JP2004325280A - 検出物質の安定化方法およびその試薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明が解決しようとする課題は、測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度な測定法を提供することにある。
【解決手段】測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化方法、および、測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化試薬。
【解決手段】測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化方法、および、測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清、尿、血漿、唾液、髄液等の生体試料中の特定成分などの測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質を安定化する方法およびその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中の特定成分を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法として、例えばクレアチニンとクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼとの反応で生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの共存下、色源体と反応させ生成する発色体を検出物質として定量し、クレアチニン濃度を求める方法などがある。この場合、例えば水素供与体、カップラーを色源体として用いた場合は、これらの酸化カップリング反応により生成するキノン系色素が検出物質となる。しかし、これら検出物質には次のような問題がある。
【０００３】
まず、ペルオキシダーゼの反応が律速となり、過剰の過酸化水素が一時的にも生じる場合、既に生成した検出物質が過酸化水素により還元され褪色が起こるという問題がある。その結果として、測定値の正確性または精密性を損なうことになる。二点目として、検出物質の溶解性不良に起因し、特に検出物質の濃度が高くなるに従い、発色感度が低下する問題がある。その結果として定量性が損なわれことになる。三点目として、検体中のビリルビン、アスコルビン酸などの還元物質、または測定試薬中の反応に関わる酵素から持ち込まれる遷移金属により、検出物質が還元され褪色が起こるという問題がある。その結果として、測定値の正確性または精密性を損なうことになる。四点目として、色源体が試薬保存中に空気中の酸素または試薬中の酸化物により、非特異的に酸化され試薬ブランクが上昇するという問題がある。その結果として、測定の精密性が損なわれることになる。
【０００４】
これらの問題に対し、試薬のｐＨを７以上とする方法がある（例えば、特許文献１参照。）。また安定化剤として１−アリールセミカルバジドを添加する方法（例えば、特許文献２参照。）、シクロデキストリンおよびその修飾体を添加する方法（例えば、特許文献３および４参照。）、アミノスルホン酸化合物を添加する方法（例えば、特許文献５参照。）、非イオン界面活性剤又は両性界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献６参照。）、プロピレングリコールモノエチルエーテル等を添加する方法（例えば、特許文献参７照。）、γ−シクロデキストリン及び非イオン界面活性剤等を添加する方法（例えば、特許文献８参照。）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を添加する方法（例えば、特許文献９参照。）、膨潤性層状粘土鉱物を添加する方法（例えば、特許文献１０参照。）、ホウ酸又はホウ酸塩を添加する方法（例えば、特許文献１１参照。）、Ｂｉｃｉｎｅを添加する方法（例えば、特許文献１２参照。）、テトラゾリウム化合物を添加する方法（例えば、特許文献１３参照。）等がある。または水素供与体、カップラーを別々に処方し、かつペルオキシダーゼを含有していない方の試薬にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを処方する方法（例えば、特許文献１４参照。）等がある。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭５２−１５２２９０号公報
【特許文献２】
特開昭５３−１２６９９６号公報
【特許文献３】
特開昭５８−１８７８５８号公報
【特許文献４】
特開昭６０−１９４３６３号公報
【特許文献５】
特開昭６２−６４９５５号公報
【特許文献６】
特開平７−５１０９５号公報
【特許文献７】
特開平７−２３４２２１号公報
【特許文献８】
特開平８−８９２９１号公報
【特許文献９】
特開平９−１９２９６号公報
【特許文献１０】
特開平９−１８４８３６号公報
【特許文献１１】
特開平１１−４６７９５号公報
【特許文献１２】
特開２０００−９７９２７号公報
【特許文献１３】
特開２０００−２１０１００号公報
【特許文献１４】
特開昭６３−２４６６６５号公報
【０００６】
しかしながら、これらの方法では十分な効果が得られるに至っていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このことから、本発明が解決しようとする課題は測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度な測定法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることにより検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度化を達成することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化方法。
（２）試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする（１）の検出物質の安定化方法。
（３）試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする（１）の検出物質の安定化方法。
（４）測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化試薬。
（５）試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする（４）の検出物質の安定化試薬。
