DE69033316T2

DE69033316T2 - Synthetische Antigene zum Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C Virus

Info

Publication number: DE69033316T2
Application number: DE1990633316
Authority: DE
Inventors: Robert J. Deleys; Geert Maertens; Dirk Pollet; Hugo Van Heuverswyn
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1990-12-14
Filing date: 1990-12-14
Publication date: 2000-05-11
Anticipated expiration: 2010-12-15
Also published as: DE69033316D1

Description

Die Einführung von systematischen Tests auf Hepatitis B-Virus (HBV) hat wesentlich dazu beigetragen, dieses Virus bei der Versorgung mit Blut zu beseitigen. Jedoch tritt immer noch eine erhebliche Anzahl an Posttransfusions-Hepatitis-Fällen (PTH-Fällen) auf. Diese Fälle sind im allgemeinen auf Nicht-A-,Nicht-B-Hepatitis-Viren (NANBH-Viren) zurückzuführen, deren Diagnose üblicherweise durch einen Ausschluß von anderen viralen Markern erfolgt.[0001]
Das für einen großen Anteil dieser Fälle verantwortliche ätiologische Agens wurde kürzlich geklont (Q.-L. Choo et al., Science, Bd. 244 (1988), S. 359-362). Ferner wurde ein Antikörper-Test der ersten Generation entwickelt (G. Kuo et al., Science, Bd. 244 (1989), S. 362- 364). Dieses Agens wurde als ein Positiv-Strang-RNA-Virus identifiziert. Die Sequenz von dessen Genom wurde partiell bestimmt. Untersuchungen lassen darauf schließen, daß dieses Virus, das nachstehend als Hepatitis C- Virus (HCV) bezeichnet wird, möglicherweise mit Flaviviren und Pestiviren verwandt ist. Ein Teil des Genoms eines aus einem Schimpansen isolierten HCV (HCVCDC/CHI) ist in EP-0318216 beschrieben. Die in dieser Druckschrift beschriebenen Kodierungssequenzen umfassen keine Sequenzen, die vom 5'-Ende des viralen Genoms, das für die mutmaßlichen Strukturproteine kodiert, stammen. Kürzlich wurden jedoch aus dieser Region des HCV-Genoms abgeleitete Sequenzen veröffentlicht (H. Okamoto et al., Japan J. Exp. Med., Bd. 60 (1990), S. 167-177). Die vom japanischen Klon HC-J1 kodierten Aminosäuresequenzen wurden mit den HCVCDC/CHI-Sequenzen in einer Region, in der sich die beiden Sequenzen überlappen, kombiniert, um die in Fig. 1 dargestellte Verbundsequenz zu erzeugen. Speziell wurden die beiden Sequenzen am Glycin&sub4;&sub5;&sub1; verbunden. Es ist darauf hinzuweisen, daß das für die HCV-Aminosäuresequenz verwendete Numerierungssystem nicht als absolut angesehen werden soll, da die Existenz von varianten HCV-Stämmen, die Deletionen oder Insertionen beinhalten, sehr wahrscheinlich ist. Sequenzen, die dem 5'-Ende des HCV-Genoms entsprechen, wurden ebenfalls kürzlich beschrieben, und zwar in EP-0388232.[0002]
Um potentielle Träger von HCV aufzufinden, ist es erforderlich, über einen Zugang zu großen Mengen an viralen Proteinen zu verfügen. Im Fall von HCV gibt es derzeit kein bekanntes Verfahren zur Züchtung des Virus, was die Verwendung von mit dem Virus infizierten Kulturen als Quelle für virale Antigene ausschließt. Der derzeitige Antikörpertest der ersten Generation bedient sich eines Fusionsproteins, das eine Sequenz von 363 Aminosäuren, die durch das HCV-Genom kodiert wird, enthält. Es wurde festgestellt, daß Antikörper gegen dieses Protein bei 75 bis 85% von chronischen NANBH-Patienten nachgewiesen werden konnten. Im Gegensatz dazu wiesen nur 15% dieser Patienten, die sich in der akuten Phase der Krankheit befanden, Antikörper auf, die dieses Fusionsprotein erkannten (G. Kuo et al., Science, Bd. 244 (1989), S. 362-364). Das Fehlen von geeigneten Bestätigungstests macht es jedoch schwierig, diese Statistiken zu verifizieren. Die anscheinende Ähnlichkeit zwischen dem HCV-Genom und dem von Flaviviren macht es möglich, die Position von Epitopen vorherzusagen, die mutmaßlich von diagnostischem Wert sind. Eine Analyse des HCV- Genoms ergibt die Anwesenheit eines kontinuierlichen, langen, offenen Leserasters. Virale RNA wird vermutlich in ein langes Polyprotein translatiert, das anschließend durch zelluläre und/oder virale Proteasen gespalten wird. In Analogie beispielsweise zum Dengue-Virus wird angenommen, daß sich die viralen Strukturproteine vom aminoterminalen Drittel des viralen Polyproteins ableiten. Derzeit können über die genauen Stellen, an denen das Polyprotein gespalten wird, nur Vermutungen angestellt werden. Dennoch ist es wahrscheinlich, daß die Strukturproteine Epitope enthalten, die für diagnostische Zwecke wertvoll sind, und zwar für den Nachweis von Antikörpern sowie für die Erzeugung von Antikörpern die anschließend für den Nachweis von viralen Antigenen verwendet werden könnten. Gleichermaßen ist zu erwarten, daß Domänen von Nicht-Strukturproteinen Epitope von diagnostischem Wert enthalten, selbst wenn sich diese Proteine nicht als Strukturkomponenten von Virusteilchen identifizieren lassen.[0003]

