JPS60178354A - 安定な発色剤組成物 - Google Patents
安定な発色剤組成物Info
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- JPS60178354A JPS60178354A JP3482784A JP3482784A JPS60178354A JP S60178354 A JPS60178354 A JP S60178354A JP 3482784 A JP3482784 A JP 3482784A JP 3482784 A JP3482784 A JP 3482784A JP S60178354 A JPS60178354 A JP S60178354A
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- reducing agent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
- C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は安定な発色剤組成物に関し、さらに詳しくは過
酸化物質、発色剤、過酸化酵素を用いた酸化発色による
測定系に用いる発色剤の安定化法に関する。
酸化物質、発色剤、過酸化酵素を用いた酸化発色による
測定系に用いる発色剤の安定化法に関する。
過酸化物質、特に過酸化水素の測定は最近、臨床検査の
分野において重要性を増しつつある。体液成分、例えば
ブドウ糖、尿酸、コレステロール、モノアミンはグルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、モノアミンオキシダーゼとの酵素反応によって
過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は発色剤お
よび過酸化酵素を用いて定量することによって、各々の
体液成分の含量を知ることができる。
分野において重要性を増しつつある。体液成分、例えば
ブドウ糖、尿酸、コレステロール、モノアミンはグルコ
ースオキシダーゼ、ウリカーゼ、コレステロールオキシ
ダーゼ、モノアミンオキシダーゼとの酵素反応によって
過酸化水素が生成する。生成した過酸化水素は発色剤お
よび過酸化酵素を用いて定量することによって、各々の
体液成分の含量を知ることができる。
また、過酸化酵素の活性測定はペルオキシダーゼを標識
物質とした酵素免疫測定法において重要性を増しつつあ
る。一般に酵素免疫測定法においては、標識抗体または
標識抗原のペルオキシダーゼ活性を測定することにより
、生体生理活性物質あるいは生体成分１例えば、インス
リン、甲状腺０ 刺激ホルモン等の成長ホルモン、α−フェト音゛ロチイ
ン、カルチノ・エンブリオニック・アンチダン１免疫グ
ロブリンＥ（ＩｒＥ）、フェリチン、β２−マイクログ
ロブリン等の極微量の血清タンパク質の測定を行なうこ
とができる。
物質とした酵素免疫測定法において重要性を増しつつあ
る。一般に酵素免疫測定法においては、標識抗体または
標識抗原のペルオキシダーゼ活性を測定することにより
、生体生理活性物質あるいは生体成分１例えば、インス
リン、甲状腺０ 刺激ホルモン等の成長ホルモン、α−フェト音゛ロチイ
ン、カルチノ・エンブリオニック・アンチダン１免疫グ
ロブリンＥ（ＩｒＥ）、フェリチン、β２−マイクログ
ロブリン等の極微量の血清タンパク質の測定を行なうこ
とができる。
ところで、過酸化物質、特に過酸化水素の定量法として
は発色剤として、０−ジアニンジンを用いる方法または
４−アミノアンチピリンとフェノールを用いる方法等が
知られている（検査と技術Ｖｏ１．９、應１１、Ｐ−８
６７〜８７１（１９８１））。しかしながら、前者は還
元性物質１例えば、アルデヒド類と反応する性質がちる
ため、その反応が過酸化水素に特異的でない欠点を持っ
ている。また、後者は、感度が十分でないため、血清等
の貴重な試料が多量必要となる。また、それがために、
測定時に、共存物質の影響を受けやすい欠点を有してい
た。
は発色剤として、０−ジアニンジンを用いる方法または
４−アミノアンチピリンとフェノールを用いる方法等が
知られている（検査と技術Ｖｏ１．９、應１１、Ｐ−８
６７〜８７１（１９８１））。しかしながら、前者は還
元性物質１例えば、アルデヒド類と反応する性質がちる
ため、その反応が過酸化水素に特異的でない欠点を持っ
ている。また、後者は、感度が十分でないため、血清等
の貴重な試料が多量必要となる。また、それがために、
測定時に、共存物質の影響を受けやすい欠点を有してい
