CN113358639B - 一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用，属于化合物检测技术领域。本发明通过研究发现，琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以将琥珀酰辅酶A和乙酸根作为底物，形成乙酰辅酶A和琥珀酸，后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下氧化，从而生成烯酰基辅酶A和H2O2。继而利用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定H2O2，从而间接测定出乙酸含量，该方法检测灵敏度较高，同时检测成本低，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用
技术领域
本发明属于化合物检测技术领域，具体涉及一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
乙酸是大宗化工产品，是重要的有机酸之一，主要可用于生产乙酸乙烯、乙酸酐、乙酸酯和乙酸纤维素等，是农药、医药、织物印染、合成纤维的重要原料之一。如聚乙酸乙烯酯可用来制备薄膜和粘合剂，也是合成纤维维纶的原料。乙酸还可用来合成乙酐、丙二酸二乙酯、乙酰乙酸乙酯、卤代乙酸等，可制造药物如阿司匹林、还可以用于生产乙酸盐等。乙酸还是优良的有机溶剂，在化工、轻纺、塑料、医疗、橡胶、染料以及油漆工业等众多领域有着广泛的应用。
在食品工业中，乙酸可用作酸化剂，增香剂和香料。用水将乙酸稀释至4-5％浓度，再添加各种调味剂，可制成食用醋。作为酸味剂，乙酸存在于罐头、冷饮(如葡萄酒、果汁、酸奶、啤酒等)、糖果、焙烤食品、硬质干酪、布丁类、胶媒糖、调味品等。在生物实验中，实验所用生物样品中多含乙酸。此外，乙酸还具有防腐剂的作用。
在上述应用过程中，需要对乙酸进行含量检测，从而监测并控制乙酸含量。目前，常用的乙酸根测定方法通常选用离子色谱仪等进行离子检测，虽然具有测量准确等优点，但离子色谱仪等设备价格高昂，难以大规模推广使用。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用。本发明通过研究发现，琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以将琥珀酰辅酶A和乙酸根作为底物，形成乙酰辅酶A和琥珀酸，后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下氧化，从而生成烯酰基辅酶A和H2O2。继而利用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定H2O2，从而间接测定出乙酸含量，该方法检测灵敏度较高，同时极大降低检测成本，具有良好的实际应用之价值。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶在乙酸根检测中的应用。
在本发明的一个具体实施方式中，所述琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以采用基因工程手段获得，具体包括：通过从醋酸杆菌中克隆获得编码琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶的基因，将上述基因与表达载体结合，导入宿主内表达即得。
本发明的第二个方面，提供一种基于酶联显色法检测乙酸根的产品，所述产品至少包括琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶。
所述产品还包括用于检测H2O2的产品；所述用于检测H2O2的产品可以使用现有已知产品，在本发明的一个具体实施方式中，所述用于检测H2O2的产品基于分光光度法的过氧化氢含量检测试剂盒。
上述基于酶联显色法检测乙酸根的产品可以是检测试剂盒。
本发明的第三个方面，提供一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法，所述方法包括：
向待测样品中加入琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶，产生H2O2，通过对H2O2进行检测进而间接测定乙酸根含量。
检测过程反应原理如下：
琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶(succinyl-CoA:acetate CoA-transferase,aarC)可以将琥珀酰辅酶A(succinyl-CoA)和乙酸根(acetate)作为底物，形成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和琥珀酸(succinate)。
succinyl-CoA+acetate＝acetyl-CoA+succinate
