ES2254368T3 - Procedimientos y dispositivos electroquimicos para usar en la determinacion de concentraciones de analito corregidas con el hematocrito. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra fisiológica, en el que la muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma, que comprende: (a) introducir dicha muestra fisiológica en una célula electroquímica que comprende: (i) electrodos de referencia y trabajo separados; y (ii) un sistema de reactivos redox que comprende una enzima y un mediador; (b) aplicar un primer potencial eléctrico con una primera polaridad a dicha célula de reacción y medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de primer tiempo; (c) aplicar un segundo potencial eléctrico con una segunda polaridad a dicha célula, en el que dicha segunda polaridad es opuesta a dicha primera polaridad, y medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de segundo tiempo; y (d) calcular una concentración preliminar del analito y la variable de dichos transitorios de corriente de primer y segundotiempo; caracterizado por que el procedimiento adicionalmente comprende la etapa de (e) multiplicar dicha concentración preliminar del analito, menos un valor de fondo, por un factor de corrección por el hematocrito para calcular dicha concentración de analito corregida con el hematocrito en dicha muestra; en el que dicho factor de corrección por el hematocrito es una función de dicha concentración preliminar del analito y de dicha célula electroquímica, en la que describe la desviación de la célula electroquímica del ideal; con lo que se determina la concentración de dicho analito corregida con el hematocrito en dicha muestra.

Description

Procedimientos y dispositivos electroquímicos para usar en la determinación de concentraciones de analito corregidas con el hematocrito.

Introducción Campo de la invención

El campo de esta invención es la determinación de analitos, particularmente la determinación electroquímica de analitos y más particularmente la determinación electroquímica de analitos en sangre.

Antecedentes

La detección de analitos en fluidos fisiológicos, por ejemplo sangre o productos derivados de la sangre, está creciendo en importancia en la sociedad actual. Los análisis de detección de analitos se usan en varias aplicaciones, incluyendo pruebas de laboratorio clínico, pruebas para realizar en el hogar, etc., en los que los resultados de tales pruebas juegan un rol importante en el diagnóstico y manejo de una diversidad de condiciones patológicas. Los analitos de interés incluyen la glucosa en el manejo de la diabetes, colesterol y similares. Como respuesta a esta creciente importancia en la detección de analitos se han desarrollado una variedad de protocolos de detección de analitos y dispositivos para uso clínico y en el hogar.

Un tipo de procedimiento que se emplea para la detección de analitos es un procedimiento electroquímico. En tales procedimientos, se coloca una muestra líquida acuosa en una zona de reacción en una célula electroquímica que comprende dos electrodos, es decir un electrodo de referencia y uno de trabajo, donde los electrodos tienen una impedancia que los hace adecuados para mediciones amperométricas. Se permite que el componente a analizar reaccione directamente con un electrodo, o directamente o indirectamente con un reactivo redox para formar una sustancia oxidable (o reducible) en una cantidad equivalente a la concentración del componente a analizar, es decir el analito. La cantidad de sustancia oxidable (o reducible) presente es posteriormente estimada electroquímicamente y relacionada con la cantidad de analito presente en la muestra inicial.

Cuando la muestra fisiológica ensayada es sangre entera o un derivado de la misma, el hematocrito de la muestra puede ser una fuente de error analítico en la medición final de la concentración del analito. Por ejemplo, en protocolos de medición electroquímica en los que la concentración del analito se calcula a partir de observaciones de los transitorios de corriente en el tiempo, el hematocrito puede hacer más lento el equilibrio químico en la célula electroquímica y/o disminuir la cinética enzimática al incrementar al viscosidad de la muestra en la célula, disminuyendo así la respuesta en el tiempo y causando error analítico.

Como tal, hay un gran interés en desarrollar procedimientos para al menos minimizar el error analítico originado por el hematocrito. En ciertos protocolos, se emplean membranas para filtrar la sangre y así eliminar los glóbulos rojos y minimizar el efecto del hematocrito. Estos protocolos particulares no son satisfactorios ya que se necesitan mayores volúmenes de muestra y mayores tiempos de prueba. Otros protocolos se enfocan en la determinación del tiempo de llenado capilar. Sin embargo, estos protocolos agregan complejidad tanto a las tiras como a los dispositivos que se usan para leerlas. En aun otras formas de realización, se determina de forma separada el hematocrito usando dos electrodos adicionales, lo que también resulta en una mayor complejidad y coste de las tiras/dispositivos.

Como tal, hay un continuo interés en identificar procedimientos nuevos para medir electroquímicamente la concentración de un analito en una muestra fisiológica, en el que el procedimiento minimiza el error analítico originado con el hematocrito de la muestra.

