JP2007195431A - 新規なプロテインキナーゼ活性の解析方法 - Google Patents

Abstract

【課題】安価な物質を用いて迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法により基質ペプチドのリン酸化を検出することにより、特に種々のプロテインキナーゼにおける動態を網羅的にプロファイリングできる方法を提供する。
【解決手段】基板上に固定化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質に、例えば式（Ｉ）に記載されるようなキレート性化合物を作用させた後、蛍光もしくは化学発光を用いてリン酸化を検出することを特徴とするリン酸化検出方法。
【化１】

【選択図】 なし

Description

本発明は、基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドが１もしくは複数種固定化されてなるアレイを用いたプロテインキナーゼ活性の解析方法であって、アレイ上でリン酸化されたペプチドもしくは蛋白質にキレート性化合物を作用させ、蛍光もしくは化学発光を用いてリン酸化を検出することによりリン酸化を検出する方法に関する。本発明により、迅速で効率的であり、しかも簡便に網羅的なプロテインキナーゼ活性の解析を実現することができる。

近年、細胞内シグナル伝達に関する研究は飛躍的に進歩しており、増殖因子やサイトカインにより活性化した細胞表面の受容体からどのように核へシグナルが伝達されるかはもとより、細胞周期、接着、運動、極性、形態形成、分化、生死などを制御する様々なシグナル伝達経路の実態が明らかになってきた。これらのシグナル伝達経路は独立して機能しているのではなく、互いにクロストークしあい、システムとして機能している。そして、癌をはじめ色々な疾病の原因が、これらのシグナル伝達経路の異常として説明されるようになってきた。

上述したシグナル伝達経路においては、蛋白質のリン酸化修飾に関与する様々な種類のプロテインキナーゼが複雑に関連しあいながら重要な役割を果たしていることが知られている。これらプロテインキナーゼの活性を網羅的に解析して、その細胞内における動態を一度にプロファイリングすることができれば、細胞生物学、薬学の基礎的研究はもとより、創薬開発、臨床応用などの分野においても大きく寄与しうるものと期待される。しかしながら、これまでには簡便で効率よく種々のプロテインキナーゼにおける動態を同時にプロファイリングできるような技術は、未だ確立されていないのが現状である。

既に報告されている関連する技術としては、例えばペプチドアレイを用いてチロシンキナーゼの一種であるｃＳｒｃキナーゼの活性を評価したことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。また、ｐ６０チロシンキナーゼやプロテインキナーゼＡ（以下、ＰＫＡとも示す。）などに関して、おのおのの基質ペプチドをガラススライドに固定化したアレイを用いて、蛍光標識された抗体を用いたリン酸化反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献２及び３参照）や、あるいは放射性物質（［γ^３２Ｐ］ＡＴＰ）を用いたアレイ上でのキナーゼ反応の検出系について報告されている例（例えば、非特許文献４，５及び６参照）がある。しかしながら、いずれの先行技術においても種々のプロテインキナーゼの動態を同時に効率的にプロファイリングための方法としては、十分な技術が開示されているものではない。また上記いずれの方法においても、蛍光性物質や放射性物質を用いる必要があり、解析に手間を要する点や、取り扱いの困難性、特殊な技術や施設の必要性などの点で大きな問題がある。

また、抗体を用いた検出系に関しては古くから広く適用されているものの、特にリン酸化セリン、リン酸化スレオニンを認識する抗体に関しては、その結合特異性や親和性の点で十分な特性を有するものも見出されておらず、精度のよい測定の実現には大きな問題がある。また抗体の場合は、リン酸化アミノ酸の種類に応じて別々なものを作用させる必要があることや、リン酸化アミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列への結合依存性が高い場合が多く、ユニバーサルな検出系手段として利用するにはあまり有利ではない。

Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｔ．Ｈｏｕｓｅｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第２０巻、第２７０〜２７４頁（２００２年３月発行） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０８５〜２０８８頁（２００２年発行） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ 第１２巻、第２０７９〜２０８３頁（２００２年発行） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 第１３巻、第３１５〜３２０頁（２００２年発行） Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 第２７７巻、第２７８３９〜２７８４９頁（２００２年発行） Ｓｃｉｅｎｃｅ 第２８９巻、第１７６０〜１７６３頁（２０００年発行）

