JP2004522408A - プレセニリンエンハンサー - Google Patents
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Abstract
本発明はｐｅｎ特異的構造及び活性を有するｐｅｎポリペプチド、関連ポリヌクレオチド及びｐｅｎ機能のモジュレーターに関する方法及び組成物を提供する。本発明は、天然ｐｅｎ遺伝子と特異的にハイブリダイズする能力のある単離されたｐｅｎハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、ｐｅｎ特異的結合をする薬剤、例えば特異的抗体、並びに診断（例えばｐｅｎ転写物の遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（例えば、ＡＰＰ生成を調節するｐｅｎ阻害物質）及び生物薬剤産業（例えば、免疫原、リード薬物の化学ライブラリをスクリーニングするための試薬等）における対象組成物を製造及び使用する方法を提供する。
Description
【０００１】
（導入）
（発明の分野）
本発明の分野は、プレセニリン機能を調節するタンパク質である。
【０００２】
（背景）
アルツハイマー病は、中年から後年において記憶障害及び認知低下を引き起こす中枢神経系の変性疾患である。疾患は２つの主な病理学的特徴、脳内の細胞外アミロイドプラークとニューロン内神経原繊維変化により特徴づけられる。これらの障害は神経及びグリア細胞の機能を阻害し、シナプスの減少および痴呆を引き起こす。早発性及び遅発性発症のどちらの型の疾患も遺伝的な要素を有していることが示されており、４つの遺伝子がＡＤの増大したリスクに決定的に関連している：ＡＰＰ、ＰＳ１、ＰＳ２及びＡｐｏＥ。これらの遺伝子は、最終的にアミロイドβ（Ａβ）、アルツハイマーアミロイドプラークの主要成分の生成、輸送、及び／又は排除の役割に機能的に関連している（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９９ ｓｕｐｐ： Ａ２３参照）。
【０００３】
アルツハイマーアミロイドプラークは、大部分、４０−４２のアミノ酸ペプチドＡβから成る（Ｇｌｅｎｎｅｒ， Ｇ． Ｇ．， 及び Ｗｏｎｇ， Ｃ． Ｗ．， １９８４ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １２２：１１３１）。Ａβはｂアミロイド前駆体タンパク質、又はβＡＰＰからタンパク質分解性の切断により誘導される（Ｋａｎｇ Ｊ． 等 １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３）。３つの分泌酵素活性はＡＰＰを切断してＡβペプチド又はより短いｐ３と呼ばれる別の断片産物を生成する。β分泌酵素はＡβのＮ末端を生成するが、α分泌酵素はＡβ配列を内部切断してｐ３のＮ末端を生成する。γ分泌酵素は、ＡＰＰのＣ末端β及びα分泌酵素産物を切断してＡβ及びｐ３の異質性のＣ末端を生成する。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）系統に見られるＡＰＰ突然変異は、３つの分泌酵素切断部位の周りに集まり（Ｇｏａｔｅ， Ａ． 等 １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４； Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．，等 １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ等 １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４； Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ．等 １９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：３４５； Ｌｅｖｙ， Ｅ．等， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２４； Ｈｅｎｄｒｉｋｓ， Ｌ．等１９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：２１８）、それらはそれぞれ全Ａβ（Ａβ４２＋Ａβ４０）を増加するか、又はＡβ４２／４０の割合を増加する。Ａβ４２はインビトロでより敏速に沈殿し、びまん性老人斑と呼ばれるアミロイド沈着の素早い形成の主要成分であるため、増加した全身性のＡβ４２はプラークのより早い形成、ＡＤのより早い発症を引き起こしうる。
【０００４】
家族研究によって優性遺伝、早期発症ＡＤに関連する他の２つの遺伝子、プレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）が同定された（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ． 等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４； Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ．等 １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ９７３； Ｒｏｇａｅｖ．， Ｅ． Ｉ． 等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ７７５）。これらのタンパク質は、配列において互いに類似し、８つの膜貫通セグメントを有するポリトピック膜タンパク質をコードする。ＦＡＤヒト細胞株、トランスフェクト細胞、及び遺伝子導入マウスの研究によって、ＰＳ ＦＡＤ突然変異がＡＰＰのプロセシングパターンに変化を生じさせ、Ａβ４２／４０の割合を増加させることが説明された（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ， Ｄ．等 １９９６， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：８６４； Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．等 １９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：６７； Ｂｏｒｃｈｅｌｔ， Ｄ．等 １９９６， Ｎｅｕｒｏｎ １７： １００５； Ｄｕｆｆ， Ｋ．等 １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８３： ７１０； Ｔｏｍｉｔａ， Ｔ．等 １９９７， ＰＮＡＳ ９４：２０２５）。ＰＳ１ノックアウトマウスの研究によって、ＰＳ１機能の低下はγ分泌酵素活性の減小によるＡβ生成の減少を引き起こすことが説明された（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ， Ｂ．等 １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ３８７）。従ってプレセニリン機能は２つの経路：ミスセンス突然変異がγ分泌酵素切断特異性を変化させること、さらにプレセニリン活性の低下がγ分泌酵素活性の低下を引き起こすことで、γ分泌酵素の活性に関与する。
【０００５】
プレセニリン活性の阻害は、Ａβ生成を減少させ、従ってアルツハイマー病に対する潜在的に有用な治療アプローチである。しかしながら、γ分泌酵素活性とＡβの生成に対する機能的な関与にも関わらず、ＰＳ活性の生物学的性質はあまり分かっていない。ＥＲ及び／又はゴルジ複合体でのＡＰＰ、Ｎｏｔｃｈ、及び／又はγ分泌酵素のシャペロンとしての作用（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ， Ｇ． 等 １９９８， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ４： ４３８）、新規なアスパルチルプロテアーゼとしての、すなわちそれ自体のγ分泌酵素としての活性（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ． 等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１３）、及び酸化ストレス及びアポトーシスに対する反応における潜在的な役割（Ｗｏｌｏｚｉｎ， Ｂ．等 １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１７１０； ｖｉｔｏ， Ｐ．等 １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７２：２８３１５； Ｇｕｏ， Ｑ．， 等 １９９７， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：４２１２）を含む様々な機能が提案されている。明確な機能的アッセイがないことは、プレセニリンを対象とする有用な小分子治療学の確立の困難性を増大させる。プレセニリンを対象とする代わりの方法は、γ分泌酵素及びＡβ生成の経路においてプレセニリンと共に作用し、薬剤の開発にさらに受け入れられやすい更なるタンパク質を見つけねばならない。このような新規な対象の発見に利用できる方法の１つは、ショウジョウバエ及び線虫等のモデル生物でプレセニリンと相互作用する遺伝子の遺伝子スクリーニングを行うことである。
【０００６】
ＰＳ遺伝子の無脊椎動物オルソログが、配列検索及び遺伝子スクリーニングの両方により同定されている。線虫のゲノムは、３つのプレセニリン遺伝子、ｓｅｌ−１２（ｌｉｎ−１２のサプレッサー及び／又はエンハンサー；Ｌｅｖｉｔａｎ， Ｄ．等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３５１）、ｈｏｐ−１（プレセニリンのホモログ；Ｌｉ， Ｘ．等， １９９７， ＰＮＡＳ ９４：１２２０４）及びｓｐｅ−４（精子形成欠陥；Ｌ’Ｈｅｒｎａｕｌｔ等， １９９２， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１９：５５）を含む。ｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１及びｓｐｅ−４はそれぞれ、ＰＳ１及び２と４８、３５及び２３％の配列類似性を有する。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１は幾つかの組織で重複した機能を有し（下記参照）、さらにｓｐｅ−４はオスの生殖系列で独立した機能を果たすようである。導入遺伝子を用いたレスキュー実験により、ヒトＰＳ１及びＰＳ２はｓｅｌ−１２の低下により生じる表現型を救済することができることが示され、プレセニリン機能が線形動物から哺乳動物まで保存されていることを証明する（Ｌｅｖｉｔａｎ， Ｄ． 等 １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３５１； Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ， Ｒ． 等 １９９７， Ｇｅｎｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １：１４９）。
【０００７】
ｓｅｌ−１２はＮｏｔｃｈ遺伝子ｌｉｎ−１２の活性化対立遺伝子のサプレッサーとして遺伝学的に同定された。この発見はプレセニリン活性及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性の間の機能的な関係を証明した。マウス（Ｈｅｒｒｅｍａｎ， Ａ．等 １９９９， ＰＮＡＳ ９６：１１８７２）、ショウジョウバエ（Ｓｔｒｕｈｌ， Ｇ．等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５２２； Ｙｅ， Ｙ．等 １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５２５）及び線虫（Ｌｉ， Ｘ．等， １９９７， ＰＮＡＳ ９４：１２２０４； Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ．等 １９９９， ＰＮＡＳ ９６：２４９７）でのインビボ実験では、プレセニリン活性の完全な欠損の表現型が生物におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の完全な排除と非常によく一致することが示され、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性に絶対的に必要であることを示唆する。Ｎｏｔｃｈレセプターは、無脊椎動物及び脊椎動物の多くの胚及び成体の組織の分化に重要な細胞間シグナル伝達現象を媒介する細胞表面にある１回貫通型の膜貫通タンパク質である。シグナル伝達は、膜貫通セグメントの内面におけるＮｏｔｃｈのリガンド依存性切断、それに続く核のＣ末端ドメインの転位座に関与する。細胞培地及びインビボでのＮｏｔｃｈプロセシングの分析は更に、プレセニリンがＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを膜貫通ドメインから放すリガンド依存性切断現象に必要であることを示した（Ｓｔｒｕｈｌ， Ｇ．等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５２２； Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ， Ｂ．等 １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１８）。Ｎｏｔｃｈ及びＡＰＰの両方の切断におけるプレセニリンの類似した要求は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路がプレセニリン系遺伝子のスクリーニングでＡｂ生成の代わりに利用できる代用のアッセイであり得ることを示唆する。
【０００８】
線虫プレセニリンｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の突然変異は、線虫Ｎｏｔｃｈレセプターｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１による欠陥のあるシグナル伝達と関係した表現型となる。ｈｏｐ−１単独の欠損では、明らかな表現型とはならない。ｓｅｌ−１２の欠損は、ｌｉｎ−１２突然変異を思わせる産卵口の欠損と強い産卵障害表現型となる。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１両方の欠損はｓｅｌ−１２単独の場合に見られるＮｏｔｃｈ表現型をより重大に生じる。ｓｅｌ−１２；ｈｏｐ−１二重突然変異に見られる特定の表現型は、これらの虫が母性の野生型プレセニリン活性を受け継ぐかどうかによる。母性的に与えられるｓｅｌ−１２＋活性がある場合、二重突然変異は新たな産卵欠陥表現型を示し、全ての子孫がｇｌｐ−１様の発達欠陥で胚形成の間に停止する。母性ｓｅｌ−１２＋活性のない場合には、二重突然変異はｇｌｐ−１突然変異の生殖系列増殖欠陥特性を有する生殖不能のより強い表現型を示す。総合して、この一連の特性は、ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１が部分的に重複し、２つの線虫Ｎｏｔｃｈレセプターによるシグナル伝達を刺激するために協調的に作用することを示す。
【０００９】
ｓｅｌ−１２とｈｏｐ−１活性の間の部分的な重複性は、ｓｅｌ−１２；ｈｏｐ−１二重突然変異に相当する表現型を生じうる機能対立遺伝子のｓｅｌ−１２欠損のエンハンサー検索を可能にする。このエンハンサースクリーニングは、ｐｅｎ−１及び２（ｐｅｎ＝プレセニリンエンハンサー）と名付けられ、プレセニリン機能に必要とされる２つの新規な遺伝子を同定した。ｐｅｎ遺伝子の表現型に基づいて、我々は第３のプレセニリンエンハンサー遺伝子、ａｐｈ−２を同定した。ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２及びａｐｈ−２遺伝子配列は、ｐｅｎ−１Ｂを含むヒト及び他の動物のオルソロガス遺伝子を同定する。これらの遺伝子及びそれらを調節する方法は、アルツハイマー病治療のための治療法進歩のための対象である。
【００１０】
（関連分野）
ヒトｐｅｎ−１に関する配列は、特にＷＯ９８５５５０８、ＷＯ９８５５５０８、ＷＯ９９０６５５４及びＵｎｉｇｅｎｅ ＣＧＩ−７８（ＧＩ＃６９１１５２２及びＧＩ＃４９２９６２３）に見られる。
ヒトｐｅｎ−２に関する配列は、特にＡＤ０００６７１（ゲノム）及びＧＩ＃３６０１３７１（ｃＤＮＡ）に見られる。
ヒトＡｐｈ−２に関する配列は、特にＷＯ９８４５４３５、ＷＯ９８４５４３６、ＷＯ９３００３５３及び（ＫＩＡＡ０２５３、ＤＮＡ ＧＩ１６６５７７２、タンパク質ＧＩ１６６５７７３）に見られる。
多数のＥＳＴｓが、ここに開示される天然ヒトｐｅｎ−１Ｂ配列の部分を含む公的データベースに見られ、ｎｓ４３ｇ０８．ｓｌ（ＧＩ＃２８７４５２０、注釈なし）及びＵｎｉｇｅｎコンティグＨｓ．４２９５４（ｐｅｎ−１（ＣＧＩ−７８）に５３％類似）のＥＳＴｓを含み、それは、ＡＩ５３８２０４（ＩＭＡＧＥ：２１８９９８６）； ＡＡ８０８３５５（ＩＭＡＧＥ：１３３４４１７）； Ｎ２１１５３（ＩＭＡＧＥ：２６４８６８）； ＡＩ２０４１６４（ＩＭＡＧＥ：１７３４８４０）； ＡＩ００１９９０（ＩＭＡＧＥ：１６１９１９１）； ＡＡ５７８７１８（ＩＭＡＧＥ：９５３２４１）； ＡＡ８８７９７５（ＩＭＡＧＥ：１１６０１１９）； ＡＩ００４２８２（ＩＭＡＧＥ：１６２６００４）； ＡＩ１８８０４０（ＩＭＡＧＥ：１７３８９５４）； ＡＩ１９２０３３（ＩＭＡＧＥ：１７３８６５９）； ＡＩ００５１１３（ＩＭＡＧＥ：１６２６２７７）； ＡＷ１１８９０８（ＩＭＡＧＥ：２６０５６３１）； ＡＩ７６０７５４（ＩＭＡＧＥ：２３９８３４９）； ＡＡ８０５７７０（ＩＭＡＧＥ：１１８６４３０）； ＡＡ８０５７５７（ＩＭＡＧＥ：１１８６４０６）； ＡＷ１８２０７１（ＩＭＡＧＥ：２６６２４２８）； ＡＡ８０５７７３（ＩＭＡＧＥ：１１８６４３６）； ＡＩ３０１１９１（ＩＭＡＧＥ：１８９７２５３）； ＡＡ９７６４５５（ＩＭＡＧＥ：１５８９８９５）； 及びＮ３１７１０（ＩＭＡＧＥ：２７１２９２）。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、プレセニリンエンハンサータンパク質（ｐｅｎｓ）に関する方法、組成物及びシステムを提供し、プレセニリン−ｐｅｎ相互作用を調節（例えば、促進又は抑制）及び検出する方法を含む。特定の態様では、本方法は、上流又は下流のＮｏｔｃｈ又はＡＰＰのプロセシングとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）の機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するために提供され、次のことによってなされる：（ｉ）Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの機能的相互作用を提供するシステムに所定のストレスを導入し、それによって、システムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの不偏性相互作用を提供するものであり；及び（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用を検出し、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異は、ストレスがＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの相互作用を変化させることを示す。
【００１２】
システムは、ｐｅｎ発現が非天然又は病原性であると決定されるｐｅｎを発現する生細胞、あるいは規定量のｐｅｎを含有するインビトロ無細胞混合物であり得る。広範で様々な実施態様が包含され；例えば、システムが、生細胞、インサイツ又はインビトロであるもの、ストレスが、薬理学的に活性な薬剤、或いは例えばｐｅｎをコードする別の内在性対立遺伝子のゲノム崩壊又はｐｅｎをコードする内在性対立遺伝子の配列アンチセンスを含むポリヌクレオチドの共発現等によるｐｅｎの機能的発現の欠損であるものである。或いは、システムは、インビトロ、無細胞混合物であってもよく、ストレスは薬理学的に活性な薬剤である。
Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用は、あらゆる都合のよい手段又はマーカーにより検出することができ、例えばアルツハイマー病の徴候、Ｎｏｔｃｈの転写レポーター、Ａβ等の下流産物の生成又はｐｅｎの例えば特定の抗体との構造変化を検出する。
【００１３】
本発明は、ｐｅｎ特異的構造及び活性を有するｐｅｎポリペプチド、関連するヌクレオチド及びｐｅｎ機能の調節因子に関する様々な他の方法及び組成物を提供する。ｐｅｎポリペプチドは、対象ｐｅｎポリペプチドコーディング核酸で形質転換した宿主細胞から組み換えにより作成しても、例えば哺乳動物細胞等の天然源から精製してもよい。本発明は、天然ｐｅｎ遺伝子と特異的にハイブリッド形成する能力のある単離したｐｅｎハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、ｐｅｎに特異的に結合する薬剤、例えば特異的抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト、並びに診断（例えばｐｅｎ転写物の遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（例えば、Ａβ生成を調節するｐｅｎ阻害物質）及び生物薬剤産業（例えば、免疫原、天然ｐｅｎ遺伝子及び転写物を単離するための試薬、リード薬物の化学ライブラリをスクリーニングするための試薬）における対象組成物を製造及び使用する方法を提供する。特定の態様では、ｐｅｎ方法及び組成物はｐｅｎ−１Ｂポリペプチドに関する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プレセニリンエンハンサータンパク質（ｐｅｎｓ）に関する方法、組成物及びシステムを提供し、ｐｅｎとＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとの間の相互作用を調節（例えば、促進又は阻害）及び／又は検出の方法を含む。特定の実施態様では、本方法は、プレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）とＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングの機能的な相互作用を変化させるストレスの特異的な検出を提供する。
ｐｅｎはｐｅｎ−１、ｐｅｎ−１Ｂ、ｐｅｎ−２及びＡｐｈ−２ポリペプチドから単独で選択される。これらの名称は、開示された親配列を含む、その特定断片を含む、或いは開示される親配列に類似した配列を有するポリペプチドを呼ぶ際に一般的に使用され、配列類似性は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％であり、具体的に開示されるプレセニリン又は相当する親配列ｐｅｎ特異的抗体に特異的に結合し、一以上の開示される相互作用アッセイで測定される。ポリペプチドは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも５０の連続した残基、及び最も好ましくは全ポリペプチド及び／又は親ｐｅｎ配列にわたって含み、並びに類似性又は同一性がその範囲にわたる。
【００１５】
表１．親ｐｅｎポリペプチド
【００１６】
開示される同義遺伝子について、親配列に関して「特定のウィンドウサイズＷを超えるパーセント（％）配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後に、親配列の残基と一致する候補配列のＷ残基の任意のウィンドウにおける残基のパーセンテージとして定義される。％同一性の値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９により作られる。幾つかの検索パラメータを使用するＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９は、その全てが初期の値に設定される。ＨＳＰ ＳとＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び対象の配列が検索されるものに対する特定のデータベースの組成に応じてプログラム自身により確立されるが；しかしながら、値は感度を向上させるように調節してもよい。従って、％アミノ酸配列同一性の値は、パーセント同一性が記録されるウィンドウサイズＷで割った一致する同一残基数により決定される。一致する親配列を突然変異させ、プレセニリン又は抗体結合を確認することにより例示的な種が容易に作成される。例えば、配列番号：１６−２５に定義されるｐｅｎ−１Ｂポリペプチドは、親配列である配列番号：６の周りに活性な（プレセニリン結合を示す）９０％のジーナスを例証する。特定の実施態様では、ｐｅｎは天然のｐｅｎ、例えばヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、オオタバコガ（Ｈ． ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）又は線虫のｐｅｎ−１；ヒト、ラット、マウス、ウシ、キイロショウジョウバエ又は線虫のｐｅｎ−２；ヒトのｐｅｎ−１Ｂ；及びヒト、キイロショウジョウバエ又は線虫のＡｐｈ−２である。特定の態様では、ｓｅｌ−１２Δ（Δは欠失対立遺伝子を意味する）ホモ接合ｐｅｎは線虫遺伝子突然変異エンハンサースクリーニングで同定可能な天然に生じるｐｅｎである。
【００１７】
ｐｅｎとＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとの間の相互作用は、プロセシング経路でのｐｅｎの影響を特異的にアッセイするあらゆる便利な方法で検出されうる。生成物の生成（例えば、Ａβ又はＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン生成）の下流摂動、中間経路段階（多くの中間Ｎｏｔｃｈ及びＡＰＰプロセシング経路段階及び中間成分相互作用が当該分野でよく記録されてる）、又はｐｅｎ−プレセニリン又はｐｅｎ−γ分泌酵素結合の開始をモニターするためにアッセイが構築されうる。
広範な種々のシステムが本方法に使用されうる。以下に記載されるのは、突然変異体ｐｅｎ遺伝子でストレスを与え、感作したＮｏｔｃｈ及び／又はＡＰＰプロセシング経路を提供する動物システムであり、システムは更なる相互作用タンパク質を特徴づけるのに使用される。特定の実施態様では、システムはプレセニリン又はγ分泌酵素等の結合標的とｐｅｎの両方を発現する細胞又は動物、規定量のｐｅｎ及び結合標的を含有するインビトロ無細胞混合物を含み；このような細胞及び混合物の適用は、２−ハイブリッド、生化学的ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ、免疫沈降、蛍光偏光及び固相結合アッセイを含む。適用できるシステムの多様性により、化学薬品、例えば候補薬、毒、汚染物質等；放射線、例えば紫外線及びｘ線；感染、例えば細胞性形質転換を含むウィルス又は細菌感染；遺伝子突然変異等を含む広範な種々のストレスがアッセイ又は評価されうる。
【００１８】
相互作用が特異的に検出されれば、ｐｅｎポリペプチドとプレセニリンの相互作用の検出のために用いられる特定の方法はアッセイの性質に依存しうる。例えば、以下に説明されるように、ｐｅｎ突然変異体特定表現型の調節は、遺伝子相互作用アッセイについての読み取りを与える。インビトロアッセイにおいて、ｐｅｎポリペプチド及び／又は標的が標識されるかどうか、どのようにしてそれが為されるかによって、相互作用の読み取りは蛍光、光学濃度、ゲルシフト、放射等の変化により測定されうる。特定の実施態様では、システムは下流ＡＰＰプロセシング読み取りを提供する。
