TW202122798A - 類胰蛋白酶活性測定用基質 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題在於提供一種藉由簡便之操作而準確迅速地測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性之方法,以便準確地評估肥大細胞參與病情之疾病之病情。
根據本發明,藉由類胰蛋白酶活性測定用基質,能夠不對血液樣本進行純化、濃縮等預處理而直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性,該類胰蛋白酶活性測定用基質包含選自以下式(1)~(3)中之於C末端上肽鍵結有色素標記之三肽。
(1)Lys-Ala-Arg-X
(2)Ala-Ala-Arg-X
(3)Abu-Ala-Arg-X
(式中,X為螢光特性或顯色特性會因與Arg之肽鍵被切斷而產生變化之色素標記,Abu為2-胺基丁酸)
Description
本發明係關於一種類胰蛋白酶活性測定用基質、使用該基質之血液樣本中之類胰蛋白酶活性之測定方法、及包含該基質之血液樣本中之類胰蛋白酶活性測定用套組,上述類胰蛋白酶活性測定用基質之特徵在於包含於C末端上肽鍵結有色素標記之特定三肽,且上述色素標記之螢光特性或顯色特性會因上述三肽之C末端肽鍵被切斷而產生變化。
過敏性疾病、腫瘤、早產兒視網膜病變等尤其是肥大細胞參與病情之疾病被診斷為肥大細胞活化症候群。為了評估病情,於自肥大細胞釋出之多種多樣之介體中,根據其特異性使用作為蛋白質分解酵素之類胰蛋白酶。目前,為了定量化類胰蛋白酶,國際上使用利用特異抗體之免疫反應(ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay,酵素結合免疫吸附分析法))。然而,類胰蛋白酶會作為酵素發揮功能而對活體產生影響,因此判斷病情時重要的是測定酵素活性,因此只能判定作為抗原之類胰蛋白酶相關蛋白質之存在量的ELISA並不充分。
本發明人等報告了早產兒視網膜病變發病時需要自肥大細胞釋出之類胰蛋白酶(非專利文獻1)。於該報告中,本發明人等使用ELISA來判定類胰蛋白酶之參與,但如上所述,在考慮能夠用什麼方法來評估新生兒之病情(是否失明、治療法之選擇)之情形時,必須測定酵素活性。
類胰蛋白酶係藉由肥胖細胞之去顆粒而釋出至血液中之酵素,血中濃度往往成為10 μg/L左右之低濃度(非專利文獻2、3,非專利文獻3中報告有1歲前之健康幼兒之血清中的存在量為4.67 μg/L)。現狀是,該濃度時無法檢測到先前之類胰蛋白酶基質,因此必須將檢體溶液進行濃縮、或延長反應時間,其結果導致難以進行準確且迅速之測定。又,為了簡便地測定類胰蛋白酶活性,較理想的是將樣本製備較容易之血清直接供於測定,但血清中存在凝血系統之蛋白酶即凝血酶,於使用公知之蛋白酶基質進行類胰蛋白酶之活性測定之情形時,凝血酶顯示出極大於類胰蛋白酶之活性之活性而會妨礙測定。
1980年以後之類胰蛋白酶之酵素化學研究中,使用有當時作為胰蛋白酶之螢光性基質所市售之Boc-Phe-Ser-Arg-MCA或Tos-Gly(glycine,甘胺酸)-Pro-Arg-MCA等。除該等以外,還調查了數種三肽-MCA之基質特異性,但通常不使用除上述2種以外之基質(非專利文獻4~16)。現狀是類胰蛋白酶為類胰蛋白酶酵素,因此只要為於C末端上具有Arg之MCA基質,則無論敏感性(sensitivity)高低,均能檢測到酵素活性,因此並未嘗試進行三肽之胺基酸序列之最佳化。
再者,近年來,報告有Ac-Lys-Pro-Arg-FMCA(7-amino-4-trifluoromethylcoumarin,7-胺基-4-三氟甲基香豆素)為類胰蛋白酶之較佳基質(非專利文獻17)。給出了如下暗示,即,對於針對類胰蛋白酶之天然基質蛋白質之作用部位而言,該序列中之Lys之存在較為寶貴。又,在20多年前就進行了藉由於基板上構建三肽庫之方法來調查蛋白酶之基質特異性的綜合性基因庫構建,明確了對β類胰蛋白酶I及II敏感性最高之三肽序列為-Lys/Arg-Asn-Lys/Arg-(非專利文獻18)。P2
位Asn顯示較P2
位Ala強2倍之敏感性,進而於P3
位側鏈帶正電荷之胺基酸之感度較P3
位Ala優異2倍左右。然而,令人遺憾的是,2001年公表之該優異研究成果並未以如i
Boc-Arg-Asn-Arg-MCA之易於使用之形式得到實用化。
如上所述,在此之前報告有能夠成為類胰蛋白酶之基質之三肽,但據發明者所知,並無將該基質用於直接測定夾雜有蛋白酶之血液樣本之報告,進而該基質亦可能被凝血酶等其他蛋白酶切斷,因此於合成能夠將夾雜有蛋白酶之血液樣本作為直接測定對象之類胰蛋白酶活性測定用基質中,無法排除技術上之困難。
先前技術文獻
非專利文獻
非專利文獻1:J Clin Invest., 127(11), 3987-4000, 2017.
