
澱を RNaseフリー滅菌蒸留水２００μｌに再懸濁後、エ
タノール沈澱し、最終的に植物組織中の全ＲＮＡ約４０
−約９０μｇを得た。

【００２０】試験例２ （ウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡおよび該遺伝子を含む全ＲＮＡに対するｃＤＮＡ
の作製） 実施例２によって得られたウィルスゲノム遺伝子である
ＲＮＡを RNaseフリー滅菌蒸留水１０μｌに懸濁し、該
懸濁液のうち、６μｌ、すなわちＲＮＡ量として４μｇ
からｃＤＮＡ合成システム（アマシャム社製）によって
ｃＤＮＡを３００ng得た。一方、試験例１によって得ら
れたウィルスゲノム遺伝子を含む全ＲＮＡを上記と同様
な方法で、ｃＤＮＡを約１３０〜２３０μｇ得た。

【００２１】試験例３ （ｃＤＮＡに含まれるウィルス
外被蛋白質遺伝子の増幅） 試験例２により得られたｃＤＮＡに含まれるウィルス外
被蛋白質遺伝子の増幅は、カーラウィルスグループに属
するウィルス用プライマーである配列5'−ATGCAAAACCTG
CCTACCCG-3' ならびに5'−GGAAAACATCCGAAGAAGCCA-3'で
示されるオリゴヌクレオチド、およびポティウィルスグ
ループに属するウィルス用プライマーである配列5'−AC
ATGTGCTGTGTGCCTCTC-3' ならびに5'−CCGATTGTGAGGCAAC
GGAA-3'で示されるオリゴヌクレオチドをプライマーと
して用いて、 1.5mMの塩化マグネシウムを含有する増幅
用緩衝液中で、２７回ＤＮＡ増幅サイクルを繰り返すポ
リメラーゼチェインリアクション法により行ない、ウィ
ルス外被蛋白質遺伝子を増幅した。その際の各工程の条
件は、（１）変性工程９５℃、初回のみ５分間、他は１
分間加熱、（２）プライマーのアニーリング工程５７
℃、１分間インキュベート、（３）ＤＮＡポリメラーゼ
による伸長工程７２℃、最終のみ７分間、他は１分間耐
熱性ポリメラーゼ処理であった。なお、プライマーは、
β- シアノエチルホスホアミダイト法を用いる市販のDN
A 合成装置によって得た。

【００２２】試験例４ （ｃＤＮＡの視覚検出） 試験例２により得られたｃＤＮＡおよび試験例３により
得られた増幅されたウィルス外被蛋白質遺伝子は、１０
０℃、５分間および氷中、５分間の条件下で熱変性を行
ない、１μｌずつナイロンフィルター（Hybond N 登録
商標、アマシャム社製）にスポットし、濾紙上２０分間
風乾後、紫外線を２分間照射することにより固定した。
次に、ＥＣＬ detection kit( アマシャム製）を用い、
上記のＤＮＡ固定フィルター４cm² に対し、 0.5Ｍの塩
化ナトリウムを含むハイブリダイゼーション用緩衝液１
mlをハイブリバックに入れ、熱シール後、４２℃で１時
間プレハイブリダイズした。その後、等量のハイブリダ
イゼーション用緩衝液と交換し、試験例３により得られ
た増幅されたウィルス外被蛋白質遺伝子に対しては、実
施例５により得られたプローブ（カーラウィルスグルー
プに属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領域に特異的な
塩基配列を有するペルオキシダーゼで標識した非放射性
プローブ）および試験例２により得られたｃＤＮＡに対
しては、実施例６により得られたプローブ（ポティウィ
ルスグループに属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領域
に特異的な塩基配列を有するペルオキシダーゼで標識し
た非放射性プローブ）を１０ng／mlの割合で添加し、該
ＤＮＡ固定フィルターを４２℃で約１２時間ゆっくりと
振とうしながらインキュベートし、ＤＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッドを形成させた。反応終了後、該ＤＮＡ固定フィ
ルターを、該フィルター１cm² に対し６Ｍの尿素、 0.4
重量％のＳＤＳを含む 0.5×ＳＳＣ(7.5mMクエン酸ナト
リウム，７５mM塩化ナトリウム， pH7.0) 洗浄後２mlを
用いて、４２℃で１０分間洗浄した。さらに毎回洗浄液
を交換しながら１０分間、次に２０分間洗浄した。次に
0.3Ｍの塩化ナトリウムを含む0.03Ｍクエン酸ナトリウ
ム(pH7.0) 洗浄液を上記と同量用いて、室温で５分間洗
浄した。この洗浄を１回繰り返した後、ＤＮＡ固定フィ
ルターを濾紙上で１分間放置し、検出試薬混合液（ECL
ダイレクト ラベリングキット；アマシャム社製) に浸
し、室温で1 分間振とうすることにより、プローブの発
光反応させた。上記の発光によりＸ線フィルムを１時間
感光させた後、このＸ線フィルムを現像し、ウィルス存
在有無の指標であるスポットの有無を調べた。結果を表
１に示す。なお、比較試験としてウィルス粒子を用いた
が、これはニンニク生葉５ｇから実施例１、２および３
に準じた同様な方法で調製され、試験された。