在该反应中，aarC能够将琥珀酰辅酶A转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)实际上是激活了的乙酸，由乙酰基(CH3CO-)与辅酶A的巯基以高能的硫酯键相连。
后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下(acyl–CoAOXIDASE,ACOD]氧化，从而生成烯酰基辅酶A(dehydroacyl-CoA)和H2O2。
acetyl-CoA+O2＝trans-2,3-dehydroacyl-CoA+H2O2
然后H2O2在过氧化物酶(POD)的催化下与N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)和4-氨基安替比林(4-APP)反应生成有色底物。有色底物在546nm处具有最大吸收峰。测量546nm处的OD值并间接计算乙酸含量
2H2O2+4-APP+TOOS＝Indamine(有色底物)+3H2O
本发明的第四个方面，提供上述检测产品和/或方法在乙酸根检测中的应用。
所述应用领域包括但不限于食品、化工、轻纺、塑料、医疗、橡胶、染料、油漆等领域。
上述一个或多个技术方案的有益效果：
上述技术方案首次提供一种基于酶联显色法检测乙酸根的方法，经研究发现，琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以将琥珀酰辅酶A和乙酸根作为底物，形成乙酰辅酶A和琥珀酸，后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下氧化，从而生成烯酰基辅酶A和H2O2。继而利用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定H2O2，从而间接测定出乙酸含量，该方法检测灵敏度较高，同时极大降低检测成本，因此具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。
如前所述，目前常用的乙酸根测定方法通常选用离子色谱仪等进行离子检测，虽然具有测量准确等优点，但离子色谱仪等设备价格高昂，难以大规模推广使用。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶在乙酸根检测中的应用。
其中，琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以将琥珀酰辅酶A和乙酸根作为底物，形成乙酰辅酶A和琥珀酸，后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下氧化，从而生成烯酰基辅酶A和H2O2。继而利用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定H2O2，从而间接测定出乙酸含量。
在本发明的一个具体实施方式中，所述琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶可以采用基因工程手段获得，具体包括：通过从醋酸杆菌中克隆获得编码琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶的基因，将上述基因与表达载体结合，导入宿主内表达即得。
在本发明的一个具体实施方式中，所述表达载体可以为表达载体为病毒载体、质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、F黏粒、噬菌体或人工染色体中的任意一种或多种；病毒载体可包括腺病毒载体、逆转录病毒载体或腺伴随病毒载体，人工染色体包括细菌人工染色体(BAC)、噬菌体P1衍生的载体(PAC)、酵母人工染色体(YAC)或哺乳动物人工染色体(MAC)；进一步优选为质粒；在本发明的一个具体实施方式中，选用的表达载体为pET-30a质粒。
在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主包括但不限于细菌、真菌和真核细胞，进一步选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉；更进一步优选为大肠杆菌Rosetta。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种基于酶联显色法检测乙酸根的产品，所述产品至少包括琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶。
在本发明的一个具体实施方式中，所述产品还包括用于检测H2O2的产品；所述用于检测H2O2的产品可以使用现有已知产品，在本发明的一个具体实施方式中，所述用于检测H2O2的产品基于分光光度法的过氧化氢含量检测试剂盒。
在本发明的一个具体实施方式中，上述基于酶联显色法检测乙酸根的产品可以是检测试剂盒。
在本发明的一个具体实施方式中，所述检测试剂盒包括试剂A和试剂B；