Literatura relevante

Los documentos de interés incluyen la Patente de EEUU 5.942.102.

El documento WO 99 60391 describe un procedimiento de medición electroquímica para medir una concentración de un analito en una muestra usando un biosensor, que comprende el cálculo de parámetros desde un valor real que se obtiene como resultado de aplicar un voltaje fijo al biosensor tras colocar la muestra y la corrección de errores de un valor medido usando estos parámetros por medio de una técnica estadística.

Resumen de la invención

Se proveen los procedimientos y dispositivos para determinar la concentración de un analito en una muestra fisiológica, en los que la muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma. En estos procedimientos, la sangre entera o el derivado de la misma se introduce en una célula electroquímica que tiene un electrodo de trabajo y uno de referencia. Se aplica un primer potencial eléctrico a la célula y se mide la corriente que atraviesa la célula en un primer período de tiempo para determinar la corriente transitoria en un primer tiempo. Posteriormente se aplica a la célula un segundo potencial eléctrico de polaridad opuesta y se determina una corriente transitoria en un segundo tiempo. Posteriormente se calcula la concentración preliminar del analito (C_{0}) con las corrientes transitorias del primero y/o segundo tiempo. Esta concentración preliminar del analito, menos un valor de fondo, se multiplica luego por un factor de corrección del hematocrito para obtener la concentración del analito en la muestra, dicho factor de corrección del hematocrito es una función de la concentración preliminar de analito y la relación de dos valores de corriente (\gamma) dentro del transitorio de corriente de la célula electroquímica. Los procedimientos y dispositivos del tema son adecuados para el uso en la determinación de una gran variedad de analitos en sangre entera o derivados de la misma, entre los cuales un analito de interés particular es la glucosa.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 provee un gráfico tridimensional de C_{0}, \gamma y \alpha(C_{0}, \gamma) desarrollado a partir de datos experimentales usando un gran intervalo de valores de glucosa y de hematocrito.

Descripción de las formas de realización específicas Procedimientos

Como se resumió anteriormente, la invención provee un procedimiento para determinar un valor de concentración de analito corregido con el hematocrito en una muestra fisiológica. Por concentración de analito corregida con el hematocrito se entiende que el valor de concentración del analito determinado usando los procedimientos del tema fue modulado o cambiado para eliminar sustancialmente toda contribución del hematocrito en el valor. En otras palabras, el valor de concentración que se determina usando los procedimientos del tema ha sido modificado de manera que cualquier contribución del hematocrito de la muestra al valor estaría presente en el valor pero se elimina para la práctica de los procedimientos del tema. Como tal, la señal del hematocrito se simplifica de la señal del analito en la concentración final del analito corregida con el hematocrito.

La primera etapa en los procedimientos del tema es introducir una cantidad de la muestra fisiológica de interés en la célula electroquímica que incluye electrodos de trabajo y de referencia separados y un sistema de reactivos redox. La muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma, siendo la sangre entera de particular interés en muchas formas de realización. La cantidad de muestra fisiológica, por ej. sangre, que se introduce en el área de reacción de la tira de prueba varía, pero generalmente es de entre 0,1 y 10 \mul, usualmente desde aproximadamente 0,9 hasta 1,6 \mul. La muestra se introduce en el área de reacción usando un protocolo conveniente, en el que la muestra puede inyectarse en el área de reacción, dejarse gotear en el área de reacción, o similar, como resulte conveniente.

Mientras que los procedimientos del tema pueden usarse, en principio, con cualquier tipo de célula electroquímica que tenga separados los electrodos de trabajo y de referencia y un sistema de reactivos redox, en muchas formas de realización los procedimientos del tema usan una tira de prueba electroquímica. Las tiras de prueba electroquímicas usadas en estas formas de realización de la invención están hechas de dos electrodos metálicos opuestos separados por una fina capa espaciadora, donde estos componentes definen un área o zona de reacción en la que se encuentra un sistema de reactivos redox.

En ciertas formas de realización de estas tiras de prueba electroquímicas, los electrodos de trabajo y de referencia están generalmente configurados en forma de tiras rectangulares elongadas. Típicamente, la longitud de los electrodos varía desde aproximadamente 1,9 hasta 4,5 cm, usualmente desde aproximadamente 2,0 hasta 2,8 cm. El ancho de los electrodos varía desde aproximadamente 0,38 hasta 0,76 cm, usualmente desde aproximadamente 0,51 hasta 0,67 cm. Los electrodos de referencia típicamente tienen un espesor que varía desde aproximadamente 10 hasta 100 nm y usualmente desde aproximadamente desde 10 hasta 20 nm. En ciertas formas de realización, la longitud de uno de los electrodos es menor que la del otro electrodo, típicamente aproximadamente 0,32 cm. El electrodo más corto puede ser el electrodo de trabajo o el de referencia.

