ES2298155T3 - Metodo para la monitorizacion de un analito utilizando un biosensor electroquimico que puede desconectarse al aplicar un potencial electrico. - Google Patents
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Abstract
Un método para monitorizar la concentración de analito en un fluido biológico mediante la utilización de un sensor, y este método comprende los pasos de: proporcionar un sensor que comprende un volumen de retención de un medio hidrofílico, formándose este volumen de retención para retener una cantidad de analito que es proporcional a la concentración de analito en un fluido biológico que está en contacto con el sensor, un recinto para dicho volumen de retención de analito, estando el recinto definido al menos en parte por una pared que comprende un área de una membrana permeable al analito (20, 220) con un primer lado en contacto con el medio hidrofílico, un electrodo que está en contacto con el medio hidrofílico, una enzima rédox que está en contacto con el medio, y un mediador de transferencia electrónica para facilitar la transferencia de electrones entre la enzima y los electrodos, siendo la enzima sustancialmente incapaz de transferir electrones a o a partir de componentes del fluido biológico diferentes a dicho analito, poner en contacto el fluido biológico con el sensor y, a intervalos, aplicar un potencial al electrodo suficiente para oxidar el mediador electrónico y detectar la corriente a través de dicho electrodo como una función de la duración del potencial aplicado, manteniendo el potencial de oxidación del mediador aplicado al menos durante un periodo de tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de la corriente a lo largo del tiempo en el electrodo, y correlacionar el flujo de corriente con el flujo de corriente de concentraciones conocidas de dicho analito en el medio de retención, en el que el método además comprende el paso de aplicar en el electrodo un potencial suficiente para reducir la forma oxidada del mediador electrónico.
Description
Método para la monitorización de un analito
utilizando un biosensor electroquímico que puede desconectarse al
aplicar un potencial eléctrico.
Esta invención está relacionada con un método
para utilizar un sensor para la detección de la presencia o
cantidad de un analito en un fluido biológico. Más concretamente,
esta descripción está dirigida a un sensor particularmente adaptado
para su uso permanente o implantado. Las concentraciones de analito
se miden de forma electroquímica en un volumen retenido de
detección contenido de un medio permeable al analito opcionalmente
separado del fluido biológico con una membrana semipermeable.
Se ha dedicado un esfuerzo significativo a la
investigación y desarrollo dirigidos a conseguir sensores
electroquímicos capaces de detectar la presencia y/o cantidad de
analitos biológicamente significativos. Muchos, si no la mayoría de
tales dispositivos sensores de analito están en forma de una tira de
prueba que comprende un espacio contenedor del fluido de prueba
pretratado con una composición de detección dependiente del analito
y electrodos para poner en contacto con el fluido de prueba
liberado en el espacio contenedor del fluido de prueba. Los
conductores eléctricos se extienden de los electrodos a un área de
la tira de prueba que se conecta con un dispositivo de lectura del
sensor preprogramado portátil o de sobremesa. Típicamente un fluido
biológico se libera al área o volumen de prueba y el dispositivo de
lectura del sensor se programa para que aplique un potencial
predeterminado a los electrodos tras un periodo predeterminado de
tiempo tras la liberación de la muestra de fluido al espacio
contenedor de la muestra. El flujo de corriente se mide entonces en
respuesta a dicho potencial aplicado para proporcionar una
indicación de la presencia y/o concentración del analito diana.
Algunos de tales sensores electroquímicos se
construyen de forma que se evita el contacto directo del fluido de
muestra con los electrodos cubriendo los electrodos con una membrana
semipermeable o un material con matriz de gel, que es insoluble en
el medio de prueba y permeable al menos al analito de interés cuando
se pone en contacto con dicho medio de prueba.
Existe una necesidad continua de desarrollar
sensores factibles comercialmente y de uso múltiple/continuo para
analitos biológicamente significativos. En particular, existe la
necesidad de desarrollar sensores biológicos que puedan implantarse
o inyectarse en un paciente durante periodos que oscilen de varias
horas hasta varias semanas, meses o años, y estén diseñados para
proporcionar resultados precisos sin su extracción o recalibración
para compensar cambios en las propiedades de difusión de los
componentes de la membrana o pérdidas en la actividad enzimática
y/o elementos mediadores electrónicos. Tales sensores encontrarían
aplicación como componentes de órganos artificiales, por ejemplo un
páncreas artificial, que requieren la monitorización continua y/o
regular de los niveles de glucosa del paciente. Tales dispositivos
también pueden encontrar su uso como sensores reutilizables para la
medida de concentraciones de analito en fluidos corporales in
vitro, como las situaciones analíticas que se encuentran en los
laboratorios comerciales que realizan análisis en muestras de fluido
de pacientes.
Existen problemas concretos que se presentan en
el diseño y construcción de sensores biológicos que puedan
utilizarse de forma repetitiva in vitro y/o en uso continuo
in vivo. Además, es inherente a tales requerimientos
funcionales la condición de que el componente químico funcional del
sensor esté confinado, es decir no se libere del sensor al fluido
de muestra durante la utilización repetitiva y/o continua. La
retención de los componentes químicos/electroquímicos
"activos" del biosensor puede conseguirse mediante una de
varias técnicas, sola o en combinación. Así los componentes activos
pueden inmovilizarse, por ejemplo, mediante enlaces covalentes a
componentes no filtrables del biosensor o confinando los componentes
biológicamente/eléctricamente activos en una zona o volumen de
prueba mediante una membrana permeable al menos al analito, pero no
a los enzimas, coenzimas y/o mediadores electrónicos contenidos y
opcionalmente unidos de forma covalente.
Los biosensores implantables y/o reutilizables
se diseñan típicamente para retener los componentes químicos
activos dependientes del sensor en una matriz hidrofílica en un
volumen de retención del analito. Las especies electroquímicas
activas que cooperan en la respuesta del sensor a un potencial
aplicado para proporcionar una señal de flujo de corriente
proporcional a la concentración de analito difundidas al volumen de
retención, opcionalmente pueden estar covalentemente unidas a
componentes no filtrables del volumen de retención, lo que incluye,
pero no se limita a, un electrodo del sistema de electrodos, una
pared de la porción contenedora del sensor que define, al menos en
parte, el volumen de retención, microesferas u otros sólidos
microparticulados contenidos en el volumen de retención, al volumen
de retención que contacta con el lado de una membrana, o
componentes poliméricos de la matriz del volumen de retención.
Alternativamente el(los) enzima(s), el(los)
cofactor(es) de enzima(s) y el(los)
mediador(es) electrónico(s) puede seleccionarse para
que tengan un peso molecular suficientemente elevado como para
impedir cualquier difusión sustancial de tales componentes del
volumen de retención al fluido biológico a analizar.