【００２３】

【表１】 ここで「疑良好」とは、カーラウィルスグループに属す
るウィルスの単独感染では、モザイク病徴を生じないた
めに、現在は健全な状態であるが、将来ポティウィルス
グループに属するウィルスに感染した場合（重複感染）
には、ポティウィルスグループに属するウィルスの単独
感染の場合よりも著しく激しいモザイク病徴を生じ、生
育を甚だしく阻害することを意味する。したがって、潜
在的な危険性を有する。

【００２４】

【発明の効果】本発明方法によって、きわめて効率的に
ネギ属野菜に感染したウィルスの検出が可能となり、ネ
ギ属野菜のよりすぐれたウィルスフリー種苗の判定がで
きる。

【配列表】

【００２５】配列番号：１ 配列の長さ：１４１３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Carlavirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１３７．．１０３０ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CGACATTGAA CGAAGTGCAC GTTATCATCA CTGGTGAGTC CGTCAAGCTC ATTGGCTGCG 60 ATCACGAAGA TTCATCGATT TCGCAAACAA GCGAACCCTT TGGTTCACTT TAGTTAACAG 120 CGCTCTAATT GATATTATGG CTAACGAAGA AGAAGAACTC AGTAGAATGC AAAACCTGCC 180 TACCCGCGAT CCCGGAACTA TCCCCGAGCA AGAACGTAGC AAGGCAGTTA ATGATGTTGG 240 CGTGATGGAT CGTGAGAATT TTGAAGCTGT GTTGCGGAGA AGTGAAGATA GATTCAATAA 300 GCTTAAGGAG AAATGCCTGT CGGAACTATC TAGCGTGAGA GTGACCAATT GCGGGTGGGA 360 GTCAGGAAGA CCCAAAGCAC AATTAGCCGA TAGTCTTAAG GGGGATGCAT CCAACATTTT 420 CACACGCCCC TCAATGGATG CCTTGCTAGT GAGGAACTAC GCGCCTGAGA GCAACAATAT 480 GGCTACCGCC GAAGAGTTAG CGAAAATTTC TGCTAAAATA CAGGCTCTCG GCGCTCCTGA 540 AGAATGCTTG GCCGAAGTTT TCTGGGATAT CTGTATGTAC TGTACCACTG CAGGCAGTTC 600 GCCAAATGTG AATCCCAAAG GTACTATCTC AGTCGGGGGT AAAGTCGTGA CTCGAGATAT 660 GGTTGTCGCT GTGATCAAGG AGTATTCCAC ATTACGTCAA GTCTGTCGTT GCTACGCACC 720 AGTGGTCTGG AATTACATGC TATTAAATGA ACAACCACCA GCTAATTGGG ATTCCAAAGG 780 ATTTACTGAG AACACTAAAT ACGCGGCTTT CGATACTTTT GATGCTGTCA CGAACAAGGC 840 TGCAATTCAA CCACTCGAGG GCCTTATTCG AGCCCCGACT GACGCGGAAC GCATCGCTTT 900 TCGTACGCAC AAGAAATTAG CTCTGGCGAA GAATTCCCAG AATTCACGTT ATTCCAACAC 960 TTCTGCTGAA GTTACCGGTG GCTTCTTCGG ATGTTTTCCA AAACACAATT TCAGAGAGAA 1020 TCGATGTTGA TCAAGCAAAG GACTTACCGT AGACTATTGC GTGCTATATT TAAGTTGCAT 1080 ACTAATAAGA ACTGTGTGGA TGTGATAGAC ATCATCGTTA ATAAAATAGT GTGTGGATGC 1140 ACTGGAGCAT CTAAATATGC TCGAGCTCGT AGAGCTAAGA GTATTGGTAG GTGCCCCCGC 1200 TGCTTCAGGT GTGCTCCTGG TTTTTATTTT ACTAAAAACT GTGATACTAA AAATTGTACC 1260 CCAGGCATTA GCTATAATGA AAAAGTCAAG AACTTTATAG TTGATGGTGT TAACAATGTG 1320 AAACCCTACT ACAGTTCTTG GCTTGTTGCC CATAAAACCT AAATAATGCA TAAGTGGGAC 1380 ATATAAAATA ATTTGTTTTT AAAATATTTT CGC 1413

