JP2666632B2 - ビリルビン測定方法 - Google Patents
ビリルビン測定方法Info
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Description
【０００１】
【発明の利用分野】本発明は、例えば血漿、血清、尿等
の生体体液中に含まれるビリルビンの測定方法に関す
る。
の生体体液中に含まれるビリルビンの測定方法に関す
る。
【０００２】
【発明の背景】ビリルビンは、老化赤血球の破壊により
遊離するヘモグロビンに由来する化合物であり、生体血
中には、直接にジアゾ化合物と反応して呈色する直接ビ
リルビン（主にグルクロナイド抱合型）とアルコール等
の促進剤の存在によって初めてジアゾ化合物と反応する
間接ビリルビン（遊離型）がある。血中の総ビリルビン
濃度及び上記２つの型のビリルビン濃度を夫々分別測定
することにより各種肝疾患の診断、黄疸の鑑別を行うこ
とができるため、ビリルビンの測定は臨床検査に於ける
重要な検査の１つとなっている。
遊離するヘモグロビンに由来する化合物であり、生体血
中には、直接にジアゾ化合物と反応して呈色する直接ビ
リルビン（主にグルクロナイド抱合型）とアルコール等
の促進剤の存在によって初めてジアゾ化合物と反応する
間接ビリルビン（遊離型）がある。血中の総ビリルビン
濃度及び上記２つの型のビリルビン濃度を夫々分別測定
することにより各種肝疾患の診断、黄疸の鑑別を行うこ
とができるため、ビリルビンの測定は臨床検査に於ける
重要な検査の１つとなっている。
【０００３】ビリルビンの測定方法としては、ビリルビ
ンがジアゾ化合物と反応して生ずるアゾビリルビンの赤
紫色の呈色を測定する、所謂ジアゾ法が現在の主流であ
り、各種肝疾患の診断や黄疸の鑑別は、主としてこの方
法により測定された各種ビリルビン濃度を基準として行
われている。しかしながら、この方法は、その測定試液
が調製後５日程度しか利用できないことや、試料中に共
存するL-アスコルビン酸やヘモグロビンにより測定値が
影響を受けること等の問題点を有している。
ンがジアゾ化合物と反応して生ずるアゾビリルビンの赤
紫色の呈色を測定する、所謂ジアゾ法が現在の主流であ
り、各種肝疾患の診断や黄疸の鑑別は、主としてこの方
法により測定された各種ビリルビン濃度を基準として行
われている。しかしながら、この方法は、その測定試液
が調製後５日程度しか利用できないことや、試料中に共
存するL-アスコルビン酸やヘモグロビンにより測定値が
影響を受けること等の問題点を有している。
【０００４】また、その他のビリルビン測定法として
は、酸化剤としてビリルビンオキシダーゼ（BOD）を利
用するBOD法、高速液体クロマトグラフィを利用する高
速液体クロマトグラフィ法、媒染剤をコーティングした
フィルムを用いてビリルビンのα、β、γ及びδ型を測
定するフィルム法、フェリシアン化イオンや銅イオンを
酸化剤として用いる化学的酸化法（フェリシアン化カリ
を用いる総ビリルビン及び直接ビリルビン測定方法、銅
イオンとチオ尿素を用いる直接ビリルビン測定法等）等
が挙げられるが、何れの方法も何らかの問題点を有して
おり、そのままではジアゾ法より好ましい方法であると
は言い難い。
は、酸化剤としてビリルビンオキシダーゼ（BOD）を利
用するBOD法、高速液体クロマトグラフィを利用する高
速液体クロマトグラフィ法、媒染剤をコーティングした
フィルムを用いてビリルビンのα、β、γ及びδ型を測
定するフィルム法、フェリシアン化イオンや銅イオンを
酸化剤として用いる化学的酸化法（フェリシアン化カリ
を用いる総ビリルビン及び直接ビリルビン測定方法、銅
イオンとチオ尿素を用いる直接ビリルビン測定法等）等
が挙げられるが、何れの方法も何らかの問題点を有して
おり、そのままではジアゾ法より好ましい方法であると
は言い難い。
【０００５】即ち、BOD法は、総ビリルビンの測定に用
いる場合には特に問題はないが、直接ビリルビンの測定
を行う場合にはBODの至適pＨ範囲外のpＨで測定を行わ
なくてはならないため必然的に多量の酵素が必要となり
測定に要する費用が高くなるという問題点を有してお
り、高速液体クロマトグラフィ法やフィルム法は、測定
精度については高い評価を得ているものの、専用の装置
が必要であり、多数検体についての多項目同時測定を行
う目的では利用できない等の問題点を有している。ま
た、化学的酸化法は、総ビリルビン及び直接ビリルビン
の測定を同一pＨで行うことができないためpＨの変化に
伴うビリルビンの吸収曲線の変動による影響を受けるの
で、総ビリルビン測定時に得られた標準液の吸光度変化
値を利用して直接ビリルビンの測定を行うと、測定値の
信頼性に問題が生じることや、酸化剤としてシアン化物
を利用した場合には廃液処理が難しい等の問題点を有し
ている。更に、BOD法や化学的酸化法に於いては、直接
ビリルビンの測定値がジアゾ法によるそれと相関性が悪
いので、測定値を、ジアゾ法により得られる測定値に基
づいて確立された各種肝疾患の診断や黄疸の鑑別に利用
し難いと言う問題も生じている。
いる場合には特に問題はないが、直接ビリルビンの測定
を行う場合にはBODの至適pＨ範囲外のpＨで測定を行わ
なくてはならないため必然的に多量の酵素が必要となり
測定に要する費用が高くなるという問題点を有してお
り、高速液体クロマトグラフィ法やフィルム法は、測定
精度については高い評価を得ているものの、専用の装置
が必要であり、多数検体についての多項目同時測定を行
う目的では利用できない等の問題点を有している。ま
た、化学的酸化法は、総ビリルビン及び直接ビリルビン
の測定を同一pＨで行うことができないためpＨの変化に
伴うビリルビンの吸収曲線の変動による影響を受けるの
で、総ビリルビン測定時に得られた標準液の吸光度変化
値を利用して直接ビリルビンの測定を行うと、測定値の
信頼性に問題が生じることや、酸化剤としてシアン化物
を利用した場合には廃液処理が難しい等の問題点を有し
ている。更に、BOD法や化学的酸化法に於いては、直接
ビリルビンの測定値がジアゾ法によるそれと相関性が悪
いので、測定値を、ジアゾ法により得られる測定値に基
づいて確立された各種肝疾患の診断や黄疸の鑑別に利用
し難いと言う問題も生じている。
【０００６】このような現状から、自動分析装置への応
用が可能であって、ジアゾ法との相関が良く、しかも測
定試液の安定性に優れたビリルビンの測定方法の出現が
望まれている。
用が可能であって、ジアゾ法との相関が良く、しかも測
定試液の安定性に優れたビリルビンの測定方法の出現が
望まれている。
【０００７】
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、自動分析装置への応用が可能であって、ジ
アゾ法との相関が良く、しかも測定試液の安定性に優
れ、且つ試料中の共存物質による測定値への影響が少な
いビリルビンの測定方法を提供することをその目的とす
る。
れたもので、自動分析装置への応用が可能であって、ジ
アゾ法との相関が良く、しかも測定試液の安定性に優
れ、且つ試料中の共存物質による測定値への影響が少な
いビリルビンの測定方法を提供することをその目的とす
る。
【０００８】
【発明の構成】本発明は、生体体液試料に、バナジン酸
イオン又は三価のマンガンイオンを酸化剤として作用さ
せ、該試料の光学的変化を測定することを特徴とする総
ビリルビン又は直接ビリルビンの測定方法の発明であ
る。
イオン又は三価のマンガンイオンを酸化剤として作用さ
せ、該試料の光学的変化を測定することを特徴とする総
ビリルビン又は直接ビリルビンの測定方法の発明であ
る。
【０００９】また、本発明は、ヒドラジン類、ヒドロキ
シルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェ
ノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イ
オン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化
合物を、間接ビリルビンの反応抑制剤として共存させる
ことを特徴とする、上記直接ビリルビンの測定方法の発
明である。
シルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェ
ノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イ
オン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化
合物を、間接ビリルビンの反応抑制剤として共存させる
ことを特徴とする、上記直接ビリルビンの測定方法の発
明である。
【００１０】更に、本発明は、間接ビリルビンの反応抑