Los electrodos de referencia y de trabajo se caracterizan además por que al menos la superficie de los electrodos que da al área de reacción en la tira es de metal, siendo metales de interés el paladio, oro, platino, plata, iridio, carbono, óxido de estaño con impurezas, acero inoxidable y similares. En muchas formas de realización, el metal es oro o paladio. Mientras que en principio el electrodo completo puede estar hecho de metal, cada uno de los electrodos está generalmente hecho de un material de soporte inerte en cuya superficie está presente una fina capa del componente metálico del electrodo. En esta forma de realización más común, el espesor del material de soporte típicamente varía desde aproximadamente 51 hasta 356 \mum, usualmente desde aproximadamente 102 hasta 153 \mum mientras que el espesor del de la capa metálica típicamente varía desde aproximadamente 10 hasta 100 nm y usualmente desde aproximadamente 10 hasta 40 nm, por ej. una capa metálica realizada por deposición catódica (sputtered). Puede usarse en los electrodos cualquier material inerte como soporte que sea capaz de proveer soporte estructural al electrodo y, en el caso, a la tira de prueba electroquímica en su totalidad. Los materiales adecuados que pueden emplearse como sustrato de apoyo incluyen plásticos, por ej. PET, PETG, poliimida, policarbonato, poliestireno, silicona, cerámica, vidrio y similares.

Una característica de las tiras para pruebas electroquímicas usadas en estas formas de realización del tema es que los electrodos de referencia y de trabajo como se describieron anteriormente están enfrentados uno con el otro y separados sólo por una distancia muy corta, de manera tal que la distancia entre el electrodo de trabajo y el de referencia en el área o zona de reacción de la tira para prueba electroquímica es extremadamente pequeña. Este mínimo espaciamiento de los electrodos de trabajo y de referencia en las tiras para pruebas del tema es el resultado de la presencia de una fina capa espaciadora ubicada entre ambos electrodos. El espesor de esta capa espaciadora generalmente debería ser menor o igual a 500 \mum, y usualmente varía desde 102 hasta 153 \mum. La capa espaciadora está cortada de manera de proveer un área o zona de reacción con al menos un puerto de entrada en la zona de reacción y generalmente también un puerto de salida fuera de la zona de reacción. La capa espaciadora puede tener un área de reacción de forma circular con puertos de entradas y salidas laterales u otras configuraciones, por ej. cuadrada, triangular, rectangular, áreas de reacción de forma irregular, etc.. La capa espaciadora puede estar fabricada de cualquier material conveniente, incluidos PET, PETG, poliimida, policarbonato y similares y las superficies de la capa espaciadoras pueden estar tratadas de manera de ser adhesivas con respecto a su electrodo respectivo y por lo tanto mantener la estructura de la tira para prueba electroquímica. Resulta de particular interés el uso de tiras adhesivas de doble cara troqueladas como capa espaciadora.

Las tiras para prueba electroquímica usadas en estas formas de realización de la invención incluyen un área o zona de reacción que está definida por el electrodo de trabajo, el electrodo de referencia y la capa espaciadora, los cuales están descritos anteriormente. Específicamente, los electrodos de trabajo y de referencia definen la parte superior e inferior del área de reacción, mientras que la capa espaciadora define las paredes del área de reacción. El volumen del área de reacción es de al menos aproximadamente 0,1 \mul, usualmente al menos aproximadamente 1 \mul y más usualmente al menos aproximadamente 1,5 \mul, dicho volumen puede ser tan grande como 10 \mul o mayor. Como se menciona anteriormente, el área de reacción generalmente incluye al menos un puerto de entrada y en muchas formas de realización también incluye un puerto de salida. La sección del corte de los puertos de entrada y de salida pueden variar siempre que sean suficientemente grandes para proveer una entrada o salida eficaz del fluido del área de reacción, pero generalmente varía desde aproximadamente 9 x 10^{-4} hasta 5 x 10^{-3} cm^{2}, usualmente desde aproximadamente 1,3 x 10^{-3} hasta 2,5 x 10^{-3} cm^{2}.

