JPS62239054A - 試料中の分析対象物の目視試験用のレインボーカラー発色試験組成物及び試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り一文里り】１ 本発明は、分析対象物の種々の濃度に対して種々の色相
を発し得る試験組成物及び試験具に関する。臨床的分析
対象物の目視試験が本発明の焦点である。

詳細には、本発明はレインボーカラー（ＲＡＩＮＢＯＷ
）を発する（多色呈色性の）、体液中の分析対象物、例
えばグルコースを測定するための自己表示試験具を提供
する。

ルユ」遣 比色試験は、目視試験として好都合に用いられており、
それを用いれば、比較的未熟練の者でも適切なカラー・
チャートとの単なる比較により、結果を経常的に得るこ
とができる。目視試験は、測定機器を必要としないため
安価で軽便である。現在、目視試験は尿試料中の、多く
の診断上重要な分析対象物の日常的なスクリーニングに
；糖尿病患者による、尿又は血液グルコースの家庭用試
験に；またその他の分野、例えば水の鉄台有利の試験に
用いられている。

しかしながら、現在入手可能な試験手段は、ある特定の
色の強度を分析対象物の濃度に関係づけるものである。

例えば、ある試験具は、グルコース濃度の増加に伴い、
無色から除々に淡青色を経て濃い青色に変化する。単色
の種々の濃淡よりも、一定範囲の（種々の）色相によっ
て示されたならば、視認が大Ｉ１１に可能となり、それ
に伴って正確度も増す。したがって、分析対象物の異っ
た濃度に対して異った色を発する試験組成物の方が使用
が容易であり、より正確な目視結果を与える。

グルコースのより高い濃度間の目視による識別を可能と
するために、現在入手可能な製品の多くは、２個の試薬
パッドを使用する方法をとっており、それらの片方が、
高い濃度域においてより良好な色差を示す。さもないと
、かかる製品は、１５０ｍｇ／ｄＬを越えるグルコース
濃度には極めて僅かに変化する濃い青色（又は濃い緑色
）の濃淡を示すのみである。対照的に、本発明の試験具
は、０〜８００ｍｇ／　ｄ　Ｌの範囲に亘って、青色か
ら海緑色、淡黄色、更には赤色へと劇的な色変化を示す
。

本発明は、特に臨床的に重要な分析対象物に対して一定
範囲の色相を生じせしめるために用いることのできる組
成物を提供する。特に、虹のスペクｉ・ル全ての色相を
示すことができる、全血のような体液中のグルコース測
定のための試験具を示す。

則−情ｌ漫訓逐 米国特許第４，４９０，４６５号は、測定範囲が拡大さ
れた、グルコース測定用の試験系を開示している。上記
系には、少くとも１個のピリジン結合デヒドロゲナーゼ
と１個の非ピリジン結合デヒドロゲナーゼが含まれてい
る。その−例としては、グルコースデヒドロゲナーゼ／
ニコチンアデニンジヌクレオチド／ジアホラーゼ／テト
ラゾリウム塩とグルコースデヒドロゲナーゼ／ジクロロ
フェノールインドフェノールとの複合系を用いたグルコ
ース測定法が挙げられる。パックブラウンド染祠の使用
によって、（’ＴＪられた色素の中に黄色成分が、取入
れられる。

ＤＥ３２　１１　１６７号は、それぞれが、触媒として
作用することにより基質を直接又は間接的に変換するこ
とができる少くとも２種の酵素系を請求している。上記
明細書は「互いに独立して」と限定しているが、これは
基質と反応する２つの系の存在下に、第１の系の補酵素
の大部分が消耗された後にのみ第２の系による反応が起
こることを意味するものである。

ＤＥ　　３２　４ｊ８９４号は還元されたニコチンアデ
ニンジヌクレオチドの測定のための試験系及び方法を開
示しており、これにより、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈｌ又はＮＡＤ
　（Ｐ）Ｈの形成又は消耗下に反応する基質もしくは酵
素の測定に、拡大された測定範囲が提供される。上記系
は、電気化学ポテンシャルを異にし、かっＮＡＤ　（Ｐ
、）Ｈの電子受容体として互いに独立して作用する、数
個の物質を同時に包含していることを特徴とする。電子
受容体の具体例としては、ジクロロフェノールインドフ
ェノール及びＩＮＴＥｆｌｌｉ化２−（４，−インドフ
ェニル）−３−（４−二トロフェニル）−５−フェニル
テトラゾリウム］が挙げられる。上記明細書によれば、
上記試験系は吸収材に含浸せしめることができる。黄色
成分が、バックグラウンド染料のチタンイエローを包含
せしめることによって、見られる色素に加えられる。

１］木国特許願第５９−１０６２９９号は１９８４年６
月１９日に公開された。上記出願は、グルタチオンレダ
クターゼと発色剤の存在下に、酸化グルタチオンを用い
てＮＡＤ　（Ｐ）Ｈな評価する方法を開示している。上
記発色剤の例としては、５，５′−ジチオビス−（２−
二トロ安息香Ｓ）、Ｎ−（ｉ−アニリノナフチル−４）
マレイミド、β−ヒドロキシエチル−２，４−ジニトロ
フェニルジスルフィド、２．２−ジチオピリジン及びベ
ンズイミダゾリルマレイミドが挙げられる。

欧州特許願第０−１５３−８７２号は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
を、（ｉ）ペルオキシダーゼ又は酸化チオールレダクタ
ーゼ；及び（２）ジアホラーゼ又は電子キャリアと、色
原体の存在下に反応させることにより形成された色素（
ｐｉｇｍｅｎｔ）を測定することを伴うニコチンアミド
アデニンジヌクレオチド（ホスフェート）の還元体を定
量するための方法を開示している。これら２つの反応は
共通の基質に対して作用しない。

これらの開示はいずれも、一方が、その場で生成される
黄色成分をはじめとする、レインボーの全スペクトルを
与えることができるジスルフィドレダクターゼ系である
と共に、特定の最終的色相が分析対象物の濃度に依存す
る２種の独立した触媒系から成る系を提供するものでは
ない。

昆−文貫迎Ｉ刀 本発明は、（ａ）対象の分析対象物との反応により、還
元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを生成
せしめ得る触媒系；　（ｂ）還元されたニコチンアミド
アデニンジヌクレオチドとの反応により、還元された第
１の指示薬を生成せしめ得る第１の独立触媒系；及び（
ｃ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
との反応により、第２の指示薬成分の色相変化を生じさ
せ得る第２の独立触媒系から成り、該第２の独立触媒系
は、 （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ｉ１）ジスルフィド基質；及び （ｉ１０チオール指示薬を包含し、 ここで、上記ジスルフィドレダクターゼは、還元された
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド
基質との反応に触媒として作用して、上記チオール指示
薬と相互作用して、第２の指示薬の色相変化をもたらし
得る生成物を生成することができ、それによって還元さ
れた第１の指示薬の生成及び第２の指示薬の色相変化が
調整されて一定範囲の色相が与えられ、試験成分により
生成される特定の最終的色相が、分析対象物の濃度に依
存することを特徴とする、流体試料中の分析対象物の濃
度を目視測定するための試験組成物を提供する。

系の１つが黄色の色相を与えることが好ましい。１つの
好ましい系においては、チオール指示薬が還元されて、
黄色の第２の指示薬を生成する。

」二記成分は、溶解せしめて試験溶液とすることができ
、またキャリアマトリックス中に包含せしめて試験具の
フォーマット（形Ｆ；）とすることもできる。

好ましい実施態様は、その場で作られる黄色をはじめと
する虹の全スペクトルを示すことができ、試験具の特定
の最終的色相が試料中のグルコースの濃度に応じてｑ−
えられる全血グルコース試験具である。

■、−日の一−ｒド説Ｉｆ 目視的色合わせ法は便利であり、高価な測定機器を必要
とせずに、分析対象物の濃度を十分正確に測定すること
を可能にする。色は彩度、明度及び色相のような要素に
分解することができる。色相（ｈｕｅ）は、通常、色（
ｃｏｌｏｒ）　（例えばあるものが、青、赤又は黄色に
「見える」というように）とよばれている。本明細書で
は全て゛色相（ｈｕｅ）”を用いた。

一般的に、１つの色相は、ある形の単一指示薬と関連づ
けて考えられる。したがって、一定範囲の色相を発色さ
せるには、多くの異った指示薬分子が必要とされる。可
能な色相変化は限りない。指示薬は、１つの色相から他
の色相へ、１つの色相から無色へ、また無色から、ある
色相へと変化することができる。また、指示薬自体は色
相変化せずに、試験組成物を包含する試験具の形態が、
分析対象物を含有する試料と接触したときに試験具の色
相に明らかな変化が生ずるようにすることもできる。例
えば、指示薬の色相は、試験組成物と分析対象物との反
応前には不可視であるが、その反応が生じた後には可視
となる。試験具によって示される、１つの分析対象物濃
度と他の分析対象物濃度とに対する最終的色相変化は使
用者にとって可及的に明確であることが望ましいので、
無色から、ある色相へ、またある色相から無色への変化
が好ましいとされている。２種以上の指示薬を用いる場
合、少くとも１の指示薬成分がある色相から無色に変化
するのが好ましい。さもなければ、試験組成物又は試験
具の最終的色相は、発生する色相の種類が多くなるに従
って黒色に近づく。ある状態で原色、つまり赤、黄、青
、の１色を示す指示薬の生成及び／又は消失を調整する
ことが特に望ましい。２種の指示薬成分を含む組成物を
用いることができる一方、３種の指示薬成分の使用が有
利であることが判明した。

下記の順序で下記の色相変化を示す指示薬を含有する試
験組成物を例にとって考えてみよう。

指示薬ｌ）　　青色から無色 指示薬２）　　無色から黄色 指示薬３）　　無色から赤色 上記更示薬が逐次反応するならば、試験組成物の見掛け
の色相は青色から無色、更に橙色（黄色十赤色）となる
であろう。

しかしながら、指示薬２の色相が、指示薬ｌの色相変化
と同時に変化し、指示薬３の色相変化が後で起こる場合
には、試験組成物の見掛けの色相は、青色から緑色（青
色＋黄色）、黄色、橙色（黄色＋赤色）、更に赤色とな
るであろう。同様の例として下記のものが挙げられる。

