WO2021045182A1 - トリプターゼ活性測定用基質 - Google Patents

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浩珍 松田
憲和 西野
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国立大学法人東京農工大学
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    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)

Definitions

  • the present invention is characterized in that the fluorescence characteristic or color development characteristic of the dye label is changed by cleaving the C-terminal peptide bond of the tripeptide, which contains a predetermined tripeptide in which the dye label is peptide-bonded to the C-terminal.
  • the present invention relates to a substrate for measuring tryptase activity, a method for measuring triptase activity in a blood sample using the substrate, and a kit for measuring triptase activity in a blood sample containing the substrate.
  • mast cells Diseases in which mast cells are involved in the disease, such as allergic diseases, tumors, and retinopathy of prematurity, are diagnosed as mast cell activation syndrome.
  • tryptase which is a proteolytic enzyme
  • ELISA immune reaction
  • tryptase functions as an enzyme and affects the living body, it is important to measure the enzyme activity in determining the disease state. Therefore, in ELISA, which can determine only the abundance of the tryptase-related protein as an antigen. Insufficient.
  • Non-Patent Document 1 The present inventors have reported that tryptase released from mast cells is essential for the onset of retinopathy of prematurity.
  • Non-Patent Document 1 the present inventors have determined the involvement of tryptase using ELISA, but when considering how to evaluate the pathology of newborns (whether or not they lose their eyesight and the choice of treatment method) as described above, It is essential to measure enzyme activity.
  • Tryptase is an enzyme released into the blood by degranulation of mast cells, and the blood concentration is often as low as about 10 ⁇ g / L (Non-Patent Documents 2 and 3; Non-Patent Document 3 up to 1 year old).
  • the abundance in blood of healthy infants has been reported to be 4.67 ⁇ g / L). Since this concentration cannot be detected with a conventional tryptase substrate, it is necessary to concentrate the sample solution or lengthen the reaction time, but as a result, accurate and rapid measurement is difficult at present.
  • thrombin which is a blood coagulation protease, is present in serum, and is a known protease substrate.
  • thrombin shows an activity much larger than that of tryptase and interferes with the measurement.
  • Non-Patent Document 17 Ac-Lys-Pro-Arg-FMCA (7-amino-4-trifluoromethylcommarin) is a good substrate for tryptase.
  • Lys in this sequence provides valuable implications for the site of action of tryptase on the native substrate protein.
  • a comprehensive library was constructed to investigate the substrate specificity of proteases by constructing a tripeptide library on a substrate, and tripeptides most sensitive to beta-tryptases I and II were constructed. The sequence was revealed to be -Lys / Arg-Asn-Lys / Arg- (Non-Patent Document 18).
  • An object of the present invention is to provide a method for accurately and quickly measuring the tryptase activity in a blood sample by a simple operation in order to accurately evaluate the pathology of a disease in which mast cells are involved in the pathology.
  • the present inventors have made intensive studies to solve the above problems, i Boc-Ala-Ala- Arg-MCA, i Boc-Lys-Ala-Arg-MCA, i Boc-Abu-Ala-Arg -MCA, i Boc-Lys-Pro -Arg-MCA is sensitive is very high for tryptase found that can detect also cleaved by low concentrations of tryptase. Furthermore, the present inventors have developed a polymer substrate obtained by binding the above tripeptide-MCA to poly (L-lysine) via succinic acid even in the coexistence of thrombin after the reaction with ⁇ 2 macroglobulin. , It was found that the tryptase activity in serum can be specifically measured without being affected by thrombin in the complex. The present invention has been completed based on these findings.
  • a substrate for measuring triptase activity which is selected from the following formulas (1) to (3) and contains a tripeptide (tripeptide-X) in which a dye label is peptide-bonded to the C-terminal.
  • tripeptide-X a tripeptide in which a dye label is peptide-bonded to the C-terminal.
  • Lys-Ala-Arg-X Ala-Ala-Arg-X
  • Abu-Ala-Arg-X In the formula, X is a dye label whose fluorescence property or color development property is changed by cleaving the peptide bond with Arg, and Abu is 2-aminobutyric acid).
  • the substrate for measuring tryptase activity according to the above [1], which is for direct measurement of tryptase activity in a blood sample.
  • Polyamino acids are poly (L-lysine), dendritic poly (L-lysine), poly (D-lysine), dendritic poly (D-lysine), poly (L-ornithine) and poly (D-lysine).
  • the substrate for measuring tryptase activity according to the above [4], which is selected from ornithine).
  • the dye label is a fluorescent dye label selected from MCA group, ANS group, CMCA group, FMCA group, AMP group, Rhodamine 110 group, Rhodamine 110 monoamide group, Rhodamine 6G group and Rhodamine B group.
  • the substrate for measuring tryptase activity according to any one of the above [1] to [5].
  • a method for measuring triptase activity in a blood sample which comprises the following steps (A) and (B).
  • A The step of contacting the substrate for measuring triptase activity according to any one of [1] to [6] above with a blood sample;
  • B After the step (A), the degree of tryptase activity in the blood sample is calculated by measuring the amount of change in the fluorescence characteristic or the color development characteristic of the dye label; [8] The method according to the above [7], wherein the blood sample is serum.
  • a kit for measuring tryptase activity in a blood sample which comprises the substrate for measuring tryptase activity according to any one of the above [1] to [6]. [10] The kit according to the above [9], wherein the blood sample is serum.
  • the tryptase activity in a blood sample can be directly measured without pretreatment such as purification and concentration of the blood sample.
  • the present invention is a substrate for measuring tryptase activity (hereinafter, “the present invention") containing a tripeptide (tripeptide-X) in which a dye label is peptide-bonded to the C-terminal, which is selected from the following formulas (1) to (3).
  • a method for measuring tripeptide activity in a blood sample using the substrate of the present invention hereinafter, sometimes referred to as “the method for measuring the present invention”
  • the present invention relates to a kit for measuring tripeptide activity in a sample (hereinafter, may be referred to as “kit of the present invention”).
  • X is a dye label whose fluorescence property or color development property is changed by cleaving the peptide bond with Arg
  • Abu is 2-aminobutyric acid
  • the substrate of the present invention can be suitably used for the purpose of directly measuring the tryptase activity in a blood sample.
  • the term "cleave” for peptides shall be used synonymously with "hydrolysis".
  • the activity can be detected even at an extremely low concentration of about 10 ⁇ g / L. Therefore, even if the tryptase is in a blood sample, the enzymatic reaction takes place for 2 minutes after the start of measurement.
  • the activity can be evaluated by a method such as waiting for a steady state and then recording the increase in fluorescence intensity obtained in 1 minute from 2 minutes to 3 minutes after the start of measurement as enzyme activity.
  • the dye label is not limited as long as the fluorescence property or color development property of the dye label changes due to cleavage of the peptide bond, but from the viewpoint of ease of detection and sensitivity, a fluorescent label is preferable, for example, MCA.