（６）試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする（４）の検出物質の安定化試薬。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定化」とは、検出物質の褪色を抑制すること、発色感度の低下を抑制するかまたは感度が向上すること、また色源体が非特異的に酸化または還元されることによる試薬ブランクの変動を低減することを意味する。
【００１０】
本発明の一実施態様として、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体等からなるクレアチニン測定試薬において、カリックスアレン誘導体を共存させることによる検出物質の安定化方法がある。また、ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体等からなる尿酸測定試薬において、カリックスアレン誘導体を共存させることによる検出物質の安定化方法がある。
【００１１】
本発明で用いるカリックスアレン誘導体とは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた「カリックスアレン」に親水性基を導入し水溶性としたものである。例えば、硫酸カリックス（４）アレン、硫酸カリックス（６）アレン、硫酸カリックス（８）アレンが市販されている。カリックスアレン誘導体の濃度としては特に限定されないが、検出物質の生成量または色源体の濃度などを考慮して設定され、反応液中で０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１２】
本発明で用いるカリックスアレン誘導体により、（１）検出物質の褪色を低減する。（２）検出物質の溶解性を向上させ、発色感度が上昇する。（３）検体中のビリルビン、アスコルビン酸などの還元物質の影響を低減する。（４）色源体の非特異的酸化による試薬ブランクの上昇を抑制する、等の効果が得られ、その結果として、測定の特異性、精密性を向上させることができる。
【００１３】
本発明の検出物質とは、光学的方法により検出可能な物質であり、加えて当該物質が酸化還元反応などにより生成する前の色源体も本発明の安定化の対象となる。このような検出物質としては例えばカプラーと水素供与体が酸化縮合することによって生成するキノン色素、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどの酸化発色色素、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンなどのロイコ体が酸化された色素、テトラゾリウム化合物の還元色素であるホルマザン、などが挙げられる。
【００１４】
色源体としては、水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、カップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。
【００１５】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
【００１６】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
【００１７】
本発明では、さらに界面活性剤を共存させることで、検出物質とカリックスアレン誘導体との相互作用により得られる効果を更に高めることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられ、検出物質の測定時、または色源体、カリックスアレン誘導体の存在する溶液中に添加することで更なる効果が得られる。
【００１８】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００１９】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２０】
本発明で用いる非イオン界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２１】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２２】
両性イオン界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２３】
また、これらの界面活性剤は単独または２種以上または非イオン性界面活性剤と両性イオン界面活性剤とを組み合わせて用いることができる。また、非イオン界面活性剤のＨＬＢは特に限定されないが、好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以下が検出物質の溶解性または検出物質とカリクスアレン誘導体との相互作用に対する影響が少ない点で好ましい。また、２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられるが、非イオン性界面活性剤の組み合わせの場合は各界面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ましい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。
中でも約１３が好ましい。本発明のカリックスアレン誘導体、検出物質またはその前駆体との混合方法は特に限定されず、カリックスアレン誘導体存在下、検出物質の測定の直前に混合してもよいし、あらかじめ検出物質の前駆体と混合して使用できる。
【００２４】
本発明では、さらに鉄錯体を共存させることで、検出物質とカリクスアレン誘導体との相互作用により得られる効果を更に高めることができる。鉄錯体としては、エチレンジアミン四酢酸鉄（ＩＩＩ）、塩化第一鉄（ＩＩＩ）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられ、検出物質の測定時に添加することで更なる効果が得られる。鉄錯体の濃度としては、反応液中で０．００５〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２５】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。
【００２６】
本発明において、防腐剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
【００２７】