本発明は、安価な物質を用いて迅速でしかも特別な技術を必要としない簡易な手法によりペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出することにより、特に種々のプロテインキナーゼにおける動態を網羅的にプロファイリングできる方法を確立しようとするものである。

本発明者らは、上記事情に鑑み鋭意検討を重ねた結果、基板上にプロテインキナーゼを認識するペプチドもしくは蛋白質が固定化されてなるアレイを用いて、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質にキレート性化合物を作用させ、蛍光もしくは化学発光を用いてリン酸化を検出する方法が、様々なプロテインキナーゼ動態を迅速に特に網羅的な解析を行う上で極めて有用であることを見出し、本発明に到達した。

本発明は、以下のような構成からなる。
（１）基板上に固定化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質にキレート性化合物を作用させた後、蛍光もしくは化学発光を用いてリン酸化を検出することを特徴とするリン酸化検出方法。
（２）キレート性化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする（１）のリン酸化検出方法。
（３）キレート性化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体であることを特徴とする（１）又は（２）のリン酸化検出方法。
（４）キレート性化合物が式（Ｉ）に記載される化合物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれかのリン酸化検出方法。
（５）基板がガラスであることを特徴とする（１）〜（４）のいずれかのリン酸化検出方法。
（６）基板の表面が金であることを特徴とする（１）〜（５）のいずれかのリン酸化検出方法。
（７）末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする（１）〜（６）のいずれかのリン酸化検出方法。
（８）キレート性化合物に蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾された化合物を用いることを特徴とする（１）〜（７）のいずれかのリン酸化検出方法。
（９）キレート性化合物にビオチンで修飾された化合物を用い、かつ蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする（１）〜（８）のいずれかのリン酸化検出方法。
（１０）ビオチンで修飾されたキレート性化合物と蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を用いることを特徴とする（１）〜（９）のいずれかのリン酸化検出方法。

本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼの動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列により依存されない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待される。

本発明における基板上のリン酸化されたペプチドもしくは蛋白質の検出方法としては、従来からよく知られているような蛍光性物質もしくは化学発光性物質を利用して行う。蛍光性物質は特に限定されるものではなく、あらゆる蛍光性化合物が適用される。例えば、ＦＩＴＣ，６−ＦＡＭ．Ｃｙ３、Ｃｙ５，Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ，ＴＡＭＲＡ，ＡＰＣなど一般的な蛍光アッセイに際して用いられるものが例示される。また、化学発光性物質を用いる場合についても特に限定されるものではなく、例えば、ルミノール、ルシゲリン、ロフィンなど一般的な化合物が例示される。

本発明において、基質として用いられるペプチドもしくは蛋白質はプロテインキナーゼの動態を網羅的にプロファイリングすることが目的であるので、１種類のペプチドもしくは蛋白質は１種類のプロテインキナーゼによってのみリン酸化され、他のプロテインキナーゼによってはリン酸化されないのが理想であり好ましい。プロテインキナーゼの基質となるアミノ酸配列は公知であるか、公知の配列に基づき適宜選択することが可能である。本発明のアレイがその動態の把握を必要とする複数のプロテインキナーゼの種類に対応した種類のペプチドもしくは蛋白質を固定化していれば、１枚のアレイで全てのプロテインキナーゼのプロファイリングをすることができ好ましい。もちろん１つのアレイに１種のみのプロテインキナーゼに対応するペプチドもしくは蛋白質を固定化し、必要な数のアレイを使用してプロテインキナーゼのプロファイリングを行ってもよい。

本発明において用いられるアレイの基板としては、ガラスが最も一般的で好ましいが、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカーボネート、アクリルなどのプラスチック類も挙げることができる。透明なガラスは容易に入手しやすく、汎用性の点でも特に有利である。ガラス基板を用いる場合、ガラスの種類や基板の厚さは特に限定されるものではないが、厚さとしては０．１〜２０ｍｍ程度が好ましく、例えば１〜２ｍｍ程度の基板が用いられる。大きさや形状に関しても特に限定されるものではないが、一般に普及されているアレイ解析装置への対応性を考慮すると、通常市販されているスライドグラスのサイズと同じものを用いるのが好ましい。

