DD274098A1 - Immunenzymometrisches verfahren zur quantitativen bestimmung des isoenzyms bb der humanen glykogenphosphorylase b - Google Patents

Immunenzymometrisches verfahren zur quantitativen bestimmung des isoenzyms bb der humanen glykogenphosphorylase b Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein immunenzymometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Isoenzyms BB der humanen Glykogenphosphorylase b (EC 2.4.1.1.) fuer die medizinische Diagnostik von Herzmuskelerkrankungen. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass zwei monoklonale Antikoerper (mAk) gegen das Isoenzym BB der humanen Glykogenphosphorylase b verwendet werden, wobei diese zwei am Enzymmolekuel entfernt voneinander gelegene antigene Determinanten erkennen und binden. Einer der mAk wird an die feste Phase gebunden und mit der das Enzym in unbekannter Menge enthaltenden Probe in Reaktion gebracht. Anschliessend wird nach Bindung des zweiten mAk, der an ein Markerenzym gekoppelt ist, das gebundene Isoenzym BB der humanen Glykogenphosphorylase b ueber die Enzymaktivitaet des Markerenzyms quantitativ bestimmt. Das erfindungsgemaesse Testsystem erlaubt die quantitative Bestimmung des Isoenzyms BB der humanen Glykogenphosphorylase b mit hoher Empfindlichkeit selbst in Gegenwart hoher Konzentrationen des Isoenzyms MM, da alle eingesetzten mAk keine Kreuzreaktivitaet mit dem Isoenzym MM zeigen.

Description

paarweise eingesetzt werden, wobei man den von dem jeweils erstgonannten Klon produzierten monoklonalen Antikörper an der festen Phase adsorbiert, mit der Isoenzym-BB-haltigen Probe inkubiert, den vom zweiten Klon des jeweiligen Paares produzierten monoklonalen Antikörper, der enzymmarkiert wurde (Antikörper-Enzym-Konjugat), hinzufügt und die Enzymaktivität photometrisch, fluorometrisch oder luminometrisch in üblicher Weise mißt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Inkubation mit der Isoenzym-BB-haltigen Probe und das Hinzufügen des Antikörper-Enzym-Konjugats nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die monoklonalen Antikörper als Fab-Fragmente oder als Derivate eingesetzt werden.
Hierzu 1 Seite Abbildung
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung von quantitativen Bestimmungen des Isoenzyms BB der humanen Glykogenphosphorylase b, das für die medizinische Diagnostik und die Enzymtechnik benötigt wird.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Glykogenphosphorylase b (EC 2.4.1.1.) kommt im menschlichen Organismus vorzugsweise im Skelett- und Kerzmuskel sowie in der glatten Muskulatur, der Leber und in Leukozyten vor und kann in die Isoenzyme B, M, L unterteilt werden. Die natürlicherweise auftretenden Dimera der Glykogenphosphorylase haben entsprechend die Zusammensetzung BB, MM, LL und ge'wisse Mischformen. Für den Herzmuskel typisch ist das Isoenzym BB, obwohl auch MM in geringer Konzentration vorliegt, in Abhängigkeit von der Stoffwechselsituation ist das Enzym aus einer strukturgebundenen Zeilkomponente in ein zytosolisch gelöstes Protein überführbar. Bei entsprechender metabolischer Schädigung des Herzmuskels wird das Enzym aus den Myozyten freigesetzt und erscheint im Blut (SCHULZE, W., E.-G. KRAUSE und A.WOLLENBERGER: J. Mol. Cell. Cardiol. 2, 241-251 [1971 ]; G. RABITZSf. H, E. G. KRAUSE und L. WILL-SHAHAB: Gutachten zur Wertigkeit der Glykogenphosphorylase b in der serologischen Diagnostik des aktuellen Herzinfarktes, Zentralinst, f. Herz-Kreislauf-Forschung der AdW der DDR, 19797).
Dieses Phänomen läßt sich für die Diagnostik ischämischer Herzkrankheiten ausnutzen.