En un aspecto de esta descripción el medio del
volumen de retención, alternativamente denominado el "medio del
volumen de eliminación" está en contacto con el sistema de
electrodos, que comprende un electrodo capaz de recibir electrones
o ceder electrones al(a las) enzima(s) a través del
(de los) mediador(es) electrónico(s). Los elementos
conductores se extienden del electrodo a un punto en el dispositivo
que permite la comunicación eléctrica del electrodo con un
controlador programable. El controlador puede programarse para
aplicar una secuencia de potencial predeterminada al sistema de
electrodos, lo que incluye un potencial variable que incluye un
potencial de oxidación del mediador o potencial de reducción del
mediador, ancho de pulso variable e intervalos de pulso variable.
El controlador también es capaz de detectar la respuesta de flujo de
corriente a potencial(es) aplicado(s) al sistema de
electrodos y de comparar tales datos con los datos control
previamente obtenidos para dicho sistema para calcular e informar
de las concentraciones de analito en la muestra biológica a analizar
y, opcionalmente, utilizar tales datos para monitorizar el estado
de funcionamiento del dispositivo y utilizarlos para modificar
entonces el protocolo existente de secuencia de potencial para
optimizar el funcionamiento del dispositivo. Así, por ejemplo, el
control del sensor puede modificarse periódicamente para ajustar las
diferencias en la eficiencia de la difusión del analito a través de
la membrana y/o cambios en la concentración del mediador
electrónico activo y/o el(los) componente(s)
enzimático(s) del dispositivo sin utilizar las técnicas de
recalibración clásicas.
En una realización de la descripción el volumen
de retención es definido o determinado, al menos en parte, por una
membrana permeable al analito y la proporción entre el volumen de
retención y el área de la superficie de la membrana semipermeable
que define este volumen, al menos en parte, es inferior a 2 mm, más
preferiblemente inferior a 1 mm. Son preferibles las proporciones
bajas entre volumen y área ya que mejoran la tasa de equilibrio
difusional entre el fluido a analizar y el medio del volumen de
retención, y por lo tanto minimizan el periodo refractario (periodo
de recuperación) del sensor.
En una realización preferible de la descripción
el componente enzimático se selecciona de forma que es
sustancialmente incapaz de transferir electrones a o de cualquier
sustancia endógena diferente a dicho analito. Bajo tales
condiciones la reacción enzimática responsable de proporcionar una
señal de la concentración de analito no puede darse sin que se
aplique un potencial umbral predeterminado al sistema de electrodos.
El sensor, por lo tanto, puede desconectarse para detener la
actividad enzimática tras un pulso de potencial de reducción para
"desactivar" el mediador, y permitir que la difusión basada en
el gradiente de concentración esperable "restablezca"
rápidamente la concentración de analito en el volumen de
detección/retención de analito para la siguiente secuencia de
detección de potencial pulsado programada.
En la presente invención, que se especifica en
las reivindicaciones anexas, se proporciona un método para
monitorizar la concentración de analito utilizando un sensor de esta
invención al poner en contacto el sensor con el fluido biológico a
analizar. Inicialmente, a intervalos predeterminados, se aplica de
forma intermitente al sistema de electrodos un potencial suficiente
para oxidar el mediador electrónico en el volumen de retención, y
el flujo de corriente a través del electrodo se detecta como una
función de la duración del potencial aplicado. El potencial de
oxidación del mediador aplicado se mantiene al menos durante un
periodo de tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de
corriente a través del electrodo como una función de la duración del
potencial aplicado. Los valores de la corriente detectada se
correlacionan con valores de flujo de corriente de concentraciones
conocidas de analito. Alternativamente el protocolo de detección
puede comprender el ajuste del potencial para establecer un flujo
de corriente predeterminado y a continuación detectar la tasa de
cambio de potencial necesario para mantener dicho flujo de
corriente durante un periodo de tiempo predeterminado.
En otra realización, la concentración de analito
de una muestra biológica se mide como función de la concentración
de analito dependiente del tiempo en el volumen de retención tras
pulsos de potencial de eliminación de analito. La tasa de
concentración de recuperación en el volumen de retención/eliminación
pueden correlacionarse fácilmente con la concentración de analito
en el fluido biológico que está en contacto con el sensor. El
"estado de la difusión" de la membrana puede comprobarse
mediante una secuencia preprogramada periódicamente durante el uso
del sensor y los valores numéricos asociados con el estado detectado
pueden utilizarse como información para la modificación de los
algoritmos de la secuencia de pulsos preprogramada para el
subsiguiente funcionamiento del sensor.
A continuación se describen éstas y otras
características de la invención en referencia a las figuras y la
mejor forma de llevar a cabo la invención.
La Fig. 1 es una vista del diseño de un
sensor.
La Fig. 2 es una vista de una sección
transversal del sensor a lo largo de las líneas 2-2
de la Fig. 1.
La Fig. 3 ilustra una vista de una sección
transversal similar a la Fig. 2 pero el electrodo tiene una
construcción diferente.
La Fig. 4 es similar a la Fig. 2 e ilustra la
vista de una sección transversal de un sensor con un membrana
limitante de la difusión con poros anchos.
La Fig. 5 es similar a la Fig. 4 e ilustra la
vista de una sección transversal de un sensor en el que la difusión
al volumen de retención es a través de los poros en la periferia de
un componente de membrana no permeable en otros puntos.
La Fig. 6 es una representación gráfica de una
secuencia de pulsos en la que se aplican dos pulsos de potencial
oxidativo de diferente duración al sensor, con intervalos de
recuperación con potencial de reducción intercalados.
La Fig. 7 es una representación gráfica de una
secuencia de pulsos en la que la duración de los intervalos entre
los pulsos se ha cambiado.
Las Fig. 8-9 son
representaciones gráficas de protocolos de medida, que combinan
cambios en el intervalo entre pulsos con cambios en la amplitud del
pulso.
La Fig. 10 es similar a la Fig. 1 y es una vista
del diseño de un sensor.
La Fig. 11 es un gráfico que muestra la
respuesta medida del sensor de ácido
pirrol-3-acético/mediador/glucosa
deshidrogenasa (GDH).
La Fig. 12 es un gráfico que muestra la
respuesta medida del sensor de ácido
pirrol-3-carboxílico/mediador/GDH.
La Fig. 13 es un gráfico que muestra la
respuesta de los sensores de ácido
pirrol-3-acético/mediador/GDH y
ácido
pirrol-3-carboxílico/mediador/GDH.
\vskip1.000000\baselineskip
El sensor electroquímico de esta descripción
está diseñado para proporcionar señales indicativas de la
concentración de analito en un fluido biológico. El sensor
comprende un electrodo que se encuentra en contacto con un volumen
bajo de un medio hidrofílico para retener una cantidad de analito
proporcional a la concentración de analito del fluido biológico en
contacto con el sensor. El medio se selecciona de forma que se
permita una fácil difusión del analito a través de dicho medio en
sí mismo o tras la hidratación de dicho medio previamente o
posteriormente a la utilización del sensor. El sensor comprende un
recinto para el volumen de medio hidrofílico. El recinto está
formado para exponer el medio hidrofílico al fluido biológico de
forma que el analito del fluido biológico difunde al medio
hidrofílico hasta que la concentración de analito del medio es
equivalente a la concentración de analito del fluido biológico. La
tasa de difusión de masa de analito al volumen de retención es
dependiente del gradiente de concentración de analito. La
concentración de analito en el volumen de retención/eliminación
puede medirse de forma electroquímica mediante la cooperación de un
mediador electrónico y una enzima rédox específica del analito, en
la que cada uno de ellos forma parte o está en contacto con el medio
hidrofílico.