其中，所述试剂A包括aarC、succinyl-CoA、4-APP、MgCl2、NaCl、KCl和Tris-HCl缓冲液；
所述试剂B包括TOOS、POD、ACOD、Triton X-100和Tris-HCl缓冲液。
所述检测试剂盒还可以包括标准品。
在本发明的一个具体实施方式中，提供一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法，所述方法包括采用上述基于酶联显色法检测乙酸根的产品进行检测。
在本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法包括：向待测样品中加入琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶，产生H2O2，通过对H2O2进行检测进而间接测定乙酸根含量。
其中，对H2O2进行检测可采用现有技术中常用的检测方法，在本发明的一个具体实施方式中，可采用基于分光光度法的过氧化氢含量检测试剂盒进行检测。
检测过程反应原理如下：
琥珀酰辅酶A:乙酸CoA转移酶(succinyl-CoA:acetate CoA-transferase,aarC)可以将琥珀酰辅酶A(succinyl-CoA)和乙酸根(acetate)作为底物，形成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)和琥珀酸(succinate)。
succinyl-CoA+acetate＝acetyl-CoA+succinate
在该反应中，aarC能够将琥珀酰辅酶A转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A(acetyl-CoA)实际上是激活了的乙酸，由乙酰基(CH3CO-)与辅酶A的巯基以高能的硫酯键相连。
后续将乙酰辅酶A在酰基辅酶A氧化酶作用下(acetyl-CoA-oxidase,ACOD]氧化，从而生成烯酰基辅酶A(dehydroacyl-CoA)和H2O2。
acetyl-CoA+O2＝trans-2,3-dehydroacyl-CoA+H2O2
因此可以利用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定H2O2，进而间接测定出乙酸含量。
在本发明的一个具体实施方式中，提供上述检测产品和/或方法在乙酸根检测中的应用。
所述应用领域包括但不限于食品、化工、轻纺、塑料、医疗、橡胶、染料、油漆等领域。
其中，所述食品包括但不限于葡萄酒、果汁、醋、酱汁、啤酒、硬质干酪、蛋黄酱或酸奶。
需要说明的是，当待测物为固体时，需要将固体样品在蒸馏水中进行粉碎、匀浆操作，使固体样品最终呈现液态方可进行测定；进一步的，将制备得到的匀浆液进行过滤后再进行测定。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
琥珀酸辅酶A:乙酸辅酶A转移酶(succinyl-CoA:acetate CoA-transferase,aarC)的制备:
1、aarC基因的全长克隆
从NCBI里获得醋酸杆菌(Acetobacter aceti)aarC基因的编码区序列(AccessionNo.D13291)，设计了一对基因特异性引物(aarC F，aarC R)。提取醋酸杆菌的基因组DNA后，利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增出该基因的全长序列。
PCR反应体系如下：引物(10μmol·L-1)各为3μL，2x Besttaq Master Mix(AppliedBiological Materials Inc.)为25μL，cDNA为0.3μL，ddH2O为18.7μL。PCR程序为：94℃3min；94℃10s，56℃45s，72℃1min，10个循环；94℃10s，53℃45s，72℃1min，10个循环；94℃10s，49℃45s，72℃1min，15个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，从而判断目的条带是否符合预期。
AarC基因扩增和表达所用引物
Figure BDA0003115328160000061
2.aarC生物信息学分析
aarC生物信息学分析以确定表达的可行性。
491个AA
等电点：6.82
分子量：53456.42
无信号肽
无跨膜区
亲水性
不存在二硫键
3、aarC的原核表达载体构建
利用Gel Extraction Kit(OMEGA bio-tek)将得到的PCR产物进行纯化回收，再通过Pro Ligation-Free Cloning Kit(abm)将纯化PCR产物与载体pET-30a(Novagen公司)连接，反应体系见YYY，获得pET30a-AarC的重组质粒。将含pET-30a-aarC的重组质粒转入大肠杆菌DH5ɑ(TransGen Biotech公司)中，挑选5-10个单菌落并接种于含有卡那霉素(BBILife Sciences公司)的LB肉汤(Hopebio公司)。使用rTaq试剂(TaKaRa公司)和载体上引物(T7P)、载体下引物(T7T)进行菌液PCR，鉴定为阳性重组子。菌液PCR体系为：T7P(8mmol·L-1)为2μL，T7T(8mmol·L-1)为2μL，rTaq为0.25μL，dNTP(2.5mmol·L-1)为4μL，10×Buffer为5μL，菌液为0.5μL，ddH2O为36.25μL。
