ES2226240T3

ES2226240T3 - Empleo de reactivo derivatizados, en procedimientos de deteccion por quimioluminiscencia y electroquimiluminiscencia.

Info

Publication number: ES2226240T3
Application number: ES99112194T
Authority: ES
Inventors: Martin Egger; Hans-Peter Josel; Gabriele Punzmann
Original assignee: Roche Diagnostics GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1998-06-25
Filing date: 1999-06-24
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2019-06-24
Also published as: ATE274702T1; DE59910326D1; EP0973035A1; US6281021B1; EP0973035B1; DE19828441A1; JP2000028609A

Abstract

La detección de analitos utiliza reactivos de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia protegida de la oxidación. Un procedimiento para la detección de analitos en una muestra que utiliza la quimioluminiscencia o la electroquimioluminiscencia, consiste en poner en contacto la muestra con un ractivo de prueba, que comprende una etiqueta de quimioluminiscencia o electrolquimioluminiscencia acolada a un receptor específico de analito y otros componentes de prueba. Los componentes susceptibles de oxidación de los compuestos de prueba están protegidos por derivación. La invención se refiere también a lo siguiente: (1) un kit que comprende los reactivos utilizados para el nuevo procedimiento; y (2) un conjugado de etiqueta como el anterior.

Description

Empleo de reactivos derivatizados, en procedimientos de detección por quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia.

La invención se refiere a un procedimiento para la detección de un analito en una muestra mediante quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia mediante el empleo de reactivos de ensayo derivatizados. Además, se dan a conocer nuevos reactivos y kits de reactivos para procedimientos de detección por quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia.

La detección de analitos mediante quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia es ya conocida. Así, la patente EP-A-0 178 450 da a conocer conjugados de complejos de rutenio con materiales inmunológicamente activos, los cuales se emplean como reactivos en procedimientos de detección por quimioluminiscencia. Los complejos de rutenio contienen tres ligandos iguales o diferentes bi- o policíclicos con por lo menos dos heterociclos que contienen nitrógeno, en donde por lo menos uno de estos ligandos está substituido con por lo menos un grupo hidrosolubilizante como el -SO_{3}H ó -COOH, y en donde por lo menos uno de estos ligandos está substituido directamente por lo menos con un grupo reactivo como el -COOH o mediante un grupo espaciador, y en donde los ligandos están unidos al rutenio mediante átomos de nitrógeno.

Además, el empleo de complejos metálicos como reactivos marcadores para un procedimiento de detección electroquimioluminiscente es ya conocido (ver p. ej., las patentes EP-A-0 580 979, W 87/06706, US 5.238.108 ó US 5.310.687). Un tal procedimiento de detección por quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia se basa en que el átomo central del complejo metálico, p. ej., el rutenio, se puede convertir por medios químicos o electroquímicos, en un dispositivo de medición apropiado, mediante un proceso consumidor de energía, p. ej., por transferencia de electrones de un cosubstrato como por ejemplo un radical tripropilamina al estado excitado del triplete MLCT. De este estado excitado se puede relajar al estado original mediante la emisión de un fotón, mediante el paso prohibido triplete-singulete (ver p. ej., la patente WO 90/05296; Leland y Powell, J. Electrochem. Soc. 137 (1990), 3127-3131; Blackburn et al., Clin. Chem. 37 (1991), 1534-1539). Sin embargo, este mecanismo de reacción está sujeto, en función de las condiciones y durante la fase de medición, a múltiples inconvenientes. Así, pueden originarse reacciones secundarias que disminuyen el rendimiento de luz, hasta la completa extinción de la misma.

Sorprendentemente, se descubrió en el marco de la presente invención, que grupos químicos fácilmente oxidables de los componentes del reactivo de ensayo p. ej., grupos amino libres, pueden ocasionar inconvenientes a la reacción luminiscente. Ensayos efectuados por los inventores muestran que los grupos que causan inconvenientes a este respecto, pueden estar presentes sobre la molécula que lleva el grupo marcador quimioluminiscente o sobre moléculas separadas.