た。
一方、過酸化酵素の活性測定方法としては、過酸化物質
を基質とし、０−ジアニシジンあるいはピロガロールお
よびフェニレンジアミン誘導体を発色剤として用いる方
法が知られている。しかしながら、０−ジアニシジンを
もちいる方法は前述のごとく１反応が非特異的である。
を基質とし、０−ジアニシジンあるいはピロガロールお
よびフェニレンジアミン誘導体を発色剤として用いる方
法が知られている。しかしながら、０−ジアニシジンを
もちいる方法は前述のごとく１反応が非特異的である。
また、ピロガロールを使用する測定方法は酵素反応後の
呈色生成物質の生成のしゃすいエチμ・エーテルを使用
し、抽出操作をくりかえすために、精度が要求される等
の不便さを有する。また、それがために、実用性にとぼ
しい。フェニレンジアミン誘導体。
呈色生成物質の生成のしゃすいエチμ・エーテルを使用
し、抽出操作をくりかえすために、精度が要求される等
の不便さを有する。また、それがために、実用性にとぼ
しい。フェニレンジアミン誘導体。
例えば、０−フェニレンジアミンを使用する測定法は一
般に良く使用され、感度の点では申し分がない。しかし
、０−フェニレンジアミンは光酸化を受けやすく、不安
定で非特異的反応による発色がみられるために取扱いに
は細心の注意が必要である。それゆえに、光酸化等の非
特異的反応をおさえる危めに、暗所で取扱ったりする必
要がある等の不便さを有している。
般に良く使用され、感度の点では申し分がない。しかし
、０−フェニレンジアミンは光酸化を受けやすく、不安
定で非特異的反応による発色がみられるために取扱いに
は細心の注意が必要である。それゆえに、光酸化等の非
特異的反応をおさえる危めに、暗所で取扱ったりする必
要がある等の不便さを有している。
従来から発色剤の安定化法としては、遮光する方法、Ｅ
ＤＴＡを添加する方法等が用いられるけれども、必ずし
も、効果的で有利な方法とは言えない。さらに、酸化発
色系に還元性物質を添加すると発色反応を妨害すること
は公知の事実である（検査ト技術Ｖｏ１．９．Ａｌｌ、
Ｐ−８６７〜８７１（８１））。
ＤＴＡを添加する方法等が用いられるけれども、必ずし
も、効果的で有利な方法とは言えない。さらに、酸化発
色系に還元性物質を添加すると発色反応を妨害すること
は公知の事実である（検査ト技術Ｖｏ１．９．Ａｌｌ、
Ｐ−８６７〜８７１（８１））。
本発明者らは水溶液中での酸化反応の検討を進めていく
過程で、酸化反応の特殊性（例えば酸素ラジカルの反応
性、酸素イオンの反応性、さらには、溶存した分子状酸
素の反応性等）を鋭意検討することにより、０−フェニ
レンジアミンの酸化発色系において、蓚酸化合物、硫酸
ヒドロキシルアミン等の有機系還元剤が過酸化酵素１例
えば。
過程で、酸化反応の特殊性（例えば酸素ラジカルの反応
性、酸素イオンの反応性、さらには、溶存した分子状酸
素の反応性等）を鋭意検討することにより、０−フェニ
レンジアミンの酸化発色系において、蓚酸化合物、硫酸
ヒドロキシルアミン等の有機系還元剤が過酸化酵素１例
えば。
ペルオキシダーゼによる酸化反応を阻害しないばかりか
、安定な呈色を達成できることがわかり本発明を完成し
た。
、安定な呈色を達成できることがわかり本発明を完成し
た。
スナわち１本発明はフェニレンジアミンまたはその誘導
体、有機還元剤および水溶性高分子化合物を含むことを
特徴とする安定な発色剤組成物である。
体、有機還元剤および水溶性高分子化合物を含むことを
特徴とする安定な発色剤組成物である。
有機系還元剤のうち、蓚酸化合物としては蓚酸およびそ
のナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩
、マグネシウム、力ｐシウム等のアルカリ土類金ＦＡ塩
、さらにはそれらのアンモニウム塩等を挙げることがで
きる。
のナトリウム、カリウム、リチウム等のアルカリ金属塩
、マグネシウム、力ｐシウム等のアルカリ土類金ＦＡ塩
、さらにはそれらのアンモニウム塩等を挙げることがで
きる。
また１本発明に使用されるフェニレンジアミンまたはそ
の誘導体とは１例えば、０−フェニレンジアミン、ｍ−
フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミンおよびそ
れらの硫酸塩、塩酸塩または蓚酸塩、さらに、４−アミ
ノ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−
ジエチルアニリン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジプロピルア
ニリン、４−アル ミツト１イジン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−
）ルイジン、４−アミノーＮ−エチル−Ｎ−β−ヒドロ
キシエチ／ｌ／ −ｍ −）ルイジン等を挙げることか
できる。
の誘導体とは１例えば、０−フェニレンジアミン、ｍ−
フェニレンジアミン、ｐ−フェニレンジアミンおよびそ
れらの硫酸塩、塩酸塩または蓚酸塩、さらに、４−アミ
ノ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−
ジエチルアニリン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジプロピルア
ニリン、４−アル ミツト１イジン、４−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−
）ルイジン、４−アミノーＮ−エチル−Ｎ−β−ヒドロ
キシエチ／ｌ／ −ｍ −）ルイジン等を挙げることか
できる。
過酸化酵素としては例えば、ペルオキシダーゼ。
フクトベルオキシダーゼ、チトクロームペルオキシダー
ゼ等がある。
ゼ等がある。
さらに、水溶性高分子物質としてはポリエチレングリコ
−Ａ／Ｃ以下ＰＥＧと略す）、シよ糖、ポリビニルアル
コール等を使用しうる。
−Ａ／Ｃ以下ＰＥＧと略す）、シよ糖、ポリビニルアル
コール等を使用しうる。
本発明の発色剤組成物において、有機還元剤は通常０．
１ｍＭ 〜５Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜ＩＭでアリ、フェ
ニレンジアミンまたはその誘導体は１ｍＭ〜１００ｍＭ
である。さらに、水溶性高分子物質は、水溶液に対して
０．００１〜１０重量％、好ましくは１〜２重量−含壕
れる。また、ｐＨは４〜９の範囲であることが好ましい
。
１ｍＭ 〜５Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜ＩＭでアリ、フェ
ニレンジアミンまたはその誘導体は１ｍＭ〜１００ｍＭ
である。さらに、水溶性高分子物質は、水溶液に対して
０．００１〜１０重量％、好ましくは１〜２重量−含壕
れる。また、ｐＨは４〜９の範囲であることが好ましい
。
本発明の発色剤組成物には、過酸化物質または過酸化酵
素、水または緩衝液が含まれていてもよい。さらに必要
により他の安定剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
素、水または緩衝液が含まれていてもよい。さらに必要
により他の安定剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
本発明の発色剤組成物および過酸化酵素を使用した測定
例としては１例えば１次のようなものがあげられる。過
酸化水素またはペルオキシダーゼの活性を測定するに際
しては有機還元剤を通常、０．１ｍＭ 〜５Ｍ、好まし
くはＩＦ７２Ｍ 〜ＩＭとフェニレンジアミン誘導体を
１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらには、水溶性高分子物質、例
えばＰＥＧφ４０００を１〜２重量％含む緩衝液および
ベルオキシダー− ゼを任意の順序にまたは、同時に、試料Ｓ−添加する。
例としては１例えば１次のようなものがあげられる。過
酸化水素またはペルオキシダーゼの活性を測定するに際
しては有機還元剤を通常、０．１ｍＭ 〜５Ｍ、好まし
くはＩＦ７２Ｍ 〜ＩＭとフェニレンジアミン誘導体を
１ｍＭ〜１００ｍＭ、さらには、水溶性高分子物質、例
えばＰＥＧφ４０００を１〜２重量％含む緩衝液および
ベルオキシダー− ゼを任意の順序にまたは、同時に、試料Ｓ−添加する。
ｐＨは４〜９の範囲の任意のｐＨである。２〜６０℃、
好ましくは２〜４０℃の反応温度で暗所また紘明所で酵
素反応を行なわせると、生成した過酸化水素量あるいは
存在しているペルオキシダーゼ量に応じて呈色物質が生
成する。生成した呈色物質の吸収極大値の波長における
吸光度を測定する。一方、濃度既知の過酸化水素または
ペルオキシダーゼの活性値を同様に反応させて検量線を
作成し、この検量線と対比して試料中の過酸化水素また
はペルオキシダーゼ活性を測定する。
好ましくは２〜４０℃の反応温度で暗所また紘明所で酵
素反応を行なわせると、生成した過酸化水素量あるいは
存在しているペルオキシダーゼ量に応じて呈色物質が生
成する。生成した呈色物質の吸収極大値の波長における
吸光度を測定する。一方、濃度既知の過酸化水素または
ペルオキシダーゼの活性値を同様に反応させて検量線を