En el área de reacción se encuentra un sistema de reactivos redox, cuyo sistema de reactivos provee la especie que se mide por medio del electrodo y por lo tanto se usa para calcular la concentración de analito en la muestra fisiológica. El sistema de reactivos redox presente en el área de reacción típicamente incluye al menos una(s) enzima(s)
y un mediador. En muchas formas de realización, la(s) enzima(s) del sistema de reactivos redox es una enzima o pluralidad de enzimas que trabajan en conjunto para oxidar el analito de interés. En otras palabras, el componente enzimático del sistema de reactivos redox está formado por una enzima que oxida un único analito o una colección de dos o más enzimas que trabajan en conjunto para oxidar el analito de interés. Las enzimas de interés incluyen oxidasas, deshidrogenasas, lipasas, quinasas, diforasas, quinoproteínas y similares.

La enzima específica presente en el área de reacción depende del analito particular a detectar para el cual está diseñada la tira para prueba electroquímica, siendo enzimas representativas: glucosaoxidasa, glucosadeshidrogenasa, colesterolesterasa, colesteroloxidasa, lipoproteinlipasa, glicerolquinasa, glicerol-3-fosfatooxidasa, lactatooxidasa, lactatodeshidrogenasa, piruvatooxidasa, alcoholoxidasa, bilirrubinoxidasa, uricasa y similares. En muchas formas de realización de preferencia, en las que el analito de interés es glucosa, el componente enzimático del sistema de reactivos redox es una enzima que oxida la glucosa, por ej. una glucosaoxidasa o glucosadeshidrogenasa.

El segundo componente del sistema de reactivos redox es un mediador, el que está formado por uno o más agentes mediadores. Se conoce una variedad de diferentes agentes mediadores en la técnica e incluyen: ferrocianuro, fenacina, etosulfato, metosulfato de fenacina, feilendiamina, metosulfato de 1-metoxi-fenacina, 2,6-dimetil-1,4-benzoquinona, 2,5-dicloro-1,4-benzoquinona, derivados de ferroceno, complejos de osmio bipiridilo, complejos de rutenio, y similares. En aquellas formas de realización en las que la glucosa es el analito de interés y la glucosaoxidasa o glucosadeshidrogenasa son los componentes enzimáticos, los mediadores de particular interés son ferrocianuro y similares.

Otros reactivos que pueden estar presentes en el área de reacción incluyen agentes tamponadores, por ej. citraconato, citrato, málico, maleico, fosfato, tamponadores "buenos" y similares. Aún otros agentes que pueden estar presentes incluyen: cationes divalentes tales como cloruro de calcio y cloruro de magnesio; pirroloquinolinquinona; tensioactivos tales como Triton, Macol, Tetronic, Silwet, Zonyl y Pluronic; agentes estabilizantes tales como albúmina, sacarosa, trehalosa, manitol y lactosa.

El sistema de reactivos redox está generalmente presente en forma seca. Las cantidades de varios componentes pueden variar, la cantidad del componente enzimático varía típicamente desde aproximadamente 1 hasta 100 mg/ml, usualmente desde aproximadamente 5 hasta 80 mg/ml; y la cantidad del componente mediador varía típicamente desde aproximadamente 5 hasta 1000 mM, usualmente desde aproximadamente 90 hasta 900 mM.

Tras la introducción de la muestra, se obtienen los transitorios de corriente de primer y segundo tiempo. Los transitorios de primer y segundo tiempo se obtienen aplicando un potencial eléctrico constante a la célula y observando el cambio en la corriente durante un período de tiempo en la célula. En otras palabras, los pulsos primero y segundo se aplican a la célula y se observan los transitorios de corriente resultantes. Como tal, el transitorio de corriente de primer tiempo se obtiene aplicando un potencial eléctrico constante o primer pulso a la célula, por ej. entre el electrodo de trabajo y el de referencia, y observando el cambio en la corriente en el tiempo entre los electrodos, es decir, el cambio en la corriente de la célula, para obtener el transitorio de corriente de primer tiempo. La magnitud del primer potencial eléctrico aplicado generalmente se encuentra alrededor de -0,6 V, usualmente desde aproximadamente -0,2 a 0,4 V. La duración del tiempo durante el que se observa la corriente entre los electrodos para obtener el transitorio de corriente de primer tiempo típicamente varía desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 20 segundos, usualmente desde aproximadamente 4 hasta 10 segundos.

La corriente de segundo tiempo se obtiene aplicando un segundo potencial eléctrico constante o segundo pulso, de polaridad opuesta al primer potencial eléctrico constante durante un segundo período de tiempo. La magnitud de este segundo potencial eléctrico constante típicamente se encuentra alrededor de -0,6 V, usualmente desde aproximadamente -0,2 a 0,4 V, y en muchas formas de realización la magnitud del segundo potencial eléctrico es la misma que la magnitud del primer potencial eléctrico. El segundo período de tiempo típicamente varía desde aproximadamente 1 hasta 10 segundos, usualmente desde aproximadamente 2 hasta 4 segundos. Observando el cambio en la corriente entre los electrodos durante este segundo período de tiempo, se determina un transitorio de corriente de segundo tiempo para la célula.