制剤としての、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、
オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶
性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性
剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物の存在下
に、生体体液試料に酸化剤を作用させ、該試料の光学的
変化を測定をすることを特徴とする直接ビリルビンの測
定方法の発明である。
制剤としての、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、
オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶
性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性
剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物の存在下
に、生体体液試料に酸化剤を作用させ、該試料の光学的
変化を測定をすることを特徴とする直接ビリルビンの測
定方法の発明である。
【００１１】更に、本発明は、間接ビリルビンの反応抑
制剤としての、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の
非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上
の化合物の存在下に生体体液試料にビリルビンオキシダ
ーゼを作用させ、該試料の光学的変化を測定をすること
を特徴とする直接ビリルビンの測定方法の発明である。
制剤としての、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の
非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上
の化合物の存在下に生体体液試料にビリルビンオキシダ
ーゼを作用させ、該試料の光学的変化を測定をすること
を特徴とする直接ビリルビンの測定方法の発明である。
【００１２】本発明のビリルビンの測定方法に於いて用
いられるバナジン酸イオンとしては、本発明の目的に使
用できるものであれば特に限定されることなく挙げられ
るが、好ましい具体例としては例えばＶＯ3 -、ＶＯ4 3-
等の５価のバナジウムを含むものが挙げられる。実際に
これを試薬中に添加する場合には、バナジン酸そのもの
を用いてもよいが、例えばリチウム，ナトリウム，カリ
ウム等のアルカリ金属類の塩やアンモニウム塩等、塩の
形にして用いたほうが溶解性の面等からより好ましい。
いられるバナジン酸イオンとしては、本発明の目的に使
用できるものであれば特に限定されることなく挙げられ
るが、好ましい具体例としては例えばＶＯ3 -、ＶＯ4 3-
等の５価のバナジウムを含むものが挙げられる。実際に
これを試薬中に添加する場合には、バナジン酸そのもの
を用いてもよいが、例えばリチウム，ナトリウム，カリ
ウム等のアルカリ金属類の塩やアンモニウム塩等、塩の
形にして用いたほうが溶解性の面等からより好ましい。
【００１３】また、本発明のビリルビンの測定方法に於
いて用いられる三価のマンガンイオンとしては、酢酸マ
ンガン(III)等の通常の３価のマンガン塩のみならず、
例えばアセチルアセトン，エチレンジアミン四酢酸等の
キレート剤とキレートを形成してしているものも挙げら
れる。
いて用いられる三価のマンガンイオンとしては、酢酸マ
ンガン(III)等の通常の３価のマンガン塩のみならず、
例えばアセチルアセトン，エチレンジアミン四酢酸等の
キレート剤とキレートを形成してしているものも挙げら
れる。
【００１４】バナジン酸イオン及びマンガンイオンのビ
リルビン測定時の使用濃度としては、試料中のビリルビ
ンを酸化し得る濃度であれば特に限定されないが、最終
反応液中の濃度として通常0.02〜10 mgイオン/ｌ、好まし
くは0.1〜２ mgイオン/ｌの範囲が挙げられる。
リルビン測定時の使用濃度としては、試料中のビリルビ
ンを酸化し得る濃度であれば特に限定されないが、最終
反応液中の濃度として通常0.02〜10 mgイオン/ｌ、好まし
くは0.1〜２ mgイオン/ｌの範囲が挙げられる。
【００１５】本発明の直接ビリルビンの測定方法に於い
て間接ビリルビンの反応抑制剤として用いられるヒドラ
ジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多
価アミン類、フェノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値
が１５以上の非イオン型界面活性剤としては、直接ビリ
ルビンの測定に影響を及ぼさないものであれば特に限定
されることなく挙げられるが、ヒドラジン類の好ましい
具体例としては例えばヒドラジン，フェニルヒドラジン
又はこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩等）等が挙げら
れ、ヒドロキシルアミン類としては例えばヒドロキシル
アミン，フェニルヒドロキシルアミン又はこれらの鉱酸
塩（塩酸塩、硫酸塩等）等が挙げられ、オキシム類とし
ては例えばアセトキシム，ジアセチルモノオキシム，サ
リチルアルドキシム等が挙げられ、脂肪族多価アミン類
としては例えばテトラエチレンペンタミン，ヘキサメチ
レンテトラミン，トリエチレンテトラミン等が挙げら
れ、フェノール類の好ましい具体例としては例えばフェ
ノール、p-クロルフェノール、p-アセトアミドフェノー
ル、4-クロル-1-ナフトール、β-ナフトール等が挙げら
れ、水溶性高分子の好ましい具体例としては例えばポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げら
れ、ＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤として
は例えばエマルゲン-123P（ポリオキシエチレンラウリ
ルエーテル、花王(株)社商品名），エマルゲン-950（ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王(株)社
商品名），エマルゲン-985（ポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル、花王(株)社商品名），トリトンX-40
5（ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテ
ル、ローム アンド ハース社商品名）等が挙げられ
る。これら反応抑制剤は単独でも間接ビリルビンの酸化
抑制作用を有しているが、２種以上組み合わせることに
より間接ビリルビンの酸化抑制作用がより高くなる場合
もあるので、状況に合わせて適宜選択して用いればよ
い。また、これら反応抑制剤の直接ビリルビン測定時の
使用濃度は、試料中の間接ビリルビンの酸化を抑制し得
る濃度であれば特に限定されず、且つ化合物の種類によ
り異なるが、通常最終反応液中の濃度として0.01〜５W/
V％の範囲が挙げられる。
て間接ビリルビンの反応抑制剤として用いられるヒドラ
ジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多
価アミン類、フェノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値
が１５以上の非イオン型界面活性剤としては、直接ビリ
ルビンの測定に影響を及ぼさないものであれば特に限定
されることなく挙げられるが、ヒドラジン類の好ましい
具体例としては例えばヒドラジン，フェニルヒドラジン
又はこれらの鉱酸塩（塩酸塩、硫酸塩等）等が挙げら
れ、ヒドロキシルアミン類としては例えばヒドロキシル
アミン，フェニルヒドロキシルアミン又はこれらの鉱酸
塩（塩酸塩、硫酸塩等）等が挙げられ、オキシム類とし
ては例えばアセトキシム，ジアセチルモノオキシム，サ
リチルアルドキシム等が挙げられ、脂肪族多価アミン類
としては例えばテトラエチレンペンタミン，ヘキサメチ
レンテトラミン，トリエチレンテトラミン等が挙げら
れ、フェノール類の好ましい具体例としては例えばフェ
ノール、p-クロルフェノール、p-アセトアミドフェノー
ル、4-クロル-1-ナフトール、β-ナフトール等が挙げら
れ、水溶性高分子の好ましい具体例としては例えばポリ
ビニルアルコール、ポリビニルピロリドン等が挙げら
れ、ＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤として
は例えばエマルゲン-123P（ポリオキシエチレンラウリ
ルエーテル、花王(株)社商品名），エマルゲン-950（ポ