指示薬１）　　赤色から無色 指示薬２）　　無色から黄色 指示薬３）　　無色から青色 指示薬が逐次反応するならば、試験組成物の見掛けの色
相は赤色から無色、黄色、更に緑色（青色＋黄色）とな
ろう。もし、２種の指示薬の変化が同時に生じ、第３の
変化が後で起こるように上記のように指示薬を反応させ
たならば、試験組成物の見掛けの色相は赤色から橙色（
赤色＋黄色）、黄色、緑色（賛色＋青色）、更に青色と
なるであろう。

色相の同時変化を伴う上記仕組みは、どちらも虹（レイ
ンボー）の全スペクトルを与えることができる。かかる
レインボーは、分析対象物の濃度間の差を理解し易いも
のとするために用いることができる、最も広い範囲の可
視色を与えるので望ましい。

問題は、１）最大の色相変化を独立して与える、色相変
化が惹起される指示薬を選択し；かつ２）これらの指示
薬が分析対象物の濃度にのみ対応して順序正しく反応す
ることを確実にするという２点である。

各々が、還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チド（ＮＡＤＨ）に対して反応性を有し、色相において
１以上の変化を与える、２種の独立した触媒系を用いる
ことにより、一定範囲の色相が得られることが今や判明
した。上記系はそれぞれＮＡＤＨと実質的に同時に反応
する。分析対象物の特定濃度によって与えられる色相は
、試験組成物中の成分及び触媒の濃度の相対的増減によ
って調整することができる。

各々の独立触媒系は、ＮＡＤＨの存在下に１以上の指示
薬と相互作用して指示薬（ｉ又は複数の）の色相変化を
引き起こすことが可能な系である。ある系は少くとも酸
化指示薬と、ＮＡＤＨの存在下における上記酸化指示薬
の還元を促進することができる触媒とを包含する。また
他の系は、少くともジスルフィド基質、チオール指示薬
及びジスルフィドレダクターゼ（触媒）を包含する。」
二記ジスルフィドレダクターゼ系は下記の３つの一般的
方法： ｌ）　チオール指示薬をＮＡＤＨとジスルフィド基質と
の反応によって形成された生成物と相互作用して、第２
の指示薬の色相変化を生じさせる； ２）　チオール指示薬を還元して、還元された第２の指
示薬を形成する；及び ３）　その第２の指示薬が、いずれの場合も黄色の色相
を有する によって作用する。その場で黄色の色相を発色させるの
は特に困難であることが証明された。

「触媒（ｃａｔａｌｙｓｔ）及び「触媒の（ｃａｔａｌ
ｙｔｉｃ）Ｊという用語はここでは従来の意味で用いら
れている。“触媒“反応とは、「触媒」の添加によって
反応速度は変化するが、触媒自体は変化しない反応のこ
とである。ここで述べる触媒反応は通常酵素反応である
が、メト硫酸フェナジンを触媒とするような非酵素反応
をも含む。「独立して」という表現は、反応時間中に一
方の触媒系で還元される酸化指示薬と、他方の触媒系で
還元される酸化指示薬とが平衡ではないことを意味する
。

ＮＡＤＨは、通常酵素の触媒系により、問題の分析対象
物から発生せしめる。表１は、臨床的に興味深い分析対
象物及びＮＡＤＨを生成せしめ得る、有用な酵素系を示
す。これらの反応及び反応に必要な成分は周知であり、
現在、分析対象物の濃度に応答して、単一色相の強度に
おける変化をひき起こす、多くの診断用反応の基本であ
る。問題の分析対象物からＮＡＤＨを生成せしめ得る酵
素系は、通常、デヒドロゲナーゼ系であるが、ＮＡＤＨ
を生成し得るものであればどのような系を用いてもよい
。

グルコース　　　　グルコースデヒドロゲナーゼへキン
キナーゼ／グルコース −６−ホスフェート デヒドロゲナーゼ コレステロール　　コレステロールデヒドロゲナーゼ アルコール　　　　アルコールデヒドロゲナーゼラクテ
ート　　　　乳酸デヒドロゲナーゼ（乳ｍ塩） ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元体（ＮＡ
ＤＨ）は特に有用な共通基質（ｃｏｍｍｏｎｓｕｂｓｔ
ｒａｔｅ）であることが判明した。本明細書は、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）及びその還
元体（ＮＡＤＨ）のみに限定して記載しているが、その
開示するところは、ホスホリル化されたＮＡＤ　（Ｐ）
及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに対しても同様に適合するものと理
解すべきである。

ジアホラーゼ又はジアホラーゼ様活性を有する触媒例え
ばメト硫酸フェナジン及びメト硫％１−メトキシフェナ
ジンをベースとする、共通基質ＮＡＤＨにとって有用な
触媒系について次に詳細に説明する。

ジアホラーゼ系は、明らかな色相変化を示す、２種の酸
化された指示薬が容易に入手可能であるため、１つの経
路（ｐａｔｈｗａｙ）として有用であることが判明した
。ＤＣＩＰ（２，６−ジクロロインドフェノール）は青
色の化合物であり、ジアホラーゼとＮＡＤＨの存在下に
還元されると無色となる。ＩＮＴ（塩化２−（４−イン
ドフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−フェ
ニルテトラゾリウム）は酸化された形では無色であるが
、ジアホラーゼ及びＮＡＤＨの存在下に還元されると赤
色になる。上記の２つの色相変化は逐次的に起る。ジア
ホラーゼとＮＡＤＨとに反応するその他の指示薬を用い
ることもできる。例えば、便宜上ＴＲ−１と呼ばれるＮ
−（２，３−ジメチル−５−オキソ−１−フェニル−３
−ピラゾリン−４−イル）−２−クロロ−６−スルホ−
４−イミノベンゾキノン及びここではＮＢＴと呼ばれる
塩化ｐ−ニトロブルーテトラゾリウムをＤＣＩＰとＩＮ
Ｔの代わりに用いることができる。その他のインドフェ
ノール類並びに同族の置換アルキル、ニトロ、ハロゲン
及びハロゲノイド（ｐｓｅｕｄｏｈａ　ｌｏｇｅｎ）誘
導体を、ＮＡＤＨの存在下に還元され得る、還元電位を
有する同様なその他の指示薬以外にも、ＤＣＩＰの代わ
りに用いることができる。その他のテトラゾリウムをＩ
ＮＴの代わりに用いることができる。多くのものが当業
界で公知であり、”Ａｎ　Ｉｎｔ’ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
　ｔｏ　ｔｈｅ　ｔｌｓｅｏｆ　Ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕ
ｍ　５ａｌｔｓ　ｉｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｅ
ｎｚｙｍｅＣｈｅ’ｍ１ｓｔｒｙ″、　　Ｆ、　　Ｐ、
　　Ａｌｔｍａｎ、　　Ｋｏｃｈ−１ｉｄ＜ｈｔ　　Ｌ
ａｂｏｒａ−ｔｏｒｉｅｓ、　Ｌｔｄ、、　Ｇｏｌｎｂ
ｒｏｏｋ、　Ｅｎｚｌａｎｄ、１Ｂ７２；及びＴｈｅ　
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｍａｚａｎｓ　ａｎ
ｄ　ＴｅｔｒａｚｏｌｉｕｍＳａｌｔｓ”、　Ａ、　Ｗ
、　Ｎｉｎｅｈａｍ、　ＣｈｅＩＩｌ、　Ｒｅｖ、、　
±３５５（＋９５５）のような評論誌に収録されている
。

第２の、同様の手段が、ジスルフィドレダクターゼをベ
ースとする、第２の独立触媒系によって与えられる。下
記表２に種々のレダクターゼ系を示す。

Ｌ−シスチン　　　　シスチンレダクターゼ酸化グルタ
チオン　　グルタチオンレダクターゼリポアミド　　　
　　ジヒドロリポアミドレダクターゼ（ここではりボア
ミ ドブヒドロゲナーゼと呼 ぶ） プロテインージスル　プロテインージスルフィドフィド
　　　　　　　　レダクターゼ 酸化チオレドキシン　チオレドキシンレダクターゼ ＣｏＡ−３−３−グ　ＣｏＡ−３−Ｓ−グルタチルタチ
オン　　　　　オンレダクターゼアスパレート　　　　
アスパラギン酸レダクターゼ ジスルフィドレダクターゼ系は、ジスルフィド基質、ジ
スルフィド基質とＮＡＤＨの反応を促進し得るジスルフ
ィドレダクターゼ及びジスルフィド基質とＮＡＤＨとの
反応の生成物と相互作用して、第２の指示薬の色相変化
をもたらし得るチオール指示薬の３成分から成る。好ま
しいジスルフィド基質はりポアミド及びその類縁体であ
り、これらはりボアミドデヒドロゲナーゼと共に用いる
ことができる。ジスルフィドレダクターゼ系は、試験組
成物によって発生せしめられる色相の範囲に黄色を導入
するのに特に有用である。

チオール指示薬はチオール（−３Ｈ化合物）と相互作用
して視認可能な色を与えるものであればどのような物質
であってもよい。好ましいチオール指示薬は、相互作用
の後に黄色になる無色の指示薬である。一般に、チオー
ル指示薬は、ジスルフィド基質とＮＡＤＨとの反応の生
成物の存在下に還元されて還元された第２の指示薬（黄
色であってもよいが、必ずしも黄色である必要はない）
を生成する酸化指示薬である。しかしながら、色素を生
成する他の種類の相互作用も考えられる。例えば、チオ
ール指示薬はニトロプルシドのようなキレート剤であっ
てもよく、これはジスルフィド基質／ＮＡＤＨ反応の生
成物と相互作用して赤色の色相を呈する。パラジウム複
合体を用いて赤色を発色させることもできる。黄色の色
相は、チオール指示薬とジスルフィド基質／ＮＡＤＨ反
応の生成物との相互作用、もし上記生成物がシスティン
であるならばアルキル化によって発色せしめられる。ま
た、システィン生成物は、ノルアドレノクロムと反応せ
しめて黄色を発色せしめることもできる。

他の一般的種類のチオール指示薬は所望の色相、好まし
くは黄色の発色団であり、不透明遮断層（バリヤー）の
背後に固定化される。ジスルフィド基質／ＮＡＤＨ反応
の生成物との反応により、上記発色団はその結合部位か
ら解放されて不透明バリヤーに拡散して、観測者に見え
るような位置まで移行する。