El período de tiempo total requerido para obtener los transitorios de corriente de primero y segundo tiempo, como se describe anteriormente, es relativamente corto en ciertas formas de realización. En tales formas de realización, la cantidad de tiempo total requerida para obtener los transitorios de corriente de primero y segundo tiempo es menor que aproximadamente 30 segundos, usualmente menor que aproximadamente 20 segundos y más usualmente menor que aproximadamente 14 segundos.

La siguiente etapa en los procedimientos del tema es usar los transitorios de corriente de primero y segundo tiempo observados, obtenidos como se describió anteriormente, para determinar: (a) la variable \gamma de la célula electroquímica usada en el procedimiento; y (b) una concentración preliminar del analito de interés en la muestra.

La variable \gamma empleada en los procedimientos está definida para describir la desviación de la célula electroquímica del ideal. A modo de fondo, debería notarse que \gamma debería aproximarse a la unidad bajo condiciones ideales, es decir el equilibrio de reactivos y la reacción de la glucosa están completas antes del final del primer pulso. Si cualquiera de estas condiciones no se completa, causará una desviación de la relación hacia valores diferentes de la unidad. El numerador de \gamma está definido como la corriente en estado de equilibrio observada tras la aplicación del segundo potencial eléctrico a la célula, es decir valor predicho del transitorio de corriente de segundo tiempo a t = \infty. El denominador está definido como la corriente promedio durante un período de tiempo corto cerca del final del primer período de tiempo, es decir cerca del final de la aplicación del primer potencial eléctrico o primer pulso. El período corto de tiempo a partir del cual se determina la corriente promedio típicamente varía desde 0,2 hasta 2 segundos, usualmente desde aproximadamente 0,2 hasta 1,5 segundos y más usualmente desde aproximadamente 0,2 hasta 1,25 segundos, siendo este período de tiempo en muchas formas de realización de 0,3 segundos. La corriente promedio se determina en un tiempo cercano al final del primer período de tiempo, típicamente entre aproximadamente 0,1 a 1 segundo. La variable \gamma está descrita por la fórmula:

\gamma = i_{ss}/i_{pp}

donde:

i_{ss} es la corriente en estado de equilibrio del segundo potencial eléctrico aplicado; y

i_{pp} es la corriente promedio durante un período corto de tiempo cercano al final del primer período de tiempo, es decir cerca del final del tiempo en el que el primer potencial eléctrico se aplica a la célula. Por ejemplo, cuando el primer período de tiempo tiene una duración de 10 segundos, la corriente promedio puede ser la corriente promedio desde 8,5 hasta 9,5 segundos de los 10 segundos de duración del período, el que es un período de tiempo de un segundo a 0,5 segundos del final del primer período de tiempo. Como se menciona anteriormente, los transitorios de corriente del primer y segundo tiempo se emplean también para calcular un valor preliminar de concentración del analito para la muestra ensayada. En muchas formas de realización, la concentración preliminar del analito se determina usando las siguientes ecuaciones:

i(t) = i_{ss} \{1 + 4\ exp(-4\pi^{2}Dt/L^{2})\}

i_{ss} = 2 FADC_{0}/L

donde

i_{ss} es la corriente en estado estacionario tras la aplicación del segundo potencial eléctrico;

i es la corriente medida, la que está en función del tiempo

D es el coeficiente de difusión de la célula, el que puede determinarse con la primera ley de Fick, es decir J(x,t) = -D^{dC(x,t)}/_{dx}

L es el espesor del espaciador;

t es el tiempo para la aplicación del 2º potencial eléctrico, donde t=0 es el inicio del pulso

C_{0} es la concentración preliminar del analito;

F es la constante de faraday, es decir 9,6485 x 10^{4} C/mol; y

A es el área del electrodo de trabajo.

Usando las ecuaciones y etapas anteriores, los transitorios de corriente de primero y segundo tiempo se usan para determinar la variable \gamma de la célula electroquímica usada en el procedimiento y el valor preliminar de concentración del analito de interés en la muestra fisiológica ensayada.