非專利文獻2:Thermo Fisher Scientific公司「Mast cell Tryptase For diagnosis and prediction」(http://www.phadia.com/Global/Market%20Companies/Finland/Mast%20Cell%20Tryptase%20for%20Diagnosis%20and%20Prediction.pdf)
非專利文獻3:Allergy Asthma Proc. 35, 404-408, 2014.
非專利文獻4:J. Biol. Chem., 258, 13552-13557, 1983.
非專利文獻5:J. Biol. Chem., 262, 1363-1373, 1987.
非專利文獻6:Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 369, 617-625, 1988.
非專利文獻7:J. Biol. Chem., 263, 18104-18107, 1988.
非專利文獻8:Biol. Chem. Hoppe-Seyler Suppl., 371, 65-73, 1990.
非專利文獻9:J. Biol. Chem., 267, 13573-13579, 1992.
非專利文獻10:J. Biochem., 120, 856-864, 1996.
非專利文獻11:Peptides, 19, 437-443, 1998.
非專利文獻12:FEBS Lett., 408, 85-88, 1997.
非專利文獻13:British J. Pharm., 138, 959-967, 2003.
非專利文獻14:Allergology International, 57, 83-91, 2008.
非專利文獻15:Chemical Science, 6, 1792-1800, 2015.
非專利文獻16:IJC Metabolic & Endocrine, 10, 16-23, 2016.
非專利文獻17:Sigma-Aldrich公司「N-Acetyl-Lys-Pro-Arg-7-Amino-4-Trifluoromethylcoumarin」(製品編號:C6608)製品資訊(https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Datasheet/3/c6608dat.pdf)
非專利文獻18:J. Biol. Chem., 276, 34941-34947, 2001
[發明所欲解決之問題]
本發明之課題在於提供一種以簡便操作準確且迅速地測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性之方法,以便準確地評估肥大細胞參與病情之疾病之病情。
[解決問題之技術手段]
如上所述,於類胰蛋白酶之酵素化學研究中,當時使用作為胰蛋白酶之螢光性基質所市售之Boc-Phe-Ser-Arg-MCA或Tos-Gly-Pro-Arg-MCA等。於測定經純化之類胰蛋白酶之活性時,該等基質顯示充分之活性,但本發明人等認識到存在以下問題點:就測定血清中之類胰蛋白酶活性之觀點而言,該等基質之敏感性較低,又,如上所述,受到凝血酶之干擾,因此無法用於測定血清中類胰蛋白酶之活性。本發明人等為了解決上述問題點而反覆進行了銳意研究,結果發現,i
Boc-Ala-Ala-Arg-MCA、i
Boc-Lys-Ala-Arg-MCA、i
Boc-Abu-Ala-Arg-MCA、i
Boc-Lys-Pro-Arg-MCA對於類胰蛋白酶之敏感性極高,即便是低濃度之類胰蛋白酶亦能夠檢測到切斷。進而,本發明人等發現,使上述三肽-MCA經由琥珀酸結合於聚(L-離胺酸)而成之高分子基質即便在與α2巨球蛋白反應後之凝血酶之共存下亦不會受到複合體中之凝血酶之作用,能夠特異性地測定血清中之類胰蛋白酶活性。本發明基於該等見解而完成。
即,本發明係根據以下所記載之事項來特定。
[1]一種類胰蛋白酶活性測定用基質,其包含選自以下式(1)~(3)中之於C末端上肽鍵結有色素標記之三肽(三肽-X)。
(1)Lys-Ala-Arg-X
(2)Ala-Ala-Arg-X
(3)Abu-Ala-Arg-X
(式中,X為螢光特性或顯色特性會因與Arg之肽鍵被切斷而產生變化之色素標記,Abu為2-胺基丁酸)
[2]如上述[1]所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質,其用於直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性。
[3]如上述[1]或[2]所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中於分子量5,000以上之類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物上鍵結有三肽-X之N末端。