リオキシエチレンノニルフェニルエーテル、花王(株)社
商品名），エマルゲン-985（ポリオキシエチレンノニル
フェニルエーテル、花王(株)社商品名），トリトンX-40
5（ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテ
ル、ローム アンド ハース社商品名）等が挙げられ
る。これら反応抑制剤は単独でも間接ビリルビンの酸化
抑制作用を有しているが、２種以上組み合わせることに
より間接ビリルビンの酸化抑制作用がより高くなる場合
もあるので、状況に合わせて適宜選択して用いればよ
い。また、これら反応抑制剤の直接ビリルビン測定時の
使用濃度は、試料中の間接ビリルビンの酸化を抑制し得
る濃度であれば特に限定されず、且つ化合物の種類によ
り異なるが、通常最終反応液中の濃度として0.01〜５W/
V％の範囲が挙げられる。
【００１６】尚、これら本発明に係る間接ビリルビンの
反応抑制剤は、化学的酸化法による直接ビリルビンの測
定方法であれば、酸化剤の種類に関係なく何れの場合も
間接ビリルビンの反応抑制剤として有効に使用し得る。
また、これらの内、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以
上の非イオン型界面活性剤の場合にはビリルビンオキシ
ダーゼを使用する直接ビリルビンの測定に於いても同様
に間接ビリルビンの反応抑制剤として使用し得る。
反応抑制剤は、化学的酸化法による直接ビリルビンの測
定方法であれば、酸化剤の種類に関係なく何れの場合も
間接ビリルビンの反応抑制剤として有効に使用し得る。
また、これらの内、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以
上の非イオン型界面活性剤の場合にはビリルビンオキシ
ダーゼを使用する直接ビリルビンの測定に於いても同様
に間接ビリルビンの反応抑制剤として使用し得る。
【００１７】尚、本発明に用いられる測定試液中にキレ
ート剤を共存させておくと、試薬盲検値が低下して分析
精度が向上し、該試液の安定化が図れると共に、ビリル
ビンの酸化反応が促進されるので好ましい。このような
目的で使用されるキレート剤の好ましい具体例としては
例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ニトリロ三酢酸
(NTA)、シクロヘキサンジアミン四酢酸(CyDTA)、ジエチ
レントリアミン五酢酸(DTPA)、ヒドロキシエチルエチレ
ンジアミン三酢酸(EDTA-OH)、トリエチレンテトライミ
ン六酢酸(TTHA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HID
A)、1-ヒドロキシエタン-1,1-ジホスホン酸、或はこれ
らのアルカリ金属塩（例えばリチウム塩，ナトリウム
塩，カリウム塩等）やアンモニウム塩等が挙げられる。
これらキレート剤のビリルビン測定時の使用濃度として
は、ビリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に限
定されないが、最終反応液中の濃度として通常0.02〜50
mM、好ましくは１〜30mM、更に好ましくは１〜20mMの範
囲が挙げられる。
ート剤を共存させておくと、試薬盲検値が低下して分析
精度が向上し、該試液の安定化が図れると共に、ビリル
ビンの酸化反応が促進されるので好ましい。このような
目的で使用されるキレート剤の好ましい具体例としては
例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ニトリロ三酢酸
(NTA)、シクロヘキサンジアミン四酢酸(CyDTA)、ジエチ
レントリアミン五酢酸(DTPA)、ヒドロキシエチルエチレ
ンジアミン三酢酸(EDTA-OH)、トリエチレンテトライミ
ン六酢酸(TTHA)、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HID
A)、1-ヒドロキシエタン-1,1-ジホスホン酸、或はこれ
らのアルカリ金属塩（例えばリチウム塩，ナトリウム
塩，カリウム塩等）やアンモニウム塩等が挙げられる。
これらキレート剤のビリルビン測定時の使用濃度として
は、ビリルビンの測定を妨害しない濃度であれば特に限
定されないが、最終反応液中の濃度として通常0.02〜50
mM、好ましくは１〜30mM、更に好ましくは１〜20mMの範
囲が挙げられる。
【００１８】本発明の方法により総ビリルビン濃度を測
定する際に、通常用いられるビリルビンの酸化反応促進
剤（以下、単に反応促進剤と略記する。）を試液中に共
存させておくと、測定時間が短縮できるので好ましい。
このような目的で用いられる反応促進剤としては、例え
ばラウリル硫酸ナトリウム，ラウリルベンゼンスルホン
酸ナトリウム，コール酸ナトリウム等の陰イオン型界面
活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド，セチルピリジニウムクロライド等の陽イオン型界面
活性剤、アンヒトール24B（花王(株)社商品名）等のア
ルキルベタイン系の両性型界面活性剤等、通常この分野
に於いてこの種の目的で使用されるものが全て挙げられ
る。中でも両性型界面活性剤は、pＨ２〜13の広い範囲
で利用でき、且つ乳ビ血清の澄明化効果が高いので特に
好ましい。これら反応促進剤のビリルビン測定時の使用
濃度としては、試料中のビリルビンの酸化を促進し得る
濃度であれば特に限定されないが、最終反応液中の濃度
として通常0.01〜３W/V％、好ましくは0.1〜２W/V％の
範囲が挙げられる。
定する際に、通常用いられるビリルビンの酸化反応促進
剤（以下、単に反応促進剤と略記する。）を試液中に共
存させておくと、測定時間が短縮できるので好ましい。
このような目的で用いられる反応促進剤としては、例え
ばラウリル硫酸ナトリウム，ラウリルベンゼンスルホン
酸ナトリウム，コール酸ナトリウム等の陰イオン型界面
活性剤、例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイ
ド，セチルピリジニウムクロライド等の陽イオン型界面
活性剤、アンヒトール24B（花王(株)社商品名）等のア
ルキルベタイン系の両性型界面活性剤等、通常この分野
に於いてこの種の目的で使用されるものが全て挙げられ
る。中でも両性型界面活性剤は、pＨ２〜13の広い範囲
で利用でき、且つ乳ビ血清の澄明化効果が高いので特に
好ましい。これら反応促進剤のビリルビン測定時の使用
濃度としては、試料中のビリルビンの酸化を促進し得る
濃度であれば特に限定されないが、最終反応液中の濃度
として通常0.01〜３W/V％、好ましくは0.1〜２W/V％の
範囲が挙げられる。
【００１９】本発明の測定方法に於いて用いられるその
他の試薬類、例えば緩衝剤や防腐剤等は、自体公知の化
学的酸化法やBOD法等に於いて用いられる例えばリン
酸，クエン酸，コハク酸等の緩衝剤や防腐剤等から必要
に応じて適宜選択して用いればよく、これらの試薬の濃
度や測定試液のpＨ等も自体公知の方法に於いて用いら
れる測定試液のそれに準じて適宜設定すれば足りる。
他の試薬類、例えば緩衝剤や防腐剤等は、自体公知の化
学的酸化法やBOD法等に於いて用いられる例えばリン
酸，クエン酸，コハク酸等の緩衝剤や防腐剤等から必要
に応じて適宜選択して用いればよく、これらの試薬の濃
度や測定試液のpＨ等も自体公知の方法に於いて用いら
れる測定試液のそれに準じて適宜設定すれば足りる。
【００２０】本発明を実施するには、例えば以下の如く
行えばよい。即ち、総ビリルビン濃度の測定を行う場合
には、先ず、反応促進剤、及び要すればキレート剤等を
含む緩衝液を第１試液とし、これと例えば血漿，血清，
尿等の生体体液等のビリルビンを含む試料とを混合し、
この溶液の特定波長（430〜460nm付近）の吸光度を測定
する（吸光度１）。次いで、該溶液に、バナジン酸イオ
ン又は三価のマンガンイオン、要すればキレート剤を含
む第２試液を添加して25〜40℃で、３〜15分間ビリルビ
ンの酸化反応を行った後、再度特定波長の吸光度を測定
する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値
に液量補正値等を乗ずる等した後、酸化反応前後での該
特定波長に於ける吸光度の変化量を求める。この値と、
予めビリルビン濃度既知の標準液を用いて上記と同様の
操作により得られた、ビリルビン濃度と該特定波長に於
ける吸光度の変化量との関係を示す検量線から、試料中
の総ビリルビン濃度を求めることができる。
行えばよい。即ち、総ビリルビン濃度の測定を行う場合
には、先ず、反応促進剤、及び要すればキレート剤等を
含む緩衝液を第１試液とし、これと例えば血漿，血清，
尿等の生体体液等のビリルビンを含む試料とを混合し、
