ES2204946T3 - Cuantificacion de la actividad de una proteina-quinasa individual. - Google Patents
Cuantificacion de la actividad de una proteina-quinasa individual.Info
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Abstract
SE PROPORCIONA UN METODO PARA CUANTIFICAR LA ACTIVIDAD DE UNA QUINASA DE PROTEINA SELECCIONADA EN UN SUBSTRATO PEPTIDICO. EL SUBSTRATRO PEPTIDICO SE CONJUGA EN UN COMPUESTO DE ENLACE. EL SUBSTRATO PEPTIDICO MODIFICADO SE AÑADE ENTONCES A UNA SOLUCION QUE CONTIENE LA QUINASA DE PROTEINA SELECCIONADA. LA QUINASA DE PROTEINA Y EL PEPTIDO SE INCUBAN CON UNA ETIQUETA DURANTE EL TIEMPO SUFICIENTE PARA FORMAR UN PRODUCTO PEPTIDICO MODIFICADO QUE INCLUYE EL COMPUESTO DE ENLACE Y LA ETIQUETA. EL PRODUCTO PEPTIDICO MODIFICADO SE UNE ENTONCES A UNA MATRIZ QUE TIENE UNA ALTA AFINIDAD CON EL COMPUESTO DE ENLACE. POSTERIORMENTE SE LIMPIA EL PEPTIDO MENCIONADO Y SE MIDE LA QUINASA DE PROTEINA, COMO SE MUESTRA EN EL GRAFICO. TAMBIEN SE FACILITA UN EQUIPO PARA DESARROLLAR ESTE METODO.
Description
Cuantificación de la actividad de una
proteína-quinasa individual.
La invención se dirige a un proceso para
proporcionar un protocolo de ensayo que mida la actividad
enzimática. Más particularmente, la invención se dirige a un proceso
para cuantificar de manera precisa y conveniente la actividad
enzimática de proteína-quinasas y además,
proporcionar un ensayo específico para
proteína-quinasas individuales en presencia de otras
proteína-quinasas.
Una bibliografía de las referencias citadas en
esta aplicación se puede encontrar en la sección que precede a las
reivindicaciones.
Las enzimas son grandes proteínas que catalizan
las reacciones en las células vivas. Las enzimas construyen o
destruyen otras moléculas. Por ejemplo, las enzimas catalizan la
síntesis de grasas a partir de ácidos grasos, forman azúcares
complejos a partir de glucosa y fructosa, y ayudan en la formación
de otras proteínas a partir de aminoácidos. Las enzimas también
invierten el proceso de construcción mediante la ruptura de
estructuras más complejas. Las enzimas son generalmente específicas
a ciertos sustratos para sus reacciones. Por ejemplo, una enzima
individual puede catalizar la reacción en donde sólo está
involucrado un sustrato o puede actuar sobre un grupo de sustratos
relacionados.
En personas sanas, la mayoría de las enzimas se
encuentran dentro de las células. Sin embargo, algunas enfermedades
producen la liberación de las enzimas desde las células muertas a la
sangre. Entonces se pueden medir los niveles elevados de las
enzimas. Un nivel anormal de enzimas en la sangre caracteriza
ciertas condiciones médicas. Por ejemplo, un ensayo de enzima para
niveles anormales de la enzima de creatina-quinasa
en la sangre es apto como un medio de diagnóstico de enfermedad
cardiaca. De manera semejante, enfermedades del hígado o de huesos
se pueden diagnosticar al observar el incremento de los niveles de
la fosfatasa alcalina en el torrente sanguíneo. El cáncer de
próstata se diagnostica mediante los niveles elevados de fosfatasa
ácida en el torrente sanguíneo.
Las enzimas se clasifican en grupos según el tipo
general de reacción que catalizan. La presente invención se refiere
a un grupo específico de enzimas denominadas transferasas, que
catalizan la transferencia de un grupo desde un sustrato a otro. La
presente invención está específicamente dirigida al subgrupo de las
transferasas denominado proteína-quinasas.
La proteína-quinasa es un nombre
genérico para todas las enzimas que transfieren un grupo fosfato a
una proteína. Aproximadamente de tres a cuatro por ciento del genoma
humano contiene información de transcripción para la formación de
proteína-quinasa. En la actualidad, existen hasta
200 proteína-quinasas conocidas. Sin embargo, debido
a que tres a cuatro por ciento del genoma humano es un código para
la formación de proteína-quinasas, pueden existir
varios miles de quinasas distintas y separadas en el cuerpo
humano.
Las proteína-quinasas son enzimas
que catalizan la transferencia del fósforo desde el trifosfato de
adenosina (ATP, del inglés Adenosine Triphosphate) o el trifosfato
de guanosina (GTP, del inglés Guanosine Triphospate) a una proteína
objetivo para producir una proteína fosforilada y difosfato de
adenosina (ADP, del inglés Adenosine Diphosphate) o difosfato de
guanosina (GDP, del inglés Guanosine Diphosphate), respectivamente.
ATP o GTP se hidroliza en primer lugar para formar ADP o GDP y
fosfato inorgánico. El fosfato inorgánico se une entonces a la
proteína objetivo. El sustrato de proteína que es objetivo de la
quinasa puede ser una proteína estructural, localizada en el
material de la membrana tal como una pared celular, u otra enzima
que sea una proteína funcional.
Debido a su relevancia fisiológica, variedad y
omnipresencia, las proteína-quinasas han llegado a
ser una de las familias de enzimas más importantes y más ampliamente
estudiadas en la investigación médica y bioquímica. Los estudios han
mostrado que las proteína-quinasas son reguladores
claves de muchas funciones celulares, incluyendo la transducción de
señales, la regulación transcripcional, el mecanismo de la célula y
la división celular. También se ha mostrado que varios oncogenes
codifican las proteína-quinasas, sugiriendo que las
quinasas juegan un papel en la oncogénesis.
Las proteína-quinasas a menudo se
dividen en dos grupos en base a los residuos de aminoácidos que
fosforilan. El primer grupo, denominado
serina/treonina-quinasas, incluye las
proteína-quinasas dependientes de la AMP cíclica y
de la GMP cíclica, la proteína-quinasa dependiente
de calcio y de fosfolípido, las proteína-quinasas
dependientes de calcio y de la calmodulina, las
caseina-quinasas, las
proteína-quinasas del ciclo de la de división
celular y otras. Estas quinasas son normalmente citoplasmáticas o
asociadas con fracciones particulares de las células, posiblemente
mediante proteínas de anclaje.
El segundo grupo de quinasas, denominadas
tirosina-quinasas son residuos de tirosina
fosforilada. Están presentes en cantidades mucho menores pero juegan
un papel igual de importante en la regulación de la célula. Estas
quinasas incluyen varios receptores para moléculas tales como
factores del crecimiento y hormonas, que incluyen el receptor del
factor del crecimiento epidérmico, el receptor de la insulina, el
receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y otros.
Los estudios han indicado que muchas de las
tirosina-quinasas son proteínas de transmembrana con
sus dominios de receptores situados en el lado exterior de la célula
y sus dominios de quinasa en el interior.
La fosforilación de las proteínas que contienen
serina, treonina y tirosina por las quinasas es importante porque
los productos de proteínas fosforiladas han sido implicados en una
variedad de procesos celulares, que incluyen oncogénesis,
transformación celular, crecimiento celular y exocitosis celular. En
la actualidad, se desarrolla mucha experimentación involucrando a
las quinasas que pueden inhibir el crecimiento del cáncer o promover
la muerte de la célula cancerosa. Determinan la quinasa específica
involucrada en inhibir del crecimiento del cáncer o en promocionar
la muerte de la célula es importante para la sociedad. De este modo,
son extremadamente importantes los avances en reconocer los niveles
de la actividad de la quinasa.
Se hace una referencia a Robyt and White
(1990) incorporado en la presente invención por referencia, para una
descripción general de los métodos para determinar la actividad de
una enzima. Robit y White definen la actividad de una enzima
como la cantidad de reacción que una cierta cantidad de enzima
producirá en un periodo específico de tiempo. La actividad se
determina mediendo de la cantidad de producto producido o de la
cantidad de sustrato usado por unidad de tiempo bajo condiciones de
saturación o elevadas concentraciones del sustrato. Esto se lleva a
cabo normalmente desarrollando un análisis químico del producto o
del sustrato.