本発明において、診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。クレアチニン測定試薬としては、一般にクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素が含有される。尿酸測定試薬としては、一般にウリカーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素が含有される。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記の尿酸測定試薬に、カリックスアレン（６）硫酸塩を試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とし、下記測定条件で、試料として精製水および尿酸１０ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、各々の吸光度より感度（尿酸１０ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を検討した。比較例として、カリックスアレン（６）硫酸塩に換えて、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、クラスターデキストリンを各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製した測定試薬およびカリックスアレン（６）硫酸塩を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００２９】
（試薬の調製）
下記組成からなる尿酸測定試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．１％
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
【００３０】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 ２７０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーション後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３１】
【表１】
【００３２】
結果 表１に示す。比較例に対し実施例では感度の向上が確認された。発色体の褪色が抑制されたものと考える。
【００３３】
（実施例２）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、カリックスアレン（６）硫酸塩、またはカリックスアレン（８）硫酸塩を各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とし、調製直後および３５℃、７日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。比較例として、カリックスアレン（６）硫酸塩等に換えて、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、クラスターデキストリンを各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製した測定試薬およびカリックスアレン（６）硫酸塩等を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００３４】
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３４１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２１） ３０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） ５０Ｕ／ｍＬ
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩 ０．０４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ３００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２０Ｕ／ｍＬ
【００３５】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３６】
【表２】
【００３７】
結果 表２に示す。比較例では３５℃、７日間保存後の試薬ブランクの上昇、感度の低下があるが、実施例では試薬ブランク、感度とも良好な安定性を示す。また、調製直後の感度は比較例に対し高くなっている。
【００３８】
（実施例３）
実施例２のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、カリックスアレン（８）硫酸塩を試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製し、第一試薬、第二試薬とも界面活性剤としてエマルゲン４２０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）、トリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸）を０．１％になるように添加し、実施例２に示す測定条件で測定した。試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。比較例として、カリックスアレン（８）硫酸塩等を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００３９】
【表３】
【００４０】
結果 表３に示す。界面活性剤添加による感度の向上は、比較例よりも実施例において顕著に認められる。界面活性剤によりカリックスアレン（８）硫酸塩添加効果が高められたものと考えられる。
【００４１】
（実施例４）
実施例２の調製直後の試薬（第一試薬、第二試薬とも）に各々トリトンＸ−１００を０．１％になるように添加し、実施例２に示す測定条件で、試料としてクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液の１０段階希釈系列を測定し、直線性を検討した。結果は図１に示すが、各直線性はクレアチニン最大濃度を１００％として相対感度で示した。
【００４２】
結果 図１に示す。比較例では直線性の湾曲傾向を認めるが、実施例では良好な直線性を示す。
【００４３】
（実施例５）