特定の実施態様では、本方法は、ＡＰＰ及び／又はＮｏｔｃｈプロセシングとｐｅｎポリペプチドの物理的な相互作用を変化させるストレスの特異的な検出を包含する。一態様では、この実施態様は次の工程を含む（ａ）結合標的とｐｅｎの物理的相互作用を与えるシステムに所定のストレスを導入する工程、それによりシステムが標的とｐｅｎのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムは標的とｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を提供する；及び（ｂ）標的とｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出する工程、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異によって、ストレスが標的とｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示し、好ましい標的はγ分泌酵素、プレセニリン、ｎｏｔｃｈ及び／又はＡＰＰ基質、及び／又はその組み合わせ及び複合体を含む。
【００１９】
後者の実施態様では、プレセニリンはプレセニリン−１（ＰＳ−１）及びプレセニリン−２（ＰＳ−２）から選択される。これらの名称は、一般に開示される親配列を含む、又はその特定断片を含む、又は開示された親プレセニリン配列に対して配列類似性を有するポリペプチドを称するのに使用され、配列類似性は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは１００％であり、ここでプレセニリンは、一以上の開示される遺伝子的又は生化学的相互作用アッセイで測定されるような相当親配列プレセニリンにより提供されるものと比較して、プレセニリンに特異的で検出可能な機能的相互作用を提供するのに十分である。プレセニリンは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも５０の連続した残基、最も好ましくは全長プレセニリン又は親配列を含み、類似性又は同一性がその範囲にわたる。親プレセニリンは、当該分野でよく知られＧｅｎｂａｎｋ等の公的な受託者から入手できる、天然配列プレセニリン１（例えば、ヒト、マウス、ニワトリ及びアフリカツメガエルの配列）及びプレセニリン２（例えば、ヒト、マウス、及びアフリカツメガエルの配列）から選択される。
【００２０】
対象とする方法に有用な本発明の組成物は、対象とするｐｅｎポリペプチド及び所定量の開示されるｐｅｎ及びプレセニリンポリペプチドを含む混合物を含み、特に、好ましくはこれらの成分が共に単離されるもの及び本質的に両成分からなる混合物、即ち、混合物の他の成分（アッセイしたストレスを除く）がこれら２つの成分の相互作用に有意に影響しないものである。本発明の他の態様は、開示されるｐｅｎポリペプチドをコードする核酸、それらに特異的に結合する抗体、及び使用方法を含む。
開示される親配列又はその断片からなる対象ポリペプチドが単離され、即ち非天然又は異種性の成分、例えば非天然アミノ酸又はアミノ酸配列或いは天然のタンパク質においてポリペプチドが結合するもの以外の天然アミノ酸又は配列と共有的に結合するｐｅｎポリペプチドを包含し、好ましくは溶液中にあり、好ましくは得られる試料中で全ポリペプチドの少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成し、純粋なポリペプチドが、得られる試料中で全ポリペプチドの少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９９重量％を構成し、親配列以外を含む対象ポリペプチドが好ましい。ポリペプチドはより大きい複合体、例えばより大きいポリペプチド及び／又は種々のコンジュゲート等の共有的又は非共有的な部分でありうる。ポリペプチドは組み換え技術により合成、作成され、又は哺乳動物、好ましくはヒト細胞から精製されうる。広範な種々の分子及び生物化学の方法が生化学合成、分子発現及び対象とする組成物の精製に利用可能であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ，等， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）又は他に当分野で既知のものを参照のこと。
【００２１】
断片を包含するｐｅｎは、相当する開示した親ｐｅｎ配列の少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５，より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、最も好ましくは少なくとも５０の連続する残基を含む。ｐｅｎポリペプチドは、相当するｐｅｎ特異的機能、例えば天然ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシング過程、特にここで開示されるような一以上の結合アッセイに示されるようなプレセニリン結合又は結合阻害活性、及び／又は特に開示される結合アッセイで測定されるようなｐｅｎ特異的抗体結合又は結合阻害活性との相互作用を提供する。
ｐｅｎ特異的機能は、便宜的なインビトロ、細胞系、又はインビボアッセイ、例えば結合アッセイにより測定することができる。結合アッセイという用語は、一般にｐｅｎポリペプチドと特異的結合標的の分子相互作用を評価する、インビトロ、細胞培地又は動物系アッセイ（例えば遺伝子治療技術を使用する又は遺伝子組み換えを含む）等を含むあらゆるアッセイを包含して使用される。結合標的は、天然細胞内結合標的、例えばプレセニリン、ｐｅｎ調節タンパク質又はｐｅｎ活性もしくはその局在を直接変化させる他の調節分子；あるいは非天然結合標的、例えば下記されるようなスクリーニングアッセイで同定されるもののようなｐｅｎ特異的薬剤、又は抗体等の特異的免疫タンパク質であり得る。ｐｅｎ結合特異性は、ＡＰＰプロセシング（例えば、ｐｅｎ発現細胞の負のエフェクターとしての機能に対する対象ポリペプチドの能力）により、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、免疫原性（例えば、マウス、ラット、ヤギ又はウサギ等の異種の宿主のｐｅｎ特異的抗体を誘発する能力）等によりアッセイされ得る。
【００２２】
特定の実施態様では、対象ポリペプチドは、特に担体タンパク質と結合する場合にｐｅｎ特異的抗原及び／又は免疫原を提供する。例えば、対象ポリペプチドはキーホールリンペット抗原（ＫＬＨ）に共有的に結合し、コンジュゲートは完全フロイントアジュバンドに乳化される。実験用ウサギを従来のプロトコールに従って免疫化し、出血させる。ｐｅｎ特異的抗体の存在を、免疫化した対応するｐｅｎポリペプチドを用いて固相免疫吸着アッセイによりアッセイする。例えば表２参照。
表２．ｐｅｎ−１Ｂ特異的ウサギポリクローナル抗体を誘発する免疫原ｐｅｎ−１Ｂポリペプチド：上記されるプロトコールにより免疫化されたｐｅｎ−１Ｂポリペプチド−ＫＬＨコンジュゲート
【００２３】
対象ｐｅｎポリペプチドはまた、Ｎ−及び／又はＣ−末端切断を含む、親ｐｅｎポリペプチドの小さな欠失型突然変異を包含する。このような欠失型の突然変異は、ｐｅｎ競合的又はドミナントネガティブな活性を求めてスクリーニングされる。ｐｅｎ−１Ｂの例示的な活性欠失突然変異は、配列番号６、残基１−２５４；配列番号：６、残基４−２５５；配列番号：６、残基９−２５７；及び配列番号：６、残基２−２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明は、天然細胞内結合標的等を含む、請求したｐｅｎ−１Ｂポリペプチドに特異的な結合物質、このような物質を同定及び作成する方法、並びに診断、治療及び医薬開発におけるそれらの使用を提供する。例えば、特異的結合物質は、様々な診断及び治療で、特に疾患又は疾患の兆候が例えばＡＰＰプロセシング等のｐｅｎに関わる過程の不適化利用に関係する場合に利用される。新規なｐｅｎ特異的結合物質は、ｐｅｎ特異的レセプター、例えば体細胞性組み換えポリペプチドレセプター様特異抗体又はＴ細胞抗原レセプター（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及び１−、２重−及び３重−ハイブリッドスクリーニング等のアッセイで同定される他の天然細胞内結合物質、ここに記載されるインビトロ、細胞系及び動物系結合アッセイ等の化学ライブラリのスクリーニングで同定される非天然細胞内結合物質、あるいは当業者に既知の他のものを含む。特に対象とする物質はｐｅｎ機能、例えば、ｐｅｎ依存性Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングを調節し、ドミナントネガティブな欠失突然変異等を含む。従って、本発明はまた、例えば、常在ｐｅｎ、ドミナントネガティブｐｅｎ欠失突然変異体、又はｐｅｎポリヌクレオチド（下記）の調節物質と細胞の接触によって、ｐｅｎ活性の調節段階を含む細胞のＡＰＰプロセシングを調節する方法を提供する。
【００２４】
また、直接的な合成に加えて、対象のポリペプチドは対応する親ポリヌクレオチド、又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー及び対象のポリペプチド配列から創出された（“ＧＣＧ”ソフトウェアー、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）プローブを用いて単離された天然コード化ポリヌクレオチド、又はコンピューターアルゴリズムに従って対象のポリペプチドを逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）することにより作成される選択された発現系に最適化されたポリヌクレオチド（例えば、Ｈｏｌｌｅｒ等 （１９９３） Ｇｅｎｅ １３６， ３２３−３２８；Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９５） Ｇｅｎｅ １５４， １５０−１６６）などのコード化ポリヌクレオチドから細胞及び無細胞系で発現させることもできる（例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ，等， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ｏｃｔ；９（５）：５３４−４８）。従って、ポリペプチドは組み換え技術により合成、作成され、或いは細胞から精製されうる。広範な種々の分子及び生物化学の方法が生化学合成、分子発現及び対象組成物の精製に利用可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，等 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ， 等， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）又は他に当分野で既知のものを参照のこと。
【００２５】
本発明は、開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは他の化合物、例えば標識又は他のポリヌクレオチド配列と結合されていてもよく（即ち、それらはより大きい配列の部分であってもよい）、合成／非天然配列のものであり、及び／又は単離され、即ちその天然状態で関わる少なくとも幾つかの物質を伴わず、好ましくは得られる分画に存在する全核酸の少なくとも約０．５重量％、より好ましくは約５重量％を構成し、通常、組み換え体は、それらが天然染色体で結合するもの以外のヌクレオチドと結合した非天然配列又は天然配列を含むことを意味する。天然配列を含む組み換えポリヌクレオチドは、末端にこのような配列を含み、天然染色体で結合するもの以外の配列に直接隣接し（即ち連続する）、あるいは１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満、より好ましくは５００塩基未満、最も好ましくは１００塩基未満の天然隣接領域に隣接し、それは末端にあるか、又は天然染色体で結合するもの以外の配列に直接隣接する。ポリヌクレオチドは、通常ＲＮＡ又はＤＮＡであるため、しばしば他の塩基又はヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドを使用して変化した安定性等を得るのに有利である。更に、ポリヌクレオチド及び核酸という用語は、長さの制限なく、ヌクレオチドのあらゆる重合体を指して互換的に使用される。
【００２６】
本発明はまた、ｐｅｎ、特にｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを包含する。例えば、天然ヒトｐｅｎ−１Ｂポリペプチドをコードする天然ヒト転写物のヌクレオチド配列は、配列番号：２６として示される。ｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、通常、配列番号：２６を含む、配列番号：２６の特定断片を含む、あるいは配列番号：２６と配列類似性を有するポリヌクレオチドを指して使用され、例えばハイブリダーゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーとして利用でき、配列番号：２６の少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも４８、より好ましくは少なくとも９６及び最も好ましくは少なくとも１８２の連続したヌクレオチドを含む。
ｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、相当する親配列又はその補体との特異的ハイブリダイゼーションに影響を与え；例えば、全てのｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、配列番号：２６又はその補体との特異的ハイブリダイゼーションに影響する。示される特異的ハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェンシー条件、例えば３０％のホルムアミド含有５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１ＭのＥＤＴＡ）バッファーを含む緩衝液で４２℃の温度でのハイブリッド形成、及び４２℃の０．２ｘＳＳＰＥを用いて４２℃で洗浄したときに結合して残留し；好ましくは５０％のホルムアミド含有５ｘＳＳＰＥバッファーを含む緩衝液で４２℃の温度でのハイブリッド形成、及び４２℃の０．２ｘＳＳＰＥバッファーを用いて４２℃で洗浄したときに結合して残留することを必要とする。特異的にハイブリッド形成したポリヌクレオチドは、簡便なゲルベース（ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ）アッセイで簡単に同定され；例えば、配列番号２７−３８を含むポリヌクレオチドは、上述の好ましいハイブリダイゼーション条件下で配列番号：２６と特異的にハイブリッド形成することが示される。
【００２７】
表３．条件Ｉ及びＩＩで配列番号：２６の鎖とハイブリッド形成する例示的なｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチド
【００２８】
対象核酸は、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等としての使用；他のｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチド及び遺伝子転写物の存在の検出において並びに更なるｐｅｎ相同体及び構造類似体をコードする核酸の検出又は増幅においての使用を含む広範な種々の用途が見出される。例えば、ｐｅｎコーディングポリヌクレオチドはｐｅｎ発現ベクターで使用することができ、一般に異種プロモーターに作用可能に結合し、及び／又は例えば、発現及びスクリーニングのために、組み換え宿主細胞に、例えばｐｅｎ調節細胞機能に関する疾患の候補薬の効果等の機能研究のために、形質転換動物に組み込まれる。診断では、ｐｅｎハイブリダイゼーションプローブは、臨床及び研究用試料での野生型及び突然変異ｐｅｎ対立遺伝子の同定における使用が見出される。突然変異対立遺伝子は、例えばアルツハイマー病に関するｐｅｎ突然変異のためなどの、高処理臨床診断のための対立遺伝子特異的プローブを作成するのに使用される。治療では、治療用ｐｅｎポリヌクレオチドは、活性ｐｅｎの細胞発現又は細胞内の濃度あるいは有効性を調節するために使用する。
【００２９】
例えば、ｐｅｎポリヌクレオチドは、活性ｐｅｎタンパク質の細胞発現又は細胞内濃度或いは有効性を調節するために使用される。ｐｅｎの抑制性核酸は、典型的にはアンチセンス：開示される天然ｐｅｎ転写配列の補体を含む１本鎖配列である。得られるｐｅｎポリペプチドの発現のアンチセンス調節には、遺伝子調節配列に作用可能に結合するアンチセンス核酸を用いることができる。遺伝子の転写が内在性ｐｅｎコーディングｍＲＮＡへの結合能力のあるアンチセンス転写物を生産するように適応させたプロモーター配列を有するｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞に形質移入する。或いは、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡコーディングｐｅｎポリペプチドに結合する１本鎖アンチセンスポリヌクレオチドは、標的タンパク質の発現の実質的な減少を生じる濃度で、宿主内の又は宿主から一時的に単離された標的細胞に投入されうる。ｐｅｎ発現の増強は、相当する遺伝子産物の機能発現を増大させるｐｅｎポリヌクレオチドを標的とする細胞型に導入することにより成される。このようなポリヌクレオチドはｐｅｎ発現ベクター、内在性対立遺伝子の機能発現を促進制御するベクター、あるいは内在性突然変異又は野生型対立遺伝子の対象とする修飾の置換ベクターであり得る。核酸を生細胞に導入するための技術は当分野で既知であり、レトロウィルス系トランスフェクション、ウィルスコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクション等を含む。
【００３０】
本発明は、転写を含む細胞性機能及び／又はｐｅｎ遺伝子発現の調節が可能なｐｅｎのレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤のリード化合物を同定する効果的な方法を提供する。標識したインビトロリガンド結合アッセイ、免疫アッセイ等を含む転写調節物質又は結合物質のための広範で種々のアッセイを提供する。方法は、リード化合物の化学ライブラリの自動化した対費用効率のよい高処理スクリーニングに従う。同定される試薬は、動物及びヒトの治験のための医薬産業での使用が見出され；例えば、試薬は医薬の開発のための活性の最適化及び毒性の最小化のためのインビトロ及びインビボアッセイで誘導体化され、再スクリーニングされうる。
結合物質の広範で種々のアッセイ、例えば天然ｐｅｎ結合標的とのｐｅｎ相互作用を調節する化合物のスクリーニングもまた提供される。これらのアッセイは、例えば検出又は固着のためのペプチドタグ等の他のポリペプチドとの融合産物の部分であり得るｐｅｎポリペプチドを含む成分の混合物を用いる。アッセイ混合物は、天然細胞内ｐｅｎ結合標的を含む。特定の実施態様では、結合標的はプレセニリン、或いはそのアッセイで簡便に測定可能な対象ｐｅｎポリペプチドに対する結合親和性及び結合活性を好ましくは無償のプレセニリンに匹敵する程度で与える部分である。アッセイ混合物はまた、候補薬物を含む。候補薬は多くの化学分類を包含するが、典型的にそれらは有機化合物；好ましくは小有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範で種々の供給源から得られる。また、様々な他の試薬が混合物中に含まれうる。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等を含む。
【００３１】
できた混合物は、仮に候補薬物が存在しなければｐｅｎポリペプチドが細胞性結合標的、部分又は関連した結合親和性を有する類似物に特異的に結合するような条件下でインキュベートされる。混合物の成分は、必要な結合を提供する任意の順序で添加することができ、インキュベーションは最適な結合を促進する任意の温度で実施することができる。インキュベーション時間は同様に、最適な結合について選択されるが、高速の、高処理スクリーニングを促進するために最小化される。
インキュベーションの後、ｐｅｎポリペプチドと一以上の結合標的の間の薬剤系結合が、任意の都合のよい方法によって検出される。産物の性質及び他のアッセイ要因に依存する、例えば光学又は電子密度、放射性放出、無放射性エネルギー移動等、あるいは抗体コンジュゲート等を用いた間接的検出による変化を検出するために様々な方法が使用されうる。薬剤存在下での結合親和性に比較した、薬剤不存在下での標的に対するｐｅｎ−１Ｂの結合親和性の差異は、薬剤がｐｅｎ結合標的に対するｐｅｎの結合を調節することを示す。ここで使われる差異は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差異を示す。
次の実験の部分及び実施例は、例示のために提供され、限定するものではない。
【００３２】
実施例、プロトコール及び実験方法
Ｉ．高処理インビトロ蛍光偏光アッセイ
試薬：
ｐｅｎペプチド（サイズ最小化、ローダミン標識；最終濃度＝１−５ｎＭ）
ＰＳポリペプチド（最終濃度＝１００−２００ｎＭ）
緩衝液：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６
プロトコール：
１．９０マイクロリットルのｐｅｎペプチド／ＰＳポリペプチド混合物を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加える。
２．ウェルにつき１０マイクロリットルの試験化合物を加える。
３．５分振盪し、Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて蛍光偏光の量を５分以内に測定する。
【００３３】
ＩＩ．高次構造センサー−ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイ
緩衝液及び溶液の調製：
１．１０Ｘアッセイ緩衝液：
１ＭのＨｅｐｅｓを１００ｍＬ
５ＭのＮａＣｌを３００ｍＬ
１ＭのＭｇＣｌを２０ｍＬ
ＭＱ Ｈ２Ｏを１Ｌまで加える
２．ペプチド／タンパク質のマスターミックス
タンパク質：グルタチオンＳトランスフェラーゼ／γ分泌酵素ポリペプチド融合タンパク質：最終濃度＝１００ｎＭ
ｐｅｎペプチド（サイズ最小化、ビオチン標識；最終濃度＝１ｕＭ）
アッセイ緩衝液及びＨ２Ｏを最終容量になるまで加える：最終緩衝液濃度＝１Ｘ
３．抗体の構成：
抗ＧＳＴ、ウサギ（最終濃度＝１：１００００）
抗ウサギＨＲＰ（最終濃度＝１：１００００）
Ｔ−ＴＢＳを最終容量になるまで加える：最終緩衝液濃度＝１Ｘ
【００３４】
方法：
１．適切なペプチド／タンパク質の組み合わせの５０ｍＬのマスターミックス（上記２参照）を生成する。ＲＴで１時間インキュベートする。
２．Ｐｉｅｒｃｅ社のＳｕｐｅｒ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬で阻害した、９６穴プレートＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジン被覆、ホワイトポリスチレンプレート（＃１５１１８Ｂ）の各ウェルに９５ｕＬのマスターミックスを加える。
３．５ｕＬのそれぞれの試験化合物（ストック＝６０ｕＭ）をプレートの各ウェルに移す。
４．ＲＴで１時間プレートをインキュベートする。
５．インキュベートの間に、抗ＧＳＴ抗体と抗ウサギＨＲＰ抗体の混合物（上記３参照）を生成する。氷上で１時間インキュベートする。
６．プレートをＨ２Ｏで３回十分に洗浄する。
７．１００ｕＬの抗体混合物をプレートの各ウェルに加える。
８．ＲＴで１時間インキュベートする。
９．Ｈ２Ｏで３回洗浄する。
１０．Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（ルミノール及び過酸化物を混合）をＨ２Ｏに１：２で希釈し、次いで各ウェルに１００ｕＬ加える。
１１．３−５分撹拌する。化学発光を読み取る。
【００３５】
ＩＩＩ．高処理インビトロ結合アッセイ
Ａ．試薬：
−中性のアビジン：ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ
−阻害緩衝液：ＰＢＳ中５％のＢＳＡ、０．５％のＴｗｅｅｎ；室温で１時間
−アッセイ緩衝液：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の混合物。
−３３Ｐｐｅｎペプチド１０ｘストック：２００，０００−２５０，０００ｃｐｍの標識したｐｅｎペプチド（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｎｔｅｒ）を補足した１０−８−１０−６Ｍの「非放射性」ｐｅｎペプチド。スクリーニングの間、４℃のマイクロフリッジにおく。
−プロテアーゼ阻害剤混合物（１０００Ｘ）：１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（Ｓｉｇｍａ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び１０ｍｌのＰＢＳ中２ｍＭのＮａＶＯ３（シグマ＃Ｓ−６５０８）。
−結合ポリペプチド：ＰＢＳ中１０−７−１０−５Ｍのビオチン化ＰＳポリペプチド。
Ｂ．アッセイプレートの調製：
−ウェルにつき１２０μｌのストックＮ−アビジンで一晩、４℃でコートする。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。
−１５０μｌのブロッキングバッファーでブロックする。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。
【００３６】
Ｃ．アッセイ
−４０μｌアッセイ緩衝液／ウェルで添加する。
−１０μｌの化合物又は抽出物を添加する。
−１０μｌの３３Ｐ−ｐｅｎペプチド（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍの最終濃度）を添加する。
−２５℃で１５分間撹拌する。
−さらに２５℃で４５分間インキュベートする。
−４０μＭのビオチン化ＰＳポリペプチド（アッセイ緩衝液中０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／４０ｕｌ）を添加する。
−室温で１時間インキュベートする。
−２００μＭのＰＢＳで４回洗浄して反応を停止する。
−１５０μＭのシンチレーションカクテルを添加する。
−トップカウントで計測する。
Ｄ．全てのアッセイのコントロール（各プレートに配置する）：
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害での溶解（非ビオチニル化ＰＳポリペプチド）
【００３７】
ＩＶ．プレセニリンエンハンサー遺伝子の同定：天然ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２ ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の一部重複性は、ほとんどの組織において、どちらか一方の遺伝子の欠失がプレセニリン機能の一部の損失のみを生じることを意味する。従って、どちらか一方の遺伝子におけるノックアウト突然変異はプレセニリン相互作用遺伝子を同定するために設計される遺伝子スクリーニングに感作された環境を提供する。この推論を用いて、我々はプレセニリンと協力して作用する遺伝子の同定の目的で幾つかの種類の遺伝子を作成した。１つの種類（選別Ａ）はｓｅｌ−１２欠失突然変異にとってホモ接合である虫を突然変異誘発させ（以下ｓｅｌ−１２Δと称する）、ｓｅｌ−１２Δと組み合わせてｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異のものに相当する表現型を作成しエンハンサー突然変異のスクリーニングをする。このようなエンハンサー突然変異を、１）ｈｏｐ−１プレセニリンと唯一相互作用する成分及び２）ｈｏｐ−１及びｓｅｌ−１２プレセニリンの両方と相互作用する成分を共に同定する。内在性のコントロールとして、選別がｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異で見られる表現型を対象とするので、選別Ａは機能喪失ｈｏｐ−１対立遺伝子を生成することが期待される。他の差異は、ｈｏｐ−１単一突然変異の突然変異誘発及びさらに完全なプレセニリンに伴う表現型の増大ついてのスクリーニングをする。
【００３８】