[4]如上述[3]所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物為聚胺基酸。
[5]如上述[4]所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中聚胺基酸選自聚(L-離胺酸)、樹枝狀聚(L-離胺酸)、聚(D-離胺酸)、樹枝狀聚(D-離胺酸)、聚(L-鳥胺酸)及聚(D-鳥胺酸)。
[6]如上述[1]至[5]中任一項所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中色素標記為選自MCA基、ANS基、CMCA基、FMCA基、AMP基、若丹明110基、若丹明110單醯胺基、若丹明6G基及若丹明B基中之螢光色素標記。
[7]一種血液樣本中之類胰蛋白酶活性之測定方法,其特徵在於具備以下之步驟(A)及(B)。
(A)使上述[1]至[6]中任一項所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質與血液樣本接觸之步驟;
(B)於上述步驟(A)後,藉由測定色素標記之螢光特性或顯色特性之變化量,算出上述血液樣本中之類胰蛋白酶活性之程度之步驟;
[8]如上述[7]所記載之方法,其中血液樣本為血清。
[9]一種血液樣本中之類胰蛋白酶活性測定用套組,其特徵在於包含:如上述[1]至[6]中任一項所記載之類胰蛋白酶活性測定用基質。
[10]如上述[9]所記載之套組,其中血液樣本為血清。
[發明之效果]
根據本發明,能夠不對血液樣本進行純化、濃縮等預處理而直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性。
本發明係關於一種類胰蛋白酶活性測定用基質(以下有時稱為「本發明之基質」)、以及使用本發明之基質的血液樣本中之類胰蛋白酶活性之測定方法(以下有時稱為「本發明之測定方法」)、包含本發明之基質的血液樣本中之類胰蛋白酶活性測定用套組(以下有時稱為「本發明之套組」),上述類胰蛋白酶活性測定用基質包含選自以下式(1)~(3)之於C末端上肽鍵結有色素標記之三肽(三肽-X)。
(1)Lys-Ala-Arg-X
(2)Ala-Ala-Arg-X
(3)Abu-Ala-Arg-X
(式中,X為螢光特性或顯色特性會因與Arg之肽鍵被切斷而產生變化之色素標記,Abu為2-胺基丁酸)
本發明之基質能夠適宜地用於直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性之用途。
於本說明書中,關於肽之「切斷」用詞係與「水解」以相同含義來使用。藉由本發明之基質,即便類胰蛋白酶為約10 μg/L之極低濃度亦能夠檢測出活性,因此,即便為血液樣本中之類胰蛋白酶,亦能夠藉由如下等方法來評估活性:測定開始後等待2分鐘酵素反應成為穩定狀態,其後,將測定開始後2分鐘至3分鐘為止之1分鐘內所獲得之螢光強度之增大記錄為酵素活性。
作為上述色素標記,只要色素標記之螢光特性或顯色特性會因肽鍵切斷而產生變化,則並無限制,就檢測之簡便性及感度之觀點而言,較佳為螢光標記,例如可列舉:MCA(4-甲基-香豆基-7-醯胺)基、ANS(2-胺基萘-6-磺酸)基、CMCA(7-胺基-4-氯甲基香豆素)基、FMCA(7-胺基-4-三氟甲基香豆素)基、AMP(2-胺基-7-甲基嘌呤-6-硫醇)基、若丹明110基、若丹明110單醯胺基、若丹明6G基、若丹明B基等。
上述螢光特性有無變化或變化量能夠使用公知之螢光強度測定機等來進行檢測或定量,上述顯色特性有無變化或變化量能夠使用分光光度計等來進行檢測或定量。此時,較佳為分析上述色素標記之吸收波長或螢光波長,選擇如能夠特異性地檢測、定量該色素標記之激發波長及螢光波長。於使用MCA基作為本發明之基質中之色素標記之情形時,1)於特異性地測定AMC(7-胺基-4-甲基香豆素)時,較佳為照射不會激發MCA基而會激發AMC之波長(例如360 nm~400 nm),檢測、測定AMC所發出之螢光波長(例如400 nm~500 nm),2)於特異性地測定MCA基時,較佳為照射不會激發AMC而會激發MCA基之波長(例如260 nm~350 nm),而檢測、測定MCA基所發出之波長(例如350 nm~385 nm)。
作為本說明書中之血液樣本,只要為自受檢者採集之血液樣本即可,例如能夠列舉全血、血漿、血清,較佳為血漿或血清,就測定之簡便性及樣本製備之容易度而言,進而較佳為血清。又,上述血液樣本可任意添加血液凝固抑制劑。本發明之類胰蛋白酶活性測定用基質包含存在於血液中之凝血酶之識別序列,因此上述血液樣本亦可包含抗凝血酶III、水蛭素、肝素輔因子II、抑肽酶等凝血酶抑制劑以防止凝血酶之干擾,於較佳之形態中,上述血液樣本不包含凝血酶抑制劑。作為上述受檢者,可列舉較佳為哺乳動物、更佳為靈長類、進而較佳為人。