【００２６】配列番号：２ 配列の長さ：１９７４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Potyvirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：３４６．．１３７７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTCTTCGTGA ACGGTGATGA TTTAATCATA GCAGTTGAAC CAGGCTCTGA AACATTCCTT 60 GATAGTTTGC AAAATCTCTT TCATCAACTT GGCTTAAATT ACAACTTTGA CAATCGAACG 120 CGCAATAAGG AAGAGTTGTG TTTCATGTCA CACATGGGTA TTTTACAAGA AGACATATAT 180 ATACCAAAAC TGGATAAGGA GCGCATAGTG TCAATATTGG AGTGGGATCG CGCTCAGCAG 240 CCTGAGCATA GATTGGAAGC TCTATGCGCA GCCATGATCG AAGCTTGGGG ATATCCGGAA 300 TTGCTAGATC GAATCCGAAA GTTCTATTAT TGGGTTCTTG AACAAGCACC GTATAATGAG 360 TTGAGTGCAT TAGGTAAAGC GCCATTTATC TCTGAGGCAG CCCTGCGGAA TTTATACACC 420 GATTGTGAGG CAACGGAAGC GGAGTTAGCA CGATACCTCG AACTTTACGA CAGCGATACA 480 CCCGTAGAAG ACACGTTTGT GTTCCAAGCT AATGATGAAT TAGATGCAGG CATGCAAACA 540 AGTAAGAAAC AGAAGGATGG TAATGATAAA TCTATTGAAC AACGCGATCC AGCATCATCA 600 CAAGTTAGTT CATTAGGCAA GAAAGACGGT GAAGGCGGTT CAGGAATGAG TAGAAACAAA 660 GACAGGGATG TGAACGTTGG CACAACAGGG ACTTTTAGTG TTCCACGAAT CAAACAGATA 720 CCACAGAAAG GTATTTCGAT ACCAATGGAC GGAGGAAAAT CAATACTCAA CTTAGATCAC 780 TTACTACAGT ATAAACCAAA GCAATTGAAT ATATCGAACA CAAGAGCCAC GGTGGCACAA 840 TTTAAAACCT GGATGGAGAG AGTGCAAGAG GATTACGGTG TCACTAAAGG TGAAATGGGC 900 ATAATTCTGA ATGGTTTGAT GGTGTGGTGC ATCGAAAATG GAACCTCACC AAATATAAAT 960 GGGACTTGGA CTATGATGGA TGGCGATGAG CAAGTCGCGT ACCCTTTACG GCCGATCGTT 1020 GAACATGCGA AACCAACCTT ACGGCAAATA ATGGCGCATT TTTCAGCACT CGCGGAGGCG 1080 TACATTGAAA TGAGAAATTC AGAGCAGGCT TATATGCCAA GATATGGACT ACAAAGAAAT 1140 CTTACAGACA TGGGCCTCGC ACGGTATGCA TTTGATTTTT ATGAAGTCAC ATCAAGAACA 1200 CCAGTTAGAG CGCGCGAGGC TCACGCACAA ATGAAAGCAG CGGCCCTACG TAATTCAAGG 1260 CCAAGGCTGT TTGGACTAGA CGGTAACGTC ACAACCACGG ATGAGGACAC GGAGAGGCAC 1320 ACAGCACATG TCGTGAATGC ACGGATGCAC CATCTTGATG GTCGGCATAT GCAGTGATGT 1380 TTCGGTTAGT AACCGGTTAT GGGCTTCCAT TTAAAAAGTC CCGAGTGCCA AACTTGTATT 1440 TTGGCTAGTG TAGTGAAACT ATGATTCACT CGTTCAAGGC AGTTTCTACT TTAAGGATGA 1500 CTTGGGAATT AGTAGCTCCC AATGCCAGTC ACGATGGTGA CTACCAAGAG TCAACACTTG 1560 GTTTGAGGTT GATCGTCCGA AGATCTATCC GGAGTACGGT TTTGTAAAGA AGGTGAATTC 1620 AATTTTTAAG GATAGTAAGT CTGAAGCCTT ATTGGTGTAT AAGCAGCCTG AATTCTGATA 1680 CCCCACCTTT ACCCTACAAT GGAGTGCTAC TTTAGAGACT AGCTAGGATT GAGACCGAAA 1740 TCTCACATAC TGGCATGGCC AGTAGTTGAT CACTTAATGA TCAGGTGACC ACTCTACAGT 1800 CAAGTTGGAA CCCGTAGTAT CCTATCCTTA CCTAATATCG TAAGTTTTAT TTACTGGTGT 1860 AGCGTAGGTT CAACCACCTT ATAAACACTT TGCTATATTA GGATCTGAGC TGTTCGTCTG 1920 AAGGCACTAA GAGTGGTTTG ACCATGTGTG CGTTCTTACG TTGCAGTAAG AGAC 1974