Los inventores descubrieron que estos grupos oxidables que causan inconvenientes en la reacción de detección por quimioluminiscencia pueden ser bloqueados mediante derivatización química ("capping") ("formación de un casquete") y convertirse de este modo en inaccesibles para una reacción química o electroquímica, sin que aparezcan al mismo tiempo insospechadas pérdidas de sensibilidad en el procedimiento de detección. En particular, es sorprendente y nuevo, el descubrimiento experimental de que compuestos derivatizados, en particular aquellos que llevan un gran número de grupos marcadores de quimioluminiscencia, emiten más luz que los correspondientes compuestos sin derivatizar, y que en un procedimiento de detección por electroquimioluminiscencia, la parte de corriente anódica catalítica de los compuestos derivatizados, conduce a una disminución indeseada de la señal de medición, la cual en los compuestos derivatizados es menor que en los compuestos no derivatizados. Así, pueden lograrse importantes ventajas mediante el empleo de reactivos de ensayo derivatizados en los procedimientos de detección por quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia.

Un objeto de la invención es por ello un procedimiento para la detección de un analito de una muestra mediante quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia, en donde la muestra se pone en contacto con un reactivo de ensayo, el cual contiene un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia copulado con un receptor específico del analito y otros componentes de ensayo, y en donde dicho procedimiento se caracteriza porque grupos químicos oxidables del receptor marcado o/y otros componentes de ensayo, están protegidos por lo menos parcialmente mediante derivatización.

El procedimiento según la invención puede ser un procedimiento por quimioluminiscencia, es decir, en el que mediante medios químicos se origina una señal que sale del grupo marcador. De preferencia el procedimiento es un procedimiento por electroquimioluminiscencia, en el cual la señal luminosa que sale del grupo marcador se genera por medios electroquímicos. Un procedimiento de detección por electroquimioluminiscencia puede efectuarse en dispositivos de medición ya conocidos, que por ejemplo presentan una cámara de medición para la inserción de un electrodo de medida, medios para la conducción y desviación de líquidos a partir de la cámara de medición y medios para la detección de la electroquimioluminiscencia generada en la cámara de medición. Además, el dispositivo puede tener de preferencia medios magnéticos para la inmovilización de partículas magnéticas en el líquido de muestra en el electrodo de medición. Esta clase de dispositivos de medición están descritos por ejemplo por N.R. Hoyle: "The Application of Electrochemiluminiscence to Immunoassay-based Analyte Measurement" ("Aplicación de la electroquimioluminiscencia a la medición de analitos basada en un inmunoensayo") en "Bioluminiscencia y Quimioluminiscencia"; Proceedings of the 8th International Symposium on Bioluminiscence and Chemiluminiscence ("Procedimientos del 8º simposio internacional sobre bioluminiscencia y quimioluminiscencia"), Cambridge, Septiem-bre 1994, A.K. Campbell et al., (Hrsg.), John Wiley & Sons, así como en WO89/10551 ó WO90/11511.

El procedimiento según la invención comprende el empleo de reactivos de ensayo en los cuales grupos químicos oxidables, que ocasionan inconvenientes en la reacción de detección por quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, se protegen por lo menos parcialmente, mediante deriva-tización, es decir se convierten, en las condiciones del ensayo, en grupos no oxidables o mucho menos oxidables. Los grupos químicos oxidables se escogen por ejemplo entre grupos amino primarios, grupos amino secundarios, bases de Schiff, grupos tioles, grupos acetales y grupos cetales. Particularmente preferidos son los grupos amino primarios y/o secundarios alifáticos o aromáticos, en particular los alifáticos.

La derivatización de los grupos oxidables puede efectuarse mediante métodos de por sí ya conocidos. Un método particularmente preferido de la derivatización es la acilación, en particular en el caso de grupos amino primarios o secundarios. Otros métodos de la derivatización comprenden por ejemplo la formación de imida, p. ej., la introducción de un grupo ftalimido (a partir del anhídrido ftálico o del cloruro de O-metoxicarbonil-benzoilo ó N-etoxicarbonilftalimida), la formación de carbamato (carbamoilación) y en particular la sulfonilación (p. ej., la introducción de grupos benzolsulfonamida o respectivamente grupos p-toluen-sulfonamida). Además, es también posible la formación de sales de amonio cuaternario.