Los sustratos que son normalmente utilizados en
un ensayo para la actividad de la quinasa específica incluyen
caseina, que se aísla de la leche; histonas, aisladas de los
terneros; fosfovitina, aislada de las yemas de huevo; proteínas
básicas de mielina, aisladas de médulas espinales de bovino. Estos
sustratos se pueden fosforilar en un ensayo, suponiendo que se ha
elegido la quinasa correcta. Los ensayos que utilizan estos
sustratos para determinar la actividad de la quinasa son bien
conocidos en la técnica anterior.
La mayoría de los métodos actuales de medir la
actividad de la proteína-quinasa se basan en el
método de detección radiactiva. En estos métodos, una muestra que
contiene la quinasa de interés se incuba con activadores y un
sustrato en presencia de
\tau-^{32}P-ATP o
\tau-^{32}P-GTP. A menudo se usa
un sustrato general y barato tal como histona o caseina. Después de
un periodo adecuado de incubación, se detiene la reacción y se
coloca directamente una alícuota de la mezcla de reacción sobre un
filtro que une el sustrato Entonces el filtro se lava varias veces
para eliminar el exceso de ATP libre marcado radiactivamente, y se
mide la cantidad de fosfato radio marcado incorporado al sustrato
mediante un contador de destellos. Este método se usa ampliamente y
proporciona un método preciso para determinar la actividad de la
proteína-quinasa en muestras purificadas y en
bruto.
Babcook et al. (1991) también describe un
ensayo que usa anticuerpos monoclonales y la tecnología de la
inmunofluorescencia para la determinación de las actividades de la
tirosina proteína-quinasa y de la fosfatasa de la
tirosina proteína. El método se desarrollaba utilizando p56^{lck}
o p60^{src}.
Budde et al. (1991) describe una técnica
de ensayo que utiliza sustratos de peptídicos ácidos de
proteína-quinasas. Esta tecnología usa el fósforo
radiactivo colocado en el sustrato que va a ser estudiado. Después
de la actividad de la quinasa, el fosfopéptido se lava mientras que
se fijan el fósforo radiactivo individual, la ATP y la proteína.
Gopalakrishna et al. (1992) describe un
método que utiliza los enfoques convencionales para medir la
actividad de la proteína-quinasa. El método combina
las etapas de incubación y filtraciones necesarias para determinar
la actividad de la proteína-quinasa usando placas
multilaminares con discos de filtración ajustados. En una referencia
relacionada por Chakravarthy et al. (1990), la actividad de
la quinasa C se mide usando sustratos peptídicos selectivos de la
proteína-quinasa C (PKC) incorporando fósforo
radiactivo al sustrato. La radiactividad se mide mediante un
contador de destellos en fase líquida.
Se ha desarrollado un método no radiactivo para
detectar la actividad de la quinasa en el que la fosforilación de la
tirosina se detecta usando anticuerpos de
anti-fosfotirosina (Rijksen et al., 1991).
Después de la incubación de la tirosina-quinasa con
ATP no marcado y un sustrato adecuado, la mezcla de reacción se
somete a un ensayo de transferencia de manchas (dot blot) sobre una
membrana de sifluoruro de polivinildieno (PVDF, del inglés
polyvinyldene Diflouride). El alcance de la fosforilación se
determina por reacción con el anticuerpo de
anti-fosfotirosina, seguido de detección con un
procedimiento de coloración de inmunogold. La cantidad de
fosfotirosina presente se detecta con un densitómetro.
Una desventaja del método de transferencia de
manchas (dot blot) es que está limitado para detectar las
tirosina-quinasas. Los anticuerpos fosfotirosina se
pueden producir debido al tamaño del antígeno. Los intentos para
producir anticuerpos similares a la fosfoserina y fosfotreonina no
han sido empleados de manera exitosa para ensayar proteínas que
contiene fosfoserina y fosfotreonina. Además, el ensayo requiere
varias etapas de incubación y lavado, tomando cada una de ellas una
considerable cantidad de tiempo, lo que da como resultado un tiempo
de realización del ensayo muy extenso. El resultado del ensayo es un
punto coloreado sobre la superficie de transferencia. El punto
coloreado puede limitar la eficacia del intervalo de la muestra del
ensayo y puede requerir al usuario que cuantifique los resultados
finales usando un densitómetro de barrido, que es un componente caro
del equipo y que no está disponible en todos los laboratorios. El
densitómetro debe tener un haz de dimensiones que cubra al menos la
sección transversal del blanco de los puntos generados.
La presente invención proporciona un método de
determinar la presencia de la actividad de una
proteína-quinasa seleccionada, que comprende
conjugar un compuesto de unión a un sustrato peptídico formando un
sustrato peptídico modificado; añadir una suficiente cantidad del
sustrato peptídico modificado a una disolución que contiene la
proteína-quinasa seleccionada; incubar de la
proteína-quinasa con el sustrato peptídico
modificado bajo condiciones en las que la
proteína-quinasa es activa durante un tiempo
suficiente para formar un producto peptídico modificado; y medir la
actividad de la proteína-quinasa.
Además, la presente invención está dirigida a un
kit para determinar la presencia o actividad de una
proteína-quinasa seleccionada que comprende un
recipiente que contiene un sustrato peptídico modificado que tiene
una reactividad específica para la proteína-quinasa
y se modifica mediante reacción química para permitir la
cuantificación; e instrucciones para su uso.
La presente invención también está dirigida a un
kit para determinar la presencia o actividad de
tirosina-quinasa que comprende un recipiente que
contiene un sustrato peptídico modificado elegido del grupo que
consiste en péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7) y análogos y
sus combinaciones; un recipiente que contiene una matriz de unión de
biotina; e instrucciones para su uso.
La presente invención también está dirigida a un
kit para determinar la presencia o actividad de
serina-treonina-quinasas que
comprende un recipiente que a su vez contiene un sustrato peptídico
modificado elegido del grupo que consiste en péptido Promega A
biotinilado (SEQ. ID. 1), péptido Promega B biotinilado (SEQ. ID.
2), péptido Promega C biotinilado (SEQ. ID. 3), péptido Promega D
biotinilado (SEQ. ID. 4), péptido Promega E biotinilado (SEQ. ID.
5), péptido Promega F biotinilado (SEQ. ID. 6), péptido Promega G
biotinilado (SEQ. ID. 7), péptido Promega H biotinilado (SEQ. ID. 8)
y análogos y sus combinaciones; un recipiente que contiene una
matriz de unión de biotina; e instrucciones para su uso.
Además, la presente invención está dirigida a un
método para detectar la presencia o actividad de una
proteína-quinasa seleccionada en un fluido corporal
que comprende hacer reaccionar el fluido corporal con una cantidad
suficiente de un sustrato peptídico biotinilado para formar un
producto peptídico modificado bajo condiciones en las que la
proteína-quinasa es activa durante un tiempo
suficiente para formar el producto peptídico modificado en una
cantidad tal que el producto peptídico modificado se puede detectar
y medir la cantidad de producto peptídico modificado.
La presente invención hace posible un ensayo para
una proteína-quinasa específica en presencia de
otras proteína-quinasas en un extracto de tejido.
Este tipo de ensayo es altamente deseable para los investigadores
debido a que no se requiere la purificación de la
proteína-quinasa objeto de estudio. De manera
convencional, se requiere la purificación en el extracto para
eliminar otras proteína-quinasas. Esta opción de
larga duración se puede evitar usando la opción del sustrato
peptídico biotinilado específico.
Además, se ayuda al investigador en determinar la
expresión del nivel de la quinasa específica bajo varias condiciones
fisiológicas con mínimas pérdidas en enzima, ya que se obvia la
etapa de purificación. Esto significa que la actividad ensayada es
una estimación precisa de la actividad total de la enzima
estudiada.