プレセニリンの不足を増大させる所望の突然変異に加えて、これらの選別は、これらの遺伝子産物の欠損がｇｌｐ−１様の生殖不能を生じるので、ｇｌｐ−１シグナル伝達経路の既知の要素における突然変異（例えば、ｇｌｐ−１／Ｎｏｔｃｈレセプター、ｌａｇ−２／ＤＳＬリガンド、ｌａｇ−２／Ｓｕ（Ｈ）ファミリーエフェクター）を同定する。プレセニリンエンハンサーと既知のｇｌｐ−１系の遺伝子における突然変異との間の重要な差異は、前者がｓｅｌ−１２Δを背景としてのみｇｌｐ−１様生殖不能を生じるが、後者は野生型遺伝子の背景（Ａｕｓｔｉｎ， Ｊ． 及び Ｋｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ （１９８７） ５１：５８９−５９９； Ｌａｍｂｉｅ， Ｅ． 及びＫｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９１） １１２：２３１−２４０）とｓｅｌ−１２Δの背景を併せもつｇｌｐ−１生殖不能を生じることである。
我々は、エチルメタンスルホン酸を用いたｓｅｌ−１２Δホモ接合株の突然変異誘発の後に約１２８，０００の半数体ゲノムをスクリーニングして選別Ａを手広く実施した。選別は、２７の推定上のｇｌｐ−１対立遺伝子、地図の位置に基づいておそらくｌａｇ−１又はｌａｇ−２対立遺伝子として同定される３の突然変異、及び８のｈｏｐ−１突然変異を含む期待される型の単離を生じた。期待されるように、推定上のｇｌｐ−１、ｌａｇ−１、及びｌａｇ−２突然変異は、野生型及びｓｅｌ−１２Δ遺伝子の両方を背景としたｇｌｐ−１様生殖不能を生じ；従って、これらの突然変異はｓｅｌ−１２＋機能の存在又は不存在に関係なく生殖不能を引き起こす。対照的に、８のｈｏｐ−１突然変異は、ｓｅｌ−１２＋活性の存在下ではなく、不存在下で浸透性ｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じる。
【００３９】
前述に加えて、我々は、マッピング及び相補性試験に基づき、２つの新規なプレセニリン相互作用遺伝子を同定する７つの突然変異体を単離した。これらの突然変異体の４つは、染色体Ｉに位置する遺伝子ｐｅｎ−１を同定し、他の３つは、染色体ＩＩＩに位置する遺伝子ｐｅｎ−２を同定する。これらの遺伝子を用いた我々のその後の研究で：１）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２エンハンサー対立遺伝子は機能喪失突然変異であり；２）ｓｅｌ−１２＋機能の喪失を伴うｐｅｎ−１＋又はｐｅｎ−２＋機能の喪失が、プレセニリン機能の完全な喪失として同一の表現型の結果を有し；３）ｓｅｌ−１２＋を背景としたｐｅｎ−１＋及びｐｅｎ−２＋の喪失は、プレセニリン／Ｎｏｔｃｈ系の機能の一部の喪失を示す表現型を生じ；４）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２はｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の両方と遺伝学的に相互作用し；５）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のオープンリーディングフレームは、無関係の完全な膜タンパク質をコードし；６）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２関連遺伝子は門の分類をこえて保存されていることが示された。
【００４０】
ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、ｓｅｌ−１２Δをプレセニリン喪失の全体に関わるｌｉｎ−１２／ｇｌｐ−１様表現系まで増強させる。ｓｅｌ−１２Δ突然変異との二重突然変異として、ｐｅｎ−１対立遺伝子及びｐｅｎ−２対立遺伝子はそれぞれ、母性ｓｅｌ−１２＋活性を受けていないｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δの虫に見られるものと同一の表現型の集合を生じる。特に、ｓｅｌ−１２Δとのこれらの各二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ又はｈｏｐ−１Δ単一突然変異、あるいはｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２単一突然変異には見られない３つの共通の異常を共有する。第１に、二重突然変異の３つ全ての集合は、ｇｌｐ−１機能消失突然変異について記載されたもの（Ａｕｓｔｉｎ及びＫｉｍｂｌｅ， １９８７）と同様の生殖細胞増殖により特徴付けられる区別のつかないｇｌｐ−１様生殖不能表現型を示す。第２に、３つ全ての二重突然変異はｌｉｎ−１２／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の欠損を示す共通の細胞運命特性を示す。ｌｉｎ−１２＋活性は、アンカー細胞運命の決定に対して腹側の子宮前駆体に必要であり：ｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異は、正常に腹側子宮前駆体運命をとる細胞が代わりにアンカー細胞になるので、その正常な補体ではなく、２つのアンカー細胞を有する（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ， Ｉ． 等， Ｃｅｌｌ （１９８３） ３４：４３５−４４４）。ｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−１及びｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−２二重突然変異は、ｓｅｌ−１Δ２；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異がそうであるように、この「２つのアンカー細胞」表現型を示す（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９９）９６：２４９７−２５０２）。第３に、ｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−１及びｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−２二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δのように、ｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異に見られる産卵口の欠陥を思わせるめくれた産卵口の表現型を示す。
【００４１】
前記の表現型の比較は、ｐｅｎ−１＋又はｐｅｎ−２＋活性の減少が、ｓｅｌ−１２＋活性の欠損と併せて、ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１によりコードされる２つの重複したプレセニリンを排除する効果に匹敵するプレセニリン系機能の喪失を生じる。
単一のｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、プレセニリン機能の部分的な喪失に関する表現型を与える。単一の突然変異のように、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２の虫は２つの明らかな異常を示す。第１に、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２ホモ接合体（ｐｅｎ−１／＋又はｐｅｎ−２／＋の雌から産まれた）は共に、正常な数の自己子孫の胚を作るが、これらの胚は動物の子宮にとどまり、産まれることはない。従って、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体は産卵欠陥（又はＥｇｌ）があり、表現型はｓｅｌ−１２Δ単一突然変異と共通していた。
【００４２】
第２に、ホモ接合ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体から産まれた胚は孵化しないが、代わりに複数の異常のある発達を停止する。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体から産まれた停止した胚は、非常に類似した異常を見せる。最も著しくは、多くの停止した胚が部分的な咽頭のみを生じ；後部咽頭葉はあるが、前葉はない。前咽頭の欠如は、（前咽頭がないことに関する）Ａｐｈ表現型と呼ばれ、最初ｇｌｐ−１の特定の劣勢対立遺伝子として説明された。ＧＬＰ−１レセプターは前咽頭の形成を誘発する特定のシグナル伝達の現象に必要であり（Ｍｅｌｌｏ， Ｃ． 等， Ｃｅｌｌ （１９９４） ７７：９５−１０６； Ｍｏｓｃｏｖｉｔｚ， Ｉ 等， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （１９９４） １２０：３３２５−３３３８； Ｈｕｔｔｅｒ， Ｈ． 及び Ｓｃｈｎａｂｅｌ， Ｒ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （１９９４） １２０：２０５１−２０６４）；従って、母性付与型のｇｌｐ−１＋活性の欠如は、Ａｐｈ表現型並びに他の欠損を生じる（Ｐｒｉｅｓｓ， Ｊ． 等．， Ｃｅｌｌ （１９８７） ５：６０１−６１１）。減少したプレセニリン機能とＡｐｈ表現型の関連は、母性ｓｅｌ−１２＋を受けるｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体の分析（母性ｓｅｌ−１２＋機能の欠如に見られる生殖不能をレスキューすること）によってもたらされる。この状況において、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体は、他のｇｌｐ−１様の胚欠陥に加えて、同様にＡｐｈ表現型を表す停止した胚を産む（上掲のＷｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ．）。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のこれらの特性は、ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２の欠損がｓｅｌ−１２又はｈｏｐ−１単一突然変異によって引き起こされるものよりも深刻な表現型を引き起こすので、両方の遺伝子がｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の両方のプレセニリンと協力して作用することを示す。
【００４３】
Ａｐｈ表現型に加えて、ホモ接合ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体により生成される胚は他の異常を表す。通常、胚はほとんど伸長の形跡なしに停止し、胚の皮下組織（角質の下及び裏にある表皮細胞の層）はしばしば他の細胞型を完全に包み込むことができない。同様の表現型がｇｌｐ−１（ｔｓ）突然変異により生成される胚について説明されている。
要約すると、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、Ｎｏｔｃｈファミリーレセプターｇｌｐ−１及びｌｉｎ−１２に関与する細胞シグナル伝達欠陥の表れである複数の表現型（Ｅｇｌ、Ａｐｈ及び欠陥のある胚伸長）を共通にもつ。更に、ｓｅｌ−１２Δ、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２との組み合わせは、加えて、より強力なＮｏｔｃｈ系に関連する欠陥（ｇｌｐ−１様生殖不能、２つのアンカー細胞表現型；産卵口の外がえし）を生じる。一体とした遺伝子的及び表現型的証拠は、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２がＮｏｔｃｈレセプター成熟及び／又はプロセシングにおけるプレセニリンを抑止しうる新規な成分であることを示す。
【００４４】
ｐｅｎ−１は、予測される線虫の遺伝子ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１に相当する。ｐｅｎ−１をクローニングするために、我々は、ますます小さな間隔でｐｅｎ−１（ｅｐ１４０）の遺伝子地図を、まず検出可能な遺伝子マーカーを用いて、次いで分子マーカーを用いて［Ｔｃ１トランスポゾンの挿入及び単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）］作成した。ＳＮＰマッピングの最終段階は、その位置を染色体Ｉで５２ＫＢ間隔まで狭くした。線虫のデータベースＡＣＥＤＢに記録されるように（Ｅｅｃｋｍａｎ， Ｆ． 及び Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ．５８３−５９９）、この間隔は全体で７つの予測される遺伝子を含む。これらの１つ、ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のデータと突然変異の検出に基づいてｐｅｎ−１であると同定された。多くの線虫遺伝子について、ＲＮＡｉは母性及び接合遺伝子活性の両方を乱す（Ｔａｂａｒａ， Ｈ． 等 Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８）２８２：４３０−４３１）。ｐｅｎ−１の場合には、成体の雌雄同体へのｄｓＲＮＡの注入後の母性活性の破壊は、Ａｐｈ表現型で発生的に停止させた胚の作成によって証明された。期待されるように、この表現型は野生型及びｓｅｌ−１２Δ雌雄同体の両方のＲＮＡｉの後に観察された。何れの背景でもＲＮＡｉはまた、成体期まで成長する多くの明らかな死を免れた子孫を得た。ｓｅｌ−１２Δの背景でのＲＮＡｉの場合には、高い比率のこれらの死を免れた個体は、ｇｌｐ−１様生殖不能を示し、接合ｐｅｎ−１活性の阻害と一致する。意外なことに、野生型のＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１のＲＮＡｉはＧｌｐ生殖不能の子孫を生じるが、ｓｅｌ−１２Δ雌雄同体のｐｅｎ−１ＲＮＡｉによるものよりも非常に低い頻度である。対照的に、ｇｌｐ−１様生殖不能はｐｅｎ−１単一突然変異には見られない。この違いは、ＲＮＡｉが典型的に母性及び接合遺伝子機能を共に混乱させる特性に最も帰因し、従って接合性の致死突然変異に見られるよりもより深刻な表現型を生じうる。
【００４５】
配列分析によって、我々はｓｅｌ−１２エンハンサーとして単離した４つのｐｅｎ−１対立遺伝子がＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１オープンリーディングフレームの単一のヌクレオチド置換を含むことを決定した。著しくこれら４つの独立した由来の領域は、それぞれ同じコドン、Ｔｒｐ１９１のナンセンス突然変異である。これらの対立遺伝子（ｅｐ１４０、ｅｐ１６８、及びｅｐ１７０）は、３番目の塩基ＵＧＧのＵＧＡへの変更であり、４番目（ｅｐ２１６）は２番目の塩基ＵＡＧのＵＧＧへの変化である。これらの領域がＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１のＲＮＡｉに類似したＡｐｈ及びｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じることは、それらが機能減少突然変異であることを示す。
【００４６】
ｐｅｎ−１は複数の膜貫通ドメインで進化的に保存されたタンパク質をコードする。ｐｅｎ−１（ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１、ＧＩ＃２８１５０３６）オープンリーディングフレームは、スプライシングしたときに３０８アミノ酸のタンパク質をコードする４つのエキソンに分けられる。我々は、部分的なｃＤＮＡ産物の配列分析によって、エキソン２及び３の予定されるスプライシング結合を確認した。ｐｅｎ−１は、以下に詳細に説明されるように様々なヒト、マウス、及びショウジョウバエのタンパク質の予測される構造との類似性を示す。ｐｅｎ−１は、構造予測プログラムＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２によって決定されるように最大７つの膜貫通ドメインまで含みうる、予測される完全な膜タンパク質である。
【００４７】
ｐｅｎ−２は、予測される線虫遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９に相当する。我々は、クローン化遺伝子ｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間の染色体ＩＩＩに遺伝学的に位置づけた。この間隔はおよそ２４０ＫＢのＤＮＡに及び、ＡＣＥＤＢバージョン９に記録されるように（Ｅｅｃｋｍａｎ， Ｆ． 及び Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ．５８３−５９９）３１の予測される遺伝子を含む。ｐｅｎ−２はＲＮＡｉデータ及び突然変異検出に基づいてＴ２８Ｄ６．９であると同定された。その間の多くの遺伝子のＲＮＡｉは、Ｔ２８Ｄ６．９がＲＮＡｉによって予測される母性及び接合ｐｅｎ−２表現型が与えられる唯一の候補遺伝子であると同定した。Ｔ２８Ｄ６．９を注入した野生型及びｓｅｌ−１２Δ雌雄同体は、高い割合の発達停止胚を生成し、その多くがＡｐｈである。更に、ｓｅｌ−１２Δ（野生型以外）の虫のＲＮＡｉはｇｌｐ−１様の生殖不能を示す明らかな「死を免れた」子孫を生じる。ｓｅｌ−１２エンハンサーとして単離された３つのｐｅｎ−２対立遺伝子の突然変異検出は、それぞれがＴ２８Ｄ６．９の予測されるオープンリーディングフレームのナンセンス突然変異を含むことを明らかにした。２つの領域（ｅｐ２１９及びｅｐ２２０）は、ＵＧＧからＵＧＡ（ｅｐ２１９）又はＵＡＧ（ｅｐ２２０）に変えてＴｒｐ７４コドンを変化させ、３番目の領域（ｅｐ２２１）はＴｒｐ３６をＵＧＡ停止コドンに変える。これらのナンセンス対立遺伝子は、遺伝子機能を強力に減少させる又は消滅させて、ｓｅｌ−１２Δの増強が野生型ｐｅｎ−２＋活性の喪失に起因することを示す。
【００４８】
ｐｅｎ−２は予測される複数回膜貫通タンパク質をコードする。ｐｅｎ−２（Ｔ２８Ｄ６．９、ＧＩ＃３８７３４１５）オープンリーディングフレームは１０１アミノ酸タンパク質をコードする。ｐｅｎ−２の予測されるエキソン／イントロン構造は、Ｇｅｎｂａｎｋにある公にされていない全長ｃＤＮＡ（ｙｋ５６９ｈ５ ＧＩ＃５５７２３２５及び５５５８５５７）の配列により確かめられた。ｐｅｎ−２は、以下に詳細に説明されるように、様々なヒト、マウス、ラット、及びショウジョウバエのタンパク質の予測される構造と高いレベルの類似性を示す。ｐｅｎ−２は、構造予測プログラムＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２により決定されるように、２つの見込みの膜貫通ドメインを含む、予測される完全な膜タンパク質である。
それら独自の特定の表現型及びｓｅｌ−１２とのそれらの相互作用を含む、幾つかの推定に基づき、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２はおそらくプレセニリンと相互作用する産物をコードする。引いては、ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２、ｓｅｌ−１２、又はｈｏｐ−１と共通の特性を有する他の遺伝子を、潜在的なプレセニリン相互作用遺伝子とみなすことができる。我々は、１）ａｐｈ−２＋機能の欠損と関連する特定の表現型及び２）ａｐｈ−２とｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１との、及びｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２との新規な遺伝学的相互作用の我々による同定に基づいて、ａｐｈ−２遺伝子をプレセニリン相互作用遺伝子と同定した。
【００４９】
ａｐｈ−２遺伝子は、Ｃ． Ｇｏｕｔｔｅ等 （１９９５ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｍ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ａｂｓｔｒａｃｔ ３９； １９９８ Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｗｏｒｍ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ａｂｓｔｒａｃｔ １５１； Ｗｏｒｍ Ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ Ｇａｚｅｔｔｅ １２（５）：２７（１９９３）； Ｗｏｒｍ Ｂｒｅｅｄｅｒ Ｇａｚｅｔｔｅ １３（ｄ）：８３（１９９４））によって線虫胚のｇｌｐ−１媒介性シグナル伝達の可能性のある成分として同定された。これらの研究者により特徴付けられたａｐｈ−２突然変異は、未報告の接合表現型を有するが、Ａｐｈ表現型を含みｇｌｐ−１（ｔｓ）胚の欠陥と著しく類似する母性胚欠陥を有する。ａｐｈ−２は、報告によれば、予測される遺伝子ＺＣ４３４．６に相当する。予測されるａｐｈ−２タンパク質は、７２１アミノ酸長であり、ＰＳＯＲＴ２（Ｎａｋａｉ Ｋ．， 及びＨｏｒｔｏｎ Ｐ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ， １９９９， ２４：３４−６）及びＴｏｐＰｒｅｄ２（Ｃｌａｒｏｓ ＭＧ， 及びｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ． Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ １９９４ Ｄｅｃ； １０（６）：６８５−６）により予測されるようなシグナル配列及び１〜３の膜貫通ドメインによって特徴づけられる。
【００５０】
ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２を同定するスクリーニングはａｐｈ−２の突然変異を引き起こさなかった。このスクリーニングの高いストリンジェンシーにより失敗しうる潜在的なプレセニリン／ａｐｈ−２相互作用を同定するために、我々はプレセニリン欠損にさらに高度に感作させる様々な遺伝学的背景を調べた。これらの実験について、入手可能なａｐｈ−２突然変異体が不足していたことにより、我々は、選択される背景のａｐｈ−２＋機能を減少させるＲＮＡｉを用いた。野生型雌雄同体の生殖細胞系へのａｐｈ−２ ｄｓＲＮＡの注入は、子孫に高く浸透した胚の致死率、並びにＡｐｈ表現型を示す多くの停止した胚をもたらす。しかしながら、注入した雌雄同体はさらに、体細胞組織の表現型の異常のない成体に成長する相当な割合の生存能力のある子孫を産む。それらの多くが発達停止Ａｐｈ胚を産むので、これらの虫は「一時的に死を免れたもの」とみなすことができる。従って、我々は成体の雌雄同体にａｐｈ−２ＲＮＡを注入し、プレセニリン依存表現型の一時的な死を免れた子孫を調べた。これらの調査の結果を表４にまとめる。
【００５１】
表４ ａｐｈ−２ＲＮＡｉによるプレセニリン及びｐｅｎ遺伝子表現型（導入遺伝子の死を免れた子孫の表現型）の増大
１ ＸＸ雌雄同体の完全な遺伝子型は次のとおりである：Ｒｏｗ１：Ｎ２（野生型）。Ｒｏｗ２：ｓｅｌ−１２（ｅｐ６）。Ｒｏｗ３：ｓｅｌ−１２（ｅｐ６）；ｈｏｐ−１（ｅｐ１６８）ｕｎｃ−７４（ｘ１９）／ｈＴ２［ｈｏｐ−１＋ｕｎｃ−７４＋］。Ｒｏｗ４：ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）ｕｎｃ−７４（ｘ１９）。Ｒｏｗ５：ｕｎｃ−２９（ｅ１０７２）ｐｅｎ−１（ｅｐ１４０）Ｒｏｗ６：ｐｅｎ−２（ｅｐ２２０）ｄｐｙ−１８（ｅ３６４）。
２ ホモ接合又はヘテロ接合系統からの雌雄同体はａｐｈ−２ｄｓＲＮＡを注入した。
全ての遺伝子型は、発達停止したＡｐｈ−２胚、並びに一部の生存する死を免れた子孫を分離した。ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）が死を免れた子孫のうち接合Ｇｌｐ−１様生殖不能を生じる遺伝子型について、Ｇｌｐ生殖不能の虫の概算の割合を示す。
【００５２】
ホモ接合ｓｅｌ−１２Δを背景とするＡｐｈ−２ＲＮＡｉは、より深刻なプレセニリン表現型にｓｅｌ−１２を目立って増強しない。しかしながら、有意な増強は、ｈｏｐ−１ナンセンス突然変異（ｈｏｐ−１（ｅｐ１６８）／＋）にとってもホモ接合であるホモ接合ｓｅｌ−１２Δの虫で検出される。ａｐｈ−２ＲＮＡｉに併せて、約１２％のｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１（ｅｐ１６８）／＋の動物はｇｌｐ−１様生殖不能を示し、ａｐｈ−２のない状態でこの遺伝子型には何も見られない。更に、ａｐｈ−２ＲＮＡｉの増強は、ｓｅｌ−１２Δで相互作用が見られないので、両方のプレセニリンの複合した減少に依存する。
ａｐｈ−２との更なる相互作用は、異常なｈｏｐ−１対立遺伝子、ｅｐ１７１で観察される。この対立遺伝子は、ヒトＰＳ１のＡｓｐ３８５残基（ＴＭドメイン８に位置する）に相当する保存されたアスパラギン酸残基でＤからＮへのミスセンス変異をもたらす。ＰＳ１Ａｓｐ２８５Ａｌａ突然変異は、ＰＳ１機能の喪失を生じ、ＰＳ＋発現でのドミナントネガティブは効果もまた有する（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ３９８：５１３−５１７）。ＰＳ１ Ｄ３８５Ａ変異のように、ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）は野生型のプレセニリン活性を持たず；ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δに類似するｇｌｐ−１様の生殖不能欠陥を有する。ｓｅｌ−１２＋の背景において、ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）は非常に低い浸透度（＜１％）のｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じ、ｓｅｌ−１２プレセニリン機能又は発現でのドミナントネガティブな効果を有するはずであると示唆する。我々は、ホモ接合ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）雌雄同体ａｐｈ−２のＲＮＡｉが高い浸透度のｇｌｐ−１様生殖不能（＞５０％の生存子孫）を生じることを発見し、減少したａｐｈ−２＋機能及びｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）ドミナントの効果の間に強い付加的な相互作用が示唆される。
【００５３】
最後に、我々はまた、ａｐｈ−２ＲＮＡｉがｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異表現型を強力に促進することを観察した。ヘテロ接合系統から分離するホモ接合成体ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体は、正常にみえる生殖系列を有し、ｇｌｐ−１様生殖不能が見られない。対照的に、相当するｐｅｎ−１；ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）及びｐｅｎ−２；ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）雌雄同体は高い浸透度（＞５０％の生存ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体の子孫）でｇｌｐ−１様生殖不能を示す。これらの観察は、部分的に減少したプレセニリン系活性の様々な遺伝学的背景が、ａｐｈ−２活性のＲＮＡｉ媒介減少によるより強い表現型に増強することが可能であることを示唆する。データは、プレセニリン及びｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２とａｐｈ−２の機能的相互作用を示す。
ＡＰＨ−２の構造及びＡＰＨ−２はヒト及びハエのタンパク質に関連する。ＡＰＨ−２は、ＰＳＯＲＴ２で予測される切断可能なシグナル配列及びＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２により予測される１〜３の膜貫通ドメインを含む。ＡＰＨ−２は、ほぼ全長のｃＤＮＡ ＫＩＡＡ０２５３によりコードされる予測のヒトタンパク質とアミノ酸配列において１８％の同一性である（Ｎａｇａｓｅ， Ｔ． 等 ＤＮＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９６）３：３２１−３２９）。更に、ＡＰＨ−２は、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ社で作成されたコンティグ化されたＥＳＴｓから予測されるショウジョウバエのタンパク質に対して同様のレベルの同一性を示す。ヒト及びショウジョウバエのＡＰＨ−２関連タンパク質は３０％同一であり、３つのタンパク質のＣｌｕｓｔａｌアラインメントは各タンパク質の完全長にわたる保存を示す。