一般に、還元されるチオール指示薬はジスルフィド化合
物である。４５に、ここではＤＴＮＢと呼ぶ下記の構造
： の５，５′−ジチオビス−（２−二１・口安息香酸）の
類縁体が好ましい。ＤＴＮＢは、通常エルマン試薬（Ｅ
ｌ１ｍａｎ’ｓ　ｒｅａｇｅｎｔ）と呼ばれる。カルボ
ン酸ヒドロキシ基における変化が有用であることが判明
している。下記の構造： ［Ｒは、エステル又はアミド結合を与えるような多くの
基、例えば： の基を表わすことができる。］ のＤＴＮＢの類縁体（ここではＤＴＮＢの位置異性体を
含むものとする）が好ましい。

上記のような水可溶化ノ、（がゼラチンマトリックスの
形態においては好ましいが、本明細書中で後述する区分
化）７１−−マット（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚ
ｅｄｆｏｒｍａｔ）においては水不溶性の類縁体を用い
ることができる。

好ましい水溶性類縁体化合物は下記の構造：の３−Ｎ−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキサミド−４−
二トロフェニルジスルフイドであり、その合成について
は実施例中で詳述する。上記化合物は、本明細書では、
以後、便宜」−３−ＮＤと呼ばれる。この化合物は、醇
化された形態では無色であり、リポアミド、ＮＡＤＨ及
びリポアミドデヒドロゲナーゼの存在下に黄色になる。

特に有用な指示薬の色相を下記の表３に示す。

ＤＣ：ＩＰ　　　　　　　　青色　　　　　無色ＩＮＴ
　　　　　　　　無色　　　　　赤色ＴＲ−１赤色　　
　　　無色 ＮＢＴ　　　　　　　　無色　　　　　青色ＤＴＮＢ　
　　　　　　　無色　　　　　黄色３〜ＮＤ　　　　　
　　　無色　　　　　黄色ＥＡＩ　　　　　　　　４色
　　　　　黄色発色遅延剤を組成物中に加えてもよいこ
とが判明した。発色遅延剤は、使用者にとって見える色
相には実質的影響を与えないが、これを包含せしめるこ
とによって、個々の系の触媒効果が遅延されることによ
り、酸化指示薬の還元が遅延され、したがって分析対象
物のある特定の濃度に対して発色せしめられる最終的色
相に変化をもたらす。有用な発色遅延剤としてはフェリ
シアン化カリウム及びヨウ化１−Ｎ−エチル−４−メチ
ルキノリニウム並びにそれらの類縁体又はこれらの化合
物の混合物が挙げられるが、フェリシアン化力リウムが
好ましい。発色遅延剤は、組成物の測定範囲を有効に変
化させることができる。

緩衝剤、界面活性剤及びポリマーのようなその他の成分
を組成物中に加えることができる。通常、ｐＨは試薬に
良好な性能及び安定性を与えるように選ばれ、緩衝剤に
よって調節される。緩衝剤の使用は、酵素がｐＨ６，０
〜８の範囲でより良好に作用するので好ましい。緩衝剤
の選択方法は、当該技術の範囲で行なわれる。有用な緩
衝剤としては、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−
Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−　［
）リス（ヒドロキシメチル）メチル１アミノエタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）、２−　［Ｎ−モルホリノ］−エタン
スルホン酸（ＭＥＳ）及び［３−（Ｎ−モルホリノ）プ
ロパンスルホン酩］（ＭＯＰ　Ｓ）が挙げられるが、こ
れらに限定ｙれることはない。界面活性剤及びポリマー
は、酸化指示薬としてカチオン性テトラゾリウム塩を含
む配合物（ｆｏｒｆｆｌｕｌａｔｉｏｎ）において特に
有用である。なぜならば、トリトン（ＴＲＩ　ＴＯＮ■
）ｘ−ｔｏｏの商標でシグマケミカル社（Ｓ　ｉ　ｇｍ
ａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、）から入手可能なポリオキ
シエチレンエーテルのような界面活性剤及びＰＶＰ　　
Ｋ２ＯとしてアルドリッチΦケミカル社（Ａｌｄｒｉｃ
ｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手可能なポリビニ
ルアルコール及びポリビニルピロリドンのようなポリマ
ーは、カチオン性指示薬の可溶化を助け、試験組成物中
の他の指示薬との相互作用を防止するからである。界面
活性剤はまた、乾燥相を有する形態ｃ７）　（ｄｒｙ　
ｐｈａｓｅ　ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）試験具の湿潤性
を高める。酵素安定剤、例えば牛血清アルブミンを加え
ることもできる。

本発明の試験組成物は、成分を溶解せしめて溶液として
用いるか又はキャリアマトリックス中に包含せしめて、
ポリエステル片のような支持部材に取り付けて、診断法
において周知の乾燥試薬片とする。これらの試験片は、
持ち運びや保管に便利で、糖尿病患者のような、家庭で
の使用者にとって特に有用なフォーマットを提供する。

本発明の好ましい組成物は約１０分以内で、ある特定の
分析対象物濃度と関連づけることができる最終的色相を
呈する 用いられるキャリアマトリックスは、上記組成物が包含
せしめられ、発色に必要な反応を妨害しない限り、当業
界公知の数種のマトリックスのいずれを用いてもよい。

これらのマトリックスとしては、紙及び天然ポリマー、
ラテックス、ポリウレタン、シリコーン又はこれらの混
合物から成るフィルムが挙げられる。

最も明澄な色を得るためには、透明なキャリアマトリッ
クスが好ましいとされていた。本発明に共通の分析対象
物は、体液中に見られるような水溶性化合物であるため
、水を含むことのできるキャリアマトリックス、例えば
親水性キャリアが好ましい。好適な親水性キャリアとし
ては、アガロース、ゼラチン、ポリ（ビニル）アルコー
ル、ポリ（プロピルイミン）、カラゲナン及びアルギン
酸が挙げられる。その他のキャリアを用いてもよい。試
験成分が区分化される場合には、吸収性不透明マｉ・リ
ックス、例えば紙及び親水性（例えばゼラチン）キャリ
ア層から成る混合多層キャリアを用いるのが有利である
。

好ましい実施態様において、カルボジイミドの１．２５
％溶液を、多層ゼラチンキャリアマトリックスの架橋に
用いた。これにより、試験具の表面を拭き取ることによ
って血液試料の除去を可能にする全血用グルコース試験
手段に好適なフォーマットが得られる。当業界周知のそ
の他の被覆剤を用いて、必要に応じて、有色試料を除去
するために試験具を洗浄又は拭き取ることを可能にして
もよい。

親水性キャリア層はポリスチレン、ポリエステル等のよ
うな硬質支持体又は支持部材上に塗布することによって
得られる。上記支持体は不透明でも透明であってもよい
が、一般には白濁支持体が目視読取試験用としては好ま
しい。

前記の独立触媒系に用いることができる成分の数及び種
類は、試験具フォーマット中に、非相容性であるかもし
れない成分を区分化することによって増加することがで
きる。区分化は種々の形態をとることができる。成分は
、そのあるものを別の層中に配置すること：エマルジョ
ンの一方の相中に可溶化せしめること；析出；封入等に
よって分離される。利用可能な方法のあるものを実施例
中で詳細に述べる。

多層ゼラチンキャリアが区分化には好ましい。

ＩＮＴは他の指示薬成分とは別の層中に配置することが
できる。種々の層中に成分を位置させることにより、使
用者に見える、特定の分析対象物濃度における色相が変
化せしめられ、したがって、示される色相を調整する別
の手段となることが判明した。試験具の見掛けの色相は
流層の順序又は層の厚さを変えることによって変化させ
得る。成分を異った層に区分化することにより、使用者
に視認可能な色相に与える影響を下記に詳述する。

グルコース分析用レインボー（虹色）試験具は、次に示
す個々の触媒反応を用いて、調製される。

ＮＡＤＨ生成系： グルコース（分析対象物） グルコースデヒドロゲナーゼ（酵素） ＮＤＡ　（添加成分） 第１の独立触媒系： ジアホラーゼ（触媒） ＤＣＩＰ（酸化された第１の指示薬、青色）ＩＮＴ　　
（酸化された第３の指示薬、無色）ＤＣＩＰを、まずＮ
ＡＤＨによって還元する。

したがって第１の独立触媒系は青色から無色へ、次いで
無色から赤色へと、使用者にとって視認可能な色相の変
化をもたらす。

第２の独立触媒系： リポアミド（ジスルフィド基質） リポアミドデヒドロゲナーゼ（ジスルフィドレダクター
ゼ） ＤＴＮＢ　（チオール指示薬二酸化された第２の指示薬
、無色） 酸化指示薬の区分化１例えば上記指示薬を別々のゼラチ
ン層中に配置することにより、試験成分の濃度が同一で
あっても、異ったグルコース濃度において見られる色相
を有効に変化させることができる。−例として、指示薬
は異った層に配備されているが、試験組成物全体の成分
の濃度は同一にして、３種類のフィルムを作成した。

ゼラチンにおいては、ＤＴＮＢにようなある種の水溶性
分子は、水性試料と接触した後にゼラチン中に拡散する
が、他のもの、例えばＩＮＴは容易に移行しない。

フィルムＡにおいては、グルコースが酵素と反応し、次
に、生成されたＮＡＤＨが個々の触媒系と反応してＤＣ
ＩＰ及びＤＴＮＢが還元される。

しかしながら、ＩＮＴの還元は、ＮＡＤＨが下層フィル
ムに拡散するまで遅延される。グルコース濃度２５０ｍ
ｇ／　ｄ　ＬでフィルムＡは黄橙色を示す。

フィルムＢにおいては、グルコースは、酵素に到達し、
反応してＮＡＤＨを生成する前にＩＮＴ層に拡散しなけ
ればならない。ＮＡＤＨの生成に伴い、ＤＣＩＰは還元
されるが、ＩＮＴの還元は、ＩＮＴが還元される前にＮ
ＡＤＨが上層に逆拡散しなければならないため遅延され
る。したがって、グルコース２５０ｍｇ／ｄＬでフィル
ムＢは黄緑色を示す。ＩＮＴを酵素及びその他の指示薬
成分の上層に区分化することにより、この特定のグルコ
ース濃度において観察される色を変化させる。

フィルムＣにおいては、グルコースは上層の酵素と反応
する。ＮＡＤＨがＩＮＴ層中に移行するに伴い、還元さ
れた小量のＩＮＴによる僅かな赤色化がもたらされる。

ＮＡＤＨが下層に移行するに伴い、ＤＣＩＰ及びＤＴＮ
Ｂが還元される。最後にＮＡＤＨは、遠ばれた成分の濃
度により、その全部が還元され為わけではないので、Ｉ
ＮＴと反応する。グルコース２５０ｍｇ／ｄＬで、フィ
ルムＣは赤橙色を示す。