Con la variable \gamma determinada y el valor preliminar de concentración del analito, se determina un factor de corrección por el hematocrito, el que se usa para obtener un valor de concentración de analito corregido con el hematocrito desde el valor inicial preliminar de concentración del analito descrito anteriormente. El factor de corrección por el hematocrito es un factor por el que se puede multiplicar la concentración preliminar del analito (típicamente menos un valor de fondo) para obtener el valor de concentración del analito corregido con el hematocrito, es decir un valor de concentración del que se ha eliminado el componente correspondiente al hematocrito. El factor de corrección por el hematocrito es una función del valor preliminar de concentración del analito y de la variable \gamma de la célula electroquímica.

En los procedimientos del tema puede usarse cualquier factor de corrección por el hematocrito que pueda multiplicarse por el valor preliminar de concentración (usualmente menos un valor de fondo, como se describe en detalle a continuación). Una clase de factores de corrección por el hematocrito que tiene utilidad en los procedimientos del tema son aquellos que se calculan a partir de un gráfico tridimensional de C_{0}, \gamma y \alpha(C_{0}, \gamma) obtenido a partir de datos experimentales usando un amplio intervalo de valores de analito y hematocrito. El factor de corrección por el hematocrito (\alpha(C_{0}, \gamma)) se determina usando la fórmula:

\alpha(C_{0}, \gamma) = \text{concentración real}/(C_{0} - \text{Valor de Fondo})

(Por ejemplo, para analito glucosa, \alpha(C_{0}, \gamma) en muchas formas de realización es igual a la concentración de glucosa determinada usando el analizador de glucosa Yellow Springs Instrument modelo 23A (como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.968.760) dividida por C_{0} menos el valor de fondo, por ej. 22 mg/dl). Esta clase de factores de corrección por el hematocrito son típicamente ecuaciones que corresponde con una función de superficie suave que minimiza el error entre el dato predicho y el real. Ver por ej. la sección experimental, más adelante. Un factor de corrección por el hematocrito representativo que tiene utilidad en los procedimientos del tema es:

1/((0,6637) + ((4,9466*ln(C_{0}))/C_{0}) + (-0,4012*ln(\gamma)))

Para determinar la concentración de analito corregida con el hematocrito de acuerdo con la invención, la concentración preliminar del analito (C0) determinada anteriormente, menos un valor de señal de fondo, se multiplica por el factor de corrección por el hematocrito. El valor de fondo que se sustrae del valor preliminar de concentración depende del analito que se está midiendo. Para glucosa, este valor típicamente varía desde aproximadamente 0 hasta 40 mg/dl, usualmente desde aproximadamente 8 hasta 25 mg/dl; en muchas formas de realización el valor de fondo es aproximadamente 22 mg/dl o es 22 mg/dl.

Generalmente, se emplea la siguiente fórmula para determinar la concentración de analito corregida con el hematocrito de acuerdo con la invención del tema:

\text{concentración corregida con el hematocrito} = \text{factor de corrección por el hematocrito}\ x [C_{0} - \beta]

donde

\beta es el valor de fondo; y

C_{0} es la concentración preliminar del analito.

Los procedimientos descritos anteriormente producen un valor de concentración del analito corregido con el hematocrito, es decir un valor de concentración en el que se desglosó y eliminó el componente correspondiente al hematocrito. Como tal, los procedimientos descritos anteriormente proveen los elementos para obtener un valor exacto de la concentración del analito en la muestra ensayada.

Las etapas computacionales anteriores del procedimiento pueden realizarse manualmente o a través del uso de un medio computarizado automático, siendo de interés en muchas formas de realización el uso de un medio computarizado automático, tal como se describe junto con los dispositivos del tema a continuación.

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Dispositivos

Con esta invención también se proveen medidores para el uso en la práctica de la invención del tema. Los medidores son típicamente para medir amperométricamente la concentración corregida con el hematocrito de un analito en una muestra fisiológica. Los medidores del tema típicamente incluyen: (a) un medio para aplicar un primer potencial eléctrico a una célula electroquímica en la que se ha introducido la muestra y para medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de primer tiempo; (b) un medio para aplicar un segundo potencial eléctrico a la célula electroquímica y para medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un segundo transitorio de corriente de segundo tiempo; (c) un medio para determinar un valor preliminar de concentración de analito y una variable \gamma de dichas corrientes de primer y segundo tiempo; y (d) un medio para eliminar el componente correspondiente al hematocrito del valor preliminar de concentración para calcular un valor de concentración del analito corregido con el hematocrito en dicha muestra. Los medios (a) y (b) pueden ser medios adecuados como los descritos en la Patente de EEUU Nº 5.942.102. Los medios (c) y (d) son típicamente medios computacionales presentes en el medidor capaces de usar los transitorios de corriente de primer y segundo tiempo para obtener finalmente la concentración del analito corregida con el hematocrito. Como tal, (c) es típicamente un medio capaz de determinar la concentración preliminar del analito de interés y la variable \gamma de los transitorios de corriente de primer y segundo tiempo usando las ecuaciones descritas anteriormente. Asimismo, el medio (d) es típicamente un medio capaz de determinar la concentración de analito corregida con el hematocrito usando las ecuaciones descritas anteriormente, y típicamente comprende el factor de corrección por el hematocrito.

Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.

Parte experimental I. Preparación de tira para prueba electroquímica

Se preparó una tira para prueba electroquímica consistente en dos electrodos metalizados orientados en una configuración sándwich de la siguiente manera. La capa superior de la tira fue una tira Mylar con deposición catódica de oro. La capa media fue una capa adhesiva de doble cara con una perforación que definió el área o zona de reacción. La perforación fue circular con 2 canales rectangulares yuxtapuestos, uno de entrada y uno de salida. La capa inferior de la tira fue de Mylar con deposición catódica de paladio. En la superficie de la deposición catódica de paladio se depositó una película de ferrocianuro y glucosaoxidasa PQQ.

II. Generación de datos experimentales

Se obtuvieron de la siguiente manera, transitorios de corriente de primer y segundo tiempo para un número de muestras diferentes con concentraciones variables de glucosa y hematocrito. Se aplicó la muestra a la tira y se le aplicó un potencial de -0,03 V durante un período de 10 segundos seguido por un segundo pulso de +0,3 V durante un período de 3 a 10 segundos (estos potenciales de electrodo son respecto al electrodo de oro).

III. Cálculo del factor de corrección por el hematocrito para glucosa

Se calcularon C_{0}, la variable \gamma y \alpha(C_{0}, \gamma) para un amplio intervalo de valores de glucosa y hematocrito medidos como se describió anteriormente.

C_{0} se calculó usando la ecuación:

i(t) = i_{ss} \{1+ 4\ exp(-4\pi^{2}Dt/L^{2})\}

i_{ss} = 2 FADC_{0}/L

donde

i_{ss} es la corriente en estado estacionario tras la aplicación del segundo potencial eléctrico;

i es la corriente medida, la que está en función del tiempo

D es el coeficiente de difusión de la célula, el que puede determinarse con la primera ley de Fick, es decir J(x,t) = -D^{dC(x,t)}/_{dx}

L es el espesor del espaciador;

t es el tiempo para la aplicación del 2º potencial eléctrico, donde t=0 es el inicio del pulso

C_{0} es la concentración preliminar del analito;

F es la constante de faraday, es decir 9,6485 x 10^{4} C/mol; y

A es el área del electrodo de trabajo.

La variable \gamma se calculó usando la ecuación:

\gamma = i_{ss}/i_{pp}

donde:

i_{ss} es la corriente en estado estacionario del segundo potencial eléctrico aplicado o segundo pulso; y

i_{pp} es la corriente promedio de 8,5 a 9,5 segundos del período de 10 segundos durante el cual se aplicó el primer pulso.

\alpha(C_{0}, \gamma) se determinó usando la ecuación:

\alpha(C_{0}, \gamma) = \text{concentración YSI}/(C_{0} -22\ mg/dl)

donde YSI es la concentración de glucosa determinada usando el analizador de glucosa Yellow Springs Instrument modelo 23A (como se describe en la Patente de EEUU Nº 5.968.760).

En la figura 1 se muestra un gráfico tridimensional de C_{0}, \gamma y \alpha (C_{0,} \gamma) como se determinaron anteriormente para un amplio intervalo de valores de glucosa y hematocrito. Posteriormente se adaptó una ecuación simple al gráfico para definir la superficie. Se estudiaron los datos residuales que no se adaptaron a la ecuación para averiguar la calidad de la ecuación modelo. La ecuación empírica resultó ser:

\text{Factor de Corrección por Hematocrito} = 1/((0,6637) + ((4,9466*ln(C_{0}))/ C_{0}) + (-0,4012*ln(\gamma)))

El factor de corrección anterior resultó válido para aquellas situaciones en las que \gamma > 0,7 y C_{0} > 40 mg/dl.