実施例２に示すクレアチニン測定試薬の第一試薬、第ニ試薬にトリトンＸ−１００を０．１％になるように添加し、第一試薬にカリックスアレン（６）硫酸塩またはカリックスアレン（８）硫酸塩を各々試薬中終濃度で０、０．５、１、２、４、８ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製し、第二試薬に鉄錯体としてフェロシアン化カリウムを０、４０ｍｇ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。実施例２に示す測定条件で、試料として市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ（国際試薬株式会社）を測定しその測定値を理論値（市販のクレアチニン測定試薬 ダイヤカラー・リキッドＣＲＥ−Ｓ（東洋紡製）で測定した時の測定値）に対する相対％を算出した。
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
結果 表４、５に示す。比較例では管理血清値は理論値に対し高めに回収されるが、実施例では回収率は良好化しする。これはカリックスアレン硫酸塩により非特異反応が低減され、フェロシアン化カリウムにより更に低減されることを意味する。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度な測定法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４における直線性の検討結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、血清、尿、血漿、唾液、髄液等の生体試料中の特定成分などの測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質を安定化する方法およびその試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体試料中の特定成分を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法として、例えばクレアチニンとクレアチニンアミドヒドロラーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼとの反応で生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの共存下、色源体と反応させ生成する発色体を検出物質として定量し、クレアチニン濃度を求める方法などがある。この場合、例えば水素供与体、カップラーを色源体として用いた場合は、これらの酸化カップリング反応により生成するキノン系色素が検出物質となる。しかし、これら検出物質には次のような問題がある。
【０００３】
まず、ペルオキシダーゼの反応が律速となり、過剰の過酸化水素が一時的にも生じる場合、既に生成した検出物質が過酸化水素により還元され褪色が起こるという問題がある。その結果として、測定値の正確性または精密性を損なうことになる。二点目として、検出物質の溶解性不良に起因し、特に検出物質の濃度が高くなるに従い、発色感度が低下する問題がある。その結果として定量性が損なわれことになる。三点目として、検体中のビリルビン、アスコルビン酸などの還元物質、または測定試薬中の反応に関わる酵素から持ち込まれる遷移金属により、検出物質が還元され褪色が起こるという問題がある。その結果として、測定値の正確性または精密性を損なうことになる。四点目として、色源体が試薬保存中に空気中の酸素または試薬中の酸化物により、非特異的に酸化され試薬ブランクが上昇するという問題がある。その結果として、測定の精密性が損なわれることになる。
【０００４】
これらの問題に対し、試薬のｐＨを７以上とする方法がある（例えば、特許文献１参照。）。また安定化剤として１−アリールセミカルバジドを添加する方法（例えば、特許文献２参照。）、シクロデキストリンおよびその修飾体を添加する方法（例えば、特許文献３および４参照。）、アミノスルホン酸化合物を添加する方法（例えば、特許文献５参照。）、非イオン界面活性剤又は両性界面活性剤を添加する方法（例えば、特許文献６参照。）、プロピレングリコールモノエチルエーテル等を添加する方法（例えば、特許文献参７照。）、γ−シクロデキストリン及び非イオン界面活性剤等を添加する方法（例えば、特許文献８参照。）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を添加する方法（例えば、特許文献９参照。）、膨潤性層状粘土鉱物を添加する方法（例えば、特許文献１０参照。）、ホウ酸又はホウ酸塩を添加する方法（例えば、特許文献１１参照。）、Ｂｉｃｉｎｅを添加する方法（例えば、特許文献１２参照。）、テトラゾリウム化合物を添加する方法（例えば、特許文献１３参照。）等がある。または水素供与体、カップラーを別々に処方し、かつペルオキシダーゼを含有していない方の試薬にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを処方する方法（例えば、特許文献１４参照。）等がある。
【０００５】
【特許文献１】
特開昭５２−１５２２９０号公報
【特許文献２】
特開昭５３−１２６９９６号公報
【特許文献３】
特開昭５８−１８７８５８号公報
【特許文献４】
特開昭６０−１９４３６３号公報
【特許文献５】
特開昭６２−６４９５５号公報
【特許文献６】
特開平７−５１０９５号公報
【特許文献７】
特開平７−２３４２２１号公報
【特許文献８】
特開平８−８９２９１号公報
【特許文献９】
特開平９−１９２９６号公報
【特許文献１０】
特開平９−１８４８３６号公報
【特許文献１１】
特開平１１−４６７９５号公報
【特許文献１２】
特開２０００−９７９２７号公報
【特許文献１３】
特開２０００−２１０１００号公報
【特許文献１４】
特開昭６３−２４６６６５号公報
【０００６】
しかしながら、これらの方法では十分な効果が得られるに至っていないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
このことから、本発明が解決しようとする課題は測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度な測定法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために種々検討した結果、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることにより検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度化を達成することを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
（１）測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化方法。