Figure BDA0003115328160000071
4、aarC蛋白重组表达
将鉴定序列正确的重组质粒经Plasmid Mini KitⅠ(OMEGA bio-tek)提取后转入大肠杆菌Rosetta(TransGen Biotech公司)中。活化的种子按1：100(v/v)的比例接种于诱导培养基，在37℃、180rpm下诱导培养，待OD600为0.4-0.6时，在培养基中加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，终浓度0.5mmol·L-1)诱导表达4h。5000×g、5min收集细菌后用磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.2)清洗3遍后重悬。破碎细胞后10000×g离心5min收集沉淀包涵体蛋白。沉淀包涵体蛋白先用Buffer A(5mM EDTA,50mM Tris-HCL)清洗2次，再用Buffer B(5mMEDTA,50mM Tris-HCL,2M尿素)清洗1次，最后用Buffer C(10mM Tris-HCL,0.1M NaH2PO4,8M尿素)溶解。采用25kDa透析袋(YEASEN公司)去除溶解蛋白质溶解液中的各种盐离子，并利用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对目的蛋白检测和分离，用SDS-PAGE蛋白胶染液(睿博兴科公司)进行蛋白染色。按照Bradford蛋白定量试剂盒(BIOMIGA公司)的方法检测目的重组蛋白的浓度。
5.蛋白表达量
PAGE电泳结果表明纯化后的蛋白大小与预测的大小一致，Bradford法测定的aarC蛋白的表达量为2.6g/L。
测定食醋中的乙酸含量
试剂与配方
Figure BDA0003115328160000081
Figure BDA0003115328160000091
操作步骤
1.吸取4μL超纯水，加入200μL试剂A，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A1空白；加入50μL试剂B，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A2空白；△A空白＝A2空白-A1空白
2.吸取4μL标准品，加入200μL试剂A，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A1标准品；加入50μL试剂B，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A2标准品；△A标准品＝A2标准品-A1标准品
3.吸取4μL样品(用NaOH中和，稀释200倍)，加入200μL试剂A，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A1样品；加入50μL试剂B，混匀后37℃孵育5min，读取546nm处的吸光值，记作A2样品；△A样品＝A2样品-A1样品
4.样品乙酸含量＝[(△A样品-△A空白)/(△A标准品-△A空白)]×标准品浓度＝4.005mM
5.即食醋中乙酸浓度为801mM，约48.06g/L。食品安全国家标准食醋(GB2719-2018)中规定食醋中乙酸含量不低于35g/L，由此可见，我们检测的某品牌的食醋符合国家标准。
6.准确度
检验方法的准确度可采用加标回收评估法。国标中对加标回收率的定义为：仪器通过分别测定加入标准溶液前后的实际水样得到的增量相对于加入已知量的百分率。我们选了低、中、高三个浓度梯度计算了加标回收率，结果如下表所示：
Figure BDA0003115328160000101
7.方法的精密度
精密度采用相对标准偏差(RSD,relative standard deviation)进行评价。分别测定0.00,0.01,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28mM NaAC标准液显色吸光值，再分别代入标准曲线中得出其浓度值，计算其均值、标准差及相对标准偏差(RSD)以评估其精密度，结果如下：
Figure BDA0003115328160000102
该方法在乙酸含量为0.01mM时RSD依然小于10％，具有很高的精密度；加标回收率在98～114％，具有很高的准确度；检出下限为0.01mM。因此该方法能够满足水样中乙酸根的分析测定要求。
实际应用
(a)葡萄酒中乙酸的测定。
