DE02747916T1 - Immunaffinitätsisolierung modifizierter peptide aus komplexen gemischen - Google Patents

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Hui Zhang
Xiangming Zha
J. Michael COMB
Yi Tan
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Abstract

Verfahren zum Isolieren eines modifizierten Peptids aus einem komplexen Gemisch von Peptiden, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Erhalten eines proteinhaltigen Präparats aus einem Organismus, wobei das proteinhaltige Präparat modifizierte Peptide von zwei oder mehr verschiedenen Proteinen umfasst;
(b) Kontaktieren des proteinhaltigen Präparats mit mindestens einem immobilisierten Modifikations-spezifischen Antikörper; und
(c) Isolieren mindestens eines modifizierten Peptids, das durch den immobilisierten Modifikations-spezifischen Antikörper in Schritt (b) spezifisch gebunden wird.

Claims (40)

  1. Verfahren zum Isolieren eines modifizierten Peptids aus einem komplexen Gemisch von Peptiden, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalten eines proteinhaltigen Präparats aus einem Organismus, wobei das proteinhaltige Präparat modifizierte Peptide von zwei oder mehr verschiedenen Proteinen umfasst; (b) Kontaktieren des proteinhaltigen Präparats mit mindestens einem immobilisierten Modifikations-spezifischen Antikörper; und (c) Isolieren mindestens eines modifizierten Peptids, das durch den immobilisierten Modifikations-spezifischen Antikörper in Schritt (b) spezifisch gebunden wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner den Schritt (d) der Charakterisierung des in Schritt (c) isolierten modifizierten Peptids durch Massenspektrometrie (MS), Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) und/oder MS3-Analyse umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Massenspektrometrie MALDI-TOF-MS, die Tandem-Massenspektrometrie LC-MS/MS und die MS3-Analyse LC-MS3 umfasst.
  4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, welches ferner den Schritt (e) der Verwendung eines Suchprogramms umfasst, um die während des Charakterisierungsschritts (d) für das modifizierte Peptid erhaltenen Spektren im Wesentlichen mit den Spektren für eine bekannte Peptidsequenz abzugleichen und dadurch das oder die Ausgangsprotein(e) des modifizierten Peptids zu identifizieren.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das proteinhaltige Präparat eine verdaute biologische Probe umfasst, die ausgewählt ist aus einem verdauten rohen Zellextrakt, einer verdauten Gewebeprobe, einer verdauten Serumprobe, einer verdauten Urinprobe, einer verdauten Synovialflüssigkeitsprobe und einer verdauten Spinalflüssigkeitsprobe.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das verdaute Präparat erhalten wird unter Verwendung mindestens eines proteolytischen Enzyms oder mindestens einer chemischen Spaltung.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das proteolytische Enzym immobilisiert ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das proteolytische Enzym löslich ist und wobei das verdaute Präparat vor dem Kontaktierungsschritt (b) mit einem Proteolysehemmer behandelt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (a) ferner die Vorreinigung des proteinhaltigen Präparats durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie (IMAC) umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der immobilisierte Antikörper von Schritt (b) kovalent an ein Chromatographie-Harz gebunden ist oder nicht-kovalent an Protein A- oder Protein-G-Agarose gebunden ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Harz in einer Säule oder Mikropipettenspitze enthalten ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 2, wobei der immobilisierte Antikörper von Schitt (b) in einem Chromatographie-Harz in einer Säule immobilisiert ist, wobei die Säule an ein Massenspektrometer für die Charakterisierung von Schritt (d) gekoppelt ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Modifizierung eine Phosphorylierung umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das oder die modifizierte(n) Peptid(e) ein Phosphopeptid umfassen.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Modifikations-spezifische Antikörper einen Motiv-spezifischen, Kontext-unabhängigen Antikörper umfasst, der ein Motiv umfassend mindestens eine phosphorylierte Aminosäure erkennt.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Motiv aus einer einzelnen phosphorylierten Aminosäure besteht.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Motiv das gesamte oder einen Teil eines Kinase-Consensus-Substratmotivs oder eines Protein-Protein-Bindungsmotivs umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Kinase-Consensus-Substratmotiv ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus MAPK-Consensus-Substratmotiven, CDK-Consensus-Substratmotiven, PKA-Consensus-Substratmotiven, AKT-Consensus-Substratmotiven, PKC-Consensus-Substratmotiven, Phosphothreonin-X-Arginin und ATM-Consensus-Substratmotiven, und wobei die Protein-Protein-Bindung ein 14-3-3-Bindungsmotiv oder ein PDK1-Andockmotiv ist.
  19. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Modifikations-spezifische Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler Antikörper ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt (c) isolierte modifizierte Peptid einem bekannten Krankheitsmarker entspricht.