本発明の最終目標は、異る分析対象物濃度において明確
に異る色相を発生Ｓせることである。この目標は本発明
の組成物を用い、下記に要約した種々の方法によって達
成し得ることが明らかになった。

１）還元した際に所望の色相を発色するか又は無色とな
る醇化指示薬を選択する。

２）　特定の触媒系における反応シーケンスを制御する
異る還元電位を有する指示薬を選択する。

３）　　（ｆｆ々の触媒系における成分の量を、１つの
反応シーケンスに関与する成分が、特定の分析対象物濃
度において実質的に消耗されるように調節する。

４）１つの系における触媒の早を増加（又は減少）させ
ることにより、その系による、指示薬成分の相互作用又
は還元の速度を上昇（又は低下）させ、それにより、特
定の分析対象物の見掛は色相を変化させる。

５〕　試験具中の反応系の諸成分を区分化する。

区分化の利点としては、たとえ成分濃度が同一であって
も試験具の最終的な見掛けの色相を変化させ得ること；
非相容性指示薬又は水不溶性指示薬を活用できること；
及び通常チオール指示薬によって阻害される酵素系を活
用できることが挙げられる。

６）個々の触媒系の反応を遅延させる発色遅延剤を添加
する。

上記に例示した方法を合わせ用いることもできる。

本発明を下記実施例により説明するが、それにより本発
明を制限するものではない。

■、実施例 略号 ＭＰＭＳ　　　　　メト硫酸１−メトキシフェナジンＰ
ＭＳ　　　　　メト硫酸フェナジン ＤＣＩＰ　　　　　２．Ｂ−ジクロロインドフェノール
ＴＲ−Ｉ　　　　Ｎ−（２，３−ジメチル−５−才キソ
ー１−フェニル−３−ピラゾリン−４−イル）−２−ク
ロロ−６−スルホ−４−イミノベンゾキノン（製造方法
については実施 例ＩＡを参照） ＩＮＴ　　　　　塩化２−（４−インドフェニル）−３
−（４−ニトロフェニル）−５−フェニルテトラゾリウ
ム ＮＢＴ　　　　　ｍ化Ｐ−二トロブルーテトラゾリウム
ＩＩＴＮＢ　　　　　５　、５−ジチオビス（２−ニト
ロ安息香酸） ３−Ｎｌ］　　　　　ジ硫化３−Ｎ−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボキサミド−４−二トロ フェニ）ＩｙＣ製造方法については実施例ＩＢを参照） ＥＡＩ　　　　　　５，５“−ジチオビス−（２−ニト
ロ安息香酸）ジプチル（製造方法については 実施例２Ｇを参照） ＮＡＤ−ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド、リ
チウム塩 ＨＥＰＥＳ　　　　緩衝剤、Ｎ−２−ヒドロキシエチル
ピペラシンーＮ’−２−エタンスルホン酸 ＭＥＳ　　　　　緩！ｊ剤、２−（Ｎ−モルホリノ）−
エタンスルホン酸） ＴＡＰＳＯ緩衝剤、３−（Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチルアミン）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸 ＴＲｌ５　　　　　緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル
）アミノメタン トリトン　　界面活性剤、ポリオキシエチレン−Ｘ−１
００エーテル　シグマ・ケミカル社から入手 ＧＩＩＨグルコースデヒドロゲナーゼ （ＥＣ１，１，１４７）ＮＡＤＨ産生 ＬｉｐＤＨリポアミドデヒドロゲナーゼＬＤＨ乳酸デヒ
ドロゲナーゼ Ｕ　　　　　　国際中位、酵素活性の尺度（ｉ０は、特
定の温度及びｐＨ条件下に、　１分につき、基質１マイ
クロモルの変換反 応に触媒として作用するために必要 な酵素活性を表わす。） ＰＥＴ　　　　　　ポリエチレンテレフタレートＦＭＮ
　　　　　　フラビンモノヌクレオチドＰＥ　３１０　
　　　ポリエチレン被覆紙ＢＳＡ　　　　　牛血清アル
ブミン ＰＶＰ　Ｋ２Ｏポリビニルピロリドン。

分子量：４０，０００．アルドリッチ・ケミカル社から
入手 ｄＬ　　　　　　デシリットル ｍＬ　　　　　　ミリリットル ｐＬＬ　　　　　マイクロリットル ｇ　　　　　グラム １８ｇ　　　　マーキュリ−ミリメートル、圧力表ｍｐ
　　　　　　融点 ｐ　　　　　ミクロン ＲＴ　　　　　　室温、通常２５°Ｃ 実施例１：化合物の製造 Ａ、　　Ｎ−（２，３−ジメチル−５−オキソ−１−フ
ェニル−３−ピラゾリン−４−イル）−２＝クロロ−６
−スルホ−４−イミノベンゾキノン（ＴＲ−１） ＴＲ−１は、酸化された状態では赤色であり、還元され
ると無色となる指示薬である。これはＤＣＩＰと同様の
還元電位を有し、レインボーの色を“逆転′°させるの
に用いられる。ＴＲ−１は下記のようにして製造した。

水酸化アンモニウム（ＩＮ、１０ｍＬ）を、４−アミノ
アンチピリン０．４ｇ（ｉ，９ミリモル）と水５０ｍＬ
中の２−ヒドロキシ−３，５−ジクロロベンゼンスルホ
ン酸二ナトリウム塩０．５ｇ（ｉ，７ミリモル）との混
合物に加えた。短時間の撹拌後、フェリシアン化カリウ
ム（Ｋ３　Ｆｅ　（ｃＮ）ａ）１．３ｇ　（３，８ミリ
モル）を加え、室温にて１昨間撹拌して反応を行った。

上記混合物を濾過すると暗褐色の固体０．２ｇ（２１％
）が得られた。この生成物は薄層クロマトグラフィー（
シリカゲル、クロロホルム／メタノール４：１を使用）
上では均一であり、アルカリ塩とアンモニウム塩との混
合物であることが明らかであった。

匁逝 Ｃ１７Ｈ，Ｉ　ＣＩＮ３０５　Ｎａについての計算値：
Ｃ，４７，５４，Ｈ，３，０４，Ｎ、９．７２゜実測値
：Ｃ，４６，１０；Ｈ，３，６１；Ｎ、１１．００ ’　ＨＮＭＲ（Ｄ６　ＤＭＳＯ）δ：　７．８０−７．
２０　（ｍ、７Ｈ）、３．４０　（ｓ、３Ｈ）。

２．５３　（ｓ、３Ｈ）、ＩＲ（ＫＣＩ）：１６６０．
１６３０．１４００ｃｍ”’。

８．３−Ｎ（３−ジメチルアミノプロピル）カルボキサ
ミド−４−二）・ロフェニルジスルフイド（３−ＮＤ） ５．５′−ジチオビス（２−二１・口安息香酸）の水溶
性類縁体を、チオール指示薬として用いるために製造し
た。これは、酸化状態では無色であって、還元されると
黄色を示すジスルフィドレダクターゼ系と併用して好ま
しい指示薬である。上記化合物３−ＮＤは下記のように
して製造した。

３−カルボキシ−４−二トロフェルジスルフィド７．９
３ｇ（２０ミリモル）、乾燥Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムア
ミド１．２ｍＬ　（ｉ，５５ミリモ　　・ル）、塩化チ
オニル１１．７ｍＬ（６０，３ミリモル）及びジクロロ
メタン（ｃＨ２Ｃ文ｘ　）４００ｍＬを含む懸濁液を４
時間還流し、周囲温度で一晩撹拌した。４４Ｔられた明
澄な溶液を真空蒸発（ｉ２ｍｍＨｇ次いで０　、１　ｍ
ｍＨｇ）　して黄色の固体を得た。上記残渣をアルゴン
雰囲気下に置き、ＣＨ２Ｃｌ　２２００　ｍ　Ｌ中に溶
解し、ｏ　’ｃに冷却してから３−ジメチルアミノプロ
ピルアミン１０．１ｍＬ（８０ミリモル）で処理した。

上記反応混合物は暗橙色となり沈澱が形成された。得ら
れた溶液を一晩周囲温度まで加温した。次いで、上記反
応混合物を５％重炭酸ナトリウム溶液２００ｍＬづつで
４回、水２００　ｍ　Ｌで２回及び塩水（ブライン）で
１回連次抽出した。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥し
、濾過し、濃縮して暗橙色の油状物９．３９ｇを得た。

この混合物を、次に、Ｓ　ｉ０２−６０　［７０−２３
０メツシユ。

シリカゲル−６０としてメルク社（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｇ
ｏ、）から入手］　５００ｇ上のフラッシュクロマトグ
ラフィーに付し、平衡化しジクロロメタン／メタノール
／濃水酸化アンモニウムの５０：１０：１溶媒混合物で
溶出した。精製された生成物を含むフラクション１１０
〜２０５をプールし、真空濃縮すると橙色固体７．０６
ｇが得られた。上記粗生成物をノーライトのような粉砕
カーボンブラック及びケイ藻土［コロラド州、デンバー
のマンビル・プロダクツ社（Ｍａｎｖｉｌｌｅ　Ｐｒｏ
ｄｕｃｔｓ　Ｃａｒｐ、）からセライ）　（ｃｅｌｉｔ
ｅ■）の商標で入手される濾過助剤］による処理を行い
ながら酢酸エチルで再結晶した。５５°Ｃで乾燥した後
、淡黄色結晶（粒径０　、１ｍｍ）　５　、４７ｇが得
られた。収率＝４８．４％、ｍ　ｐ　１５２〜１５６°
Ｃ江逝 Ｃ２４Ｈ３２ＮＢｏ８Ｓ２についての計算値：Ｃ，５１
，０５，Ｈ，５，７１； Ｎ、１４．８８゜ 実測値、Ｃ，５１，０５；Ｈ，５，５６；Ｎ、１４．６
２ ＰＭＲ（６０ＭＨｚ　、ＣＤＣ１３）８　：　１．７３
（５重線、Ｊ＝６Ｈｚ　、４Ｂ）； ２．１７　　（ｓ、１２Ｈ）； ２．４５　（ｔ　、Ｊ＝６Ｈｚ　、４Ｈ）；３．５３　
（ｑ　、Ｊ＝６Ｈｚ　、４Ｈ）；７．５７　　（ｓ、２
Ｈ）。

７．６５　（ｄｄ　、Ｊ＝７Ｈｚ　、２Ｈｚ　、２Ｈ）
；８．０２　（ｍ、２Ｈ，Ｎ−Ｈ）； ８．０３　（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ、２）１）。

ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−’　：３２６０，３０６０゜２９
４０．２８７０．２Ｂ２０，２７９０゜１６５０．１５
６０，１５３０，１４７０゜１３４５゜ 質量スペクトル（ＦＡＢ）ｍ／６　： ５６５　（Ｍ＋１．１３．６％）。

Ｃ，５，５′−ジチオビス−（２−二トロ安息香酸）ジ
ブチル（ＥＡ−１） ここでＥＡＩと呼ぶ上記化合物は、５．５’−ジチオビ
ス−（２−ニトロ安息香酸）の親油性類縁体である。こ
れをチオール指示薬として用いるため、下記のようにし
て製造した。

５．５′−ジチオビス−（２−二トロ安息香酸）６．８
５ｇ　（ｉ７，２５ミリモル）、塩化チオニル３．４６
ｍＬ、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド０．３４６ｍＬ′
Ｐびジクロロメタン３５０ｍＬを含む懸濁液を３時間加
熱還流した。更に塩化チオニル（３，４６ｍＬ）及びＮ
、Ｎ’−ジメチルホルムミドを加え還流を２時間続行し
た。明澄で淡緑色の溶液が得られ、これはビスー酸クロ
リドへの完全なる変換を示すものである。溶媒を真空下
に除去し、得られた淡緑色固体をアルゴン雰囲気下に置
いた。残渣を、次に、ピリジンｌｏｏｍＬ中に懸濁せし
めｎ−ブタノール２０ｍＬで処理した。若干の発熱及び
暗色化が生じたが、均一な反応物が得られ、これを−晩
撹拌した。反応溶媒を真空下に除去し、残渣をクロロホ
ルム３０　ＯｍＬ中に溶解せしめた。次に有機層を０．
１　ＮＨＮＨＣｌ２０Ｏで３回、５％ＮａＨＣＯ３溶液
２００ｍＬで２回、及び塩水２００ｍＬで逐次抽出した
。乾燥（ＭｇＳＯａ）、濾過、溶媒の除去を行って油状
物１２．７９ｇを得、これを酢酸エチル中に溶解せしめ
て、真空下に少量の５ｉＯ７−６０に吸着せしめた。上
記の含浸を行った固体を、ヘキサン−酢酸エチル８：１
で平衡化された５ｉ０２−６０　（２３０−４００メツ
シユ）５００ｇが充填されたカラムに載置した。次に上
記カラムを、この溶媒混合物を用いてフラッシュクロマ
トグラフィーに付し、フラクション２５　ｍ　Ｌを採取
した。フラクション１９０〜２７０をプールし濃縮する
と生成物８．０７ｇが油状物として得られ、静置してお
くと、固化した。（収率９２％） 立折 計算値：Ｃ，５１，９６；Ｈ，４，７６；Ｎ、５．０８
゜ 実測値：Ｃ，５２，４９；Ｈ，４，８８；Ｎ、５．４５
゜ ＰＭＲ（６０ＭＨｚ　、ＣＤＣ１３）　　δ：０．９７
　　（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、６Ｈ。

ＣＨｓ−ＣＨ２）；　１．２−１．９　（ｍ、８Ｈ。

ＣＨ２ＣＨ２）；　４．３７　（ｔ　、Ｊ＝６Ｈｚ、４
Ｈ，ＯＣＨ２ＣＨ２） ７．７７　　（ｓ、２Ｈ，Ｃ５Ｈ）； ７．８３（ＡＢ　　４重線、Ｊ＝８Ｈ２，４Ｈ。

Ｃ３ＨＩＣ４Ｈ）。

Ｉ　Ｒ（ＫＢ　ｒ）　ｃｍ−１： １７３０　（Ａｒ−Ｃ−０−ＣＨ２−伸縮）。

質量スペ）ｙ　Ｉ−ル：　Ｅ　、　Ｉ　、　（７０ＥＶ
）ｍ／ｅ＝５０８（３７％、Ｍ”）。

Ｄ、　　５．５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸
）ジメチル この化合物は、５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安
息香酸）の親油性類縁体であり、チオール指示薬として
用いるために下記のようにして製造した。

５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香Ｍ）７．９
３ｇ　（２０ミリモル）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド１．２ｍＬ、塩化チオニル１１．７ｍＬ及びジクロロ
メタン４００ｍＬを含有する懸濁液を、明澄な淡緑色の
溶液が得られるまで４時間還流した。次に溶媒を真空蒸
発すると黄色固体が得られた。これをアルゴン雰囲気下
に置き、ジクロロメタン２００ｍＬ中に溶解し、０°Ｃ
に冷却した。」二記混合物を撹拌し、次に乾燥ピリジン
４．０３ｍＬ　（５０ミリモル）次いでメタノール３０
ｍＬで処理した。次に、得られた混合物を一晩周囲温度
に加温した。次に、上記反応混合物を５％ＮＡＨＣＯ３
溶液３００ｍＬで３回、１Ｍクエン酸３００ｍＬで３回
、及び塩水３００ｍＬで逐次抽出した。乾燥（Ｍｇ　Ｓ
　Ｏ＋　）　、　Ｉ濾過及び溶媒の除去を行って黄色固
体８．２９ｇを得、これをトルエンで２回に分けて再結
晶して収率９２％の淡黄色固体を得た。ｍ　ｐ　１０３
〜１０４．５℃ 分所 計算値：Ｃ，４５，２８；Ｈ，２，８６；Ｎ、６．６０
゜ 実測値：Ｃ，４５，７４；Ｈ，３，０１；Ｎ、６．２５
゜ ＰＭＲ（６０ＭＨｚ　、ＣＤＣ１３）δ：３．９３　（
Ｓ、６Ｈ，０−ＣＨ５）。

７．８　（ｓ、２Ｈ，Ｃ６Ｈ）； ７．８３（ＡＢ４重線、Ｊ＝８Ｈｚ　、４Ｈ。

Ｃ３Ｈ，Ｃ４Ｈ）。

Ｉ　Ｒ（ＫＲｒ）　ｃｍ−’　： １７４０　（−Ｃ−０−ＣＨ３伸縮）。

質量スペクトル：　ＥＩ　（７０ＥＶ）ｍ／ｅ　：４２
４．３　（Ｍ”　、６７．７％）。

Ｅ、　　３．６−シオキサオクチルー５．５′−ジチオ
−（２−ニトロベンゾエート） この化合物は、５，５′−ジチオビス−（２−二Ｉ・口
安息香酸）の水溶性類縁体であり、チオール指示薬とし
て用いるために下記のようにして製造した。

５．５′−ジチオ−（２−ニトロ安息香酸）７．９３ｇ
（ｉ０ミリモル）、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド１　
、１７　ｇ、塩化チオニル１１．７ｍＬ、及びジクロロ
メタン４００ｍＬを含有する懸濁液を撹拌下に２時間加
熱還流し、明澄な溶液を得た。溶媒を真空下に除去する
と淡緑色固体が得られた。これをアルゴン雰囲気下に置
き、０℃に冷却し、乾燥ピリ９フ１２０ｍＬ中に撹拌下
に懸濁せしめた。次にカルピトール（ｃａｒｂｉｔｏ１
８　）（２０ｍＬ）を加えると、１時間の反応時間後、
得られた混合物は橙赤色の均一な溶液となった［カルピ
トールはダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｇｏ、）の商標であり、化学名は２−（２−エトキシエ
トキシ）エタノールである］。上記混合物を一晩周囲温
度まで戻した。上記試料を、次に、真空蒸発して黒っぽ
い油状物を得、これをカラムに充填されたＳ　ｉ　０２
−６０　（２３０〜４００メツシユ）５００ｇでのフラ
ッシュクロマトグラフィーに付し、０．５％メタノール
−クロロホルム溶媒混合物で溶出した。フラクション２
５ｍＬが採取された。フラクション１５０〜１８６をプ
ールして濃縮すると黄色油状物７．８６ｇが得られた。

次に、試料をエーテルに溶解せしめ、ノーリット４ｇで
処理し、セライトで濾過すると、濃厚な黄色油状物かへ
キサンと共に沈澱した。溶媒を傾瀉し、残与の溶媒を真
空下に４０℃（０，１ｍｍ）にて１時間除去すると粘稠
な黄色油状物５．４８ｇが得られた。（収率４４％）分
所 計算値：Ｃ，４９，６７；Ｈ，５，１３゜Ｎ、４．４６
゜ 実測値、Ｃ，４９，４１，Ｈ，５，０９゜Ｎ、４．３７
゜ ＰＭＲ（６０ＭＨｚ　、ＣＤＣ１３）δ：１．２　（ｔ
　、Ｊ＝７Ｈｚ　、６Ｈ、ＣＨ３ＣＨ２−０−）；３．
５　（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、４Ｈ。

ＣＨ３ＣＨ２０）； ３．６　　（Ｓ　、８Ｈ，−ＣＨ２−ＣＨ２−０−）；
３　、８　　（ｍ　、　４Ｈ、−Ｇ−０−ＣＨ２−ＣＨ
２）；　４．５５　（ｍ、４Ｈ、ＣＣＨ２−ＣＨ２−０
−）　　。

７　、８　　（ｓ　、　２Ｈ，Ｃａ　Ｈ）　　；７　、
８２　　（ＡＢ４重線、Ｊ＝８Ｈｚ、４Ｈ，Ｃ３Ｈ，Ｃ
４Ｈ）。

Ｉ　Ｒ（ｃＨＣ１３）　ｃｍ−’　　：１７４０　（−
Ｃ−０−ＣＨ２−伸縮）。

Ｆ、　　５．５’−ジチオ−（２−ニトロ安息香酸）３
，６，９．１２−テトラオキサドデシル及びその１．１
２一環式ジエステル これらの両化合物は、５，５′−ジチオビス−（２−こ
１・口安息香酸）の水溶性類縁体であり、チオール指示
薬として用いるために下記のようにして製造した。