Kurze Beschreibung der Zeichnung

[0004]
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz des Verbund-HCVHC-J1/CDC/CHI.
Fig. 2 zeigt die Antikörperbindung an einzelne Peptide und verschiedene Gemische in einem ELISA-Test.

Beschreibung der speziellen Ausführungsformen

[0005] Es ist bekannt, daß RNA-Viren häufig eine hohe Rate der spontanen Mutation aufweisen. Somit ist zu erwarten, daß keine zwei HCV-Isolate vollständig identisch sind, selbst wenn sie vom gleichen Individuum abstammen. Für die Zwecke dieser Beschreibung wird ein Virus als gleich oder gleichwertig mit HCV angesehen, wenn es eine globale Homologie von 60% oder mehr mit der HCVHC-J1/CDC/CHI-Verbundsequenz auf dem Nucleinsäureniveau und von 70% auf dem Aminosäureniveau aufweist.
[0006] Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere eine Peptidzusammensetzung, die mindestens ein Peptid umfaßt, das aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
[0007] Weitere Aminosäuren oder chemische Gruppen können an den Amino- oder Carboxylterminus addiert werden, um einen "Linker-Arm" zu schaffen, mit dem das Peptid in zweckmäßiger Weise an einem Träger befestigt werden kann. Der Linker-Arm weist eine Länge von mindestens einer Aminosäure auf und kann eine Länge von 60 Aminosäuren aufweisen, wobei es sich aber am häufigsten um 1 bis 10 Aminosäuren handelt. Die Art der Befestigung an einer festen Phase oder an einem Träger muß nicht kovalent beschaffen sein.
[0008] Natürliche Aminosäuren, wie Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, können am Amino- oder Carboxylterminus addiert werden, um funktionelle Gruppen für die Kupplung mit einer festen Phase oder einem Träger zu schaffen. Jedoch können auch andere chemische Gruppen, beispielsweise Biotin und Thioglykolsäure, an die Termini addiert werden, wodurch den Peptiden die gewünschten chemischen oder physikalischen Eigenschaften verliehen werden. Die Termini der Peptide können beispielsweise auch durch N-terminale Acetylierung oder terminale Carboxyamidierung modifiziert werden. Die Peptide von Interesse werden im Zusammenhang mit der in Fig. 1 dargestellten Verbund-Aminosäuresequenz beschrieben. Die Aminosäuresequenzen sind mit dem herkömmlichen und allgemein anerkannten Dreibuchstaben-Code angegeben. Zusätzlich zu den dargestellten Aminosäuren werden weitere Gruppen folgendermaßen definiert: Y bedeutet beispielsweise NH&sub2;, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder andere Reste, die zur Erleichterung der Kupplung addiert sind. Y selbst kann beispielsweise durch Acetylierung modifiziert sein. Z bedeutet eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder eine oder mehrere chemische Gruppen, die zur Verknüpfung verwendet werden können. X soll OH, NR&sub2; oder eine Bindung unter Beteiligung einer dieser beiden Gruppen darstellen.
[0009] Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Mercaptogruppe von Cysteinen oder Thioglykolsäuren, die zur Acylierung von terminalen Aminogruppen für die Cyclisierung der Peptide oder für die gegenseitige Kupplung von zwei Peptiden verwendet wird. Die Cyclisierung oder Kupplung kann über eine Einfachbindung erfolgen oder kann unter Verwendung von thiolspezifischen Reagenzien zur Bildung einer molekularen Brücke erreicht werden.
[0010] Die Peptide können mit einem löslichen Träger gekuppelt werden, um entweder Antikörper zu erzeugen oder um die Adsorption der Peptide an einer festen Phase zu erleichtern. Der Träger soll so beschaffen sein, daß sein Molekulargewicht mehr als 5000 beträgt und er durch Antikörper in Humanserum nicht erkannt wird. Im allgemeinen handelt es sich beim Träger um ein Protein. Zu Proteinen, die häufig als Träger verwendet werden, gehören das Keyhole-Napfschnecken-Hämocyanin, (KLH), Rinder- Gammaglobulin, Rinder-Serumalbumin und Poly-L-lysin.