作成し、この検量線と対比して試料中の過酸化水素また
はペルオキシダーゼ活性を測定する。
酵素標識抗原または酵素標識抗原を用いる方法において
は、濃度既知の抗原′Ｗｋまたは抗体量を用いて作成し
た検量線と対比して試料中の抗原または抗体を算出する
ことができる。
は、濃度既知の抗原′Ｗｋまたは抗体量を用いて作成し
た検量線と対比して試料中の抗原または抗体を算出する
ことができる。
本発明では呈色反応は暗所においても、さらには明所に
おいても取扱うことができ、非特異的反応を最小限にお
さえて、ＷＢ度よく測定することができる。
おいても取扱うことができ、非特異的反応を最小限にお
さえて、ＷＢ度よく測定することができる。
本発明の発色剤組成物にはフェニレンジアミンまたはそ
の誘導体、還元剤および水溶性高分子物質のほかに必要
により過酸化酵素が含まれるが。
の誘導体、還元剤および水溶性高分子物質のほかに必要
により過酸化酵素が含まれるが。
さらに、緩衝液、標準液等、通常使用される試薬を含む
ことができる。
ことができる。
本発明の発色剤組成物社有機還元剤を含むことにより、
光に対する安定性が改良され、非特異的反応をおさえる
ことが可能となる。
光に対する安定性が改良され、非特異的反応をおさえる
ことが可能となる。
さらには、水溶性高分子物質を含めることにより１発色
剤組成物の取扱いやすさが容易となる。
剤組成物の取扱いやすさが容易となる。
すなわち、水溶性高分子物質がなくても、発色剤組成物
は凍結乾燥できるが、水溶性高分子物質を添加すること
により、振動に対する形状安定性が大幅に改良される。
は凍結乾燥できるが、水溶性高分子物質を添加すること
により、振動に対する形状安定性が大幅に改良される。
さらに本発明の発色剤組成物を用いて、過酸化酵素およ
び過酸化水素を測定するに当り、有機還元剤および、水
溶性高分子物質は酵素反応を阻害しない特徴を有する。
び過酸化水素を測定するに当り、有機還元剤および、水
溶性高分子物質は酵素反応を阻害しない特徴を有する。
また本発明の発色剤組成物は呈色後の経時変化において
も優れる。
も優れる。
次に１本発明を実施例によりさらに、具体的に説明する
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。
が、本発明はこれらにより限定されるものではない。
０−フェニレンジアミン・２ 垣酸塩を０．０２％の過
酸化水素を含むりん酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５，７）
に、０．３％になるように加え、さらに、ＰＥＧ◆４０
００を１％になるように加え、溶解した。
酸化水素を含むりん酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５，７）
に、０．３％になるように加え、さらに、ＰＥＧ◆４０
００を１％になるように加え、溶解した。
さらに、各種有機還元剤を添加剤として加え、溶解後、
試ＦＡ管（１２緒φＸ７，５ｃｒｎ）に０．５ｔｘｌず
つ分注し、発色液となした。各種条件下に放置後、ＩＮ
−硫酸を２ ｍｌ添加した後、４９２ｎｍでの吸光度を
測定し、非特異的ｒｉ応を評価した。
試ＦＡ管（１２緒φＸ７，５ｃｒｎ）に０．５ｔｘｌず
つ分注し、発色液となした。各種条件下に放置後、ＩＮ
−硫酸を２ ｍｌ添加した後、４９２ｎｍでの吸光度を
測定し、非特異的ｒｉ応を評価した。
その結果を表−１に示す。
表−１より、ＰＥＧφ４０００を添加した系において、
：ｆＩＡ鴇−−′ −無添加に比較して蓚酸化合物、ア
スコルビン酸、ヒドロキシル・アミン・硫酸塩、グルコ
ース等の還元性物質が非特異的反応をおさえることがわ
かった。
：ｆＩＡ鴇−−′ −無添加に比較して蓚酸化合物、ア
スコルビン酸、ヒドロキシル・アミン・硫酸塩、グルコ
ース等の還元性物質が非特異的反応をおさえることがわ
かった。
〇−フェニレンジアミン・２ ｔｅ酸塩ヲ０．０２．
％の過酸化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５
，７）に０．３％になるように加え、さらに、 ＰＥＧ
＄４０００を１％になるように加え、溶解した。さらに
、各種濃度の還元性物ｖＩを加え溶解後、試験管（１２
ｆｆｌｌφＸ７．５ｃｍ）に０．５ｇｔずつ分注し１発
色液を作成した。次に、ペルオキシダーゼ’ｋｏ、１５
ｎｘＵ／ゴになるように０．１％ＢＳＡ水溶液で溶解し
。
％の過酸化水素を含むリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５