  21. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das in Schritt (d) charakterisierte modifizierte Peptid eine unbekannte Modifikationsstelle des Ausgangsproteins umfasst.
  22. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, welches ferner den Schritt (e) des Vergleichens des Modifikationszustandes des in Schritt (d) charakterisierten modifizierten Peptids mit dem Modifikationszustand eines entsprechenden Peptids in einer Vergleichsprobe umfasst, um dadurch die Proteinaktivierung in dem proteinhaltigen Präparat mit der Proteinaktivierung in der Vergleichsprobe zu vergleichen.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das proteinhaltige Präparat einem erkrankten Organismus und die Vergleichsprobe einem normalen Organismus entspricht, wobei die Vergleich der Proteinaktivierung Information über die von der Krankheit bewirkten Aktivierungsänderungen liefert.
  24. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das proteinhaltige Präparat aus einer Gewebebiopsie-Zelle oder einer klinischen Flüssigkeitsprobe erhalten wird und die Vergleichsprobe einem erkrankten Organismus entspricht, wobei der Vergleich der Proteinaktivierung Information liefert, die für die Diagnose der Krankheit nützlich ist.
  25. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Proteinpräparat einem mit mindestens einer Testverbindung behandelten Organismus oder Präparat entspricht und die Vergleichsprobe einem unbehandelten Organismus oder Präparat entspricht, wobei der Vergleich der Proteinaktivierung Information über Aktivierungsänderungen liefert, die durch die Behandlung mit der Testverbindung verursacht werden.
  26. Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Vergleich der Proteinaktivierung das in Schritt (d) charakterisierte modifizierte Peptid identifiziert als entsprechend einem Ausgangsprotein, von dem vorher nicht bekannt war, dass es bei der Krankheit derart modifiziert wird.
  27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Krankheit Krebs ist.
  28. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Testverbindung ein Krebstherapeutikum umfasst.
  29. Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Testverbindung einen Kinasehemmer umfasst.
  30. Verfahren zum Isolieren eines Phosphopeptids aus einem komplexen Gemisch von Peptiden, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Erhalten eines proteinhaltigen Präparats aus einem Organismus, wobei das proteinhaltige Präparat Phosphopeptide von zwei oder mehr verschiedenen Proteinen umfasst; (b) Kontaktieren des proteinhaltigen Präparats mit mindestens einem immobilisierten Motiv-spezifischen, Kontext-unabhängigen Antikörper, der ein Motiv umfassend mindestens eine phosphorylierte Aminosäure bindet; (c) Isolieren mindestens eines Phosphopeptids, das durch den immobilisierten Antikörper in Schritt (b) spezifisch gebunden wird; und (d) Charakterisieren des in Schritt (c) isolierten modifizierten Peptids durch Massenspektrometrie (MS), Tandem-Massenspektrometrie (MS-MS) und/oder MS3-Analyse.
  31. Verfahren nach Anspruch 30, welches ferner den Schritt (e) der Verwendung eines Suchprogramms umfasst, um die während des Charakterisierungsschritts (d) für das modifizierte Peptid erhaltenen Massenspektren im Wesentlichen mit den Massenspektren für ein Peptid von einem oder mehreren bekannten Proteinen) abzugleichen und dadurch das oder die Ausgangsproteine) des modifizierten Peptids zu identifizieren.
  32. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die Massenspektrometrie MALDI-TOF-MS, die Tandem-Massenspektrometrie LC-MS/MS und die MS3-Analyse LC-MS3 umfasst.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei Schritt (a) ferner den Verdau des proteinhaltigen Präparats umfasst, um ein komplexes Gemisch von Peptiden zu erzeugen.
  34. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das Motiv von Schritt (b) das gesamte oder einen Teil eines Kinase-Consensus-Substratmotivs oder eines Protein-Protein-Bindungsmotivs umfasst oder aus einer einzelnen phosphorylierten Aminosäure besteht.
  35. Immunoaffinitäts-Isoliervorrichtung für die Isolierung von modifizierten Peptiden eines komplexen Gemischs, wobei die Vorrichtung einen Träger umfassend mindestens einen Modifikations-spezifischen Antikörper umfasst, der an einem festen unporösen oder makroporösen Harz immobilisiert ist.
  36. Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei der Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer dünnen Kapillarsäule mit einem Innendurchmesser von etwa 50 bis 300 Mikrometern und einer Mikropipettenspitze.
  37. Vorrichtung nach Anspruch 35, wobei der Modifikations-spezifische Antikörper einen Motiv-spezifischen, Kontext-unabhängigen Antikörper umfasst.
  38. Vorrichtung nach Anspruch 36, wobei die Säule so ausgestaltet ist, dass sie mit einer Elektrosprühquelle auf einem Massenspektrometer gekoppelt werden kann.
  39. Antikörper, der Ubiquitin-Fusionsabbauprotein 1 (UFD1) nur dann bindet, wenn es an Serin 335 phosphoryliert ist, und UFD1 im Wesentlichen nicht bindet, wenn es nicht an diesem Rest phosphoryliert ist.
  40. Antikörper, der Protein-Tyrosin-Phospatase 1c (PTN6) nur dann bindet, wenn es an Serin 588 phosphoryliert ist, und PTN6 im Wesentlichen nicht bindet, wenn es nicht an diesem Rest phosphoryliert ist.
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