基板表面に関しては、例えばガラス表面に公知の方法に基づいてシランカップリングのような化学修飾を行い、官能基を導入されたものを用いることができる。具体的な官能基としては、アミノ基、カルボキシル基。チオール基、エポキシ基などが挙げられる。あるいは、基板の表面が金属薄層でコーティングされていてもよい。コーティングされる金属の種類としては、金、銀、白金などが例示されるが、酸・アルカリ・有機溶媒などに非常に安定性の高い金が好ましい。金を用いる場合、上述したような官能基を末端に有してなるようなアルカンチオール化合物を用いることによる表面化学の改質に関しては、その実績や知見も数多く報告されていることからも、金表面に対して官能基を容易に導入する事ができる点で有用である。

金属、特に金をコーティングする場合、その方法は特に限定されるものではないが、一般的に蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが選択される。金属薄層の厚みをナノレベルでコントロールするのが好ましい。金属薄層の厚みも特に限定されるものではないが、一般的には２０〜１００ｎｍ、好ましくは３０〜８０ｎｍの範囲で選択される。また、金属薄層の剥離を抑制するために、０．５〜１０ｎｍ程度、好ましくは１〜５ｎｍ程度のクロム層やチタン層を予め基板にコーティングしておいてもよい。

本発明において、ペプチドもしくは蛋白質とは、複数のアミノ酸が縮合結合されて連結された通常のポリペプチド全般を指すものである。プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼとしては、蛋白質のセリン、スレオニンなどのアミノ酸の側鎖をリン酸化する酵素が挙げられ、例えばｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼファミリー（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ファミリー、ＭＡＰキナーゼ（ＭＡＰＫ）、などが例示できるが、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに関して適用することが可能である。

これら該プロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質は公知のものであってもよいが、アミノ酸配列は公知の配列に基づき適宜選択することも可能である。ペプチドを用いる場合の長さは一般的に１００アミノ酸残基以下のものが用いられるが、好ましくは３０アミノ酸残基、より好ましくは８〜２５アミノ酸残基、更に好ましくは１０〜２０アミノ酸残基程度からなるものが用いられる。また、蛋白質を用いる場合の分子量は特に限定されるものではない。上記ペプチドもしくは蛋白質の生成手法は特に限定されるものではなく、化学的もしくは遺伝子工学的な公知の手法により生成することが可能である。本発明においてプロテインキナーゼの基質となるペプチドもしくは蛋白質とは、該プロテインキナーゼによりリン酸化反応を受ける性質を有するペプチドもしくは蛋白質をいうものである。

本発明においては、ペプチドもしくは蛋白質が上述したような基板上に固定化されたアレイを用いる。ペプチドもしくは蛋白質は、プロテインキナーゼの基質として機能しうるようなアミノ酸配列を含有するものを少なくとも１つ、好ましくは異なる種類のプロテインキナーゼによりリン酸化を受けるアミノ酸配列のものを複数種が用いられる。更には、予めリン酸化されたアミノ酸残基を含むもの（ポジティブコントロール）、あるいはネガティブコントロールも同じ基板上に固定化されているのが好ましい。ネガティブコントロールを用いる場合は、リン酸化部位がセリン残基、スレオニン残基の場合はアラニン残基に、リン酸化部位がチロシン残基の場合はフェニルアラニン残基に置換されたものが好ましい。合成のしやすさ、取り扱いやすさ、保存安定性などの点では、比較的低分子量のペプチドを用いる方がより好ましい。

本発明に用いられるアレイにおけるペプチドもしくは蛋白質の基板への固定化方法に関しては特に限定されるものではなく、ポリペプチド配列において存在するアミノ基やチオール基を介した方法、あるいはＨｉｓタグ、ＧＳＴタグ等を用いる方法など様々な様式が挙げられる。

Ｊ．Ｍ．ＢｒｏｃｋｍａｎらによりＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１２１巻、第８０４４〜８０５１頁（１９９９年）において報告されているような方法に基づいて、アルカンチオール層を介して固定化し、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）によりバックグラウンドを修飾する方法を用いてもよい。また、非特異的な影響をより抑えるために、ＰＥＧの末端に上述のような官能基が導入された誘導体をアルカンチオールに結合させた後に、ペプチドを固定化することも、スペーサー効果を奏する点で有用である。

