JPH08320314A - アスコルビン酸の影響を受けない、過酸化水素の検出方法 - Google Patents
アスコルビン酸の影響を受けない、過酸化水素の検出方法Info
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Abstract
体液中の過酸化水素を検出する方法の提供。 【解決手段】 酸化還元指示薬と、鉄と配位結合したク
レアチニンやグアニジンである遷移金属錯体とを用いる
工程を含む、過酸化水素を検出する方法。
Description
と配位結合したクレアチニン、または鉄と配位結合した
グアニジンのいずれかである遷移金属錯体に生体液もし
くは水溶液を接触させることによって、生体液または水
溶液中の過酸化水素の濃度を比色分析的に測定する新規
な方法に関するものである。
過酸化水素の検出は、様々な異常の診断に役立つ。過酸
化水素は、分析対象物と酵素との数多くの反応の副生物
として生成される。生体液中の過酸化水素の検出のため
の試験は、電子を指示薬に伝達して偽陰性の結果を生じ
得る強力な還元剤である、アスコルビン酸塩の存在によ
って複雑化される。指示薬の試薬組成物中に、ある種の
金属イオン錯体、例えばFe−HEDTAを含ませるこ
とは、アスコルビン酸塩の干渉を本質的に排除するが、
これらの金属イオン錯体は、それ自体、過酸化物と酸化
可能な染料との呈色反応を触媒することができ、該反応
が、ある状況下では、金属イオン錯体が介在する染料の
追加的な酸化のために、偽陽性の、または誤って高い検
定結果を生じることがある。
体の発見を引用している文献が存在する。
液中の過酸化水素を検出する方法を提供することにあ
る。更に、本発明は、分析対象物を化合物と反応させて
過酸化水素を生成することによって、この分析対象物を
検出する方法を提供する。
水素を含む疑いがある溶液に、遷移金属錯体および酸化
還元指示薬を加える工程、(b)色変化を測定して過酸
化水素の存在または濃度を検知する工程を含む、過酸化
水素を検出する方法に関する。遷移金属錯体は、鉄と配
位結合したクレアチニン、または鉄と配位結合したグア
ニジンである。鉄と配位結合したクレアチニンは、式
(I):
ニン、塩化物イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、
ヨウ化物イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸
イオン、硝酸イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、
アンモニウム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、
チオシアン酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノ
ール、ピリジン、ならびに酢酸イオン、クエン酸イオ
ン、酒石酸イオン、マロン酸、ホウ酸、コハク酸、グリ
セロール−2−リン酸イオン、サリチル酸、シュウ酸お
よびリンゴ酸のような緩衝剤よりなる群から選ばれる)
で示される構造を有する。
I):
クレアチニン錯体についてのものと同じ群から選ばれ、
R1 およびR2 の少なくとも一方は、アルキルおよびア
リール基よりなる群から選ばれ、各々相互に独立したも
のである。R1 およびR2 の基の例は、Cn H2n+1(こ
こで、nは1〜20、好ましくは1〜12の整数であ
る)のようなアルキル基、OC2 H4 (OC2 H4 )
n-2 OCH2 CH3 (nは前記の通りである)、または
C5 H4 Z、C4 H3 ZおよびC11H6 Z(ここで、Z
はO、S、NもしくはCHである)のようなアリール基
である。このアリール基としては、例えばフェニル(Z
=CH)、ピリジル(Z=N)、フリル(Z=O)、チ
エニル(Z=S)、アセナフチル(Z=CH)等が挙げ
られる。)で示される構造を有する。
ル(−OH)、アミン(−NH2 )、カルボニル(−C
=O)、スルホン酸(−SO3 H)、カルボン酸(−C
O2H)、フッ素(−F)、塩素(−Cl)、臭素(−
Br)、ヨウ素(−I)、ホスホン酸〔−P(O)(O
H)2 〕およびリン酸〔−OP(O)(OH)2 〕のよ
うな水溶性を高める1個以上の官能基で置換されていて
もよい。特に好適な鉄クレアチニン錯体は、XおよびY
がともに塩化物イオンであるか、またはXおよびYがと
もに酢酸イオンであるそれらである。特に好適な鉄グア
ニジン錯体は、XおよびYがともに硫酸イオン(−SO
4 )であるか、またはXおよびYがともに酢酸イオンで
あり、そして/あるいはR1 がHであって、R2 がスル
ホン酸置換アルキル基(−CH2 CH2 −SO3 H)で
あるか、R1 がHであって、R2がアミン−およびカル
ボン酸−置換アルキル基〔−(CH2 )3 CH(NH
2 )CO2 H〕(アルギニン)であるか、またはR1 が
Hであって、R2 がカルボン酸置換アリール基〔−C6