（２）試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする（１）の検出物質の安定化方法。
（３）試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする（１）の検出物質の安定化方法。
（４）測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化試薬。
（５）試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする（４）の検出物質の安定化試薬。
（６）試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする（４）の検出物質の安定化試薬。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明において「安定化」とは、検出物質の褪色を抑制すること、発色感度の低下を抑制するかまたは感度が向上すること、また色源体が非特異的に酸化または還元されることによる試薬ブランクの変動を低減することを意味する。
【００１０】
本発明の一実施態様として、クレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体等からなるクレアチニン測定試薬において、カリックスアレン誘導体を共存させることによる検出物質の安定化方法がある。また、ウリカーゼ、ペルオキシダーゼ、色源体等からなる尿酸測定試薬において、カリックスアレン誘導体を共存させることによる検出物質の安定化方法がある。
【００１１】
本発明で用いるカリックスアレン誘導体とは、フェノールを基本骨格とし、フェノールの４〜８分子をメチレン基で環状に重合させた「カリックスアレン」に親水性基を導入し水溶性としたものである。例えば、硫酸カリックス（４）アレン、硫酸カリックス（６）アレン、硫酸カリックス（８）アレンが市販されている。カリックスアレン誘導体の濃度としては特に限定されないが、検出物質の生成量または色源体の濃度などを考慮して設定され、反応液中で０．０５〜５ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．１〜２ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００１２】
本発明で用いるカリックスアレン誘導体により、（１）検出物質の褪色を低減する。（２）検出物質の溶解性を向上させ、発色感度が上昇する。（３）検体中のビリルビン、アスコルビン酸などの還元物質の影響を低減する。（４）色源体の非特異的酸化による試薬ブランクの上昇を抑制する、等の効果が得られ、その結果として、測定の特異性、精密性を向上させることができる。
【００１３】
本発明の検出物質とは、光学的方法により検出可能な物質であり、加えて当該物質が酸化還元反応などにより生成する前の色源体も本発明の安定化の対象となる。このような検出物質としては例えばカプラーと水素供与体が酸化縮合することによって生成するキノン色素、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどの酸化発色色素、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フェノチアジンなどのロイコ体が酸化された色素、テトラゾリウム化合物の還元色素であるホルマザン、などが挙げられる。
【００１４】
色源体としては、水素供与体として、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン等が挙げられる。また、カップラーとして４−アミノアンチピリン、ＭＢＴＨ、ＮＣＰ等が挙げられる。
【００１５】
また、ロイコ体としては、４，４’−ベンジリデンビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、４，４’−ビス［Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピルアミノ）−２，６−ジメチルフェニル］メタン、１−（エチルアミノチオカルボニル）−２−（３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、Ｎ−カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン塩、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩等が挙げられる。
【００１６】
また、テトラゾリウム塩としては、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム塩、２，５−ジフェニル−３−（１−ナフチル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス［２−（４−ニトロフェニル）−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリウム］塩、３，３’−［３，３’−ジメトキシ−（１，１’−ビフェニル）−４，４’−ジイル］−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、２−（４−ヨードフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム塩、３，３’−（１，１’−ビフェニル−４，４’−ジイル）−ビス（２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム）塩、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−テトラゾリウム塩等が挙げられる。
【００１７】
本発明では、さらに界面活性剤を共存させることで、検出物質とカリックスアレン誘導体との相互作用により得られる効果を更に高めることができる。界面活性剤としては、非イオン界面活性剤または／および両性イオン界面活性剤が好適に用いられ、検出物質の測定時、または色源体、カリックスアレン誘導体の存在する溶液中に添加することで更なる効果が得られる。
【００１８】