【００５４】
方法：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）。特定の遺伝子のＲＮＡｉは、一般にＰＣＲ増幅遺伝子ＤＮＡ断片の鋳型から調製されたｄｓＲＮＡを用いてなされた。ＰＣＲプライマーの５’末端はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含み、３’領域は、標的とする遺伝子の一以上のエキソンをそれらが増幅するように作成された。ＰＣＲ反応は、５０ｍｌ反応で０．５ｍｇの野生型ゲノムと５ｍモルの各プライマーを用い、拡張キット（Ｅｘｐａｎｄ ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｕｍｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＮＪ）を使用して製造業者のプロトコールに従って為された。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃で３０秒間の初期変性、続いて３５サイクルの９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１分間、最終伸長７２℃で３分間。増幅したＤＮＡは、エタノール沈殿させ、２０ｍｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。ＰＣＲ産物の部分を、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従ってＴ７ポリメラーゼ関連インビトロ転写反応の鋳型として使用した。反応物をエタノールで懸濁し、ＲＮＡを２０ｍｌのＲＮＡｓｅを含まない水と１０ｍｌの３Ｘ ＩＭ緩衝液（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７．５、３ｍＭのＫ＋クエン酸塩 ｐＨ７．５、２％のＰＥＧ６０００）に再懸濁した。相補的なセンス及びアンチセンスＲＮＡｓを６８℃で１０分間のインキュベーション、続いて３７℃で３０分間インキュベーションによりアニールし、次いで０．４５ｕｍのセルロースアセテートフィルターをとおして遠心分離した。ＲＮＡの微量注入は、Ｌ４又は若い成体期の雌雄同体を用いての記載（Ｆｉｒｅ等， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９１）１１３：５０３−５１４）のようにして行った。注入した虫をＭ９バッファー（リットル当たり：３０ｇのＮａ２ＨＰＯ４、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ、５ｇのＮＨ４Ｃｌ）に１０−３０分間回収し、個々のプレートに移し、次いで毎日新しいプレートに移した。注入した雌雄同体の第１世代の自己子孫は、ノマルスキー微分干渉顕微鏡を備えた複合顕微鏡又は解剖顕微鏡で観察することによりＲＮＡｉ誘発の表現型を調べた。
【００５５】
使用される線虫の系統。線虫を処理及び培養する方法は記載がある（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７４）７７： ７１−９４）。線虫のバリエーション、Ｂｒｉｓｔｏｌ系統Ｎ２は野生型を示し、ここで使用されるほとんどの突然変異株と大部分がアイソジェニックである。遺伝子地図作成及び特徴付けに使用された特定の突然変異は：ＬＧＩ−ｕｎｃ７４（ｘ１９）、ｄｐｙ−５（ｅ６１）、ｕｎｃ−２９（ｅ１０７２）、ｆｏｇ−３（ｑ４４３）、ｄｐｙ−２４（ｓ７１）。ＬＧＩＩＩ−ｄｐｙ−１９（ｅ１２５９ｔｓ）、ｕｎｃ−１１９（ｅ２４９８）、ｐｈａ−１（ｅ２１２３）、ｄｐｙ−１８（ｎ４９９又はｅ３６４）ＬＧＩＶ−ｈｉｍ−８（ｅ１４８９）、ＬＧＸ ｌｏｎ−２（ｅ６７８）を含んでいた。全ては線虫ＩＩで説明される。ｓｅｌ−１２又はｈｏｐ−１コード領域の大部分又は部分を除去する欠失突然変異は、以下に説明される。ｓｅｌ−１２遺伝子は伴性であり、ｓｅｌ−１２突然変異は交配欠陥があるので、系統の間のｓｅｌ−１２Δの移動は、通常、相補的なｓｅｌ−１２＋対立遺伝子をもつ染色体増幅ｍｎＤｐ６６（Ｘ；Ｉ）を持つ雄を用いて成された。
【００５６】
ＤＨＰＬＣによるＳＮＰスクリーニング：候補ＳＮＰｓをＣＢ４８５６及びＮ２ゲノムＤＮＡから分離して増幅した。ＰＣＲ産物を混合、変性及び再アニールして、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）によるスクリーニングのためのヘテロ接合分子を作成した。各ＳＮＰを同一の分離勾配を用いて５つの異なる温度でスクリーニングした。ＳＮＰを、ヘテロ二本鎖がヘテロ接合状態で検出されるが、ホモ接合の初期の系統では検出されない場合に信頼できる結果とした。各ＳＮＰの適切な温度を記録し、組み換えした虫のＳＮＰをスクリーニングするために使用した。
組み換えした虫のＳＮＰスコアリング：適切な組み換え体からのライセートをＰＣＲによりＳＮＰｓを増幅するためのゲノムＤＮＡ鋳型として用いた。次いで、これらの粗製のＰＣＲ産物を、先に決定した各ＳＮＰの適した温度を用いてＤＨＰＬＣを実施した。各組み換え体について、各ＳＮＰをタイプし、無作為に表計算シートに入力した。次いでＳＮＰｓの物理的次数をＡｃｅＤＢから決定した。これは各組み換え体のハプロタイプを作り、組み換えが生じる位置を意味した。
【００５７】
ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１突然変異株の単離及び特徴付け。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の欠失対立遺伝子を、Ｐｌａｓｔｅｒｋの２段階法（Ｐｌａｓｔｅｒｋ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ． ５９−８０）によってＴｃ１トランスポゾン変異誘発活性源としてｍｕｔ−２を用いて得た。ｓｅｌ−１２（ｅｐ６）（以下ｓｅｌ−１２Δと称する）はｓｅｌ−１２オープンリーディングフレームのアミノ酸３４から４４１がなくなる欠失突然変異である。ｈｏｐ−１（ｅｐ９０）（以下ｈｏｐ−１と称する）は、ｈｏｐ−１オープンリーディングフレームのアミノ酸２１６で始まり、遺伝子の３’非翻訳領域で終結する７２２ｂｐの欠失である。ｓｅｌ−１２Δ及びｈｏｐ−１Δ単一突然変異を、表現型の特徴付け及び二重突然変異の構築の前に少なくとも１０回、野生型（上掲の線虫のバリエーション．Ｂｒｉｓｔｏｌ系統Ｎ２）に戻し勾配した。ｓｅｌ−１２Δ単一突然変異は、前記したｓｅｌ−１２（ｌｆ）突然変異のものと同様の産卵欠陥表現型を有する（Ｌａｖｉｔａｎ， Ｄ． 及び Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ， Ｉ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９５）３７７：３５１−３５４）。ｈｏｐ−１Δ突然変異は、他で記載される（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ． 等 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ （１９９９） ９６：２４９７−２５０２）ｈｏｐ−１欠失対立遺伝子と同様に、肉眼的な表現型の異常はない。
母性ｓｅｌ−１２＋活性を欠くｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異源を与えるために、我々は、平衡にしたｓｅｌ−１２Δ／ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ＋／＋ｕｎｃ−７４系統を構築した。この系統は、ｇｌｐ−１（ｌｆ）突然変異の特性をもつ生殖系統増殖欠陥を有する完全な浸透度の生殖不能表現型を示す二重突然変異ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体を分離する（Ａｕｓｔｉｎ， Ｊ． 及び Ｋｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ （１９８７）５１：５８９−５９９）。更に、これらの虫は十分な浸透度の２つのアンカー細胞表現型及びｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異により引き起こされる産卵口欠陥を思わせるめくれた産卵口表現型を有する。
【００５８】
ｓｅｌ−１２Δのエンハンサーの単離。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のエンハンサー対立遺伝子は、ホモ接合ｓｅｌ−１２Δ系統、又は後の実験においてｓｅｌ−１２Δ；ｕｎｃ−７４（ｘ１９）系統（ｕｎｃ−７４突然変異は染色体Ｉ上のｈｏｐ−１の近くにあり、組み込みの（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）地図作成の材料を提供する）の突然変異誘発の後に得られる。何れの遺伝子型のＸＸ雌雄同体も、記載されるように（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７４） ７７：７１−９４）エチルメタンスルホン酸で突然変異誘発し、１（又は時には２）の雌雄同体を個々の生育プレート（全部で約５５，０００プレート）につまみ出した。３から５日後、プレートを生殖系統増殖の欠陥を示す「暗い」外観を有する生殖不能Ｆ２子孫の外観について選別した。次いで候補生殖不能突然変異をｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δの虫と同様のｇｌｐ−１様生殖不能を示すものを同定するノマルスキー微分干渉顕微鏡により選別した。
【００５９】
この方法で決定した４４の候補の集団を、これらの突然変異の生殖不能表現型がｓｅｌ−１２エンハンサーに予想されるような虫のｓｅｌ−１２表現型に依存するかどうかを決定するために設計された交配計画を実施した。この試験のために、各候補をｄｐｙ−１９ＩＩＩ；ｈｉｍ−８；ｌｏｎ−２の雄に交配させ、生じた交配子孫を個々のプレートにつまみ出した。次の世代において、ｌｏｎ−２／ｌｏｎ−２子孫（組み換えのないｓｅｌ−１２＋／ｓｅｌ−１２＋である）の存在は、生殖不能表現型がｓｅｌ−１２＋活性の欠損に依存しない、あるいは既知のｇｌｐ−１系遺伝子（ｇｌｐ−１、ｌａｇ−１、ｌａｇ−２）のものの突然変異が原因であることを示唆する。この方法で分析された２９の候補はｓｅｌ−１２非依存性であり、従って、おそらくプレセニリンエンハンサーとしては拒否された。２９の拒否候補の２６について、生殖不能を引き起こす突然変異はトランスでｄｐｙ−１９に分離され、ｇｌｐ−１対立遺伝子に予測される作用である。これらのＬＧＩＩＩ突然変異の９つは、既知のｇｌｐ−１対立遺伝子の生殖不能表現型を補足することができず；他の１７ＬＧＩＩＩ突然変異は試験しなかった。
残りの１５の候補について、Ｇｌｐ生殖不能表現型はＦ２世代には見られず、結果は、ｓｅｌ−１２との相互作用を母性ｓｅｌ−１２＋活性によりレスキューするエンハンサー突然変異の存在と一致する。この解釈は、個々のプレートのＦ２世代のｓｅｌ−１２／ｓｅｌ−１２の虫を選び出し、次世代のｇｌｐ−１様生殖不能の再出現についてそれらの子孫を調べることにより試験された。これは、残り１５の候補のそれぞれについて得た結果であった。相補性試験の組み合わせ、減数分裂マッピング、突然変異体対立遺伝子の配列分析によって、各候補はｈｏｐ−１（８候補）或いは２つの新しく同定された遺伝子、ｐｅｎ−１（４候補）又はｐｅｎ−２（３候補）の何れかの突然変異を持つことが示された。
【００６０】
ｐｅｎ−１のマッピング、特徴付け、クローニング、及びコンピュータ分析：ｐｅｎ−１の遺伝子地図の作成を、ｓｅｌ−１２Δの背景において行い、二重突然変異ｐｅｎ−１；ｓｅｌ−１２Δの虫のｇｌｐ−１様生殖不能表現型を基にした。我々は、初めに染色体Ｉのｕｎｃ−２９及びｄｐｙ−２４の間にｐｅｎ−１（ｅｐ１４０）を位置づけた。更に可視マーカーでのマッピングはｕｎｃ−２９及びｆｏｇ−３の間、１．１ＭＢの間隔に位置を狭めた。遺伝子型ｐｅｎ−１の雌雄同体／ｕｎｃ−２９ｆｏｇ−３トランス雌雄同体から、１６／２０Ｕｎｃ−２９ｎｏｎ−Ｆｏｇ−３組み換え及び１／４Ｆｏｇ−３ｎｏｎ−Ｕｎｃ−２９組み換えはｐｅｎ−１を分離した。
【００６１】
ｐｅｎ−１突然変異が誘導されるＮ２ Ｂｒｉｓｔｏｌ系統と、線虫の系統ＣＢ４８５６ Ｈａｗａｉｉａｎ系統の間で多形であるＳＮＰマーカーを用いて更に細かいマッピングを行った。ゲノム配列決定センター（セントルイス、ＭＯ）は、多数のＣＢ４８５６の潜在的なＳＮＰｓを同定した（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｇｓｃ／ＣＥｐｏｌｙｍｏｒｐｈ／ｓｎｐ．ｓｈｔｍｌ）。ｕｎｃ−２９からｆｏｇ−３間のこれらの潜在的な４つのＳＮＰｓは、ＨＰＬＣを変性させることによりヘテロ二本鎖ＰＣＲ産物の分離に基づくＳＮＰ遺伝子型同定アッセイで試験することにより確認された（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＰＡ， 等， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９７ Ｏｃｔ； ７（１０）：９９６−１００５）。これらＳＮＰｓに対する初期マッピングは、遺伝子型ｕｎｃ−２９ ｐｅｎ−１／ＣＢ４８５６又はｐｅｎ−１ ｄｐｙ−２４／ＣＢ４９５６の雌雄同体の構築、及びＵｎｃ−２９ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１又はＤｐｙ−２４ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体の選択により為された。さらなるｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体はｕｎｃ−２９ ｐｅｎ−１ ｆｏｇ−３／ＣＢ４８５６ヘテロ接合体から単離された。５０のＵｎｃ−２９ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体のうちの９つは、Ｃ３１Ｈ５ ＳＮＰの右に生じ、ｐｅｎ−１をこのマーカーの右に位置させる交差を有していた。４５のＤｐｙ−２４ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１又はＦｏｇ−３ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体のうちの４つは、Ｆ１４Ｂ４ ＳＮＰの左に交差を有して、ｐｅｎ−１をこのマーカーの左に位置させていた。複合したデータは、Ｃ３１Ｈ５とＦ１４Ｂ４ ＳＮＰｓの区間、〜２４０ＫＢの間にｐｅｎ−１を位置づけた。
【００６２】
同様の間隔にｐｅｎ−１をマッピングするために、Ｃ４５Ｇ３からＦ１４Ｂ４の間にある更なるＳＮＰｓをＤＮＡ配列決定により同定した。間にあるＤＮＡの約２ＫＢの６つのセグメントをＮ２及びＣＢ４８５６ゲノムＤＮＡ及び配列決定された末端のＰＣＲにより増幅した。場合によっては、更なる配列決定プライマーは開始配列を作成するのに使用された。Ｎ２とＣＢ４８５６の間のＳＮＰｓを配列アラインメントにより同定し、〜２００ｂｐのＰＣＲ産物をそれぞれ質のよい候補の周りに作成した。これらの２００ｂｐの産物をスクリーニングし、上記のようにＤＨＰＬＣにより記録した。この分析はｐｅｎ−１を２つのＳＮＰｓ、一方がコスミドＣ４５Ｇ３と他方がコスミドＦ３６Ｈ２の間に位置づけ、相互に約５２ＫＢのところにある。
【００６３】
突然変異の検出。２つの一本鎖ヌクレオチド多形（ＳＮＰｓ）、標識したＣ４５Ｇ３Ａ及びＦ３６Ｈ２Ａは、７つの予測される候補遺伝子が存在する５２ｋｂのゲノム間隔、ｐｅｎ−１を決定した。この５２ｋｂの間隔の３０ｋｂ遺伝子の多い部分が、この領域に遺伝学的に位置づけされる突然変異を有する３つの虫、ｅｐ１４０、ｅｐ１６９、及びｅｐ１７０で示された。全てのＤＮＡ配列決定反応をＢｉｇＤｙｅ配列決定試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）の標準的なプロトコールを用いて実施し、産物をＡＢＩ３７７ＤＮＡ配列を用いて分析した。
ＡＢＩ３７７ＤＮＡ配列から得られたトレースデータを分析し、Ｐｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐプログラム（Ｇｏｒｄｏｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． （１９９８）８：１９５−２０２）を用いてコンティグに構築した。次いで再配列のデータを野生型の系統、Ｎ２と多形性について比較した。この分析は、第３位の塩基の変化、ＧからＡを３つのｐｅｎ−１対立遺伝子、トリプトファン（Ｗ）から停止（＊）までアミノ酸変化を生じるｅｐ１４０、ｅｐ１６９及びｅｐ１７０のＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１遺伝子（ＧＩ＃２８１５０３６）の１９１ＡＡで同定した。マッピングされていない突然変異体の更なる配列分析は、同じコドンの虫ｅｐ２１６の他の突然変異を明らかにするが、第２の部分ではＧからＡもまた、同じアミノ酸変化となる。ヒトｐｅｎ−１の分析により新規なｐｅｎ−１Ｂタンパク質を同定することができた。
【００６４】
ｐｅｎ−２のマッピング、特徴付け、クローニング、及びコンピュータ分析。我々は、初めにｐｅｎ−２（ｅｐ２２０）を染色体ＩＩＩのｕｎｃ−２５の左に位置づけた。遺伝子型ｐｅｎ−２／ｄｐｙ−１８ ｕｎｃ−２５の雌雄同体から、４／４ ｎｏｎ−Ｄｐｙ−１８ Ｕｎｃ−２５組み換え体はｐｅｎ−２を分離し、０／２１ Ｄｐｙ−１８ ｎｏｎ−Ｕｎｃ−２５組み換え体はｐｅｎ−２を分離した。７０のｄｐｙ−１８ ｕｎｃ−２５ホモ接合体が同一のヘテロ接合雌雄同体、２つのみの分離されたｐｅｎ−２から選択され、ｐｅｎ−２がｄｐｙ−１８の比較的近区にあり、或いはこの遺伝子の左にあることが示唆される。
ｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間にｐｅｎ−１を位置づけする更なるマッピング：ｐｅｎ−１／ｐｈａ−１ ｄｐｙ１９；ｓｅｌ−１２Δ雌雄同体から、１／１４ｎｏｎ−Ｐｈａ−１ Ｄｐｙ−１組み換え体はｐｅｎ−２を選択した。これらのデータは、ｐｅｎ−２をｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間、約２４０ＫＢの間に位置づけ、ｐｅｎ−２がｄｐｙ−１８の近くにあることを示唆した。
【００６５】
予測遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９としてのｐｅｎ−２の同定：我々は、１）ｐｈａ−１からｐｄｙ−１８の間の予測遺伝子のＲＮＡｉ及び２）突然変異検出に基づいて、ｐｅｎ−２が予測遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９（ＧＩ＃３８７３４１５）であることを決定した。その間の３１の遺伝子の２８について、Ｔ７プロモータ配列を付随するプライマーを、上記されるような鋳型として第一鎖ｃＤＮＡプール又はゲノムＤＮＡの何れかを用いた選択されるコーディング領域の増幅に使用した。２本鎖ＲＮＡを各ＰＣＲ産物から合成し、ｓｅｌ−１２Δホモ接合体に注入した。Ｔ２８Ｄ６．９のＲＮＡｉは注入した虫の子孫のうち予期されるｐｅｎ−２表現型を作り、ｓｅｌ−１２Δの虫のｇｌｐ−１様生殖不能、並びにＮ２及びｓｅｌ−１２Δの虫への注入の後のＡｐｈ胚停止表現型を含む。Ｔ２８Ｄ６．９オープンリーディングフレームの突然変異検出は、３つのｐｅｎ−２対立遺伝子（ｅｐ２１９、ｅｐ２２０、ｅｐ２２１）のそれぞれでナンセンス突然変異を同定した。概略すると、このグループ、ｅｐ２２０の単一突然変異をｅｐ２２０ライセート及び野生型系統で増幅したＰＣＲ産物を配列決定することにより試験した。この分析は、トリプトファン（Ｗ）から停止（＊）で生じた７４ＡＡのＧからＡへの突然変異を同定した。位置づけされない突然変異の更なる配列分析は、このグループに２以上の突然変異があることを明らかにした。ｅｐ２１９の虫はＷから＊を作る７４ＡＡの３番目の位置にＧからＡへの変異を有する。ｅｐ２２１の虫は３６ＡＡの停止コドンにも生じる他のＷでＧからＡへの変異を有する。これら３つの変異は全て、Ｔ２８ｄ６．９遺伝子の機能を有意に変化させ又は除去することができる、高度に保存されたトリプトファンに影響する。
【００６６】
Ｖ．細胞を利用したレポーターアッセイ
我々は、Ｇａｌ４ＶＰ１６転写活性化タンパク質に融合するＡＰＰのＣ末端の９９アミノ酸を持つレポーター構造を利用した細胞培地γ分泌酵素アッセイを開発した。Ｇａｌ４部分は、プレセニリン依存切断がそれを遊離して核に移動させ、ＵＡＳルシフェラーゼレポーター導入遺伝子の転写を活性化するまで、ＡＰＰ膜貫通ドメインによって細胞表面に維持される。アッセイ確証実験において、既知のγ分泌酵素阻害剤はレポーター遺伝子活性を完全に阻止し、既知のドミナントネガティブプレセニリン突然変異はまた、レポーター活性を阻害した。概念的に類似したアッセイは、以前、ＵＡＳβガラクトシダーゼ導入遺伝子レポーターを用いたインビボのショウジョウバエでの研究が示されている。βガラクトシダーゼレポーター遺伝活性、従ってさらにγ分泌酵素様プロテアーゼ活性は、このインビボアッセイにおけるプレセニリンの存在に完全に依存していることが示されている。
【００６７】
我々のデータは、ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２、ａｐｈ−２又はプレセニリンの阻害が定常状態のプレセニリンタンパク質レベルの強力な減少、及びγ分泌酵素活性の相関した減少を生じることを示す。ｐｅｎ−１又はａｐｈ−２阻害の効果は等しい強さであり、ｐｅｎ−２はγ分泌酵素活性の減少及びプレセニリンタンパク質減少の両方に関してほぼ同等の強さが、そのプレセニリン阻害である。プレセニリン減少は、ショウジョウバエ及びヒト細胞システムを含む複数の細胞を利用したシステムにおいて、ＲＮＡｉ、開示されるスクリーニングで同定される複素環式化合物、及び細胞内発現抗体を含む幾つかの阻害剤を用いて立証される。これらのデータは、ｐｅｎ遺伝子及びプレセニリンの機能的相互作用についてのアッセイを提供する。従って、本発明は、プレセニリンとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）ポリペプチドの機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するための、プレセニリンとｐｅｎポリペプチドの機能的相互作用を与えるシステムに予測されるストレスを導入することによる方法を提供し、よってシステムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を与え、ストレスのない状態で、システムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を与え；システム内のプレセニリンの量の変化としてプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出し、量はプレセニリンＮ又はＣ末端断片（ＮＴＦｓ）プレセニリンホロタンパク質の量、又はその割合として表されてもよく、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異は、ストレスがプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示す。
【００６８】
この明細書において引用した全ての刊行物及び特許出願は、各刊行物もしくは特許出願が特にまた個々に出典明示により取込むことが示されているかのごとく、出典明示によりここに取込む。上述した発明は、理解を明瞭にする目的で、例証及び実施例によりある程度の詳細さをもって記載したが、特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りそれに所定の変化と変更を加えても良いことは本発明の教唆から当業者にとって明らかであろう。
（導入）
（発明の分野）
本発明の分野は、プレセニリン機能を調節するタンパク質である。
【０００２】
（背景）
アルツハイマー病は、中年から後年において記憶障害及び認知低下を引き起こす中枢神経系の変性疾患である。疾患は２つの主な病理学的特徴、脳内の細胞外アミロイドプラークとニューロン内神経原繊維変化により特徴づけられる。これらの障害は神経及びグリア細胞の機能を阻害し、シナプスの減少および痴呆を引き起こす。早発性及び遅発性発症のどちらの型の疾患も遺伝的な要素を有していることが示されており、４つの遺伝子がＡＤの増大したリスクに決定的に関連している：ＡＰＰ、ＰＳ１、ＰＳ２及びＡｐｏＥ。これらの遺伝子は、最終的にアミロイドβ（Ａβ）、アルツハイマーアミロイドプラークの主要成分の生成、輸送、及び／又は排除の役割に機能的に関連している（Ｓｅｌｋｏｅ， Ｄ． １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９９ ｓｕｐｐ： Ａ２３参照）。
【０００３】
アルツハイマーアミロイドプラークは、大部分、４０−４２のアミノ酸ペプチドＡβから成る（Ｇｌｅｎｎｅｒ， Ｇ． Ｇ．， 及び Ｗｏｎｇ， Ｃ． Ｗ．， １９８４ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １２２：１１３１）。Ａβはｂアミロイド前駆体タンパク質、又はβＡＰＰからタンパク質分解性の切断により誘導される（Ｋａｎｇ Ｊ． 等 １９８７， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７３３）。３つの分泌酵素活性はＡＰＰを切断してＡβペプチド又はより短いｐ３と呼ばれる別の断片産物を生成する。β分泌酵素はＡβのＮ末端を生成するが、α分泌酵素はＡβ配列を内部切断してｐ３のＮ末端を生成する。γ分泌酵素は、ＡＰＰのＣ末端β及びα分泌酵素産物を切断してＡβ及びｐ３の異質性のＣ末端を生成する。家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）系統に見られるＡＰＰ突然変異は、３つの分泌酵素切断部位の周りに集まり（Ｇｏａｔｅ， Ａ． 等 １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３４９：７０４； Ｍｕｒｒｅｌｌ， Ｊ．，等 １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：９７； Ｃｈａｒｔｉｅｒ−Ｈａｒｌｉｎ等 １９９１， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：８４４； Ｍｕｌｌａｎ， Ｍ．等 １９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：３４５； Ｌｅｖｙ， Ｅ．等， １９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：１１２４； Ｈｅｎｄｒｉｋｓ， Ｌ．等１９９２， Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． １：２１８）、それらはそれぞれ全Ａβ（Ａβ４２＋Ａβ４０）を増加するか、又はＡβ４２／４０の割合を増加する。Ａβ４２はインビトロでより敏速に沈殿し、びまん性老人斑と呼ばれるアミロイド沈着の素早い形成の主要成分であるため、増加した全身性のＡβ４２はプラークのより早い形成、ＡＤのより早い発症を引き起こしうる。
【０００４】