El medio hidrofílico puede contener una nivel de
concentración de agua inferior, igual o superior al contenido
hídrico del fluido biológico. Así los componentes del medio
hidrofílico, lo que incluye el componente enzimático y el mediador
electrónico y un polímero hidrofílico pueden utilizarse en la
construcción del sensor en un estado sustancialmente deshidratado,
listo para su rehidratación previamente a su uso o tras el contacto
del sensor con un fluido biológico. Es importante para el
funcionamiento del sensor que el analito de interés difunda
fácilmente a través del medio hidrofílico para permitir la entrada
de una concentración sustancialmente homogénea del analito en el
volumen de retención de analito, y una concentración que corresponda
aproximadamente a la concentración de analito en el fluido
biológico que está en contacto con el sensor.
El sensor está construido de forma que tiene un
recinto o compartimento que mantiene separado el volumen de
retención de analito del medio hidrofílico. El compartimento está
formado para exponer el medio hidrofílico al fluido biológico
cuando el sensor se está utilizando. En una realización, el
compartimento está definido al menos en parte por una pared que
comprende un área de una membrana permeable al analito con un primer
lado en contacto con el medio hidrofílico y el lado contrario en
contacto con el fluido biológico cuando el sensor se está
utilizando. El analito de interés, el agua y otros componentes del
fluido biológico que pueden pasar por la membrana difunden a través
de la membrana hacia el volumen de retención del medio hidrofílico,
hasta que la concentración de analito del medio es proporcional a
la concentración de analito del fluido biológico que se encuentra
en contacto con el componente de membrana permeable al analito del
sensor.
El sensor está construido de forma que
proporciona un electrodo en contacto eléctrico con el medio
hidrofílico. El electrodo está formado típicamente por un elemento
conductor como carbono, plata, oro, platino, paladio y similares, y
normalmente forma parte o se extiende hacia las paredes del
contenedor o cámara del volumen de retención del analito del medio
hidrofílico. En una realización, el electrodo está formado de
platino y el volumen de retención está definido como el espacio
sobre el electrodo. En otra realización, el electrodo puede estar
formado de polvo de grafito y el volumen de retención está definido
por los espacios intraparticulares y, en al menos una realización,
por una membrana permeable al analito en la parte superior. En otra
realización el electrodo es un componente de un sistema de
electrodos que comprende un electrodo de referencia y opcionalmente
un electrodo auxiliar, que puede ser diferente o idéntico al
electrodo de referencia. El sistema de electrodos también puede
comprender elementos conductores que proporcionan la comunicación
eléctrica entre los componentes del electrodo del sistema y un
controlador programable para controlar los potenciales eléctricos de
dicho sistema de electrodos y para detectar el flujo de corriente a
través de al menos uno de dichos electrodos que responden a dichos
potenciales eléctricos. Típicamente el controlador programable está
construido como una unidad separada con conectores eléctricos
adaptados particularmente para la comunicación eléctrica entre el
controlador y el sistema de electrodos del sensor. El controlador es
normalmente una unidad de sobremesa o portátil capaz de conectarse
de forma reversible a uno o más biosensores y que posee elementos
para el almacenamiento de datos y visionado de datos.
El sensor para el análisis electroquímico de
acuerdo con esta descripción además comprende una enzima rédox y un
mediador electrónico que está en contacto con el medio hidrofílico.
La enzima se selecciona por su capacidad de oxidar o reducir el
analito de interés. La enzima se selecciona preferiblemente también
por su incapacidad de transferir electrones a o a partir de
sustancias diferentes de dicho analito que puedan difundir desde el
fluido biológico hacia el volumen de retención de analito. Ejemplos
no limitantes de enzimas adecuadas incluyen la glucosa
deshidrogenasa (GDH) dependiente de pirroloquinolina quinona (PQQ)
(EC 1.1.99.17) o hidroxibutirato deshidrogenasa (HBDH) (EC
1.1.1.30). Las enzimas deshidrogenasa de otros analitos difusibles
son conocidos en la materia y pueden sustituirse en función del
analito de interés.
El mediador electrónico puede seleccionarse de
entre una amplia variedad de mediadores electrónicos capaces de
facilitar la transferencia de electrones entre la enzima rédox y un
electrodo del sensor que está en contacto con el medio que contiene
o que está en contacto con dicha enzima y dicho mediador. Un ejemplo
no limitante de mediador adecuado incluye el cloruro de
osmio(bis-bipiridilo)piridinio. Sin
embargo, se apreciará que pueden utilizarse un número de mediadores
disponibles comercialmente, de los que se describen ejemplos no
limitantes en la patente estadounidense Nº 5.589.326. La enzima y
el mediador electrónico pueden estar incluidos en una matriz de
polímero sobre el electrodo. Opcionalmente, la enzima y el mediador
electrónico pueden seleccionarse para minimizar su difusión a
través de la membrana permeable al analito durante la utilización
del sensor o pueden estar unidos de forma covalente a las paredes
del recinto o a los componentes de polímero hidrofílico del medio
de retención para minimizar, si no evitar, su difusión desde el
volumen del medio de retención a través de la membrana y hacia el
fluido biológico durante la utilización del sensor.
Pueden utilizarse cualquiera de la gran variedad
de polímeros hidrofílicos, normalmente con un peso molecular con un
exceso de 5000 Daltons y con funcionalidad polianiónica,
policatiónica o polihídrica como transportador o matriz
transportadora que forma parte del componente de medio hidrofílico
del sensor. Ejemplos de tales polímeros incluyen los polímeros
celulósicos como el acetato de celulosa, hidroxietilcelulosa,
polietilenglicoles, gomas sintéticas o naturales como las gomas de
guar o xantán, ácido algínico, ácidos
poli(met)acrílicos y copolímeros de ácidos acrílicos
y ésteres acrílicos, glicosaminoglicanos y similares, cuyos
polímeros pueden utilizarse. Adicionalmente, matrices polimerizadas
eléctricamente a partir de monómeros como el ácido
pirrol-3-acético y ácido
pirrol-3-carboxílico pueden servir
como matriz hidrofílica y/o matriz de inclusión de la enzima.
Tales polímeros hidrofílicos pueden utilizarse
solos o en combinación para proporcionar una matriz hidratada o
hidratable a través de la que el analito diana difunde fácilmente.