Obwohl diese Tatsache schon lange bekannt war, gehört die Konzentrations.messung der Glykogenphosphorylase b noch nicht zu den diagnostischen Routinemethoden.
Das bisher verwendete Bestimmung^.verfahren beruhte auf dem Nachweis der Enzymaktivität im menschlichen Serum (KRAUSE, E.-G., H.WILL, M.BÖHM, A. WOLLENBERGER: CMn. Chim. Acta 58,145-154 [19751). Dieser Test ist in seiner Durchführung für klinische Routine-Untersuchungen auf Grund seiner Kompliziertheit nicht einsetzbar. Außerdem ist eine Diskriminierung zwischen dem Isoenzym BB und MM nicht möglich, da nicht das Enzym selbs*, sondern seine Aktivität gemessen
Eine Verbesserung der Bestimmungsmethode wurde durch die Einführung der spezifischen Immunhemmung entweder des Isoenzyms BB oder des Isoenzyms MM mittels entsprechender polyklonaler Antikörper des Kaninchens erreicht (RABITZSCH, G„ H.SCHULZ, K.ONNEN.A.KÖSSLER und E.-G.KRAUSE: Biomed. Biochim. Acta 46, S.584-S.598 (1987); RABITZSCH, G.,
A. KÖSSLER und E.-G. KRAUSE: Zeitschr. Laboratoriumstechnik [1988]). Jedoch ist dieser Test nicht empfindlich ienug, beruht auf nicht standardisierbaren Testbestandteilen, wie polygonale Antikörper, und ist als Routinetest ungeeignet. An lere Testverfahren sind nicht bekannt.
Ziel der Erfindung
Die Erfindung hat das Ziel, ein Testverfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem das Isoenzym BB der humanen Glykogenphosphorylase b quantitativ in rationeller Weise spezifisch, schnell und präzis und empfindlich bestimmt werden kann. Dieser Test soll als Routinetest in der medizinischen Diagnostik einsetzbar sein.
Darlegung des Wesens der Erfindung
Erfindungsgemäß wird zur quantitativen Bestimmung des Isoenzyms BB der humanen Glykogenphosphorylase b ein immunenzymometrisches Verfahren nach dem Zwei-Seiten-Bindungsprinzip eingesetzt, wobei ein Paar von zwei monoklonalen Antikörpern, die an zwei räumlich getrennte Epitope des zu bestimmenden Moleküls binden, verwendet wird.
Der erste monoklonal Antikörper wird an die feste Phase der Näpfe von Reaktionsgefäßen aus Plaste oder einem anderen Material, vorrangig Mikrotestplatten aus Polystyrol, für den Festphasen-Immuntest adsorbiert. Zur Verkürzung der Testdauer und zur Qualitätssicherung können unter Verwendunn von Stabilisatoren (Saccharose, Rinderserumalbumin) und Schutzsubstanzen (Bakteriozide, Proteasehemmer) uis zu 2 Jahre im voraus beschichtete Platten eingesetzt werden. In den mit dem ersten Antikörper beschichteten Reaktionsgefäßen werden erfindungsgemäß nach Blockierung der noch freien proteinbindenden Stellen mittels NH2-Gruppen-hnltiger Pufferlösungen und/oder proteinhaltigen Lösungen, wie z.B.
Gelafusal®, zunächst die zu messenden Proben inkubiert und wieder entfernt, dann der zweite Antikörper, mit Meerrettich-Peroxydase nach bekanntem Verfahren markiert (Antikörper-Enzym-Konjugat), zugegeben und inkubiert. Die Inkubation der zu messenden Lösung kann auch gleichzeitig mit der Inkubation des Antikörper-Enzym-Konjugats erfolgen. Die zwischen jedem Inkubationsschritt notwendige Waschung der ReaktionsgefäßB kann mit Leitungswasser erfolgen.
Die Nachweisreaktion erfolgt in üblicher Weise photometrisch mit o-Phenylendiamin und H2O2 oder luminometrisch mit Isoluminol, H2O2 und Verstärkerreagens.