Para la acilación pueden emplearse reactivos de acilación ya conocidos como por ejemplo el cloruro del ácido carbónico, el anhídrido o los ésteres activos. Se prefieren los anhídridos o/y los ésteres activos. Son particularmente preferidos los ésteres activos como por ejemplo, el éster de N-hidroxisuccinimida, ante todo derivados solubles de los mismos, p. ej., radicales de ácido sulfónico. Además, entran también en cuestión los ésteres p-nitrobencilo del ácido acético. Respecto a loa grupos acilo empleados para la derivatización, se trata de preferencia de grupos acilo de cadena corta como por ejemplo, radicales acetilo o propionilo. Por otro lado, se prefiere el empleo de grupos hidrófilos, p. ej., hidroxilo, radicales acilo que llevan grupos éter o ácido carboxílico, como por ejemplo radicales tartrilo o succinilo o radicales acilo modificados con polietilenglicol.

Las substancias derivatizadas según la invención son habitualmente substancias biológicas, como las empleadas como componentes de ensayo en procedimientos de detección para la determinación de analitos. Por ejemplo, las substancias derivatizadas pueden escogerse del grupo formado por células, virus, partículas subcelulares, proteínas, lipoproteínas, glucoproteínas, péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, oligosacáridos, polisacáridos, lipopolisacáridos, metabolitos celulares, haptenos, hormonas, substancias activas farmacológicas, alcaloides, esteroides, vitaminas y aminoácidos. De preferencia, las substancias derivatizadas se escogen del grupo formado por péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, como por ejemplo ácidos nucleicos peptídicos (PNA), azúcares y haptenos, es decir, moléculas orgánicas con un peso molecular de 150 a 2000. Particularmente preferidos son las substancias derivatizadas escogidas de polipéptidos como por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Como grupos marcadores de quimioluminiscencia o electro-quimioluminiscencia se emplean de preferencia los complejos metálicos con una estructura de fórmula general (I):

(I)M_{n} (L_{1}L_{2}L_{3})_{m}

en donde

M: es un catión metálico di o trivalente escogido de las tierras raras y cationes de metales de transición como por ejemplo rutenio, osmio, renio, iridio, rodio, platino, indio, paladio, molibdeno, tecnético, cobre, cromo, wolframio, itrio o lutecio,

L_{1}, L_{2}, y L_{3} son iguales o diferentes y son ligandos con por lo menos 2 heterociclos que contienen nitrógeno, p. ej., heterociclos aromáticos como bipiridilo, bipirazilo, terpiridilo o fenantronilo, y

n y m: son independientemente entre sí, números enteros de 1 a 10, de preferencia de 1 a 3.

Cationes metálicos particularmente preferidos son el rutenio, iridio, renio, cromo y osmio. El más preferido es el rutenio. Para equilibrar la carga, el complejo metálico puede todavía contener eventualmente iones contrarios, p. ej., aniones. Además, se prefiere que n y m sean 1 en cada caso. Los ligandos del complejo se escogen con particular preferencia entre los sistemas anulares de la bipiridina y fenantrolina.

Se obtienen resultados particularmente buenos, en particular en el procedimiento por electroquimioluminiscencia, con complejos metálicos, que presentan por lo menos un grupo hidrófilo o/y un soporte de la carga (el cual es distinto del catión metálico) en el complejo. Ejemplos de tales soportes de carga son los grupos fosfato-, fosfonato-, sulfonato- y carboxilato-, en donde los grupos sulfonato y carboxilato son particularmente preferidos. Ejemplos de grupos hidrófilos apropiados son las unidades alquilenoxi- de 2 a 3 átomos de carbono, las unidades alquilentio- de 2 a 3 átomos de carbono y las unidades polihidroxilo. Esta clase de hidrófilos o/y complejos metálicos cargados se describen en las patentes EP-A-0 178 540, WO 96/03409 y WO96/03410.