[0011] Es gibt zahlreiche, ausführlich beschriebene Techniken zur Kupplung von Peptiden an Träger. Die Bindung kann am N-Terminus, am C- Terminus oder an einer inneren Stelle im Peptid erfolgen. Das Peptid kann zur Kupplung auch einer Derivatbildung unterzogen werden. Ausführliche Beschreibungen über eine Vielzahl von Kupplungsverfahren finden sich beispielsweise bei M. H. V. Van Regenmortel, J. P. Briand, S. Muller und S. Plaue, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 19 (Synthetic Polypeptides as Antigens, Elsevier Press, Amsterdam, New York, Oxford, 1988.
[0012] Die Peptide können auch direkt an einem Oligolysin-Kern synthetisiert werden, bei dem sowohl die alpha- als auch die epsilon-Aminogruppen von Lysinen als Wachstumsstellen für die Peptide verwendet werden. Die Anzahl von Lysinen, die den Kern bilden, beträgt vorzugsweise 3 oder 7. Ferner kann ein Cystein in der Nähe oder am C-Terminus des Komplexes enthalten sein, um die Bildung von Homo- oder Heterodimeren zu erleichtern. Die Anwendung dieser Technik wurde ausführlich für Hepatitis B-Antigene (J. P. Tam und Y.-A. Lu, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 9084-9088) sowie für eine Vielzahl von anderen Antigenen (vergl. J. P. Tam, Multiple Antigen Peptide Systems: A Novel Design für Synthetic Peptide Vaccine and Immunoassay, in Synthetic Peptides, Approaches to Biological Problems, Hrsg. J. P. Tam und E. T. Kaiser, Alan R. Liss Inc., New York, 1989) beschrieben.
[0013] Je nach dem vorgesehenen Verwendungszweck können die Peptide entweder markiert oder unmarkiert sein. Beliebige Typen von Markierungen können verwendet werden, beispielsweise enzymatische, chemische, fluoreszierende, lumineszierende oder radioaktive Markierungen. Ferner können die Peptide für eine Bindung an Oberflächen oder feste Phasen, z. B. Mikrotiterplatten, Nylonmembranen, Glas- oder Kunststoffkügelchen, oder an chromatographische Träger, wie Cellulose, Siliciumdioxid oder Agarose, modifiziert sein. Die Verfahren, mit denen Peptide an einem festen Träger oder an einer Oberfläche angebracht oder gebunden werden können, sind dem Fachmann geläufig.
[0014] Antikörper, die die Peptide erkennen, lassen sich auf verschiedene Weise nachweisen. Ein bevorzugtes Nachweisverfahren ist der enzymgekoppelte Immunoabsorptionstest (ELISA), bei dem ein Peptid oder ein Gemisch von Peptiden an einen festen Träger gebunden wird. In den meisten Fällen handelt es sich um eine Mikrotiterplatte, wobei es sich aber prinzipiell um eine beliebige Art einer unlöslichen festen Phase handeln kann. Eine oder mehrere geeignete Verdünnungen von Serum oder einer anderen zu testenden Körperflüssigkeit wird in Kontakt mit der festen Phase gebracht, an die das Peptid gebunden ist. Die Inkubation wird für eine Zeitspanne durchgeführt, die erforderlich ist, um die Bindungsreaktion ablaufen zu lassen. Anschließend werden nicht-gebundene Komponenten durch Waschen der festen Phase entfernt. Der Nachweis von Immunkomplexen wird unter Verwendung von Antikörpern erreicht, die spezifisch an humane Immunoglobuline binden und die mit einem Enzym, vorzugsweise (ohne Beschränkung hierauf) an Meerrettich-peroxidase, alkalische Phosphatase oder beta-Galactosidase, markiert sind, wobei das Enzym zur Umwandlung eines farblosen oder nahezu farblosen Substrats oder Cosubstrats zu einem stark gefärbten Produkt oder zu einem Produkt, das mit einem Chromogen einen gefärbten Komplex bilden kann, befähigt ist. Alternativ kann sich das Nachweissystem eines Enzyms bedienen, das in Gegenwart des oder der geeigneten Substrate Licht emittiert. Die Menge des gebildeten Produkts wird entweder visuell, spektrophotometrisch, elektrochemisch oder luminometrisch erfaßt und mit einer ähnlich behandelten Kontrolle verglichen. Das Nachweissystem kann sich auch radioaktiv markierter Antikörper bedienen, wobei die Menge des Immunkomplexes quantitativ durch Szintillationszählung oder gamma-Zählung bestimmt wird.