具体的には、例えば金属薄膜にカルボキシメチルデキストランあるいはカルボキシル基で末端が修飾されたＰＥＧのような水溶性高分子を結合させて表面にカルボキシル基を導入して、ＥＤＣ（１−エチル−３，４−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド）のような水溶性カルボジイミドを用いてＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）のエステルとして、活性化されたカルボキシル基にペプチドもしくは蛋白質のアミノ基を反応させる方法が挙げられる。あるいは表面をマレイミドにより修飾した後、システインのようなチオール基を含むアミノ酸残基を介して固定化してもよい。この場合のシステイン残基はペプチドの一方の末端に付加されてなるのが好ましい。非特異的な影響を低減させるためには、後者のチオール基を介した固定化方法がより好ましいが、特に限定されるものではない。

上述したＨｉｓ−ｔａｇやＧＳＴのようなタグを付加したペプチドを固定化する方法も非常に簡便で有用である。この場合には、上述のように金属表面にアルカンチオールを介してアミノ基やカルボキシル基を導入した後に、それぞれＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）、グルタチオンを金属薄膜上に導入させておくのがよい。Ｈｉｓ−ｔａｇの場合は、ＮＴＡを導入したアレイを塩化ニッケルにより処理した後で基質を固定化する。

上述した方法の中では、特にチオール基を介してペプチドを固定化する方法が、特異性、感度の両面から特に好ましい。この場合には、システイン残基を介して固定化を行うのが好ましい。

固定化されるペプチドのアミノ酸配列において少なくとも１箇所以上のシステイン残基が存在することが好ましい。システイン残基は固定化されるペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列として必須な残基として存在している場合であっても、あるいはペプチドが本来の機能を奏するために必要なアミノ酸配列に対してさらに付加された場合であってもよい。固定化されるペプチドにおけるシステイン残基の存在位置は特に限定されないが、好ましくは少なくとも一方の末端に、より好ましくは一方の末端のみに付加されてなる方がよい。一方の末端にシステイン残基を付加させる場合、システイン残基のみを付加してもよいが、固定化されたペプチドの自由度を上げることにより作用させる物質との相互作用の効率を高めるためにスペーサーとして１乃至数残基のアミノ酸配列をさらに付加させてもよい。スペーサー部分のアミノ酸配列は特に限定されないが、なかでもグリシン残基及び／又はアラニン残基もしくはセリン残基が１乃至数個の配列を付加させることが特に好ましい。あるいは、末端のシステイン残基と基質配列との間には、上述のようなアミノ酸配列の替わりに例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような親水性高分子が挿入されていてもよい。

上述のように、チオール基を介してペプチドを固定化する場合、ヘテロ二官能基型リンカーを導入するのが好ましい。ヘテロ二官能基型リンカーの化学構造は特に限定されるものではないが、予めアミノ基を表面に導入した後、スクシンイミド（ＮＨＳ）基もしくは硫酸スクシンイミド基とマレイミド（ＭＡＬ）基を有するヘテロ二官能型架橋剤を用いることが特に好ましい。このようなヘテロ二官能型架橋剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いることも可能であるが、ペプチドの固定化収率を向上させるためには、より低分子量のものを用いてもよい。具体的には、式（ＩＩ）に示す化合物Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＭＣＣと示す。）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４−［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ（以下、ＳＳＭＣＣと示す。）が挙げられる。なお、式（ＩＩ）もしくは式（ＩＩＩ）に示す化合物と完全に同一構造のものだけを指すのではなく、その機能を損なわない範囲でアナログ化された化合物をも包含される。また、本発明においてはＳＭＣＣ及びＳＳＭＣＣのいずれも適用することが可能であるが、水に対する溶解性の点からは、緩衝液のような水系で反応させる場合においてはＳＳＭＣＣを用いる方がより好ましい。

ＰＥＧのような親水性高分子の両端がＮＨＳ基とＭＡＬ基で修飾されたものを用いる場合、特にサイズは限定されるものではない。好ましくは、例えば分子量が５００〜５０００程度であることが好ましく、より好ましくは８００〜２０００程度、更に好ましくは６００〜１２００程度のものが用いられる。