Das Wesen der Erfindung besteht darin, daßfürdenTest jeweilsein Paar von monoklonalen Antikörpern zum Einsatz kommt. Die eingesetzten Paare ermöglichen aur Grund ihrer Eigenschaften, wie Erkennung räumlich getrennt liegender Epitope auf dem Isoenzym BB der humanen Glykogenphosphorylase b, Adsorptionsfähigkeit an festen Phasen, Affinitätsparameter, Konjugierbarkeit mit Markern, eine empfindliche, schnelle, rationell und präzis durchführbare Bestimmung des Isoenzyms BB.
Als erste und zweite Antikörper kommen in diesem immunenzymometrischen Test die natürlichen Produkte (Antikörpermoleküle) der Hybridomzellklone sowie Fragmente oder Derivate dieser Antikörpermoleküle zum Einsatz.
Die Produkte folgender Zellklone lassen sich als Antikörperpaare für das hier beschriebene Bestimmungsverfahren verwenden:
Adsorption an fester Phase - Enzymmarkierung
ZIM-0328 (ZZ-IIID9) - ZIM-0330 (ZZ-IF11)
ZIM-O329(ZZ-IIF11) - ZIM-0330 (ZZ-IF11)
ZIM-0331 (ZZ-IIA2) - ZIM-0328 (ZZ-IIID9)
ZIM-0331 (ZZ-IIA2) - ZIM-0330 (ZZ-IF11)
ZIM-0326 (ZZ-VID 12) - ZIM-0328 (7Z-IIID 9)
ZIM-0326 (ZZ-VID 12) - ZIM-0330 (ZZ-IF11)
ZIM-0326 (ZZ-VID 12) - ZIM-0329 (ZZ-IIF 11)
ZIM-0326 (ZZ-V112) - ZIM-0331 (ZZ-IIA2)
ZIM-0325 (ZZ-IG 12) - ZIM-0328 (ZZ-IÜD9)
ZIM-0325 (ZZ-IG 12) - ZIM-0330 (ZZ-IF11)
Die Hybridomzellklone wurden am 7.7.1988 in der ZIM-Hinterlegungsstelle hinterlegt.
Der jeweils zuerst genannte Antikörper wird vorzugsweise zur Beschichtung der Re; ictionsgefäße und der zweitgenannte Antikörper vor allem zur Markic ^g mit einem Markeronzym verwendet. Die Auswahl der Antikörperpaare örfolgt einerseits nach dem Gesichtspunkt der entfernten Lage der entsprechenden Epitope auf dem quantitativ zu bestimmenden Isoenzym BB de.r humanen Glykogenphosphorylase bund andrerseits auch nach dem Gesichtspunkt der guten Adsorptionsfähigkeit und der leichten Markierbarkeit mit einem Markerenzy m. Als Markerenzym eignet sich besonders Meerrettich-Peroxydase, weil damit die Nachweisreaktion bei Einsatz entsprechender Substrate, wie o-Phenylendiamin, p-Hydroxyphenylpropionsäure oder Isolumuniol, photometrisch, fluorometrisch oder luminometrisch erfolgen kann.
Der beschriebene immunenzymometrische Test beinhaltet bekannte Verfahrensmerkmale, wie das Zwei-Seiten-Bindungsprinzip und die Enzymmarkierung der monoklonalen Antikörper. Der mit dem beschriebenen Test erzielte Nachweis des Isoenzyms BB, die kurzen Testzeiten und vor allem die hohe Spezifität werden durch die erfindungsgemäß eingesetzten und optimal ausgewählten Antikörperpaare erreicht. Mit diesem Bestimmungsverfahren läßt sich auf Grund der fehlenden Kreuzreaktivität der verschiedenen verwendeten Antikörperpaare mit dem Isoenzym MM der humanen Glykogenphosphorylase b das Isoenzym BB auch in Gegenwart hoher Konzentrationen des Isoenzyms MM mit hoher Empfindlichkeit präzis bestimmen. Die erreichbare Nachweisgrenze (Empfindlichkeit) in diesem Testverfahren liegi unter 0,5ng/ml Probe, und der Testbereich erstreckt sich von 0,5ng/ml bis etwa 100ng/ml (siehe Abb.1). Die Erfindung soll an einem Ausführungsbeispiel noch näher erläutert werden.