[0015] Zu weiteren Nachweissystemen, die herangezogen werden können, gehören solche, die auf der Verwendung von Protein A aus Staphylococcus aureus Cowan Stamm I, Protein G aus der Gruppe C Staphylococcus sp. (Stamm 26RP667) beruhen, oder Systeme, die sich der Biotin-Avidin- oder -Streptavidin-Bindungsreaktion von hoher Affinität bedienen.
[0016] Antikörper gegen trägergebundene Peptide können ebenfalls in Verbindung mit markierten Peptiden zum Nachweis von Antikörpern, die in Serum oder anderen Körperflüssigkeiten vorhanden sind, in einem kompetitiven Test verwendet werden. Dabei werden Antikörper gegen trägergebundene Peptide an einen festen Träger, bei dem es sich beispielsweise um ein Kunststoffkügelchen oder um ein Kunststoffröhrchen handeln kann, gebunden. Markiertes Peptid wird sodann mit geeigneten Verdünnungen der zu testenden Flüssigkeit vermischt. Dieses Gemisch wird anschließend in Kontakt mit dem am festen Träger gebundenen Antikörper gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird der feste Träger gewaschen und die Menge des markierten Peptids wird quantitativ ermittelt. Eine Verringerung der Menge der am festen Träger gebundenen Markierung ist ein Anzeichen für die Anwesenheit von Antikörpern in der ursprünglichen Probe. Gleichermaßen kann das Peptid an den festen Träger gebunden werden. Anschließend kann markierter Antikörper in Konkurrenz mit dem Antikörper in der Probe treten, und zwar unter Bedingungen, bei denen die Menge des Peptids limitierend ist. Wie im vorhergehenden Beispiel stellt eine Verminderung des gemessenen Signals ein Anzeichen für die Anwesenheit von Antikörpern in der getesteten Probe dar.
[0017] Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zum Antikörpernachweis ist der homogene Immunoassay. Es gibt zahlreiche Variationen bei der Konzeption derartiger Tests. Beispielsweise finden sich zahlreiche mögliche Konfigurationen für homogene Enzymimmunoassays und Verfahren, nach denen diese durchgeführt werden können, bei P. Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Elsevier Press, Amersham, Oxford, New York, 1985. Zu Nachweissystemen, die herangezogen werden können, gehören solche auf der Basis des "Enzym-Channeling", Biolumineszenz, allosterischen Aktivierung und allosterischen Hemmung. Es können auch Verfahren unter Verwendung von in Liposomen eingeschlossenen Enzymen oder Coenzymen herangezogen werden (vergl. P. Pinnaduwage und L. Huang, Clin. Chem., Bd. 34/2 (1988), S. 268-272; und E. F. Ullman et al., Clin. Chem., Bd. 33/9 (1987), S. 1579- 1584).
[0018] Die Herstellung der Peptide kann in Lösung oder an einem festen Träger erfolgen. Syntheseverfahren bedienen sich im allgemeinen der Verwendung von mit tert.-Butyloxycarbonyl oder 9-Fluorenylmethoxycarbonyl geschützten, aktivierten Aminosäuren. Das Verfahren zur Durchführung der Synthese, die Typen der Seitenketten-Schutzgruppen und die Spaltungsverfahren sind ausführlich beispielsweise bei Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Auflg., Pierce Chemical Company, 1984; und Atherton und Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press, 1989, beschrieben.