本發明之基質可於三肽上鍵結重量平均分子量為5,000以上、更佳為6,000以上、進而較佳為7,000以上、進而更佳為8,000以上之類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物。於本形態中,本發明之基質不會被血液樣本中共存之凝血酶切斷,因此即便不對血液樣本進行凝血酶抑制劑之添加、凝血酶之去除等預處理,亦能夠精度良好地測定類胰蛋白酶活性。認為其理由在於:重量平均分子量5,000以上之類胰蛋白酶活性測定用基質於血液樣本中不會達到被α2巨球蛋白四聚體捕捉到之凝血酶之活性中心。再者,作為本形態中之三肽,除選自式(1)~(3)中之三肽以外,還能夠使用既知之三肽(Lys-Pro-Arg;於選自式(1)~(3)中之三肽中P2
位為Asn之三肽;Lys/Arg-Asn-Lys/Arg等),該等既知之三肽對類胰蛋白酶之敏感性係與選自式(1)~(3)中之三肽同等或較高。
關於上述類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物,只要不妨礙本發明之基質中之Arg殘基-色素標記間之肽鍵被類胰蛋白酶切斷即可,作為重量平均分子量之上限,例如可列舉5,000,000以下、1,000,000以下、500,000以下、100,000以下、50,000以下等。又,類胰蛋白酶難消化性意指本發明之基質中類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物中之鍵相較於Arg殘基-色素標記間之肽鍵,難以被類胰蛋白酶切斷,例如意指類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物對類胰蛋白酶之敏感性為Arg殘基-色素標記間肽鍵對類胰蛋白酶之敏感性的1/10以下、較佳為1/50以下、更佳為1/100以下、進而較佳為1/500以下、進而更佳為1/1000以下。此處,若對類胰蛋白酶之敏感性較高,則於反應中水溶性聚合物會被消化,縮小至能夠到達被α2巨球蛋白四聚體捕捉到之凝血酶之活性中心的分子尺寸,因此並不理想。類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物之性狀要點在於處在如下程度之較大分子量,即,無法將所擔載之三肽-MCA基質傳遞到被α2巨球蛋白四聚體捕獲到之凝血酶等干擾酵素之活性中心程度的分子量,但並不受理論約束。類胰蛋白酶係藉由分子量31至33 kDa之四聚體(135 kDa)來發揮功能,因此認為不會受到α2巨球蛋白之阻礙。
作為上述類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物,較佳為聚胺基酸,其中能夠較佳地例示:聚(L-離胺酸)、樹枝狀聚(L-離胺酸)、聚(D-離胺酸)、樹枝狀聚(D-離胺酸)、聚(L-鳥胺酸)及聚(D-鳥胺酸)。上述類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物較佳為鍵結於三肽之N末端,亦可經由PEG(polyethylene glycol,聚乙二醇)或琥珀酸等連接子鍵結於三肽。
本發明之基質能夠適宜地用於依序具備步驟(A)及步驟(B)的血液樣本中之類胰蛋白酶活性之測定方法(本發明之測定方法),上述步驟(A)係使本發明之基質與血液樣本接觸,步驟(B)係於上述步驟(A)後,藉由測定色素標記之螢光特性或顯色特性之變化量,算出上述血液樣本中之類胰蛋白酶活性之程度。步驟(A)中之接觸時間、血液樣本中之基質添加量能夠根據血液樣本中之類胰蛋白酶活性來適當設定,作為步驟(B)中之算出血液樣本中之類胰蛋白酶活性之程度的方法,例如能夠列舉如下方法:基於使用純化類胰蛋白酶及本發明之基質預先繪製成之校準曲線,算出血液樣本中之類胰蛋白酶活性。本發明之測定方法為了防止凝血酶之干擾,亦可於步驟(A)之前將上述凝血酶抑制劑添加至測定對象之血液樣本中,於本發明之基質鍵結有分子量5,000以上之類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物之情形時,亦可不添加凝血酶抑制劑。作為疾病之判定基準的血液樣本中之類胰蛋白酶活性能夠根據疾病來適當設定,通常認為於血中類胰蛋白酶濃度為10 μg/L以上之情形時為較高值,因此可基於類胰蛋白酶濃度為10 μg/L之情形時之活性來設定病態之判定基準。
於一形態中,本發明之基質可以血液樣本中之類胰蛋白酶活性測定用套組(本發明之套組)之形式來進行保存、流通及使用。本發明之套組可用於本發明之測定方法。本發明之套組除本發明之基質以外,還可包含血液樣本採集用容器、血液樣本之預處理劑、反應用緩衝液、防腐劑、操作說明書等。作為血液樣本之預處理劑,可例示上述凝血酶抑制劑或血液凝固抑制劑,於使用鍵結有分子量5,000以上之類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物者作為本發明之基質之情形時,亦可不包含凝血酶抑制劑。