La obtención de tales complejos metálicos puede efectuarse según métodos ya conocidos, por ejemplo mediante la reacción de una sal metálica, p. ej., de un haluro metálico, y eventualmente el subsiguiente intercambio del ión haluro por los grupos hexafluorfosfato, trifluoracetato o tetrafluorborato. El complejo metálico se copula a continuación mediante procedimientos ya conocidos, con la substancia biológica. Los conjugados resultantes pueden emplearse a continuación como reactivos de detección.

El procedimiento según la invención comprende la determinación de un analito en una muestra. La muestra es de preferencia una muestra biológica y está presente en una forma líquida. Puede proceder de tejidos humanos, animales o vegetales, líquidos corporales, cultivos celulares procariónticos o eucariónticos, etc. Para la determinación de los correspondientes analitos, se añaden a estas muestras los reactivos de ensayo necesarios, los cuales contienen un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia copulado con una substancia biológica así como otros componentes de ensayo, como ya es sabido por el experto.

El procedimiento según la invención comprende la determinación de un analito mediante la reacción con uno o varios receptores específicos del analito, del reactivo de ensayo. Esta reacción es de preferencia una acción recíproca de alta afinidad, p. ej., una reacción antígeno-anticuerpo, una reacción de hibridación de un ácido nucleico o/y una reacción azúcar-lectina. De preferencia, el procedimiento según la invención es un procedimiento inmunológico o un procedimiento de hibridación de un ácido nucleico.

El procedimiento de detección puede efectuarse como ensayo homogéneo, es decir, por medición de la quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia en fase líquida. De preferencia, sin embargo, se efectúa un ensayo heterogéneo, en el cual se inmoviliza la marca de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia en una fase sólida, p. ej., una fase sólida particular como por ejemplo microperlas magnéticas p. ej., microperlas recubiertas de estreptovidina, o partículas coloidales, y la presencia o/y la cantidad de analito se determina por la marca inmovilizada en la fase sólida. En la ejecución de un ensayo heterogéneo el procedimiento comprende el llamado paso de comienzo y lavado, en los cuales la fase sólida es inmovilizada en primer lugar en el electrodo y a continuación tiene lugar la separación del resto de componentes de la muestra que no se han unido.

La invención se funda en el empleo de uno o varios componentes del ensayo derivatizados, en la determinación de un analito por quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia. En una versión particularmente preferida, el receptor específico del analito que lleva el grupo marcador de la quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, se utiliza en forma derivatizada. En el caso de este receptor se trata de un conjugado, de preferencia covalente, de una substancia biológica con uno o varios grupos marcadores. La substancia biológica del conjugado es "específica del analito", es decir puede tener lugar directamente una acción recíproca específica con el analito u otro receptor específico del analito (ensayo sandwich), o bien puede tratarse de un análogo del analito (ensayo competitivo). El receptor específico del analito puede llevar uno o varios grupos marcadores. Particularmente preferido es el empleo del receptor específico del analito en una forma altamente marcada, es decir, que lleva por lo menos 5, con particular preferencia 10, grupos marcadores por molécula de substancia biológica.

Alternativa o adicionalmente para la derivatización del receptor específico del analito marcado, pueden emplearse también otros componentes de ensayo en forma derivatizada. Entre estos otros componentes de ensayo se cuentan receptores específicos del analito sin marcar, recubrimientos de la fase sólida y -en tanto existan- substancias eliminadoras de interferencias. Los receptores específicos del analito sin marcar son por ejemplo substancias, que son necesarias en un ensayo sandwich para la inmovilización del analito en una fase sólida, o receptores libres que directamente pueden actuar recíprocamente con el analito, y al cual a continuación se une de nuevo el receptor marcado. En el caso de recubrimientos de la fase sólida puede tratarse de polipéptidos como por ejemplo anticuerpos o estreptavidina. En el caso de emplear reactivos eliminadores de interferencias, por ejemplo anticuerpos no específicos, pueden emplearse también éstos, en forma derivatizada.