Experimenteller Teil

[0019]

1. Peptidsynthese

Sämtliche beschriebenen Peptide wurden an Pepsyn K-Polyamid-Kieselgur-Harz (Milligen, Novato, Kalifornien), das mit Ethylendiamin funktionalisiert worden war, und an das der säurelabile Linker 4-(alpha-Fmoc- Amino-2',4'-dimethoxybenzyl)-phenoxyessigsäure gekuppelt worden war, synthetisiert (Rink, Tetrahedron Lett., Bd. 28 (1987), S. 3787). Ein Seitenkettenschutz auf der Basis von tert.-Butylgruppen und ein Fmoc-alpha-Aminogruppenschutz wurden herangezogen. Die Guanidinogruppe von Arginin wurde durch den 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonylrest geschützt. Die Imidazolgruppe von Histidin wurde entweder durch t-Boc oder Trityl und die Sulfhydrylgruppe von Cystein durch eine Tritylgruppe geschützt. Kupplungen wurden unter Verwendung von O-Pentafluorphenylestern durchgeführt, ausgenommen im Fall von Arginin, bei dem man sich einer durch Diisopropylcarbodiimid vermittelten Hydroxybenzotriazolesterbildung bediente. Mit Ausnahme des Peptids I waren sämtliche Peptide unter Verwendung von Essigsäureanhydrid N-acetyliert. Sämtliche Synthesen wurden an einem Milligen 9050-PepSynthesizer (Novato, Kalifornien) unter Anwendung kontinuierlicher Fließverfahren durchgeführt.
Nach Spaltung mit Trifluoressigsäure in Gegenwart von Abfangmitteln und nach Extraktion mit Diethylether wurden sämtliche Peptide durch C&sub1;&sub8;- Umkehrphasenchromatographie analysiert.
Das Peptid I entspricht den Aminosäuren 1 bis 20 und weist folgende Aminosäuresequenz auf:
Das Peptid II entspricht den Aminosäuren 7 bis 26 und weist folgende Aminosäuresequenz auf:
Das Peptid IIA entspricht:
Das Peptid III entspricht den Aminosäuren 13 bis 32 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid IV entspricht den Aminosäuren 37 bis 56 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid V entspricht den Aminosäuren 49 bis 68 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid VI entspricht den Aminosäuren 61 bis 80 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid VII entspricht den Aminosäuren 73 bis 92 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid XVI entspricht den Aminosäuren 2275 bis 2294 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid XVII entspricht den Aminosäuren 2287 bis 2306 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid XVIII entspricht den Aminosäuren 2299 bis 2318 und weist die folgende Sequenz auf:
Das Peptid XIX entspricht den Aminosäuren 2311 bis 2330 und weist die folgende Sequenz auf:

II. Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus

[0020]

A. Verwendung von an eine Nylonmembran gebundenen Peptiden

Peptide wurden in einem geeigneten Puffer gelöst, um eine konzentrierte Vorratslösung herzustellen, die dann zur Herstellung von Arbeitslösungen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,6, weiter verdünnt wurde. Die Peptide wurden in Form von Linien auf eine Nylonmembran (Fall, Portsmouth, Großbritannien) aufgetragen, wonach die Membran mit Casein behandelt wurde, um unbesetzte Bindungsstellen zu blockieren. Anschließend wurde die Membran in senkrechter Richtung zu den Peptidlinien in Streifen geschnitten. Die einzel nen Streifen wurden sodann mit einer 1 : 100-verdünnten Serumprobe, die von einem mit HCV infizierten Individuum erhalten worden war, inkubiert. Die Antikörperbindung wurde durch Inkubation der Streifen mit Ziegen-anti- Humanimmunoglobulin-Antikörpern, die mit dem Enzym alkalische Phosphatase konjugiert waren, nachgewiesen. Nach Entfernung von nicht-gebundenem Konjugat durch Waschen wurde eine Substratlösung mit einem Gehalt an 5-Brom- 4-chlor-3-indolylphosphat und Nitrotetrazoliumblau zugegeben. Positive Reaktionen sind als gefärbte Linien erkennbar, die den Positionen der Peptide entsprechen, die spezifisch erkannt worden sind. Die Reaktionsmuster von 36 unterschiedlichen Seren sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Ergebnisse von Tabelle 1 sind ferner in Tabelle 2 zusammengefaßt.