【００２７】配列番号：３ 配列の長さ：８９４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Carlavirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．８９４ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGGCTAACG AAGAAGAAGA ACTCAGTAGA ATGCAAAACC TGCCTACCCG CGATCCCGGA 60 ACTATCCCCG AGCAAGAACG TAGCAAGGCA GTTAATGATG TTGGCGTGAT GGATCGTGAG 120 AATTTTGAAG CTGTGTTGCG GAGAAGTGAA GATAGATTCA ATAAGCTTAA GGAGAAATGC 180 CTGTCGGAAC TATCTAGCGT GAGAGTGACC AATTGCGGGT GGGAGTCAGG AAGACCCAAA 240 GCACAATTAG CCGATAGTCT TAAGGGGGAT GCATCCAACA TTTTCACACG CCCCTCAATG 300 GATGCCTTGC TAGTGAGGAA CTACGCGCCT GAGAGCAACA ATATGGCTAC CGCCGAAGAG 360 TTAGCGAAAA TTTCTGCTAA AATACAGGCT CTCGGCGCTC CTGAAGAATG CTTGGCCGAA 420 GTTTTCTGGG ATATCTGTAT GTACTGTACC ACTGCAGGCA GTTCGCCAAA TGTGAATCCC 480 AAAGGTACTA TCTCAGTCGG GGGTAAAGTC GTGACTCGAG ATATGGTTGT CGCTGTGATC 540 AAGGAGTATT CCACATTACG TCAAGTCTGT CGTTGCTACG CACCAGTGGT CTGGAATTAC 600 ATGCTATTAA ATGAACAACC ACCAGCTAAT TGGGATTCCA AAGGATTTAC TGAGAACACT 660 AAATACGCGG CTTTCGATAC TTTTGATGCT GTCACGAACA AGGCTGCAAT TCAACCACTC 720 GAGGGCCTTA TTCGAGCCCC GACTGACGCG GAACGCATCG CTTTTCGTAC GCACAAGAAA 780 TTAGCTCTGG CGAAGAATTC CCAGAATTCA CGTTATTCCA ACACTTCTGC TGAAGTTACC 840 GGTGGCTTCT TCGGATGTTT TCCAAAACAC AATTTCAGAG AGAATCGATG TTGA 894