①对于白葡萄酒，在分析中需使用0.10mL，对于酸含量低的样品可使用2.0mL。
②若红葡萄酒中乙酸含量约为0.2g乙酸/升，使用0.10mL样品，在测定中不脱色。
若红葡萄酒中乙酸含量少于0.1g乙酸/升，对每10mL样品中添加0.2g PVPP并搅拌5min使其脱色。用Whatman No.1滤纸过滤一份样品，并将其pH值调节至约7.4。调整体积是原始样品体积的两倍。用在测定中最多使用2.0mL样品，允许对样品进行稀释，但请注意，在稀释后需按比例计算出乙酸对应含量。
当使用大量样品时，葡萄酒样品中较高的酒精浓度可能会延缓用于测定乙酸盐含量的酶的活性。在这种情况下，增加测定的温育时间到20min，然后进行吸光度的测量值以确认反应已完成。通常，以1：5的比例稀释体积为0.1mL的样品最佳。
(b)果汁中乙酸的测定。
①含高浓度乙酸的果汁(约0.3g/L)，用等体积的水稀释待测样品，取0.1mL进行测定。如果需要大量样品，请在分析前将溶液的pH值调整到大约7.4。
②有色果汁应先进行脱色。使用0.10至2.00mL样品进行分析(如果需要更大的体积，则调节至pH 7.4)。通常，无需稀释，样品体积为0.1mL最佳。
(c)测定醋中的乙酸。
根据用于测定的稀释表稀释样品。
通常，1：500的稀释度和0.1mL的样品量最优。
(d)测定酸调味料和酱汁中的乙酸。
将固体与液体组分分开。向40mL水中加入1g样品，并将体积调节至100mL。存放在4℃下溶解20min即可分离出脂肪。过滤样品中的水分，弃去前几mL。如果需要，可根据稀释表稀释一份滤液。通常不需要稀释，样品使用量为0.1mL最佳。
(e)啤酒中乙酸的测定。
通过过滤或用玻璃棒搅拌5min对啤酒进行脱气，样品无需稀释。
通常，使用未经稀释的0.2mL的样品进行分析最佳。
(f)测定硬质干酪中的乙酸。
准确称量约2克奶酪碎放入100mL容量瓶中，并加入60mL蒸馏水。在大约60℃下培养20min，并间歇摇动。冷却烧瓶至20-25℃，并用蒸馏水填充至标记处。将烧瓶存放在4℃放置30-60min，然后通过Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤一份溶液，使用上清液进行分析。
通常，使用未经稀释的0.2mL样品最佳。
(g)测定蛋黄酱或酸奶中的乙酸。
准确称量约5g样品倒入100mL容量瓶中，并加入50mL蒸馏水。在50-60℃水浴中加热，并间接摇动20min。冷却烧瓶至大约20℃并用蒸馏水调节至标记处。将烧瓶在冰箱中放置30min。通过Whatman GF/A玻璃纤维滤纸过滤，并使用澄清或略混浊的溶液进行测定。
通常，使用未经稀释的0.1mL样品最佳。
(h)测定生物样品中的乙酸。
如有必要，可将生物样品在80℃下加热20min，至使任何可能干扰测定的酶变性。过滤后，使用澄清的上清液进行测定，如果需要，可对上清液进行稀释。
通常，使用未经稀释的0.2mL样品最佳。
注意事项：
待测样品应为无色透明(略带颜色也可)且大约呈中性的液体样品。若样品存在以下问题，应按照相应方法去除后再行测定。
1、酸性样品：
若待测样品呈酸性(例如葡萄酒或果汁)，应用2M NaOH调至pH值约为7.4并将溶液在室温下孵育30分钟，待酸碱中和反应充分反应后方可进行测定。
2、含有大量二氧化碳：
若待测样品中含有大量二氧化碳(例如啤酒)，应用2M NaOH缓慢调制pH值约为7.4，并将溶液在室温下孵育30分钟，待酸碱中和反应充分反应后方可进行测定。
3、有色样品
方法一：将待测样品进行稀释，使溶液呈现略带颜色或无色后进行测定。
方法二：在待测样品中加入0.2克聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)/10mL，然后通过GEWhatman 1号定性滤纸进行过滤后方可进行测定。
4、固体样品：
将待测固体样品在蒸馏水中进行粉碎、匀浆操作，使固体样品最终呈现液态方可进行测定。必要时可将匀浆液进行过滤后再进行测定。
5、含脂肪的样品：
将待测样品放到温度高于脂肪熔点的热水中，一段时间后将温度调至室温并用蒸馏水将溶液体积补充至样品初始体积。后将样品放在冰上或冰箱中存放15-30分钟。过滤并丢弃前几mL滤液，使用澄清的上清液(可能是稍微乳白色)用于测定。
6、含有蛋白质的样品
对于高蛋白样品(酸乳、冰激凌、奶制品、豆腐等)应当先采用Carrez法预处理。具体方法如下：
将适量待测样品溶于50mL纯水中，可以采用超声破碎等手段加速溶解，依次加入5mL Carrez sol.I溶液、5mL Carrez sol.II溶液和10mL NaOH溶液(100mM)，每次添加都要充分混合，然后定容至100mL，0.45μm滤膜过滤，滤出液用于测定。
Carrez试剂:
①Carrez sol.I溶液：在100mL蒸馏水中溶解3.60g三水合六氰合铁(Ⅱ)酸钾(K4[Fe(CN)6]·3H2O)。室温下保存。
②Carrez sol.II溶液：在100mL蒸馏水中溶解7.20g七水合硫酸锌(ZnSO4·7H2O)。室温下保存。