家族研究によって優性遺伝、早期発症ＡＤに関連する他の２つの遺伝子、プレセニリン１（ＰＳ１）及びプレセニリン２（ＰＳ２）が同定された（Ｓｈｅｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｒ． 等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７５： ７５４； Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ， Ｅ．等 １９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ９７３； Ｒｏｇａｅｖ．， Ｅ． Ｉ． 等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７６： ７７５）。これらのタンパク質は、配列において互いに類似し、８つの膜貫通セグメントを有するポリトピック膜タンパク質をコードする。ＦＡＤヒト細胞株、トランスフェクト細胞、及び遺伝子導入マウスの研究によって、ＰＳ ＦＡＤ突然変異がＡＰＰのプロセシングパターンに変化を生じさせ、Ａβ４２／４０の割合を増加させることが説明された（Ｓｃｈｅｕｎｅｒ， Ｄ．等 １９９６， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２：８６４； Ｃｉｔｒｏｎ， Ｍ．等 １９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：６７； Ｂｏｒｃｈｅｌｔ， Ｄ．等 １９９６， Ｎｅｕｒｏｎ １７： １００５； Ｄｕｆｆ， Ｋ．等 １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８３： ７１０； Ｔｏｍｉｔａ， Ｔ．等 １９９７， ＰＮＡＳ ９４：２０２５）。ＰＳ１ノックアウトマウスの研究によって、ＰＳ１機能の低下はγ分泌酵素活性の減小によるＡβ生成の減少を引き起こすことが説明された（Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ， Ｂ．等 １９９８， Ｎａｔｕｒｅ ３９１： ３８７）。従ってプレセニリン機能は２つの経路：ミスセンス突然変異がγ分泌酵素切断特異性を変化させること、さらにプレセニリン活性の低下がγ分泌酵素活性の低下を引き起こすことで、γ分泌酵素の活性に関与する。
【０００５】
プレセニリン活性の阻害は、Ａβ生成を減少させ、従ってアルツハイマー病に対する潜在的に有用な治療アプローチである。しかしながら、γ分泌酵素活性とＡβの生成に対する機能的な関与にも関わらず、ＰＳ活性の生物学的性質はあまり分かっていない。ＥＲ及び／又はゴルジ複合体でのＡＰＰ、Ｎｏｔｃｈ、及び／又はγ分泌酵素のシャペロンとしての作用（Ｔｈｉｎａｋａｒａｎ， Ｇ． 等 １９９８， Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． Ｄｉｓ． ４： ４３８）、新規なアスパルチルプロテアーゼとしての、すなわちそれ自体のγ分泌酵素としての活性（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｓ． 等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１３）、及び酸化ストレス及びアポトーシスに対する反応における潜在的な役割（Ｗｏｌｏｚｉｎ， Ｂ．等 １９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１７１０； ｖｉｔｏ， Ｐ．等 １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７２：２８３１５； Ｇｕｏ， Ｑ．， 等 １９９７， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：４２１２）を含む様々な機能が提案されている。明確な機能的アッセイがないことは、プレセニリンを対象とする有用な小分子治療学の確立の困難性を増大させる。プレセニリンを対象とする代わりの方法は、γ分泌酵素及びＡβ生成の経路においてプレセニリンと共に作用し、薬剤の開発にさらに受け入れられやすい更なるタンパク質を見つけねばならない。このような新規な対象の発見に利用できる方法の１つは、ショウジョウバエ及び線虫等のモデル生物でプレセニリンと相互作用する遺伝子の遺伝子スクリーニングを行うことである。
【０００６】
ＰＳ遺伝子の無脊椎動物オルソログが、配列検索及び遺伝子スクリーニングの両方により同定されている。線虫のゲノムは、３つのプレセニリン遺伝子、ｓｅｌ−１２（ｌｉｎ−１２のサプレッサー及び／又はエンハンサー；Ｌｅｖｉｔａｎ， Ｄ．等 １９９５， Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３５１）、ｈｏｐ−１（プレセニリンのホモログ；Ｌｉ， Ｘ．等， １９９７， ＰＮＡＳ ９４：１２２０４）及びｓｐｅ−４（精子形成欠陥；Ｌ’Ｈｅｒｎａｕｌｔ等， １９９２， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１９：５５）を含む。ｓｅｌ−１２、ｈｏｐ−１及びｓｐｅ−４はそれぞれ、ＰＳ１及び２と４８、３５及び２３％の配列類似性を有する。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１は幾つかの組織で重複した機能を有し（下記参照）、さらにｓｐｅ−４はオスの生殖系列で独立した機能を果たすようである。導入遺伝子を用いたレスキュー実験により、ヒトＰＳ１及びＰＳ２はｓｅｌ−１２の低下により生じる表現型を救済することができることが示され、プレセニリン機能が線形動物から哺乳動物まで保存されていることを証明する（Ｌｅｖｉｔａｎ， Ｄ． 等 １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３７７：３５１； Ｂａｕｍｅｉｓｔｅｒ， Ｒ． 等 １９９７， Ｇｅｎｅｓ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ １：１４９）。
【０００７】
ｓｅｌ−１２はＮｏｔｃｈ遺伝子ｌｉｎ−１２の活性化対立遺伝子のサプレッサーとして遺伝学的に同定された。この発見はプレセニリン活性及びＮｏｔｃｈシグナル伝達経路の活性の間の機能的な関係を証明した。マウス（Ｈｅｒｒｅｍａｎ， Ａ．等 １９９９， ＰＮＡＳ ９６：１１８７２）、ショウジョウバエ（Ｓｔｒｕｈｌ， Ｇ．等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５２２； Ｙｅ， Ｙ．等 １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８：５２５）及び線虫（Ｌｉ， Ｘ．等， １９９７， ＰＮＡＳ ９４：１２２０４； Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ．等 １９９９， ＰＮＡＳ ９６：２４９７）でのインビボ実験では、プレセニリン活性の完全な欠損の表現型が生物におけるＮｏｔｃｈシグナル伝達の完全な排除と非常によく一致することが示され、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達活性に絶対的に必要であることを示唆する。Ｎｏｔｃｈレセプターは、無脊椎動物及び脊椎動物の多くの胚及び成体の組織の分化に重要な細胞間シグナル伝達現象を媒介する細胞表面にある１回貫通型の膜貫通タンパク質である。シグナル伝達は、膜貫通セグメントの内面におけるＮｏｔｃｈのリガンド依存性切断、それに続く核のＣ末端ドメインの転位座に関与する。細胞培地及びインビボでのＮｏｔｃｈプロセシングの分析は更に、プレセニリンがＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを膜貫通ドメインから放すリガンド依存性切断現象に必要であることを示した（Ｓｔｒｕｈｌ， Ｇ．等 １９９９， Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５２２； Ｄｅ Ｓｔｒｏｏｐｅｒ， Ｂ．等 １９９９ Ｎａｔｕｒｅ ３９８： ５１８）。Ｎｏｔｃｈ及びＡＰＰの両方の切断におけるプレセニリンの類似した要求は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路がプレセニリン系遺伝子のスクリーニングでＡｂ生成の代わりに利用できる代用のアッセイであり得ることを示唆する。
【０００８】
線虫プレセニリンｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の突然変異は、線虫Ｎｏｔｃｈレセプターｌｉｎ−１２及びｇｌｐ−１による欠陥のあるシグナル伝達と関係した表現型となる。ｈｏｐ−１単独の欠損では、明らかな表現型とはならない。ｓｅｌ−１２の欠損は、ｌｉｎ−１２突然変異を思わせる産卵口の欠損と強い産卵障害表現型となる。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１両方の欠損はｓｅｌ−１２単独の場合に見られるＮｏｔｃｈ表現型をより重大に生じる。ｓｅｌ−１２；ｈｏｐ−１二重突然変異に見られる特定の表現型は、これらの虫が母性の野生型プレセニリン活性を受け継ぐかどうかによる。母性的に与えられるｓｅｌ−１２＋活性がある場合、二重突然変異は新たな産卵欠陥表現型を示し、全ての子孫がｇｌｐ−１様の発達欠陥で胚形成の間に停止する。母性ｓｅｌ−１２＋活性のない場合には、二重突然変異はｇｌｐ−１突然変異の生殖系列増殖欠陥特性を有する生殖不能のより強い表現型を示す。総合して、この一連の特性は、ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１が部分的に重複し、２つの線虫Ｎｏｔｃｈレセプターによるシグナル伝達を刺激するために協調的に作用することを示す。
【０００９】
ｓｅｌ−１２とｈｏｐ−１活性の間の部分的な重複性は、ｓｅｌ−１２；ｈｏｐ−１二重突然変異に相当する表現型を生じうる機能対立遺伝子のｓｅｌ−１２欠損のエンハンサー検索を可能にする。このエンハンサースクリーニングは、ｐｅｎ−１及び２（ｐｅｎ＝プレセニリンエンハンサー）と名付けられ、プレセニリン機能に必要とされる２つの新規な遺伝子を同定した。ｐｅｎ遺伝子の表現型に基づいて、我々は第３のプレセニリンエンハンサー遺伝子、ａｐｈ−２を同定した。ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２及びａｐｈ−２遺伝子配列は、ｐｅｎ−１Ｂを含むヒト及び他の動物のオルソロガス遺伝子を同定する。これらの遺伝子及びそれらを調節する方法は、アルツハイマー病治療のための治療法進歩のための対象である。
【００１０】
（関連分野）
ヒトｐｅｎ−１に関する配列は、特にＷＯ９８５５５０８、ＷＯ９８５５５０８、ＷＯ９９０６５５４及びＵｎｉｇｅｎｅ ＣＧＩ−７８（ＧＩ＃６９１１５２２及びＧＩ＃４９２９６２３）に見られる。
ヒトｐｅｎ−２に関する配列は、特にＡＤ０００６７１（ゲノム）及びＧＩ＃３６０１３７１（ｃＤＮＡ）に見られる。
ヒトＡｐｈ−２に関する配列は、特にＷＯ９８４５４３５、ＷＯ９８４５４３６、ＷＯ９３００３５３及び（ＫＩＡＡ０２５３、ＤＮＡ ＧＩ１６６５７７２、タンパク質ＧＩ１６６５７７３）に見られる。
多数のＥＳＴｓが、ここに開示される天然ヒトｐｅｎ−１Ｂ配列の部分を含む公的データベースに見られ、ｎｓ４３ｇ０８．ｓｌ（ＧＩ＃２８７４５２０、注釈なし）及びＵｎｉｇｅｎコンティグＨｓ．４２９５４（ｐｅｎ−１（ＣＧＩ−７８）に５３％類似）のＥＳＴｓを含み、それは、ＡＩ５３８２０４（ＩＭＡＧＥ：２１８９９８６）； ＡＡ８０８３５５（ＩＭＡＧＥ：１３３４４１７）； Ｎ２１１５３（ＩＭＡＧＥ：２６４８６８）； ＡＩ２０４１６４（ＩＭＡＧＥ：１７３４８４０）； ＡＩ００１９９０（ＩＭＡＧＥ：１６１９１９１）； ＡＡ５７８７１８（ＩＭＡＧＥ：９５３２４１）； ＡＡ８８７９７５（ＩＭＡＧＥ：１１６０１１９）； ＡＩ００４２８２（ＩＭＡＧＥ：１６２６００４）； ＡＩ１８８０４０（ＩＭＡＧＥ：１７３８９５４）； ＡＩ１９２０３３（ＩＭＡＧＥ：１７３８６５９）； ＡＩ００５１１３（ＩＭＡＧＥ：１６２６２７７）； ＡＷ１１８９０８（ＩＭＡＧＥ：２６０５６３１）； ＡＩ７６０７５４（ＩＭＡＧＥ：２３９８３４９）； ＡＡ８０５７７０（ＩＭＡＧＥ：１１８６４３０）； ＡＡ８０５７５７（ＩＭＡＧＥ：１１８６４０６）； ＡＷ１８２０７１（ＩＭＡＧＥ：２６６２４２８）； ＡＡ８０５７７３（ＩＭＡＧＥ：１１８６４３６）； ＡＩ３０１１９１（ＩＭＡＧＥ：１８９７２５３）； ＡＡ９７６４５５（ＩＭＡＧＥ：１５８９８９５）； 及びＮ３１７１０（ＩＭＡＧＥ：２７１２９２）。
【００１１】
（発明の概要）
本発明は、プレセニリンエンハンサータンパク質（ｐｅｎｓ）に関する方法、組成物及びシステムを提供し、プレセニリン−ｐｅｎ相互作用を調節（例えば、促進又は抑制）及び検出する方法を含む。特定の態様では、本方法は、上流又は下流のＮｏｔｃｈ又はＡＰＰのプロセシングとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）の機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するために提供され、次のことによってなされる：（ｉ）Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの機能的相互作用を提供するシステムに所定のストレスを導入し、それによって、システムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの不偏性相互作用を提供するものであり；及び（ｉｉ）Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用を検出し、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異は、ストレスがＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎの相互作用を変化させることを示す。
【００１２】
システムは、ｐｅｎ発現が非天然又は病原性であると決定されるｐｅｎを発現する生細胞、あるいは規定量のｐｅｎを含有するインビトロ無細胞混合物であり得る。広範で様々な実施態様が包含され；例えば、システムが、生細胞、インサイツ又はインビトロであるもの、ストレスが、薬理学的に活性な薬剤、或いは例えばｐｅｎをコードする別の内在性対立遺伝子のゲノム崩壊又はｐｅｎをコードする内在性対立遺伝子の配列アンチセンスを含むポリヌクレオチドの共発現等によるｐｅｎの機能的発現の欠損であるものである。或いは、システムは、インビトロ、無細胞混合物であってもよく、ストレスは薬理学的に活性な薬剤である。
Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎのストレス偏向性相互作用は、あらゆる都合のよい手段又はマーカーにより検出することができ、例えばアルツハイマー病の徴候、Ｎｏｔｃｈの転写レポーター、Ａβ等の下流産物の生成又はｐｅｎの例えば特定の抗体との構造変化を検出する。
【００１３】
本発明は、ｐｅｎ特異的構造及び活性を有するｐｅｎポリペプチド、関連するヌクレオチド及びｐｅｎ機能の調節因子に関する様々な他の方法及び組成物を提供する。ｐｅｎポリペプチドは、対象ｐｅｎポリペプチドコーディング核酸で形質転換した宿主細胞から組み換えにより作成しても、例えば哺乳動物細胞等の天然源から精製してもよい。本発明は、天然ｐｅｎ遺伝子と特異的にハイブリッド形成する能力のある単離したｐｅｎハイブリダイゼーションプローブ及びプライマー、ｐｅｎに特異的に結合する薬剤、例えば特異的抗体、アゴニスト及びアンタゴニスト、並びに診断（例えばｐｅｎ転写物の遺伝子ハイブリダイゼーションスクリーニング）、治療（例えば、Ａβ生成を調節するｐｅｎ阻害物質）及び生物薬剤産業（例えば、免疫原、天然ｐｅｎ遺伝子及び転写物を単離するための試薬、リード薬物の化学ライブラリをスクリーニングするための試薬）における対象組成物を製造及び使用する方法を提供する。特定の態様では、ｐｅｎ方法及び組成物はｐｅｎ−１Ｂポリペプチドに関する。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、プレセニリンエンハンサータンパク質（ｐｅｎｓ）に関する方法、組成物及びシステムを提供し、ｐｅｎとＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとの間の相互作用を調節（例えば、促進又は阻害）及び／又は検出の方法を含む。特定の実施態様では、本方法は、プレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）とＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングの機能的な相互作用を変化させるストレスの特異的な検出を提供する。
ｐｅｎはｐｅｎ−１、ｐｅｎ−１Ｂ、ｐｅｎ−２及びＡｐｈ−２ポリペプチドから単独で選択される。これらの名称は、開示された親配列を含む、その特定断片を含む、或いは開示される親配列に類似した配列を有するポリペプチドを呼ぶ際に一般的に使用され、配列類似性は、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは１００％であり、具体的に開示されるプレセニリン又は相当する親配列ｐｅｎ特異的抗体に特異的に結合し、一以上の開示される相互作用アッセイで測定される。ポリペプチドは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも５０の連続した残基、及び最も好ましくは全ポリペプチド及び／又は親ｐｅｎ配列にわたって含み、並びに類似性又は同一性がその範囲にわたる。
【００１５】
表１．親ｐｅｎポリペプチド
開示される同義遺伝子について、親配列に関して「特定のウィンドウサイズＷを超えるパーセント（％）配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならばギャップを導入した後に、親配列の残基と一致する候補配列のＷ残基の任意のウィンドウにおける残基のパーセンテージとして定義される。％同一性の値は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９により作られる。幾つかの検索パラメータを使用するＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２．０ａ１９は、その全てが初期の値に設定される。ＨＳＰ ＳとＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の組成及び対象の配列が検索されるものに対する特定のデータベースの組成に応じてプログラム自身により確立されるが；しかしながら、値は感度を向上させるように調節してもよい。従って、％アミノ酸配列同一性の値は、パーセント同一性が記録されるウィンドウサイズＷで割った一致する同一残基数により決定される。一致する親配列を突然変異させ、プレセニリン又は抗体結合を確認することにより例示的な種が容易に作成される。例えば、配列番号：１６−２５に定義されるｐｅｎ−１Ｂポリペプチドは、親配列である配列番号：６の周りに活性な（プレセニリン結合を示す）９０％のジーナスを例証する。特定の実施態様では、ｐｅｎは天然のｐｅｎ、例えばヒト、マウス、キイロショウジョウバエ、オオタバコガ（Ｈ． ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）又は線虫のｐｅｎ−１；ヒト、ラット、マウス、ウシ、キイロショウジョウバエ又は線虫のｐｅｎ−２；ヒトのｐｅｎ−１Ｂ；及びヒト、キイロショウジョウバエ又は線虫のＡｐｈ−２である。特定の態様では、ｓｅｌ−１２Δ（Δは欠失対立遺伝子を意味する）ホモ接合ｐｅｎは線虫遺伝子突然変異エンハンサースクリーニングで同定可能な天然に生じるｐｅｎである。
【００１７】
ｐｅｎとＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとの間の相互作用は、プロセシング経路でのｐｅｎの影響を特異的にアッセイするあらゆる便利な方法で検出されうる。生成物の生成（例えば、Ａβ又はＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン生成）の下流摂動、中間経路段階（多くの中間Ｎｏｔｃｈ及びＡＰＰプロセシング経路段階及び中間成分相互作用が当該分野でよく記録されてる）、又はｐｅｎ−プレセニリン又はｐｅｎ−γ分泌酵素結合の開始をモニターするためにアッセイが構築されうる。
広範な種々のシステムが本方法に使用されうる。以下に記載されるのは、突然変異体ｐｅｎ遺伝子でストレスを与え、感作したＮｏｔｃｈ及び／又はＡＰＰプロセシング経路を提供する動物システムであり、システムは更なる相互作用タンパク質を特徴づけるのに使用される。特定の実施態様では、システムはプレセニリン又はγ分泌酵素等の結合標的とｐｅｎの両方を発現する細胞又は動物、規定量のｐｅｎ及び結合標的を含有するインビトロ無細胞混合物を含み；このような細胞及び混合物の適用は、２−ハイブリッド、生化学的ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ、免疫沈降、蛍光偏光及び固相結合アッセイを含む。適用できるシステムの多様性により、化学薬品、例えば候補薬、毒、汚染物質等；放射線、例えば紫外線及びｘ線；感染、例えば細胞性形質転換を含むウィルス又は細菌感染；遺伝子突然変異等を含む広範な種々のストレスがアッセイ又は評価されうる。
【００１８】
相互作用が特異的に検出されれば、ｐｅｎポリペプチドとプレセニリンの相互作用の検出のために用いられる特定の方法はアッセイの性質に依存しうる。例えば、以下に説明されるように、ｐｅｎ突然変異体特定表現型の調節は、遺伝子相互作用アッセイについての読み取りを与える。インビトロアッセイにおいて、ｐｅｎポリペプチド及び／又は標的が標識されるかどうか、どのようにしてそれが為されるかによって、相互作用の読み取りは蛍光、光学濃度、ゲルシフト、放射等の変化により測定されうる。特定の実施態様では、システムは下流ＡＰＰプロセシング読み取りを提供する。
特定の実施態様では、本方法は、ＡＰＰ及び／又はＮｏｔｃｈプロセシングとｐｅｎポリペプチドの物理的な相互作用を変化させるストレスの特異的な検出を包含する。一態様では、この実施態様は次の工程を含む（ａ）結合標的とｐｅｎの物理的相互作用を与えるシステムに所定のストレスを導入する工程、それによりシステムが標的とｐｅｎのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムは標的とｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を提供する；及び（ｂ）標的とｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出する工程、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異によって、ストレスが標的とｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示し、好ましい標的はγ分泌酵素、プレセニリン、ｎｏｔｃｈ及び／又はＡＰＰ基質、及び／又はその組み合わせ及び複合体を含む。
【００１９】
後者の実施態様では、プレセニリンはプレセニリン−１（ＰＳ−１）及びプレセニリン−２（ＰＳ−２）から選択される。これらの名称は、一般に開示される親配列を含む、又はその特定断片を含む、又は開示された親プレセニリン配列に対して配列類似性を有するポリペプチドを称するのに使用され、配列類似性は少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％及び最も好ましくは１００％であり、ここでプレセニリンは、一以上の開示される遺伝子的又は生化学的相互作用アッセイで測定されるような相当親配列プレセニリンにより提供されるものと比較して、プレセニリンに特異的で検出可能な機能的相互作用を提供するのに十分である。プレセニリンは、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも５０の連続した残基、最も好ましくは全長プレセニリン又は親配列を含み、類似性又は同一性がその範囲にわたる。親プレセニリンは、当該分野でよく知られＧｅｎｂａｎｋ等の公的な受託者から入手できる、天然配列プレセニリン１（例えば、ヒト、マウス、ニワトリ及びアフリカツメガエルの配列）及びプレセニリン２（例えば、ヒト、マウス、及びアフリカツメガエルの配列）から選択される。
【００２０】
対象とする方法に有用な本発明の組成物は、対象とするｐｅｎポリペプチド及び所定量の開示されるｐｅｎ及びプレセニリンポリペプチドを含む混合物を含み、特に、好ましくはこれらの成分が共に単離されるもの及び本質的に両成分からなる混合物、即ち、混合物の他の成分（アッセイしたストレスを除く）がこれら２つの成分の相互作用に有意に影響しないものである。本発明の他の態様は、開示されるｐｅｎポリペプチドをコードする核酸、それらに特異的に結合する抗体、及び使用方法を含む。
開示される親配列又はその断片からなる対象ポリペプチドが単離され、即ち非天然又は異種性の成分、例えば非天然アミノ酸又はアミノ酸配列或いは天然のタンパク質においてポリペプチドが結合するもの以外の天然アミノ酸又は配列と共有的に結合するｐｅｎポリペプチドを包含し、好ましくは溶液中にあり、好ましくは得られる試料中で全ポリペプチドの少なくとも約０．５重量％、より好ましくは少なくとも約５重量％を構成し、純粋なポリペプチドが、得られる試料中で全ポリペプチドの少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９９重量％を構成し、親配列以外を含む対象ポリペプチドが好ましい。ポリペプチドはより大きい複合体、例えばより大きいポリペプチド及び／又は種々のコンジュゲート等の共有的又は非共有的な部分でありうる。ポリペプチドは組み換え技術により合成、作成され、又は哺乳動物、好ましくはヒト細胞から精製されうる。広範な種々の分子及び生物化学の方法が生化学合成、分子発現及び対象とする組成物の精製に利用可能であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，等 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ，等， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）又は他に当分野で既知のものを参照のこと。
【００２１】
断片を包含するｐｅｎは、相当する開示した親ｐｅｎ配列の少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５，より好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５、最も好ましくは少なくとも５０の連続する残基を含む。ｐｅｎポリペプチドは、相当するｐｅｎ特異的機能、例えば天然ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシング過程、特にここで開示されるような一以上の結合アッセイに示されるようなプレセニリン結合又は結合阻害活性、及び／又は特に開示される結合アッセイで測定されるようなｐｅｎ特異的抗体結合又は結合阻害活性との相互作用を提供する。
ｐｅｎ特異的機能は、便宜的なインビトロ、細胞系、又はインビボアッセイ、例えば結合アッセイにより測定することができる。結合アッセイという用語は、一般にｐｅｎポリペプチドと特異的結合標的の分子相互作用を評価する、インビトロ、細胞培地又は動物系アッセイ（例えば遺伝子治療技術を使用する又は遺伝子組み換えを含む）等を含むあらゆるアッセイを包含して使用される。結合標的は、天然細胞内結合標的、例えばプレセニリン、ｐｅｎ調節タンパク質又はｐｅｎ活性もしくはその局在を直接変化させる他の調節分子；あるいは非天然結合標的、例えば下記されるようなスクリーニングアッセイで同定されるもののようなｐｅｎ特異的薬剤、又は抗体等の特異的免疫タンパク質であり得る。ｐｅｎ結合特異性は、ＡＰＰプロセシング（例えば、ｐｅｎ発現細胞の負のエフェクターとしての機能に対する対象ポリペプチドの能力）により、結合平衡定数（通常は少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）により、免疫原性（例えば、マウス、ラット、ヤギ又はウサギ等の異種の宿主のｐｅｎ特異的抗体を誘発する能力）等によりアッセイされ得る。
【００２２】
特定の実施態様では、対象ポリペプチドは、特に担体タンパク質と結合する場合にｐｅｎ特異的抗原及び／又は免疫原を提供する。例えば、対象ポリペプチドはキーホールリンペット抗原（ＫＬＨ）に共有的に結合し、コンジュゲートは完全フロイントアジュバンドに乳化される。実験用ウサギを従来のプロトコールに従って免疫化し、出血させる。ｐｅｎ特異的抗体の存在を、免疫化した対応するｐｅｎポリペプチドを用いて固相免疫吸着アッセイによりアッセイする。例えば表２参照。
表２．ｐｅｎ−１Ｂ特異的ウサギポリクローナル抗体を誘発する免疫原ｐｅｎ−１Ｂポリペプチド：上記されるプロトコールにより免疫化されたｐｅｎ−１Ｂポリペプチド−ＫＬＨコンジュゲート
対象ｐｅｎポリペプチドはまた、Ｎ−及び／又はＣ−末端切断を含む、親ｐｅｎポリペプチドの小さな欠失型突然変異を包含する。このような欠失型の突然変異は、ｐｅｎ競合的又はドミナントネガティブな活性を求めてスクリーニングされる。ｐｅｎ−１Ｂの例示的な活性欠失突然変異は、配列番号６、残基１−２５４；配列番号：６、残基４−２５５；配列番号：６、残基９−２５７；及び配列番号：６、残基２−２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