５．５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）７．９
３ｇ（２０ミリモル）塩化チオニル１１．７ｍＬ及びＮ
、Ｎ−ジメチルホルムアミド１．２ｍＬを含む懸濁液を
２時間加熱還流して明澄な黄色溶液を得た。溶媒を真空
下に除去すると淡緑色固体が得られ、これをジクロロメ
クン５０ｍＬとピリジン５ｍＬとの混合物中に溶解せし
めた。この溶液を、アルゴン雰囲気下にジクロロメタン
１００ｍＬ中のテトラエチレングリコール３４．５ｍＬ
（３８，８ｇ、２００ミリモル）溶液に０°Ｃで徐々に
加えた。上記反応混合物を一晩周囲温度に戻した。溶媒
を真空蒸発することにより褐色油状物が得られ、これを
クロロホルムと水とに分配した。水層を再びクロロホル
ムで抽出し、有機層を合わせて塩水で洗浄し乾燥（Ｎａ
２ｓｏ４　）した。濾過及び溶媒の真空蒸発により、橙
色油状物が得られ、これをカラムに充填された５ｉ０２
６０（２３０〜４００メツシユ）のフラッシュクロマト
グラフィーに伺し、５％メタノール−クロロホルム溶媒
混合物で溶出した。フラクション２５ｍＬが採取された
。フラクション２４〜３８をプールし濃縮すると、黄色
のガラス状物２．２１ｇが得られた。これは、５．５′
−ジチオビス−（２−二トロ安息香酸）のｌ、１２一環
式−３，６，９，１２−テトラオキサウンデシルエステ
ルと同定された。環式エステルの収率は２０％であった
。

１３ＣＮＭＲ（２２，５ＭＨ２，ＣＤＣ１３）δ：６６
．８，６８．３，７０．４（すべて−〇−ＣＨ２ＣＨ２
０）； １２８．８，１４２．４゜ １４６．３（アリールＣ）； １６４　、３　（−Ｃ−０−Ｃ：Ｈ２）　。

Ｉ　Ｒ（ｃＨＣ１３）　ｃｍ−’　： １７３０ｃｍ−１（−Ｃ−０−ＣＨ２−伸縮）。

フラクション９１−１０１をプールし濃縮すると、所望
の３．６，９．１２−テトラオキサドデシルジエステル
３．９４ｇが得られた。（収率２６％） １３ＣＮＭＲ（２２，５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）　　δ：
６１．８，６５．６，６８．３，７０．２゜７．０．５
，７２．４（すべて−ＯＣＲ２ＣＨ２−０−）　　。

１２９．０，１４２．４゜ １４６．５（アリールＣ）； １６４．５　　（ｃＯＣＨ２）− ＰＭＲ（６０ＭＨｚ　、ＣＤＣＩ３　）：脂肪族プロト
ンの芳香族ブロー・ンに対する積分比＝５．６Ｉ　Ｒ（
ｃＨＣ１３）　ｃｍ−’　： ３６００　３３５０　（ｃＨ２０Ｈ−伸縮）：１７３０
　（−Ｃ−）　　ＣＨ２−伸縮）。

実施例２ニゲルコ一ス用組成物 全血の試験に有用なグルコース試験具は下記のようにし
て製造した６還元されたニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドを共通基質とし、グルコースデヒドロゲナーゼ
によりグルコースから生成した。レインボーカラーを発
色するグルコース配合物に対する一般化学は、下記に模
式図により示す。チオール指示薬、ＤＴＮＢは、一般に
エルマン試薬と呼ばれている。

Ａ、　経路１：ジアホラーゼ／ＮＢＴ／　ＴＲ−１経路
２　：　ＬｉＰＤＨ／リボアミド／ＤＴＮＢ４　　カル
ボジイミド　　　　　　　　　１．２５％「し　ンボー
　　８ グルコース ＋ 操作：各々の溶液の成分を上記の順序に従って４０°０
で合わせた。溶液を塗布する前に脱泡した。層１をポリ
エステル支持体上に塗布し乾燥した。層２を層１上に塗
布、乾燥し、残りの層も同様にして塗布、乾燥した。試
験具は最終的に、ポリエステル支持体上の３つのゼラチ
ン層で構成された。カルボジイミドの塗布によりゼラチ
ンが架橋されて表面が硬化され、試験具の表面の拭取り
操作を可能にする。

用量応答ニゲルコース濃度が５０〜６００ｍ／ｄＬの範
囲で増加するに伴い、カラーシーケンスは淡赤色から、
オリーブグリーンを経て青黒色を示した。

Ｂ、　経路１　：　ＭＰＭＳ／ＤＣＩＰ／ＩＮＴ経路２
：グルタチオンレダクターゼ／グルタチオン／ＤＴＮＢ ３　　カルボジイミド　　　　　　　　　１．２５％実
施例２Ａと同様に操作して、配合及び試験具のテストを
行った。

用量応答ニ ゲルコースｍ／ｄＬｆ！：Ｊ １１０　　　　　　　　　ピーコック青１４０　　　　
　　　　緑青色 １８０＜すんだ淡い水色 ２５０＜すんだバラ色 ３００＜すんだバラ色 ４００　　　　　　　　バラ色 ５００　　　　　　　　バラ色 ６００　　　　　　　　暗バラ色 ８００　　　　　　　　バーガンディー（暗紅色） 青から、バラ色を経るパーガンディーまでの色相は、容
易に視認可能であった。

Ｃ０経路１　：　ＭＰＭＳ／ＤＣＩＰ／ＩＮＴ　−経路
２　：　ＬｉｐＤＨ／リボアミド／ＤＴＮＢ３　　カル
ボジイミド　　　　　　　　　１．２５％実施例２Ａと
同様に操作して配合及び試験具のテストを行った。

用量応答ニ ゲルコースｍ１ｄＬ　　　　　　　色 ２０　　　　　　　　　ピーコック青 ４０　　　　　　　　　ピーコック青 ７０　　　　　　　　水色 １１０　　　　　　　　ティールグリーン（暗青色がか
った緑色） １４０　　　　　　　　　ミントグリーン１８０　　　
　　　　　海緑色 ２５０　　　　　　　　綴金色 ３００　　　　　　　　金色 ４００　　　　　　　　橙金色 ５００　　　　　　　　橙色 ６００　　　　　　　　暗橙色 ８００　　　　　　　　深い暗橙色 青、緑、金及び橙の色は明確に視認された。

Ｄ、　経路１　：　ＤＣＩＰ／ＴＮＴ／ＭＰＭＳ経路２
　：　ＬｉｐＤＨ／リボアミド／３−ＮＤ水　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　６．７８ＰＶＰ　Ｋ
２Ｏ（２０％）　　　　　　　　　　　１．８９ト　リ
　ト　ン　Ｘ−１００（４％）　　　　　　　　　　　
　　　０．４０ＩＮＴ　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，０８４２ゼラチン　　　　　　　　　　　　１
．１３ＤＣＩＰ　　　　　　　　　　　　　　　０．０
１４７３−ＮＤ　（２０ｍＷ）　　　　　　　　　　　
１．２５１１１ＬＧＤＩＩ　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ，０８ＯＮＡＩＩ”　　　　　　　　　　　　　
　　０．０８０ＭＰＭＳ　　　　　　　　　　　　　　
　０．０１０リポアミド　　　　　　　　　　　　０．
０３０３　　カルボジイミド　　　　　　　　　１．２
５％実施例２Ａと同様に操作して配合及び試験具のテス
トを行った。

用量応答ニ ゲルコースｖａｌｄＬ　　　　　　　　色４０　　　　
　　　　　ピーコック青 ７０　　　　　　　　ティールグリーン１１０　　　　
　　　　　ミントグリーン１４０　　　　　　　　　淡
いミント １８０　　　　　　　　海緑色 ２５０　　　　　　　　黄褐色 ３００　　　　　　　　暗黄褐色 ４００　　　　　　　　薄茶色 ５００　　　　　　　　錆色 ｅｏｏ　　　　　　　　錆色 ８００　　　　　　　　暗赤色 この配合物により、ＤＴＮＢ誘導体３−ＮＤを用いた場
合、使用者にとって視認可能な、試験具の最終的色相の
発色は８分で完了した。

Ｅ、　経路１　：　ＭＰＭＳ／ＤＣＩＰ／ＩＮＴ経路２
　：　ＬｉｐＤＨ／リポアミド／３−ＮＤ３　　カルボ
ジイミド　　　　　　　　　１．２５＄用量応答ニ ゲルコース（ｍｇ／ｄＬ　　　　　発色した色相０　　
　　　　　青色 ２０　　　　　　　　暗青緑色 ４０　　　　　　　　青緑色 ７０　　　　　　　　淡緑色 １１０　　　　　　　　黄緑色 １４０　　　　　　　　金色 １８０　　　　　　　　全橙色 ２５０　　　　　　　　橙色 ４００　　　　　　　　赤橙色 ８００　　　　　　　　暗赤色 この試験具は、青、緑、金、橙及び赤色のレインボーの
全スペクトルを発色する。グルコースの濃度に応じて使
用者に視認可能な色相が７〜８分で発色する。

Ｆ、　全血中グルコース用レインボー試験具。

経路１：ジアホラーゼ／ＤＣＩＰ／ＩＮＴ経路２：　　
ＬｉｐＤＨ／　リポアミド／３−Ｎ口３　　カルボジイ
ミド　　　　　　　　　１．２５駕試験具の作成に用い
た操作は実施例２Ａに記載したと同様のものである。Ｙ
ＳＩグルコース分析器を用いて分析された所望のグルコ
ース濃度に調整された全血試料について試験を行った。

用量応答のデータを下記に示す。成層することによりゼ
ラチンキャリア中に区分化された本発明の試験組成物を
含む試験具は、グルコース濃度０〜８００ｍｇ／ｄＬの
範囲に亘ってレインボーの全スペクトルを発色した。」
二記組成物は正常な血液グルコースの範囲に対しては緑
の色相を発色するように意図されたものである。

用量応答ニ ゲルコースＩａ／ｄＬ　　　　　灸ム旦ムｌＯ青色 ４０　　　　　　　　淡青色 ７０　　　　　　　　青緑色 １１０　　　　　　　　海緑色 １４０　　　　　　　　薄縁色 １８０　　　　　　　　淡黄色 ２５０　　　　　　　　黄橙色 ４００　　　　　　　　橙赤色 ８００　　　　　　　　赤色 Ｇ、　レインボー試験具：酵素濃度の異るもの下記の例
は酵素の濃度を変化させることによす、最終的に得られ
た色相がいかに調整され得るかを示すためのものである
。

経路１：ジアホラーゼ／ＤＣＩＰ／ＩＮ？経路２　：　
ＬｉｐＤＨ／リポアミド／３−ＮＤ■　−ＣＮ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　。

実施例２Ａに記載のようにフィルムを作成して試験を行
った。

実施例３：紙製レインボー試験具 多層ゼラチンが、レインボー試験具にとっての好ましい
マトリックスであるが、紙をキャリアとして用いて試験
具を製造することができる。下記の組成及び表示の順序
に従って溶液を調製した。