Los sustratos peptídicos para varias
proteína-quinasa tales como las
proteína-quinasa dependientes de cAMP (PKA), las
proteína-quinasas dependientes de cGMP (PKG), las
proteína-quinasas dependientes de
Ca^{2+}/fosfolípidos (PKC), las caseina-quinasas 1
y 2 (CK-1 y CK-2), los receptores
del factor del crecimiento, los receptores del factor del
no-crecimiento y las proteínas solubles que
contienen una tirosina-quinasa activa, la
proteína-quinasa dependiente del ciclo celular
(proteína-quinasa p34cdc2), la
proteína-quinasa S6, las
proteína-quinasas multifuncionales (CAM) o
dependientes de Ca^{2+}/calmodulina, la
proteína-quinasa dependiente del ADN, y las quinasas
de dominio terminal carboxilo (CDT) son sintetizadas de manera
acostumbrada usando un protocolo de síntesis de péptidos que
incorpora un aminoácido biotinilado en el N-terminal
del péptido. De este modo, existen varias
proteína-quinasas que se pueden ensayar mediante el
presente procedimiento proporcionando la capacidad para hacer varios
kits para su uso con varias proteína-quinasas.
El ensayo es muy rápido y normalmente se puede
completar en menos de 10 minutos después de la finalización de la
reacción. Esto es muy importante ya que los protocolos actuales
requieren aproximadamente 2 horas para obtener los mismos
objetivos.
No se requiere equipo especial, más que el equipo
estándar que está en la actualidad disponible en la mayoría de los
laboratorios. El procedimiento no requiere disolventes orgánicos o
inorgánicos especiales, tales como ácido fosfórico, ácido acético,
acetona o etanol, encontrados en los protocolos de la técnica
anterior.
La presente invención es susceptible de ser
adaptada a un ensayo a gran escala que puede ser demandado por los
grandes laboratorios o laboratorios farmacéuticos ocupados en la
investigación de fármacos.
El coste de la presente invención es similar al
coste de los ensayos de la técnica anterior. El incremento de coste
previsto de avidina y del reactivo de biotinilante se puede
compensar por la eliminación de los caros disolventes requeridos en
otros ensayos.
Además, la presente invención elimina la
necesidad del uso de un sistema que ensayo que requiere la
electroforesis del gel para separar el péptido exógeno del sustrato
endógeno. La electroforesis del gel separa las diferentes formas
mono- y fosforiladas del sustrato que pueden ser útiles. Sin
embargo, este método además complica la cuantificación de la
transferencia de fosfato total.
A menudo se encuentran problemas al utilizar el
ensayo de papel de unión de filtro de la técnica previa para unir
fuertemente las moléculas positivas que están presentes en el
extracto celular del tejido y que están fosforiladas. La presente
invención solventa los problemas debido a que sólo se unen el
sustrato y el producto ya que son los únicos componentes que están
biotinilados.
La presente invención elimina la necesidad de
cambiar la estructura primaria de la secuencia de consenso, que es
el objetivo de la secuencia del aminoácido primario de la enzima que
es analizada, mediante la adición adicional de residuos de arginina
para mantener las secuencia primaria para la enzima que está
presente in vivo. Los ensayos de la técnica previa que
utilizan un filtro de unión requerían que los sustratos contengan
múltiples residuos de arginina lo que puede alterar la especificidad
del sustrato de modo que el sustrato puede llegar a ser apto para
otra quinasa. Un ejemplo de esta alteración está dada por la
secuencia
Arg-Arg-Arg-Tyr-Ser
(una clave para las abreviaciones de los aminoácidos se encuentra en
la Tabla 1) que está presente en el sustrato peptídico de
CDT-quinasa
Arg-Arg-Arg
(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-pro-Ser)_{4}
que podría ser reconocido por una proteína-quinasa
dependiente de cAMP y otras quinasas que reconozcan esta
secuencia.
La presente invención produce resultados con una
elevada probabilidad de exactitud ya que virtualmente todas las
moléculas peptídicas fosforiladas son capturadas por la matriz de
unión fuerte revestida de avidina o estreptavidina. Por el
contrario, las proteínas fosforiladas depositadas sobre el papel de
fosfocelulosa se unen mediante una interacción electrostática que no
es fuerte. De este modo, durante el proceso de lavado tienen lugar
pérdidas de péptidos fosforilados.
Ahora se hace referencia en detalle a las
realizaciones preferidas de la invención, los ejemplos de las mismas
se ilustran en las figuras que se acompañan.
La Fig. 1 es un gráfico que ilustra el efecto de
la concentración de la enzima sobre la actividad de la quinasa de
PKA usando un sustrato Kemptido modificado. El péptido estaba
presente a 100 \muM, y la enzima se analizó según se describe en
el ejemplo 1.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra el efecto del
incremento de la concentración del sustrato Kemptido biotinilado
sobre la actividad de la proteína-quinasa de PKA.
Dos unidades de Kemptido de PKA estaban presentes en la reacción.
Los componentes remanentes de la reacción estaban presentes como se
describen en el ejemplo 1.
La Fig. 3 es un gráfico que ilustra el análisis
de la cinética del PKA con Kemptido como un sustrato a 2 unidades
por reacción como se describe en el ejemplo 1.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra el efecto del
inhibidor del péptido de PKA sobre su actividad de la
proteína-quinasa como se describe en el ejemplo
1.
La Fig. 5 es un gráfico que ilustra la actividad
de la proteína-quinasa de PKA en varios tejidos de
rata como se describe en el ejemplo 2.
La Fig. 6 es un gráfico que ilustra el efecto de
la concentración de la enzima sobre la actividad de la quinasa de
PKA usando la neurogranina_{(28-43)} biotinilada
como sustrato como se describe en el ejemplo 3.
La Fig. 7 es un gráfico que ilustra el efecto del
incremento de la concentración del sustrato de
neurogranina_{(28-43)} biotinilada sobre la
actividad de la proteína-quinasa de PKC como se
describe en el ejemplo 3.
La Fig. 8 es un gráfico que ilustra el efecto del
inhibidor de PKC sobre la actividad de PKC que usa la
neurograni-
na_{(28-43)} biotinilada como un sustrato como se describe en el ejemplo 3.
na_{(28-43)} biotinilada como un sustrato como se describe en el ejemplo 3.
\newpage
La Fig. 9 es una gráfico que ilustra el efecto de
la actividad de la proteína-quinasa de PKC en el
extracto de cerebro de rata y de una PKC particularmente pura como
se describe en el ejemplo 4.
Para los propósitos de la presente invención, se
aplican las siguientes definiciones:
La cantidad de producto(s) de reacción que
una cierta cantidad de enzima que actuando sobre un sustrato
producirá en un periodo de tiempo específico.
Una especie química compuesta de un péptido que
posteriormente se hace reaccionar con un segundo resto químico, en
este caso biotina, lo que permite al péptido ser monitorizado en
virtud de las propiedades del segundo resto químico. El resto se
puede referir como un segmento detector o cola de modificación.
Un compuesto generalmente consistente de
2-30 aminoácidos sintéticos o que están presentes de
modo natural que además, también se puede modificar incluyendo
enlaces de modo covalente a los enlaces peptídicos del grupo alfa
carbonilo de un primer aminoácido y el grupo amino alfa de un
segundo aminoácido al eliminar una molécula de agua. Los
aminoácidos pueden ser los aminoácidos que están presentes de manera
natural o variantes sintetizadas de modo químico de tales
aminoácidos o formas modificadas de estos aminoácidos que pueden ser
alterados a partir de su estructura química básica mediante la
adición de otros grupos químicos que se pueden encontrar que están
unidos de manera covalente a ellos en los compuestos que aparecen de
forma natural.
La adición de un grupo fosfato a un sustrato.
Una especie química que se forma por la acción de
una enzima sobre un sustrato peptídico modificado, que ha sido
alterado a parir del patrón de enlace original. Tales alteraciones
pueden incluir la adición o eliminación de nuevas especies químicas
al sustrato peptídico modificado. Los cambios particulares
realizados sobre el sustrato peptídico modificado dependerán de la
enzima particular que haya estado involucrada en la alteración del
sustrato peptídico modificado. Ejemplos de un producto peptídico
modificado puede incluir, pero no está limitado a, un producto,
formado por incubación de un sustrato peptídico modificado con una
proteína-quinasa bajo condiciones en las que la
quinasa ha alterado el sustrato peptídico modificado mediante la
adición de un grupo fosfato al péptido desde un donante de fosfato
tal como ATP o GTP.