B. Verwendung von Peptiden in einem enzymgekoppelten Immunoabsorptionstest (ELISA)

Peptid-Vorratslösungen wurden in Natriumcarbonatpuffer, pH-Wert 9,6, verdünnt und zur Beschichtung von Mikrotiterplatten mit einer Peptidkonzentration von 2 ug/ml verwendet. Ein Gemisch aus den Peptiden II, III, V, IX und XVIII wurde ebenfalls zur Beschichtung von Platten verwendet. Im Anschluß an die Beschichtung wurden die Platten mit Casein blockiert. Fünfzehn HCV-Antikörper-positive Seren und Kontrollseren aus sieben nicht-infizierten Blutspendern wurden 1 : 20 verdünnt und in Vertiefungen von peptidbeschichteten Platten inkubiert. Die Antikörperbindung wurde durch Inkubation der Platten mit Ziegen-anti-Humanimmunoglobulin-Antikörpern, die mit dem Enzym Meerrettich-peroxidase konjugiert waren, nachgewiesen. Im Anschluß an die Entfernung von ungebundenem Konjugat durch Waschen wurde eine Lösung mit einem Gehalt an H&sub2;O&sub2; und 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin zugegeben. Die Umsetzungen wurden nach einem geeigneten Zeitraum durch Zugabe von Schwefelsäure gestoppt. Positive Reaktionen ergaben eine gelbe Färbung, die quantitativ unter Verwendung eines herkömmlichen Mikrotiterplatten-Ablesegeräts gemessen wurde. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Tabelle 3 aufgeführt. Zur Korrektur auf eine etwaige unspezifische Bindung, die den physikalischen oder chemischen Eigenschaften der Peptide selbst zugeschrieben werden konnte, wurde für jedes Peptid individuell eine Ausschlußgrenze festgelegt. Dieser Ausschluß-Absorptionswert wurde als Mittelwert der optischen Dichte der negativen Proben plus 0,200 berechnet. Proben, die Absorptionswerte über den Ausschlußwerten ergaben, werden als positiv angesehen. Die Ergebnisse für fünfzehn positive Serumproben sind ferner in Tabelle 4 aufgeführt. Während ersichtlich ist, daß einige der Peptide von einem großen prozen tualen Anteil der Seren von HCV infizierten Individuen erkannt werden, ist es auch ersichtlich, daß kein einzelnes Peptid von sämtlichen Seren erkannt wird. Dagegen wurde das Peptidgemisch von allen fünfzehn Seren erkannt. Bei sechs der fünfzehn Seren waren die erzielten optischen Dichten gleich groß oder größer als die Werte, die für beliebige Peptide einzeln erhalten wurden. Diese Ergebnisse dienen zur Erläuterung der Vorteile der Verwendung von Gemischen von Peptiden für den Nachweis von anti-HCV-Antikörpern.

C. Bindung von Antikörpern in Seren von HCV infizierten Patienten an verschiedene einzelne Peptide und Peptidgemische beim ELISA-Test

Fünf Peptide wurden einzeln und in sieben verschiedenen Kombinationen zur Beschichtung von Mikrotiterplatten verwendet. Die Platten wurden anschließend mit Verdünnungen von fünfzehn HCV-Antikörperpositiven Seren inkubiert, um die relativen Vorteile der Verwendung von Gemischen im Vergleich zu einzelnen Peptiden für den Antikörpernachweis zu bewerten. Die verwendeten Gemische und die erzielten Ergebnisse sind in Fig. 2 aufgeführt. Im allgemeinen funktionierten die Gemische besser als die einzelnen Peptide. Dies war besonders deutlich für das Gemisch 12 (Peptide I, III, V, IX und XVIII), die von sämtlichen zwölf getesteten Seren erkannt wurden. Diese Ergebnisse unterstreichen die Vorteile der Verwendung von Peptidgemischen bei diagnostischen Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV.

D. Verwendung eines Peptidgemisches beim ELISA-Test zum Nachweis von anti-HCV-Antikörpern

Ein Gemisch der Peptide II, III, V, IX und XVIII wurde hergestellt und zur Beschichtung von Mikrotiterplatten gemäß dem gleichen Verfahren wie es zum Testen der einzelnen Peptide herangezogen wurde, verwendet. Insgesamt neunundvierzig Seren von Patienten mit klinisch diagnostizierter, aber undifferenzierter chronischer Nicht A- und Nicht B-Hepatitis sowie neunundvierzig Seren von gesunden Blutspendern wurden getestet. Der Nachweis der Antikörperbindung wurde mit Ziegen-anti-Humanimmunoglobulin- Antikörpern, die mit Meerrettich-peroxidase konjugiert waren, durchgeführt. Die erhaltenen Werte der optischen Dichte sind in Tabelle 5 aufgeführt. Die Ergebnisse zeigen, daß das Gemisch von Peptiden nicht von Antikörpern in Seren von gesunden Spendern erkannt wird (0/49 reaktive), jedoch von einem großen Anteil (41/49 oder 84%) der Seren von Patienten mit chronischer NANBH erkannt wird. Diese Ergebnisse belegen, daß die beschriebenen Peptide in wirksamer Weise als Gemische für die Diagnose einer HCV-Infektion verwendet werden können.