本発明は、天然細胞内結合標的等を含む、請求したｐｅｎ−１Ｂポリペプチドに特異的な結合物質、このような物質を同定及び作成する方法、並びに診断、治療及び医薬開発におけるそれらの使用を提供する。例えば、特異的結合物質は、様々な診断及び治療で、特に疾患又は疾患の兆候が例えばＡＰＰプロセシング等のｐｅｎに関わる過程の不適化利用に関係する場合に利用される。新規なｐｅｎ特異的結合物質は、ｐｅｎ特異的レセプター、例えば体細胞性組み換えポリペプチドレセプター様特異抗体又はＴ細胞抗原レセプター（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）及び１−、２重−及び３重−ハイブリッドスクリーニング等のアッセイで同定される他の天然細胞内結合物質、ここに記載されるインビトロ、細胞系及び動物系結合アッセイ等の化学ライブラリのスクリーニングで同定される非天然細胞内結合物質、あるいは当業者に既知の他のものを含む。特に対象とする物質はｐｅｎ機能、例えば、ｐｅｎ依存性Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングを調節し、ドミナントネガティブな欠失突然変異等を含む。従って、本発明はまた、例えば、常在ｐｅｎ、ドミナントネガティブｐｅｎ欠失突然変異体、又はｐｅｎポリヌクレオチド（下記）の調節物質と細胞の接触によって、ｐｅｎ活性の調節段階を含む細胞のＡＰＰプロセシングを調節する方法を提供する。
【００２４】
また、直接的な合成に加えて、対象のポリペプチドは対応する親ポリヌクレオチド、又は縮重オリゴヌクレオチドプライマー及び対象のポリペプチド配列から創出された（“ＧＣＧ”ソフトウェアー、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｉｎｃ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）プローブを用いて単離された天然コード化ポリヌクレオチド、又はコンピューターアルゴリズムに従って対象のポリペプチドを逆翻訳（ｂａｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ）することにより作成される選択された発現系に最適化されたポリヌクレオチド（例えば、Ｈｏｌｌｅｒ等 （１９９３） Ｇｅｎｅ １３６， ３２３−３２８；Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９５） Ｇｅｎｅ １５４， １５０−１６６）などのコード化ポリヌクレオチドから細胞及び無細胞系で発現させることもできる（例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓ Ｌ，等， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９８ Ｏｃｔ；９（５）：５３４−４８）。従って、ポリペプチドは組み換え技術により合成、作成され、或いは細胞から精製されうる。広範な種々の分子及び生物化学の方法が生化学合成、分子発現及び対象組成物の精製に利用可能である。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，等 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ， 等， Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ． Ａｓｓｏｃ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ＮＹ）又は他に当分野で既知のものを参照のこと。
【００２５】
本発明は、開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを提供し、該ポリヌクレオチドは他の化合物、例えば標識又は他のポリヌクレオチド配列と結合されていてもよく（即ち、それらはより大きい配列の部分であってもよい）、合成／非天然配列のものであり、及び／又は単離され、即ちその天然状態で関わる少なくとも幾つかの物質を伴わず、好ましくは得られる分画に存在する全核酸の少なくとも約０．５重量％、より好ましくは約５重量％を構成し、通常、組み換え体は、それらが天然染色体で結合するもの以外のヌクレオチドと結合した非天然配列又は天然配列を含むことを意味する。天然配列を含む組み換えポリヌクレオチドは、末端にこのような配列を含み、天然染色体で結合するもの以外の配列に直接隣接し（即ち連続する）、あるいは１０ｋｂ未満、好ましくは２ｋｂ未満、より好ましくは５００塩基未満、最も好ましくは１００塩基未満の天然隣接領域に隣接し、それは末端にあるか、又は天然染色体で結合するもの以外の配列に直接隣接する。ポリヌクレオチドは、通常ＲＮＡ又はＤＮＡであるため、しばしば他の塩基又はヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドを使用して変化した安定性等を得るのに有利である。更に、ポリヌクレオチド及び核酸という用語は、長さの制限なく、ヌクレオチドのあらゆる重合体を指して互換的に使用される。
【００２６】
本発明はまた、ｐｅｎ、特にｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを包含する。例えば、天然ヒトｐｅｎ−１Ｂポリペプチドをコードする天然ヒト転写物のヌクレオチド配列は、配列番号：２６として示される。ｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、通常、配列番号：２６を含む、配列番号：２６の特定断片を含む、あるいは配列番号：２６と配列類似性を有するポリヌクレオチドを指して使用され、例えばハイブリダーゼーションプローブ及び複製／増幅プライマーとして利用でき、配列番号：２６の少なくとも１２、好ましくは少なくとも２４、より好ましくは少なくとも４８、より好ましくは少なくとも９６及び最も好ましくは少なくとも１８２の連続したヌクレオチドを含む。
ｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、相当する親配列又はその補体との特異的ハイブリダイゼーションに影響を与え；例えば、全てのｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチドは、配列番号：２６又はその補体との特異的ハイブリダイゼーションに影響する。示される特異的ハイブリダイゼーションは、通常のストリンジェンシー条件、例えば３０％のホルムアミド含有５ｘＳＳＰＥ（０．１８ＭのＮａＣｌ、０．０１ＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７．７、０．００１ＭのＥＤＴＡ）バッファーを含む緩衝液で４２℃の温度でのハイブリッド形成、及び４２℃の０．２ｘＳＳＰＥを用いて４２℃で洗浄したときに結合して残留し；好ましくは５０％のホルムアミド含有５ｘＳＳＰＥバッファーを含む緩衝液で４２℃の温度でのハイブリッド形成、及び４２℃の０．２ｘＳＳＰＥバッファーを用いて４２℃で洗浄したときに結合して残留することを必要とする。特異的にハイブリッド形成したポリヌクレオチドは、簡便なゲルベース（ｇｅｌ−ｂａｓｅｄ）アッセイで簡単に同定され；例えば、配列番号２７−３８を含むポリヌクレオチドは、上述の好ましいハイブリダイゼーション条件下で配列番号：２６と特異的にハイブリッド形成することが示される。
【００２７】
表３．条件Ｉ及びＩＩで配列番号：２６の鎖とハイブリッド形成する例示的なｐｅｎ−１Ｂ遺伝子特異的ポリヌクレオチド
対象核酸は、翻訳可能な転写物、ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー、診断用核酸等としての使用；他のｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチド及び遺伝子転写物の存在の検出において並びに更なるｐｅｎ相同体及び構造類似体をコードする核酸の検出又は増幅においての使用を含む広範な種々の用途が見出される。例えば、ｐｅｎコーディングポリヌクレオチドはｐｅｎ発現ベクターで使用することができ、一般に異種プロモーターに作用可能に結合し、及び／又は例えば、発現及びスクリーニングのために、組み換え宿主細胞に、例えばｐｅｎ調節細胞機能に関する疾患の候補薬の効果等の機能研究のために、形質転換動物に組み込まれる。診断では、ｐｅｎハイブリダイゼーションプローブは、臨床及び研究用試料での野生型及び突然変異ｐｅｎ対立遺伝子の同定における使用が見出される。突然変異対立遺伝子は、例えばアルツハイマー病に関するｐｅｎ突然変異のためなどの、高処理臨床診断のための対立遺伝子特異的プローブを作成するのに使用される。治療では、治療用ｐｅｎポリヌクレオチドは、活性ｐｅｎの細胞発現又は細胞内の濃度あるいは有効性を調節するために使用する。
【００２９】
例えば、ｐｅｎポリヌクレオチドは、活性ｐｅｎタンパク質の細胞発現又は細胞内濃度或いは有効性を調節するために使用される。ｐｅｎの抑制性核酸は、典型的にはアンチセンス：開示される天然ｐｅｎ転写配列の補体を含む１本鎖配列である。得られるｐｅｎポリペプチドの発現のアンチセンス調節には、遺伝子調節配列に作用可能に結合するアンチセンス核酸を用いることができる。遺伝子の転写が内在性ｐｅｎコーディングｍＲＮＡへの結合能力のあるアンチセンス転写物を生産するように適応させたプロモーター配列を有するｐｅｎ遺伝子特異的ポリヌクレオチドを含むベクターで細胞に形質移入する。或いは、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡコーディングｐｅｎポリペプチドに結合する１本鎖アンチセンスポリヌクレオチドは、標的タンパク質の発現の実質的な減少を生じる濃度で、宿主内の又は宿主から一時的に単離された標的細胞に投入されうる。ｐｅｎ発現の増強は、相当する遺伝子産物の機能発現を増大させるｐｅｎポリヌクレオチドを標的とする細胞型に導入することにより成される。このようなポリヌクレオチドはｐｅｎ発現ベクター、内在性対立遺伝子の機能発現を促進制御するベクター、あるいは内在性突然変異又は野生型対立遺伝子の対象とする修飾の置換ベクターであり得る。核酸を生細胞に導入するための技術は当分野で既知であり、レトロウィルス系トランスフェクション、ウィルスコートタンパク質−リポソーム媒介トランスフェクション等を含む。
【００３０】
本発明は、転写を含む細胞性機能及び／又はｐｅｎ遺伝子発現の調節が可能なｐｅｎのレベルで活性な薬剤、化合物又は薬剤のリード化合物を同定する効果的な方法を提供する。標識したインビトロリガンド結合アッセイ、免疫アッセイ等を含む転写調節物質又は結合物質のための広範で種々のアッセイを提供する。方法は、リード化合物の化学ライブラリの自動化した対費用効率のよい高処理スクリーニングに従う。同定される試薬は、動物及びヒトの治験のための医薬産業での使用が見出され；例えば、試薬は医薬の開発のための活性の最適化及び毒性の最小化のためのインビトロ及びインビボアッセイで誘導体化され、再スクリーニングされうる。
結合物質の広範で種々のアッセイ、例えば天然ｐｅｎ結合標的とのｐｅｎ相互作用を調節する化合物のスクリーニングもまた提供される。これらのアッセイは、例えば検出又は固着のためのペプチドタグ等の他のポリペプチドとの融合産物の部分であり得るｐｅｎポリペプチドを含む成分の混合物を用いる。アッセイ混合物は、天然細胞内ｐｅｎ結合標的を含む。特定の実施態様では、結合標的はプレセニリン、或いはそのアッセイで簡便に測定可能な対象ｐｅｎポリペプチドに対する結合親和性及び結合活性を好ましくは無償のプレセニリンに匹敵する程度で与える部分である。アッセイ混合物はまた、候補薬物を含む。候補薬は多くの化学分類を包含するが、典型的にそれらは有機化合物；好ましくは小有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範で種々の供給源から得られる。また、様々な他の試薬が混合物中に含まれうる。これらは、塩、緩衝液、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等を含む。
【００３１】
できた混合物は、仮に候補薬物が存在しなければｐｅｎポリペプチドが細胞性結合標的、部分又は関連した結合親和性を有する類似物に特異的に結合するような条件下でインキュベートされる。混合物の成分は、必要な結合を提供する任意の順序で添加することができ、インキュベーションは最適な結合を促進する任意の温度で実施することができる。インキュベーション時間は同様に、最適な結合について選択されるが、高速の、高処理スクリーニングを促進するために最小化される。
インキュベーションの後、ｐｅｎポリペプチドと一以上の結合標的の間の薬剤系結合が、任意の都合のよい方法によって検出される。産物の性質及び他のアッセイ要因に依存する、例えば光学又は電子密度、放射性放出、無放射性エネルギー移動等、あるいは抗体コンジュゲート等を用いた間接的検出による変化を検出するために様々な方法が使用されうる。薬剤存在下での結合親和性に比較した、薬剤不存在下での標的に対するｐｅｎ−１Ｂの結合親和性の差異は、薬剤がｐｅｎ結合標的に対するｐｅｎの結合を調節することを示す。ここで使われる差異は、統計的に有意であり、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも９０％の差異を示す。
次の実験の部分及び実施例は、例示のために提供され、限定するものではない。
【００３２】
実施例、プロトコール及び実験方法
Ｉ．高処理インビトロ蛍光偏光アッセイ
試薬：
ｐｅｎペプチド（サイズ最小化、ローダミン標識；最終濃度＝１−５ｎＭ）
ＰＳポリペプチド（最終濃度＝１００−２００ｎＭ）
緩衝液：１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．６
プロトコール：
１．９０マイクロリットルのｐｅｎペプチド／ＰＳポリペプチド混合物を９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに加える。
２．ウェルにつき１０マイクロリットルの試験化合物を加える。
３．５分振盪し、Ｆｌｕｏｒｏｌｉｔｅ ＦＰＭ−２ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて蛍光偏光の量を５分以内に測定する。
【００３３】
ＩＩ．高次構造センサー−ＥＬＩＳＡフォーマットアッセイ
緩衝液及び溶液の調製：
１．１０Ｘアッセイ緩衝液：
１ＭのＨｅｐｅｓを１００ｍＬ
５ＭのＮａＣｌを３００ｍＬ
１ＭのＭｇＣｌを２０ｍＬ
ＭＱ Ｈ２Ｏを１Ｌまで加える
２．ペプチド／タンパク質のマスターミックス
タンパク質：グルタチオンＳトランスフェラーゼ／γ分泌酵素ポリペプチド融合タンパク質：最終濃度＝１００ｎＭ
ｐｅｎペプチド（サイズ最小化、ビオチン標識；最終濃度＝１ｕＭ）
アッセイ緩衝液及びＨ２Ｏを最終容量になるまで加える：最終緩衝液濃度＝１Ｘ
３．抗体の構成：
抗ＧＳＴ、ウサギ（最終濃度＝１：１００００）
抗ウサギＨＲＰ（最終濃度＝１：１００００）
Ｔ−ＴＢＳを最終容量になるまで加える：最終緩衝液濃度＝１Ｘ
【００３４】
方法：
１．適切なペプチド／タンパク質の組み合わせの５０ｍＬのマスターミックス（上記２参照）を生成する。ＲＴで１時間インキュベートする。
２．Ｐｉｅｒｃｅ社のＳｕｐｅｒ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬で阻害した、９６穴プレートＲｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジン被覆、ホワイトポリスチレンプレート（＃１５１１８Ｂ）の各ウェルに９５ｕＬのマスターミックスを加える。
３．５ｕＬのそれぞれの試験化合物（ストック＝６０ｕＭ）をプレートの各ウェルに移す。
４．ＲＴで１時間プレートをインキュベートする。
５．インキュベートの間に、抗ＧＳＴ抗体と抗ウサギＨＲＰ抗体の混合物（上記３参照）を生成する。氷上で１時間インキュベートする。
６．プレートをＨ２Ｏで３回十分に洗浄する。
７．１００ｕＬの抗体混合物をプレートの各ウェルに加える。
８．ＲＴで１時間インキュベートする。
９．Ｈ２Ｏで３回洗浄する。
１０．Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ基質（ルミノール及び過酸化物を混合）をＨ２Ｏに１：２で希釈し、次いで各ウェルに１００ｕＬ加える。
１１．３−５分撹拌する。化学発光を読み取る。
【００３５】
ＩＩＩ．高処理インビトロ結合アッセイ
Ａ．試薬：
−中性のアビジン：ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ
−阻害緩衝液：ＰＢＳ中５％のＢＳＡ、０．５％のＴｗｅｅｎ；室温で１時間
−アッセイ緩衝液：１００ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．６、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、０．５％のＮＰ−４０、５０ｍＭのｂ−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、プロテアーゼ阻害剤の混合物。
−３３Ｐｐｅｎペプチド１０ｘストック：２００，０００−２５０，０００ｃｐｍの標識したｐｅｎペプチド（Ｂｅｃｋｍａｎ ｃｏｕｎｔｅｒ）を補足した１０−８−１０−６Ｍの「非放射性」ｐｅｎペプチド。スクリーニングの間、４℃のマイクロフリッジにおく。
−プロテアーゼ阻害剤混合物（１０００Ｘ）：１０ｍｇのトリプシン阻害剤（ＢＭＢ＃１０９８９４）、１０ｍｇのアプロチニン（ＢＭＢ＃２３６６２４）、２５ｍｇのベンズアミジン（Ｓｉｇｍａ＃Ｂ−６５０６）、２５ｍｇロイペプチン（ＢＭＢ＃１０１７１２８）、１０ｍｇのＡＰＭＳＦ（ＢＭＢ＃９１７５７５）、及び１０ｍｌのＰＢＳ中２ｍＭのＮａＶＯ３（シグマ＃Ｓ−６５０８）。
−結合ポリペプチド：ＰＢＳ中１０−７−１０−５Ｍのビオチン化ＰＳポリペプチド。
Ｂ．アッセイプレートの調製：
−ウェルにつき１２０μｌのストックＮ−アビジンで一晩、４℃でコートする。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。
−１５０μｌのブロッキングバッファーでブロックする。
−２００μｌのＰＢＳで２回洗浄する。
【００３６】
Ｃ．アッセイ
−４０μｌアッセイ緩衝液／ウェルで添加する。
−１０μｌの化合物又は抽出物を添加する。
−１０μｌの３３Ｐ−ｐｅｎペプチド（２０−２５，０００ｃｐｍ／０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／ウェル＝１０−９−１０−７Ｍの最終濃度）を添加する。
−２５℃で１５分間撹拌する。
−さらに２５℃で４５分間インキュベートする。
−４０μＭのビオチン化ＰＳポリペプチド（アッセイ緩衝液中０．１−１０ｐｍｏｌｅｓ／４０ｕｌ）を添加する。
−室温で１時間インキュベートする。
−２００μＭのＰＢＳで４回洗浄して反応を停止する。
−１５０μＭのシンチレーションカクテルを添加する。
−トップカウントで計測する。
Ｄ．全てのアッセイのコントロール（各プレートに配置する）：
ａ．非特異的結合
ｂ．８０％阻害での溶解（非ビオチニル化ＰＳポリペプチド）
【００３７】
ＩＶ．プレセニリンエンハンサー遺伝子の同定：天然ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２ ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の一部重複性は、ほとんどの組織において、どちらか一方の遺伝子の欠失がプレセニリン機能の一部の損失のみを生じることを意味する。従って、どちらか一方の遺伝子におけるノックアウト突然変異はプレセニリン相互作用遺伝子を同定するために設計される遺伝子スクリーニングに感作された環境を提供する。この推論を用いて、我々はプレセニリンと協力して作用する遺伝子の同定の目的で幾つかの種類の遺伝子を作成した。１つの種類（選別Ａ）はｓｅｌ−１２欠失突然変異にとってホモ接合である虫を突然変異誘発させ（以下ｓｅｌ−１２Δと称する）、ｓｅｌ−１２Δと組み合わせてｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異のものに相当する表現型を作成しエンハンサー突然変異のスクリーニングをする。このようなエンハンサー突然変異を、１）ｈｏｐ−１プレセニリンと唯一相互作用する成分及び２）ｈｏｐ−１及びｓｅｌ−１２プレセニリンの両方と相互作用する成分を共に同定する。内在性のコントロールとして、選別がｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異で見られる表現型を対象とするので、選別Ａは機能喪失ｈｏｐ−１対立遺伝子を生成することが期待される。他の差異は、ｈｏｐ−１単一突然変異の突然変異誘発及びさらに完全なプレセニリンに伴う表現型の増大ついてのスクリーニングをする。
【００３８】
プレセニリンの不足を増大させる所望の突然変異に加えて、これらの選別は、これらの遺伝子産物の欠損がｇｌｐ−１様の生殖不能を生じるので、ｇｌｐ−１シグナル伝達経路の既知の要素における突然変異（例えば、ｇｌｐ−１／Ｎｏｔｃｈレセプター、ｌａｇ−２／ＤＳＬリガンド、ｌａｇ−２／Ｓｕ（Ｈ）ファミリーエフェクター）を同定する。プレセニリンエンハンサーと既知のｇｌｐ−１系の遺伝子における突然変異との間の重要な差異は、前者がｓｅｌ−１２Δを背景としてのみｇｌｐ−１様生殖不能を生じるが、後者は野生型遺伝子の背景（Ａｕｓｔｉｎ， Ｊ． 及び Ｋｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ （１９８７） ５１：５８９−５９９； Ｌａｍｂｉｅ， Ｅ． 及びＫｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １９９１） １１２：２３１−２４０）とｓｅｌ−１２Δの背景を併せもつｇｌｐ−１生殖不能を生じることである。
我々は、エチルメタンスルホン酸を用いたｓｅｌ−１２Δホモ接合株の突然変異誘発の後に約１２８，０００の半数体ゲノムをスクリーニングして選別Ａを手広く実施した。選別は、２７の推定上のｇｌｐ−１対立遺伝子、地図の位置に基づいておそらくｌａｇ−１又はｌａｇ−２対立遺伝子として同定される３の突然変異、及び８のｈｏｐ−１突然変異を含む期待される型の単離を生じた。期待されるように、推定上のｇｌｐ−１、ｌａｇ−１、及びｌａｇ−２突然変異は、野生型及びｓｅｌ−１２Δ遺伝子の両方を背景としたｇｌｐ−１様生殖不能を生じ；従って、これらの突然変異はｓｅｌ−１２＋機能の存在又は不存在に関係なく生殖不能を引き起こす。対照的に、８のｈｏｐ−１突然変異は、ｓｅｌ−１２＋活性の存在下ではなく、不存在下で浸透性ｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じる。
【００３９】
前述に加えて、我々は、マッピング及び相補性試験に基づき、２つの新規なプレセニリン相互作用遺伝子を同定する７つの突然変異体を単離した。これらの突然変異体の４つは、染色体Ｉに位置する遺伝子ｐｅｎ−１を同定し、他の３つは、染色体ＩＩＩに位置する遺伝子ｐｅｎ−２を同定する。これらの遺伝子を用いた我々のその後の研究で：１）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２エンハンサー対立遺伝子は機能喪失突然変異であり；２）ｓｅｌ−１２＋機能の喪失を伴うｐｅｎ−１＋又はｐｅｎ−２＋機能の喪失が、プレセニリン機能の完全な喪失として同一の表現型の結果を有し；３）ｓｅｌ−１２＋を背景としたｐｅｎ−１＋及びｐｅｎ−２＋の喪失は、プレセニリン／Ｎｏｔｃｈ系の機能の一部の喪失を示す表現型を生じ；４）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２はｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の両方と遺伝学的に相互作用し；５）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のオープンリーディングフレームは、無関係の完全な膜タンパク質をコードし；６）ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２関連遺伝子は門の分類をこえて保存されていることが示された。
【００４０】
ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、ｓｅｌ−１２Δをプレセニリン喪失の全体に関わるｌｉｎ−１２／ｇｌｐ−１様表現系まで増強させる。ｓｅｌ−１２Δ突然変異との二重突然変異として、ｐｅｎ−１対立遺伝子及びｐｅｎ−２対立遺伝子はそれぞれ、母性ｓｅｌ−１２＋活性を受けていないｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δの虫に見られるものと同一の表現型の集合を生じる。特に、ｓｅｌ−１２Δとのこれらの各二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ又はｈｏｐ−１Δ単一突然変異、あるいはｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２単一突然変異には見られない３つの共通の異常を共有する。第１に、二重突然変異の３つ全ての集合は、ｇｌｐ−１機能消失突然変異について記載されたもの（Ａｕｓｔｉｎ及びＫｉｍｂｌｅ， １９８７）と同様の生殖細胞増殖により特徴付けられる区別のつかないｇｌｐ−１様生殖不能表現型を示す。第２に、３つ全ての二重突然変異はｌｉｎ−１２／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の欠損を示す共通の細胞運命特性を示す。ｌｉｎ−１２＋活性は、アンカー細胞運命の決定に対して腹側の子宮前駆体に必要であり：ｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異は、正常に腹側子宮前駆体運命をとる細胞が代わりにアンカー細胞になるので、その正常な補体ではなく、２つのアンカー細胞を有する（Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ， Ｉ． 等， Ｃｅｌｌ （１９８３） ３４：４３５−４４４）。ｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−１及びｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−２二重突然変異は、ｓｅｌ−１Δ２；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異がそうであるように、この「２つのアンカー細胞」表現型を示す（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９９）９６：２４９７−２５０２）。第３に、ｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−１及びｓｅｌ−１２Δ；ｐｅｎ−２二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δのように、ｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異に見られる産卵口の欠陥を思わせるめくれた産卵口の表現型を示す。
【００４１】
前記の表現型の比較は、ｐｅｎ−１＋又はｐｅｎ−２＋活性の減少が、ｓｅｌ−１２＋活性の欠損と併せて、ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１によりコードされる２つの重複したプレセニリンを排除する効果に匹敵するプレセニリン系機能の喪失を生じる。
単一のｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、プレセニリン機能の部分的な喪失に関する表現型を与える。単一の突然変異のように、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２の虫は２つの明らかな異常を示す。第１に、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２ホモ接合体（ｐｅｎ−１／＋又はｐｅｎ−２／＋の雌から産まれた）は共に、正常な数の自己子孫の胚を作るが、これらの胚は動物の子宮にとどまり、産まれることはない。従って、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体は産卵欠陥（又はＥｇｌ）があり、表現型はｓｅｌ−１２Δ単一突然変異と共通していた。