，７）に０．３％になるように加え、さらに、 ＰＥＧ
＄４０００を１％になるように加え、溶解した。さらに
、各種濃度の還元性物ｖＩを加え溶解後、試験管（１２
ｆｆｌｌφＸ７．５ｃｍ）に０．５ｇｔずつ分注し１発
色液を作成した。次に、ペルオキシダーゼ’ｋｏ、１５
ｎｘＵ／ゴになるように０．１％ＢＳＡ水溶液で溶解し
。
酵素溶液とした。この酵素溶液を上記にて準備した発色
液に５０μｌを加え、室温にて３０分間。
液に５０μｌを加え、室温にて３０分間。
明所で反応した。反応終了後、ＩＮ・硫酸を２ ｔｓｌ
添加し５反応停止後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、
各種還元性物質共存下における酵素反応の阻害作用を検
創した。
添加し５反応停止後、４９２ｎｍでの吸光度を測定し、
各種還元性物質共存下における酵素反応の阻害作用を検
創した。
その結果を表−２に示す。
表−２各種還元性物質の酵素反応阻害作用の検討秦 測
定値は４９２ｎｍでの吸光度を示す。
定値は４９２ｎｍでの吸光度を示す。
※ −は溶解不能のため、測定しなかった。
表−２より明らかなように、蓚酸化合物は酵素反応系に
添加していても、全く酵素反応を阻害しないことがわか
った。アスコルビン酸等は濃度に大きく依存するけれど
も、低濃度の添加域では若干の発色がみられるものの、
酵素反応を著しく阻害した。
添加していても、全く酵素反応を阻害しないことがわか
った。アスコルビン酸等は濃度に大きく依存するけれど
も、低濃度の添加域では若干の発色がみられるものの、
酵素反応を著しく阻害した。
実施例３１発色剤組成物の凍結乾燥
表−３に示すような発色剤組成物を凍結乾燥した。なお
、凍結乾燥は３０ｍ１のかっ色バイヤルビンを使用し、
６ ｍｅづつ分注後、すみやかに１常法により凍結乾燥
した。なお、凍結乾燥終了後窒素置換した。表−３中の
色調は目視観察し、形状安定性はバイヤルビンを回転さ
せ、粉末のでやすさで。
、凍結乾燥は３０ｍ１のかっ色バイヤルビンを使用し、
６ ｍｅづつ分注後、すみやかに１常法により凍結乾燥
した。なお、凍結乾燥終了後窒素置換した。表−３中の
色調は目視観察し、形状安定性はバイヤルビンを回転さ
せ、粉末のでやすさで。
そのこわれやすさを表示した。なお、凍結乾燥前の溶液
調製時、蒸溜水または、０．０１Ｍ−クエン酸−りん酸
Ｒ衝液（ｐＨ：５．０＞を使用した。
調製時、蒸溜水または、０．０１Ｍ−クエン酸−りん酸
Ｒ衝液（ｐＨ：５．０＞を使用した。
表−３発色剤組成物の凍結乾燥結果
注−１形態安定性はローラー上で、バイヤルビンを横に
して、微振動を与えながら回転させ、最初に粉末が分離
してくるまでの回転数をめ、形状のこわれやすさを表示
した。
して、微振動を与えながら回転させ、最初に粉末が分離
してくるまでの回転数をめ、形状のこわれやすさを表示
した。
測定例１． 凍結乾燥品の保存安定性試験実施例３．で
作成した凍結乾燥品の４℃での保存安定性試験を実施し
た。すなわち、４℃に所定時間保存後、バイヤルビン当
り、０．０２ ％の過酸化水素を含むクエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ： ５．７）２０ｙｔｌを加え、完全溶解
（但し、煮５は４０ｙｔｌを加え溶解）した翫。溶解後
、試験管（１２ｆｉφＸ７，５６ｎ）に０．５ｍ／づつ
分注し、発色液となし、室温、明所の条件下に１時間放
置後、１規定の硫酸を２ｍｌ添加した後、４９２ｎｍで
の吸光度を測定し、ブランク発色の程度から保存安定性
を評価した。なお；対照として、実験Ａ３と同一組成と
なるように、０−フェニレン・ジアミン・２ ｔｋＡ
ｅ 塩３ Ｗ ／ ｍｅ 。
作成した凍結乾燥品の４℃での保存安定性試験を実施し
た。すなわち、４℃に所定時間保存後、バイヤルビン当
り、０．０２ ％の過酸化水素を含むクエン酸−リン酸
緩衝液（ｐＨ： ５．７）２０ｙｔｌを加え、完全溶解
（但し、煮５は４０ｙｔｌを加え溶解）した翫。溶解後
、試験管（１２ｆｉφＸ７，５６ｎ）に０．５ｍ／づつ
分注し、発色液となし、室温、明所の条件下に１時間放
置後、１規定の硫酸を２ｍｌ添加した後、４９２ｎｍで
の吸光度を測定し、ブランク発色の程度から保存安定性
を評価した。なお；対照として、実験Ａ３と同一組成と
なるように、０−フェニレン・ジアミン・２ ｔｋＡ
ｅ 塩３ Ｗ ／ ｍｅ 。
蓚酸７ンモ＝つＡ３．５ｍＭ％ＰＥＧす４００００．５
ｍｙ／ ｍｅの濃度に、それぞれ秤量し、クエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ：５．７）に溶解した。その結果は無