E. Nachweis von anti-HCV-Antikörpern in Seren von Patienten mit akuter NANB-Infektion unter Verwendung von einzelnen Peptiden, die an Nylonmembranen gebunden sind, und eines Gemisches von Peptiden in einem ELISA- Test und Vergleich mit einem herkömmlichen Kit

Peptide wurden auf Nylonmembranen aufgesetzt oder vermischt und zur Beschichtung von Mikrotiterplatten gemäß den vorstehenden Angaben verwendet. Das Peptidgemisch bestand aus den Peptiden II, III, V, IX und XVIII. Seren von neunundzwanzig Patienten mit akuter Nicht A-Nicht B-Hepatitis wurden auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen Hepatitis C-Virus getestet. Die gleichen Seren wurden auch unter Verwendung eines handelsüblichen Kits (Ortho, Emeryville, CA, USA) bewertet. Die Ergebnisse dieser Vergleichsuntersuchung sind in Tabelle 6 aufgeführt. Um den ELISA-Test auf Peptidbasis mit dem handelsüblichen Kit vergleichen zu können, werden die Ergebnisse beider Tests auch als Signal-Rausch-Verhältnisse (S/N) angegeben, die berechnet wurden, indem man die für die einzelnen Proben ermittelten Meßwerte der optischen Dichte durch den Ausschlußwert dividierte. Ein Signal-Rausch-Verhältnis von 1,0 oder mehr wird als eine positive Reaktion angesehen. Für das handelsübliche Kit wurde der Ausschlußwert gemäß den Angaben des Herstellers berechnet. Der Ausschlußwert für den ELISA-Test auf Peptidbasis wurde als Mittelwert der optischen Dichte von fünf negativen Proben plus 0,200 berechnet.
Die zur Bewertung der Antikörpererkennung von an Nylon gebundenen Peptiden verwendete Skala war die gleiche wie in Tabelle 1. Von den neunundzwanzig getesteten Proben waren fünfundzwanzig (86%) beim ELISA- Test auf Peptidbasis positiv und erkannten ein oder mehr an Nylon gebundene Peptide. Dagegen führten nur vierzehn der neunundzwanzig Seren beim handelsüblichen ELISA-Test zu einem positiven Ergebnis. Diese Ergebnisse dienen zur Erläuterung der Vorteile der Verwendung von Peptidgemischen zum Nachweis von anti-HCV-Antikörpern sowie der Notwendigkeit, in die Gemische Peptide aufzunehmen, die Aminosäuresequenzen aus verschiedenen Regionen des HCV-Polyproteins enthalten. Tabelle 1 Erkennung von an Nylonmembranen gebundenen Peptiden durch Seren von HCV infizierten Personen
ohne Angabe: keine Reaktion; 0,5: schwach positiv; 1: klar positiv; 2: starke Reaktion; 3: intensive Reaktion; ND: nicht bestimmt Tabelle 1 (Fortsetzung) Tabelle 2 Zusammenfassung der Antikörperbindung an Nylon gebundenen HCV-Peptiden durch Seren von infizierten Patienten Tabelle 3 Vergleich von individuellen Peptiden mit einem ELISA-Test zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV Tabelle 3 (Fortsetzung) Tabelle 4 Zusammenfassung der Antikörperbindung an individuelle Peptide in einem ELISA-Test Tabelle 5 Verwendung eines Peptidgemisches zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in Seren von chronischen NANBH-Patienten und Vergleich mit Seren gesunder Blutspender Tabelle 5 (Fortsetzung) Tabelle 6 Vergleich eines anti-HCV-Antikörpernachweises durch Nylon-gebundene Peptide; ELISA-Test auf Peptidbasis und handelsübliches Kit
0: keine Reaktion; 0,5: schwach positiv; 1: klar positiv; 2: starke Reaktion; 3: intensive Reaktion Tabelle 6 (Fortsetzung)
Ausschlußgrenze: 0,250 Ausschlußgrenze: 0,623
* OD über 3,000 und außerhalb des Bereiches.
Die Werte stellen daher Minimalwerte dar.

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE ANGABEN:

(i) ANMELDER:
(A) NAME: Innogenetics sa. (B) STRASSE: Industriepark Zwijnaarde 7, box 4 (C) ORT: Ghent (E) LAND: Belgien (F) POSTLEITZAHL (ZIP): B-9052 (G) TELEFON: 00 32 9 241 07 11 (H) TELEFAX: 00 32 9 241 07 99
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Synthetic antigens for the detection of antibodies to Hepatitis C virus
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 20
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER: Floppy Disk (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 11 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 11 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL: (A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11.