この溶液の特定波長（430〜460nm付近）の吸光度を測定
する（吸光度１）。次いで、該溶液に、バナジン酸イオ
ン又は三価のマンガンイオン、要すればキレート剤を含
む第２試液を添加して25〜40℃で、３〜15分間ビリルビ
ンの酸化反応を行った後、再度特定波長の吸光度を測定
する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値
に液量補正値等を乗ずる等した後、酸化反応前後での該
特定波長に於ける吸光度の変化量を求める。この値と、
予めビリルビン濃度既知の標準液を用いて上記と同様の
操作により得られた、ビリルビン濃度と該特定波長に於
ける吸光度の変化量との関係を示す検量線から、試料中
の総ビリルビン濃度を求めることができる。
【００２１】また、直接ビリルビン濃度の測定を行うに
は、第１試液として前記本発明に係る反応抑制剤及び要
すればキレート剤等を含む緩衝液を用い、第２試液とし
ては、上記の総ビリルビン濃度を求める場合と同じもの
を用い、以下、総ビリルビン濃度を求める場合と同様に
して操作を行えばよい。
は、第１試液として前記本発明に係る反応抑制剤及び要
すればキレート剤等を含む緩衝液を用い、第２試液とし
ては、上記の総ビリルビン濃度を求める場合と同じもの
を用い、以下、総ビリルビン濃度を求める場合と同様に
して操作を行えばよい。
【００２２】また、本発明に係る反応抑制剤は、先に述
べた如く、自体公知の化学的酸化法、即ちフェリシアン
化イオンや２価の銅イオンを酸化剤として用いるビリル
ビンの測定方法に於ても同様に間接ビリルビンの反応抑
制剤として使用可能なので、第１試液として本発明に係
る反応抑制剤及び要すればキレート剤を含む緩衝液を用
い、第２試液としてこれらの酸化剤（即ち、フェリシア
ン化イオンや２価の銅イオン）及び要すればキレート剤
を含む緩衝剤溶液を用いれば同様に直接ビリルビンをジ
アゾ法との相関良く測定することができる。
べた如く、自体公知の化学的酸化法、即ちフェリシアン
化イオンや２価の銅イオンを酸化剤として用いるビリル
ビンの測定方法に於ても同様に間接ビリルビンの反応抑
制剤として使用可能なので、第１試液として本発明に係
る反応抑制剤及び要すればキレート剤を含む緩衝液を用
い、第２試液としてこれらの酸化剤（即ち、フェリシア
ン化イオンや２価の銅イオン）及び要すればキレート剤
を含む緩衝剤溶液を用いれば同様に直接ビリルビンをジ
アゾ法との相関良く測定することができる。
【００２３】更に、本発明の反応抑制剤の内、水溶性高
分子又はＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤の
場合にはビリルビンオキシダーゼを用いる直接ビリルビ
ンの測定法に於いても間接ビリルビンの反応抑制剤とし
て使用可能なので、第１試液として水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群よ
り選ばれた１種以上の化合物と要すればキレート剤を含
む緩衝液を用い、第２試液としてビリルビンオキシダー
ゼと要すればキレート剤を含む緩衝剤溶液を用いればこ
の場合も同様に直接ビリルビンをジアゾ法との相関良く
測定することができる。
分子又はＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤の
場合にはビリルビンオキシダーゼを用いる直接ビリルビ
ンの測定法に於いても間接ビリルビンの反応抑制剤とし
て使用可能なので、第１試液として水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群よ
り選ばれた１種以上の化合物と要すればキレート剤を含
む緩衝液を用い、第２試液としてビリルビンオキシダー
ゼと要すればキレート剤を含む緩衝剤溶液を用いればこ
の場合も同様に直接ビリルビンをジアゾ法との相関良く
測定することができる。
【００２４】尚、上記夫々の直接ビリルビンの測定方法
に於いて、間接ビリルビンの反応抑制剤としてＨＬＢ値
が１５未満の非イオン型界面活性剤を用いても何れの場
合も本発明の如き効果は得られない。即ち、このような
性質の非イオン型界面活性剤では間接ビリルビンの酸化
を充分に防止することができないため、該界面活性剤を
間接ビリルビンの反応抑制剤として用いても直接ビリル
ビンの測定値は依然として間接ビリルビンの影響を受け
たままでジアゾ法によるそれとの相関が悪く実用上問題
を生じる。
に於いて、間接ビリルビンの反応抑制剤としてＨＬＢ値
が１５未満の非イオン型界面活性剤を用いても何れの場
合も本発明の如き効果は得られない。即ち、このような
性質の非イオン型界面活性剤では間接ビリルビンの酸化
を充分に防止することができないため、該界面活性剤を
間接ビリルビンの反応抑制剤として用いても直接ビリル
ビンの測定値は依然として間接ビリルビンの影響を受け
たままでジアゾ法によるそれとの相関が悪く実用上問題
を生じる。
【００２５】上記の総ビリルビン或は直接ビリルビンの
測定に於いて、第１液と試料とを混合した溶液を用いて
測定される吸光度を吸光度１とし、第１液と第２液とを
予め混合したものと試料とを反応させた結果得られる溶
液から測定される吸光度を吸光度２として、上記と同様
の操作を行うことによっても、同様に試料中の総ビリル
ビン濃度或は直接ビリルビン濃度を求めることができ
る。
測定に於いて、第１液と試料とを混合した溶液を用いて
測定される吸光度を吸光度１とし、第１液と第２液とを
予め混合したものと試料とを反応させた結果得られる溶
液から測定される吸光度を吸光度２として、上記と同様
の操作を行うことによっても、同様に試料中の総ビリル
ビン濃度或は直接ビリルビン濃度を求めることができ
る。
【００２６】以下に実験例及び実施例を挙げ、本発明を
更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限
定されるものではない。
更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限
定されるものではない。
【００２７】
実験例１．ビリルビンの酸化剤の選択 ビリルビンの酸化剤として有用な金属イオンを見出すべ
く以下の実験を行った。 （測定試液） ・第１試液 0.1M 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pＨ4.0）を第１試液
（Ｒ１、以下同じ。）とした。 ・第２試液 所定の金属イオンを１mM含む0.1M 酢酸-酢酸ナトリウム
緩衝液（pＨ4.0）を第２試液（Ｒ２、以下同じ。）とし
た。 （試料）ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン
を含む水溶液を直接型試料として、また、市販のビリル
ビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl含有、和光純
薬工業(株)製）を間接型試料として用いた。 （操作法）日立7050型自動分析装置（日立製作所(株)
製）を用い、表１に示す条件で測定を行った。
く以下の実験を行った。 （測定試液） ・第１試液 0.1M 酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液（pＨ4.0）を第１試液
（Ｒ１、以下同じ。）とした。 ・第２試液 所定の金属イオンを１mM含む0.1M 酢酸-酢酸ナトリウム
緩衝液（pＨ4.0）を第２試液（Ｒ２、以下同じ。）とし
た。 （試料）ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン
を含む水溶液を直接型試料として、また、市販のビリル
ビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl含有、和光純
薬工業(株)製）を間接型試料として用いた。 （操作法）日立7050型自動分析装置（日立製作所(株)
製）を用い、表１に示す条件で測定を行った。
【表１】 （結果）得られた結果を表２に示す。
【表２】 表２の結果から明らかな如く、フェリシアン化イオン、
メタバナジン酸イオン及び三価のマンガンイオンがビリ
ルビンの酸化剤として優れていることが判る。しかしな
がら、シアン化合物であるフェリシアン化イオンには廃
液処理等の点で問題があるので、これらのうちではメタ
バナジン酸イオン及び三価のマンガンイオンが実用上の
有用性が高いと判断される。 実験例２．間接ビリルビンの反応抑制剤の検討 ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂
肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤の、間接ビリ