本発明で用いる非イオン界面活性剤としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル類として例えばエマルゲン１０４Ｐ、エマルゲン１０５、エマルゲン１０６、エマルゲン１０８、エマルゲン１０９Ｐ、エマルゲン１２０、エマルゲン１２３Ｐ、エマルゲン１４７、エマルゲン１３０Ｋ、ノニオンＫ−２０４、ノニオンＫ−２１５、ノニオンＫ−２２０、ノニオンＫ−２３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−４．２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−９ＥＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２１、ＮＩＫＫＯＬ ＢＬ−２５、ポリオキシエチレンセチルエーテル類として、エマルゲン２１０、エマルゲン２２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−５．５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−１５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２３、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−２５ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−３０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＣ−４０ＴＸ、ノニオンＰ−２０８、ノニオンＰ−２１０、ノニオンＰ−２１３、ポリオキシエチレンステアリルエーテル類として、エマルゲン３０６Ｐ、エマルゲン３２０Ｐ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−４、ＮＩＫＫＯＬ ＢＳ−２０、ノニオンＳ−２０６、ノニオンＳ−２０７、ノニオンＳ−２１５、ノニオンＳ−２２０、ポリオキシエチレンオレイルエーテル類としては、エマルゲン４０４、エマルゲン４０８、エマルゲン４０９Ｐ、エマルゲン４２０、エマルゲン４３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−１０ＴＸ、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＯ−５０、ノニオンＥ−２０６、ノニオンＥ−２１５、ノニオンＥ−２３０、ポリオキシエチレンベヘニルエーテル類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＢ−３０等が挙げられる。
【００１９】
また、ポリオキシエチレン２級アルキルエーテル類としては、エマルゲン７０７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−７、ＮＩＫＫＯＬ ＢＴ−９、アデカトールＳＯ−８０、アデカトールＳＯ−１０５、アデカトールＳＯ−１２０、アデカトールＳＯ−１３５、アデカトールＳＯ−１４５、アデカトールＳＯ−１６０、エマルゲン７０５、エマルゲン７０７、エマルゲン７０９等が挙げられる。ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル類としては、エマルゲン８１０、エマルゲン８４０Ｓ、エマルゲン９０９、エマルゲン９１０、エマルゲン９３０、エマルゲン９５０、トリトンＸ−１００、トリトンＸ−１１４、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−７．５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−１５、ＮＩＫＫＯＬ ＮＰ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＯＰ−３０、等が挙げられる。ポリオキシエチレンスチリルフェニルエーテル類としてはエマルゲンＡ６０、エマルゲンＡ９０、エマルゲンＢ６６等が挙げられる。オキシエチレン・オキシプロピレンブロックコポリマー類としては、エマルゲンＰＰ−１５０、エマルゲンＰＰ−２３０、エマルゲンＰＰ−２５０、エマルゲンＰＰ−２９０、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−３４、ＮＩＫＫＯＬ ＰＢＣ−４４、等が挙げられる。ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル類としては、エマレックスＤＡＰＥ０２０７、エマレックスＤＡＰＥ０２１０、エマレックスＤＡＰＥ０２１２、エマレックスＤＡＰＥ０２１５、エマレックスＤＡＰＥ０２２０、エマレックスＤＡＰＥ０２２０等が挙げられる。脂肪酸エステル類としては、レオドールＴＷ−Ｌ１２０、レオドールＴＷ−Ｌ１０６、レオドールＴＷ−Ｐ１２０、レオドールＴＷ−Ｓ１２０、レオドールＴＷ−Ｏ１２０、レオドール４６０、エマノーン１１１２、エマノーン３１１５、エマノーン３１７０、エマノーン３２９９、エマノーン３１３０
ポリオキシエチレンステロール類としては、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−１０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−２０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳ−３０、ＮＩＫＫＯＬ ＢＰＳＨ−２５、ＮＩＫＫＯＬ ＤＨＣ−３０等が挙げられる。その他には、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）コラミド、Ｎ，Ｎ−ビス（３−Ｄ−グルコノアミドプロピル）デオキシコラミド、ｎ−オクタノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルコアミド、シュークロースモノカプレート、シュークロースモノラウレート、シュークロースモノコレート、ジギトニン等が挙げられる。
【００２０】
本発明で用いる非イオン界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２１】
本発明で用いる両性イオン界面活性剤としては、例えばアルキルイミダゾリウムベタイン、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン、アルキルアラニン、アルキルアミンオキサイド、これらの誘導体等が挙げられる。これらのアンヒトール２０ＢＳ、アンヒトール２４Ｂ、アンヒトール８６Ｂ、アンヒトール２０Ｚ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、等が挙げられる。
【００２２】
両性イオン界面活性剤の濃度は特に限定されないが、反応液中で０．０１〜１０重量％、好ましくは０．１〜５重量％である。
【００２３】