H3 (CO2 H)2 〕であるそれらである。
は水溶液であってよい。酸化還元指示薬および遷移金属
錯体は、それらが適用された試験片を用いて溶液に導入
してよい。
ペルオキシダーゼ活性やアスコルビン酸オキシダーゼ活
性は、以前は未知であった。本開示は、アスコルビン酸
イオンのデヒドロアスコルビン酸イオンへの酸化によっ
てアスコルビン酸干渉を除去するための、鉄錯体の用途
を初めて記載するものである。
くの反応によって生成される。それは、例えば下記で示
される。 過酸化水素の存在または濃度の決定は、生体液中の基質
の存在または濃度を決定する一つの方法である。
が生成する生成物の例を列挙しているが、本発明の方法
はここに列記のものに限定して適用されるものではな
い。
キシダーゼと酸化還元指示薬との反応によって実施する
ことが多い: H2 O2 +ペルオキシダーゼ+指示薬 −−−−−> 色彩
キシダーゼという酵素の存在下でグルコースを反応させ
て、過酸化水素を生成することによって測定され得る。
その後、過酸化水素はペルオキシダーゼと反応して指示
薬の酸化を触媒、過酸化水素の濃度に正比例する比色分
析の応答を生じる。しかしながら、生体液中の過酸化水
素を検出する試験は、電子を指示薬に伝達して偽陰性の
結果を生じ得る、強力な還元剤であるアスコルビン酸イ
オンの存在によって複雑化される。本発明の遷移金属錯
体は、過酸化水素と反応して、過酸化水素の存在下での
み指示薬の酸化を触媒するにすぎない。アスコルビン酸
イオンは、本発明の遷移金属錯体を用いて実施される過
酸化水素の検出には全く干渉を生じない。 H2 O2 +遷移金属錯体+指示薬 −−−−−> 色彩
は、還元形態では酸化形態とは異なる色彩を有し、可逆
的に酸化でき、また還元できる物質である。本発明の遷
移金属錯体とともに用い得る酸化還元指示薬の例は、ベ
ンジジン、o−トリジン、アルキル基が1〜6個の炭素
原子を有する3,3’,5,5’−テトラアルキルベン
ジジン(例えば3,3’,5,5’−テトラメチルベン
ジジン(「TMB」))、o−ジアニシジン、2,7−
ジアミノフルオレン、ビス−(N−エチルキノリン−2
−オン)アジン、(N−メチルベンゾチアゾール−2−
オン)−(1−エチル−3−フェニル−5−メチルトリ
アゾール−2−オン)アジン、2,2’−アジノビス
(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)、4
−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウム、またはそれら
の組合せである。
範囲、より好ましくは約4.5〜約8.2の範囲内であ
る。過酸化水素は、過酸化水素の濃度が約0.1〜約1
00mM(mM)、好ましくは約1〜約20mMの範囲内であ
る検査試料中で検出され得る。
化水素の検出法であることを立証するために、下記の実
施例およびデータを列挙する。実施例1および2は、過
酸化水素の検出のための乾燥試薬の例である。実施例3
は、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応によ
り生成する過酸化水素の検出を介してグルコースを検出
する乾燥試薬の例である。実施例4は、様々な遷移金属
錯体のペルオキシダーゼ活性の試験を示す。
に乾燥することによって、乾燥試薬紙を作成した。次い
で、試薬紙を60℃で約7分間乾燥した。用いた紙担体
は、Whatman 3MMであった。浸液1は、鉄クレアチニ
ンおよび緩衝剤を含有し、クレアチニン4.52g(グ
ラム)、塩化第二鉄六水和物2.70gおよびマロン酸
2.0gに水100ml(ミリリットル)を加え、混合物
を一晩攪拌することによって調製した。次いで、1規定
NaOHを用いて溶液をpH4.6に調整した。最終濃度
は、塩化第二鉄100mM、クレアチニン400mMおよび
マロン酸250mMであった。浸液2は、アセトニトリル
中にレドックス指示薬の3,3’,5,5’−テトラメ
チルベンジジン(「TMB」)を80mMの濃度で含有す
るものであった。
た。次いで、様々なレベルの過酸化水素を含有する尿に
試験片を浸漬し、660nm(ナノメートル)での反射率
を、浸漬の1分後にAdvanced Research Rapid Scanner
という計器で測定した。反射率の値を、試薬の反応性を
算出するために測定した。異なる比重、すなわち1.0
05、1.015および1.023g/mlの3様の尿プ
ールを用いて、試薬の反応性を決定した。
する。図1は、過酸化水素の濃度と、鉄クレアチニン試
薬で得られたK/S値との間に観察された線形の用量応
答を示す。K/Sは、反射率から、指示薬による吸光度
に比例する単位への換算であって、等式K/S=(1−
R)2 /2R〔Rは660nmでの反射率(1分後)〕に
従って算出した。
リットル)の過酸化水素(0.88mM)に対する試薬反
応性は、3種類の尿プールのすべてで明確に整合したこ