La derivatización de substancias biológicas puede lograrse estadísticamente, pero también selectivamente. Una derivatización estadística de grupos oxidables se emplea a menudo con éxito en macromoléculas como por ejemplo polipéptidos, p. ej., anticuerpos. Para ello, la substancia biológica con el reactivo de derivatización, p. ej., un reactivo de acilación, se pone en contacto con una cantidad adecuada en condiciones adecuadas para lograr un deseado grado de derivatización, el cual por una parte produce una importante mejora de la señal de medición de la quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia durante el procedimiento de detección, pero por otra parte no genera ningún inconveniente significativo para la realización del ensayo de la substancia biológica, p. ej., en la especificidad del analito, capacidad de eliminar interferencias, etc. Las condiciones de la reacción, que conducen a un grado adecuado de derivatización de la substancia biológica, pueden ser determinadas sin dificultad por el experto.

Por otra parte, puede lograrse también una derivatización selectiva de los componentes de ensayo. A este respecto, se derivatizan selectivamente determinados grupos selectivos de la substancia biológica. Esta forma de proceder entra en consideración en particular en pequeñas substancias biológicas, como por ejemplo haptenos, péptidos, pero también en ácidos nucleicos o análogos de ácidos nucleicos. Pueden realizarse por ejemplo reacciones selectivas de derivatización, en procedimientos de síntesis química de péptidos, ácidos nucleicos o ácidos nucleicos peptídicos, de manera fácil mediante el empleo de estrategias adecuadas de grupos de protección o respectivamente mediante el empleo de elementos fundamentales de monómero derivatizados en las posiciones deseadas en cada caso.

Otro objeto de la presente invención es un kit de reactivos para la detección de un analito, el cual kit contiene:

(a) un receptor específico del analito, el cual lleva por lo menos un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, y

(b) otros componentes de ensayo,

caracterizado porque los grupos químicos oxidables del receptor marcado o/y de otros componentes de ensayo, están protegidos mediante derivatización.

Los otros componentes de ensayo comprenden substancias biológicas que de preferencia se escogen entre receptores específicos del analito sin marcar, recubrimientos de la fase sólida o/y substancias eliminadoras de interferencias. Una o varias substancias del grupo compuesto del receptor específico del analito y estos otros componentes de ensayo, están presentes en forma derivatizada. De preferencia, por lo menos el receptor específico del analito marcado, está derivatizado. El kit de reactivos según la invención puede emplearse en un procedimiento para la detección de un analito, en particular en un procedimiento citado anteriormente.

Todavía otro objeto de la invención es un conjugado de una substancia biológica con por lo menos un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, el cual se caracteriza porque los grupos químicos oxidables de la substancia biológica están protegidos mediante derivatización.

Además, la invención se aclara mediante los siguientes ejemplos y figuras. En ellos se muestra:

Figuras 1 y 2. Los resultados de mediciones ciclovoltamétricas en anticuerpos marcados con rutenio, derivatizados y sin derivatizar.

Figuras 3 y 4. El tamaño de las señales de medición de la electroquimioluminiscencia en anticuerpos marcados con rutenio, derivatizados y sin derivatizar, en un sistema de ensayo heterogéneo y otro homogéneo.

Ejemplos 1. Preparación de los reactivos

Se prepararon conjugados de anticuerpos anti-T4-IgG de oveja, y biotina, así como el complejo de rutenio (bipi-ridil)_{3} (Rubpyl), en diferentes grados de biotinación y rutenación.

Biotinación

Se disolvió inmunoglobulina (IGG) en fosfato de potasio 0,1 M, pH 8,4 a una concentración de 10 mg/ML. Por 1 ml de solución, se añadió la cantidad molar necesaria para la estequiometría escogida del éster de N-hidroxisuccinimida del ácido biotina-\varepsilon-amino-caprónico disuelto en 50 \mul de sulfóxido de dimetilo anhidro. Después de 90 minutos de agitación a 25ºC se interrumpió la reacción mediante la adición de 10 \mumoles de lisina por 1 ml de mezcla. A continuación se dializó a 4ºC frente a 25 mM de fosfato de potasio/50 mM de NaCl, pH 7,0 y se liofilizó el correspondiente IGG biotinado (IGG-BI).