【００２８】配列番号：４ 配列の長さ：１０３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to genomic ＲＮＡ 配列の特徴 起源 生物名：Virus 株名：Potyvirus group 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．１０３２ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GCACCGTATA ATGAGTTGAG TGCATTAGGT AAAGCGCCAT TTATCTCTGA GGCAGCCCTG 60 CGGAATTTAT ACACCGATTG TGAGGCAACG GAAGCGGAGT TAGCACGATA CCTCGAACTT 120 TACGACAGCG ATACACCCGT AGAAGACACG TTTGTGTTCC AAGCTAATGA TGAATTAGAT 180 GCAGGCATGC AAACAAGTAA GAAACAGAAG GATGGTAATG ATAAATCTAT TGAACAACGC 240 GATCCAGCAT CATCACAAGT TAGTTCATTA GGCAAGAAAG ACGGTGAAGG CGGTTCAGGA 300 ATGAGTAGAA ACAAAGACAG GGATGTGAAC GTTGGCACAA CAGGGACTTT TAGTGTTCCA 360 CGAATCAAAC AGATACCACA GAAAGGTATT TCGATACCAA TGGACGGAGG AAAATCAATA 420 CTCAACTTAG ATCACTTACT ACAGTATAAA CCAAAGCAAT TGAATATATC GAACACAAGA 480 GCCACGGTGG CACAATTTAA AACCTGGATG GAGAGAGTGC AAGAGGATTA CGGTGTCACT 540 AAAGGTGAAA TGGGCATAAT TCTGAATGGT TTGATGGTGT GGTGCATCGA AAATGGAACC 600 TCACCAAATA TAAATGGGAC TTGGACTATG ATGGATGGCG ATGAGCAAGT CGCGTACCCT 660 TTACGGCCGA TCGTTGAACA TGCGAAACCA ACCTTACGGC AAATAATGGC GCATTTTTCA 720 GCACTCGCGG AGGCGTACAT TGAAATGAGA AATTCAGAGC AGGCTTATAT GCCAAGATAT 780 GGACTACAAA GAAATCTTAC AGACATGGGC CTCGCACGGT ATGCATTTGA TTTTTATGAA 840 GTCACATCAA GAACACCAGT TAGAGCGCGC GAGGCTCACG CACAAATGAA AGCAGCGGCC 900 CTACGTAATT CAAGGCCAAG GCTGTTTGGA CTAGACGGTA ACGTCACAAC CACGGATGAG 960 GACACGGAGA GGCACACAGC ACATGTCGTG AATGCACGGA TGCACCATCT TGATGGTCGG 1020 CATATGCAGT GA 1032