Además, pueden utilizarse tales polímeros hidrofílicos
polifuncionales para "anclar" o impedir de algún otro modo la
difusión de la enzima o los componentes mediadores electrónicos del
medio para minimizar la pérdida de tales componentes del volumen de
retención durante la utilización del sensor.
Así, pueden acoplarse mediadores electrónicos
reconocidos en la materia con, por ejemplo una funcionalidad
hidroxi, carboxi o amino, por ejemplo ácido ferrocenocarboxílico,
utilizando metodologías de acoplamiento de formación de ésteres o
de formación de amidas reconocidas en la materia para dar lugar al
medio hidrofílico para su utilización en la preparación de los
presentes sensores. Ejemplos adicionales no limitantes de compuestos
mediadores incluyen los mediadores rédox que contienen osmio, como
los descritos en la patente estadounidense Nº 5.589.326, y los
compuestos mediadores que pueden estar unidos a una matriz
polimérica, lo que incluye complejos rédox reversibles de
imidazol-osmio. Ejemplos no limitantes de tales
complejos incluyen los conjugados osmio-bipiridilo
como los complejos de
bis(bipiridil)-imidazolil-haloosmio
caracterizados por la cinética de mediación rápida y el bajo
potencial rédox (+150 mV frente a Ag/AgCl). Otro grupo de mediadores
que contienen osmio incluye los conjugados marcados con complejos
de tris(bipiridil)osmio detectables
electroquímicamente. La enzima rédox y el mediador electrónico
pueden encontrarse por lo tanto inherentemente en forma no difusible
o químicamente acoplados con los componentes de elevado peso
molecular del medio para dar lugar a una enzima y unos componentes
mediadores electrónicos sustancialmente incapaces de difundir a
través de la membrana permeable al analito durante la utilización
del sensor en contacto con un fluido biológico.
El componente enzimático del sensor es
normalmente de suficiente peso molecular como para que la pérdida
por difusión de este componente a través de la membrana
semipermeable sea marginal durante el periodo típico de utilización
del sensor. Tales enzimas pueden incorporarse al medio hidrofílico
durante la construcción del dispositivo, como, por ejemplo, un
liofilizado de la enzima, formado mediante una deshidratación por
congelación de una solución de enzima en presencia de un monómero
hidrofílico, por ejemplo, maltosa o trehalosa, u otra composición
hidrofílica estabilizante de la enzima. La enzima liofilizada puede
retenerse en dicho medio durante la fabricación y almacenamiento
del sensor en un estado deshidratado hasta su rehidratación
previamente o durante el inicio de la utilización de dicho sensor,
proporcionando así una vida media del sensor superior.
Los componentes mediadores electrónicos de los
sensores de la presente descripción no son críticos excepto por el
hecho de que deberían seleccionarse o modificarse, por ejemplo, con
un enlace covalente de los componentes del polímero de la matriz
hidrofílica o medio hidrofílico, para evitar o minimizar la pérdida
por difusión del componente mediador electrónico del medio del
volumen de retención de analito durante el curso de la utilización
del sensor. Los antecedentes de la materia están repletos de
referencias de una gran variedad de compuestos que incluyen los
quelatos metálicos y otros complejos metálicos como el ferroceno, y
más concretamente el carboxiferroceno, que pueden acoplarse
fácilmente de forma covalente a componentes no difusibles del medio
hidrofílico.
Los componentes de membrana de las
construcciones sensor de esta descripción pueden ser cualquier
membrana permeable al analito biocompatible, lo que incluye por
ejemplo las de acetato de celulosa, poliuretano y policarbonato.
También son bien conocidas en la materia otras membranas poliméricas
biocompatibles adecuadas para su utilización en la construcción del
biosensor y pueden utilizarse cualesquiera de tales membranas/
materiales de membrana permeables al analito reconocidos en la
materia para la elaboración de los presentes sensores. Ejemplos de
membranas permeables al analito, así como mediadores electrónicos y
enzimas rédox se describen en la patente estadounidense Nº
5.264.105.
En una realización de la descripción la matriz
hidrofílica está unida en la superficie de al menos uno de los
electrodos del sistema de electrodos. La matriz hidrofílica
comprende un mediador electrónico covalentemente unido a un
componente polimérico hidrofílico de la matriz no difusible o poco
difusible. La enzima rédox también está unida a un componente
polimérico de la matriz hidrofílica. Un sensor de la presente
descripción preferiblemente ya incluye los componentes de mediador
electrónico y enzima rédox, que se exponen al analito presente en el
volumen de retención del sensor. Inicialmente, se aplica al sistema
de electrodos de forma intermitente y a intervalos predeterminados
un potencial suficiente para oxidar el mediador electrónico y el
flujo de corriente a través del electrodo se detecta como función
de la duración del potencial aplicado. El potencial de oxidación
del mediador aplicado se mantiene al menos durante un periodo de
tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de corriente a
través del electrodo como una función de la duración del potencial
aplicado. Los valores de corriente detectados se correlacionan con
los valores de flujo de corriente de concentraciones conocidas de
analito.
En otra realización, el medio hidrofílico
comprende un mediador electrónico polimérico o un mediador
electrónico covalentemente unido a un componente del polímero
hidrofílico del medio no difusible o poco difusible. La enzima
rédox se incluye como un liofilizado estabilizado o está
covalentemente unido a un componente polimérico del medio
hidrofílico. El medio hidrofílico también comprende componentes
polifuncionales que pueden hacerse reaccionar con agentes de
entrelazamiento difuncionales en contacto con la superficie de dicho
medio hidrofílico para formar una membrana permeable al analito
in situ sobre la superficie del medio hidrofílico. Así, por
ejemplo, un polímero polihídrico o un componente monomérico di- o
trihídrico, preferiblemente de elevado peso molecular, del medio
hidrofílico puede hacerse reaccionar, por ejemplo, con un
poliisocianato, por ejemplo un diisocianato en fase gaseosa, para
formar una capa o membrana de polímero sobre la superficie del medio
hidrofílico. La permeabilidad de la membrana puede controlarse
mediante la extensión de la exposición de la superficie de medio
polihídrico al entrelazante multifuncional. Así, por ejemplo, puede
vaporizarse diisocianato de 1,4-benceno en una
cámara. Las construcciones de sensor comprenden el medio
hidrofílico, que preferiblemente ya incluye los componentes de
mediador electrónico y enzima rédox, con una superficie expuesta que
se introduce en la cámara durante un periodo de tiempo suficiente
para formar una membrana biocompatible sobre la superficie del
medio hidrofílico que define en conjunto con otros componentes del
sensor por ejemplo, un sustrato plano simple no conductor, el
recinto para el componente del volumen de retención de analito del
sensor.