藉由使用本發明之基質、測定方法或套組,能夠對肥大細胞活化症候群進行病情評估。此處,作為肥大細胞活化症候群,例如能夠列舉:過敏、異位性皮膚炎、腫瘤、早產兒視網膜病變等全身性肥胖細胞增多症;慢性淋巴球性白血病(CLL)等。根據本發明,不僅能夠測定類胰蛋白酶蛋白質相關抗原之存在量,亦能夠直接測定血液中之類胰蛋白酶活性,因此,與先前之使用ELISA之方法相比,能夠準確地評估病情(階段等之評估)。
以下,藉由實施例更具體地說明本發明,但本發明之技術範圍並不限定於該等例示。
實施例1
1.類胰蛋白酶基質之篩選
採用對類胰蛋白酶使用過之已報告之三肽-MCA基質之胺基酸序列相關的文獻資訊及簡易之基因庫方法,化學合成全部17種MCA基質,最終發現對市售之自人肺分離出之類胰蛋白酶敏感性及物性最優異的i
Boc-Ala-Ala-Arg-MCA。i
Boc-Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs之合成係按照以下步序進行。
(1)冰浴冷卻下,向Fmoc-Arg(Pmc)-OH(渡邊化學工業股份有限公司製造,4 mmol)之二氯甲烷(DCM)溶液中添加N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)(450 mg,2.2 mmol),並攪拌1小時。於所生成之對稱酸酐中添加AMC(東京化成工業股份有限公司製造,400 mg,2.2 mmol)並於室溫下反應1夜,而獲得Fmoc-Arg(Pmc)-MCA。
(2)藉由慣例使i
Boc-Ala-OH(自家製造,1.89 g,10 mmol)與H-Ala-OBzl_HCl(自家製造,2.12 g,10 mmol)進行縮合,製備i
Boc-Ala-Ala-OBzl。進而使用5%Pd-C於甲醇中進行催化還原,獲得i
Boc-Ala-Ala-OH[產量2.08 g(80%)]。
(3)使Fmoc-Arg(Pmc)-MCA(1.0 mmol)溶解於20%哌啶(5 mL)中,於室溫下反應2小時。蒸餾去除溶劑,使殘渣溶解於N,N'-二甲基甲醯胺(DMF),向其中添加i
Boc-Ala-Ala-OH(260 mg,1.0 mmol),藉由HBTU/HOBt(1-hydroxybenzotriazole,1-羥基苯并三唑)法加以縮合。藉由矽膠層析法對產物i
Boc-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA進行純化,獲得420 mg(50%)之白色結晶。
(4)使i
Boc-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA(400 mg,0.45 mmol)溶解於三氟乙酸(TFA)(5 mL)中,於室溫下反應2小時。蒸餾去除TFA,向殘渣中添加二乙醚,獲得作為結晶狀粉末之Pmcs鹽[產量365 mg(91%)]。
除參考如上述之以往文獻以外,作為利用肽庫之方法,還如表1所列合成導入有於P2
位及P3
位上體積不同之Gly、Ala、Abu、Val、Pro、Phe或親水性Lys的i
Boc-Y-X-Arg-MCA並進行活性測定。再者,Abu(2-胺基丁酸)為非蛋白質性胺基酸,但作為最佳肽序列探索工具而添加。
活性測定係藉由以下之方法來進行。
(1)將基質溶液之原料作為2.0 mM之DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲亞碸)溶液來準備。
(2)用50 mM Tris-HCl(pH值8.0)將基質溶液之原料稀釋20倍,製作100 μM之溶液。將其100 μL添加至聚丙烯製微型管中,進而添加市售之類胰蛋白酶溶液(Cappel公司製造)2 μL,輕輕用漩渦攪拌器加以混合後,使用酵素活性測定裝置(Peptide support有限公司製造 試製品),直接測定激發波長365 nm下之470 nm之螢光強度之變化。
[表1]
螢光基質之胺基酸序列與利用人肺類胰蛋白酶*1 之敏感性之比較 | |
i Boc-P3 -P2 -Arg-MCA*2 | 類胰蛋白酶活性*3 |
i Boc-Phe-Ser-Arg-MCA | 11 |
i Boc-Arg-MCA | 0 |
i Boc-G1y-G1y-Arg-MCA | 0 |
i Boc-Phe-Gly-Arg-MCA | 5 |
i Boc-Lys-Gly-Arg-MCA | 75 |
i Boc-Ala-Ala-Arg-MCA | 100 |
i Boc-Abu-Ala-Arg-MCA | 109 |
i Boc-Val-Ala-Arg-MCA | 53 |