また、これらの界面活性剤は単独または２種以上または非イオン性界面活性剤と両性イオン界面活性剤とを組み合わせて用いることができる。また、非イオン界面活性剤のＨＬＢは特に限定されないが、好ましくは単独でのＨＬＢが１５以下、さらには１４以下が検出物質の溶解性または検出物質とカリクスアレン誘導体との相互作用に対する影響が少ない点で好ましい。また、２種以上の活性化剤を組み合わせて用いられるが、非イオン性界面活性剤の組み合わせの場合は各界面活性剤の（ＨＬＢ）×（添加量）を界面活性剤の添加量の総和で割った総ＨＬＢが１２〜１４であるのが好ましい。さらには１２．５〜１３．５が好ましい。
中でも約１３が好ましい。本発明のカリックスアレン誘導体、検出物質またはその前駆体との混合方法は特に限定されず、カリックスアレン誘導体存在下、検出物質の測定の直前に混合してもよいし、あらかじめ検出物質の前駆体と混合して使用できる。
【００２４】
本発明では、さらに鉄錯体を共存させることで、検出物質とカリクスアレン誘導体との相互作用により得られる効果を更に高めることができる。鉄錯体としては、エチレンジアミン四酢酸鉄（ＩＩＩ）、塩化第一鉄（ＩＩＩ）、フェロシアン化カリウム、フェロシアン化ナトリウム等が挙げられ、検出物質の測定時に添加することで更なる効果が得られる。鉄錯体の濃度としては、反応液中で０．００５〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、好ましくは０．０１〜０．０５ｍｍｏｌ／Ｌである。
【００２５】
また、従来から用いられている緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液などが挙げられる。一方、ＧＯＯＤ緩衝液にはＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＯＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳなどが例示される。該緩衝液のｐＨは５〜９の範囲で調整される。さらには６〜８が好ましい。中でも６．５〜７．５が好ましい。
【００２６】
本発明において、防腐剤などを反応に影響を及ぼさない範囲で添加してもよい。防腐剤としては、アジ化物、キレート剤、抗生物質、抗菌剤などが挙げられる。
【００２７】
本発明において、診断用試薬として必要な他の試薬が含まれていてもよい。クレアチニン測定試薬としては、一般にクレアチンアミジノヒドロラーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ等の酵素が含有される。尿酸測定試薬としては、一般にウリカーゼ、ペルオキシダーゼ等の酵素が含有される。
【００２８】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は実施例により特に限定されるものではない。
（実施例１）
下記の尿酸測定試薬に、カリックスアレン（６）硫酸塩を試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とし、下記測定条件で、試料として精製水および尿酸１０ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、各々の吸光度より感度（尿酸１０ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を検討した。比較例として、カリックスアレン（６）硫酸塩に換えて、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、クラスターデキストリンを各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製した測定試薬およびカリックスアレン（６）硫酸塩を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００２９】
（試薬の調製）
下記組成からなる尿酸測定試薬をそれぞれ調製した。
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．０
ポリオキシプロピレン（２）ポリオキシエチレンデシルエーテル（エマレックスＤＡＰＥ０２０７：日本エマルジョン社製） ０．１％
ウリカーゼ（東洋紡社製ＵＡＯ−２１１） ０．３Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２Ｕ／ｍＬ
Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−２，５−ジメチルアニリン（同仁化学社製） ０．４ｇ／Ｌ
４−アミノアンチピリン ０．１ｇ／Ｌ
【００３０】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 ２７０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーション後、波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００３１】
【表１】
結果 表１に示す。比較例に対し実施例では感度の向上が確認された。発色体の褪色が抑制されたものと考える。
【００３３】
（実施例２）
下記のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、カリックスアレン（６）硫酸塩、またはカリックスアレン（８）硫酸塩を各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製して測定試薬とし、調製直後および３５℃、７日間保存後の試薬について下記測定条件で測定した。試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、試薬ブランク（精製水測定吸光度）および感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。比較例として、カリックスアレン（６）硫酸塩等に換えて、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、クラスターデキストリンを各々試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製した測定試薬およびカリックスアレン（６）硫酸塩等を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００３４】
（試薬の調製）
下記組成からなるクレアチニン測定試薬をそれぞれ調製した。
第一試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