En referencia a la Fig. 1, se proporciona en una
realización del sensor 10 que utiliza un electrodo de capa fina de
oro 12 sobre un sustrato inerte 14. En sección transversal (véase la
Fig. 2) una porción de detección 16 incluye un electrodo de oro 12
sobre una superficie 13 de sustrato inerte 14, capas espaciadoras 18
y una membrana limitante de la difusión 20 sin poros o con pequeños
poros. La membrana 20 puede estar formada como una lámina separada
y aplicarse sobre las capas espaciadoras 18 descansando sobre el
electrodo 12 y el sustrato inerte 14 para completar la definición
del recinto del volumen de eliminación 22 relleno con un medio
hidrofílico 24. La enzima y el mediador pueden estar inmovilizados,
por ejemplo incluidos en una matriz hidrofílica sobre el electrodo
de oro 12. Adicionalmente, se contempla que la enzima y el mediador
puedan estar inmovilizados mediante enlaces covalentes a una pared
26 del recinto 22 o a la membrana suprayacente 20 o tales
componentes pueden encontrarse difundiendo libremente y
seleccionarse para que tengan una permeabilidad de membrana mínima.
La membrana limitante de la difusión 20 puede seleccionarse entre
membranas permeables al analito reconocidas en la materia y
adherirse a una superficie 28 de la capa espaciadora 18 para
completar el recinto 22 para el volumen de retención/eliminación
del analito. Alternativamente, la membrana permeable al analito
puede estar formada in situ mediante el entrelazamiento de
un polímero hidrofílico polifuncional y/o componentes monoméricos
de la capa de reactivo de enzima/mediador. Se entenderá que como se
ha utilizado a lo largo de la descripción, los mismos números de
referencia se utilizan para indicar los mismos componentes.
En referencia a la Fig. 3, se proporciona el
sensor 110 de acuerdo con esta descripción. El sensor 110 incluye
un electrodo formado de una capa de carbono porosa/particulada, en
el que el volumen de eliminación está definido por los espacios
intersticiales entre las partículas de carbono/grafito (no se
muestra). Así, puede formarse una capa de reactivo
carbono-enzima-mediador 122, por
ejemplo por impresión en pantalla, de una suspensión de
carbono/grafito que comprende una enzima rédox, y un mediador
electrónico no difusible o poco difusible, por ejemplo un mediador
polimérico, en combinación opcionalmente con uno o más polímeros
polifuncionales no mediadores electrónicos. La suspensión
normalmente se deposita sobre un elemento conductor (no se muestra)
sobre un sustrato inerte. La membrana permeable al analito limitante
de la difusión 20 puede aplicarse, de forma similar a lo
anteriormente mencionado, como una lámina de polímero preformada
aplicada y sellada sobre una superficie 123 del electrodo de
carbono, o la membrana 20 puede formarse mediante el recubrimiento
del electrodo expuesto impreso que tiene una matriz polimérica
polifuncional intraparticulada con un polímero en solución. Véanse,
por ejemplo, en la solicitud de patente internacional Nº WO 98/17995
los ejemplos no limitantes de membranas de polímero para el
recubrimiento de biosensores.
En referencia a la Fig. 4, que es similar a la
Fig. 1, el sensor 210 incluye una membrana limitante de la difusión
220 que está formada para que presente grandes poros 223 para una
mejor difusión de la glucosa. Los componentes mediador y enzima
están preferiblemente inmovilizados mediante su inclusión en una
matriz hidrofílica sobre el electrodo 12, mediante enlaces
covalentes a componentes poliméricos no difusibles del medio
hidrofílico 24, o a las superficies 26 del recinto del sensor 22
para el volumen de retención.
En referencia a la Fig. 5, se proporciona otra
realización en la descripción en la que el sensor 310 es similar al
que se ilustra en las Fig. 1 y 4, con la excepción de que el medio
hidrofílico 24 que se encuentra sobre la membrana 320 es en sí
mismo impermeable. La membrana 320 se proporciona con una porosidad
periférica que permite la difusión de glucosa u otros analitos
hacia el volumen de retención/eliminación.
El sensor bioquímico puede construirse de
cualquier manera que se adapte a su uso previsto. Así, los sensores
previstos para su utilización repetitiva en el laboratorio pueden
construirse en forma de una sonda elongada con el elemento sensor
situado en uno de los extremos y los conductores eléctricos
conectando el componente de electrodos del elemento de detección
con los puntos del anclaje eléctrico de la sonda de detección a un
controlador del sensor programable. Alternativamente, los presentes
sensores electroquímicos pueden construirse utilizando técnicas de
elaboración en escala micro reconocidas en la materia para producir
sensores de tipo aguja que pueden implantarse o inyectarse en un
punto para las aplicaciones permanentes del sensor.
Los sensores electroquímicos de esta descripción
pueden utilizarse para monitorizar concentraciones del analito en
fluidos biológicos. El método comprende los pasos de poner en
contacto el fluido biológico con el sensor y aplicar al electrodo,
a intervalos inicialmente predeterminados y de forma intermitente,
un potencial suficiente para oxidar el mediador electrónico. La
corriente que pasa a través del electrodo entonces es detectada como
una función de la duración del potencial aplicado. El potencial de
oxidación del mediador se mantiene durante al menos un periodo de
tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de la corriente
con el tiempo a lo largo de dicho electrodo. El flujo de corriente
detectado entonces se correlaciona con el flujo de corriente de
concentraciones conocidas de dicho analito en el medio de
retención/detección. Alternativamente, el sensor puede construirse
para que comprenda al menos un electrodo de trabajo y un electrodo
de referencia, y opcionalmente, un electrodo auxiliar, que puede
ser idéntico al electrodo de referencia. A intervalos inicialmente
predeterminados se aplica un potencial suficiente para establecer
un nivel predeterminado de flujo de corriente entre el electrodo de
trabajo y el electrodo auxiliar. La diferencia de potencial entre
los electrodos de trabajo y de referencia necesaria para establecer
dicho nivel de flujo de corriente se mide y se mantiene durante un
periodo de tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de
potencial necesaria para mantener dicho flujo de corriente a lo
largo de dicho electrodo. Las medidas de potencial entonces se
correlacionan con las medidas de potencial registradas de las
concentraciones conocidas de analito en el fluido biológico.
Los potenciales aplicados, la duración de los
pulsos de potencial, y los intervalos entre pulsos de potencial se
introducen en el controlador programable utilizado en conjunción con
el sensor para las medidas de analito. En una realización los
intervalos entre los potenciales intermitentes aplicados son menores
que el tiempo necesario para que la concentración del analito en el
volumen de retención se equilibre con la del fluido biológico en
contacto con la membrana permeable al analito. En otra realización
los intervalos se aumentan de forma creciente en una serie de
potenciales aplicados, y la concentración del analito y del fluido
biológico se determina como una función de la tasa de aumento de la
concentración de analito en el volumen de retención. Los intervalos
entre pulsos de potencial aplicados pueden modificarse en base a
medidas previas para ajustar las variaciones en el funcionamiento
del sensor derivadas de la pérdida o degradación de los componentes
de enzima rédox y mediador electrónico y/o cambios en las
características de difusión de la membrana permeable al analito o
del medio del volumen de retención. Alternativamente, la duración de
los pulsos de potencial aplicados se modifica en base a medidas
previas para la detección del estado de funcionamiento del sensor.