  • MCA fluorescent label
  • the presence / absence and amount of change in the fluorescence characteristics can be detected and quantified using a known fluorescence intensity measuring device or the like, and the presence / absence or amount of change in the color development characteristics can be detected using a spectrophotometer or the like. And can be quantified. At that time, it is preferable to analyze the absorption wavelength and the fluorescence wavelength of the dye label and select the excitation wavelength and the fluorescence wavelength that can specifically detect and quantify the dye label.
  • an MCA group is used as a dye label in the substrate of the present invention, 1) When AMC (7-amino-4-methylcoumarin) is specifically measured, the wavelength at which the AMC is excited without exciting the MCA group.
  • irradiate for example, 360 nm to 400 nm
  • the AMC is not excited and the MCA group is not excited.
  • irradiate with a wavelength that excites for example, 260 nm to 350 nm
  • detect and measure the wavelength emitted by the MCA group for example, 350 nm to 385 nm.
  • the blood sample in the present specification may be a blood sample collected from a subject, and examples thereof include whole blood, plasma, and serum, but plasma or serum is preferable, and convenience of measurement and sample preparation can be used. Serum is more preferred because of its ease.
  • a blood coagulation inhibitor may be optionally added to the blood sample. Since the substrate for measuring triptase activity of the present invention contains a recognition sequence by thrombin present in blood, the above blood sample inhibits thrombin such as antithrombin III, hirudin, heparincofactor II, and aprotinin in order to prevent interference by thrombin.
  • the agent may be included, but in a preferred embodiment, the blood sample does not contain a thrombin inhibitor. Examples of the subject include mammals, more preferably primates, and even more preferably humans.
  • the substrate of the present invention is a tripeptide indigestible water-soluble polymer having a weight average molecular weight of 5,000 or more, more preferably 6,000 or more, still more preferably 7,000 or more, and even more preferably 8,000 or more. May be combined.
  • the tryptase activity can be exhibited without pretreatment such as addition of a thrombin inhibitor or removal of thrombin to the blood sample. It can be measured accurately.
  • the substrate for measuring tryptase activity having a weight average molecular weight of 5,000 or more does not reach the active center of thrombin captured by the ⁇ 2 macroglobulin tetramer in the blood sample.
  • the sensitivity to tryptase is equal to or higher than that of the tripeptides selected from the formulas (1) to (3).
  • known tripeptide using (Lys-Pro-Arg, in the tripeptide selected from the formula (1) to (3), tripeptide P 2 position is Asn, Lys / Arg-Asn- Lys / Arg , etc.) can do.
  • the tryptase indigestible water-soluble polymer may be any as long as it does not interfere with the cleavage of the peptide bond between the Arg residue and the dye label in the substrate of the present invention by tryptase, and the upper limit of the weight average molecular weight is, for example, 5, Examples include millions or less, 1,000,000 or less, 500,000 or less, 100,000 or less, 50,000 or less, and the like.
  • tryptase indigestibility means that in the substrate of the present invention, the bond in the tryptase indigestible water-soluble polymer is less likely to be cleaved by tryptase as compared with the peptide bond between the Arg residue and the dye label.
  • the sensitivity of the tryptase refractory water-soluble polymer to tryptase is 1/10 or less, preferably 1/50 or less, more preferably 1/100 or less, the sensitivity of the Arg residue-dye-labeled peptide bond to tryptase. It means that it is more preferably 1/500 or less, and even more preferably 1/1000 or less.
  • the sensitivity to tryptase is high, the water-soluble polymer is digested during the reaction, and the molecular size is reduced to a molecular size that can reach the active center of thrombin captured by the ⁇ 2 macroglobulin tetramer, which is desirable. Absent.
  • the gist of the properties of tryptase indigestible water-soluble polymers is that the tripeptide-MCA substrate carried is the active center of interfering enzymes such as thrombin trapped in ⁇ 2 macroglobulin tetramers. It has a molecular weight that is too large to be delivered. Since tryptase functions in a tetramer (135 kDa) having a molecular weight of 31 to 33 kDa, it is considered that it is not inhibited by ⁇ 2 macroglobulin.
  • polyamino acids are preferable, and among them, poly (L-lysine), dendritic poly (L-lysine), poly (D-lysine), dendritic poly (D-lysine), and poly.
  • (L-ornithine) and poly (D-ornithine) can be preferably exemplified.
  • the tryptase indigestible water-soluble polymer preferably binds to the N-terminal of the tripeptide, and may bind to the tripeptide via a linker such as PEG (polyethylene glycol) or succinic acid.
  • the substrate of the present invention is the blood sample by measuring the amount of change in the fluorescence characteristic or the color development characteristic of the dye label after the step (A) of bringing the substrate of the present invention into contact with the blood sample and the step (A). It can be suitably used for the method for measuring the tryptase activity in a blood sample (the measuring method of the present invention), which is sequentially provided with the step (B) for calculating the degree of the tryptase activity in the blood sample.
  • the contact time in step (A) and the amount of substrate added to the blood sample can be appropriately set according to the tryptase activity in the blood sample, and as a method for calculating the degree of tryptase activity in the blood sample in step (B).
  • thrombin inhibitor may be added to the blood sample to be measured in order to prevent interference by thrombin, but the substrate of the present invention has a molecular weight of 5,000.
  • a thrombin inhibitor may not be added.
  • the substrate of the present invention may be stored, distributed and used as a kit for measuring tryptase activity in a blood sample (kit of the present invention).
  • the kit of the present invention is used for the measuring method of the present invention.
  • the kit of the present invention may include a container for collecting a blood sample, a pretreatment agent for a blood sample, a reaction buffer, a preservative, an instruction manual, and the like.
  • the pretreatment agent for blood samples include the thrombin inhibitor and blood coagulation inhibitor, and the substrate of the present invention to which a tryptase indigestible water-soluble polymer having a molecular weight of 5,000 or more is bound is used. When used, it does not have to contain a thrombin inhibitor.
  • the substrate By using the substrate, measuring method or kit of the present invention, it is possible to evaluate the pathology of mast cell activation syndrome.
  • the mast cell activation syndrome include allergies, atopic dermatitis, tumors, retinopathy of prematurity, systemic mast cell disease, chronic lymphocytic leukemia (CLL), and the like.
  • CLL chronic lymphocytic leukemia
  • the present invention not only the abundance of tryptase protein-related antigens but also the tryptase activity in blood can be directly measured, so that the disease can be evaluated more accurately than the conventional method using Elisa (evaluation of stage, etc.). )It can be performed.