【００４２】
第２に、ホモ接合ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体から産まれた胚は孵化しないが、代わりに複数の異常のある発達を停止する。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体から産まれた停止した胚は、非常に類似した異常を見せる。最も著しくは、多くの停止した胚が部分的な咽頭のみを生じ；後部咽頭葉はあるが、前葉はない。前咽頭の欠如は、（前咽頭がないことに関する）Ａｐｈ表現型と呼ばれ、最初ｇｌｐ−１の特定の劣勢対立遺伝子として説明された。ＧＬＰ−１レセプターは前咽頭の形成を誘発する特定のシグナル伝達の現象に必要であり（Ｍｅｌｌｏ， Ｃ． 等， Ｃｅｌｌ （１９９４） ７７：９５−１０６； Ｍｏｓｃｏｖｉｔｚ， Ｉ 等， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （１９９４） １２０：３３２５−３３３８； Ｈｕｔｔｅｒ， Ｈ． 及び Ｓｃｈｎａｂｅｌ， Ｒ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ （１９９４） １２０：２０５１−２０６４）；従って、母性付与型のｇｌｐ−１＋活性の欠如は、Ａｐｈ表現型並びに他の欠損を生じる（Ｐｒｉｅｓｓ， Ｊ． 等．， Ｃｅｌｌ （１９８７） ５：６０１−６１１）。減少したプレセニリン機能とＡｐｈ表現型の関連は、母性ｓｅｌ−１２＋を受けるｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体の分析（母性ｓｅｌ−１２＋機能の欠如に見られる生殖不能をレスキューすること）によってもたらされる。この状況において、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体は、他のｇｌｐ−１様の胚欠陥に加えて、同様にＡｐｈ表現型を表す停止した胚を産む（上掲のＷｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ．）。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のこれらの特性は、ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２の欠損がｓｅｌ−１２又はｈｏｐ−１単一突然変異によって引き起こされるものよりも深刻な表現型を引き起こすので、両方の遺伝子がｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の両方のプレセニリンと協力して作用することを示す。
【００４３】
Ａｐｈ表現型に加えて、ホモ接合ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体により生成される胚は他の異常を表す。通常、胚はほとんど伸長の形跡なしに停止し、胚の皮下組織（角質の下及び裏にある表皮細胞の層）はしばしば他の細胞型を完全に包み込むことができない。同様の表現型がｇｌｐ−１（ｔｓ）突然変異により生成される胚について説明されている。
要約すると、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異は、Ｎｏｔｃｈファミリーレセプターｇｌｐ−１及びｌｉｎ−１２に関与する細胞シグナル伝達欠陥の表れである複数の表現型（Ｅｇｌ、Ａｐｈ及び欠陥のある胚伸長）を共通にもつ。更に、ｓｅｌ−１２Δ、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２との組み合わせは、加えて、より強力なＮｏｔｃｈ系に関連する欠陥（ｇｌｐ−１様生殖不能、２つのアンカー細胞表現型；産卵口の外がえし）を生じる。一体とした遺伝子的及び表現型的証拠は、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２がＮｏｔｃｈレセプター成熟及び／又はプロセシングにおけるプレセニリンを抑止しうる新規な成分であることを示す。
【００４４】
ｐｅｎ−１は、予測される線虫の遺伝子ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１に相当する。ｐｅｎ−１をクローニングするために、我々は、ますます小さな間隔でｐｅｎ−１（ｅｐ１４０）の遺伝子地図を、まず検出可能な遺伝子マーカーを用いて、次いで分子マーカーを用いて［Ｔｃ１トランスポゾンの挿入及び単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）］作成した。ＳＮＰマッピングの最終段階は、その位置を染色体Ｉで５２ＫＢ間隔まで狭くした。線虫のデータベースＡＣＥＤＢに記録されるように（Ｅｅｃｋｍａｎ， Ｆ． 及び Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ．５８３−５９９）、この間隔は全体で７つの予測される遺伝子を含む。これらの１つ、ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）のデータと突然変異の検出に基づいてｐｅｎ−１であると同定された。多くの線虫遺伝子について、ＲＮＡｉは母性及び接合遺伝子活性の両方を乱す（Ｔａｂａｒａ， Ｈ． 等 Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９８）２８２：４３０−４３１）。ｐｅｎ−１の場合には、成体の雌雄同体へのｄｓＲＮＡの注入後の母性活性の破壊は、Ａｐｈ表現型で発生的に停止させた胚の作成によって証明された。期待されるように、この表現型は野生型及びｓｅｌ−１２Δ雌雄同体の両方のＲＮＡｉの後に観察された。何れの背景でもＲＮＡｉはまた、成体期まで成長する多くの明らかな死を免れた子孫を得た。ｓｅｌ−１２Δの背景でのＲＮＡｉの場合には、高い比率のこれらの死を免れた個体は、ｇｌｐ−１様生殖不能を示し、接合ｐｅｎ−１活性の阻害と一致する。意外なことに、野生型のＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１のＲＮＡｉはＧｌｐ生殖不能の子孫を生じるが、ｓｅｌ−１２Δ雌雄同体のｐｅｎ−１ＲＮＡｉによるものよりも非常に低い頻度である。対照的に、ｇｌｐ−１様生殖不能はｐｅｎ−１単一突然変異には見られない。この違いは、ＲＮＡｉが典型的に母性及び接合遺伝子機能を共に混乱させる特性に最も帰因し、従って接合性の致死突然変異に見られるよりもより深刻な表現型を生じうる。
【００４５】
配列分析によって、我々はｓｅｌ−１２エンハンサーとして単離した４つのｐｅｎ−１対立遺伝子がＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１オープンリーディングフレームの単一のヌクレオチド置換を含むことを決定した。著しくこれら４つの独立した由来の領域は、それぞれ同じコドン、Ｔｒｐ１９１のナンセンス突然変異である。これらの対立遺伝子（ｅｐ１４０、ｅｐ１６８、及びｅｐ１７０）は、３番目の塩基ＵＧＧのＵＧＡへの変更であり、４番目（ｅｐ２１６）は２番目の塩基ＵＡＧのＵＧＧへの変化である。これらの領域がＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１のＲＮＡｉに類似したＡｐｈ及びｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じることは、それらが機能減少突然変異であることを示す。
【００４６】
ｐｅｎ−１は複数の膜貫通ドメインで進化的に保存されたタンパク質をコードする。ｐｅｎ−１（ＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１、ＧＩ＃２８１５０３６）オープンリーディングフレームは、スプライシングしたときに３０８アミノ酸のタンパク質をコードする４つのエキソンに分けられる。我々は、部分的なｃＤＮＡ産物の配列分析によって、エキソン２及び３の予定されるスプライシング結合を確認した。ｐｅｎ−１は、以下に詳細に説明されるように様々なヒト、マウス、及びショウジョウバエのタンパク質の予測される構造との類似性を示す。ｐｅｎ−１は、構造予測プログラムＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２によって決定されるように最大７つの膜貫通ドメインまで含みうる、予測される完全な膜タンパク質である。
【００４７】
ｐｅｎ−２は、予測される線虫遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９に相当する。我々は、クローン化遺伝子ｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間の染色体ＩＩＩに遺伝学的に位置づけた。この間隔はおよそ２４０ＫＢのＤＮＡに及び、ＡＣＥＤＢバージョン９に記録されるように（Ｅｅｃｋｍａｎ， Ｆ． 及び Ｄｕｒｂｉｎ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ．５８３−５９９）３１の予測される遺伝子を含む。ｐｅｎ−２はＲＮＡｉデータ及び突然変異検出に基づいてＴ２８Ｄ６．９であると同定された。その間の多くの遺伝子のＲＮＡｉは、Ｔ２８Ｄ６．９がＲＮＡｉによって予測される母性及び接合ｐｅｎ−２表現型が与えられる唯一の候補遺伝子であると同定した。Ｔ２８Ｄ６．９を注入した野生型及びｓｅｌ−１２Δ雌雄同体は、高い割合の発達停止胚を生成し、その多くがＡｐｈである。更に、ｓｅｌ−１２Δ（野生型以外）の虫のＲＮＡｉはｇｌｐ−１様の生殖不能を示す明らかな「死を免れた」子孫を生じる。ｓｅｌ−１２エンハンサーとして単離された３つのｐｅｎ−２対立遺伝子の突然変異検出は、それぞれがＴ２８Ｄ６．９の予測されるオープンリーディングフレームのナンセンス突然変異を含むことを明らかにした。２つの領域（ｅｐ２１９及びｅｐ２２０）は、ＵＧＧからＵＧＡ（ｅｐ２１９）又はＵＡＧ（ｅｐ２２０）に変えてＴｒｐ７４コドンを変化させ、３番目の領域（ｅｐ２２１）はＴｒｐ３６をＵＧＡ停止コドンに変える。これらのナンセンス対立遺伝子は、遺伝子機能を強力に減少させる又は消滅させて、ｓｅｌ−１２Δの増強が野生型ｐｅｎ−２＋活性の喪失に起因することを示す。
【００４８】
ｐｅｎ−２は予測される複数回膜貫通タンパク質をコードする。ｐｅｎ−２（Ｔ２８Ｄ６．９、ＧＩ＃３８７３４１５）オープンリーディングフレームは１０１アミノ酸タンパク質をコードする。ｐｅｎ−２の予測されるエキソン／イントロン構造は、Ｇｅｎｂａｎｋにある公にされていない全長ｃＤＮＡ（ｙｋ５６９ｈ５ ＧＩ＃５５７２３２５及び５５５８５５７）の配列により確かめられた。ｐｅｎ−２は、以下に詳細に説明されるように、様々なヒト、マウス、ラット、及びショウジョウバエのタンパク質の予測される構造と高いレベルの類似性を示す。ｐｅｎ−２は、構造予測プログラムＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２により決定されるように、２つの見込みの膜貫通ドメインを含む、予測される完全な膜タンパク質である。
それら独自の特定の表現型及びｓｅｌ−１２とのそれらの相互作用を含む、幾つかの推定に基づき、ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２はおそらくプレセニリンと相互作用する産物をコードする。引いては、ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２、ｓｅｌ−１２、又はｈｏｐ−１と共通の特性を有する他の遺伝子を、潜在的なプレセニリン相互作用遺伝子とみなすことができる。我々は、１）ａｐｈ−２＋機能の欠損と関連する特定の表現型及び２）ａｐｈ−２とｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１との、及びｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２との新規な遺伝学的相互作用の我々による同定に基づいて、ａｐｈ−２遺伝子をプレセニリン相互作用遺伝子と同定した。
【００４９】
ａｐｈ−２遺伝子は、Ｃ． Ｇｏｕｔｔｅ等 （１９９５ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｍ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ａｂｓｔｒａｃｔ ３９； １９９８ Ｅａｓｔ Ｃｏａｓｔ Ｗｏｒｍ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ａｂｓｔｒａｃｔ １５１； Ｗｏｒｍ Ｂｒｅｅｄｅｒ’ｓ Ｇａｚｅｔｔｅ １２（５）：２７（１９９３）； Ｗｏｒｍ Ｂｒｅｅｄｅｒ Ｇａｚｅｔｔｅ １３（ｄ）：８３（１９９４））によって線虫胚のｇｌｐ−１媒介性シグナル伝達の可能性のある成分として同定された。これらの研究者により特徴付けられたａｐｈ−２突然変異は、未報告の接合表現型を有するが、Ａｐｈ表現型を含みｇｌｐ−１（ｔｓ）胚の欠陥と著しく類似する母性胚欠陥を有する。ａｐｈ−２は、報告によれば、予測される遺伝子ＺＣ４３４．６に相当する。予測されるａｐｈ−２タンパク質は、７２１アミノ酸長であり、ＰＳＯＲＴ２（Ｎａｋａｉ Ｋ．， 及びＨｏｒｔｏｎ Ｐ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ， １９９９， ２４：３４−６）及びＴｏｐＰｒｅｄ２（Ｃｌａｒｏｓ ＭＧ， 及びｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ Ｇ． Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ １９９４ Ｄｅｃ； １０（６）：６８５−６）により予測されるようなシグナル配列及び１〜３の膜貫通ドメインによって特徴づけられる。
【００５０】
ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２を同定するスクリーニングはａｐｈ−２の突然変異を引き起こさなかった。このスクリーニングの高いストリンジェンシーにより失敗しうる潜在的なプレセニリン／ａｐｈ−２相互作用を同定するために、我々はプレセニリン欠損にさらに高度に感作させる様々な遺伝学的背景を調べた。これらの実験について、入手可能なａｐｈ−２突然変異体が不足していたことにより、我々は、選択される背景のａｐｈ−２＋機能を減少させるＲＮＡｉを用いた。野生型雌雄同体の生殖細胞系へのａｐｈ−２ ｄｓＲＮＡの注入は、子孫に高く浸透した胚の致死率、並びにＡｐｈ表現型を示す多くの停止した胚をもたらす。しかしながら、注入した雌雄同体はさらに、体細胞組織の表現型の異常のない成体に成長する相当な割合の生存能力のある子孫を産む。それらの多くが発達停止Ａｐｈ胚を産むので、これらの虫は「一時的に死を免れたもの」とみなすことができる。従って、我々は成体の雌雄同体にａｐｈ−２ＲＮＡを注入し、プレセニリン依存表現型の一時的な死を免れた子孫を調べた。これらの調査の結果を表４にまとめる。
【００５１】
表４ ａｐｈ−２ＲＮＡｉによるプレセニリン及びｐｅｎ遺伝子表現型（導入遺伝子の死を免れた子孫の表現型）の増大
２ ホモ接合又はヘテロ接合系統からの雌雄同体はａｐｈ−２ｄｓＲＮＡを注入した。
全ての遺伝子型は、発達停止したＡｐｈ−２胚、並びに一部の生存する死を免れた子孫を分離した。ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）が死を免れた子孫のうち接合Ｇｌｐ−１様生殖不能を生じる遺伝子型について、Ｇｌｐ生殖不能の虫の概算の割合を示す。
【００５２】
ホモ接合ｓｅｌ−１２Δを背景とするＡｐｈ−２ＲＮＡｉは、より深刻なプレセニリン表現型にｓｅｌ−１２を目立って増強しない。しかしながら、有意な増強は、ｈｏｐ−１ナンセンス突然変異（ｈｏｐ−１（ｅｐ１６８）／＋）にとってもホモ接合であるホモ接合ｓｅｌ−１２Δの虫で検出される。ａｐｈ−２ＲＮＡｉに併せて、約１２％のｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１（ｅｐ１６８）／＋の動物はｇｌｐ−１様生殖不能を示し、ａｐｈ−２のない状態でこの遺伝子型には何も見られない。更に、ａｐｈ−２ＲＮＡｉの増強は、ｓｅｌ−１２Δで相互作用が見られないので、両方のプレセニリンの複合した減少に依存する。
ａｐｈ−２との更なる相互作用は、異常なｈｏｐ−１対立遺伝子、ｅｐ１７１で観察される。この対立遺伝子は、ヒトＰＳ１のＡｓｐ３８５残基（ＴＭドメイン８に位置する）に相当する保存されたアスパラギン酸残基でＤからＮへのミスセンス変異をもたらす。ＰＳ１Ａｓｐ２８５Ａｌａ突然変異は、ＰＳ１機能の喪失を生じ、ＰＳ＋発現でのドミナントネガティブは効果もまた有する（Ｗｏｌｆｅ， Ｍ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ３９８：５１３−５１７）。ＰＳ１ Ｄ３８５Ａ変異のように、ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）は野生型のプレセニリン活性を持たず；ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）二重突然変異は、ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δに類似するｇｌｐ−１様の生殖不能欠陥を有する。ｓｅｌ−１２＋の背景において、ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）は非常に低い浸透度（＜１％）のｇｌｐ−１様生殖不能表現型を生じ、ｓｅｌ−１２プレセニリン機能又は発現でのドミナントネガティブな効果を有するはずであると示唆する。我々は、ホモ接合ｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）雌雄同体ａｐｈ−２のＲＮＡｉが高い浸透度のｇｌｐ−１様生殖不能（＞５０％の生存子孫）を生じることを発見し、減少したａｐｈ−２＋機能及びｈｏｐ−１（ｅｐ１７１）ドミナントの効果の間に強い付加的な相互作用が示唆される。
【００５３】
最後に、我々はまた、ａｐｈ−２ＲＮＡｉがｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２突然変異表現型を強力に促進することを観察した。ヘテロ接合系統から分離するホモ接合成体ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２雌雄同体は、正常にみえる生殖系列を有し、ｇｌｐ−１様生殖不能が見られない。対照的に、相当するｐｅｎ−１；ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）及びｐｅｎ−２；ａｐｈ−２（ＲＮＡｉ）雌雄同体は高い浸透度（＞５０％の生存ｐｅｎ−１又はｐｅｎ−２雌雄同体の子孫）でｇｌｐ−１様生殖不能を示す。これらの観察は、部分的に減少したプレセニリン系活性の様々な遺伝学的背景が、ａｐｈ−２活性のＲＮＡｉ媒介減少によるより強い表現型に増強することが可能であることを示唆する。データは、プレセニリン及びｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２とａｐｈ−２の機能的相互作用を示す。
ＡＰＨ−２の構造及びＡＰＨ−２はヒト及びハエのタンパク質に関連する。ＡＰＨ−２は、ＰＳＯＲＴ２で予測される切断可能なシグナル配列及びＰＳＯＲＴ２及びＴｏｐＰｒｅｄ２により予測される１〜３の膜貫通ドメインを含む。ＡＰＨ−２は、ほぼ全長のｃＤＮＡ ＫＩＡＡ０２５３によりコードされる予測のヒトタンパク質とアミノ酸配列において１８％の同一性である（Ｎａｇａｓｅ， Ｔ． 等 ＤＮＡ ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９６）３：３２１−３２９）。更に、ＡＰＨ−２は、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ社で作成されたコンティグ化されたＥＳＴｓから予測されるショウジョウバエのタンパク質に対して同様のレベルの同一性を示す。ヒト及びショウジョウバエのＡＰＨ−２関連タンパク質は３０％同一であり、３つのタンパク質のＣｌｕｓｔａｌアラインメントは各タンパク質の完全長にわたる保存を示す。
【００５４】
方法：ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）。特定の遺伝子のＲＮＡｉは、一般にＰＣＲ増幅遺伝子ＤＮＡ断片の鋳型から調製されたｄｓＲＮＡを用いてなされた。ＰＣＲプライマーの５’末端はＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモータ配列を含み、３’領域は、標的とする遺伝子の一以上のエキソンをそれらが増幅するように作成された。ＰＣＲ反応は、５０ｍｌ反応で０．５ｍｇの野生型ゲノムと５ｍモルの各プライマーを用い、拡張キット（Ｅｘｐａｎｄ ｋｉｔ）（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｕｍｍｅｒｖｉｌｌｅ， ＮＪ）を使用して製造業者のプロトコールに従って為された。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９５℃で３０秒間の初期変性、続いて３５サイクルの９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で１分間、最終伸長７２℃で３分間。増幅したＤＮＡは、エタノール沈殿させ、２０ｍｌのＲＮＡｓｅを含まない水に再懸濁した。ＰＣＲ産物の部分を、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に従ってＴ７ポリメラーゼ関連インビトロ転写反応の鋳型として使用した。反応物をエタノールで懸濁し、ＲＮＡを２０ｍｌのＲＮＡｓｅを含まない水と１０ｍｌの３Ｘ ＩＭ緩衝液（２０ｍＭのＫＰＯ４ ｐＨ７．５、３ｍＭのＫ＋クエン酸塩 ｐＨ７．５、２％のＰＥＧ６０００）に再懸濁した。相補的なセンス及びアンチセンスＲＮＡｓを６８℃で１０分間のインキュベーション、続いて３７℃で３０分間インキュベーションによりアニールし、次いで０．４５ｕｍのセルロースアセテートフィルターをとおして遠心分離した。ＲＮＡの微量注入は、Ｌ４又は若い成体期の雌雄同体を用いての記載（Ｆｉｒｅ等， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（１９９１）１１３：５０３−５１４）のようにして行った。注入した虫をＭ９バッファー（リットル当たり：３０ｇのＮａ２ＨＰＯ４、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ、５ｇのＮＨ４Ｃｌ）に１０−３０分間回収し、個々のプレートに移し、次いで毎日新しいプレートに移した。注入した雌雄同体の第１世代の自己子孫は、ノマルスキー微分干渉顕微鏡を備えた複合顕微鏡又は解剖顕微鏡で観察することによりＲＮＡｉ誘発の表現型を調べた。
【００５５】
使用される線虫の系統。線虫を処理及び培養する方法は記載がある（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９７４）７７： ７１−９４）。線虫のバリエーション、Ｂｒｉｓｔｏｌ系統Ｎ２は野生型を示し、ここで使用されるほとんどの突然変異株と大部分がアイソジェニックである。遺伝子地図作成及び特徴付けに使用された特定の突然変異は：ＬＧＩ−ｕｎｃ７４（ｘ１９）、ｄｐｙ−５（ｅ６１）、ｕｎｃ−２９（ｅ１０７２）、ｆｏｇ−３（ｑ４４３）、ｄｐｙ−２４（ｓ７１）。ＬＧＩＩＩ−ｄｐｙ−１９（ｅ１２５９ｔｓ）、ｕｎｃ−１１９（ｅ２４９８）、ｐｈａ−１（ｅ２１２３）、ｄｐｙ−１８（ｎ４９９又はｅ３６４）ＬＧＩＶ−ｈｉｍ−８（ｅ１４８９）、ＬＧＸ ｌｏｎ−２（ｅ６７８）を含んでいた。全ては線虫ＩＩで説明される。ｓｅｌ−１２又はｈｏｐ−１コード領域の大部分又は部分を除去する欠失突然変異は、以下に説明される。ｓｅｌ−１２遺伝子は伴性であり、ｓｅｌ−１２突然変異は交配欠陥があるので、系統の間のｓｅｌ−１２Δの移動は、通常、相補的なｓｅｌ−１２＋対立遺伝子をもつ染色体増幅ｍｎＤｐ６６（Ｘ；Ｉ）を持つ雄を用いて成された。
【００５６】
ＤＨＰＬＣによるＳＮＰスクリーニング：候補ＳＮＰｓをＣＢ４８５６及びＮ２ゲノムＤＮＡから分離して増幅した。ＰＣＲ産物を混合、変性及び再アニールして、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）によるスクリーニングのためのヘテロ接合分子を作成した。各ＳＮＰを同一の分離勾配を用いて５つの異なる温度でスクリーニングした。ＳＮＰを、ヘテロ二本鎖がヘテロ接合状態で検出されるが、ホモ接合の初期の系統では検出されない場合に信頼できる結果とした。各ＳＮＰの適切な温度を記録し、組み換えした虫のＳＮＰをスクリーニングするために使用した。
組み換えした虫のＳＮＰスコアリング：適切な組み換え体からのライセートをＰＣＲによりＳＮＰｓを増幅するためのゲノムＤＮＡ鋳型として用いた。次いで、これらの粗製のＰＣＲ産物を、先に決定した各ＳＮＰの適した温度を用いてＤＨＰＬＣを実施した。各組み換え体について、各ＳＮＰをタイプし、無作為に表計算シートに入力した。次いでＳＮＰｓの物理的次数をＡｃｅＤＢから決定した。これは各組み換え体のハプロタイプを作り、組み換えが生じる位置を意味した。
【００５７】
ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１突然変異株の単離及び特徴付け。ｓｅｌ−１２及びｈｏｐ−１の欠失対立遺伝子を、Ｐｌａｓｔｅｒｋの２段階法（Ｐｌａｓｔｅｒｋ， Ｒ． Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ： Ｍｏｄｅｒｎ ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ （１９９５） ｐｐ． ５９−８０）によってＴｃ１トランスポゾン変異誘発活性源としてｍｕｔ−２を用いて得た。ｓｅｌ−１２（ｅｐ６）（以下ｓｅｌ−１２Δと称する）はｓｅｌ−１２オープンリーディングフレームのアミノ酸３４から４４１がなくなる欠失突然変異である。ｈｏｐ−１（ｅｐ９０）（以下ｈｏｐ−１と称する）は、ｈｏｐ−１オープンリーディングフレームのアミノ酸２１６で始まり、遺伝子の３’非翻訳領域で終結する７２２ｂｐの欠失である。ｓｅｌ−１２Δ及びｈｏｐ−１Δ単一突然変異を、表現型の特徴付け及び二重突然変異の構築の前に少なくとも１０回、野生型（上掲の線虫のバリエーション．Ｂｒｉｓｔｏｌ系統Ｎ２）に戻し勾配した。ｓｅｌ−１２Δ単一突然変異は、前記したｓｅｌ−１２（ｌｆ）突然変異のものと同様の産卵欠陥表現型を有する（Ｌａｖｉｔａｎ， Ｄ． 及び Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ， Ｉ． Ｎａｔｕｒｅ （１９９５）３７７：３５１−３５４）。ｈｏｐ−１Δ突然変異は、他で記載される（Ｗｅｓｔｌｕｎｄ， Ｂ． 等 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ （１９９９） ９６：２４９７−２５０２）ｈｏｐ−１欠失対立遺伝子と同様に、肉眼的な表現型の異常はない。
母性ｓｅｌ−１２＋活性を欠くｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ二重突然変異源を与えるために、我々は、平衡にしたｓｅｌ−１２Δ／ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ＋／＋ｕｎｃ−７４系統を構築した。この系統は、ｇｌｐ−１（ｌｆ）突然変異の特性をもつ生殖系統増殖欠陥を有する完全な浸透度の生殖不能表現型を示す二重突然変異ｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δ雌雄同体を分離する（Ａｕｓｔｉｎ， Ｊ． 及び Ｋｉｍｂｌｅ， Ｊ．， Ｃｅｌｌ （１９８７）５１：５８９−５９９）。更に、これらの虫は十分な浸透度の２つのアンカー細胞表現型及びｌｉｎ−１２（ｌｆ）突然変異により引き起こされる産卵口欠陥を思わせるめくれた産卵口表現型を有する。
【００５８】