Ausführunysbeispiel
Immurienzymometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Isoenzyms BB der humanen Glykogenphosphorylase b: Als Reaktionsgefäße werden 96-Napf-Mikrotestplatten verwendet. In die einzelnen Näpfe werden je 100 μΙ des ersten Antikörpers (ZIM-0328) 5 Mg/ml PBS einpipettiert und für etwa 12 Std. bei 4°C stehen gelassen. Anschließend wird die Antikörperlösung entfernt, und die Näpfe der Mikrotestplatten werden mit je 200 μΙ einer Blockierungslösung (Tris-gepufferte Salzlösung: 0,05M Tfis/HCI, pH7,4-0,2 M NaCI-0,1 %Tween 20-0,5% Rinderserumalbumin) gefüllt und für 1 Std. bei Zimmertemperatur zur Absättigung freier proteinbindender Stellen inkubiert und wieder ausgegossen. Danach werden ΙΟΟμΙ einer Standardlösung (biochemisch aufgereinigtes Isoenzym BB der humanen Glykogenphosphorylase b, aus menschlichem Herzmuskel isoliert) bzw. der zu untersuchenden Probe eingefüllt. Die Standardlösung wird entweder in PBS-RSA (0,1SM NaCI-0,02M Na-Phosphatpuffer, pH7,2-0,5% Rinderserumalbumin) oder in Humanserum verdünnt. Die Inkubation erfolgt bei Zimmertemperatur für 1 Std. Nach anschließendem 3maligen Waschen mit H2O werden 50 μΙ des mit Peroxydase markierten zweiten Antikörpers ZIM-0330 (in PBS-RSA-0,1 % Tween 20) eingefüllt und für 1 Std. bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach mindestens 5maligem Waschen mit H2O werden in die einzelnen Näpfe jeweils 200μΙ einer Substratlösung, z.B.
Phosphat (0,2 M Na2HPO4)-Zitrat (0,07 M)-Puffer pH 5,0 o-Phenylendiamin 0,40mg/ml H2O2 0,02%ig
eingefüllt und für 15 Min. bei Zimmertemperatur im Dunkeln belassen. Anschließend werden zum Stoppen der Nachweisreaktion in die Näpfe 50μΙ einer 2,5 N H2SO4 zupipettiert. Die entwickelte Farbintensität in den einzelnen Näpfen wird schließlich photometrisch bei der Wellenlänge von 492 nm gemessen
Aus der gemessenen Extinktion wird an Hand der Standardkurve der Isoenzymgehalt einer Probe ermittelt.

Claims (1)

1. Immurienzymometrisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Isoenzyms BB der humanen Glykoganphosphorylase b nach dem Zwei-Seiten-Bindungsprinzip, gekennzeichnet dadurch, daß die von den folgenden Klonen produzierten monoklonalen anti-lsoenzym-BB-Antikörper
ZZ-IIID9 (ZIM-0328) - ZZ-IF11 (ZIM-0330)oder
ZZ-HF11 (ZIM-0329) - ZZ-IF11 (ZIM-0330)oder
ZZ-IIA2 (ZIM-0331) - ZZ-HID9 (ZIM-0328)oder
ZZ-IIA2 (ZIM-0331) - ZZ-IF11 (Z!M-0330)oder
ZZ-VID12 (ZIM-0326) - ZZ-IIID9 (ZIM-0328) oder
ZZ-VID12 (ZIM-0326) - ZZ-IF11 (ZIM-0330)oder
ZZ-VID12 (ZIM-0326) - ZZ-IIF11 (ZIM-0329) oder
ZZ-VID12 (ZIM-0326) - ZZ-IIA2 (ZIM-0331) oder
ZZ-IG12 (ZIM-0325) - ZZ-IIID9 (ZIM-0328) oder
ZZ-IG12 (ZIM-0325) - ZZ-IF11 (ZIM-0330)
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