i Boc-Phe-Ala-Arg-MCA | 62 |
i Boc-Lys-Ala-Arg-MCA | 167 |
i Boc-Ala-Abu-Arg-MCA | 80 |
i Boc-Abu-Abu-Arg-MCA | 69 |
i Boc-Gly-Pro-Arg-MCA | 9 |
Tos-Gly-Pro-Arg-MCA | 25 |
i Boc-Val-Pro-Arg-MCA | 20 |
i Boc-Lys-Pro-Arg-MCA | 175 |
i Boc-Ala-Val-Arg-MCA | 50 |
i Boc-Ala-Phe-Arg-MCA | 1 |
i Boc-Ala-Lys-Arg-MCA | 11 |
*1 所購入之類胰蛋白酶之資訊。酵素反應條件。 | |
*2 該等化合物於藉由三氟乙酸處理將精胺酸之胍基之保護基即Pmc-基去除掉時,該磺酸(Pmcs,五甲基苯并二氫吡喃磺酸)以游離之胍基之相對離子之形式形成鹽。 | |
*3 將i Boc-Ala-Ala-Arg-MCA之感度設為100之情形時之相對值。 |
藉由上述篩選,作為類胰蛋白酶敏感性高於i
Boc-Ala-Ala-Arg-MCA之三肽基質,獲得了i
Boc-Abu-Ala-Arg-MCA及i
Boc-Lys-Ala-Arg-MCA。又,根據非專利文獻15,確認到三肽部分為已知之類胰蛋白酶基質之i
Boc-Lys-Pro-Arg-MCA之類胰蛋白酶敏感性較i
Boc-Ala-Ala-Arg-MCA高不到兩倍。關於非專利文獻18所記載之類胰蛋白酶基質即-Arg-Asn-Arg-序列,亦P2
位Asn顯示較P2
位Ala強2倍之敏感性,進而於P3
位於側鏈帶有正電荷之胺基酸之感度較P3
位Ala優異2倍左右,鑒於此,計算上認為具有較-Ala-Ala-Arg-序列約高5倍之敏感性。
作為上述三肽之適宜胺基酸序列之探索成果,獲得了以下見解。
蛋白質分解酵素(蛋白酶)因蛋白質所含之胺基酸之側鏈原子團之結構不同而肽鍵的水解反應速度會有所不同,此作為其特異性廣為人知。類胰蛋白酶最重要的會識別側鏈具有正電荷之Arg,使其羧基側之肽鍵水解。將酵素最重要所識別之胺基酸之位置作為P1
位,其之後依據與N-末端側相隔之距離,依次稱為P2
位、P3
位。即便是該等之一個胺基酸亦會對酵素反應之速度差異產生不小影響。另一方面,著眼於蛋白質中之胺基酸之側鏈,大致分為酸性胺基酸、鹼性胺基酸、疏水性胺基酸、中性親水性胺基酸4類。亦能夠分別用Glu、Arg、Phe、Ser來代表。因此,作為P2
位胺基酸,除Glu外,導入Gly、Ala、Val、Phe、Ser、Pro。P3
位亦同樣地導入典型之胺基酸。P3
位亦使用Lys。由於需要合成大量化合物,故簡化合成中間物之純化方法,於最終步驟之保護基之去除中,使用對三氟乙酸穩定之i
Boc基。又,Arg之側鏈之Pmc保護基藉由三氟乙酸去除後,產物與Arg之側鏈形成鹽,因此大致以良好之粉末狀獲得了i
Boc-三肽-MCA之化合物。
研究表1之實驗結果,將類胰蛋白酶之基質之胺基酸序列之特徵總結成了以下5點。(i)清楚P2
位之Gly並不適當。(ii)對於P3
位而言,最佳為側鏈較小之甲基之Ala,若如Val或Phe般變得龐大,則敏感性減少。較大側鏈難以被收容至酵素側之次部位S2
位。Pro係即便為其他蛋白酶之基質亦常出現在P2
位之胺基酸。(iii)非蛋白質性之Abu顯示低於Ala之敏感性。(iv)P3
位亦與P2
位同樣地,容許如Ala或Abu之較小側鏈,變得難以鍵結龐大之疏水性側鏈。(v)另一方面,明確了P3
位收容具有正電荷之Lys。將來,若與病理相關鑑定類胰蛋白酶之天然基質蛋白質,並決定其作用點之胺基酸序列,則會於其P3
位找到Lys。
實施例2
2.於類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物上鍵結Suc-Ala-Ala-Arg-MCA而成之高分子基質之合成
藉由以下方法,合成鍵結有類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物即聚(L-離胺酸)之類胰蛋白酶活性測定用基質。
(1)使Fmoc-Arg(Pmc)-MCA(自家製造,1.1 mmol)溶解於20%哌啶/DMF(10 mL)中,反應90分鐘。蒸餾去除DMF,獲得白色固體狀之游離胺。使其溶解於DMF(5 mL)中,添加Boc-Ala-Ala-OH(自家製造,1.2 mmol)並藉由HBTU/HOBt法進行縮合。反應4小時後,將Boc-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA單離,藉由矽膠層析法進行純化[產量505 mg(62%)]。
(2)使Boc-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA(440 mg)溶解於TFA(5 mL)中,反應10分鐘。迅速蒸餾去除TFA,並利用二乙醚進行結晶化。