En otra realización de funcionamiento del sensor los intervalos
entre medidas son sustancialmente iguales o superiores al tiempo
necesario para que la concentración del analito en el volumen de
retención se equilibre con la del fluido biológico. El método de
acuerdo con esta invención se especifica en las reivindicaciones
anexas.
En las Fig. 6-9 se presentan
ilustraciones gráficas de algoritmos de medida de muestras en los
que el potencial del electrodo se controla durante un periodo de
tiempo para que varíe entre un potencial en el que no se produce la
oxidación del mediador (E0) y un potencial de oxidación del mediador
(E1) y un potencial en el que tiene lugar la reducción del mediador
(E-1). El protocolo del potencial a aplicar en una
situación dada depende del estado del sensor, la forma del sensor,
y la naturaleza del mediador electrónico y la enzima rédox. El
protocolo de funcionamiento del sensor puede ser optimizado por un
usuario experimentado mediante medidas y observaciones
empíricas.
Específicamente, la Fig. 6 muestra una secuencia
de pulsos en la que se aplican dos pulsos de potencial oxidativo de
diferente duración al sensor, intercalados con intervalos de
recuperación con potencial de reducción. Al comparar el perfil de
corriente del primer pulso con el del segundo, puede obtenerse
información de la tasa de recambio enzimático del sustrato, y la
tasa de difusión electrónica del sensor. Entre las aplicaciones de
potencial oxidativo, el potencial de reducción asegura que todo el
mediador retorna a su estado inicial previamente a la aplicación
del siguiente potencial de oxidación.
La Fig. 7 muestra una secuencia en la que se
cambia la duración de los intervalos entre los pulsos. Comparando
la corriente observada del segundo pulso con la del primero, puede
obtenerse información sobre el tiempo de recuperación del sensor.
El tiempo de recuperación resulta no sólo en información sobre la
concentración de analito, sino también sobre la difusión hacia la
matriz hidrofílica. La medida del potencial de descanso del sensor
entre los pulsos potenciostáticos también proporciona información
sobre la recuperación del sensor.
Las Fig. 8-9 muestran los
protocolos de medida, que combinan cambios en el intervalo de los
pulsos con cambios en la amplitud del pulso. El controlador puede
seleccionar de entre una variedad de secuencias y duraciones de
intervalos de medida amperimétrica e intervalos de recuperación para
determinar no sólo la concentración del analito, sino también
comprobar el estado del sensor respecto de actividad enzimática,
difusión del sustrato y mediador en el sensor, y difusión de
sustrato hacia el sensor.
La naturaleza y construcción del controlador
utilizado con los presentes sensores electroquímicos no es crítica,
siempre que el controlador pueda programarse para que aplique los
perfiles de pulsos de potencial apropiados al electrodo o sistema
de electrodos del sensor y de detectar el flujo de corriente como
una función del potencial en el tiempo. Separadamente, puede
efectuarse un protocolo de valoración del estado del sensor en el
que el controlador efectúa un protocolo que permite el cálculo de
las características de difusión del volumen de eliminación y la
membrana a partir de los datos de corriente. El controlador puede
programarse para ajustar los intervalos de medida y amplitud de los
pulsos en base a los tiempos de difusión calculados y la
concentración de sustrato determinada. Tanto la cronoamperimetría
como la cronocolometría pueden utilizarse para determinar el estado
del sensor y la concentración de sustrato. Idealmente el controlador
también debería poder aplicar un potencial de reducción al
electrodo para reducir el mediador y disminuir así el consumo de
analito entre medidas.
Un sensor se compone de forma similar al sensor
10 de las Fig. 1-2, con la excepción de que no
incluye la membrana 20. La enzima y el mediador electrónico están
incluidos en una matriz polimérica sobre el electrodo. Esta matriz
de polímero se prepara mediante electropolimerización de pirrol y
derivados mediadores pirrol. Este método incluye la enzima en una
matriz polimérica sobre el electrodo, y al incorporar derivados de
mediadores pirrol en el polímero, proporciona un mediador
inmovilizado para la transferencia de electrones en el sensor.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Los electrodos de disco de platino fueron
adecuados para obtener sensores de acuerdo con este método. Se
obtuvo un mediador que era adecuado para la copolimerización en una
matriz mediante la siguiente secuencia de reacción:
\newpage
El cloruro de osmio (bisbipiridil) piridinio con
pirrol modificado se preparó mediante la siguiente secuencia de
reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
Los electrodos de disco de platino se pulieron
con pasta de Al_{2}O_{3} de rugosidad decreciente (3 \mum, 1
\mum, 0,1 \mum) sobre una tela de pulido y se lavaron con agua
destilada. A continuación, los electrodos se lavaron en un baño de
ultrasonidos inicialmente en NaOH 10 M y luego en H_{2}SO_{4} 5
M, diez minutos cada uno.
Los electrodos se sometieron a un ciclado
electroquímico en H_{2}SO_{4} 0,5 M libre de oxígeno:
1. Escaneo: de -610 a +1000 mV frente a Hg/
HgSO_{4} (100 mV/s, 10 \muA)
2. Escaneo: de -810 a +1600 mV frente a Hg/
HgSO_{4} (100 mV/s, 10 \muA)
3. Escaneo: de -610 a +1000 mV frente a Hg/
HgSO_{4} (100 mV/s, 10 \muA)
El tercer escaneo se repitió hasta que el
voltagrama cíclico mostró una superficie de platino limpia y se
mantuvo constante.
El último paso fue la polarización a -210 mV
durante 5 minutos.
Adicionalmente, se prepararon 4 ml de una
solución de H_{2}PtCl_{6} 2 mM libre de oxígeno bajo argón en
una célula electroquímica desgasificada. Se aplicaron tres ciclos
voltamétricos de +500 a -400 mV frente a Ag/AgCl con una tasa de
escaneo de 10 mV/s. Luego se lavo el electrodo bajo argón con agua
destilada libre de oxígeno y se almacenó bajo argón hasta su
utilización.
Se polimerizó una película de pirrol que
contenía cloruro de osmio (bis-bipiridil) piridinio
activo como sigue:
La copolimerización se llevó a cabo con una
mezcla de pirrol 2 mM, (9) 8 mM y perclorato de tetrametilamonio 25
mM (como electrolito) en una mezcla 1:1 de acetonitrilo: agua. Se
realizaron 100 pulsos con un potencial/tiempo de 0 V por s./1,5 V
durante 1 s. La polimerización se llevó a cabo en ausencia de
oxígeno.