ルビンの反応抑制能について検討を行った。 （測定試液） ・第１試液 所定濃度のヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキ
シム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高
分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤
と、0.2％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸
ナトリウム緩衝液（pＨ3.0）を第１試液とした。 ・第２試液（マンガン法） ３mMの酢酸第二マンガンと、0.2％のEDTA・2Naとを含む
0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）をマンガン法用の第２試
液とした。 ・第２試液（バナジン酸法） ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）を バナジン酸法用
の第２試液とした。 （標準） ・直接型標準 ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン を含む水
溶液を直接型標準として使用した。 ・間接型標準 市販のビリルビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl
含有、和光純薬工業(株)製）を間接型標準として使用し
た。 （操作法）実験例１と同様に行った。 （結果）結果を表３（バナジン酸法）及び表４（マンガ
ン法）に示す。尚、表３及び表４中には、参考のため、
各測定試液及び市販のビリルビン測定試薬［ビリルビン
II-HA テストワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ
法。）］により新鮮ヒト血清中の直接ビリルビン濃度を
実測した値を併せて示している。
メタバナジン酸イオン及び三価のマンガンイオンがビリ
ルビンの酸化剤として優れていることが判る。しかしな
がら、シアン化合物であるフェリシアン化イオンには廃
液処理等の点で問題があるので、これらのうちではメタ
バナジン酸イオン及び三価のマンガンイオンが実用上の
有用性が高いと判断される。 実験例２．間接ビリルビンの反応抑制剤の検討 ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂
肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤の、間接ビリ
ルビンの反応抑制能について検討を行った。 （測定試液） ・第１試液 所定濃度のヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキ
シム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高
分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤
と、0.2％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸
ナトリウム緩衝液（pＨ3.0）を第１試液とした。 ・第２試液（マンガン法） ３mMの酢酸第二マンガンと、0.2％のEDTA・2Naとを含む
0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）をマンガン法用の第２試
液とした。 ・第２試液（バナジン酸法） ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）を バナジン酸法用
の第２試液とした。 （標準） ・直接型標準 ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン を含む水
溶液を直接型標準として使用した。 ・間接型標準 市販のビリルビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl
含有、和光純薬工業(株)製）を間接型標準として使用し
た。 （操作法）実験例１と同様に行った。 （結果）結果を表３（バナジン酸法）及び表４（マンガ
ン法）に示す。尚、表３及び表４中には、参考のため、
各測定試液及び市販のビリルビン測定試薬［ビリルビン
II-HA テストワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ
法。）］により新鮮ヒト血清中の直接ビリルビン濃度を
実測した値を併せて示している。
【表３】
【表４】 表３及び表４の結果から明らかな如く、ヒドラジン類、
ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン
類、フェノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以
上の非イオン型界面活性剤を共存させることにより、間
接ビリルビンの酸化が抑制されることが判る。尚、上記
した化合物が間接ビリルビンの酸化を抑制する機構につ
いては明確ではないが、ヒドラジン類、ヒドロキシルア
ミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類及びフェノー
ル類等の還元能力を有する化合物の場合には過剰の酸化
剤を吸収するので間接ビリルビンが徐々に酸化されてい
くのを防止する等の機構が、また、水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤等の化合物の
場合は間接ビリルビンと何らかの形で結合して間接ビリ
ルビンの酸化を防止するため結果的に酸化剤の直接ビリ
ルビンへの特異性を向上させる等の機構が考えられる。
ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン
類、フェノール類、水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以
上の非イオン型界面活性剤を共存させることにより、間
接ビリルビンの酸化が抑制されることが判る。尚、上記
した化合物が間接ビリルビンの酸化を抑制する機構につ
いては明確ではないが、ヒドラジン類、ヒドロキシルア
ミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類及びフェノー
ル類等の還元能力を有する化合物の場合には過剰の酸化
剤を吸収するので間接ビリルビンが徐々に酸化されてい
くのを防止する等の機構が、また、水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤等の化合物の
場合は間接ビリルビンと何らかの形で結合して間接ビリ
ルビンの酸化を防止するため結果的に酸化剤の直接ビリ
ルビンへの特異性を向上させる等の機構が考えられる。
【００２８】実施例１． （測定試液） ・第１試液（直接ビリルビン測定用） 20mMの塩酸ヒドロキシルアミンと、0.2％のEDTA・2Naと
を含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液（pＨ
3.0）を直接ビリルビン測定用第１試液とした。 ・第１試液（総ビリルビン測定用） 0.3％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドと、
0.3％のアンヒトール24B（花王(株)社商品名）と、0.2
％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウ
ム緩衝液（pＨ3.0）を総ビリルビン測定用第１試液とし
た。 ・第２試液 ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）を 第２試液とし
た。 （標準） ・直接型標準 ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン を含む水
溶液を直接型標準として使用した。 ・間接型標準 市販のビリルビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl
含有、和光純薬工業(株)製）を間接型標準として使用し
た。 （試料）新鮮ヒト血清40検体を試料とした。 （操作）実施例１と同様に行った。 参考例１．実施例１で用いたのと同じ試料について、市
販のビリルビン測定用試薬［ビリルビン II-HA テス
トワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ法。）］により
総ビリルビン及び直接ビリルビンの測定を行った。尚、
操作は、上記の市販測定試薬に添付の現品説明書の標準