(3)使TFA_H-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA(390 mg)溶解於DMF(5 mL)中,於冰浴冷卻下添加NEt3
(2.2 eq.)及琥珀酸酐(1.2 eq.),於室溫下反應一夜。對所生成之Suc-Ala-Ala-Arg(Pmc)-MCA進行萃取單離,進而溶解於TFA(3 mL)中,反應2小時而去除Pmc基。
(4)使分子量8,000以上之聚(L-離胺酸)鹽酸鹽(PEPTIDE INSTITUTE製造,Lot. 670515,165 mg,1 mmol)溶解於水(5 mL)中,添加Suc-Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs(164 mg,0.2 mmol)並藉由NaHCO3
(21 mg,0.5 mmol)來中和鹽酸鹽。進而添加N-羥基丁二醯亞胺(HOSu,23 mg,0.2 mmol)與1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二醯亞胺_HCl(EDC,MW 191.7,96 mg,0.5 mmol)並維持在pH值8~9。由於反應液會起泡,故於5小時後添加乙醇(1 mL)作為消泡劑。反應2天。
(5)於反應液中添加少量乙酸並進行濃縮,向剩餘之漿液中添加乙醇以進行固化。第二天利用傾析法去除溶劑,再次溶於蒸餾水中,將乙醇作為消泡劑進行濃縮,向剩餘之漿液中添加乙醇,獲得白色固體。藉由真空乾燥獲得了220 mg之鍵結有Suc-Ala-Ala-Arg-MCA之聚(L-離胺酸)。
(6)使鍵結有Suc-Ala-Ala-Arg-MCA之聚(L-離胺酸) 3.81 mg溶解於50 mL之蒸餾水中,測定吸收光譜,結果280 nm下之吸光度為0.55。
又,藉由以下方法,合成出鍵結有類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物即聚(D-離胺酸)之類胰蛋白酶活性測定用基質。
(7)於上述(4)中,使用分子量4,000-15,000之聚(D-離胺酸)氫溴酸鹽(Sigma-Aldrich公司製造,Lot. SLBZ6409,42 mg,0.2 mmol)及Suc-Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs(33 mg,0.04 mmol),除此以外,藉由與上述(1)~(6)同樣之步序而於聚(D-離胺酸)上縮合三肽-MCA。獲得目標物38 mg。
又,作為用以抑制MCA基質接近被α2巨球蛋白四聚體捕獲之凝血酶等凝血系統蛋白酶之適宜高分子,考慮到樹枝狀聚(離胺酸)。因此,藉由以下方法製備樹枝狀聚(L-離胺酸)及樹枝狀聚(D-離胺酸)。
(8)於六亞甲基二胺上縮合二-Boc-L-離胺酸2分子。利用TFA進行去Boc基之後,於游離之4個胺基上縮合二-Boc-L-離胺酸4分子(第2代K6B8,此處,K表示L-離胺酸之個數,B表示Boc基之個數)。重複該操作,擴展樹枝直至第3代K14B16、第4代K30B32、進而第5代K62B64(Chem. Commun., 1999, 2057-2058(1999))。藉由對K14B16、K30B32及K62B64進行TFA處理,獲得白色粉末之K14A16(A表示去保護後之游離胺基(TFA鹽))、K30A32、及K62A64之TFA鹽(表2)。
(9)於上述(8)中,使用二-Boc-D-離胺酸代替二-Boc-L-離胺酸,除此以外,藉由同樣之步序獲得白色粉末之k14A16(k表示D-離胺酸之個數)、k30A32、及k62A64之TFA鹽(表2)。
[表2]
樹枝狀聚(L-離胺酸)及聚(D-離胺酸)之每代之離胺酸數、游離胺基數、作為TFA鹽之分子量、合成產量及產率。
代 | 略碼 | 游離 | 分子量 | 合成產量 |
胺基數*) | (+TFA鹽) | 及產率 | ||
3G | K14A16 | 16 | 1908+1824 | 908 mg(86%) |
4G | K30A32 | 32 | 3956+3648 | 762 mg(77%) |
5G | K62A64 | 64 | 8052+7296 | 341 mg(75%) |
3G | k14A16 | 16 | 1908+1824 | 1.85 g(83%) |
4G | k30A32 | 32 | 3956+3648 | 1.13 g(80%) |
5G | k62A64 | 64 | 8052+7296 | 962 mg(75%) |
*) k係D-離胺酸之簡稱。 |
藉由以下方法使所得之樹枝狀聚(離胺酸)鍵結於Suc-Ala-Ala-Arg-MCA。
(10)使樹枝狀聚(D-離胺酸)即5Gk62A64(316 mg)溶解於水(10 mL)中,添加Suc-Ala-Ala-Arg-MCA_Pmcs(330 mg,0.4 mmol),並藉由NaHCO3