上述のように表面に官能基が導入された基板上にペプチドもしくは蛋白質溶液を作用させてアレイを作製するが、その際にはマニュアル操作で行うことも可能ではあるが、自動スポッターのようなスポッティング装置を用いて行う方が好ましい。自動スポッターの形式や種類は特に制約されるものではなく、一般的に普及されているようなスポッティング装置を用いることが可能である。スポットの大きさについても特に限定されないが、１〜１０００μｍ程度が好ましく、１０〜６００μｍがより好ましく、１００〜５００μｍが更に好ましい。スポットするペプチドもしくは蛋白質溶液は、ＰＢＳのような緩衝液に溶解させたものを用いるのが好ましいが、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）のような有機溶媒を適当な比率で混合してあるいはそのまま用いてもよい。

プロファイリングの対象となるプロテインキナーゼは市販されているような試薬であってもよいが、細胞由来の抽出液中に既に含まれる、もしくは含まれると推定されるものを用いることも可能である。例えば、バッファーもしくは細胞抽出液または両者混合液中にプロテインキナーゼ試薬もしくは細胞抽出液中に既に含まれるプロテインキナーゼとヌクレオシド三リン酸を加えたものを直接アレイに作用させることにより固定化基質のリン酸化を行うことができる。リン酸化の条件はプロテインキナーゼの種類により変動するが、通常は１０〜４０℃程度、好ましくは２０〜４０℃程度の温度で５分〜８時間程度、好ましくは１０分〜５時間程度反応させることで、ペプチドもしくは蛋白質をリン酸化することができる。必要に応じてリン酸化反応液中には、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、Ｍｇ^２＋、Ｃａ^２＋などのリン酸化を補助、促進する物質を共存させてもよい。

本発明においては、アレイ上における基質のリン酸化を特異的に感度よくモニターするためにキレート化合物を用いる。キレート化合物とは一般に多座配位子ないしキレート試薬が、亜鉛、鉄、コバルト、パラジウムのような金属イオンに配位して生じた錯体をいうものを指すが、特にリン酸に選択的かつ可逆的に結合する性質を有する化合物が好ましい。キレート化合物として、上述したような蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾されたものを直接用いてもよい。なかでも、ポリアミン亜鉛錯体を用いることがより好ましい。ポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体を用いることが更に好ましい。更に、二核亜鉛（ＩＩ）錯体を基本構造にもつヘキサアミン二核亜鉛（ＩＩ）錯体を用いることがより好ましい。

このような化合物の典型としては、式（Ｉ）に示されるような１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパノラート（ＩＵＰＡＣ名：１，３−ｂｉｓ［ｂｉｓ（２−ｐｙｒｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ］−２−ｐｒｏｐａｎｏｌａｔｏｄｉｚｉｎｃ（ＩＩ） ｃｏｍｐｌｅｘ）を基本骨格とするポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体（ただし、プロパノール骨格の水酸基はアルコラートとして二つの亜鉛２価イオンの架橋配位子になっている）が挙げられるが、本発明は特にこの化合物に限定されるものではない。

上述した錯体化合物は、一般的な化学合成技術を利用して合成することが可能であるが、市販の化合物を原料としても合成することができる。例えば、上記式（Ｉ）で示される化合物（Ｚｎ_２Ｌ）は、市販の１，３−ビス[ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパンと酢酸亜鉛を原料として次の方法により合成することができる。１，３−ビス［ビス（２−ピリジルメチル）アミノ］−２−ハイドロキシプロパン４．４ｍｍｏｌのエタノール溶液（１００ｍｌ）に１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．４４ｍｌ）を加え、次いで酢酸亜鉛二水和物（９．７ｍｍｏｌ）を加える。溶媒を減圧留去することにより褐色のオイルを得ることができる。この残渣に水１０ｍｌを加えて溶解後、１Ｍ過塩素酸ナトリウム水溶液（３当量）を７０℃に加温しながら滴下して加え、析出する無色の結晶を濾取し、加熱乾燥することにより式（Ｉ）の構造式で表される酢酸イオン付加体の二過塩素酸塩（Ｚｎ_２Ｌ−ＣＨ_３ＣＯＯ⁻・２ＣｌＯ_４ ⁻・Ｈ_２Ｏ）を高収率で得ることができる。この結晶は一分子の結晶水を含んでいる。