とを示している。アスコルビン酸イオンの酸化が多少起
きていたが、100mg/dlのアスコルビン酸の存在下
で、3.0mg/dlの過酸化水素に対して本試薬は反応性
であり続けた。
セイヨウワサビのペルオキシダーゼを用いて作成したも
のであり、本発明に係る試薬とは鮮明に対比される。
のアスコルビン酸の存在下で、3.0mg/dlの過酸化水
素に対して、完全に非反応性であった。鉄クレアチニン
試薬の反応性は、pHの低下、および鉄に対するクレアチ
ニンの比率の増大とともに上昇した。尿中リン酸イオン
からの干渉がより少ないことから、4:1の配位子比
(クレアチニン:鉄)を選び、それによって、より整合
的な結果をすべての尿で与えた。4.5という試薬のpH
を選んだが、それは、100mg/dlのグルコースとグル
コースオキシダーゼとの反応から予測される過酸化水素
の大まかな量である、3.0mg/dlの過酸化水素に対し
て適切な反応性を与えるからである。マロン酸は、pHを
制御するための緩衝剤として働き、クエン酸、酒石酸、
ホウ酸、コハク酸、グリセロール−2−リン酸、サリチ
ル酸、シュウ酸およびリンゴ酸のような他の緩衝剤と置
き換えることができる。
した。実施例1のとおりに実施した試験によって、反応
性を決定したが、400mMクレアチニンに代えて、40
0mMグアニジンを浸液1に用いた。尿素の比重は1.0
15g/mlであった。結果を表4に示す。
第二の浸液を実施例1のとおりに調製したが、第一の浸
液には500単位/mlのグルコースオキシダーゼも加え
てから、pHを調整した。
試験片を浸漬し、1分後に得られた660nmでの反射率
を、試薬の反応性を算出するために測定した。
する。100mg/dlのグルコースまでの試薬反応性は、
3種類の尿プールのすべてで明確に整合した(表5)。
アスコルビン酸イオンの酸化が多少起きていたが、10
0mg/dlのアスコルビン酸の存在下で、100mg/dlの
グルコースに対して本試薬は反応性であり続けた。
素検出のための試薬 pH5.8で3.1mMの金属キレート、44mMのマロン
酸、14mMのジイソプロピル=ジヒドロペルオキシドお
よび11.6mMのTMBを含有する3部の水対2部のア
セトニトリルの溶液について、レドックス指示薬である
TMBの酸化率を測定することによって、pH5.8での
ペルオキシダーゼ活性について様々な遷移金属錯体を試
験した。表6に示した結果は、ポリL−アルギニンおよ
びクレアチニンとの鉄(Fe2+およびFe3+)錯体が最
も活性であることを示している。銅は、多少の反応性を
示すものの、はるかに低い程度に(1/10)である。
これらの条件下では、ペルオキシダーゼ活性を示した金
属は、(与えられたリストでは)他には皆無であった。
結果を表6に示した。
は、EDTA:エチレンジアミン四酢酸、HEDTA:
N−(2−ヒドロキシエチル)エチレンジアミン三酢
酸、DTPA:ジエチレントリアミン五酢酸、EGT
A:エチレングリコールビス(2−アミノエチルエーテ
ル)−N,N,N′,N′−四酢酸、およびCDTA:
1,2−ジアミノシクロヘキサン−N,N,N’,N’
−四酢酸である。
を参照すれば明らかになるものと思われる。
Claims (25)
- 【請求項1】 溶液中の過酸化水素を検出する方法であ
って、 (a)酸化還元指示薬、および式(I): 【化1】 (式中、XおよびYは、独立に、クレアチニン、塩化物
イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオ
ン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸
イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、アンモニウ
ム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、チオシアン
酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノール、ピリ
ジン、酢酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸、マロン
酸、ホウ酸、コハク酸、グリセロール−2−リン酸イオ
ン、サリチル酸、シュウ酸およびリンゴ酸よりなる群か
ら選ばれる)で示される構造を有する遷移金属錯体を該
溶液に加える工程;ならびに (b)色変化を測定して、過酸化水素の存在または濃度
を検知する工程を含む方法。 - 【請求項2】 XおよびYが塩化物イオンである、請求
項1記載の方法。 - 【請求項3】 XおよびYが酢酸イオンである、請求項
1記載の方法。 - 【請求項4】 酸化還元指示薬が、ベンジジン、o−ト
リジン、炭素原子数1〜6のアルキル基を有する3,
3’,5,5’−テトラアルキルベンジジン、o−ジア
ニシジン、2,7−ジアミノフルオレン、ビス−(N−
エチルキノリン−2−オン)アジン、(N−メチルベン
ゾチアゾール−2−オン)−(1−エチル−3−フェニ