  • N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 450 mg, 2.2 mmol
  • DCM dichloromethane
  • Fmoc-Arg (Pmc) -OH manufactured by Watanabe Chemical Industry Co., Ltd., 4 mmol
  • AMC manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., 400 mg, 2.2 mmol
  • the activity was measured by the following method. (1) A stock of the substrate solution was prepared as a 2.0 mM DMSO solution. (2) The stock of the substrate solution was diluted 20-fold with 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) to prepare a 100 ⁇ M solution. Add 100 ⁇ L of this to a polypropylene microtube, add 2 ⁇ L of a commercially available tryptase solution (manufactured by Cappel), lightly vortex and mix, and then use an enzyme activity measuring device (Peptide Support Co., Ltd., prototype). Immediately, the change in fluorescence intensity at 470 nm at an excitation wavelength of 365 nm was measured.
  • the -Arg-Asn-Arg- sequence which is a tryptase substrate described in Non-Patent Document 18, also shows that P 2- position Asn is more than twice as sensitive as P 2- position Ala, and further, it is positive in the side chain at P 3-position. Given that the amino acids carry a charge is superior about 2 times more sensitive than the P 3 position Ala, from -Ala-Ala-Arg- sequence, but is computationally has about 5 fold higher sensitivity It was considered.
  • Fmoc-Arg (Pmc) -MCA (homemade, 1.1 mmol) was dissolved in 20% piperidine / DMF (10 mL) and reacted for 90 minutes. DMF was distilled off to obtain a free amine in the form of a white solid. This was dissolved in DMF (5 mL), Boc-Ala-Ala-OH (homemade, 1.2 mmol) was added, and the mixture was condensed by the HBTU / HOBt method. After the reaction for 4 hours, Boc-Ala-Ala-Arg (Pmc) -MCA was isolated and purified by silica gel chromatography [yield 505 mg (62%)].
  • Boc-Ala-Ala-Arg (Pmc) -MCA (440 mg) was dissolved in TFA (5 mL) and reacted for 10 minutes. TFA was rapidly distilled off and crystallized with diethyl ether.
  • Suc-Ala-Ala-Arg (Pmc) -MCA was extracted and isolated, further dissolved in TFA (3 mL), and reacted for 2 hours to remove the Pmc group.
  • Poly (L-lysine) hydrochloride having a molecular weight of 8,000 or more (manufactured by Peptide Institute, Ltd., Lot. 670515, 165 mg, 1 mmol) is dissolved in water (5 mL), and Suc-Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs. (164 mg, 0.2 mmol) was added and the hydrochloride salt was neutralized with NaHCO 3 (21 mg, 0.5 mmol).
  • N-hydroxysuccinimide HOSu, 23 mg, 0.2 mmol
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimide_HCl EDC, MW 191.7, 96 mg, 0.5 mmol
  • Ethanol 1 mL was added as an antifoaming agent after 5 hours because the reaction solution foamed. It was allowed to react for 2 days.
  • a small amount of acetic acid was added to the reaction solution to concentrate, and ethanol was added to the remaining syrup to solidify.
  • a substrate for measuring tryptase activity to which poly (D-lysine), which is a tryptase indigestible water-soluble polymer, was bound was synthesized by the following method.
  • poly (D-lysine) hydrobromide having a molecular weight of 4,000-15,000 (manufactured by Sigma-Aldrich, Lot.SLBZ6409, 42 mg, 0.2 mmol), and Suc-.
  • Tripeptide-MCA was condensed into poly (D-lysine) by the same procedure as in (1) to (6) above, except that Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs (33 mg, 0.04 mmol) was used. 38 mg of the target product was obtained.
  • dendritic poly (lysine) was considered as a suitable polymer for suppressing access of the MCA substrate to blood coagulation proteases such as thrombin trapped in ⁇ 2 macroglobulin tetramer. Therefore, dendritic poly (L-lysine) and dendritic poly (D-lysine) were prepared by the following methods.
  • K14A16 (A represents a deprotected free amino group (TFA salt)
  • K30A32 and K62A64 TFA salts as white powders (Table). 2).
  • k14A16 (k represents the number of D-lysines) and k30A32 according to the same procedure except that di-Boc-D-lysine was used instead of di-Boc-L-lysine.
  • TFA salt of k62A64 were obtained as a white powder (Table 2).
  • the obtained dendritic poly (lysine) was bound to Suc-Ala-Ala-Arg-MCA by the following method.
  • the enzyme activity in the serum detected by the polymer substrate of the present invention was completely inhibited by the tryptase inhibitor nafamostat, whereas it was not inhibited by the thrombin inhibitor hirudin. .. From the results here, the enzyme activity in serum detected by the polymer substrate of the present invention is due to tryptase, and a blood coagulation enzyme such as thrombin exists in a state of being trapped in ⁇ 2 macroglobulin tetramer. It was shown that the tryptase activity can be specifically measured even in the serum sample.
  • the tryptase activity in a blood sample can be directly measured without pretreatment such as purification and concentration of the blood sample. Therefore, mast cell activation syndrome, which was previously determined only by the blood abundance of tryptase protein-related antigens, can now be determined by tryptase activity, which more accurately reflects the disease state, and is an industry in the medical field. The above availability is high.