本発明においては、上述のようなポリアミン亜鉛錯体がビオチンにより修飾されたものを用いてもよい。直鎖状もしくは分岐状のリンカー構造を介してビオチン修飾されていることがより好ましい。リンカー構造の分子量としては５００〜１０００の範囲であり、より好ましくは６００〜９００、更に好ましくは７００〜９００である。具体的には、式（ＩＶ）に示されるような構造のものが例示されるが、特に限定されるものではない。ビオチン修飾されたポリアミン亜鉛錯体の分子量が１０００を超えると、安定性も悪くなり、リン酸への結合効率の点からも好ましくない。

上記の場合に、作用されるビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の溶液濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されないが、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体溶液をアレイ表面全体に広がるのに必要な液量をドロップしてもよいし、溶液中にアレイを浸漬させてもよい。あるいはポンプを用いて溶液を送液しながら、アレイ表面上に溶液を接触させることにより作用させてもよい。作用温度は室温でもよいし、２０〜４０℃程度の一定温度でインキュベートさせてもよい。作用時間は１０分から２時間程度が好ましく、３０分から１時間程度がより好ましい。

本発明においては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた後、更にアビジンもしくはストレプトアビジンのようなレセプターを作用させることが好ましい。ストレプトアビジンを作用させる方がより好ましい。作用させるアビジンもしくはストレプトアビジンの濃度は特に限定されないが、通常は１μＭ〜１０Ｍ、好ましくは１０μＭ〜１Ｍ、より好ましくは１０μＭ〜１０ｍＭの範囲である。またアレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体の場合と同様である。その場合、アビジンもしくはストレプトアビジンに、上述したような蛍光性物質もしくは化学発光性物質により標識されているものを用いてもよい。

あるいは、アビジンもしくはストレプトアビジンを作用させた後に、更にアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させることにより、検出感度を更に高めることが可能になる。その際に上述したような蛍光性物質もしくは化学発光性物質により標識されているものを用いるのが好ましい。抗体を作用させる際の濃度は特に限定されないが、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．１からμｇ／ｍｌ程度である。抗体としてはモノクロナール抗体、ポリクロナール抗体いずれも適用できるが、特異性の点でモノクロナール抗体の方が好ましい。アレイへの作用様式に関しても特に限定されるものではなく、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンの場合と同様である。

また、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体、アビジンもしくはストレプトアビジンを順次作用させてもよいが、予めビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンの複合体を形成させたものを直接作用させてもよい。この場合も上述のように、さらにアビジンもしくはストレプトアビジンを認識する抗体を作用させてもよい。複合体の形成に際しては、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体とアビジンもしくはストレプトアビジンとのモル比にして１：１乃至４：１にして反応させるのがよい。反応物は精製して未反応物を除去する方が好ましいが、反応物をそのまま適用することも可能である。

こうしたキレート性化合物の適用は、上述したような方法により非常に安価に合成することができる点で有利である。また常温により保存ができる点でも安定で使いやすく、流通面においても有利である。またリン酸化されるアミノ酸残基の種類に関係なく作用をすることや、リン酸化されたアミノ酸の近傍におけるアミノ酸配列に対して反応が依存しない点において、特に抗体を用いて検出する方法と比較して大きな優位性を有している。

また、上記プロテインキナーゼとしては、種々のチロシンキナーゼあるいはセリン／スレオニンキナーゼが挙げられる。これらプロテインキナーゼの種類については特に限定されるものではなく、基本的にはあらゆる種類のプロテインキナーゼに対して適用することが可能である。