ｓｅｌ−１２Δのエンハンサーの単離。ｐｅｎ−１及びｐｅｎ−２のエンハンサー対立遺伝子は、ホモ接合ｓｅｌ−１２Δ系統、又は後の実験においてｓｅｌ−１２Δ；ｕｎｃ−７４（ｘ１９）系統（ｕｎｃ−７４突然変異は染色体Ｉ上のｈｏｐ−１の近くにあり、組み込みの（ｂｕｉｌｔ−ｉｎ）地図作成の材料を提供する）の突然変異誘発の後に得られる。何れの遺伝子型のＸＸ雌雄同体も、記載されるように（Ｂｒｅｎｎｅｒ， Ｓ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９７４） ７７：７１−９４）エチルメタンスルホン酸で突然変異誘発し、１（又は時には２）の雌雄同体を個々の生育プレート（全部で約５５，０００プレート）につまみ出した。３から５日後、プレートを生殖系統増殖の欠陥を示す「暗い」外観を有する生殖不能Ｆ２子孫の外観について選別した。次いで候補生殖不能突然変異をｓｅｌ−１２Δ；ｈｏｐ−１Δの虫と同様のｇｌｐ−１様生殖不能を示すものを同定するノマルスキー微分干渉顕微鏡により選別した。
【００５９】
この方法で決定した４４の候補の集団を、これらの突然変異の生殖不能表現型がｓｅｌ−１２エンハンサーに予想されるような虫のｓｅｌ−１２表現型に依存するかどうかを決定するために設計された交配計画を実施した。この試験のために、各候補をｄｐｙ−１９ＩＩＩ；ｈｉｍ−８；ｌｏｎ−２の雄に交配させ、生じた交配子孫を個々のプレートにつまみ出した。次の世代において、ｌｏｎ−２／ｌｏｎ−２子孫（組み換えのないｓｅｌ−１２＋／ｓｅｌ−１２＋である）の存在は、生殖不能表現型がｓｅｌ−１２＋活性の欠損に依存しない、あるいは既知のｇｌｐ−１系遺伝子（ｇｌｐ−１、ｌａｇ−１、ｌａｇ−２）のものの突然変異が原因であることを示唆する。この方法で分析された２９の候補はｓｅｌ−１２非依存性であり、従って、おそらくプレセニリンエンハンサーとしては拒否された。２９の拒否候補の２６について、生殖不能を引き起こす突然変異はトランスでｄｐｙ−１９に分離され、ｇｌｐ−１対立遺伝子に予測される作用である。これらのＬＧＩＩＩ突然変異の９つは、既知のｇｌｐ−１対立遺伝子の生殖不能表現型を補足することができず；他の１７ＬＧＩＩＩ突然変異は試験しなかった。
残りの１５の候補について、Ｇｌｐ生殖不能表現型はＦ２世代には見られず、結果は、ｓｅｌ−１２との相互作用を母性ｓｅｌ−１２＋活性によりレスキューするエンハンサー突然変異の存在と一致する。この解釈は、個々のプレートのＦ２世代のｓｅｌ−１２／ｓｅｌ−１２の虫を選び出し、次世代のｇｌｐ−１様生殖不能の再出現についてそれらの子孫を調べることにより試験された。これは、残り１５の候補のそれぞれについて得た結果であった。相補性試験の組み合わせ、減数分裂マッピング、突然変異体対立遺伝子の配列分析によって、各候補はｈｏｐ−１（８候補）或いは２つの新しく同定された遺伝子、ｐｅｎ−１（４候補）又はｐｅｎ−２（３候補）の何れかの突然変異を持つことが示された。
【００６０】
ｐｅｎ−１のマッピング、特徴付け、クローニング、及びコンピュータ分析：ｐｅｎ−１の遺伝子地図の作成を、ｓｅｌ−１２Δの背景において行い、二重突然変異ｐｅｎ−１；ｓｅｌ−１２Δの虫のｇｌｐ−１様生殖不能表現型を基にした。我々は、初めに染色体Ｉのｕｎｃ−２９及びｄｐｙ−２４の間にｐｅｎ−１（ｅｐ１４０）を位置づけた。更に可視マーカーでのマッピングはｕｎｃ−２９及びｆｏｇ−３の間、１．１ＭＢの間隔に位置を狭めた。遺伝子型ｐｅｎ−１の雌雄同体／ｕｎｃ−２９ｆｏｇ−３トランス雌雄同体から、１６／２０Ｕｎｃ−２９ｎｏｎ−Ｆｏｇ−３組み換え及び１／４Ｆｏｇ−３ｎｏｎ−Ｕｎｃ−２９組み換えはｐｅｎ−１を分離した。
【００６１】
ｐｅｎ−１突然変異が誘導されるＮ２ Ｂｒｉｓｔｏｌ系統と、線虫の系統ＣＢ４８５６ Ｈａｗａｉｉａｎ系統の間で多形であるＳＮＰマーカーを用いて更に細かいマッピングを行った。ゲノム配列決定センター（セントルイス、ＭＯ）は、多数のＣＢ４８５６の潜在的なＳＮＰｓを同定した（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｇｓｃ／ＣＥｐｏｌｙｍｏｒｐｈ／ｓｎｐ．ｓｈｔｍｌ）。ｕｎｃ−２９からｆｏｇ−３間のこれらの潜在的な４つのＳＮＰｓは、ＨＰＬＣを変性させることによりヘテロ二本鎖ＰＣＲ産物の分離に基づくＳＮＰ遺伝子型同定アッセイで試験することにより確認された（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌ ＰＡ， 等， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １９９７ Ｏｃｔ； ７（１０）：９９６−１００５）。これらＳＮＰｓに対する初期マッピングは、遺伝子型ｕｎｃ−２９ ｐｅｎ−１／ＣＢ４８５６又はｐｅｎ−１ ｄｐｙ−２４／ＣＢ４９５６の雌雄同体の構築、及びＵｎｃ−２９ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１又はＤｐｙ−２４ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体の選択により為された。さらなるｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体はｕｎｃ−２９ ｐｅｎ−１ ｆｏｇ−３／ＣＢ４８５６ヘテロ接合体から単離された。５０のＵｎｃ−２９ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体のうちの９つは、Ｃ３１Ｈ５ ＳＮＰの右に生じ、ｐｅｎ−１をこのマーカーの右に位置させる交差を有していた。４５のＤｐｙ−２４ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１又はＦｏｇ−３ ｎｏｎ−Ｐｅｎ−１組み換え体のうちの４つは、Ｆ１４Ｂ４ ＳＮＰの左に交差を有して、ｐｅｎ−１をこのマーカーの左に位置させていた。複合したデータは、Ｃ３１Ｈ５とＦ１４Ｂ４ ＳＮＰｓの区間、〜２４０ＫＢの間にｐｅｎ−１を位置づけた。
【００６２】
同様の間隔にｐｅｎ−１をマッピングするために、Ｃ４５Ｇ３からＦ１４Ｂ４の間にある更なるＳＮＰｓをＤＮＡ配列決定により同定した。間にあるＤＮＡの約２ＫＢの６つのセグメントをＮ２及びＣＢ４８５６ゲノムＤＮＡ及び配列決定された末端のＰＣＲにより増幅した。場合によっては、更なる配列決定プライマーは開始配列を作成するのに使用された。Ｎ２とＣＢ４８５６の間のＳＮＰｓを配列アラインメントにより同定し、〜２００ｂｐのＰＣＲ産物をそれぞれ質のよい候補の周りに作成した。これらの２００ｂｐの産物をスクリーニングし、上記のようにＤＨＰＬＣにより記録した。この分析はｐｅｎ−１を２つのＳＮＰｓ、一方がコスミドＣ４５Ｇ３と他方がコスミドＦ３６Ｈ２の間に位置づけ、相互に約５２ＫＢのところにある。
【００６３】
突然変異の検出。２つの一本鎖ヌクレオチド多形（ＳＮＰｓ）、標識したＣ４５Ｇ３Ａ及びＦ３６Ｈ２Ａは、７つの予測される候補遺伝子が存在する５２ｋｂのゲノム間隔、ｐｅｎ−１を決定した。この５２ｋｂの間隔の３０ｋｂ遺伝子の多い部分が、この領域に遺伝学的に位置づけされる突然変異を有する３つの虫、ｅｐ１４０、ｅｐ１６９、及びｅｐ１７０で示された。全てのＤＮＡ配列決定反応をＢｉｇＤｙｅ配列決定試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ． Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）の標準的なプロトコールを用いて実施し、産物をＡＢＩ３７７ＤＮＡ配列を用いて分析した。
ＡＢＩ３７７ＤＮＡ配列から得られたトレースデータを分析し、Ｐｈｒｅｄ−Ｐｈｒａｐプログラム（Ｇｏｒｄｏｎ， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． （１９９８）８：１９５−２０２）を用いてコンティグに構築した。次いで再配列のデータを野生型の系統、Ｎ２と多形性について比較した。この分析は、第３位の塩基の変化、ＧからＡを３つのｐｅｎ−１対立遺伝子、トリプトファン（Ｗ）から停止（＊）までアミノ酸変化を生じるｅｐ１４０、ｅｐ１６９及びｅｐ１７０のＶＦ３６Ｈ２Ｌ．１遺伝子（ＧＩ＃２８１５０３６）の１９１ＡＡで同定した。マッピングされていない突然変異体の更なる配列分析は、同じコドンの虫ｅｐ２１６の他の突然変異を明らかにするが、第２の部分ではＧからＡもまた、同じアミノ酸変化となる。ヒトｐｅｎ−１の分析により新規なｐｅｎ−１Ｂタンパク質を同定することができた。
【００６４】
ｐｅｎ−２のマッピング、特徴付け、クローニング、及びコンピュータ分析。我々は、初めにｐｅｎ−２（ｅｐ２２０）を染色体ＩＩＩのｕｎｃ−２５の左に位置づけた。遺伝子型ｐｅｎ−２／ｄｐｙ−１８ ｕｎｃ−２５の雌雄同体から、４／４ ｎｏｎ−Ｄｐｙ−１８ Ｕｎｃ−２５組み換え体はｐｅｎ−２を分離し、０／２１ Ｄｐｙ−１８ ｎｏｎ−Ｕｎｃ−２５組み換え体はｐｅｎ−２を分離した。７０のｄｐｙ−１８ ｕｎｃ−２５ホモ接合体が同一のヘテロ接合雌雄同体、２つのみの分離されたｐｅｎ−２から選択され、ｐｅｎ−２がｄｐｙ−１８の比較的近区にあり、或いはこの遺伝子の左にあることが示唆される。
ｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間にｐｅｎ−１を位置づけする更なるマッピング：ｐｅｎ−１／ｐｈａ−１ ｄｐｙ１９；ｓｅｌ−１２Δ雌雄同体から、１／１４ｎｏｎ−Ｐｈａ−１ Ｄｐｙ−１組み換え体はｐｅｎ−２を選択した。これらのデータは、ｐｅｎ−２をｐｈａ−１及びｄｐｙ−１８の間、約２４０ＫＢの間に位置づけ、ｐｅｎ−２がｄｐｙ−１８の近くにあることを示唆した。
【００６５】
予測遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９としてのｐｅｎ−２の同定：我々は、１）ｐｈａ−１からｐｄｙ−１８の間の予測遺伝子のＲＮＡｉ及び２）突然変異検出に基づいて、ｐｅｎ−２が予測遺伝子Ｔ２８Ｄ６．９（ＧＩ＃３８７３４１５）であることを決定した。その間の３１の遺伝子の２８について、Ｔ７プロモータ配列を付随するプライマーを、上記されるような鋳型として第一鎖ｃＤＮＡプール又はゲノムＤＮＡの何れかを用いた選択されるコーディング領域の増幅に使用した。２本鎖ＲＮＡを各ＰＣＲ産物から合成し、ｓｅｌ−１２Δホモ接合体に注入した。Ｔ２８Ｄ６．９のＲＮＡｉは注入した虫の子孫のうち予期されるｐｅｎ−２表現型を作り、ｓｅｌ−１２Δの虫のｇｌｐ−１様生殖不能、並びにＮ２及びｓｅｌ−１２Δの虫への注入の後のＡｐｈ胚停止表現型を含む。Ｔ２８Ｄ６．９オープンリーディングフレームの突然変異検出は、３つのｐｅｎ−２対立遺伝子（ｅｐ２１９、ｅｐ２２０、ｅｐ２２１）のそれぞれでナンセンス突然変異を同定した。概略すると、このグループ、ｅｐ２２０の単一突然変異をｅｐ２２０ライセート及び野生型系統で増幅したＰＣＲ産物を配列決定することにより試験した。この分析は、トリプトファン（Ｗ）から停止（＊）で生じた７４ＡＡのＧからＡへの突然変異を同定した。位置づけされない突然変異の更なる配列分析は、このグループに２以上の突然変異があることを明らかにした。ｅｐ２１９の虫はＷから＊を作る７４ＡＡの３番目の位置にＧからＡへの変異を有する。ｅｐ２２１の虫は３６ＡＡの停止コドンにも生じる他のＷでＧからＡへの変異を有する。これら３つの変異は全て、Ｔ２８ｄ６．９遺伝子の機能を有意に変化させ又は除去することができる、高度に保存されたトリプトファンに影響する。
【００６６】
Ｖ．細胞を利用したレポーターアッセイ
我々は、Ｇａｌ４ＶＰ１６転写活性化タンパク質に融合するＡＰＰのＣ末端の９９アミノ酸を持つレポーター構造を利用した細胞培地γ分泌酵素アッセイを開発した。Ｇａｌ４部分は、プレセニリン依存切断がそれを遊離して核に移動させ、ＵＡＳルシフェラーゼレポーター導入遺伝子の転写を活性化するまで、ＡＰＰ膜貫通ドメインによって細胞表面に維持される。アッセイ確証実験において、既知のγ分泌酵素阻害剤はレポーター遺伝子活性を完全に阻止し、既知のドミナントネガティブプレセニリン突然変異はまた、レポーター活性を阻害した。概念的に類似したアッセイは、以前、ＵＡＳβガラクトシダーゼ導入遺伝子レポーターを用いたインビボのショウジョウバエでの研究が示されている。βガラクトシダーゼレポーター遺伝活性、従ってさらにγ分泌酵素様プロテアーゼ活性は、このインビボアッセイにおけるプレセニリンの存在に完全に依存していることが示されている。
【００６７】
我々のデータは、ｐｅｎ−１、ｐｅｎ−２、ａｐｈ−２又はプレセニリンの阻害が定常状態のプレセニリンタンパク質レベルの強力な減少、及びγ分泌酵素活性の相関した減少を生じることを示す。ｐｅｎ−１又はａｐｈ−２阻害の効果は等しい強さであり、ｐｅｎ−２はγ分泌酵素活性の減少及びプレセニリンタンパク質減少の両方に関してほぼ同等の強さが、そのプレセニリン阻害である。プレセニリン減少は、ショウジョウバエ及びヒト細胞システムを含む複数の細胞を利用したシステムにおいて、ＲＮＡｉ、開示されるスクリーニングで同定される複素環式化合物、及び細胞内発現抗体を含む幾つかの阻害剤を用いて立証される。これらのデータは、ｐｅｎ遺伝子及びプレセニリンの機能的相互作用についてのアッセイを提供する。従って、本発明は、プレセニリンとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）ポリペプチドの機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するための、プレセニリンとｐｅｎポリペプチドの機能的相互作用を与えるシステムに予測されるストレスを導入することによる方法を提供し、よってシステムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を与え、ストレスのない状態で、システムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を与え；システム内のプレセニリンの量の変化としてプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出し、量はプレセニリンＮ又はＣ末端断片（ＮＴＦｓ）プレセニリンホロタンパク質の量、又はその割合として表されてもよく、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異は、ストレスがプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示す。
【００６８】
この明細書において引用した全ての刊行物及び特許出願は、各刊行物もしくは特許出願が特にまた個々に出典明示により取込むことが示されているかのごとく、出典明示によりここに取込む。上述した発明は、理解を明瞭にする目的で、例証及び実施例によりある程度の詳細さをもって記載したが、特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱しない限りそれに所定の変化と変更を加えても良いことは本発明の教唆から当業者にとって明らかであろう。
Claims (42)
- Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）ポリペプチドの機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するための方法であって、
Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの機能的相互作用を提供するシステムに所定のストレスを導入し、それによって、システムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムはＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を提供し；及び
Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出して、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異によって、ストレスがＮｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示すことを含み、
システムは：（ｉ）ｐｅｎポリペプチド発現が非天然又は病原性であると決定されるｐｅｎポリペプチドを発現する生細胞、及び（ｉｉ）規定量のｐｅｎポリペプチドを含有するインビトロ無細胞混合物からなる群から選択され、
ｐｅｎポリペプチドは、ヒト、ラット、マウス、キイロショウジョウバエ、及び線虫のｐｅｎ−２；ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ及び線虫のｐｅｎ−１；及びヒトのｐｅｎ−１Ｂからなる群から選択されるｐｅｎポリペプチドと配列類似性を有し、類似性が少なくとも２０％同一性である方法。 - ＡＰＰプロセシングとプレセニリン（ｐｅｎ）ポリペプチドのエンハンサーの機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するための方法であって、
ＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの機能的相互作用を提供するシステムに所定のストレスを導入し、それによって、システムはＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムはＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を提供し；及び
ＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出して、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異によって、ストレスがＡＰＰプロセシングとｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示すことを含み、
システムは：（ｉ）ｐｅｎポリペプチド発現が非天然又は病原性であると決定されるｐｅｎポリペプチドを発現する生細胞、及び（ｉｉ）規定量のｐｅｎポリペプチドを含有するインビトロ無細胞混合物からなる群から選択され、
ｐｅｎポリペプチドは、ヒト、ラット、マウス、キイロショウジョウバエ、及び線虫のｐｅｎ−２；ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ及び線虫のｐｅｎ−１；ヒトのｐｅｎ−１Ｂ；及びヒト、キイロショウジョウバエ又は線虫のＡｐｈ−２からなる群から選択されるｐｅｎポリペプチドと配列類似性を有し、類似性が少なくとも２０％同一性である方法。 - プレセニリンとプレセニリンエンハンサー（ｐｅｎ）ポリペプチドの機能的相互作用を変化させるストレスを特異的に検出するための方法であって、
プレセニリンとｐｅｎポリペプチドの機能的相互作用を提供するシステムに所定のストレスを導入し、それによって、システムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を提供し、ストレスのない場合にシステムはプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの不偏性相互作用を提供し；及び
システム内でのプレセニリンの量の変化としてプレセニリンとｐｅｎポリペプチドのストレス偏向性相互作用を検出し、その量はプレセニリンＮ又はＣ末端断片（ＮＴＦｓ）、プレセニリンホロタンパク質、又はその割合の量として表されてもよく、ストレス偏向性及び不偏性相互作用の間の差異によって、ストレスがプレセニリンとｐｅｎポリペプチドの相互作用を変化させることを示すことを含み、
システムは：（ｉ）ｐｅｎポリペプチド発現が非天然又は病原性であると決定されるｐｅｎポリペプチドを発現する生細胞、及び（ｉｉ）規定量のｐｅｎポリペプチドを含有するインビトロ無細胞混合物からなる群から選択され、
ｐｅｎポリペプチドは、ヒト、ラット、マウス、キイロショウジョウバエ、及び線虫のｐｅｎ−２；ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ及び線虫のｐｅｎ−１；及びヒトのｐｅｎ−１Ｂからなる群から選択されるｐｅｎポリペプチドと配列類似性を有し、類似性が少なくとも２０％同一性である方法。 - ｐｅｎポリペプチドが、ヒト、ラット、マウス、キイロショウジョウバエ及び線虫のｐｅｎ−２からなる群から選択される、請求項１、２又は３に記載の方法。
- ｐｅｎポリペプチドが、ヒト、マウス、キイロショウジョウバエ及び線虫のｐｅｎ−１からなる群から選択される、請求項１、２又は３に記載の方法。
- ｐｅｎポリペプチドが、ヒトのｐｅｎ−１Ｂである、請求項１、２又は３に記載の方法。
- 前記ｐｅｎポリペプチドが、ｓｅｌ−１２Δ（デルタ）ホモ接合線虫遺伝子突然変異エンハンサースクリーニングにおいて天然に生じるｐｅｎポリペプチドである、請求項１、２又は３に記載の方法。
- 同一性が少なくとも５０％である、請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の方法。
- 同一性が１００％である、請求項１、２、３、４、５、６又は７に記載の方法。
- 機能的相互作用が、Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングの構成要素とｐｅｎポリペプチドの結合を含む、請求項１、４、５、６、７、８又は９に記載の方法。
- 機能的相互作用が、Ｎｏｔｃｈ又はＡＰＰプロセシングの構成要素とｐｅｎポリペプチドの結合を含み、構成要素がプレセニリン又はγ分泌酵素である、請求項１、４、５、６、７、８又は９に記載の方法。
- システムが生細胞であり、ストレスが薬理学的活性剤である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、ストレスがｐｅｎポリペプチドの機能的発現における欠陥である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、ストレスがｐｅｎポリペプチドをコードする他の内因性対立遺伝子のゲノム破壊によるｐｅｎポリペプチドの機能的発現における欠陥である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、ストレスがｐｅｎポリペプチドをコードする内因性対立遺伝子の配列アンチセンスを含むポリヌクレオチドの共発現によるｐｅｎポリペプチドの機能的発現における欠陥である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、細胞がインサイツ（動物宿主内にある）である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、細胞がインビトロ（動物宿主から単離された）である、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムがインビトロ無細胞混合物であり、ストレスが薬理学的活性剤である、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程がアルツハイマー病の徴候を検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程がｎｏｔｃｈの転写レポーターを検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程がＡβ（ベータ）の生成を検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程が、Ａβ（ベータ）の生成をＡβ特異的抗体を用いて検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程がｐｅｎポリペプチドの構造変化を検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出工程が、ｐｅｎポリペプチドの構造変化をｐｅｎポリペプチド特異的抗体を用いて検出する、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 検出可能なプレセニリンの量の変化が、プレセニリン特異的抗体により検出される、請求項３に記載の方法。
- システムが生細胞であり、γ分泌酵素レポーターを含む、請求項１、２、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- システムが生細胞であり、Ｃ末端ＡＰＰ−Ｇａｌ４融合タンパク質及びＵＡＳレポーター導入遺伝子を含むγ分泌酵素レポーターを含み、γ分泌酵素による融合タンパク質の切断がＧａｌ４を遊離し、次にレポーターを発現する導入遺伝子の転写を活性化する、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- ｐｅｎポリペプチドが、ヒト、キイロショウジョウバエ又は線虫のＡｐｈ−２からなる群から選択される、請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１に記載の方法。
- 配列番号：１に対して少なくとも５０％の配列類似性を有する配列を含み、ポリペプチド又は断片がヒトｐｅｎ−１Ｂ特異的抗体と交差反応する、単離されたポリペプチド。
- ポリペプチドが、ヒトプレセニリン又はγ分泌酵素と結合する、請求項２８に記載のポリペプチド。
- 配列番号：６、残基１−１４；配列番号：６、残基６−１５；配列番号：６、残基１０−２０；配列番号：６、残基２５−４６；配列番号：６、残基６２−７１；配列番号：６、残基６７−７６；配列番号：６、残基７２−９５；配列番号：６、残基１１５−１２６；配列番号：６、残基１３０−１４０；配列番号：６、残基１３９−１５１；配列番号：６、残基１６６−１８２；配列番号：６、残基１８４−１９８；配列番号：６、残基２１４−２３２；及び配列番号：６、残基２４６−２５７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９又は３０に記載のポリペプチド。
- 配列番号：２−１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
- 配列番号：６、残基１−２５４；配列番号：６、残基４−２５５；配列番号：６、残基９−２５７；及び配列番号：６、残基２−２５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
- 配列番号：２を含む請求項２９に記載のポリペプチド。
- 請求項２９、３０、３１、３２、３３又は３４に記載のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチド。
- ベクター又は細胞内に含まれる請求項２９、３０、３１、３２、３３又は３４に記載のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチド。
- ポリペプチドを作成する方法であって、宿主細胞又は細胞抽出物中に請求項２９、３０、３１、３２、３３又は３４に記載のポリヌクレオチドを導入し、前記宿主細胞又は抽出物を、前記ポリヌクレオチドが転写物として発現され、前記転写物が前記ポリペプチドを含む翻訳産物として発現される条件下でインキュベートする工程を含む方法。
- 結合標的に対するｐｅｎ−１Ｂポリペプチドの相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法であって、
請求項２９、３０、３１、３２、３３又は３４に記載の単離されたポリペプチド、
前記ポリペプチドの結合標的、及び
候補薬剤
を含む混合物を、前記薬剤が存在しない場合には前記ポリペプチドが基準親和性で前記結合標的に特異的に結合する条件下でインキュベートし；
前記結合標的に対する前記ポリペプチドの結合親和性を検出して薬剤偏向性親和性を測定する工程を含み、
薬剤偏向性親和性と基準親和性の間の差異によって、前記薬剤が前記結合標的に対する前記ポリペプチドの結合を調節することを示す方法。 - 前記結合標的がヒトプレセニリン又はγ分泌酵素を含む、請求項３８に記載の方法。
- 結合標的に対するｐｅｎ−１Ｂポリペプチドの相互作用を調節する薬剤のスクリーニング方法であって、
請求項２９、３０、３１、３２、３３又は３４に記載のポリヌクレオチドをポリペプチドが発現される条件下でインキュベートし；
前記ポリペプチドを含む混合物、前記ポリペプチドの結合標的、及び候補薬剤を含む混合物を、前記薬剤が存在しない場合には前記ポリペプチドが基準親和性で前記結合標的に特異的に結合する条件下でインキュベートし；
前記結合標的に対する前記ポリペプチドの結合親和性を検出して薬剤偏向性親和性を測定する工程を含み、
薬剤偏向性親和性と基準親和性の間の差異によって、前記薬剤が前記結合標的に対する前記ポリペプチドの結合を調節することを示す方法。 - 前記ポリヌクレオチドが細胞内にある、請求項４０に記載の方法。
- 前記結合標的がプレセニリン又はγ分泌酵素を含む、請求項４０に記載の方法。
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