Se disolvieron 5 mg/mL de GDH en una solución de
ácido pirrol-3-acético 50 mM, PQQ
0,05 mM, y KCl 50 mM
en tampón HEPES 0,1 M. Tras una incubación de 30 minutos para permitir la reconstitución de la apoenzima, la solución se polimerizó con un perfil de pulsos de potencial que consistió en 20 pulsos de 0 V. durante 5 s./1,2 V durante 1 segundo.
en tampón HEPES 0,1 M. Tras una incubación de 30 minutos para permitir la reconstitución de la apoenzima, la solución se polimerizó con un perfil de pulsos de potencial que consistió en 20 pulsos de 0 V. durante 5 s./1,2 V durante 1 segundo.
En una solución de ácido
pirrol-3-carboxílico 50 mM y KCl 50
mM en tampón Hepes 0,1 M, se disolvieron 5 mg/mL de sGDH. La
solución se polimerizó con un perfil de pulsos de potencial que
consistía en 20 pulsos de 0 V. durante 5 s/1,2 V durante 1 segundo,
o alternativamente de 0 V. durante 5 s/1,4 V durante 1 segundo, o
también de 0 V. durante 5 s/1,6 V durante 1 segundo. El potencial
tenía un impacto considerable en el funcionamiento del sensor, lo
que indica su dependencia de las propiedades de la película de
polipirrol.
En una solución de ácido
pirrol-3-acético 50 mM, derivado
pirrol modificado con osmio 10 10 mM, PQQ 0,05 mM y KCl 50 mM en
tampón HEPES 0,1 M se disolvieron 5 mg/mL de sGDH. La solución se
polimerizó con un perfil de pulsos de potencial que consistió en 20
pulsos de 0 V. durante 5 s/1,4 V durante 1 segundo.
En una solución de ácido
pirrol-3-carboxílico 50 mM, derivado
de pirrol modificado con osmio 10 10 mM, PQQ 0,05 mM y KCl 50 mM en
tampón HEPES 0,1 M se disolvieron 5 mg/mL de sGDH. La solución se
polimerizó con un perfil de pulsos de potencial que consistió en 20
pulsos de 0 V. durante 5 s/1,4 V durante 1 segundo.
Los electrodos enzimáticos se lavaron con agua
desionizada. Se apreciará, sin embargo, que los electrodos
enzimáticos pueden lavarse con una solución tampón o, si es
necesario, con una solución de KCl 3 M para eliminar la GDH
adsorbida y a continuación pueden almacenarse en un tampón fosfato
0,1 M pH 7. Si los electrodos se almacenan toda la noche se
mantienen a 4ºC o a TA.
La respuesta del sensor se midió situando el
sensor en un tampón PBS (salina tamponada con fosfato) agitado
junto con un electrodo de referencia y un contraelectrodo. Se aplicó
un potencial (E) suficiente para oxidar el mediador inmovilizado y
la solución se agitó durante un tiempo (t) hasta que la corriente
(1) se estabilizó en un valor bajo. Véase la Fig. 11. Se añadieron
alícuotas de una solución de glucosa 1 M en PBS de forma secuencial
al tampón PBS, como se muestra mediante flechas en la Fig. 12, para
aumentar la concentración de glucosa en la solución agitada de
tampón PBS, y se midió la corriente (1) en la meseta de la curva de
respuesta.
En referencia ahora a la Fig. 13, la respuesta
se midió para los sensores de ácido
pirrol-3-acético/mediador/GDH y
ácido
pirrol-3-carboxílico/mediador/GDH.
La respuesta muestra una buena transferencia electrónica a lo largo
del mediador inmovilizado en la película de polipirrol.
Un sensor 410 consiste en los conductores 12, 15
y los reactivos depositados sobre un sustrato polimérico plano 14.
Se proporcionan los materiales para la encapsulación de los
conductores 12 y 15, y los reactivos que forman una capa
semipermeable biocompatible sobre el área de detección 16 que
contiene los reactivos. Véase la Fig. 10.
Sustrato: Poliimida (como la película de
poliimida Kapton®, que está disponible comercialmente en E.I. DuPont
de Nemours, Wilmington, Delaware, y la película de poliimida Upilex®
que está disponible comercialmente en UBE Industries Ltd, Japón) de
0.005'' (0,127 mm) de grueso con electrodos de oro y guías
conductoras.
Procesado: El material se lavó con agua, acetona
y cloruro de metileno, luego se secó a 180ºC durante 20 horas. El
material se situó en una cámara de vacío y se metalizó con 50
\ring{A} de cromo seguido de 500 \ring{A} de oro. El material
metalizado se extrajo. Se aplicó una resina fotosensible laminada.
La resina se expuso y se reveló en una solución salina acuosa.
Luego el patrón metálico se reveló en una solución de agente
grabador metálico (normalmente HNO_{3}-HCl). El
material grabado se enjuagó con agua, y la fotomáscara restante se
eliminó con un solvente (normalmente
N-metilpirrolidona (NMP)). Se aplicó una capa de poliimida fotodefinible de 2 \mum de grosor con un recubridor giratorio, y se solidificó calentando a 80ºC durante 20 minutos. Se expuso y se reveló con un solvente (NMP). Luego se calentó a 200ºC durante 30 minutos para endurecer el polímero restante.
N-metilpirrolidona (NMP)). Se aplicó una capa de poliimida fotodefinible de 2 \mum de grosor con un recubridor giratorio, y se solidificó calentando a 80ºC durante 20 minutos. Se expuso y se reveló con un solvente (NMP). Luego se calentó a 200ºC durante 30 minutos para endurecer el polímero restante.
Referencia/Contra: Un preparado de tinta de
plata/ cloruro de plata que consiste en una suspensión de partículas
de plata, parcialmente convertidas en cloruro de plata en su
superficie, en un solvente orgánico, es decir ciclohexanona, con un
agente de suspensión polimérico, como el alginato.
Procesado: La mezcla de tinta se aplicó en la
apertura de la poliimida y se secó durante 30 minutos a 80ºC para
eliminar todo el solvente.
\newpage
Área del sensor: La apertura a lo largo de la
poliimida hacia el electrodo de oro se recubrió con un área de
reactivos multicapa que consiste en los siguientes reactivos.
Capa de enzima: Una solución de glucosa
deshidrogenasa/pirroloquinolina quinona (PQQ) (Nº de la comisión de
enzimas 1.1.99.17) y un polímero rédox que consiste en
polivinilimidazol con bis(bipiridil)
cloro-osmio en tampón fosfato, opcionalmente con un
polímero polihídrico sintético, natural o semisintético, se aplicó
en una apertura del electrodo y se secó. Se aplico en el área una
solución de diglicidil éter de polietilenglicol en tampón acuoso
(es decir NaPO_{4} 10 mM, NaCl 150 mM), y se dejó secar a
temperatura ambiente durante toda la noche. Entonces los electrodos
se enjuagaron con solución salina fisiológica y se dejaron
secar.