La propiedad de un enzima para reconocer y
catalizar una reacción debido a la secuencia peptídica del
sustrato.
La sustancia sobre la cual actúa una enzima.
Un péptido modificado que se puede cambiar por la
acción de una enzima. Tales cambios pueden incluir la adición o
eliminación de especies químicas al péptido modificado. A menudo
sería deseable diseñar un sustrato peptídico modificado particular
para ensayar una enzima particular de interés. Un sustrato peptídico
modificado potencial para la proteína-quinasa debe
tener un aminoácido que pueda actuar como receptor de fosfato, tal
como serina. La utilidad de un sustrato peptídico modificado
potencial para ensayar una actividad enzimática en particular se
puede determinar incubando el sustrato peptídico modificado
potencial con la enzima bajo condiciones en las que la enzima se
sabe que es activa y observando la velocidad con la que se genera un
producto peptídico modificado.
La presente invención cuantifica las actividades
de las enzimas de quinasa midiendo la cantidad de un sustrato
peptídico modificado que ha sufrido una reacción por la enzima.
Las quinasas cuantificadas en la presente
invención preferentemente usan ATP o GTP como donantes de fosfato y
transfieren gamma fosfato desde la molécula a un aminoácido de
serina, treonina o tiosina. Las proteína-quinasas se
distinguen por su capacidad de fosforilar sustratos en secuencias
discretas. Estas secuencias han sido determinadas por secuenciación
de los aminoácidos alrededor de los sitios de fosforilación y son
generalmente diferentes para cada proteína-quinasa.
La secuencia de reconocimiento de cada sustrato es para un
catalizador de quinasa específica.
El sitio de unión del sustrato en la quinasa se
cree que existe en el dominio catalítico de la enzima. Este dominio
es esencial para todas las proteína-quinasas.
Normalmente contiene sobre 240 residuos y también contiene el sitio
de unión de ATP o GTP de la quinasa.
La actividad de una enzima se determina midiendo
la cantidad de producto producido, es decir, producto peptídico
modificado. La medida de la actividad de las enzimas se puede llevar
a cabo por cuantificación de la cantidad del producto objeto de la
reacción. La actividad de las proteína-quinasas de
puede medir debido su capacidad de modificar los sustratos
peptídicos específicos por adición de los grupos fosfatos los
sustratos peptídicos de la invención.
La enzima se incuba bajo condiciones conocidas en
la técnica con el sustrato peptídico modificado para formar los
productos peptídicos modificados bajo condiciones en las que la
enzima es activa. Cada una de las enzimas se ensaya normalmente a su
pH óptimo, temperatura y otras condiciones.
Se ha desarrollado un protocolo de ensayo para
determinar la actividad enzimática de varias
proteína-quinasas en una manera específica, rápida y
conveniente. El protocolo de ensayo tiene el propósito de ensayar
proteína-quinasas individuales en presencia de una
mezcla de otras proteína-quinasas. El ensayo de la
enzima se puede agrupar en un formato de kit y se pueden
proporcionar kits separados para la proteína-quinasa
específica requerida. Además, este ensayo se puede adaptar a un
formato de levado rendimiento.
Un número de sustratos peptídicos especializados,
incluyendo análogos y combinaciones de los sustratos peptídicos, se
han desarrollado para su uso con el proceso descrito en la siguiente
tabla:
(Tabla pasa a página
siguiente)
| Clave de Abreviación | Aminoácido |
| Ala | Alanina |
| Cys | Cisteína |
| Asp | Acido Aspártico |
| Glu | Acido Glutámico |
| Phe | Fenilalanina |
| Gly | Glicina |
| His | Histidina |
| Ile | Isoleucina |
| Lys | Lisina |
| Leu | Leucina |
| Met | Metionina |
| Asn | Aspargina |
| Pro | Prolina |
| Gln | Glutamina |
| Arg | Arginina |
| Ser | Serina |
| Thr | Treonina |
| Val | Valina |
| Trp | Triptófano |
| Tyr | Tirosina |
Los péptidos promega A-C
contienen una secuencia favorable específica para las
serina-treonina-quinasas. El péptido
promega G forma un sustrato favorable para la
tirosina-quinasa.
Mientras que el material presentado toma la
ventaja de péptidos que son sintetizados químicamente in
vitro y alguno de los mismos están disponible comercialmente, se
debería hacer notar que la invención se puede desarrollar aislando
un péptido a partir de una fuente natural que incluye la digestión
de una proteína precursora superior o péptido y aislamiento del
fragmento resultante apropiado mediante métodos bien conocidos en la
técnica seguido de su unión a un segmento detector como se ha
definido.
El ensayo utiliza un péptido marcado biotinilado
que se requiere para la proteína-quinasa objeto de
consideración. En contraste con los sustratos de proteína usados a
menudo para los ensayos de proteína-quinasa, los
péptidos se pueden diseñar para ser un sustrato selectivo para una
quinasa en particular sintesizando un péptido que imite la secuencia
de consenso reconocida por la enzima de interés. El péptido
biotinilado se puede fosforilar por la respectiva
proteína-quinasa bajo condiciones de
fosfotransferasa óptimas por esta enzima en presencia de
\tau-^{32}P-ATP. Debido a que
los péptidos fosforilados y no fosforilados están biotinilados, se
pueden capturar sobre una matriz de unión de biotina y el
\tau-^{32}P-ATP libre remanente
se puede eliminar mediante varios lavados. Preferentemente, el
producto peptídico biotinilado unido se lava antes de la etapa de
medir la cantidad de producto peptídico modificado.
La matriz de unión de biotina puede ser cualquier
matriz que está unida covalentemente a moléculas de avidina o
estreptavidina tales como discos de filtro, gránulos o una matriz
soluble. FMC Corporation (Pine Brook, New Jersey) es un ejemplo de
un fabricante de avidina y estreptavidina en matrices tales como
sílice de Polivinilcarbonato (PVC) con estreptavidina unida, Láminas
de Plástico Microporoso o Discos de 12,5 mm. Los péptidos capturados
se pueden colocar en un espectrometro de destellos líquido para
determinar el ^{32}P incorporado al péptido y por lo tanto, la
actividad de la proteína-quinasa de la enzima bajo
consideración.
El principio básico de la modalidad del péptido
biotinilado es conjugar los sustratos peptídicos para una
proteína-quinasa específica con biotina a partir del
cual el péptido biotinilado se puede usar como un sustrato para
ensayar la enzima en cuestión. Después de la finalización de la
reacción, los péptidos fosforilados y no fosforilados se depositan
en forma de alícuotas sobre membranas de filtración revestidas de
estreptavidina o avidina, láminas de formato ELISA o partículas
magnéticas revestidas de avidina, en donde los péptidos se unen. El
ATP libre se puede eliminar mediante un procedimiento de lavado y
los péptidos libres de ATP que están unidos a los filtros,
partículas, láminas se pueden entonces contar mediante un
espectrómetro de destellos en fase líquida, y la actividad de la
enzima se puede determinar a partir del ^{32}P incorporado. Un
grupo de biotina puede unirse ccorrectamente a un péptido y usarse
como un sustrato para la medida de la actividad de la
proteína-quinasa cuando se cumplen los siguientes
criterios:
1. El grupo de biotina debe estar unido
covalentemente al grupo amino N-terminal y no a
cualquier otro grupo amino presente de manera interna o C terminal
del sustrato peptídico. Esto es esencial ya que la unión de una
molécula de biotina de modo covalente a un grupo amino \varepsilon
en una lisina interna dará como resultado una alteración de la carga
global del péptido. De este modo, la eficacia del péptido como
sustrato para algunas proteína-quinasas tales como
quinasas de PKA, PKC y CAM puede resultar alterada.
2. La adición del resto de biotina al péptido no
debería dar como resultado un impedimento estérico de la
accesibilidad al sustrato peptídico a la enzima durante la
investigación. Preferentemente, el enlace de la biotina de seis
átomos de carbono al sustrato minimiza los impedimentos
estéricos.