添加系に比較して、有機還元剤添加系はブランク発色が
小さく、また、長期保存後においても、ブランク発色は
ほとんど上昇しなかった。
ｍｙ／ ｍｅの濃度に、それぞれ秤量し、クエン酸−リ
ン酸緩衝液（ｐＨ：５．７）に溶解した。その結果は無
添加系に比較して、有機還元剤添加系はブランク発色が
小さく、また、長期保存後においても、ブランク発色は
ほとんど上昇しなかった。
表−４凍結乾燥発色剤組成物の保存安定性試験性−１測
定値は４９２ｎｍでの吸光度を示す。
定値は４９２ｎｍでの吸光度を示す。
測定例２ インスリン分析試験
実施例１，２の結果を利用して、サンドイツチ法ＥＩＡ
によりインスリンを分析した。
によりインスリンを分析した。
■ インスリン測定用不溶化試薬の？１！造抗ブタイン
スリン抗血清（モルモット）より４５％飽和硫安にて分
画後、ＤＥＡＥ−セファロースカラムにて精製し、抗体
画分を得た。この抗体画分を０．０１ Ｍリン酸Ｍ衝液
（ｐＨ＝７．２；０．１５Ｍ ＮａＣ１含有）を用い、
濃度が１ ｔｓｌ当り１ ｍｙとなるように希釈【７た
溶液５０薄ｔに、十分洗浄した粗面化ポリスチレンボー
／ｌ／４００個を浸漬し、室温で８時間静置した。その
後、ポリスチレンポールを浸漬液より分離し、牛血清ア
ルブミンを１％含有する０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
： ７．２ ； ０．１５ＭＮａＣ１含有）を用いて３
回洗浄した後、同一緩衝液中に保存した。
スリン抗血清（モルモット）より４５％飽和硫安にて分
画後、ＤＥＡＥ−セファロースカラムにて精製し、抗体
画分を得た。この抗体画分を０．０１ Ｍリン酸Ｍ衝液
（ｐＨ＝７．２；０．１５Ｍ ＮａＣ１含有）を用い、
濃度が１ ｔｓｌ当り１ ｍｙとなるように希釈【７た
溶液５０薄ｔに、十分洗浄した粗面化ポリスチレンボー
／ｌ／４００個を浸漬し、室温で８時間静置した。その
後、ポリスチレンポールを浸漬液より分離し、牛血清ア
ルブミンを１％含有する０、０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
： ７．２ ； ０．１５ＭＮａＣ１含有）を用いて３
回洗浄した後、同一緩衝液中に保存した。
■ ペルオキシダーゼ標識抗体の調製
酵素として１０りのペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由来
）を使用し、過よう木酸架橋法によって５ ｒｑの抗ブ
タインスリン抗体にペルオキシダーゼを結合させ、セフ
ァデックスＧ−２００によるゲｌｖ濾過によって精製後
、コロジオンバッグで濃縮し、ペルオキシダーゼ標識抗
体とした。抗体へのペルオキシダーゼの結合方法はＰ、
ナカネ等：ザ・ジャーナル・オプ・ヒストケミストリー
・アンド・サイトケミストリー、第２２巻、第１２号。
）を使用し、過よう木酸架橋法によって５ ｒｑの抗ブ
タインスリン抗体にペルオキシダーゼを結合させ、セフ
ァデックスＧ−２００によるゲｌｖ濾過によって精製後
、コロジオンバッグで濃縮し、ペルオキシダーゼ標識抗
体とした。抗体へのペルオキシダーゼの結合方法はＰ、
ナカネ等：ザ・ジャーナル・オプ・ヒストケミストリー
・アンド・サイトケミストリー、第２２巻、第１２号。
Ｐ−１０８４〜１０９１（１９７４年）Ｋ記載されてい
る。
る。
得られたペルオキシダーゼ標識抗体は使用直前に１チ牛
血清アルグミンを含有する０、０１ Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ： ７，２ ； ０．１５Ｍ ＮａＣ１含存）で２
０００倍附近まで希釈し使用した。
血清アルグミンを含有する０、０１ Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ： ７，２ ； ０．１５Ｍ ＮａＣ１含存）で２
０００倍附近まで希釈し使用した。
■ インスリンの測定方法
試験管（１２閣φＸ ７．５ ｃｍ ）に緩衝液−１（
０，５チ牛血清アルブミン含有０．０１ Ｍ リン酸緩
衝液〈ｐＨ： ７．２ ｉ ０．１５Ｍ ＮａＣ１含存
＞ ） ０．４ ｔｓｌおよびＷＨＯのナンバー６６／
３０４を基準にして作成した標準インスリン溶液（５〜
３２０μＵ ／ ｍｌ ）０．１ｇ／を添加し、よく混
合してから測定例−２の■の項で作成した不溶化試薬１
個を入れ、３７℃で１時間、加温した。加温終了後、試
験管内の反応液を吸引除去し、緩衝液−■の１ ｍｌを
加えて洗浄した。この操作を３回繰りかえした後、測定
例−２の■の項で得たペルオキシダーゼ標識抗体２５０
μノを加え、３７℃で２時間、加温した。