【００２９】配列番号：５ 配列の長さ：２９７ 配列の型：アミノ酸 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．２９７ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Met Ala Asn Glu Glu Glu Glu Leu Ser Arg Met Gln Asn Leu Pro 15 Thr Arg Asp Pro Gly Thr Ile Pro Glu Gln Glu Arg Ser Lys Ala 30 Val Asn Asp Val Gly Val Met Asp Arg Glu Asn Phe Glu Ala Val 45 Leu Arg Arg Ser Glu Asp Arg Phe Asn Lys Leu Lys Glu Lys Cys 60 Leu Ser Glu Leu Ser Ser Val Arg Val Thr Asn Cys Gly Trp Glu 75 Ser Gly Arg Pro Lys Ala Gln Leu Ala Asp Ser Leu Lys Gly Asp 90 Ala Ser Asn Ile Phe Thr Arg Pro Ser Met Asp Ala Leu Leu Val 105 Arg Asn Tyr Ala Pro Glu Ser Asn Asn Met Ala Thr Ala Glu Glu 120 Leu Ala Lys Ile Ser Ala Lys Ile Gln Ala Leu Gly Ala Pro Glu 135 Glu Cys Leu Ala Glu Val Phe Trp Asp Ile Cys Met Tyr Cys Thr 150 Thr Ala Gly Ser Ser Pro Asn Val Asn Pro Lys Gly Thr Ile Ser 165 Val Gly Gly Lys Val Val Thr Arg Asp Met Val Val Ala Val Ile 180 Lys Glu Tyr Ser Thr Leu Arg Gln Val Cys Arg Cys Tyr Ala Pro 195 Val Val Trp Asn Tyr Met Leu Leu Asn Glu Gln Pro Pro Ala Asn 210 Trp Asp Ser Lys Gly Phe Thr Glu Asp Thr Lys Tyr Ala Ala Phe 225 Asp Thr Phe Asp Ala Val Thr Asn Lys Ala Ala Ile Gln Pro Leu 240 Glu Gly Leu Ile Arg Ala Pro Thr Asp Ala Glu Arg Ile Ala Phe 255 Arg Thr His Lys Lys Leu Ala Leu Ala Lys Asn Ser Gln Asn Ser 270 Arg Tyr Ser Asn Thr Ser Ala Glu Val Thr Gly Gly Phe Phe Gly 285 Cys Phe Pro Lys His Asn Phe Arg Glu Asn Arg Cys 297

【００３０】配列番号：６ 配列の長さ：３４３ 配列の型：アミノ酸 配列の特徴 特徴を表す記号：peptide 存在位置：１．．３４３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 Ala Pro Tyr Asn Glu Leu Ser Ala Leu Gly Lys Ala Pro Phe Ile 15 Ser Glu Ala Ala Leu Arg Asn Leu Tyr Thr Asp Cys Glu Ala Thr 30 Glu Ala Glu Leu Ala Arg Tyr Leu Glu Leu Tyr Asp Ser Asp Thr 45 Pro Val Glu Asp Thr Phe Val Phe Gln Ala Asn Asp Glu Leu Asp 60 Ala Gly Met Gln Thr Ser Lys Lys Gln Lys Asp Gly Asn Asp Lys 75 Ser Ile Glu Gln Arg Asp Pro Ala Ser Ser Gln Val Ser Ser Leu 90 Gly Lys Lys Asp Gly Glu Gly Gly Ser Gly Met Ser Arg Asn Lys 105 Asp Arg Asp Val Asn Val Gly Thr Thr Gly Thr Phe Ser Val Pro 120 Arg Ile Lys Gln Ile Pro Gln Lys Gly Ile Ser Ile Pro Met Asp 135 Gly Gly Lys Ser Ile Leu Asn Leu Asp His Leu Leu Gln Tyr Lys 150 Pro Lys Gln Leu Asn Ile Ser Asn Thr Arg Ala Thr Val Ala Gln 165 Phe Lys Thr Trp Met Glu Arg Val Gln Glu Asp Tyr Gly Val Thr 180 Lys Gly Glu Met Gly Ile Ile Leu Asn Gly Leu Met Val Trp Cys 195 Ile Glu Asn Gly Thr Ser Pro Asn Ile Asn Gly Thr Trp Thr Met 210 Met Asp Gly Asp Glu Gln Val Ala Tyr Pro Leu Arg Pro Ile Val 225 Glu His Ala Lys Pro Thr Leu Arg Gln Ile Met Ala His Phe Ser 240 Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Ile Glu Met Arg Asn Ser Glu Gln Ala 255 Tyr Met Pro Arg Tyr Gly Leu Gln Arg Asn Leu Thr Asp Met Gly 270 Leu Ala Arg Tyr Ala Phe Asp Phe Try Glu Val Pro Ser Arg Thr 285 Pro Val Arg Ala Arg Glu Ala His Ala Gln Met Lys Ala Ala Ala 300 Leu Arg Asn Ser Arg Pro Arg Leu Phe Gly Leu Asp Gly Asn Val 315 Thr Thr Thr Asp Glu Asp Thr Glu Arg His Thr Ala His Val Val 330 Asn Ala Arg Asn His His Leu Asp Gly Arg His Met Gln 343