3. Una matriz que puede unir el péptido
biotinilado fosforilado debe ponerse a disposición de forma que la
actividad de la proteína-quinasa en cuestión se
pueda determinar midiendo la cantidad de producto peptídico
radio-marcado. La agente de unión debería ser
específico para el fosfopéptido modificado y cualquier proteína
fosforilada u otro péptido presente en la muestra no deberían unirse
a la matriz. De este modo, la actividad es proporcional a la
cantidad de péptido biotinilado fosforilado unido.
4. El exceso de
\tau-^{32}P-ATP que no usado en
la reacción se debería eliminar en su totalidad. El objetivo es
producir un bajo nivel de ruido de línea base y además, proporcionar
un método rápido para ensayar la enzima en cuestión.
5. La capacidad de unión de la matriz al péptido
biotinilado debería ser lo suficientemente alta para usar una
concentración de varias veces el valor de Km para el sustrato
peptídico. Este requerimiento asegurará que la velocidad inicial de
reacción sea lineal dentro de un tiempo razonable. Además, la
velocidad inicial de reacción debería ser proporcional a la cantidad
de la enzima en la reacción.
Para experimentos a pequeña escala, se puede
numeran con un lapicero un disco de membrana de 25 mm de diámetro
revestido con avidina. De manera alternativa, se puede usar un
volumen conocido de partículas magnéticas revestidas con avidina en
un tubo Eppendorf.
El ensayo de quinasa se lleva a cabo como se
describe usando enzimas purificadas o extractos de tejidos como una
fuente de enzimas y el péptido biotinilado como un sustrato en
presencia de otros reactivos que se requieren para la reacción tales
como tampón, cationes bivalentes tales como Mn^{2+}, Ca^{2+}, y
Mg^{2+}, y \tau-^{32}P-ATP.
Para algunas proteína-quinasas pueden requerirse
otros cofactores tales como fosfolípidos o calmodulina. Después de
la finalización de la reacción, se extrae una alícuota y se aplica
directamente sobre los discos revestidos de avidina. Los discos se
colocan en una baso de precipitados conteniendo una disolución 2M de
NaCl para lavar el
\tau-^{32}P-ATP libre. De manera
alternativa, las alícuotas se pipetean en el interior de un tubo
conteniendo partículas y se mezclan bien. El NaCl del baso de
precipitados se puede cambiar 5 veces por minuto, lo que finaliza la
operación en 5 minutos. Cuando se utilizan partículas, éstas se
pueden lavar por medio de métodos convencionales para eliminar los
componentes solubles de la reacción libres, incluyendo ATP y las
proteínas endógenas.
El ensayo puede aumentarse de escala hasta un
ensayo de alto rendimiento mediante una leve modificación de la
matriz. Pueden usarse láminas recubiertas de estreptavidina
conteniendo 24 ó 96 paredes. Las alícuotas, extraídas después de la
finalización de la reacción de ensayo, se pipetean directamente
sobre las paredes individuales más que sobre los discos
individuales. A continuación, se lava toda la lámina enjuagando las
paredes con una disolución 2M de NaCl. Se debe señalar que los
sistemas de la técnica previa están disponibles para aplicar la
mezcla de reacción completa sobre las paredes individuales. El
lavado de las paredes se puede realizar con un sistema automático.
Las láminas pueden ser entonces contadas usando un espectrómetro de
destello en fase líquida tal como un Contador de Luminiscencia y de
Destellos de Microláminas de Top Count fabricado por Packard
Corporation en Meriden, Connecticut and Wallac, Inc., en
Gaithersburg, Maryland. A continuación se muestran ejemplos no
limitantes de ensayos utilizando la presente invención.
Cuando se investiga la
proteína-quinasa dependiente de cAMP (PKA) se
investiga, un tiene conocimiento de que un sustrato peptídico
específico para esta enzima está biotinilado en su grupo
N-terminal. Un péptido modificado
*-Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly
(Péptido Promega A; SEQ. ID. 1) se sintetiza usando un sintetizador
de péptidos. El péptido se ensaya mediante los métodos conocidos en
la técnica para ser un sustrato para PKA a diferentes
concentraciones; a saber, 0, 10, 20, 50 y 100 \muM con PKA
purificado a varias disoluciones. La enzima utilizada en los
estudios es la subunidad catalítica de PKA (#V5161, Promega
Corporation, Madison, WI.) con una actividad específica de 50
pmol de ^{32}P transferidos a la caseina por \mum de
enzima en 1 minuto a 37ºC o 10.000 pmol de ^{32}P
transferidos al sustrato Kemptido
Lys-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly
(Péptido Promega A; SEQ. ID. 1) por \mum de enzima por minuto a
37ºC.
Este ensayo pone aprueba la determinación de la
actividad de la fosfotransferasa de otras
proteína-quinasas usando los correspondientes
sustratos peptídicos biotinilados. Por ejemplo, para ensayar la
actividad de la quinasa de la proteína-quinasa
dependiente de Ca^{2+} y fosfolípido (PKC) se usa el péptido
derivado de la neurogranina biotinilado
*-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys
(Péptido Promega B; SEQ. ID. 2) como un sustrato bajo condiciones
optimas para la actividad de la proteína-quinasa
PKC.
Se pueden ensayar otras
proteína-quinasas como se describe anteriormente
para PKA y PKC, pero empleando los sustratos peptídicos apropiados y
ensayándolos bajo las correspondientes condiciones de ensayo
óptimas. Por ejemplo, el sustrato peptídico
*-Asp-Asp-Asp-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg-Arg
(Péptido Promega E; SEQ. ID. 5) se usa para ensayar la
caseina-quinasa I (CK-1). El péptido
*-Arg-Arg-Arg-Glu-Glu-Glu-Thr-Glu-Glu-Glu
(CK-2) (Péptido Promega C; SEQ. ID. 3) se usa para
ensayar la caseina-quinasa II
(CK-2). El péptido
*-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
(Péptido Promega G; SEQ. ID. 7) se usa para ensayar la
tirosina-quinasa del receptor del factor del
crecimiento epidermal activado (EGFR, del inglés Epidermal Growth
Factor Receptor).
En cada caso, la actividad de la enzima de la
proteína-quinasa objeto de estudio se ensaya usando
el método se desarrolló usando el derivado biotinilado del sustrato
peptídico apropiado y la matriz de unión de estreptavidina, y
seguidamente mediante el método del disco fosfocelulosa usando el
sustrato peptídico no modificado.
Las proteína-quinasas se ensayan
bajo sus condiciones óptimas como se describe a continuación con la
excepción de usar sustratos peptídicos no modificados en la reacción
y el procedimiento de procesado recomendado descrito en
Casnellie, J. E., 1991. En resumen, la reacción se detiene
mediante la extracción de alícuotas de 40 \mul y depositándolas en
forma de gotas sobre un papel P81 (Whatman, Clifton, NJ). Los
filtros se dejan caer inmediatamente en el interior de un baso de
precipitados conteniendo ácido fosfórico al 0,5% y se dejan con una
agitación ocasional del baso de precipitados durante 5 minutos. La
disolución de ácido fosfórico se decanta y se añade una disolución
nueva. Esta etapa se repite otra vez hasta un total de 4 veces, cada
una de ellas durante 5 minutos. Los filtros se secan y se colocan en
los viales de medición de destellos y se añaden 5 ml de fluido de
medición de destellos. La actividad enzimática se determina como se
describe anteriormente en el sistema de ensayo.
Para determinar la actividad de la
proteína-quinasa para varias quinasas, se deben
cumplir los siguientes criterios:
1. El derivado biotinilado del péptido debería
servir como un sustrato correcto y específico para la enzima en
cuestión como el sustrato peptídico no modificado.
2. La fosforilación del péptido biotinilado no
debería afectar a su unión a la matriz de unión de avidina o a la
matriz de unión de estreptavidina.
3. La fosforilación del péptido biotinilado
debería ser proporcional a la cantidad de enzima añadida y a ciertos
periodos de tiempo del ensayo.
4. Las proteínas fosforiladas no deberían unirse
a la matriz a menos que estuvieran biotiniladas, es decir, sólo los
péptidos biotinilados y fosforilados deberían unirse a la
matriz.
\newpage
5. La matriz de unión de avidina o de unión a
estreptavidina deberían tener suficiente capacidad de unión para los
péptidos biotinilados añadidos a la matriz.