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Abstract

本発明の課題は、マスト細胞が病勢に関与する疾患の病勢を正確に評価するために、簡便な操作で、正確、迅速に血液試料中のトリプターゼ活性を測定する方法を提供することにある。　本発明によれば、以下の式（１）～（３）から選択される、Ｃ末端に色素標識がペプチド結合したトリペプチドを含むトリプターゼ活性測定用基質により、血液試料に対する精製、濃縮等の前処理なしに、血液試料中のトリプターゼ活性を直接測定することができる。 （１）Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ （２）Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ （３）Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ （式中、Ｘは、Ａｒｇとのペプチド結合が切断されることにより蛍光特性又は発色特性が変化する色素標識であり、Ａｂｕは２－アミノ酪酸である）

Description

トリプターゼ活性測定用基質
　本発明は、Ｃ末端に色素標識がペプチド結合した所定のトリペプチドを含む、前記トリペプチドのＣ末端ペプチド結合が切断されることにより前記色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化することを特徴とするトリプターゼ活性測定用基質や、該基質を用いた血液試料中のトリプターゼ活性の測定方法や、該基質を含む血液試料中のトリプターゼ活性測定用キットに関する。
　アレルギー疾患や腫瘍、未熟児網膜症等、特にマスト細胞が病勢に関与する疾患は、マスト細胞活性化症候群として診断されている。病勢評価には、マスト細胞から放出される多種多様なメディエーターの中で、その特異性からタンパク質分解酵素であるトリプターゼが用いられている。現在、その定量化には、世界的に特異抗体を利用した免疫反応（ＥＬＩＳＡ）が用いられている。しかしながら、トリプターゼは酵素として機能し生体に影響を及ぼすことから、病勢の判断には酵素活性を測定することが重要であるため、抗原たるトリプターゼ関連タンパク質の存在量のみしか判定することができないＥＬＩＳＡでは不十分である。
　本発明者らは、未熟児網膜症の発症にはマスト細胞から放出されるトリプターゼが必須であることを報告している（非特許文献１）。この報告において、本発明者らはＥＬＩＳＡを用いてトリプターゼの関与を判定しているが、上述のとおり新生児の病勢（失明するかどうか、治療法の選択）をいかに評価できるかを考えた場合、酵素活性を測定することが必須である。
　トリプターゼは肥満細胞の脱顆粒によって血液中に放出される酵素であり、血中濃度は往々１０μｇ／Ｌ程度の低濃度となる（非特許文献２、３。非特許文献３では、１歳までの健康な幼児の血清中の存在量は４．６７μｇ／Ｌと報告されている）。この濃度では従来のトリプターゼ基質では検出できないため、検体溶液を濃縮するか、又は反応時間を長くする必要があるが、その結果、正確、迅速な測定は困難であるのが現状である。また、簡便なトリプターゼ活性測定のためには、試料調製が容易な血清を直接測定に供することが望ましいが、血清中には血液凝固系のプロテアーゼであるトロンビンが存在しており、公知のプロテアーゼ基質を用いてトリプターゼの活性測定を行った場合、トロンビンがトリプターゼの活性よりも極めて大きな活性を示して測定を妨害する。
　１９８０年代以降のトリプターゼの酵素化学的研究においては、当時からトリプシンの蛍光性基質として市販されていたＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡやＴｏｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＭＣＡ等が使われてきた。これら以外にも数種類のトリペプチド－ＭＣＡの基質特異性が調べられているが、上記２種類以外は一般には使われていない（非特許文献４～１６）。トリプターゼはトリプシン様酵素であるので、Ｃ末端にＡｒｇを有するＭＣＡ基質であれば、感受性（サセスタビリティ）が高かれ低かれ、酵素活性を検出することができるため、トリペプチドのアミノ酸配列の最適化の試みは行われていないのが現状である。
　なお、近年、Ａｃ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＦＭＣＡ（７－ａｍｉｎｏ－４－ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ）がトリプターゼの良い基質であることが報告されている（非特許文献１７）。この配列中のＬｙｓの存在は、トリプターゼの天然基質タンパク質に対する作用部位について貴重な示唆を与える。また、２０年も前に、基板上にトリペプチドライブラリーを構築する手法によってプロテアーゼの基質特異性を調べる網羅的ライブラリー構築が行われ、ベータトリプターゼＩ及びIIに対して最も感受性が高いトリペプチド配列は、－Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ／Ａｒｇ－であることが明らかにされていた（非特許文献１８）。Ｐ２位Ａｓｎは、Ｐ２位Ａｌａよりも２倍強の感受性を示し、更にＰ３位においては側鎖に正電荷を帯びるアミノ酸がＰ３位Ａｌａよりも２倍程度感度が優れていた。しかし残念ながら２００１年公表のこの優れた研究成果は、ｉＢｏｃ－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－ＭＣＡのような使いやすい形で実用化されることはなかった。
　以上のように、トリプターゼの基質となり得るトリペプチドの報告はこれまでもなされてきたが、発明者の知る限り、該基質をプロテアーゼが夾雑した血液試料の直接測定に用いたとの報告はされておらず、さらに該基質はトロンビン等の他のプロテアーゼによっても切断され得ることから、プロテアーゼが夾雑した血液試料をも直接の測定対象とできるトリプターゼ活性測定用基質の合成においては、技術上の困難を排除できない。
J Clin Invest.,127(11), 3987-4000, 2017. サーモフィッシャー・サイエンティフィック社「Mast cell Tryptase For diagnosis andprediction」（http://www.phadia.com/Global/Market%20Companies/Finland/Mast%20Cell%20Tryptase%20for%20Diagnosis%20and%20Prediction.pdf） Allergy Asthma Proc. 35, 404-408, 2014. J. Biol. Chem., 258, 13552-13557, 1983. J. Biol. Chem., 262, 1363-1373, 1987. Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 617-625,1988. J. Biol. Chem., 263, 18104-18107, 1988. Biol. Chem. Hoppe-Seyler Suppl., 371,65-73, 1990. J. Biol. Chem., 267, 13573-13579, 1992. J. Biochem., 120, 856-864, 1996. Peptides, 19, 437-443, 1998. FEBS Lett., 408, 85-88, 1997. British J. Pharm., 138, 959-967, 2003. Allergology International, 57, 83-91, 2008. Chemical Science, 6, 1792-1800, 2015. IJC Metabolic & Endocrine, 10, 16-23, 2016. シグマ・アルドリッチ社「N-Acetyl-Lys-Pro-Arg-7-Amino-4-Trifluoromethylcoumarin」（製品番号：Ｃ６６０８）製品情報（https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Datasheet/3/c6608dat.pdf） J. Biol. Chem., 276, 34941-34947, 2001
　本発明の課題は、マスト細胞が病勢に関与する疾患の病勢を正確に評価するために、簡便な操作で、正確、迅速に血液試料中のトリプターゼ活性を測定する方法を提供することにある。