緩衝液はｐＨ７，４のＴＡＰＳＯを用いた。ポリビニル
アルコール（ＰＶＡ）と試薬の添加順序は本実施例にお
いて重要であった。ＰＶＡ濃度１〜１．５％で、紙製マ
トリックス中の、ＤＣＩＰとＩＮＴとの共沈が防止され
た。

ホワットマン（Ｗｋａｔｍａｎ）　３１　Ｅ　Ｔ紙にこ
の溶液を含浸せしめ５０’０で乾燥した。乾燥した紙を
切断しプラスチック支持体上に固定して試験片を作成し
た。ＮＡＤＨを用いて上記試験片の試験を行ったところ
下記の結果が得られた。

１　　青色　淡青色　青／緑色　茶色　茶／橙色２　　
青色　淡青色　薄縁色　　茶色　　橙色実施例４：チオ
ール試薬に感受性の酵素を含むＮＡＤＨ生成系 上記のチオール検出試薬系に係る一般的問題点は、チオ
ール指示薬が蛋白質系と反応して、酵素の不活性化を引
起こす場合が多いことである。

ＤＮＴＨによる、多くのそのような酵素の阻害は文献に
記載されている。２つの一般的溶液があり、両者ともチ
オール試薬を： （ｉ）　　有機層中に又は不溶性粒子の形で隔離してお
く、又は （２）　　チオール試薬に感受性の酵素とチオール試薬
とを、後者を固定化することにより、物理的に分離して
おくことにより、区分化することが必要である。

Ａ、　方法（ｉ）試薬の隔離 ＤＴＮＢの水不溶性類縁体であるＥＡＩを用いた（製造
方法については実施例ＩＣを参照）。

試薬を隔離するには２つの方法がある。

（ａ）　　ＥＡＩを油に溶解し、ゼラチンフィルム中に
エマルジョン状に分散せしめる方法 互扱」：　Ｅ　Ａ　１　（３００ｍＭ）をトリオクチル
アミン（ｉ％）を含むリン酸トリクレジル中に溶解した
。

本性」　　　　　　　　　　東経塁遺 ゼラチン　　　　　　　　　　　１０％リン酸カリウム
ｐＨ７，５５０ｍＭ ＤＣＩＰ　　　　　　　　　　　　　　　　１．５ｍＭ
油性相をウェアリング・ブレンダー（ＷａｒｉｎｇＢｌ
ｅｎｄｅｒ）中で水性層を用いて、最終濃度が５％とな
るように乳化した。リポアミドデヒドロゲナーゼ（シグ
マ■型、１３．３Ｕ／ｍＬ）を上記エマルジョンに加え
た。エマルジョンをプラスチック製支持体（ｉ７０ｐＬ
）上に塗布し、室温で乾燥した。

乾燥したフィルムなＮＡＤＨ／リボアミド（約１　ｍＭ
）、ｐＨ８，５Ｃトリス緩衝液）で処理することにより
、ＤＣＩＰの青色が極めて急速に漂白されてＦＡＩ試薬
による黄色が発色した。

ＮＡＤＨを用いない場合には、反応は生じなかった。

ＤＴＮＢにより阻害される乳酸デヒドロゲナーゼ酵素（
ＬＤＨ）をこのフィルムを用いて試験した。ＬＤＨ（約
１５０Ｕ／ｍＬ）及び約２５０ｍＭ乳酸塩（ｐ）（８’
、５）中のりポアミド（約１ｍ　Ｍ　）により黄色が約
１０分間で発色した。

ＬＤＨを用いないブランクは発色が見られなかった。結
論は、油溶性の千オール指示薬の使用により、油性エマ
ルジョン中にこれを区分化することにより、チオール試
薬に対して感受性を有すると通常思われている酵素の使
用が可能になるということである。

（ｂ）　　ＥＡＩを直接紙に含浸せしめる方法ＥＡＩを
、濃度が５．７ｍＭとなるようにトルエンに溶解した。

ホワットマン３１ＥＴ紙にこの溶液を含浸せしめ、５０
℃で乾燥した。第２の溶液を下記の成分により調製した
。

最１日」度 トリドア　Ｘ−１０００，１１ （トリス）２６ｆｔ酸ｆＪｉｐＨ８，５０，２ＭＰＶＡ
　（９８，５％加水分解）　　　　　　　　０．８２％
ＭＰＭＳ　　　　、　　　　　　　　　　　　　　　　
　０．２５　　終にリボアミド　　　　　　　　　　　
　Ｏ；２５　ｍＭＬｉｐＤ）ｌ　　　　　　　　　　　
　　　　３０　Ｕ／ｍＬＮＡＤ　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｏ，５ｍＭＩ］ＣＩＰ０．８ｍＭ （トリス）硫酸塩は、硫酸を用いて所望のｐＨに調整さ
れたトリス緩衝液である。

上記の乾燥した紙を第２の溶液に浸漬し、再び５０’Ｃ
で乾燥してプラスチック製支持体に取り付けた。

ＬＤＨのための試験液は、Ｌ−乳酸塩（ｉ６７ｍＭ）、
　（トリス）２硫酸塩ｐＨ８，５（０，３３Ｍ）及びＬ
ＤＨ酵素（兎の筋肉、シグマ２型）を含み、下記表に示
す試験結果が得られた。

厘用儂Ｊして１℃ｍｌＤ 種々のＬＤＨ濃度範囲に頁って極めて良好な色が視認さ
れた。

アルコール　４　　　シ゛ この区分化フィルムフォーマットの、チオール試薬に感
受性の酵素の使用が要求される試験の操作能を更に、ア
ルコールデヒドロゲナーゼを用いて試験した。

種々の濃度の硫酸エタノール、（トリス）２緩衝液０．
５Ｍ、ｐＨ８，５及びアルコールデヒドロゲナーゼ（製
パン用イースト、シグマ社カタログＮｏ、７０１１．２
２．５Ｕ／ｍＬ）を含む試験溶液を調製した。

上記のように作成した試験片を用いた。試験結果を下記
の表に示す。

青色 青色 アルコールの濃度に応じて極めて良好な視認が得られた
。

これらの実験の結論として、チオール検出試薬を用いた
レインボーシステムは、チオール試薬感受性の酵素と共
に使用し得ることが明らかになった。

Ｂ、　方法２：チオール試薬感受性酵素とチオール試薬
の後者を固定することによ る物理的分離方法 ＤＴＮＢはより大きい分子に共有結合せしめるか又は小
さい分子のみの浸透を許すゼラチンのようなマトリック
ス中に物理的に抽足することができる。したがって、酵
素とチオール試薬との直接的相互作用が起こる可能性は
ない。

？ＤＴＮＢ” ＤＴＮＢを、水溶性のカルボジイミド試薬を用い、カル
ボキシの作用により、ヒト血清アルブミンに結合せしめ
た。

３０％ヒト血清アルブミン溶液をリン酸ナトリウム中で
０．２ＭとしｐＨを４．５７に調整した。これを希釈し
て４．８％アルブミンとした。ＤＴＮＢ　（ｉ０，７ｍ
Ｍ）及び１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＡＣｌｌｏ、７ｍＭ）を小量
のエタノール中に溶解し、急激に撹拌しなから０℃に保
持された上記アルブミン溶液に加えた。２〜３時間後、
や＼ゲル化した物質を透析チューブに移し、水で十分透
析し、次に凍結乾燥した。

皮殻質の黄色固体を微粉末に粉砕し、１０％ゼラチン中
に１％の濃度に分散せしめた。被膜が得られ（ｉ７０＃
）、室温で乾燥した。

下記の試験混合物を用いてフィルムを評価した。

散Ｊｕｔ度 乳酸リチウム　　　　　　　　　　２５０　ｍＷリン酸
カリウム　　　　　　　　　２５０　ｍＭ緩衝剤、　ｐ
Ｈ７，５ グルタチオン　　　　　　　　　　０．５　ｍＷグルタ
チオンレダクターゼ　　　　９　Ｕ／ｍＬＮＡＤ　　　
　　　　　　　　　　　　Ｏ，２ｍＭＬＤ）ｌ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
　　υ１ＩＩＩＬ上記フィルムは、この溶液と接触する
と、１分以内に明澄な黄色を発色した。ＬＤＨを用いな
い対照溶液は発色を示さなかった。結論として、チオー
ル試薬を固定化することにより、チオール試薬に感受性
を有する酵素を用いた試験が可能となる。

総合的結論としては、文献によれば、アルコールデヒド
ロゲナーゼ及びコレステロールデヒドロゲナーゼのよう
な多くの酵素はＤＴＮＢによって阻害されるが、かかる
阻害を回避する多くの方法もあるということである。結
局、チオール指示薬が関与する第２の触媒系は、通常Ｎ
ＡＤＨの試験に中間体として適用することができ、分析
対象物としてのアルコール又はコレステロールの測定に
用いることができる。

実施例５：拡散性／非拡散性色素反応 レインボーカラーを発色せしめるための別の方法は、試
験組成物の色相を分散の結果として発現せしめることに
ある。例えば、指示薬が、マトリックスに共有結合して
いるために分散し得す、かつこのマトリックスが不透明
層で被われている場合は、上記指示薬は上面からは視認
不可能である。反応の結果、もし指示薬のマトリックス
への共有結合が切断されると、指示薬は不透明層を通し
て上方へ拡散し視認可能になる。

−例として、実施例４Ｂに記載のようにフィルムを作成
し、このフィルムにおいては、ＤＴＮＢをアルブミンに
共有結合せしめ、次にこれをゼラチンマトリックスに包
含せしめた。ホヮットマン３１ＥＴに下記成分を含む溶
液を含浸せしめた。

最ｍ度 リン酸力＋）　ラム、　ｐＨ７，５１８０ｍＭグルタチ
オン　　　　　　　　　　０．４　ｍＭグルタチオンレ
ダクターゼ　　　　３１３　Ｕ／ＭＬ上記の含浸を行っ
た紙を５０℃で乾燥した。乾燥した紙片を切断し、ゼラ
チンフィルム上に置いた。この紙は全く不透明であった
。ＮＡＤＨ溶液を、このようにして作成した多層試験具
に加え、対照として用いる別の試験具には水を加えた。