IV. Comparación de los valores corregidos con el hematocrito con los valores determinados con YSI

Se generó una serie de datos predictivos probando varias tiras de glucosa con un amplio intervalo de niveles de glucosa y hematocrito. Se desarrolló una ecuación de corrección por el hematocrito a partir de estos datos usando un modelo que adapta los términos C_{0}, \gamma y \alpha(C_{0}, \gamma). Se encontró que usando la ecuación de corrección por el hematocrito en la serie de datos predictivos, la mayoría de los puntos cayeron dentro de +/- 15%. También se encontró que el sesgo de la glucosa resulta para un hematocrito de 42%, indicando que el efecto del hematocrito en estos datos es mínimo. Con el fin de confirmar este algoritmo, se probó otro lote de sensores de glucosa con un dador de sangre diferente. Se encontró que el algoritmo aún corrige el efecto del hematocrito de manera análoga a los hallazgos anteriores.

Los resultados y la discusión anteriores demuestran que la invención del tema provee una herramienta simple y poderosa para obtener valores de concentración de analitos, en los que el error derivado del hematocrito es sustancialmente si no completamente eliminado. Como los procedimientos del tema dependen solo de la medición de transitorios de corriente en el tiempo, éstos deben poder realizarse con dispositivos electroquímicos relativamente simples. Además, se emplean solo pequeños volúmenes de muestra y los tiempos requeridos para la prueba son relativamente rápidos. Como tal, la presente invención representa una contribución significativa en la técnica.

Claims (8)

1. Un procedimiento para determinar la concentración de un analito en una muestra fisiológica, en el que la muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma, que comprende:

(a) introducir dicha muestra fisiológica en una célula electroquímica que comprende:

(i)

electrodos de referencia y trabajo separados; y

(ii)

un sistema de reactivos redox que comprende una enzima y un mediador;

(b) aplicar un primer potencial eléctrico con una primera polaridad a dicha célula de reacción y medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de primer tiempo;

(c) aplicar un segundo potencial eléctrico con una segunda polaridad a dicha célula, en el que dicha segunda polaridad es opuesta a dicha primera polaridad, y medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de segundo tiempo; y

(d) calcular una concentración preliminar del analito y la variable \gamma de dichos transitorios de corriente de primer y segundo tiempo;

caracterizado porque el procedimiento adicionalmente comprende la etapa de

(e) multiplicar dicha concentración preliminar del analito, menos un valor de fondo, por un factor de corrección por el hematocrito para calcular dicha concentración de analito corregida con el hematocrito en dicha muestra;

en el que dicho factor de corrección por el hematocrito es una función de dicha concentración preliminar del analito y \gamma de dicha célula electroquímica, en la que \gamma describe la desviación de la célula electroquímica del ideal;

con lo que se determina la concentración de dicho analito corregida con el hematocrito en dicha muestra.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho factor de corrección por el hematocrito modula el valor preliminar de concentración del analito para eliminar el componente derivado del hematocrito de dicho valor preliminar de concentración del analito.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho analito es glucosa.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho factor de corrección por el hematocrito es igual a:

1/((0,6637) + ((4,9466*ln(C_{0}))/ C_{0}) + (-0,4012*ln(\gamma)))

en el que:

C_{0} es dicha concentración preliminar.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicha primera polaridad es negativa y dicha segunda polaridad es positiva.

6. Un medidor para medir amperométricamente la concentración de un analito en una muestra fisiológica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma, y dicho medidor comprende:

(a) un medio para aplicar un primer potencial eléctrico con una primera polaridad a una célula electroquímica que comprende dicha muestra y para medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un transitorio de corriente de primer tiempo;

(b) un medio para aplicar un segundo potencial eléctrico con una segunda polaridad a dicha célula electroquímica en el que dicha segunda polaridad es opuesta a dicha primera polaridad y para medir la corriente en la célula en función del tiempo para obtener un segundo transitorio de corriente de segundo tiempo;

(c) un medio para determinar un valor preliminar de concentración del analito y una variable \gamma de dichos transitorios de corriente de primer y segundo tiempo, en el que dicha variable \gamma describe la desviación de la célula electroquímica del ideal; y caracterizada por

(d) un medio para eliminar el componente correspondiente al hematocrito de dicho valor preliminar de concentración para calcular dicha concentración del analito en dicha muestra, por el cual la concentración preliminar del analito menos un valor de fondo se multiplica por un factor de corrección por el hematocrito para calcular dicha concentración del analito corregida con el hematocrito en la muestra, siendo dicho factor de corrección por el hematocrito función de dicha concentración preliminar del analito y \gamma de dicha célula electroquímica.

7. El medidor de acuerdo con la reivindicación 6, en la que en dicho medidor está presente una tira para prueba electroquímica.

8. Un sistema para usar en la determinación de la concentración de un analito en una muestra fisiológica de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra fisiológica es sangre entera o un derivado de la misma, comprendiendo dicho sistema:

(a) una tira para prueba electroquímica; y

(b) un medidor de acuerdo con la reivindicación 6.