操作法に従って行った。 （結果）実施例１及び参考例１で得られた測定値に基づ
いて作成した、総ビリルビンについての相関図を図１
に、直接ビリルビンについての相関図を図２に夫々示
す。尚、同測定値を統計処理して得られた相関係数及び
回帰直線式は夫々以下の通りであった。 ・総ビリルビン 相関係数：γ＝0.999。 回帰直線式：Ｙ＝1.017Ｘ＋0.250。 Ｙ：実施例１により得られた総ビリルビンの測定値。 Ｘ：参考例１により得られた総ビリルビンの測定値。 ・直接ビリルビン 相関係数：γ＝0.990。 回帰直線式：Ｙ＝1.021Ｘ−0.003。 Ｙ：実施例１により得られた直接ビリルビンの測定値。 Ｘ：参考例１により得られた直接ビリルビンの測定値。 これらの結果から明らかな如く、本発明の方法により得
られる測定値は従来法（ジアゾ法）のそれと良く相関す
ることが判る。また、実施例１及び参考例１の試液を用
い、同様の操作法により、アスコルビン酸を含む試料中
のビリルビン濃度を測定した結果を表５に示す。
を含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液（pＨ
3.0）を直接ビリルビン測定用第１試液とした。 ・第１試液（総ビリルビン測定用） 0.3％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイドと、
0.3％のアンヒトール24B（花王(株)社商品名）と、0.2
％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウ
ム緩衝液（pＨ3.0）を総ビリルビン測定用第１試液とし
た。 ・第２試液 ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ6.0）を 第２試液とし
た。 （標準） ・直接型標準 ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン を含む水
溶液を直接型標準として使用した。 ・間接型標準 市販のビリルビン標準血清（間接ビリルビンを10mg/dl
含有、和光純薬工業(株)製）を間接型標準として使用し
た。 （試料）新鮮ヒト血清40検体を試料とした。 （操作）実施例１と同様に行った。 参考例１．実施例１で用いたのと同じ試料について、市
販のビリルビン測定用試薬［ビリルビン II-HA テス
トワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ法。）］により
総ビリルビン及び直接ビリルビンの測定を行った。尚、
操作は、上記の市販測定試薬に添付の現品説明書の標準
操作法に従って行った。 （結果）実施例１及び参考例１で得られた測定値に基づ
いて作成した、総ビリルビンについての相関図を図１
に、直接ビリルビンについての相関図を図２に夫々示
す。尚、同測定値を統計処理して得られた相関係数及び
回帰直線式は夫々以下の通りであった。 ・総ビリルビン 相関係数：γ＝0.999。 回帰直線式：Ｙ＝1.017Ｘ＋0.250。 Ｙ：実施例１により得られた総ビリルビンの測定値。 Ｘ：参考例１により得られた総ビリルビンの測定値。 ・直接ビリルビン 相関係数：γ＝0.990。 回帰直線式：Ｙ＝1.021Ｘ−0.003。 Ｙ：実施例１により得られた直接ビリルビンの測定値。 Ｘ：参考例１により得られた直接ビリルビンの測定値。 これらの結果から明らかな如く、本発明の方法により得
られる測定値は従来法（ジアゾ法）のそれと良く相関す
ることが判る。また、実施例１及び参考例１の試液を用
い、同様の操作法により、アスコルビン酸を含む試料中
のビリルビン濃度を測定した結果を表５に示す。
【表５】 表５の結果から明らかな如く、本発明の方法は従来法に
比較して共存するアスコルビン酸の影響を受け難い方法
であることが判る。また、実施例１の測定用試液を用い
て検量線を作成したところ、総ビリルビン及び直接ビリ
ルビン共に40mg/dlまで良好な直線性を示した。
比較して共存するアスコルビン酸の影響を受け難い方法
であることが判る。また、実施例１の測定用試液を用い
て検量線を作成したところ、総ビリルビン及び直接ビリ
ルビン共に40mg/dlまで良好な直線性を示した。
【００２９】実施例２．直接ビリルビンの測定 （測定試液） ・第１試液 0.3％のトリトンX-405（ローム アンド ハース社商品
名、HLB値：17.9）と、20mMの塩酸ヒドロキシルアミン
と、0.2％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸
ナトリウム緩衝液（pＨ3.0）を第１試液とした。 ・第２試液 ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ7.0）を 第２試液とし
た。 （標準）ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン
を含む水溶液を直接型標準として使用した。 （試料）採取後凍結保存しておいたヒト血清13検体を試
料とした。 （操作）実施例１と同様に行った。 （結果）測定結果を表６に示す。
名、HLB値：17.9）と、20mMの塩酸ヒドロキシルアミン
と、0.2％のEDTA・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸
ナトリウム緩衝液（pＨ3.0）を第１試液とした。 ・第２試液 ３mMのバナジン酸ナトリウムと、0.2％のEDTA・2Naとを
含む0.01M リン酸緩衝液（pＨ7.0）を 第２試液とし
た。 （標準）ビリルビン10mg/dl相当のジタウロビリルビン
を含む水溶液を直接型標準として使用した。 （試料）採取後凍結保存しておいたヒト血清13検体を試
料とした。 （操作）実施例１と同様に行った。 （結果）測定結果を表６に示す。
【００３０】比較例１．実施例２に於ける第１試薬中の
トリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名、HLB
値：17.9）をトリトンX-100（ポリオキシエチレンイソ
オクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社
商品名、HLB値：13.5）に変更した以外は、実施例２と
同じ試薬、試液及び試料を用い、同様の操作により測定
を行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。 実施例３．直接ビリルビンの測定 （測定試液） ・第１試液 0.3％のトリトンX-405（ローム アンド ハース社商品
名、HLB値：17.9）と、0.5％のチオ尿素と、0.2％のEDT
A・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝
液（pＨ3.6）を第１試液とした。 ・第２試液 ５mMの硫酸銅水溶液を 第２試液とした。 （標準）実施例２と同じものを用いた。 （試料）実施例２と同じものを用いた。 （操作）実施例１と同様に行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
トリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名、HLB
値：17.9）をトリトンX-100（ポリオキシエチレンイソ
オクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社
商品名、HLB値：13.5）に変更した以外は、実施例２と
同じ試薬、試液及び試料を用い、同様の操作により測定
を行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。 実施例３．直接ビリルビンの測定 （測定試液） ・第１試液 0.3％のトリトンX-405（ローム アンド ハース社商品
名、HLB値：17.9）と、0.5％のチオ尿素と、0.2％のEDT
A・2Naとを含む0.1M クエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝
液（pＨ3.6）を第１試液とした。 ・第２試液 ５mMの硫酸銅水溶液を 第２試液とした。 （標準）実施例２と同じものを用いた。 （試料）実施例２と同じものを用いた。 （操作）実施例１と同様に行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
【００３１】比較例２．実施例３に於ける第１試薬中の
トリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名、HLB
値：17.9）をトリトンX-100（ポリオキシエチレンイソ
オクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社