約２０秒でＮＡＤＨと接触した試験具は黄色に変化し始
め、急速に深い黄色が発色した。対照パッドは無色であ
った。

ＬＤＨ試験を下記の溶液を用いて行った。

敢終Ｉ渡 リン酸カリウム、　ｐＨ７，５２５０ｍＭ乳酸リチウム
　　　　　　　　　　２５０　ｍＭＮＡＤ　　　　　　
　　　　　　　　　Ｏ，２ｍＭＬＤＨ（約５　Ｕ　／　
ｍ　Ｌ　）をこの溶液に加え、この溶液３０ｐ、Ｌを上
記の紙／ゼラチン製多層試験具の１つに加えた。

約５坏分後、上記ＬＰＤパッドは、かすかではあるが確
かに黄色を示した。ＬＤＨを用いない対照は無色であっ
た。

結論は、指示薬は、分析対象物の濃度の関数として分散
可能にせしめられるということである。

本方法において、指示薬分子は、色相決定（発色団）部
分と反応性（開裂可能な）部分とが組合わされたもので
ある。これらの部分は、定着結合の開裂が指示薬の色相
を大きく変化させることがないように電子工学的に単離
される。指示薬の量又は強度は、還元的開裂に伴う触媒
系の活性によって調節され、発色せしめられた色相は、
上記分子の発色団性部分により、別個に測定される。こ
のことは、所望の最終的色相を発色する、色相と反応性
との適切な組合せを備えた指示薬を見出すことは困難で
あるため、かなりの利点である。

酸化による、チオール指示薬の固定化が可能な他のマト
リックスは、チオールアガロース又は２官能性の試薬、
例えばジチオビス−（プロピオン酸スクシンイミジル）
であるローマント（Ｌｏｍａｎｔ’ｓ）試薬を用いた蛋
白質ならばどのようなものであってもよい。

これらの実施例から、本発明の精神及び範囲から離れる
ことなく、変形ないし修正が種々なされ得る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、流体試料中の分析対象物の目視測定のための試験組
   成物であって、 （ａ）分析対象物から、還元されたニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒系； （ｂ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドとの反応により、還元された第１の指示薬を生成せし
   め得る第１の独立触媒系；及び （ｃ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドとの反応により、第２の指示薬成分の色相変化を生じ
   させ得る第２の独立触媒系から成り、該第２の独立触媒
   系は、 （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ｉｉ）ジスルフィド基質；及び （ｉｉｉ）チオール指示薬を包含し、 ここで、上記ジスルフィドレダクターゼは、還元された
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド
   基質との反応に触媒として作用して、上記チオール指示
   薬と相互作用して、第２の指示薬の色相変化をもたらす
   ことができる生成物を生成することができ；それによっ
   て還元された第１の指示薬の生成及び第２の指示薬の変
   化した色相が調整されて一定範囲の色相が与えられ、試
   験組成物により生成される特定の最終的色相が、分析対
   象物の濃度に依存することを特徴とする試験組成物。 ２、流体試料中の分析対象物の目視測定のための試験組
   成物であって、 （ａ）分析対象物から、還元されたニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒系； （ｂ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドとの反応により、還元された第１の指示薬を生成せし
   め得る第１の独立触媒系；及び （ｃ）還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチ
   ドとの反応により、還元された第２の指示薬を生成せし
   め得る第２の独立触媒系から成り、該第２の独立触媒系
   が、 （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ｉｉ）ジスルフィド基質；及び （ｉｉｉ）チオール指示薬を包含し、 ここで、上記ジスルフィドレダクターゼが、還元された
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド
   基質との反応に触媒として作用して、上記チオール指示
   薬を還元して、還元された第２の指示薬を生成し得る生
   成物を生成することができ；それによって、還元された
   指示薬の生成が調整されて一定範囲の色相が与えられ、
   試験組成物により生成される特定の最終的色相が、分析
   対象物の濃度に依存することを特徴とする試験組成物。 ３、還元された第１及び第２の指示薬の生成が実質的に
   同時に起る特許請求の範囲第２項記載の試験組成物。 ４、第１又は第２の独立触媒系が還元された第３の指示
   薬を生成し得る特許請求の範囲第２項記載の試験組成物
   。 ５、１つの指示薬成分の還元が、ある色相から無色への
   変化をもたらす特許請求の範囲第４項記載の試験組成物
   。 ６、発色遅延剤を更に含む特許請求の範囲第２項記載の
   試験組成物。 ７、最終的色相の発色が約１０分未満で実質的に完了す
   る特許請求の範囲第２項記載の試験組成物。 ８、還元された第２の指示薬が黄色である特許請求の範
   囲第２項記載の試験組成物。 ９、チオール指示薬がジスルフィドである特許請求の範
   囲第２項記載の試験組成物。 １０、ジスルフィドが５，５′−ジチオビス−（２−ニ
   トロ安息香酸）の類縁体である特許請求の範囲第９項記
   載の試験組成物。 １１、水性流体試料中のグルコースの目視測定のための
   試験組成物であって、 （ａ）グルコースとの反応により、還元されたニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドを生成せしめ得る触媒系
   ； （ｂ）ジアホラーゼ活性を有する触媒、酸化された第１
   の指示薬及び酸化された第３の指示薬から成る第１の触
   媒系（それぞれ、還元されたニコチンアミドアデニンジ
   ヌクレオチドと、触媒の存在下に反応して、還元された
   第１及び第３の指示薬を生成することができる）；及び （ｃ）ジスルフィドレダクターゼ、ジスルフィド基質及
   びチオール指示薬から成る第２の触媒系（ここにおいて
   、ジスルフィドレダクターゼは、還元されたニコチンア
   ミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド基質との反
   応に触媒として作用して、チオール指示薬を還元して還
   元された第２の指示薬を生成する生成物を生成せしめる
   ことができ、それにより、還元された指示薬の生成が制
   御されて一定範囲の色相が発色せしめられ、試験組成物
   により生成される最終的色相が、試料中のグルコース濃
   度に依存する）から成ることを特徴とする試験組成物。 １２、還元された第１及び第２の指示薬の生成が実質的
   に同時に起る特許請求の範囲第１１項記載の試験組成物
   。 １３、第１、第３及びチオール指示薬のうちの少くとも
   一つが、還元によってある色相から無色へ変化する特許
   請求の範囲第１１項記載の試験組成物。 １４、試験組成物の最終的色相の発色が、約１０分未満
   で実質的に完了する特許請求の範囲第１３項記載の試験
   組成物。 １５、流体試料中の分析対象物を目視測定するための試
   験具であって、 （ａ）キャリアマトリックス；及び （ｂ）該マトリックスに包含せしめた試験組成物（分析
   対象物から、還元されたニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチドを生成せしめ得る触媒系；還元されたニコチン
   アミドアデニンジヌクレオチドとの反応により、還元さ
   れた第１の指示薬を生成せしめ得る第１の独立触媒系；
   及び還元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
   との反応により、黄色の第２の指示薬を生成せしめ得る
   第２の独立触媒系を含む）から成り、該第２の独立触媒
   系が （ｉ）ジスルフィドレダクターゼ； （ｉｉ）ジスルフィド基質；及び （ｉｉｉ）チオール指示薬を包含し、 ここで、上記ジスルフィドレダクターゼが、還元された
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジスルフィド
   基質との反応に触媒として作用して、上記チオール指示
   薬との相互作用により黄色の第２の指示薬を生成し得る
   生成物を生成することができ、それによって還元された
   指示薬及び黄色指示薬の発色が調整されて一定範囲の色
   相が与えられ、試験組成物により生成される特定の最終
   的色相が、分析対象物の濃度に依存することを特徴とす
   る試験具。 １６、還元された第１及び第２の指示薬の生成が実質的
   に同時に起る特許請求の範囲第１５項記載の試験具。 １７、第１又は第２の独立触媒系が、還元された第３の
   指示薬を生成せしめ得る特許請求の範囲第１６項記載の
   試験具。 １８、第１及び第３の酸化指示薬の少くとも一方の還元
   により、該指示薬の色相を無色へ変化させる特許請求の
   範囲第１７項記載の試験具。 １９、酸化指示薬及びチオール指示薬の少くとも一方が
   キャリアマトリックス内に区分化されている特許請求の
   範囲第１８項記載の試験具。 ２０、体液試料中のグルコース目視測定のための多層試
   験具であって、 （ａ）不活性支持部材；及び （ｂ）該部材に積層された親水性キャリアから成る少く
   とも２つの層から成り、その第１の層が第１及び第３の
   酸化指示薬成分のどちらか一方を含有し、第２の層が （ｉ）ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド；（ｉｉ
   ）グルコースとの反応により、還元されたニコチンアミ
   ドアデニンジヌクレオチドを生成せしめ得るグルコース
   デヒドロゲナーゼ； （ｉｉｉ）ジスルフィド基質； （ｉｖ）前記で含有されなかった、酸化された第１のも
   しくは第３の指示薬； （ｖ）還元された形のニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドと酸化された第１及び第３の指示薬との反応を促
   進して還元された第１及び第３の指示薬を生成せしめ得
   る、ジアホラーゼ活性を有する触媒； （ｖｉ）ジスルフィドレダクターゼ；及び （ｖｉｉ）チオール指示薬を含み、 ここで、該ジスルフィドレダクターゼが、得られた、還
   元されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドとジス
   ルフィド基質との反応に触媒として作用してチオール指
   示薬を還元し得る生成物を生成することができ、それに
   より、上記試験具が一定範囲の色相を発色することがで
   き、試験具中に生じた特定の最終的色相が、試料中のグ
   ルコースの濃度に依存することを特徴とする多層試験具
   。 ２１、親水性キャリアがゼラチンであり、各層がコーテ
   ィングによって取付けられている特許請求の範囲第２０
   項記載の多層試験具。 ２２、一方の層が発色遅延剤を更に含む特許請求の範囲
   第２０項記載の多層試験具。 ２３、発色遅延剤がフェリシアン化カリウム、ヨウ化１
   −Ｎ−エチル−４−メチル−キノリニウム又はそれらの
   類縁体から選ばれる特許請求の範囲第２２項記載の多層
   試験具。 ２４、チオール指示薬が水溶性ジスルフィドである特許
   請求の範囲第２１項記載の多層試験具。 ２５、水溶性ジスルフィドの還元により黄色が発色する
   特許請求の範囲第２４項記載の多層試験具。 ２６、水溶性ジスルフィドが、５，５′−ジチオビス−
   （２−ニトロ安息香酸）の水溶性類縁体である特許請求
   の範囲第２５項記載の多層試験具。