6. Debería existir un medio para eliminar el
exceso de \tau-^{32}P-ATP libre
después de la finalización de la reacción.
Para alcanzar estos criterios, los péptidos se
sintetizan de modo que sean sustratos específicos para varias
proteína-quinasas (Kemp, B. E. and Pearson, R.
B., 1991). Cada uno de estos péptidos contienen la secuencia de
consenso requerida para la fosforilación para la correspondiente
enzima. Normalmente es necesario tener estos péptidos unidos a
aminoácidos básicos para impartir una carga(s) positiva al
péptido de forma que se pueda unir al papel de fosfocelulosa cargado
negativamente.
En la presente invención, los péptidos se
modifican en una manera tal que se hace de ellos que se unan
estrechamente a la matriz. El resto biotinilado se une al grupo
NH_{2} terminal del sustrato peptídico vía una unión átomo de
carbono-6.
Los péptidos modificados con biotina se
sintetizan en un sintetizador de péptidos usando los procedimientos
establecidos de síntesis para péptidos en fase sólida (Nova
Biochem/Calbiochem, San Diego, California). El grupo de biotina se
añade antes de la escisión del péptido de la resina. La identidad y
pureza de los péptidos biotinilados se confirman mediante el
análisis cuantitativo de aminoácidos, dos sistemas de disolventes en
cromatografía líquida de alta presión (HPLC, del inglés High
Pressure Liquid Chromatography), y espectrometría de masas mediante
bombardeo de átomos acelerados (FAB, del inglés Fast Atom
Bombardment).
Se investigan varios parámetros que puedan tener
influencia o afectar a los resultados de este ensayo. Estos son el
diámetro de los discos, la densidad de estreptavidina por disco, el
nivel de sequedad de los discos, la concentración del sustrato
peptídico modificado y la cantidad de enzima que puede ser
usada.
El ensayo se lleva a cabo a 37ºC durante 5
minutos. Se observa un incremento proporcional de la actividad de la
quinasa cuando se incrementa la cantidad de enzima presente.
Los discos de filtro en base de sílice se
fabrican de forma que están unidos a avidina o estreptavidina. Se
fabrican dos tamaños diferentes. Uno es de 25 mm (diámetro interno)
y el otro era 12,5 mm de diámetro interno. Los filtros están unidos
a 0,5, 1,0, ó 2,0 mg de estreptavidina o avidina. Los discos de 12,5
mm de diámetro con 0,5 mg de estreptavidina por disco dan los
mejores resultados. Además, se ensayan varios niveles de sequedad
tales como discos húmedos, discos secados 1 hora, discos secados 2
horas, y discos secados 2 semanas para determinar su aplicación en
este ensayo. Esto se examina para asegurar que el ensayo es fácil
para el usuario. Los resultados indican que los discos
semi-húmedos además de los discos secos pueden
usarse de manera satisfactoria en este ensayo.
La especificidad de este ensayo se examina de
manera adicional usando un extracto de tejido como fuente de PKA. La
linealidad de la incorporación de ^{32}P al péptido biotinilado
también se estudia incrementando la concentración de sustrato.
Los resultados experimentales indican que la
biotinilación de los sustratos peptídicos no afecta a la idoneidad
del péptido como sustrato. Un mg de avidina (o estreptavidina) por
disco de 25 mm (diámetro interno) (0,5 mg/disco de 12,5 mm (diámetro
interno)) es suficiente para la unión de hasta 5 nmol de
péptido biotinilado lo que da una concentración final de 200 \muM
(volumen de reacción de 25 \muL). Esta concentración de péptido es
suficiente para la mayoría de los propósitos requeridos. Ambas, la
avidina y la estreptavidina pueden usarse para este ensayo, aunque
debido al bajo coste de la estreptavidina, la mayoría de los
estudios se desarrollan con estreptavidina.
Por último, se prueban todas las disoluciones de
lavado para eliminar el ATP libre y la mejor línea de base se
obtiene con una disolución de NaCl 2 M. De este modo, se usa esta
disolución como disolución de lavado.
Para generar los datos, se llevaron a cabo las
siguientes condiciones:
1. Las reacciones se detuvieron con la disolución
de terminación (2M de urea, 125 mM de EDTA, y 1% de SDS), y sobre
los discos de 12,5 mm de unión a estreptavidina (0,5 mg de
estreptavidina) o sobre las paredes de la lámina de 24 paredes se
depositaron en forma de gotas alícuotas de 25 \muL.
2. Los discos o paredes se enjuagaron o lavaron
cinco veces con una disolución 2M de NaCl, cada una de ellas durante
un minuto.
3. Los discos o platos se secaron y se contaron
usando un contador de destellos en fase líquida.
La presente invención también está dirigida a los
kits que utilizan el proceso descrito. Un kit básico para
cuantificar la actividad de una enzima incluye un recipiente que
contiene un bioreactivo, que es un sustrato peptídico modificado que
tiene una reactividad específica al enzima, modificado por reacción
química para permitir la cuantificación, e instrucciones para su
uso.
El sustrato peptídico modificado suministrado en
el kit incluye el compuesto adhesivo de biotina. El kit también
contiene al menos un tampón que es compatible con la enzima
seleccionada.
Un kit está dirigido a detectar específicamente
la actividad de enzimas seleccionadas del grupo de
serina-treonina-quinasas y
tirosina-quinasas. El kit incluye un recipiente que
contiene un sustrato peptídico modificado junto con el compuesto de
unión de biotina. El sustrato de péptido modificado es específico
para la enzima seleccionada.
Un kit está dirigido cuantificar la actividad de
una enzima que se elige del grupo que consiste en quinasas. El kit
básico incluye al menos un recipiente con un sustrato peptídico
modificado que incluye el compuesto de unión a biotina. El sustrato
de péptido modificado es específico para la enzima seleccionada.
El sustrato peptídico modificado en el kit puede
ser uno de los siguientes péptidos, dependiendo del tipo de enzima
que se ensaya según se ha explicado: Péptido Promega A (SEQ. ID. 1),
Péptido Promega B (SEQ. ID. 2), Péptido Promega C (SEQ. ID. 3),
Péptido Promega D (SEQ. ID. 4), Péptido Promega E (SEQ. ID. 5),
Péptido Promega F (SEQ. ID. 6), Péptido Promega G (SEQ. ID. 7) y
Péptido Promega H (SEQ. ID. 8). En la Tabla 1 se hace un referencia
indicando los sustratos peptídicos modificados específicos para las
enzimas seleccionadas.
Las instrucciones para uso también se incluyen.
"Instrucciones para su uso" es una expresión concreta que
describe la concentración de reactivo o al menos un parámetro del
método de ensayo tal como la cantidad relativa de reactivo y de
muestra que se deben dosificar, periodos de tiempo de mantenimiento
para las dosis de reactivo/muestra, temperatura, condiciones del
tampón y semejantes.
El kit también puede incluir una matriz de unión
de biotinina unida a moléculas de avidina o estreptavidina tales
como discos de filtración, gránulos, matrices solubles o platos. La
matriz de unión de biotinina se puede utilizar para unir el sustrato
peptídico modificado y el producto peptídico modificado conieniendo
la biotina.
Las cantidades de los diferentes reactivos en los
kits se pueden variar dependiendo de un número de factores, tales
como la sensibilidad óptima del ensayo. Las instrucciones para su
uso son aptas para hacer posible a un analista llevar a cabo el
ensayo deseado.
Está dentro del alcance de esta invención
proporcionar kits de ensayos de tipo manual o kits de ensayos para
su uso en analizadores automáticos.
Los siguientes ejemplos se presentan para
ilustrar las ventajas de la presente invención y ayudar a alguien
habituado a su fabricación y uso de la misma. Los ejemplos no tienen
la intención de forma alguna de limitar el alcance de la descripción
o protección garantizada por la patente. Mientras que dan las
descripciones precisas para los ensayos de las
proteína-quinasa, debería quedar claro para alguien
experto en la técnica que los resultados de la presente invención se
pueden aplicar para el ensayo de una amplia variedad de enzimas
seleccionadas.