０，５チ牛血清アルブミン含有０．０１ Ｍ リン酸緩
衝液〈ｐＨ： ７．２ ｉ ０．１５Ｍ ＮａＣ１含存
＞ ） ０．４ ｔｓｌおよびＷＨＯのナンバー６６／
３０４を基準にして作成した標準インスリン溶液（５〜
３２０μＵ ／ ｍｌ ）０．１ｇ／を添加し、よく混
合してから測定例−２の■の項で作成した不溶化試薬１
個を入れ、３７℃で１時間、加温した。加温終了後、試
験管内の反応液を吸引除去し、緩衝液−■の１ ｍｌを
加えて洗浄した。この操作を３回繰りかえした後、測定
例−２の■の項で得たペルオキシダーゼ標識抗体２５０
μノを加え、３７℃で２時間、加温した。
加温終了後、前記と同様に反応液を吸引除去し。
３回洗浄後、実施例３で作成した凍結乾燥発色剤組成物
から、測定例−１で示した方法に従って作成した発色液
にボールのみを移し、各種条件下で酵素反応を実施した
。酵素図芯終了後、１Ｎ硫酸２ ｍｌを添加して反応を
停止後、赤かつ色の色素を４９２ ｎｍで測定した。
から、測定例−１で示した方法に従って作成した発色液
にボールのみを移し、各種条件下で酵素反応を実施した
。酵素図芯終了後、１Ｎ硫酸２ ｍｌを添加して反応を
停止後、赤かつ色の色素を４９２ ｎｍで測定した。
■ 酵素反し条件を変えた時の検量線の変化の検討
■の測定方法に従って、インスリン標準品を測定し、検
量線を作成した。なお、発色液は実施例３で作成した凍
結乾燥品を使用した。また、凍結乾燥品には７０ｍＭの
蓚酸アンモニウムを添加して凍結乾燥したものと、無添
加で凍結乾燥した発色剤の場合について酵素図形を行な
った。また。
量線を作成した。なお、発色液は実施例３で作成した凍
結乾燥品を使用した。また、凍結乾燥品には７０ｍＭの
蓚酸アンモニウムを添加して凍結乾燥したものと、無添
加で凍結乾燥した発色剤の場合について酵素図形を行な
った。また。
酵素反応社室温“、明所、１時間および４℃、１夜放置
で行ない、前者の結果は第１図に、後者の結果は第２図
に示している。これらの図より明らかなように、インス
リン低濃度側において、感度が大幅に改良されると共に
、非特異的反応がおさえられていることがわかる。
で行ない、前者の結果は第１図に、後者の結果は第２図
に示している。これらの図より明らかなように、インス
リン低濃度側において、感度が大幅に改良されると共に
、非特異的反応がおさえられていることがわかる。
■ 呈色後の経時変化についての検討
■の測定方法に従って、インスリン標準品を測定した。
なお、呈色安定性は各種還元性物質の添加の有無によっ
て、呈色安定性はどのように変化するか検討し、その結
果を表−５に示した。また。
て、呈色安定性はどのように変化するか検討し、その結
果を表−５に示した。また。
反応停止直後の吸光度（４９２ｎｍ ）を１００とした
時の経時変化によって示している。
時の経時変化によって示している。
表−５呈色後の経時変化の検討
表−５より明らかなように、還元性物質、特に蓚酸化合
物を酵素反応系に添加していても、呈色安定性はそこな
われないことがわかった。
物を酵素反応系に添加していても、呈色安定性はそこな
われないことがわかった。
０．３ ％ ｏ−フェニレンジアミン・２塩酸塩１％。
ＰＥＧφ４０００および３０ｍＭの蓚酸ナトリウムを含
むリン酸緩衝液（ｐｉ（５，０）’５００μ！に。
むリン酸緩衝液（ｐｉ（５，０）’５００μ！に。
２０Ｕ／耐のペルオキシダーゼ水溶液を５０μｌ加え、
さらに過酸化水素溶液（濃度：ｏｔ １ｏｔ２０ｍｆ／
１ｔｔｔ ） ２５ ｐｉを加え、３７℃、３０分間酵
素反応終了後、ＩＮ硫酸２ ｍｌで反応停止後、４９２
ｎｍでの吸光度を測定し、検量線を作成した。
さらに過酸化水素溶液（濃度：ｏｔ １ｏｔ２０ｍｆ／
１ｔｔｔ ） ２５ ｐｉを加え、３７℃、３０分間酵
素反応終了後、ＩＮ硫酸２ ｍｌで反応停止後、４９２
ｎｍでの吸光度を測定し、検量線を作成した。
なお、蓚酸ナトリウムを含まない上記緩衝液を対照とし
て測定した。その結果は第３図に示している。この図よ
り明らかなように、非特異的反応がおさえられ、感度に
おいても改良されていることがわかる。
て測定した。その結果は第３図に示している。この図よ
り明らかなように、非特異的反応がおさえられ、感度に
おいても改良されていることがわかる。
第１図は、凍結乾燥発色剤（０−フェニレンジアミン・
２塩酸塩： １０！ＩＩｆ／ｘｔ、 ｇ酸アンモニｔム
： ７０ｍＭ、ＰＥＧす４０００ ： １０ ｑ／１ｔ
ｒｌよりなる凍結乾燥品）に０．０２ ％過酸化水素を
含むクエン酸−りん酸緩衝液（ｐＨ：５．７）２０ｇ／
で溶解後発免液となし、室温、明所、１時間の酵素反応
をすることによって、得られたインスリンの検量線であ