商品名、HLB値：13.5）に変更した以外は、実施例３と
同じ試薬、試液及び試料を用い、同様の操作により測定
を行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
トリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名、HLB
値：17.9）をトリトンX-100（ポリオキシエチレンイソ
オクチルフェニルエーテル、ローム アンド ハース社
商品名、HLB値：13.5）に変更した以外は、実施例３と
同じ試薬、試液及び試料を用い、同様の操作により測定
を行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
【００３２】参考例２．実施例２で用いたものと同じ試
料について、市販のビリルビン測定用試薬［ビリルビン
II-HA テストワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ
法。）］により直接ビリルビンの測定を行った。尚、操
作は、上記の市販測定試薬に添付の現品説明書の標準操
作法に従って行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
料について、市販のビリルビン測定用試薬［ビリルビン
II-HA テストワコー（和光純薬工業(株)製、ジアゾ
法。）］により直接ビリルビンの測定を行った。尚、操
作は、上記の市販測定試薬に添付の現品説明書の標準操
作法に従って行った。 （結果）測定結果を表６に併せて示す。
【表６】 また、参考例２により得られた各試料の直接ビリルビン
濃度と、実施例２、実施例３、比較例１及び比較例２に
より得られたそれらとを統計処理した結果得られた相関
係数及び回帰直線式を表７に示す。
濃度と、実施例２、実施例３、比較例１及び比較例２に
より得られたそれらとを統計処理した結果得られた相関
係数及び回帰直線式を表７に示す。
【表７】 表６及び表７の結果から明らかな如く、HLB値が15以上
のトリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名）
を間接ビリルビンの反応抑制剤として利用した場合に
は、得られる直接ビリルビンの測定値はジアゾ法による
それと良く相関するが、HLB値が15未満のトリトンX-100
（ローム アンド ハース社商品名）を間接ビリルビン
の反応抑制剤として利用した場合には、得られる直接ビ
リルビンの測定値はジアゾ法によるそれとの相関性が悪
くなることが判る。
のトリトンX-405（ローム アンド ハース社商品名）
を間接ビリルビンの反応抑制剤として利用した場合に
は、得られる直接ビリルビンの測定値はジアゾ法による
それと良く相関するが、HLB値が15未満のトリトンX-100
（ローム アンド ハース社商品名）を間接ビリルビン
の反応抑制剤として利用した場合には、得られる直接ビ
リルビンの測定値はジアゾ法によるそれとの相関性が悪
くなることが判る。
【００３３】
【発明の効果】以上述べたことから明らかな如く、本発
明は、バナジン酸イオン又は三価のマンガンイオンをビ
リルビンの酸化剤として用いる点、並びに直接ビリルビ
ンを測定する際にはヒドラジン類、ヒドロキシルアミン
類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、
水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面
活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を間接
ビリルビンの反応抑制剤として使用する点に特徴を有す
る発明であって、従来法に於ける、自動分析装置への適
用性が悪い、ジアゾ法との相関性が悪い、測定用試液の
安定性が悪い等の問題点を全て解決した優れたビリルビ
ンの測定方法を提供するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なる発明である。
明は、バナジン酸イオン又は三価のマンガンイオンをビ
リルビンの酸化剤として用いる点、並びに直接ビリルビ
ンを測定する際にはヒドラジン類、ヒドロキシルアミン
類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、
水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面
活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を間接
ビリルビンの反応抑制剤として使用する点に特徴を有す
る発明であって、従来法に於ける、自動分析装置への適
用性が悪い、ジアゾ法との相関性が悪い、測定用試液の
安定性が悪い等の問題点を全て解決した優れたビリルビ
ンの測定方法を提供するものであり、斯業に貢献すると
ころ大なる発明である。
【００３４】
【図１】図１は、実施例１及び参考例１に於いて得られ
た測定値に基づいて作成された総ビリルビンについての
相関図を示すものである。
た測定値に基づいて作成された総ビリルビンについての
相関図を示すものである。
【図２】図２は、実施例１及び参考例１に於いて得られ
た測定値に基づいて作成された直接ビリルビンについて
の相関図を示すものである。
た測定値に基づいて作成された直接ビリルビンについて
の相関図を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−17999（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−160764（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−40957（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−230160（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−269054（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−179476（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】 生体体液試料に、バナジン酸イオン又は
三価のマンガンイオンを酸化剤として作用させ、該試料
の光学的変化を測定することを特徴とする総ビリルビン
又は直接ビリルビンの測定方法。 - 【請求項２】 ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、
オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶
性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性
剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を、間接ビ
リルビンの反応抑制剤として共存させることを特徴とす
る、請求項１に記載の直接ビリルビンの測定方法。 - 【請求項３】 間接ビリルビンの反応抑制剤としての、
ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂
肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子及びＨ
ＬＢ値が１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群よ
り選ばれた１種以上の化合物の存在下に、生体体液試料
に酸化剤を作用させ、該試料の光学的変化を測定をする
ことを特徴とする直接ビリルビンの測定方法。 - 【請求項４】 間接ビリルビンの反応抑制剤としての、
水溶性高分子及びＨＬＢ値が１５以上の非イオン型界面
活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物の存在
下に生体体液試料にビリルビンオキシダーゼを作用さ
せ、該試料の光学的変化を測定をすることを特徴とする
直接ビリルビンの測定方法。
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|---|---|---|---|
| JP29322790 | 1990-10-30 | ||
| JP2-293227 | 1990-10-30 |
Publications (2)
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|---|---|