アスコルビン酸オキシダーゼ（東洋紡社製ＡＳＯ−３１１） ５Ｕ／ｍＬ
ザルコシンオキシダーゼ（東洋紡社製ＳＡＯ−３４１） １０Ｕ／ｍＬ
クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＲＨ−２２１） ３０Ｕ／ｍＬ
カタラーゼ（東洋紡社製ＣＡＯ−５０９） ５０Ｕ／ｍＬ
１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン塩 ０．０４ｇ／Ｌ
第二試薬
ＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ ５０ｍＭ ｐＨ７．５
クレアチニンアミドヒドロラーゼ（東洋紡社製ＣＮＨ−３１１） ３００Ｕ／ｍＬ
ペルオキシダーゼ（東洋紡社製ＰＥＯ−３０１） ２０Ｕ／ｍＬ
【００３５】
（測定法）
日立７１７０形自動分析機を用いた。試料４μＬに第一試薬 １８０μＬ添加し３７℃にて５分間インキュベーションし第一反応とした。その後第二試薬を９０μＬ添加し５分間インキュベーションし第二反応とした。第一反応および第二反応の吸光度を液量補正した各吸光度の差をとる２ポイントエンド法で６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。
クレアチニン濃度未知試料のクレアチニン濃度の算出は、精製水および５ｍｇ／ｄＬクレアチニン水溶液の測定吸光度より算出して求めた。
【００３６】
【表２】
結果 表２に示す。比較例では３５℃、７日間保存後の試薬ブランクの上昇、感度の低下があるが、実施例では試薬ブランク、感度とも良好な安定性を示す。また、調製直後の感度は比較例に対し高くなっている。
【００３８】
（実施例３）
実施例２のクレアチニン測定試薬の第一試薬に、カリックスアレン（８）硫酸塩を試薬中終濃度で２ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製し、第一試薬、第二試薬とも界面活性剤としてエマルゲン４２０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル）、トリトンＸ−１００（ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル）、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］プロパンスルホン酸）を０．１％になるように添加し、実施例２に示す測定条件で測定した。試料としては精製水およびクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液を測定し、感度（クレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液測定吸光度より精製水測定吸光度を差し引いた吸光度）を求めた。比較例として、カリックスアレン（８）硫酸塩等を添加しない試薬（無添加）で同様の検討を行なった。
【００３９】
【表３】
結果 表３に示す。界面活性剤添加による感度の向上は、比較例よりも実施例において顕著に認められる。界面活性剤によりカリックスアレン（８）硫酸塩添加効果が高められたものと考えられる。
【００４１】
（実施例４）
実施例２の調製直後の試薬（第一試薬、第二試薬とも）に各々トリトンＸ−１００を０．１％になるように添加し、実施例２に示す測定条件で、試料としてクレアチニン５ｍｇ／ｄＬ水溶液の１０段階希釈系列を測定し、直線性を検討した。結果は図１に示すが、各直線性はクレアチニン最大濃度を１００％として相対感度で示した。
【００４２】
結果 図１に示す。比較例では直線性の湾曲傾向を認めるが、実施例では良好な直線性を示す。
【００４３】
（実施例５）
実施例２に示すクレアチニン測定試薬の第一試薬、第ニ試薬にトリトンＸ−１００を０．１％になるように添加し、第一試薬にカリックスアレン（６）硫酸塩またはカリックスアレン（８）硫酸塩を各々試薬中終濃度で０、０．５、１、２、４、８ｍｍｏｌ／Ｌになるように調製し、第二試薬に鉄錯体としてフェロシアン化カリウムを０、４０ｍｇ／Ｌになるように調製して測定試薬とした。実施例２に示す測定条件で、試料として市販管理血清ＱＡＰトロールＩＸ（国際試薬株式会社）を測定しその測定値を理論値（市販のクレアチニン測定試薬 ダイヤカラー・リキッドＣＲＥ−Ｓ（東洋紡製）で測定した時の測定値）に対する相対％を算出した。
【００４４】
【表４】
【表５】
結果 表４、５に示す。比較例では管理血清値は理論値に対し高めに回収されるが、実施例では回収率は良好化しする。これはカリックスアレン硫酸塩により非特異反応が低減され、フェロシアン化カリウムにより更に低減されることを意味する。
【００４７】
【発明の効果】
本発明により、測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、検出物質または色源体を安定化し、測定の正確性、精密性、定量性を向上させかつ高感度な測定法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例４における直線性の検討結果を示す。
Claims (6)
- 測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化方法。
- 試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする請求項１項記載の検出物質の安定化方法。
- 試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする請求項１項記載の検出物質の安定化方法。
- 測定対象物質を、当該物質の酸化還元反応の結果生成する検出物質を測定することにより測定する方法において、試薬中にカリックスアレン誘導体を共存させることを特徴とする検出物質の安定化試薬。
- 試薬中にさらに非イオン界面活性剤および／または両性イオン界面活性剤を共存させることを特徴とする請求項４項記載の検出物質の安定化試薬。
- 試薬中にさらに鉄錯体を共存させることを特徴とする請求項４項記載の検出物質の安定化試薬。
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-
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- 2003-04-25 JP JP2003120990A patent/JP4296480B2/ja not_active Expired - Lifetime
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