る。対照として、蓚酸アンモニウムを含まない凍結乾燥
発色剤から調製した発色液で得られたインスリンの検Ｊ
ｉｍを示す。第２図は第１ｆｆｌと発色液を同一にして
、酵素反応条件を４℃、１夜行なったものである。さら
に、第３図は発色剤として、３０ｍＭの蓚酸ナトリウム
および１％ＰＥＧ◆４ｏｏｏｅ−ｍ有する０−フェニレ
ンジアミン・２塩酸塩を使用し、酵素としてペルオキシ
ダーゼを用いた過酸化水素定量用の検量線である。なお
１発色剤に蓚酸ナトリウムを含まないものを対照として
測定した。 第１〜３図において、■印は７０ｍＭの蓚酸アンモニウ
ムを添加して凍結乾燥した発色剤を使用した場合、・印
は、無添加系で凍結乾燥した発色剤を使用した場合を示
す。
２塩酸塩： １０！ＩＩｆ／ｘｔ、 ｇ酸アンモニｔム
： ７０ｍＭ、ＰＥＧす４０００ ： １０ ｑ／１ｔ
ｒｌよりなる凍結乾燥品）に０．０２ ％過酸化水素を
含むクエン酸−りん酸緩衝液（ｐＨ：５．７）２０ｇ／
で溶解後発免液となし、室温、明所、１時間の酵素反応
をすることによって、得られたインスリンの検量線であ
る。対照として、蓚酸アンモニウムを含まない凍結乾燥
発色剤から調製した発色液で得られたインスリンの検Ｊ
ｉｍを示す。第２図は第１ｆｆｌと発色液を同一にして
、酵素反応条件を４℃、１夜行なったものである。さら
に、第３図は発色剤として、３０ｍＭの蓚酸ナトリウム
および１％ＰＥＧ◆４ｏｏｏｅ−ｍ有する０−フェニレ
ンジアミン・２塩酸塩を使用し、酵素としてペルオキシ
ダーゼを用いた過酸化水素定量用の検量線である。なお
１発色剤に蓚酸ナトリウムを含まないものを対照として
測定した。 第１〜３図において、■印は７０ｍＭの蓚酸アンモニウ
ムを添加して凍結乾燥した発色剤を使用した場合、・印
は、無添加系で凍結乾燥した発色剤を使用した場合を示
す。
Claims (1)
- （１） フェニレンジアミンまたはその誘導体、有機還
元剤および水溶性高分子化合物を含むことを特徴とする
安定な発色剤組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3482784A JPS60178354A (ja) | 1984-02-25 | 1984-02-25 | 安定な発色剤組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3482784A JPS60178354A (ja) | 1984-02-25 | 1984-02-25 | 安定な発色剤組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60178354A true JPS60178354A (ja) | 1985-09-12 |
| JPH0462026B2 JPH0462026B2 (ja) | 1992-10-02 |
Family
ID=12425027
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3482784A Granted JPS60178354A (ja) | 1984-02-25 | 1984-02-25 | 安定な発色剤組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60178354A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016528503A (ja) * | 2013-08-16 | 2016-09-15 | ハッチ カンパニ− | 塩素分析検査素子および安定化されたＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン溶液 |
-
1984
- 1984-02-25 JP JP3482784A patent/JPS60178354A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016528503A (ja) * | 2013-08-16 | 2016-09-15 | ハッチ カンパニ− | 塩素分析検査素子および安定化されたＮ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミン溶液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0462026B2 (ja) | 1992-10-02 |
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