　上述のとおり、トリプターゼの酵素化学的研究においては、当時からトリプシンの蛍光性基質として市販されていたＢｏｃ－Ｐｈｅ－Ｓｅｒ－Ａｒｇ－ＭＣＡやＴｏｓ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＭＣＡなどが使われてきた。これらの基質は、精製したトリプターゼの活性測定をするうえでは十分な活性を示すものであったが、本発明者らは、血清中のトリプターゼ活性を測定するという観点からはこれらの基質は感受性が低く、また上述のとおりトロンビンによる妨害を受けるため、血清中トリプターゼの活性測定に使用することができないという問題点があることを認識するに至った。本発明者らは、かかる問題点を解決するべく鋭意検討を重ねた結果、ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ、ｉＢｏｃ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ、ｉＢｏｃ－Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ、ｉＢｏｃ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＭＣＡが、トリプターゼに対する感受性が極めて高く、低濃度のトリプターゼによっても切断を検知しうることを見いだした。さらに、本発明者らは、上記トリペプチド－ＭＣＡを、コハク酸を介してポリ（Ｌ－リジン）に結合させてなる高分子基質が、α２マクログロブリンとの反応後のトロンビンの共存下においても、複合体中のトロンビンによる作用を受けず、血清中のトリプターゼ活性を特異的に測定できることを見いだした。本発明は、これらの知見により完成したものである。
　すなわち本発明は以下に記載の事項により特定されるとおりのものである。
〔１〕以下の式（１）～（３）から選択される、Ｃ末端に色素標識がペプチド結合したトリペプチド（トリペプチド－Ｘ）を含むトリプターゼ活性測定用基質。
（１）Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（２）Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（３）Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（式中、Ｘは、Ａｒｇとのペプチド結合が切断されることにより蛍光特性又は発色特性が変化する色素標識であり、Ａｂｕは２－アミノ酪酸である）
〔２〕血液試料中のトリプターゼ活性の直接測定用であることを特徴とする上記〔１〕に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
〔３〕分子量５，０００以上のトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーにトリペプチド－ＸのＮ末端が結合したことを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
〔４〕トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーが、ポリアミノ酸であることを特徴とする上記〔３〕に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
〔５〕ポリアミノ酸が、ポリ（Ｌ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）及びポリ（Ｄ－オルニチン）から選択されることを特徴とする上記〔４〕に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
〔６〕色素標識が、ＭＣＡ基、ＡＮＳ基、ＣＭＣＡ基、ＦＭＣＡ基、ＡＭＰ基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ローダミン６Ｇ基及びローダミンＢ基から選択される蛍光色素標識であることを特徴とする上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質。
〔７〕以下のステップ（Ａ）及び（Ｂ）を備えたことを特徴とする血液試料中のトリプターゼ活性の測定方法。
（Ａ）上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質と、血液試料とを接触させるステップ；
（Ｂ）前記ステップ（Ａ）後に、色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化量を測定することにより、前記血液試料中のトリプターゼ活性の程度を算出するステップ；
〔８〕血液試料が、血清であることを特徴とする上記〔７〕に記載の方法。
〔９〕上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質を含むことを特徴とする血液試料中のトリプターゼ活性測定用キット。
〔１０〕血液試料が、血清であることを特徴とする上記〔９〕に記載のキット。
　本発明によれば、血液試料に対する精製、濃縮等の前処理なしに、血液試料中のトリプターゼ活性を直接測定することができる。
　本発明は、以下の式（１）～（３）から選択される、Ｃ末端に色素標識がペプチド結合したトリペプチド（トリペプチド－Ｘ）を含むトリプターゼ活性測定用基質（以下、「本発明の基質」ということがある）、並びに、本発明の基質を用いた血液試料中のトリプターゼ活性の測定方法（以下、「本発明の測定方法」ということがある）や、本発明の基質を含む血液試料中のトリプターゼ活性測定用キット（以下、「本発明のキット」ということがある）に関する。
（１）Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（２）Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（３）Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
（式中、Ｘは、Ａｒｇとのペプチド結合が切断されることにより蛍光特性又は発色特性が変化する色素標識であり、Ａｂｕは２－アミノ酪酸である）
　本発明の基質は、血液試料中のトリプターゼ活性を直接測定する用途に好適に使用することができるものである。
　本明細書において、ペプチドに関する「切断」との用語は「加水分解」と同義に用いられるものとする。本発明の基質によれば、トリプターゼが約１０μｇ／Ｌの極低濃度であっても活性を検出することができるため、血液試料中のトリプターゼであっても、測定開始後、２分間酵素反応が定常状態になるのを待ち、その後測定開始後２分間から３分間までの１分間に得られる蛍光強度の増大を酵素活性として記録する等の方法により、活性を評価することができる。
　上記色素標識としては、ペプチド結合の切断によって色素標識の蛍光特性又は発色特性が変化するものであれば制限されないが、検出の簡便さ及び感度の観点から、蛍光標識であることが好ましく、例えばＭＣＡ（４－メチル－クマリル－７－アミド）基、ＡＮＳ（２－アミノナフタレン－６－スルホン酸）基、ＣＭＣＡ（７－アミノ－４－クロロメチルクマリン）基、ＦＭＣＡ（７－アミノ－４－トリフルオロメチルクマリン）基、ＡＭＰ（２－アミノ－７－メチルプリン－６－チオール）基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ローダミン６Ｇ基、ローダミンＢ基等を挙げることができる。
　上記蛍光特性の変化の有無や変化量は、公知の蛍光強度測定機等を用いて検出や定量することができ、上記発色特性の変化の有無や変化量は、分光光度計等を用いて検出や定量することができる。その際、上記色素標識の吸収波長や蛍光波長を解析し、当該色素標識を特異的に検出・定量し得るような励起波長及び蛍光波長を選択することが好ましい。本発明の基質における色素標識としてＭＣＡ基を用いている場合に、１）ＡＭＣ（７－アミノ－４－メチルクマリン）を特異的に測定するときは、ＭＣＡ基を励起せずＡＭＣを励起する波長（例えば３６０ｎｍ～４００ｎｍ）を照射し、ＡＭＣが発する蛍光波長（例えば４００ｎｍ～５００ｎｍ）を検出・測定することが好ましく、２）ＭＣＡ基を特異的に測定するときは、ＡＭＣを励起せずＭＣＡ基を励起する波長（例えば２６０ｎｍ～３５０ｎｍ）を照射し、ＭＣＡ基が発する波長（例えば３５０ｎｍ～３８５ｎｍ）を検出・測定することが好ましい。
　本明細書における血液試料としては、被検者から採取した血液試料であればよく、例えば全血、血漿、血清を挙げることができるが、血漿又は血清が好ましく、測定の簡便性及び試料調製の容易さから、血清がさらに好ましい。また、上記血液試料は、任意で血液凝固阻害剤を添加してもよい。本発明のトリプターゼ活性測定用基質は、血液中に存在するトロンビンによる認識配列を含むため、上記血液試料は、トロンビンによる妨害を防ぐためにアンチトロンビンIII、ヒルジン、ヘパリンコファクターII、アプロチニン等のトロンビン阻害剤を含んでいてもよいが、好ましい態様において、上記血液試料はトロンビン阻害剤を含まない。上記被検者としては、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、さらに好ましくはヒトを挙げることができる。
　本発明の基質は、トリペプチドに重量平均分子量が５，０００以上、より好ましくは６，０００以上、さらに好ましくは７，０００以上、さらにより好ましくは８，０００以上のトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーを結合していてもよい。本態様において、本発明の基質は血液試料中に共存するトロンビンによる切断を受けないため、血液試料に対してトロンビン阻害剤の添加、トロンビンの除去等の前処理を行わなくても、トリプターゼ活性を精度よく測定することができる。この理由は、重量平均分子量５，０００以上のトリプターゼ活性測定用基質は、血液試料中でα２マクログロブリン四量体により捕捉されているトロンビンの活性中心に到達しないからと考えられる。なお、本態様におけるトリペプチドとしては、式（１）～（３）から選択されるトリペプチドに加え、トリプターゼに対する感受性が式（１）～（３）から選択されるトリペプチドと同等又はより高い既知のトリペプチド（Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ、式（１）～（３）から選択されるトリペプチドにおいて、Ｐ２位がＡｓｎであるトリペプチド、Ｌｙｓ／Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ｌｙｓ／Ａｒｇ等）を使用することができる。