Rutenación

El IGG-BI liofilizado (con el grado de biotinación escogido) se disolvió en fosfato de potasio 0,15 M/NaCl 0,15 M, pH 7,8 a una concentración de 10 mg/ml. Por 1 ml de solución se añadió la cantidad molar necesaria para la estequiometría escogida de rutenio (2,2'-bipiridil)_{2}(4-[3-(N-hidroxisuccinimidil-carboxi)propil]-4'-metil-2,2'-bipiridina, disuelta en 50 \mul de dimetilsulfóxido anhidro, y se agitó durante 90 minutos a 25ºC.

Para las variantes de los conjugados sin acetilar, se interrumpió directamente la reacción mediante la adición de 10 \mumoles de lisina por 1 ml de solución. Para las variantes de conjugados acetilados, se añadió por 1 ml de solución, 2,35 \mumoles de acetil-N-hidroxisuccinimidaéster (disuelto en 50 ml de dimetilsulfóxido anhidro) (relación molar entre reactivo de acetilación y IGG = 35:1) y se agitó otros 45 minutos a 25ºC. A continuación se interrumpió la reacción con lisina como se ha mencionado más arriba.

Ambos tipos de conjugados se dializaron frente a fosfato de potasio 25 mM/NaCl 0,15 M, pH 7,0 y a continuación se liofilizaron.

Se prepararon lotes con un grado de biotinación de 1:2,5 y un grado de rutenación de 1:2,5 (A), 1:5 (B), 1:12 (C) y 1:25 (D) así como con un grado de biotinación de 1:7,5 y un gra-do de rutenación de 1:2,5 (E), 1:5 (F), 1:12 (G) y 1:25 (H). Los correspondientes lotes acetilados se designaron con "ac".

Los datos de análisis de estos lotes de anticuerpos están representados en la siguiente tabla 1:

TABLA 1 Grado de biotinación 1:2,5

1

Grado de biotinación 1:7,5

2

Grado de biotinación 1:2,5; grado de acetilación 1:35

3

Grado de biotinación 1:7,5; grado de acetilación 1:35

4

La cantidad total de proteínas de la mezcla (suma de proteínas) se determinó con el reactivo BCA de Pierce de acuerdo con los datos de preparación.

R/N significa el promedio del número de complejos de rutenio por 1 molécula de IGG.

R significa la cantidad (nmoles) de complejo de rutenio en 1 ml de solución y se calcula a partir de la extinción que figura en la tabla (\varepsilon 455 nm) dividiendo por el coeficiente de extinción 13,7 para el complejo.

N significa la cantidad (n moles) de IGG en 1 ml de solución y se calcula a partir del valor Prot. BCA indicado en la tabla (mg de proteína IGG por 1 ml de solución) dividiendo por el factor de peso molecular 150 para IGG.

2. Medición del ciclo de voltametría del conjugado de anticuerpos

Las condiciones de la medición fueron como sigue: electrodo de trabajo: vidrio-carbón con un diámetro de 3 mm; contraelectrodo: Pt; electrodo de referencia: Ag/AgCl en KCl 3M; 100 mV/s; temperatura ambiente.

5 mg del conjugado de anticuerpo se disolvieron en 1 ml de tampón de fosfato (KH_{2}PO_{4} 0,1 M + KOH 0,1 M, pH 7).

La comparación entre el conjugado acetilado (Hac y Dac) y los correspondientes conjugados no acetilados (H y D), se muestra en las figuras 1 y 2. De las mismas se deduce que la corriente de oxidación disminuye después de la acetilación, es decir el efecto catalítico por los grupos oxidables, p. ej., los grupos amino libres, queda bloqueado mediante la acetilación. El pico de reducción de la figura 2 está algo más fuertemente destacado.

De estos datos puede deducirse que en un procedimiento por electroquimioluminiscencia se logra una parcial oxidación de los grupos amino libres en las substancias biológicas mediante el catión metálico, p. ej., rutenio (III), y que este comportamiento, mediante una derivatización por medio de acetilación, puede quedar bloqueado de nuevo.