【図面の簡単な説明】

【図１】カーラウィルスグループに属するウィルスの外
被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有するプラスミドで
あるpGLA-9の制限酵素地図。

【図２】ポティウィルスグループに属するウィルスの外
被蛋白質遺伝子に対するｃＤＮＡを有するプラスミドで
あるpGMA-2の制限酵素地図。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】カーラウィルスグループ（Carlavirus gro
   up) に属するウィルス用のプローブとして式化１の塩基
   配列を3'末端に有する遺伝子あるいはその一部またはそ
   の同効物を用いる、およびポティウィルスグループに
   （Potyvirus group)に属するウィルス用のプローブとし
   て式化２の塩基配列を3'末端に有する遺伝子あるいはそ
   の一部またはその同効物を用いることを特徴とするウィ
   ルスフリー判定のためのネギ属野菜用ハイブリダイゼー
   ション法。 【化１】配列番号１ 【化２】配列番号２
2. 【請求項２】式化１の塩基配列を3'末端に有する遺伝子
   の一部が、式化３の塩基配列であることを特徴とする請
   求項１記載のウィルスフリー判定のためのネギ属野菜用
   ハイブリダイゼーション法。 【化３】配列番号３
3. 【請求項３】式化２の塩基配列を3'末端に有する遺伝子
   の一部が、式化４の塩基配列であることを特徴とする請
   求項１記載のウィルスフリー判定のためのネギ属野菜用
   ハイブリダイゼーション法。 【化４】配列番号４
4. 【請求項４】式化１の塩基配列を3'末端に有する遺伝子
   の一部またはその同効物が、式化５のアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列であることを特徴とする請求項１記載
   のウィルスフリー判定のためのネギ属野菜用ハイブリダ
   イゼーション法。 【化５】配列番号５
5. 【請求項５】式化２の塩基配列を3'末端に有する遺伝子
   の一部またはその同効物が、式化６のアミノ酸配列をコ
   ードする塩基配列であることを特徴とする請求項１記載
   のウィルスフリー判定のためのネギ属野菜用ハイブリダ
   イゼーション法。 【化６】配列番号６
6. 【請求項６】式化１または式化２の塩基配列を3'末端に
   有することを特徴とするウィルスゲノム遺伝子。
7. 【請求項７】式化３または式化４の塩基配列であること
   を特徴とするウィルスの外被蛋白質遺伝子。
8. 【請求項８】式化５または式化６のアミノ酸配列をコー
   ドする塩基配列であることを特徴とするウィルスの外被
   蛋白質遺伝子。
9. 【請求項９】pGLA-9を制限酵素EcoRV およびNdeIにより
   消化して得ることを特徴とするカーラウィルスグループ
   に属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領域に特異的な塩
   基配列を有するプローブ。
10. 【請求項１０】pGMA-2を制限酵素HincIIおよびAccIによ
    り消化して得ることを特徴とするポティウィルスグルー
    プに属するウィルスの外被蛋白質遺伝子領域に特異的な
    塩基配列を有するプローブ。