(43 mg,1 mmol)來中和三氟乙酸鹽。進而添加N-羥基丁二醯亞胺(HOSu,50 mg,0.4 mmol)與1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)-碳二醯亞胺_HCl(EDC,200 mg,1 mmol),並如上述(4)般進行反應。獲得343 mg之5Gk62A64-Suc-Ala-Ala-Arg-MCA乙酸鹽。
實施例3
3.使用本發明之基質之血清中類胰蛋白酶之活性測定
使用實施例2中所製備之鍵結有Suc-Ala-Ala-Arg-MCA之聚(L-離胺酸),試驗是否能夠特異性地測定血清中之類胰蛋白酶活性。
(1)使鍵結有Suc-Ala-Ala-Arg-MCA之聚(L-離胺酸)20.0 mg溶解於50 mM Tris-HCl(pH值8.0)50 mL中。
(2)將市售人血清2 μL(BioWest公司製造)與PBS(Phosphate Buffered Saline,磷酸鹽緩衝液)(-)(pH值7.4)2 μL(對照)或10 μM萘莫司他(類胰蛋白酶抑制劑,東京化成工業股份有限公司製造)2 μL或10 U/mL水蛭素(凝血酶抑制劑,Sigma-Aldrich公司製造)2 μL加以混合,於室溫下經過10分鐘後,將各混合溶液添加至上述(1)中所製備之溶液100 μL中,直接測定酵素活性。
將結果示於以下之表3。
[表3]
添加各種抑制劑之人血清酵素活性之比較 | |
反應液 | 酵素活性*1 |
血清+PBS(-) | 100 |
血清+萘莫司他 | 0 |
血清+水蛭素 | 83 |
*1 將血清+PBS(-)之酵素活性設為100之情形時之相對值。 |
根據表3,藉由本發明之高分子基質所檢測出之血清中之酵素活性完全被類胰蛋白酶抑制劑即萘莫司他所抑制,與之相對,未被凝血酶抑制劑即水蛭素所抑制。根據此處之結果,顯示藉由本發明之高分子基質所檢測出之血清中之酵素活性係利用類胰蛋白酶者,即便為凝血酶等凝血系統酵素以被α2巨球蛋白四聚體捕獲之狀態存在之血清樣本,亦能夠特異性地測定類胰蛋白酶活性。
[產業上之可利用性]
根據本發明,能夠不對血液樣本進行純化、濃縮等預處理而直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性。因此,能夠藉由會更準確地反映病情之類胰蛋白酶活性來判定在此之前僅藉由類胰蛋白酶蛋白質相關抗原之血中存在量來判定之肥大細胞活化症候群,因此醫療領域中之產業上之可利用性較高。
Claims (10)
- 一種類胰蛋白酶活性測定用基質,其包含選自以下式(1)~(3)中之於C末端上肽鍵結有色素標記之三肽(三肽-X), (1)Lys-Ala-Arg-X (2)Ala-Ala-Arg-X (3)Abu-Ala-Arg-X (式中,X為螢光特性或顯色特性會因與Arg之肽鍵被切斷而產生變化之色素標記,Abu為2-胺基丁酸)。
- 如請求項1之類胰蛋白酶活性測定用基質,其用於直接測定血液樣本中之類胰蛋白酶活性。
- 如請求項1或2之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中於分子量5,000以上之類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物上鍵結有三肽-X之N末端。
- 如請求項3之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中類胰蛋白酶難消化性水溶性聚合物為聚胺基酸。
- 如請求項4之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中聚胺基酸選自聚(L-離胺酸)、樹枝狀聚(L-離胺酸)、聚(D-離胺酸)、樹枝狀聚(D-離胺酸)、聚(L-鳥胺酸)及聚(D-鳥胺酸)。
- 如請求項1至5中任一項之類胰蛋白酶活性測定用基質,其中色素標記為選自MCA基、ANS基、CMCA基、FMCA基、AMP基、若丹明110基、若丹明110單醯胺基、若丹明6G基及若丹明B基中之螢光色素標記。
- 一種血液樣本中之類胰蛋白酶活性之測定方法,其特徵在於具備以下之步驟(A)及(B): (A)使如請求項1至6中任一項之類胰蛋白酶活性測定用基質與血液樣本接觸之步驟; (B)於上述步驟(A)後,藉由測定色素標記之螢光特性或顯色特性之變化量,算出上述血液樣本中之類胰蛋白酶活性之程度的步驟。
- 如請求項7之方法,其中血液樣本為血清。
- 一種血液樣本中之類胰蛋白酶活性測定用套組,其特徵在於包含:如請求項1至6中任一項之類胰蛋白酶活性測定用基質。
- 如請求項9之套組,其中血液樣本為血清。
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