Capa: La estructura completa se situó en una
cámara de vacío. Se creó un plasma de diglime en la cámara
introduciendo un vapor a baja presión, y aplicando un campo RF para
disociar el diglime y provocar la polimerización. Tras 5 minutos,
se detuvo la adición de diglime y se mantuvo el plasma durante 5
minutos adicionales. Entonces se rompió el vacío y la lámina se
extrajo de la cámara.
Post-procesado: Los sensores 410
se perforaron de la lámina y se montaron en pequeños soportes de
policarbonato que protegen el área de detección y sirven como
dispositivo de inserción. Los sensores empaquetados se sellaron en
bolsas de polietileno. Los sensores embolsados se esterilizaron
mediante radiación. Se empaquetaron 10 sensores esterilizados en
una caja de plástico mayor que contenía un desecante en la tapa. La
caja se cerró y empaquetó en un embalaje de cartón externo que
sirve como paquete final para el consumidor.
Este método de fabricación de sensores adecuado
para su utilización de acuerdo con la presente descripción utiliza
la denominada tecnología de "enzima impresa" para la
inmovilización de la enzima y el mediador en una relación activa
dentro de una película de sensor. La GDH/PQQ no reacciona
sustancialmente con ningún sustrato endógeno diferente del analito
de interés. Esto permite que el sensor permanezca inactivo, o
"desconectado" tanto tiempo como el electrodo no está
regenerando el mediador para permitir una actividad adicional. Los
sensores obtenidos mediante este método muestran una sensibilidad
muy elevada a la glucosa y una densidad de corriente muy
elevada.
Claims (16)
1. Un método para monitorizar la concentración
de analito en un fluido biológico mediante la utilización de un
sensor, y este método comprende los pasos de:
proporcionar un sensor que comprende un volumen
de retención de un medio hidrofílico, formándose este volumen de
retención para retener una cantidad de analito que es proporcional a
la concentración de analito en un fluido biológico que está en
contacto con el sensor, un recinto para dicho volumen de retención
de analito, estando el recinto definido al menos en parte por una
pared que comprende un área de una membrana permeable al analito
(20, 220) con un primer lado en contacto con el medio hidrofílico,
un electrodo que está en contacto con el medio hidrofílico, una
enzima rédox que está en contacto con el medio, y un mediador de
transferencia electrónica para facilitar la transferencia de
electrones entre la enzima y los electrodos, siendo la enzima
sustancialmente incapaz de transferir electrones a o a partir de
componentes del fluido biológico diferentes a dicho analito, poner
en contacto el fluido biológico con el sensor y, a intervalos,
aplicar un potencial al electrodo suficiente para oxidar el
mediador electrónico y detectar la corriente a través de dicho
electrodo como una función de la duración del potencial aplicado,
manteniendo el potencial de oxidación del mediador aplicado al
menos durante un periodo de tiempo suficiente para determinar la
tasa de cambio de la corriente a lo largo del tiempo en el
electrodo, y correlacionar el flujo de corriente con el flujo de
corriente de concentraciones conocidas de dicho analito en el medio
de retención, en el que el método además comprende el paso de
aplicar en el electrodo un potencial suficiente para reducir la
forma oxidada del mediador electrónico.
2. El método de la reivindicación 1 en el que
los intervalos entre los potenciales aplicados son inferiores al
tiempo necesario para que la concentración del analito en el volumen
de retención se equilibre con la del fluido biológicos que está en
contacto con el recinto.
3. El método de la reivindicación 2 en el que el
mediador electrónico es cloruro de osmio
(bis-bipiridil)-piridinio.
4. El método de la reivindicación 2 en el que la
enzima rédox y el mediador electrónico están embebidos en una
matriz hidrofílica del electrodo.
5. El método de la reivindicación 1 en el que
los intervalos se aumentan de forma creciente durante una serie de
potenciales aplicados y la concentración del analito en el fluido
biológico se determina como una función de la tasa de aumento de la
concentración de analito en el volumen de retención.
6. El método de la reivindicación 5 en el que
los intervalos entre los pulsos de potencial aplicados se modifican
en base a los resultados de las medidas previas.
7. El método de la reivindicación 5 en el que la
duración de los pulsos de potencial aplicados se modifican en base
a los resultados de las medidas previas.
8. El método de la reivindicación 1 en el que el
intervalo entre los potenciales aplicados es sustancialmente igual
o superior al tiempo necesario para que la concentración de analito
en el volumen de retención se equilibre con la del fluido
biológico.
9. El método de la reivindicación 1, 2 o 8 en el
que el analito es glucosa y la enzima rédox es una glucosa
deshidrogenasa.
10. El método de la reivindicación 1, 2 o 8 en
el que el analito es glucosa y la enzima rédox es una glucosa
deshidrogenasa dependiente de pirroloquinolina quinona (PQQ).
11. El método de la reivindicación 1, 2, 5, 6, 7
o 8, en el que el sensor comprende adicionalmente al menos un
electrodo de referencia y un electrodo auxiliar, y además comprende
los pasos de establecer de forma intermitente un nivel
predeterminado de corriente que fluye entre dicho electrodo de
trabajo y dicho electrodo auxiliar en intervalos predeterminados
inicialmente, y la medida de la diferencia de potencial entre dicho
electrodo de trabajo y el electrodo de referencia; manteniendo
dicho nivel de flujo de corriente al menos durante un periodo de
tiempo suficiente para determinar la tasa de cambio de potencial
necesaria para mantener dicha corriente en dicho electrodo a lo
largo del tiempo, y correlacionar dicho potencial con el potencial
de concentraciones conocidas de dicho analito en el fluido
biológico.
12. El método de la reivindicación 1 que además
comprende un controlador programable que está en contacto eléctrico
con el electrodo para controlar los potenciales eléctricos en dicho
electrodo y detectar la corriente a lo largo de dicho electrodo en
respuesta a estos.
13. El método de la reivindicación 1, en el que
se aplican 2 pulsos de potencial oxidativo de diferente duración al
sensor intercalados con intervalos de recuperación con potencial
reductor.
\newpage
14. El método de la reivindicación 1, en el que
el potencial del electrodo se controla a lo largo de un periodo de
tiempo para variar entre un potencial en el que no aparece oxidación
del mediador a un potencial de oxidación del mediador y un
potencial en el que tiene lugar la reducción del mediador.
15. El método de la reivindicación 1, en el que
entre las aplicaciones de potencial oxidativo, el potencial
reductor asegura que todo el mediador retorna a su estado inicial
previo a la aplicación del siguiente potencial de oxidación.
16. El método de la reivindicación 1, que
además comprende el paso de aplicar el siguiente potencial de
oxidación tras la aplicación de un potencial suficiente para
reducir la forma oxidada del mediador electrónico.
Applications Claiming Priority (2)
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| ES00965134T Expired - Lifetime ES2298155T3 (es) | 1999-09-20 | 2000-09-19 | Metodo para la monitorizacion de un analito utilizando un biosensor electroquimico que puede desconectarse al aplicar un potencial electrico. |
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