| JPH0518978A JPH0518978A (ja) | 1993-01-26 |
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|---|---|---|---|
| JP3335805A Expired - Lifetime JP2666632B2 (ja) | 1990-10-30 | 1991-10-30 | ビリルビン測定方法 |
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| EP (2) | EP0686849B1 (ja) |
| JP (1) | JP2666632B2 (ja) |
| DE (2) | DE69132100T2 (ja) |
| ES (2) | ES2144550T3 (ja) |
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| DE69534877T2 (de) * | 1994-12-02 | 2006-10-05 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Verfahren zur bestimmung von bilirubin |
| US5983120A (en) * | 1995-10-23 | 1999-11-09 | Cytometrics, Inc. | Method and apparatus for reflected imaging analysis |
| KR970022316A (ko) * | 1995-10-27 | 1997-05-28 | 후루야 아끼라 | 빌리루빈의 정량 방법 |
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| DE69817449T2 (de) * | 1997-06-06 | 2004-07-01 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von direktem Bilirubin |
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| CN101055271B (zh) * | 2006-04-12 | 2011-01-26 | 上海复星医药（集团）股份有限公司 | 酶法检测直胆红素试剂盒 |
| US7749766B2 (en) * | 2007-01-12 | 2010-07-06 | Nova Biomedical Corporation | Bilirubin sensor |
| CN101963611B (zh) * | 2009-07-23 | 2014-08-13 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种临床检验试剂、试剂盒及方法 |
| KR102517800B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2023-04-05 | 시크파 홀딩 에스에이 | 습식 옵셋 인쇄 공정용 환경 친화적 습수액 및 습식 옵셋 인쇄 공정 |
| CN107091934B (zh) * | 2016-02-18 | 2018-07-06 | 四川新健康成生物股份有限公司 | 一种直接胆红素测定试剂盒及配置方法以及其运用 |
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| US4288343A (en) * | 1978-07-17 | 1981-09-08 | Beckman Instruments, Inc. | Method for increasing shelf-life of a serum bilirubin reference composition and composition produced thereby |
| US4311483A (en) * | 1979-06-18 | 1982-01-19 | Beckman Instruments, Inc. | Kinetic method for directly determining total bilirubin |
| IT1219781B (it) * | 1981-04-17 | 1990-05-24 | Augusta Brega | Metodo per la determinazione rapida della bilirubina totale e diretta nei liquidi biologici con monoreattivo |
| US4404286A (en) * | 1982-02-22 | 1983-09-13 | The Dow Chemical Company | Bilirubin assay |
| JPS59160764A (ja) * | 1983-03-02 | 1984-09-11 | Amano Pharmaceut Co Ltd | 総ビリルビンの定量法 |
| JPS6040957A (ja) * | 1983-08-15 | 1985-03-04 | Toyobo Co Ltd | 抱合型ビリルビンの安定化法 |
| JPS60233559A (ja) * | 1984-05-02 | 1985-11-20 | Terumo Corp | 試験片 |
| US4820416A (en) * | 1987-09-10 | 1989-04-11 | The Royal Institution For The Advancement For Learning (Mcgill University) | Removal of bilirubin by the pseudoperoxidase activity of immobilized hemoglobin |
| JP2856757B2 (ja) * | 1989-03-13 | 1999-02-10 | ユニチカ株式会社 | 総ビリルビンの測定方法および測定用試薬 |
-
1991
- 1991-10-30 DE DE69132100T patent/DE69132100T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1991-10-30 EP EP95113156A patent/EP0686849B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-30 JP JP3335805A patent/JP2666632B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-30 DE DE69120373T patent/DE69120373T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-30 ES ES91310026T patent/ES2088473T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-30 EP EP91310026A patent/EP0484133B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-23 US US08/312,003 patent/US5449623A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-04-07 US US08/418,685 patent/US5563072A/en not_active Expired - Fee Related
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| EP0484133B1 (en) | 1996-06-19 |
| EP0484133A2 (en) | 1992-05-06 |
| JPH0518978A (ja) | 1993-01-26 |
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| US5449623A (en) | 1995-09-12 |
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| EP0484133A3 (en) | 1993-04-21 |
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| EP0686849B1 (en) | 2000-04-05 |
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