　上記トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーは、本発明の基質におけるＡｒｇ残基－色素標識間のペプチド結合の、トリプターゼによる切断を妨げないものであればよく、重量平均分子量の上限としては、例えば５，０００，０００以下、１，０００，０００以下、５００，０００以下、１００，０００以下、５０，０００以下等を挙げることができる。また、トリプターゼ難消化性とは、本発明の基質において、トリプターゼ難消化性水溶性ポリマー中の結合が、Ａｒｇ残基－色素標識間のペプチド結合と比較してトリプターゼにより切断されにくいことを意味し、例えば、トリプターゼに対するトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーの感受性が、トリプターゼに対するＡｒｇ残基－色素標識間ペプチド結合の感受性の１／１０以下、好ましくは１／５０以下、より好ましくは１／１００以下、さらに好ましくは１／５００以下、さらにより好ましくは１／１０００以下であることを意味する。ここで、トリプターゼに対する感受性が高いと、反応中に水溶性ポリマーが消化されてしまい、α２マクログロブリン四量体により捕捉されているトロンビンの活性中心に到達できる分子サイズにまで小さくなってしまうため望ましくない。理論に拘束されるものではないが、トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーの性状の要点は、担持したトリペプチド－ＭＣＡ基質を、α２マクログロブリン四量体にトラップされたトロンビン等妨害酵素の活性中心に送達することができないほどの大きな分子量にある。トリプターゼは分子量３１乃至３３ｋＤａの四量体（１３５ｋＤａ）で機能するためα２マクログロブリンによる阻害を受けないと考えられる。
　上記トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーとしては、ポリアミノ酸が好ましく、中でもポリ（Ｌ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）及びポリ（Ｄ－オルニチン）を好適に例示することができる。上記トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーは、トリペプチドのＮ末端に結合することが好ましく、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）やコハク酸等のリンカーを介してトリペプチドに結合してもよい。
　本発明の基質は、本発明の基質と血液試料とを接触させるステップ（Ａ）、及び前記ステップ（Ａ）後に、色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化量を測定することにより、前記血液試料中のトリプターゼ活性の程度を算出するステップ（Ｂ）を順次備えた血液試料中のトリプターゼ活性の測定方法（本発明の測定方法）に好適に使用することができる。ステップ（Ａ）における接触時間や、血液試料に対する基質添加量は、血液試料中のトリプターゼ活性によって適宜設定することができ、ステップ（Ｂ）における、血液試料中のトリプターゼ活性の程度を算出する方法としては、例えば精製トリプターゼ及び本発明の基質を用いてあらかじめ作成した検量線に基づいて、血液試料中のトリプターゼ活性を算出する方法を挙げることができる。本発明の測定方法は、ステップ（Ａ）に先立って、トロンビンによる妨害を防ぐために、上記トロンビン阻害剤を測定対象の血液試料に添加してもよいが、本発明の基質が、分子量５，０００以上のトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーが結合したものである場合、トロンビン阻害剤は添加しなくてもよい。疾患の判定基準としての血液試料中のトリプターゼ活性は、疾患に応じて適宜設定してもよく、一般に血中トリプターゼ濃度が１０μｇ／Ｌ以上である場合に高値であると考えられていることから、トリプターゼ濃度が１０μｇ／Ｌである場合の活性に基づいて、病態の判定基準を設定してもよい。
　一態様において、本発明の基質は、血液試料中のトリプターゼ活性測定用キット（本発明のキット）として保存、流通及び使用されてよい。本発明のキットは、本発明の測定方法に用いられる。本発明のキットは、本発明の基質に加え、血液試料採取用の容器、血液試料の前処理剤、反応用バッファー、保存料、取扱説明書等を含んでもよい。血液試料の前処理剤としては、上記トロンビン阻害剤や血液凝固阻害剤を例示することができるが、本発明の基質として、分子量５，０００以上のトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーが結合したものを用いる場合、トロンビン阻害剤は含まなくてもよい。
　本発明の基質、測定方法又はキットを用いることにより、マスト細胞活性化症候群の病勢評価を行うことができる。ここで、マスト細胞活性化症候群としては、例えばアレルギー、アトピー性皮膚炎、腫瘍、未熟児網膜症等、全身性肥満細胞症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）等を挙げることができる。本発明によれば、トリプターゼタンパク質関連抗原の存在量だけではなく、血液中のトリプターゼ活性を直接測定することができるため、従来のＥＬＩＳＡを用いた方法と比べ正確に病勢の評価（ステージ等の評価）を行うことができる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．トリプターゼ基質のスクリーニング
　トリプターゼに対して使用されたことがある既報のトリペプチド－ＭＣＡ基質のアミノ酸配列に関する文献情報及び簡易的ライブラリーの手法も取り入れて、全１７種類のＭＣＡ基質を化学合成し、ヒト肺から分離された市販のトリプターゼに対して、最も感受性と物性が優れたｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを見いだすに至った。ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ＿Ｐｍｃｓの合成は、以下の手順で行った。
（１）氷冷下、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＯＨ（渡辺化学工業株式会社製，４ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液に、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（４５０ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）を加えて、１時間撹拌した。生成した対称酸無水物にＡＭＣ（東京化成工業株式会社製，４００ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で１夜反応させ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡを得た。
（２）ｉＢｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ（自家製，１．８９ｇ，１０ｍｍｏｌ）とＨ－Ａｌａ－ＯＢｚｌ＿ＨＣｌ（自家製，２．１２ｇ，１０ｍｍｏｌ）とを定法で縮合してｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＢｚｌを調製した。更に５％Ｐｄ－Ｃを用いてメタノール中で接触還元して、ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＨを得た［収量２．０８ｇ（８０％）］。　
（３）Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡ（１．０ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン（５ｍＬ）に溶かして、室温で２時間反応させた。溶媒を留去し、残渣をＮ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かして、これにｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＨ（２６０ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）を加え、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ法で縮合した。生成物ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡをシリカゲルクロマトグラフィーで精製し、４２０ｍｇ（５０％）の白色の結晶を得た。