③100mmol·L-1氢氧化钠溶液：在1L蒸馏水中溶解4g氢氧化钠(NaOH)。室温下保存。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东大学
<120> 一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法及其应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> aarC F
<400> 1
aaggccatgg ctgatatgtc cggcagaaac cgcat 35
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> aarC R
<400> 2
tggtggtggt ggtgtgatgg gagcatggtg cc 32
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> T7P
<400> 3
taatacgact cactataggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> T7T
<400> 4
tagttattgc tcagcggtgg 20

Claims (19)

1.琥珀酰辅酶A: 乙酸CoA转移酶在乙酸根检测中的应用，其特征在于，所述琥珀酰辅酶A: 乙酸CoA转移酶采用基因工程手段获得，具体包括：通过从醋酸杆菌中克隆获得编码琥珀酰辅酶A: 乙酸CoA转移酶的基因，将上述基因与表达载体结合，导入宿主内表达即得。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述表达载体为病毒载体、质粒或人工染色体中的任意一种或多种。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述表达载体为质粒。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述表达载体为pET-30a质粒。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述宿主包括细菌和真核细胞。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主选自埃希氏大肠杆菌、芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、里氏木霉和草酸青霉。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述埃希氏大肠杆菌为大肠杆菌Rosetta。
8.一种基于酶联显色法检测乙酸根的产品，其特征在于，所述产品至少包括琥珀酰辅酶A: 乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶；
所述产品还包括用于检测H2O2的产品。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于，所述用于检测H2O2的产品为基于分光光度法的过氧化氢含量检测试剂盒。
10.如权利要求8所述产品，其特征在于，所述基于酶联显色法检测乙酸根的产品为检测试剂盒。
11.如权利要求10所述产品，其特征在于，所述检测试剂盒包括试剂A和试剂B；
其中，所述试剂A包括aarC、succinyl-CoA、4-APP、MgCl2、NaCl、KCl和Tris-HCl缓冲液；
所述试剂B包括TOOS、POD、ACOD、Triton X-100和Tris-HCl缓冲液；
所述检测试剂盒还包括标准品。
12.一种基于酶联显色法检测乙酸根含量的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求8-11任一项所述基于酶联显色法检测乙酸根的产品进行检测。
13.如权利要求12所述方法，其特征在于，所述检测方法包括：
向待测样品中加入琥珀酰辅酶A: 乙酸CoA转移酶、琥珀酰辅酶A和酰基辅酶A氧化酶，产生H2O2，通过对H2O2进行检测进而间接测定乙酸根含量。
14.如权利要求 13所述方法，其特征在于，所述对H2O2进行检测采用基于分光光度法的过氧化氢含量检测试剂盒进行检测。
15.权利要求8-11任一项所述产品或权利要求12-14任一项所述方法在乙酸根检测中的应用。
16.如权利要求15所述应用，其特征在于，所述应用领域包括食品、轻纺、塑料、医疗、橡胶、染料、油漆领域。
17.如权利要求16所述应用，其特征在于，所述食品包括葡萄酒、果汁、醋、啤酒、硬质干酪、蛋黄酱或酸奶。
18.如权利要求15所述应用，其特征在于，当待测物为固体时，需要将固体样品在蒸馏水中进行粉碎、匀浆操作，使固体样品最终呈现液态后进行测定。
19.如权利要求18所述应用，其特征在于，将制备得到的匀浆液进行过滤后再进行测定。
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