3. Influencia de la acetilación sobre la señal de medición

El estudio se efectuó con los conjugados obtenidos en el ejemplo 1 en un ensayo homogéneo y en un ensayo heterogéneo (presencia de microperlas recubiertas con estreptavidina) en un aparato en serie Elecsys®2010.

Ejecución del ensayo

Los conjugados de la tabla 1 se disolvieron a una concentración de 125 ng/ml en Elecsys®ProCell (tampón de fosfato 0,3 M + tripropilamina 0,18 M + 0,1% de detergente. pH 6,8).

Esta soluciones se emplearon sin diluir, en un ensayo homogéneo y se midieron.

En un ensayo heterogéneo, se incubaron a 37ºC, 15 \mul de las soluciones de conjugados con 185 \mul de una suspensión de perlas de 136 \mug de perlas recubiertas con estreptavidina/ml durante 9 minutos. Después de una separación de las perlas no unidas, se midieron las perlas.

Las dos aplicaciones se efectuaron en un aparato Elecsys®2010.

Como resultado de estas investigaciones se comprobó que en particular en los conjugados altamente biotinados (E a H) se encuentra un aumento significativo de la señal de medición debido a la acetilación. En los conjugados poco biotinados (A a D) este efecto es menos marcado.

Además, se encontró que un conjugado no acetilado, tanto en el ensayo homogéneo como en el heterogéneo, a partir de un grado de rutenación mayor de 1:12 ya no suministra ninguna señal de medición más alta. Mediante la formación de un casquete se puede lograr una significativa elevación de la señal de medición.

El resultado de estas investigaciones está compendiado en las figuras 3 (ensayo heterogéneo) y 4 (ensayo homogéneo).

Claims

1. Procedimiento para la detección de un analito en una muestra mediante quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia, en donde la muestra se pone en contacto con un reactivo de ensayo, el cual contiene por lo menos un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia copulado con un receptor específico del analito y otros componentes,

caracterizado porque,

los grupos químicos oxidables del receptor marcado o/y otros componentes de ensayo están protegidos mediante derivatización.

2. Procedimiento según la reivindicación 1,

caracterizado porque,

los grupos químicos oxidables se escogen entre grupos amino primarios, grupos amino secundarios, bases Schiff, grupos tiol, grupos acetal y grupos cetal.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

la derivatización tiene lugar mediante una acilación.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

las substancias derivatizadas se escogen entre los péptidos, polipéptidos, ácidos nucleicos, análogos de ácidos nucleicos, azúcares y haptenos.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

los grupos marcadores se escogen a partir de complejos metálicos con una estructura de fórmula general (I):

(I)M_{n}(L_{1}L_{2}L_{3})_{m}

en donde

M: es un catión metálico di o trivalente escogido entre las tierras raras y cationes de metales de transición,

L_{1}, L_{2} y L_{3} son iguales o diferentes y son ligandos con por lo menos 2 heterociclos que contienen nitrógeno, y

n y m: son independientemente entre sí, números enteros de 1 a 10.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

se efectúa como un ensayo heterogéneo, en donde la marca se inmoviliza en una fase sólida y la presencia o/y la cantidad del analito se determina mediante la marca inmovilizada en la fase sólida.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

se emplea un receptor específico del analito, sin marcar, en una forma derivatizada.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

se emplea un revestimiento de la fase sólida en una forma derivatizada.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado porque,

se emplea un reactivo de eliminación de interferencias, en una forma derivatizada.

10. Kit de reactivos para la detección de un analito, el cual contiene:

(b) otros componentes de ensayo,

caracterizado porque,

los grupos químicos oxidables del receptor marcado o/y de otros componentes de ensayo, están protegidos mediante derivatización.

11. Empleo de un kit de reactivos según la reivindicación 10, en un procedimiento para la detección de un analito.

12. Conjugado de una substancia biológica y por lo menos de un grupo marcador de quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia,

caracterizado porque,

los grupos químicos oxidables de la substancia biológica están protegidos mediante derivatización.