Mientras que el material presentado se aprovecha
de los péptidos que son sintetizados químicamente in vitro, y
alguno de los cuales están disponibles comercialmente, se debería
notar que la invención se puede desarrollar por aislamiento a un
péptido a partir de una fuente natural.
Los ensayos en estos ejemplos están basados en el
uso de sustratos peptídicos biotinilados que son específicos para
ciertas enzimas.
La actividad de la quinasa de la
proteína-quinasa dependiente cAMP (PKA) se llevó a
cabo por duplicado de varias concentraciones de sustrato peptídico,
en un volumen de reacción (50 \muL) conteniendo 40 mM de Tris
HCl, pH 7,4, 20 mM MgCl_{2}, 100 \muM de
\tau-^{32}P-ATP (actividad
específica de 100-200 cpm/pmol), 100
\mug/ml de albúmina de suero bovino (BSA, del inglés Bovine Serum
Albumin), y el sustrato peptídico biotinilado apropiado:
*-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly
(Péptido Promega A, SEQ. ID. 1, peso molecular de 998,4).
La reacción se inició mediante la adición de la
cantidad apropiada de enzima (Promega #V5221) para dar lugar a 2
unidades de Kemptido y se incubó durante 0, 5, y 10 minutos a 37ºC
(se define una unidad Kemptido como la cantidad de enzima requerida
para catalizar la incorporación de 1 pmol de fosfato a un
sustrato de Kemptido en un minuto). A periodos específicos de tiempo
a la temperatura apropiada, se detuvo la reacción mediante la
adición de 10 \muL de disolución finalizadora como se describe
anteriormente.
Se extrajeron alícuotas de veinticinco \muL y
se depositaron en forma de gotas en un disco de 12,5 mm de diámetro
interno de unión a estreptavidina (0,5 mg de estreptavidina/disco) y
se colocó en un baso de precipitados conteniendo una disolución 2M
de NaCl. Después de un minuto de agitación suave del baso de
precipitados a temperatura ambiente, se añadió una disolución nueva
de NaCl . Este procedimiento de lavado se repitió 5 veces más
durante un minuto cada una de ellas. Los discos se lavaron entonces
una vez más con agua, se secaron y se colocaron en los viales del
detector de destellos. Entonces se añadieron 5 ml de fluido de
detección de destellos.
La actividad de la enzima se calculó determinando
la radiactividad vía espectrometría de destellos en fase líquida.
Para confirmar que la fosforilación estaba catalizada
específicamente por la PKA, se incluyó en la reacción un inhibidor
específico y potente de PKA (#V5681, Promega Corporation, Madison,
WI.). Toda la actividad de la fosfotransferasa debería haberse
inhibido por la adición del inhibidor.
La relación entre la velocidad de reacción
(velocidad inicial de PKA) se determina mediante el protocolo y bajo
las condiciones descritas anteriormente, y la cantidad de enzima en
la reacción se muestra en la Fig. 1. Usando 100 \muM de sustrato
peptídico modificado en la reacción se obtuvo una respuesta lineal
en la actividad de la PKA al incrementar la cantidad de enzima en la
reacción. La actividad de la enzima también se investigó con
relación a la concentración de sustrato peptídico biotinilado.
Como se muestra en la Fig. 2, la curva de la
cinética describe un comportamiento de saturación
Michaelis-Menten típico (curva hiperbólica). La
transformación de los mismos datos dio como resultado un valor de Km
para el sustrato de 33 \muM, y un valor Vmax de 1,45
pmol/min como se ilustra en la Fig. 3. Valores similares se
obtuvieron con el ensayo de papel de fosfocelulosa usando el
Kemptido como sustrato, y como se ilustra en la Fig. 4 el valor de
Km para el sustrato no modificado no era afectado por la
biotinilación Kemp, B. E. and Pearson, R. B. 1991. La
actividad de la proteína-quinasa era específica para
la PKA ya que la adición de 50 \muM de inhibidor de PKA (PKI)
redujo drásticamente la actividad de la enzima.
La actividad de la quinasa de PKA en varios
tejidos de rata también se investigó usando el sustrato peptídico
modificado y el protocolo de ensayo como se describe con
anterioridad.
Como se ilustra en la Fig. 5, la actividad de la
proteína-quinasa de PKA era de 2,2, 1,75, 3,2 y 1,9
nmol ^{32}P/min/mg de hígado, ovario, corazón, y cerebro de
rata respectivamente, y era comparable a los obtenidos con el método
del papel de fosfocelulosa y péptido no modificado. La incorporación
de fosfato al sustrato modificado se eliminó completamente cuando se
incluyó en la reacción 100 \muM de inhibidor de PKA (PKI). Así, la
fosforilación del sustrato peptídico modificado, bajo las
condiciones descritas con anterioridad y ensayadas con el protocolo,
es catalizada por el PKA y no por otras
proteína-quinasas presentes en el extracto del
tejido.
Cualquier proteína(s) que sea fosforilada
en la reacción y tenga una carga básica no se unirá a la matriz.
Sólo el sustrato peptídico modificado fosforilado se une a la
matriz. Así, la incorporación de fosfato usando el protocolo de
ensayo refleja la verdadera incorporación del ^{32}P al sustrato
peptídico. Este no es el caso con el método de ensayo con papel de
fosfocelulosa en el que cualquier proteína básica del extracto que
esté fosforilada se unirá al papel y dará como resultado una
estimación por exceso de la actividad de la quinasa de la
enzima.
La actividad de la
proteína-quinasa de la actividad de la
proteína-quinasa dependiente de Ca^{2+} y
fosfolípido (PKC) se determinó de una manera similar a la descrita
con anterioridad para la PKA, excepto en que el sustrato peptídico
biotinilado era un derivado de neurogranina; denominada,
neurogranina_{(28-43)} biotinilada Chen,
S-J, et al., 1993.
El péptido se modificó mediante la adición de un
resto que contiene biotina:
*-Ala-Ala-Lys-Ile-Gln-Ala-Ser-Phe-Arg-Gly-His-Met-Ala-Arg-Lys-Lys
(Péptido Promega B, SEQ. ID. 2, Peso Molecular es 2139,6), y se usó
a una concentración de 100 \muM. La enzima (#V5261, promega
Corporation) se diluyó 5X en 100 \mug/ml de BSA.
La actividad de la quinasa de la PKA se determinó
en un volumen de reacción de 50 \muL consistente en 40 mM Tris.
HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl_{2}, BSA a 100 \mug/ml, y 100 \muM de
\tau-^{32}P-ATP (actividad
específica de 100 cpm/pmol). La actividad se determinó en
presencia y en ausencia de 100 \mug/ml de fosfatidilserina, 10
\mug/ml de diacilglicerol y 0,4 mM de cloruro cálcico. La reacción
se inició con la adición de 5 \muL de la enzima y se incubó a
25ºC. Después de periodos de tiempo específicos, se detuvo la
reacción mediante la adición de 10 \muL de disolución finalizadora
(ver arriba). Alícuotas de veinticinco \muL se depositaron sobre
los discos y los discos se procesaron tal como se describe con
anterioridad para la PKA.
La actividad del PKC obtenida también se comparó
con la obtenida usando el sustrato peptídico no modificado y se
ensayó mediante el método del papel de fosfocelulosa. Los resultados
mostrados en la Fig. 6, usando una concentración de sustrato
peptídico modificado de 100 \muM, indican que la actividad de la
PKC era lineal al incrementar la cantidad de proteína de enzima en
la reacción. De manera similar al trabajo presentado con la PKA,
también se investigó el efecto de la concentración del sustrato en
la actividad de la actividad de quinasa de PKC.
Se obtuvo una cinética
Michaelis-Menten, es decir, una curva hiperbólica,
como se ilustra en la Fig. 7, y la actividad de la enzima alcanzó un
máximo alrededor de 100 \muM de sustrato modificado. Sin embargo,
la actividad de la PKC era aproximadamente 6-7 veces
mayor que su actividad cuando se ensayó con el método del papel de
fosfocelulosa. El incremento en la actividad de la PKC en el sistema
de ensayo puede ser debido a la unión aumentada y específica del
producto peptídico fosforilado y también a la menor pérdida de
producto peptídico fosforilado de la matriz durante el procedimiento
de lavado. Esto demuestra que la actividad de la quinasa de la
enzima se puede determinar exactamente usando del sistema de ensayo
con la neurogranina_{(28-43)} biotinilada.