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) tage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 15:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 19:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 19:

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 20:

(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
(A) LANGE: 20 Aminosäuren (B) ART: Aminosäure (C) STRANGFORM: Einzelstrang (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Peptid
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 1 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Y ist H, eine oder mehrere N-terminale Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur aminoterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden."
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: modifizierte Position (B) Lage: 20 (D) SONSTIGE ANGABEN: /Markierung = gebundener Rest /Anmerkung = "Z-X: Z ist eine Bindung, eine oder mehrere Aminosäuren oder chemische Gruppen, die zur carboxyterminalen Verknüpfung der Aminosäuresequenz mit einer festen Phase oder Träger verwendet werden.
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 20:

Claims

1. Eine Peptidzusammensetzung, umfassend mindestens ein Peptid, welches ausgewählt ist aus:

wobei Y H oder ein Verbindungsarm ist, durch den das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm mindestens eine Aminosäure und bus zu 60 Aminosäuren, meinstens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z. B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z. B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist, Y z. B. durch N-terminale Acetylierung modifiziert sein kann, Z eine Bindung oder ein Verbindungsarm ist, durch die (den) das Peptid an einen Träger oder eine feste Phase gebunden werden kann, welcher Verbindungsarm wenigstens eine Aminosäure und bis zu 60 Aminosäuren, meinstens 1 bis 10 Aminosäuren, wie z. B. Cystein, Lysin, Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparginsäure, oder chemische Gruppen, wie z. B. Biotin oder Thioglycolsäure, aufweist;

und X NH&sub2;, OH oder eine Bindungsgruppe ist, die eine dieser beiden Gruppen beinhaltet;

und wobei, wenn Y oder Z-X (eine) Aminosäure(n) ist (sind), sich diese von jeglichen natürlich vorkommenden HCV Flankenbereichen unterscheiden.

2. Eine Peptidzusammensetzung nach Anspruch 1, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide N-terminal, C- terminal oder intern an ein Trägermolekül gebunden sind um Antikörper zu bilden oder die Adsorption der Peptide an eine feste Phase zu vereinfachen.

3. Eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide eine erkennbare Markierung enthalten.

4. Verwendung einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Inkorporierung in ein Immunoassay für den Nachweis der Gegenwart von Antikörpern gegen in einer Körperflüssigkeit vorliegende Hepatitis-C-Viren.

5. Ein Verfahren für den in-vitro-Nachweis von Antikörpern gegen Hepatitis-C-Viren, die in einer Körperflüssigkeit, z. B. in einem Serum oder Plasma, vorliegen, umfassend wenigstens die folgenden Schritte:

(a) das in-Berührung-bringen einer zu diagnostizierenden Körperflüssigkeit eines Menschens mit einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, und,

(b) das Nachweisen des immunologischen Komplexes, der sich zwischen den besagten Antikörpern und dem (den) verwendeten Peptid(en) gebildet hat.

6. Eine Ausrüstung zum Nachweis von Antikörpern gegen Anti-Hepatitis-C-Viren in einer Körperflüssigkeit, umfassend mindestens die folgenden Komponenten:

- eine Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3.

- Mittel zum Nachweisen eines immunologischen Komplexes, der sich zwischen den besagten Peptiden und den Antikörpern gebildet hat.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 5, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide als Linien auf eine Nylonmembran aufgebracht werden, wobei die Nylonmembran vorzugsweise senkrecht zur Richtung der Peptidlinien in Streifen geschnitten wird, sodaß jeder Streifen mit einer angemessen verdünnten Serumprobe von einem Menschen inkubiert werden kann.

8. Eine Ausrüstung nach Anspruch 6, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide als Linien auf eine Nylonmembran aufgebracht sind und die Nylonmembran vorzugsweise senkrecht zur Richtung der Peptidlinien in Streifen geschnitten ist, sodass jeder Streifen mit einer angemessen verdünnten Serumprobe von einem Menschen inkubiert werden kann.

9. Eine Ausrüstung nach Anspruch 6 oder 8, weiter dadurch gekennzeichnet, daß die besagten Peptide einzeln oder in Kombination verwendet werden, um die Vertiefungen von Mikrotiterplatten auszukleiden.

10. Die Verwendung einer Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Inkorporierung in eine Impfzusammensetzung gegen HCV.

11. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zum Bilden von Antikörpern gegen HCV.

12. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagten Peptide solche sind, die durch Cyklisieren irgendeines der Peptide der Anspruch 1 durch Kuppeln von zwei Peptiden der Anspruch 1 erhalten werden.

13. Peptidzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagten Peptide solche sind, die direkt durch Synthetisieren der Peptide von Anspruch 1 auf einem Oligo-Lysinkem erhalten werden, wobei sowohl die alpha- als auch die epsilon-Aminogruppen von Lysinen als Wachstumspunkte für die Peptide verwendet werden.