（４）ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡ（４００ｍｇ，０．４５ｍｍｏｌ）をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（５ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。ＴＦＡを留去し、残渣にジエチルエーテルを加えてＰｍｃｓ塩を結晶状の粉末として得た［収量３６５ｍｇ（９１％）］。
　上記のような過去の文献を参考にする以外に、ペプチドライブラリー的アプローチとしてＰ２位及びＰ３位に嵩高さが異なる、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ又は親水性のＬｙｓを導入したｉＢｏｃ－Ｙ－Ｘ－Ａｒｇ－ＭＣＡを表１に列挙するように合成し、活性測定を行った。なお、Ａｂｕ（２－アミノ酪酸）は非タンパク質性アミノ酸であるが、最適ペプチド配列探索ツールとして加えた。
　活性測定は、以下の方法で行った。
（１）基質溶液のストックを、２．０ｍＭのＤＭＳＯ溶液として用意した。
（２）基質溶液のストックを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で２０倍希釈して１００μＭの溶液を作製した。これの１００μＬをポリプロピレン製マイクロチューブに添加し、さらに市販のトリプターゼ溶液（Ｃａｐｐｅｌ社製）２μＬを添加、軽くボルテックスにかけて混合した後、酵素活性測定装置（有限会社ペプチドサポート社製・試作品）を用いて、直ちに励起波長３６５ｎｍにおける４７０ｎｍの蛍光強度の変化を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記のスクリーニングにより、ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡよりトリプターゼ感受性が高いトリペプチド基質として、ｉＢｏｃ－Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ、及びｉＢｏｃ－Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを取得することができた。また、非特許文献１５によってトリペプチド部分が既知のトリプターゼ基質であるｉＢｏｃ－Ｌｙｓ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－ＭＣＡについても、ｉＢｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡより２倍弱トリプターゼ感受性が高いことが確認できた。非特許文献１８に記載のトリプターゼ基質である－Ａｒｇ－Ａｓｎ－Ａｒｇ－配列も、Ｐ２位ＡｓｎがＰ２位Ａｌａよりも２倍強の感受性を示し、更にＰ３位においては側鎖に正電荷を帯びるアミノ酸がＰ３位Ａｌａよりも２倍程度感度が優れていることに鑑みると、－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－配列より、計算上であるが、約５倍高い感受性を有していると考えられた。
　上記トリペプチドの好適アミノ酸配列の探索の成果として、以下の知見が得られた。
　タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）は、タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖原子団の構造によって、ペプチド結合の加水分解反応速度が異なることが、その特異性として良く知られている。トリプターゼは側鎖に正電荷を有するＡｒｇを第一義的に認識して、これのカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する。酵素が第一義的に認識するアミノ酸の位置をＰ1 位とし、これからＮ-末端側に離れるに従って、Ｐ２位、Ｐ３位と称する。これらの一のアミノ酸でも酵素反応の速度の相違に小さからざる影響を及ぼすことがある。一方、タンパク質中のアミノ酸の側鎖に注目すると、酸性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、中性親水性アミノ酸に大きく４分類される。それぞれをＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒに代表させることもできる。そこで、Ｐ２位アミノ酸として、Ｇｌｕを除外し、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ，Ｐｈｅ，Ｓｅｒ，Ｐｒｏを導入することにした。Ｐ３位にも同様に典型的なアミノ酸を導入した。Ｐ３位にはＬｙｓも用いた。多数の化合物を合成する必要があったため合成中間体の精製方法を簡略化し、最終工程の保護基の除去において、トリフルオロ酢酸に対して安定なｉＢｏｃ基を用いた。また、Ａｒｇの側鎖のＰｍｃ保護基はトリフルオロ酢酸で除去後、生成物がＡｒｇの側鎖と塩を形成するため、ｉＢｏｃ－トリペプチド－ＭＣＡの化合物の殆どが良好な粉末状で得られた。
　表１の実験結果を検討して、トリプターゼの基質のアミノ酸配列の特徴を以下の５点にまとめることができた。（ｉ）Ｐ２位のＧｌｙは適切ではないことが明白である。（ii）Ｐ３位には側鎖が小さいメチル基のＡｌａが最適であり、ＶａｌやＰｈｅのように嵩高くなると感受性が減少した。大きな側鎖は酵素側のサブサイトＳ２位に収容されにくいのであろう。Ｐｒｏは他のプロテアーゼの基質でもＰ２位によく現れるアミノ酸である。（iii）非タンパク質性のＡｂｕはＡｌａより少し低い感受性を示した。（iv）Ｐ３位でもＰ２位と同様に、ＡｌａやＡｂｕのような小さい側鎖が許容されて嵩高い疎水性側鎖は結合しにくくなっている。（ｖ）一方、Ｐ３位には、正電荷を有するＬｙｓが収容されることが明らかになった。将来、病理に関連してトリプターゼの天然基質タンパク質が同定されて、その作用点のアミノ酸配列が決定されれば、そのＰ３位にＬｙｓが見いだされるであろう。
２．トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーにＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを結合した高分子基質の合成
　以下の方法により、トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーであるポリ（Ｌ－リジン）を結合したトリプターゼ活性測定用基質を合成した。
（１）Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡ（自家製，１．１ｍｍｏｌ）を２０％ピペリジン／ＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解し、９０分間反応させた。ＤＭＦを留去して、フリーアミンを白色固体状で得た。これをＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－ＯＨ（自家製，１．２ｍｍｏｌ）を加えてＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ法で縮合した。４時間反応後、Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡを単離し、シリカゲルクロマトグラフィーで精製した［収量５０５ｍｇ（６２％）］。
（２）Ｂｏｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡ（４４０ｍｇ）をＴＦＡ（５ｍＬ）に溶かして、１０分間反応させた。速やかにＴＦＡを留去し、ジエチルエーテルで結晶化した。
（３）ＴＦＡ＿Ｈ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡ（３９０ｍｇ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶かし、氷冷下でＮＥｔ３（２．２ｅｑ．）及びコハク酸無水物（１．２ｅｑ．）を加え、一夜室温で反応させた。生成したＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ（Ｐｍｃ）－ＭＣＡを抽出単離し、更にＴＦＡ（３ｍＬ）に溶解し、２時間反応させてＰｍｃ基を除去した。
（４）分子量８，０００以上のポリ（Ｌ－リジン）塩酸塩（株式会社ペプチド研究所製，Ｌｏｔ．６７０５１５，１６５ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を水（５ｍＬ）に溶かし、Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ＿Ｐｍｃｓ（１６４ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）を加えＮａＨＣＯ３（２１ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）で塩酸塩を中和した。更にＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ，２３ｍｇ，０．２ｍｍｏｌ）と１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド＿ＨＣｌ（ＥＤＣ，ＭＷ１９１．７，９６ｍｇ，０．５ｍｍｏｌ）を加えてｐＨ８～９に維持した。反応液が泡立つため、５時間後にエタノール（１ｍＬ）を消泡剤として加えた。２日間反応させた。