以下、実施例を挙げることにより、本発明をより具体的に説明するが、本発明は実施例に特に限定されるものではない。

［実施例１］
（ペプチド固定化）
アミノ基が高密度に導入されたガラス基板（松浪硝子工業製ＳＤＭ００１１；サイズ：２５．４ｍｍ×７６．２ｍｍ×１ｍｍ、コートタイプ：高密度化アミノ基導入コート）を用い、０．４ｍｇ／ｍｌ濃度のＳＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ製）溶液（１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ リン酸バッファー；ｐＨ７．４に溶解して調製した。）を各々のガラス基板上のペプチドを固定化する領域を覆うように、３００μｌをドロップして溶液を広げて、室温で１５分間置反応させた。こうして、基板上にマレイミド基表面を形成させることができた。その後ガラス基板をエタノール、水の順で洗浄し乾燥させた。

乾燥後、ガラス基板上に基質となる合成ペプチド（以下、基質ペプチドとも示す。）をスポッター（東洋紡績製ＭｕｌｔｉＳＰＲｉｎｔｅｒ（登録商標）自動スポッター）を用いて１０ｎｌずつスポットし、湿度を保った状態で、室温で１６時間静置して基質ペプチドを固定化させた。用いた基質ペプチドは、配列表に示したアミノ酸配列のものであり、図１に各基質ペプチドの固定化された配置を示した。Ｎｏ．１，２はＰＫＡ基質のそれぞれセリン型基質（配列番号１）（PKA pSerと略すことがある）、スレオニン型基質（配列番号２）（PKA pThrと略すことがある）が予めリン酸化されたポジティブコントロール基質、Ｎｏ．３，４がＰＫＡ基質のそれぞれセリン型基質（配列番号3）（PKA Serと略すことがある）、スレオニン型基質（配列番号４）（PKA Thrと略すことがある）、Ｎｏ．５はセリン残基がアラニン残基に置換されたネガティブコントロール（配列番号５）（PKA Alaと略すことがある）、Ｎｏ．６はペプチドが固定化されていないブランクである。いずれのペプチドも末端にシステイン残基が付加されてなり、このシステイン残基の有するチオール基が、基板表面のマレイミド基とカップリング反応することにより基板上に基質ペプチドが固定化されるものである。基質ペプチドの固定化パターンは図１に示す通りである。基質ペプチド溶液は、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び１ｍＭ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（東京化成工業製）を含む１０ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中に１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように溶解したものを用いた。

（未反応マレイミド基のブロッキング）
基質ペプチドを固定化した表面をリン酸緩衝液で洗浄した後、未反応のマレイミド基をブロッキングするために、ＰＥＧチオール（日本油脂製ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標） ＭＥＳＨ−５０Ｈ）を１ｍＭ濃度になるようにリン酸緩衝液（２０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ；ｐＨ７．２）に溶解して、３００μｌをチップ上に注出し、室温で３０分反応させた。ここで用いたＰＥＧチオールの分子量は５，０００である。

（リン酸化の検出）
上記のようにブロッキングを行ったアレイをＰＢＳ及び水でアレイの洗浄を行い、ＰＫＡによるリン酸化を行った。ＰＫＡ溶液４００μｌをアレイ上にドロップして、３０℃で２時間の反応を行った。ＰＫＡ溶液の組成は、ＰＫＡ触媒サブユニット（プロメガ製）１μｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）３７５μｌ、１Ｍ塩化マグネシウム溶液２０μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ４μｌとした。

上記のアレイをＰＢＳ、水の順で洗浄した後、ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体を作用させた。ビオチン修飾ポリアミン亜鉛錯体としては、以下の式（ＩＶ）に示されるＰｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４（株式会社ナード研究所より購入）を用いた。Ｐｈｏｓ−ｔａｇ（登録商標）ＢＴＬ−１０４は２５μｇ／ｍｌ濃度とし、溶解液には０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０，１０％（ｖ／ｖ）エタノール、０．２Ｍ硝酸ナトリウム、１ｍＭ硝酸亜鉛を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いた。作用は室温で１時間行った。

次に、蛍光標識されたストレプトアビジン（以下、ＳＡと示すこともある。）を作用させた。蛍光標識されたＳＡとしては、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５３２標識ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ製）の２種をいずれも１μｇ／ｍｌ濃度で用いた。蛍光標識ＳＡのそれぞれの溶液を１０μｇ／ｍｌ濃度で１５分間、室温で反応に用いた。反応溶液３００μｌをアレイ上にドロップして溶液を広げて室温で３０分間反応させた。