ル−5−メチルトリアゾール−2−オン)アジン、2,
2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−
スルホン酸)、4−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウ
ム、およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請
求項1記載の方法。 - 【請求項5】 酸化還元指示薬が3,3’,5,5’−
テトラメチルベンジジンである、請求項4記載の方法。 - 【請求項6】 該溶液が生体液または水溶液である、請
求項1記載の方法。 - 【請求項7】 該溶液がアスコルビン酸イオンをも含有
する、請求項1記載の方法。 - 【請求項8】 過酸化水素の濃度が約0.1〜約100
mMの範囲内にある、請求項1記載の方法。 - 【請求項9】 過酸化水素の濃度が約1〜約50mMの範
囲内にある、請求項8記載の方法。 - 【請求項10】 酸化還元指示薬および遷移金属錯体
を、それらが適用された試験片を用いて該溶液に加え
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項11】 溶液中の過酸化水素を検出する方法で
あって、 (a)酸化還元指示薬、および式(II): 【化2】 (式中、XおよびYは、独立に、クレアチニン、塩化物
イオン、フッ化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオ
ン、硫酸イオン、リン酸イオン、過塩素酸イオン、硝酸
イオン、シュウ酸イオン、硫化物イオン、アンモニウ
ム、グルコン酸イオン、シアン化物イオン、チオシアン
酸イオン、カテコール、トロポロン、フェノール、ピリ
ジン、酢酸イオン、クエン酸イオン、酒石酸、マロン
酸、ホウ酸、コハク酸、グリセロール−2−リン酸イオ
ン、サリチル酸、シュウ酸およびリンゴ酸よりなる群か
ら選ばれ、R1 およびR2 の少なくとも一方は、独立
に、Cn H2n+1、(OC2 H4 )n H、C5 H4 Z、C
4 H3 ZおよびC11H6 Z(ここで、nは1〜20の整
数であり、ZはO、S、NまたはCHである)よりなる
群から選ばれる)で示される構造を有する遷移金属錯体
を該溶液に加える工程;ならびに (b)色変化を測定して、過酸化水素の存在または濃度
を検知する工程を含む方法。 - 【請求項12】 XおよびYが硫酸イオンである、請求
項11記載の方法。 - 【請求項13】 XおよびYが酢酸イオンである、請求
項11記載の方法。 - 【請求項14】 nが1〜12の整数である、請求項1
1記載の方法。 - 【請求項15】 R1 およびR2 の少なくとも一方が、
ヒドロキシル、アミノ、カルボニル、スルホ、カルボキ
シル、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ホスホン酸
基およびリン酸基よりなる群から選ばれる少なくとも1
個の官能基で置換されている、請求項11記載の方法。 - 【請求項16】 R1 がHであり、R2 がCH2 CH2
−SO3 Hである、請求項15記載の方法。 - 【請求項17】 R1 がHであり、R2 がC6 H3 (C
O2 H)2 である、請求項15記載の方法。 - 【請求項18】 R1 がHであり、R2 が(CH2 )3
CH(NH2 )CO2 Hである、請求項15記載の方
法。 - 【請求項19】 酸化還元指示薬が、ベンジジン、o−
トリジン、炭素原子数1〜6のアルキル基を有する3,
3’,5,5’−テトラアルキルベンジジン、o−ジア
ニシジン、2,7−ジアミノフルオレン、ビス−(N−
エチルキノリン−2−オン)アジン、(N−メチルベン
ゾチアゾール−2−オン)−(1−エチル−3−フェニ
ル−5−メチルトリアゾール−2−オン)アジン、2,
2’−アジノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−
スルホン酸)、4−アミノアンチピリン、ヨウ化カリウ
ム、およびそれらの組合せよりなる群から選ばれる、請
求項11記載の方法。 - 【請求項20】 酸化還元指示薬が3,3’,5,5’
−テトラメチルベンジジンである、請求項19記載の方
法。 - 【請求項21】 該溶液が生体液または水溶液である、
請求項11記載の方法。 - 【請求項22】 該溶液がアスコルビン酸イオンをも含
有する、請求項11記載の方法。 - 【請求項23】 過酸化水素の濃度が約0.1〜約10
0mMの範囲内にある、請求項11記載の方法。 - 【請求項24】 過酸化水素の濃度が約1〜約50mMの
範囲内にある、請求項23記載の方法。 - 【請求項25】 酸化還元指示薬および遷移金属錯体
を、それらが適用された試験片を用いて溶液に加える、
請求項11記載の方法。
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