（５）反応液に少量の酢酸を加えて濃縮し、残ったシロップにエタノールを加えると固化した。翌日デカンテーションで溶媒を除き、再度蒸留水に溶かして、エタノールを消泡剤として濃縮し、残ったシロップにエタノールを加えて白色固体を得た。真空乾燥により２２０ｍｇのＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを結合したポリ（Ｌ－リジン）を得た。
（６）Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを結合したポリ（Ｌ－リジン）、３．８１ｍｇを５０ｍＬの蒸留水に溶かして、吸収スペクトルを測定すると、２８０ｎｍでの吸光度は０．５５であった。
　また、以下の方法により、トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーであるポリ（Ｄ－リジン）を結合したトリプターゼ活性測定用基質を合成した。
（７）上記（４）において、分子量４，０００－１５，０００のポリ（Ｄ－リジン）臭化水素酸塩（シグマ・アルドリッチ社製、Ｌｏｔ．ＳＬＢＺ６４０９、４２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）、およびＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ＿Ｐｍｃｓ（３３ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を用いたほかは、上記（１）～（６）と同様の手順によりポリ（Ｄ－リジン）にトリペプチド－ＭＣＡを縮合した。 目的物３８ｍｇを得た。
　また、α２マクログロブリン四量体にトラップされたトロンビン等の血液凝固系プロテアーゼへのＭＣＡ基質のアクセスを抑制するための好適な高分子として、樹枝状ポリ（リジン）が考えられた。そこで、以下の方法により樹枝状ポリ（Ｌ－リジン）及び樹枝状ポリ（Ｄ－リジン）を調製した。
（８）ヘキサメチレンジアミンにジ－Ｂｏｃ－Ｌ－リジン２分子を縮合した。ＴＦＡによる脱Ｂｏｃ基の後、遊離した４個のアミノ基にジ－Ｂｏｃ－Ｌ－リジン４分子を縮合した（第２世代Ｋ６Ｂ８。ここで、ＫはＬ－リジンの個数、ＢはＢｏｃ基の個数を表す）。これを繰り返して、第３世代Ｋ１４Ｂ１６、第４世代Ｋ３０Ｂ３２、更に第５世代Ｋ６２Ｂ６４まで樹枝を広げた（Chem. Commun., 1999, 2057-2058 (1999)）。Ｋ１４Ｂ１６、Ｋ３０Ｂ３２、及びＫ６２Ｂ６４をＴＦＡ処理を行うことによって、Ｋ１４Ａ１６（Ａは、脱保護後のフリーのアミノ基（ＴＦＡ塩）を表す）、Ｋ３０Ａ３２、及びＫ６２Ａ６４のＴＦＡ塩を白色粉末として得た（表２）。
（９）上記（８）において、ジ－Ｂｏｃ－Ｌ－リジンに代えてジ－Ｂｏｃ－Ｄ－リジンを用いたほかは同様の手順により、ｋ１４Ａ１６（ｋはＤ－リジンの個数を表す）、ｋ３０Ａ３２、及びｋ６２Ａ６４のＴＦＡ塩を白色粉末として得た（表２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　得られた樹枝状ポリ（リジン）を、以下の方法によりＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡに結合した。
（１０）樹枝状ポリ（Ｄ－リジン）である５Ｇｋ６２Ａ６４（３１６ｍｇ）を水（１０ｍＬ）に溶かし、Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ＿Ｐｍｃｓ（３３０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）を加え、ＮａＨＣＯ３（４３ｍｇ，１ｍｍｏｌ）でトリフルオロ酢酸塩を中和した。さらにＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ，５０ｍｇ，０．４ｍｍｏｌ）と１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド＿ＨＣｌ（ＥＤＣ，２００ｍｇ，１ｍｍｏｌ）を加えて、上記（４）のように反応させた。３４３ｍｇの５Ｇｋ６２Ａ６４－Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡ酢酸塩を得た。
３．本発明の基質を使用した血清中トリプターゼの活性測定
　実施例２で調製したＳｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを結合したポリ（Ｌ－リジン）を用い、血清中のトリプターゼ活性を特異的に測定できるかを試験した。
（１）Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－ＭＣＡを結合したポリ（Ｌ－リジン）２０．０ｍｇを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）５０ｍＬに溶解した。
（２）市販ヒト血清２μＬ（ＢｉｏＷｅｓｔ社製）をＰＢＳ（－）（ｐＨ７．４）２μＬ（対照）又は１０μＭナファモスタット（トリプターゼ阻害剤，東京化成工業株式会社製）２μＬ又は１０Ｕ／ｍＬヒルジン（トロンビン阻害剤，シグマ・アルドリッチ社製）２μＬと混合し、室温で１０分経過後、それぞれの混合溶液を上記（１）で調製した溶液１００μＬに添加し、直ちに酵素活性を測定した。
　結果を、以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３より、本発明の高分子基質で検出された血清中の酵素活性は、トリプターゼ阻害剤であるナファモスタットで完全に阻害されたのに対して、トロンビン阻害剤であるヒルジンでは阻害されなかった。ここでの結果より、本発明の高分子基質で検出された血清中の酵素活性は、トリプターゼによるものであり、トロンビン等の血液凝固系酵素がα２マクログロブリン四量体にトラップされた状態で存在している血清試料であっても、トリプターゼ活性を特異的に測定できることが示された。
　本発明によれば、血液試料に対する精製、濃縮等の前処理なしに、血液試料中のトリプターゼ活性を直接測定することができる。そのため、これまではトリプターゼタンパク質関連抗原の血中存在量のみにより判定していたマスト細胞活性化症候群を、病勢をより正確に反映するトリプターゼ活性により判定することが可能になるため、医療分野における産業上の利用可能性は高い。

Claims (10)

  1. 　以下の式（１）～（３）から選択される、Ｃ末端に色素標識がペプチド結合したトリペプチド（トリペプチド－Ｘ）を含むトリプターゼ活性測定用基質。
    （１）Ｌｙｓ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
    （２）Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
    （３）Ａｂｕ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｘ
    （式中、Ｘは、Ａｒｇとのペプチド結合が切断されることにより蛍光特性又は発色特性が変化する色素標識であり、Ａｂｕは２－アミノ酪酸である）
  2. 　血液試料中のトリプターゼ活性の直接測定用であることを特徴とする請求項１に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
  3. 　分子量５，０００以上のトリプターゼ難消化性水溶性ポリマーにトリペプチド－ＸのＮ末端が結合したことを特徴とする請求項１又は２に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
  4. 　トリプターゼ難消化性水溶性ポリマーが、ポリアミノ酸であることを特徴とする請求項３に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
  5. 　ポリアミノ酸が、ポリ（Ｌ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｌ－リジン）、ポリ（Ｄ－リジン）、樹枝状ポリ（Ｄ－リジン）、ポリ（Ｌ－オルニチン）及びポリ（Ｄ－オルニチン）から選択されることを特徴とする請求項４に記載のトリプターゼ活性測定用基質。
  6. 　色素標識が、ＭＣＡ基、ＡＮＳ基、ＣＭＣＡ基、ＦＭＣＡ基、ＡＭＰ基、ローダミン１１０基、ローダミン１１０モノアミド基、ローダミン６Ｇ基及びローダミンＢ基から選択される蛍光色素標識であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質。
  7. 　以下のステップ（Ａ）及び（Ｂ）を備えたことを特徴とする血液試料中のトリプターゼ活性の測定方法。
    （Ａ）請求項１～６のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質と、血液試料とを接触させるステップ；
    （Ｂ）前記ステップ（Ａ）後に、色素標識の蛍光特性又は発色特性の変化量を測定することにより、前記血液試料中のトリプターゼ活性の程度を算出するステップ；
  8. 　血液試料が、血清であることを特徴とする請求項７に記載の方法。
  9. 　請求項１～６のいずれかに記載のトリプターゼ活性測定用基質を含むことを特徴とする血液試料中のトリプターゼ活性測定用キット。
  10. 　血液試料が、血清であることを特徴とする請求項９に記載のキット。
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