上記アレイをＰＢＳ、水の順に洗浄して乾燥させ、蛍光イメージング解析を行った。アレイ解析に際しては、マイクロアレイスキャナＧｅｎｅＰｉｘ４２００ＡＬ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ製）を用いた。結果を図２に示した。リン酸化セリン体基質（Ｎｏ．１：PKA pSer）、リン酸化スレオニン体基質（Ｎｏ．２：PKA pThr）において特に強い発色が認められ，更にセリン体基質（Ｎｏ．３：PKA Ser）、スレオニン体基質（Ｎｏ．４：PKA Thr）においてもある程度の発色が見られる。アラニン体基質（Ｎｏ．５：PKA Ala）やブランク（Ｎｏ．６）のスポットにおいてはほとんど発色が認められない。したがって、ＰＫＡによりＯｎ−ｃｈｉｐでリン酸化された基質の検出に成功できているものといえる。

［実施例２］
（ペプチドアレイの作製）
スライドグラス（松浪硝子工業製Ｓ１２２６；サイズ：２６ｍｍ×７６ｍｍ×１ｍｍ）に金を蒸着処理した金スライド（コート内容：１層目 クロム２０Å、２層目 金４５０Å）を、１ｍＭ濃度の８−Ａｍｉｎｏ−１−ｏｃｔａｎｅｔｈｉｏｌ，ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（同仁化学製）のエタノール溶液中に室温で１．５時間浸漬させた。こうしてアミノ基が金表面に導入された金スライドを、エタノール及び水で洗浄して乾燥を行い、ＳＳＭＣＣによる処理以降の操作を実施例１と全く同様にして、ペプチドアレイを作製した。

（未反応マレイミド基のブロッキング）
実施例１と全く同様にして行った。

（リン酸化の検出）
実施例１と全く同様にして、ＰＫＡによるリン酸化反応及び検出を行った。結果を図３に示した。この場合も、図２と概ね同様の傾向をより高感度に確認することができており、Ｏｎ−ｃｈｉｐでリン酸化された基質の検出に成功できているものといえる。

本発明の方法により、特殊な技術を要することもなく、非常に簡便で迅速に様々なプロテインキナーゼ動態の解析を行うことが可能となった。キレート化合物を用いることにより、安価で取り扱いも容易であるうえに、リン酸化アミノ酸の種類やその近傍のアミノ酸配列による影響も受けない点でも従来の方法と比べて大きな優位性がある。本発明を利用することにより、特に多種類のプロテインキナーゼシグナルを網羅的に解析することができ、機能が未知な遺伝子の導入、あるいは薬物投与に伴う細胞内のプロテインキナーゼ動態を効果的にプロファイリングすることができる。これにより新規な遺伝子からの機能解析、新薬探索へのアプローチといったゲノム創薬への展開が期待され、産業界に寄与することが大である。

実施例１及び２において作製されたアレイ上のペプチドの固定化パターンを示す図である。 実施例１において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化に関するアレイ解析を行った結果を示す図である。 実施例２において、ＰＫＡによるＯｎ−ｃｈｉｐリン酸化に関するアレイ解析を行った結果を示す図である。

Claims (10)

1. 基板上に固定化されたペプチドもしくは蛋白質のリン酸化を検出する方法であって、リン酸化されたペプチドもしくは蛋白質にキレート性化合物を作用させた後、蛍光もしくは化学発光を用いてリン酸化を検出することを特徴とするリン酸化検出方法。
2. キレート性化合物がポリアミン亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１記載のリン酸化検出方法。
3. キレート性化合物がポリアミン化合物を配位子として有する二核亜鉛錯体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のリン酸化検出方法。
4. キレート性化合物が式（Ｉ）に記載される化合物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
   
5. 基板がガラスであることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
6. 基板の表面が金であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
7. 末端にシステイン残基の付加されているペプチドが固定化されてなることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
8. キレート性化合物に蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾された化合物を用いることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
9. キレート性化合物にビオチンで修飾された化合物を用い、かつ蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンを作用させることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載のリン酸化検出方法。
10. ビオチンで修飾されたキレート性化合物と蛍光性物質もしくは化学発光性物質により修飾されたアビジンもしくはストレプトアビジンとの複合体を用いることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載のリン酸化検出方法。