La actividad se inhibió por completo con el
inhibidor peptídico de la PKC miristoilado como se ilustra en la
Fig. 8. De este modo, 10-20 \muM de inhibidor era
suficiente para inhibir la actividad de la quinasa de PKC, indicando
que todo el ^{32}P incorporado al sustrato peptídico era
catalizado vía PKC.
También se estudió la actividad de la quinasa de
la PKC en el cerebro de rata usando los materiales y métodos del
Ejemplo 3.
Como se ilustra en la Fig. 9, la actividad de la
PKC en una fracción enriquecida de un sobrenadante a elevadas
revoluciones de extracto de cerebro de rata era de aproximadamente
500 pmol ^{32}P/mg/min, y que de la PKC parcialmente
purificada era de 2200 pmol ^{32}P/mg/min.
Se entiende que la invención no está confinada a
la construcción y a las disposiciones particulares ilustradas y
descritas en la presente invención, sino que abarca sus formas
modificadas y que están dentro del alcance de las reivindicaciones
que siguen a la bibliografía.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: GOUELI, SAID A.
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CUANTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PROTEINA-QUINASA INDIVIDUAL
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Ross & Stevens, S. C.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: One South Pinckney Street, Apartado de Correos 2599
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Madison
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Wisconsin
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU.
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 53701 - 2599
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- FORMATO DE LECTURA PARA ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM Compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- AGENTE DE INFORMACIÓN/REPRESENTANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: SARA, CHARLES S.
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30,492
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: 34506.006
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (608) 257-5353
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (608) 257-9175
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Arg Arg Ala Ser Leu Gly}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Ala Lys Ile Gln Ala Ser Phe Arg Gly His
Met Ala Arg Lys Lys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Arg Glu Glu Glu Thr Glu Glu
Glu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys Lys
Leu}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 10 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Asp Glu Glu Ser Ile Thr Arg
Arg}
\vskip0.666000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Pro Pro Leu Ser Gln Glu Ala Phe Ala Asp
Leu Trp Lys Lys}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Arg Val Tyr Ile His Pro Phe}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 8 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Péptido
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ. ID. Nº: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Lys Ile Ser Ala Ser Glu Phe}
Claims (21)
1. Un método de determinar la presencia o
actividad de una proteína-quinasa seleccionada, que
comprende:
- a.
- conjugar de un reactivo biotinilante a un sustrato peptídico formando un sustrato peptídico modificado que contiene un resto de biotina, en el que el resto de biotina no da como resultado un impedimento estérico para la accesibilidad al sustrato peptídico biotinilado a la proteína-quinasa;
- b.
- añadir de una cantidad suficiente del sustrato peptídico biotinilado a una disolución que contiene la proteína-quinasa seleccionada;
- c.
- incubar de la proteína-quinasa seleccionada con el sustrato peptídico biotinilado bajo condiciones en las que la proteína-quinasa seleccionada es activa durante un tiempo suficiente para formar un producto peptídico biotinilado:
- d
- unir el producto peptídico biotinilado a una matriz de unión a biotina, en la que la matriz tiene suficiente capacidad de unión y especificidad para el producto peptídico biotinilado; y
- e
- medir de la cantidad de producto peptídico modificado.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la
matriz incluye una proteína.
3. El método de la reivindicación 2, en el que la
proteína se elige del grupo que consiste en avidina y
estreptavidina.
4. El método de la reivindicación 1, que
comprende además lavar el producto peptídico biotinilado unido antes
de medir la cantidad de producto peptídico modificado.
5. El método de la reivindicación 1, en el que la
matriz incluye un disco revestido de proteína.
6. El método de la reivindicación 1, en el que la
matriz incluye partes (gránulos) revestidos de proteína.
7. El método de la reivindicación 1, en el que la
proteína-quinasa seleccionada se incuba en presencia
del sustrato peptídico biotinilado y un marcador.
8. El método de la reivindicación 7, en el que el
marcador es un marcador radiactivo.
9. El método de la reivindicación 8, en el que el
marcador radiactivo es \tau^{32}P.
10. El método de la reivindicación 7, en el que
la cantidad de producto peptídico modificado se mide mediante un
espectrómetro de destellos.
11. Un método de la reivindicación 1, en el que
el sustrato peptídico biotinilado se elige del grupo que consiste
en: péptido Promega A (SEQ. ID. 1), péptido Promega B (SEQ. ID. 2),
péptido Promega C (SEQ. ID. 3), péptido Promega D (SEQ. ID. 4),
péptido Promega E (SEQ. ID. 5), péptido Promega F (SEQ. ID. 6),
péptido Promega G (SEQ. ID. 7), y péptido Promega H (SEQ. ID.
8).
12. El método de la reivindicación 1, en el que
la proteína-quinasa seleccionada se elige del grupo
que consiste en
serina-treonina-quinasas y
tirosina-quinasas.
13. Un kit para determinar la actividad de una
proteína-quinasa seleccionada, que comprende un
recipiente que contiene un sustrato peptídico biotinilado que a su
vez contiene un resto de biotina, en el que el resto de biotina no
da como resultado un impedimento estérico para la accesibilidad al
péptido biotinilado a la proteína-quinasa,
teniendo además el sustrato peptídico biotinilado una reactividad
específica a la proteína-quinasa seleccionada y
modificado por reacción química para permitir la cuantificación.
14. El kit de la reivindicación 13, en el que el
sustrato peptídico modificado incluye un componente de unión.
15. El kit de la reivindicación 14, en el que el
componente de unión es biotina.
16. El kit de la reivindicación 13, que incluye
además un recipiente que tiene al menos un tampón que es compatible
con la proteína-quinasa seleccionada.
17. El kit de la reivindicación 13, que incluye
un recipiente que contiene una matriz de unión de biotina.
18. El kit de la reivindicación 13, en el que el
sustrato peptídico biotinilado se elige del grupo que consiste en
péptido Promega A biotinilado (SEQ. ID. 1), péptido Promega B
biotinilado (SEQ. ID. 2), péptido Promega C biotinilado (SEQ. ID.
3), péptido Promega D biotinilado (SEQ. ID. 4), péptido Promega E
biotinilado (SEQ. ID. 5), péptido Promega F biotinilado (SEQ. ID.
6), péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7), y péptido Promega H
biotinilado (SEQ. ID. 8).
19. El kit de la reivindicación 13, en el que la
proteína-quinasa seleccionada se elige del grupo que
consiste en serina-treonina-quinasas
y tirosina-quinasas.
20. Un kit para determinar la actividad de una
tirosina-quinasa, que comprende:
- a.
- un recipiente que contiene un sustrato peptídico biotinilado seleccionado del grupo que consiste en péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7); y
- b.
- un recipiente que contiene una matriz de unión de biotina, en la que la matriz de unión de biotina tiene suficiente capacidad de unión y especificidad para el sustrato peptídico biotinilado de tirosina-quinasa.
21. Un kit para determinar la actividad de una
serina-tirosina-quinasa, que
comprende:
- a.
- un recipiente que contiene un sustrato peptídico biotinilado seleccionado del grupo que consiste en péptido Promega A biotinilado (SEQ. ID. 1), péptido Promega B biotinilado (SEQ. ID. 2), péptido Promega C biotinilado (SEQ. ID. 3), péptido Promega D biotinilado (SEQ. ID. 4), péptido Promega E biotinilado (SEQ. ID. 5), péptido Promega F biotinilado (SEQ. ID. 6), péptido Promega G biotinilado (SEQ. ID. 7), y péptido Promega H biotinilado (SEQ. ID. 8); y
- b.
- un recipiente que contiene una matriz de unión de biotina, en la que la matriz de unión de biotina tiene suficiente capacidad de unión y especificidad para el sustrato peptídico biotinilado.
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US208573 | 1994-03-04 | ||
| US08/208,573 US6348310B1 (en) | 1994-03-04 | 1994-03-04 | Quantitation of individual protein kinase activity |
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| ES2204946T3 true ES2204946T3 (es) | 2004-05-01 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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